JPH09509046A

JPH09509046A - トランスジェニックマウス

Info

Publication number: JPH09509046A
Application number: JP7515252A
Authority: JP
Inventors: ジョンハーディー; カレンダフ
Original assignee: ユニヴァーシティオブサウスフロリダ
Priority date: 1993-11-29
Filing date: 1994-11-22
Publication date: 1997-09-16
Also published as: WO1995014769A1

Abstract

(57)【要約】ヒト変異タンパク質配列を発現するマウスの製法であって、該方法は、a)酵母の人工的な染色体内に含まれる遺伝子の一部または全体を得、b)相同組み換えによって、該酵母の人工的な染色体内に所定の変異遺伝子配列を導入し、c)トランスジェニック体を利用して、該変異遺伝子を胚幹細胞に挿入し、およびd)該幹細胞を胚盤胞に注入して、該ヒトタンパク質配列を発現するトランスジェニックマウスを誘発する工程を含む。上記方法により製造されるトランスジェニックマウスおよび上記方法によって生成された変異酵母の人工的染色体をも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】トランスジェニックマウス技術分野本発明は、非ヒトトランスジェニック動物に関し、詳細には、突然変異タンパク質配列を発現するマウスの作製方法に関する。発明の背景ここ数年にわたって、アルツハイマー病の病因及び病状の解明が進められてきた。最近、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）中の突然変異がアルツハイマー病の一因であることが判明した¹。これらの突然変異の１つの作用機序及びアルツハイマー病及びダウン症候群の予想される一因はβ−アミロイドの過剰生産であると考えられる^3,4。従って、少なくともこれらの病因によるアルツハイマー病においては、特有の病状の全てがＡＰＰミス代謝により誘導されるらしいと推定することができる^5,6。トランスジェニックマウスにおいてアルツハイマー病のモデルを治療するように設計された実験は、これまでほとんど不成功であった。かかる失敗は、導入遺伝子の低レベルな発現及び／又は発現の不正確な時間的／空間的パターン及び／又は間違ったＡＰＰ誘導転写の発現であると説明されてきた。文献にはｃＤＮＡトランスジェニックマウスでの病原性変異体の使用の報告はないが、おそらく上記で論じた同じ理由のために突然変異ＡＰＰ配列を有するｃＤＮＡ導入遺伝子がアルツハイマー病理学を進展させなかったことは広くうわさされている。上記課題のために、アルツハイマー病のような疾患の発病の理解は、主にこれらの疾患のトランスジェニックモデルを作ることが困難であることから進行が遅かった。即ち、かなり効率のよいプロトコールがマウスの遺伝子をノックアウトするために開発されたが⁷、遺伝子に微妙な突然変異を導入することは困難であり、ミスセンス劣性突然変異の作用又は優性突然変異の作用のモデルを作ることは困難であった。ＥＳ細胞内のマウス遺伝子に微妙な突然変異を挿入するために “ヒットアンドラゾ”方法の使用がわずかに報告されている^8,9。最近、コピー依存、部位依存方法で発現される酵母人工染色体（ＹＡＣ）導入遺伝子を使用するトランスジェニックテクノロジーの分野が開発されてきた^10,1 ^1,12,13 。これによれば、ＹＡＣ導入遺伝子は未変性遺伝子の発現に類似していなければならない。従って、本発明者らは、機能分析において、特に、未変性遺伝子がノックアウトされた動物だけでなく導入遺伝子としてこれらの遺伝子の潜在的使用を確認した。ＹＡＣは、酵母中にクローン化される典型的には１００ｋｂ〜１.５Ｍｂの大きなＤＮＡセグメントである。ＹＡＣベクターの能力があることから、イントロン因子及び遠隔調節因子を有する全遺伝子を含む大きなＤＮＡセグメントをクローン化するために用いられる。従来の導入遺伝子と異なり、ＹＡＣは正しい時間的、空間的及び転写分配をもって発現する。これは、他のトランスジェニック技術でプロモーター及び調節因子等として用いられた未変性でない挿入因子とは反対に、遺伝子が未変性制御因子によって制御されることから達成される。これらの技術は、ＡＰＰ遺伝子²⁴並びにチロシナーゼ遺伝子及び重鎖免疫グロブリン遺伝子に適用されてきた。上記の観点から、突然変異タンパク質配列を発現するマウスを作製する方法を誘導する技術、特に、ＹＡＣ導入遺伝子技術を開発することが望ましい。本発明者は、突然変異をＹＡＣに挿入してトランスジェニックマウスの開発に使用することができる幹細胞を誘導するためにＹＡＣ技術と共に“ポップイン／ポップアウド”法¹⁶を特に適応させた。かかるマウスは、アルツハイマー病のモデルとして用いることができる。同様の方法は、他のヒト疾患についても用いられる。更に、かかるマウスは、アミロイド前駆体タンパク質に関連した病因及び病状を有する種々の疾患の潜在的薬剤を試験するために用いることができる。発明の要約本発明によれば、突然変異タンパク質配列を発現する所定の突然変異を含む部分的又は全部の遺伝子を得る工程及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）トランスジェニックマウスを使用して該遺伝子を胚幹細胞に挿入する工程により突然変異タンパク質配列を発現するマウスを作製する方法が提供される。突然変異は、相同的組換えによりＹＡＣに導入される。突然変異タンパク質配列を発現するトランスジェニックマウスを誘導するために、幹細胞が胚盤胞に注入される。本発明は、更に、前述の方法によって作られたトランスジェニックマウスを提供するものである。本発明は、更に、突然変異ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）配列を発現することを特徴とする表現型を有するトランスジェニックマウスを提供するものである。本発明は、また、突然変異タンパク質配列を発現する所定の突然変異を含む部分的又は全部の遺伝子を得る工程及びＹＡＣトランスジェニックマウスを使用して遺伝子を胚幹細胞に挿入し、もって、マウスゲノムに突然変異を導入する工程によって修飾されたマウス胚幹細胞を提供するものである。本発明によれば、アルツハイマー病に罹患しているヒトに見いだされる突然変異ＡＰＰを発現することによりアルツハイマー病の動物モデルとして特に使用することができるマウスを誘導する方法が提供される。更に、本発明は、動物モデルの形で或いは当業者に周知の方法に従って形質転換された細胞の形でさえ、潜在的薬剤を薬理学に関して試験しかつ十分に確認された薬剤を使用してその改変した細胞の生理的及び生化学的パラメーターを試験するための伝達体として使用することができ、これらの手順の全てがアルツハイマー病に罹患しているヒトの薬力学をよりよく確認するために使用される。かかる手段は、潜在的治療法を設計、誘導及び試験するために薬理学者等によって用いられる。図面の簡単な説明本発明の他の利点は、本発明が下記の詳細な説明について添付の図面と共に考えた場合に更によく理解されるようになるので容易に理解されるであろう。図１は、本発明に従って行われた組込み（ポップイン）及び切除（ポップアウト）組換え結果の成果を示す実験の概略である。図２は、ポップインクローンＣ５及びポップアウトクローンＣ２及びＣ３のＰＣＲ分析であり、各プライマーセットに対して２回のＰＣＲ反応が生じ、各２回のうち１回はＢＣ１Ｉで消化された。図２Ａは、レーン１〜７ポップインクローンＣ５：レーン１プライマーセット２（配列番号：３、４）非切断、レーン２、プライマーセット２切断、レーン３プライマー３Ｒ／２Ｆ（配列番号：６、５）非切断、レーン４、プライマー３Ｒ／２Ｆ、切断、レーン５、プライマーセット３（配列番号：５、６）非切断、レーン６、プライマーセット３切断、レーン７プライマーセット４（配列番号：７、８）非切断を示す。図２Ｂは、レーン８〜１５ポップアウトクローンＣ２（変異体）及び３(野性型):レーン８クローンＣ２プライマーセット２非切断、レーン９クローンＣ２プライマーセット２、切断、レーン１０クローンＣ３プライマーセット２非切断、レーン１１クローンＣ３プライマーセット２切断、レーン１２クローンＣ２プライマー３Ｒ／２Ｆ非切断、レーン１３クローンＣ２プライマー３Ｒ／２Ｆ切断、レーン１４クローンＣ３プライマー３Ｒ／２Ｆ非切断、レーン１５クローンＣ３プライマー３Ｒ／２Ｆ切断、レーン１６１ｋｂラダー（ＢＲＬ）を示す。図３は、ＹＡＣクローンのサザンブロット分析であり、ポップアウト変異体クローンＣ２は改造されたＹＡＣ９及び消化されていない未変性ＹＡＣ（Ｂ１４２Ｆ９）と共に行われた。図３Ａは、ＢｓｓＨＩＩで消化されたものである。図３Ｂは、BioRad サイズマーカー（S.cerevisiae及びλコンカテマー）と比較した電気泳動を示し、消化されていないＹＡＣが約６５０ｋｂでありかつＢｓｓＨＩＩフラグメントが約２００ｋｂであることがわかった。発明の詳細な説明本発明は、一般的には、突然変異タンパク質配列を発現するマウス又は他の非ヒト動物を作製する方法を提供するものである。ヒト発病の動物モデルとして使用する場合、ヒト病状に密接に類似しかつ薬力学及び潜在的治療法の速度論を予想することができる哺乳動物が通常選ばれる。更に、かかる動物は疾患の発生並びに疾患及び疾患制御の他の態様を研究するために使用することができる。本発明は、好ましくはマウスモデルの作製に関するが、他の動物も用いられる（例えば、ラット）。本発明は、更に詳細には、突然変異ヒトタンパク質配列を発現するマウスを作製する上記方法に関する。用途は、突然変異がヒト病原性タンパク質配列を発現することができるヒト病原性突然変異であるマウスモデルの発生において本発明から誘導することができる。好ましくは、本発明は、ＡＰＰミス代謝によって誘発されたアルツハイマー病に特有の病状に関する。再配列されていないヒトＡＰＰ（ｈＡＰＰ）遺伝子²⁰において特定の突然変異の例は、病原性ＡＰＰ突然変異ＡＰＰ６７０／１¹⁷及びＡＰＰ７１７Ｖａｌ＞Ｉｌｅ¹⁸である。他の突然変異した遺伝子が、突然変異タンパク質配列を発現する他のマウス及び他の哺乳動物モデルを誘導するために本発明に従って用いることができることは当然のことである。例えば、突然変異タンパク質配列を発現する本発明に従って用いられる他の配列はＡＬＳのモデルとしての突然変異スーパーオキシドジスムターゼ及び嚢胞性線維症のモデルとしての突然変異ＣＦＴＲである。もって、突然変異タンパク質配列を発現する所定の突然変異を含むかかる部分的又は全部の遺伝子を得るか又は発生させることができる。例えば、本発明によれば、再配列されていないｈＡＰＰ遺伝子は下記で詳述されかつRothstein¹⁶ に述べられているように“ポップイン／ポップアウト”法を用いて突然変異される。このRothsteinの参考文献に開示された手法を参考として本明細書中に引用する。ポップイン／ポップアウト法は、突然変異遺伝子フラグメントをＹＡＣに挿入するために相同的組換え技術を使用する一例である。次に、ＹＡＣトランスジェニックマウスを使用して突然変異ＹＡＣをマウス胚幹細胞に、もってマウスに導入することができる。更に詳細には、“ポップイン／ポップアウト”法では、ウラシル原栄養を生じる組込み結果を選ぶためにＵＲＡ３が用いられた。組換え切除結果は、５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）を用いてＵＲＡ３遺伝子に対して負の選択をすることにより選ばれる。この方法には、宿主酵母菌株がウラシル依存性であることが必要である（ＵＲＡ３遺伝子座によってコードされた酵素オロチジン−５′−リン酸塩脱炭酸酵素を必要とする）。これには、ベクター内のＵＲＡ３遺伝子が当業者に既知の改造法により他の選択可能なマーカーで破壊されることが必要である¹⁸。“ポップイン／ポップアウト”法は、挿入断片をニワトリグロビン遺伝子を含む３８ｋｂＹＡＣに入れるために用いられた¹。この手順において、ＵＲＡ３は正及び負双方の選択可能なマーカーとして用いられる。プロトコールは、図１に一般的に示されている。ｐＲＳ４０６／ＡＰＰ構築物とＣｅｌＩＩとを線状化すると、ＹＡＣの相同な位置で組換えを促進する組換え促進端を生じる。効率のよい相同的組換えは、６００ｐｂ相同領域の３′端から８５ｂｐ及び突然変異から１１８ｂｐの位置で線状化された領域内で起こることが判明した。構築物を単一相互乗換えにより組込むと、ＹＡＣ内のエキソン１７領域の重複が生じる。重複したエキソン１７領域は、相互乗換えの位置によっては突然変異体或いは野性型エキソンの切除を生じる自然染色体内組換え結果を受けることができる。ＹＡＣ組換え結果を評価するために他の選択系を用いることができることは当然のことである²⁴。たいていのＹＡＣライブラリーの構築に用いられるベクター、ｐＹＡＣ４も選択可能なマーカーとしてＵＲＡ３を使用する。従って、プロトコールの第１段階は、改造するベクターｐＲＶ１で達成することができるベクターアームでのＵＲＡ３遺伝子座の破壊である¹⁸。この手順により、リシン原栄養の選択可能マーカーがＵＲＡ３遺伝子座ＹＡＣアームに挿入される。これにより、酵母がウラシルからリシン原栄養に変換される。具体的な方法は、下記実験の項で記載される。ＡＰＰ６７０／１突然変異を含有及びＡＰＰ７１７突然変異を含有する特定のｈＡＰＰＹＡＣが作成された。当該技術において既知の方法により、他の突然変異及びAＰＰ６７０／１とＡＰＰ７１７突然変異との組合わせのような突然変異の組合わせを取込む他のＹＡＣを作成することもできる。本発明に従って用いられるＹＡＣの例は、Ｂ１４２Ｆ９である（セントルイスＹＡＣライブラリーの命名）。ＹＡＣＢ１４２Ｆ９は、以前には全ヒトＡＰＰ遺伝子を約２００ｋｂの上流配列及び１５０ｋｂの下流配列と共に含むことが示された^14,16。Ｂ１４２Ｆ９は例として用いられるが、大体においてＹＡＣはそのように修飾される。ヒトＡＰＰ配列を発現することを特徴とする表現型を有するトランスジェニックマウスを発生させることに関して、下記プロトコールが用いられる。ベクターアームのｕｒａ３遺伝子は、ＹＡＣ含有酵母をウラシルからリシン原栄養に変換するために破壊される。コドンＡＰＰ６７０及び６７１に突然変異を含むエキソン１６及びＡＰＰ７１７に突然変異を含有するエキソン１７は、Yoshikaiらから誘導された配列情報を用いてｕｒａ３遺伝子を含有する酵母シャトルベクター中にクローン化される²⁰。ＹＡＣ含有酵母は線状化構築物で形質転換され、無ウラシル培地中に選択される（ポップイン結果）。ポップアウト結果は、下記に詳述されるように、５−ＦＯＡを使用して選択される。突然変異を含みかつ再配列されていないＹＡＣが選択される。本発明に従って行われる具体的な方法は次の通りである。ＹＡＣ含有酵母は、記載されているように栄養ブイヨン中で発育されパルスフィールド電気泳動用に調製される²¹。ＹＡＣ及び他の酵母染色体はパルスフィールドゲル電気泳動によって分離される。ＹＡＣはゲルから切断され、ゲルアガロースはβ−アガラーゼで消化される。全段階においてＹＡＣが剪断されないように注意する。Ｃ１細胞が用いられ、培養される。用いられる他の幹細胞の例は、ＡＢ１、Ｄ３、Ｅ１４又は本発明に従って生殖系列に分配することができる他のＥＳ細胞である。他の細胞系も当業者によって用いられることは当然のことである。細胞は、ネオマイシン線維芽細胞支持細胞層の培養内に維持される²²。ネオマイシン耐性線維芽細胞系を用いるための論拠は、これらの支持細胞が選択手順を生存することである（下記参照）。幹細胞は、リポフェクション前日に３５mmウェルに移される。８００ngの精製ＹＡＣＤＮＡを、１２ngｐＰＧＫ−ｎｅｏ（選択可能マーカー）と共にＯｐｔｉＭＥＭ^TM（ＢＲＬ）で１００μｌに希釈された１０μg のTransfectam^TM(Promeg a)とプラスチック管中で１時間複合体を形成する。ＹＡＣ／ｐＰＧＤ−ｎｅｏ／脂質複合体をＥＳ培地（ＢＲＬ）で１０倍に希釈し、排出されたＥＳ細胞に加える。これらを一晩インキュベートする。この手順の論拠は、細胞の部分がネオマイシン耐性を与えるプラスミドとＹＡＣＤＮＡの双方を含むＤＮＡを溶解することである。次に、ネオマイシン耐性細胞が選択される。次いで、細胞を、G418（ネオマイシン耐性遺伝子がない場合には有害な、ネオマイシン類似体）の存在下で、２週間成育させる。耐性細胞を収穫し、増殖させる。これら細胞の殆ど全てが、その内部に組み込まれた該ネオマイシン耐性遺伝子（pPGK-neoによってコードされる）をもつであろう。該細胞の一部は、その中に組み込まれた該YAC をももつであろう。次に、これら細胞を、ヒトエキソン17 の存在に関する、PCR スクリーニングによるYAC DNA の組み込みにつきスクリーニングする。これは効果的なスクリーニングプロトコールであり、このことは、各コロニーを個別にスクリーニングする必要はなく、従って多くのコロニーを迅速にスクリーニングすることが可能となることを意味する。次いで、このスクリーニングに関して正のコロニーを、前に記載された方法によって、APP の他のエキソンにつきスクリーニングして、該YAC 全体が該細胞中に組み込まれたか否かを確認する²³。該YAC の組み込みに関する初期のスクリーニングは、PCR 法によって実施されており、そこではまず選択されたAPPエキソンおよび該APP プロモータ^8,23のPCR 分析が行われる。また、ALU-PCR(これはヒトDNA の存在下でのみPCR バンドを与える)を実施し、かつ該幹細胞の該ALU-PCR プロフィールを、元のYAC のプロフィールと比較する。該全hAPP遺伝子を含むと考えられる細胞系を、これらが完全なYAC を含むか否かを知るために(YACベクターアーム(vector arms)をスクリーニングすることにより）、更に特徴付けする。全ての該hAPPエキソンおよびプロモーターを含有する細胞系をパルスフィールドゲル電気泳動法にかけて、該遺伝子を、固定化DNA に対するAPP のハイブリダイゼーションによりマッピングして、該YAC 中の該遺伝子のマップと比較することができる。また、これらの細胞系を、以下に記載するように、hAPP695、hAPP751 およびh APP770の、そのマウスの等価物からの識別アッセイ(differential assay)を可能とする配列を含む、hAPP特異的配列に関するS1ヌクレアーゼ保護アッセイによって、該hAPP遺伝子の発現につき検討する。異なるヒトイソ型の相対比を、該マウスイソ型の該比と比較する。この実験は、該マウス細胞が該マウス転写体をプロセッシングするのと同様な方法で、該細胞が該hAPP転写体をプロセッシングするか否かを示すある指標を与える。マウス株C57 胚盤胞を卵管のフラッシング(flushing)によって単離する。該胚盤胞を幹細胞と共に注入し、かつ標準的な技術²²によって疑似妊娠C57 保育器に転移させる。外皮の色を、どの動物が該幹細胞由来の細胞を高率でもつかを決定するための識別子として使用する。というのは、C57 マウスの外皮は黒色であるが、該幹細胞が由来とする細胞系は、外皮の色において縞模様状であるからである。大量の幹細胞由来の成分をもつと考えられる該マウスを、FVB マウスと交尾させ、どの動物が該幹細胞由来のものであるかを決定するために、外皮の色を利用する。該C57 マウスが該トランスジェニック動物の生殖細胞系に寄与しないように、この増殖プロトコールを選択する。というのは、高齢のC57 マウスがその脳に細胞含有物をもち、これがアミロイド沈着物と誤認される可能性があることが、プライス(Price)等によって示されているからである。該幹細胞由来の該マウスは、少なくとも以下の方法で解析される。１）該hAPP遺伝子の完全性は、該幹細胞に関連して上記した如き、PCR およびパルスフィールドゲル電気泳動法によって解析される。２）hAPPの発現の組織特異的細胞パターンを、S1ヌクレアーゼ保護²⁹およびRT -PCR²⁹により解析する。該hAPP遺伝子の発現を、同一のサンプル中の固有の遺伝子の発現と比較して、該hAPP遺伝子が該固有遺伝子と同様な方法でプロセッシングされるか否かを決定する。３）これらのマウスを、３カ月、９カ月および18カ月における「ヒト−様」の神経病理に関する病理につき検査する。以下の実験は、変異体構築、特異的な「ポップ−イン(pop-in)」、「ポップ− アウト(pop-out)」法を利用したYAC 中におけるかかる構築物の組み込み、およびかかる形質転換された幹細胞の機能的応答能に関して、本発明の利用可能性を立証している。上で詳細に論じた技術を利用することにより、このような幹細胞を、胚盤胞への組み込みおよびトランスジェニック動物、例えば上記の特異的方法を利用した上記のトランスジェニックマウスの誘導のために作成でき、あるいは変異YAC 含有細胞(例えば、Cos)を、当分野で周知の手順によって、薬力学、薬物動態学および薬理学並びに関連するテスト手順のために利用できる。pRS406/APPエキソン17構築物の調製 PCR を利用して、APP 転写物770 のコドン717 のバリン−イソロイシン変異を担持する発病群(F172)構成員由来のゲノムDNA の一部を増幅した。プライマー群１（配列表Seq．ID．Nos．1，2）を標準的な100 μｌPCR ミックスで使用して、以下のように反復した。即ち、90℃にて５分間、94℃にて１分間、54℃にて１分間、72℃にて１分間、(x35サイクル)、72℃にて10分間。数回の反応で得たPCR 生成物をプールし、マジックPCR 処方物(Magic^TMPCR pr eps)(プロメガ(Promega))を使用して精製した。該アンプリファイヤーを３時間H ind IIIで消化し、該生成物をマジッククリーンアップ(Magic^TMclean up)カラム上で精製した。このpRS406ベクターDNA（ストラタジーヌ(Stratagene)）をもHin d IIIで３時間消化し、該反応を65℃にて10分間インキュベーションすることにより終了した。該ベクターのその後のリサーキュラリゼーション(recircularisa tion）を、全体で50分間の37℃でのCIAP処理(プロメガ(Promega))によって阻止した。ほぼ等量(200 ng)の該ベクターおよび挿入断片を、T4DNA リガーゼレディー−ツー−ゴー(Ready-to-Go^TM)キット(Pharmacia))を使用して、16℃にて45分間連結した。該連結混合物の1/10を、DH５αサブクローニング有効性(subclonin g efficiency)能力細胞(BRL)を形質転換するのに使用し、該全形質転換混合物（その体積を100μｌまで減少させた）を、アンピシリン(100μg/ml)、ＸgalおよびIPTG(プロメガ(Promega))LBを含有するＬ寒天プレート上に展開した。白色のコロニーを、後で利用するために、格子状に分割し、プライマー群２(配列表のS eq．ID．Nos．3，4)を使用して、爪楊枝で取り出したコロニーを直接PCR によってスクリーニングした。変異体の存在は、該未精製PCR 生成物のBclI（これは該生成物を２つの等しいサイズのフラグメントに開裂する）による消化により確認した。この消化生成物を、2%メタフォア(Metaphor^TM)(FMC)/1% アガロースゲル上で可視化した。これらの変異体コロニーを、アンピシリン(50 μg/ml)およびマジックミニプレプ(Magic^TMminiprep)カラム(プロメガ(Promega))を使用して精製した該プラスミドDNA を補充したTB中で成育させた。このDNA を、ベーリンガーバッファーＨ中で、SalI(プロメガ(Promega))およびCelII（ベーリンガー(Boe hringer)）両者0.5Uによって消化して、該フラグメントの配向を決定した。ゲノムDNA を、標準的なフェノール／クロロホルム抽出手順によって、またはカラムを使用した方法²⁹を利用することにより調製する。該変異クローンの一つを、その全長に沿った両方向において配列決定した。その二本鎖鋳型DNA を調製²⁵し、シーケンス(Sequence:登録商標)2.0 キット(USB) を使用して配列決定した。この反応の生成物を、6%シーカゲル(Sequagel^TM)ポリアクリルアミドゲル（ナショナルダイアグノスティックス(National Diagnostic s)）を介しての電気泳動によって分割した。配列決定用プライマー(2μM における)は、第１表に掲載したものである。YAC B142F9のノックアウト(Knockout) B142F9のコロニーを、aAHC-(-ura，-trp)中で３×10⁷細胞／mlの密度にまで成育させた。スフェロプラスト化細胞を、バーガーズ＆パーシバル²⁶(Burgers and Percival)の方法に従って製造した。100μｌのスフェロプラスト化細胞を、200 ngのpRV1¹⁴および５μgのキャリヤーpBluescript(登録商標)DNA(ストラタジーヌ(Stratagene))で形質転換し、-lysソルビトールプレート上に展開した。正のコロニーを、-lysプレート上での選別および-uraプレート上でのスクリーニングにより同定した。選択された14個のコロニーのうち、３個が正確に改良された(r etrofitted)ように思われた。固有のB142F9酵母DNA と共に、これら３種のコロニーのアガロースプラグを調製²⁷し、該酵母染色体を、切替え時間40-70 秒で20 0Vにて24時間に渡る、1%アガロースゲルを通してのパルスフィールド電気泳動（バイオラドチェフ(BioRad Chef)III^TM）によって分割した。このDNA をハイボンド(Hybond^TM)N+膜（アマーシャム(Amersham)）に一夜かけて移し、標識したネオマイシン遺伝子プローブによりハイブリッド形成した。約650 kbのシグナルバンドが全てのレーンにおいて見られ、これは該YAC が、該形質転換中に大幅な再配列を生じなかったことを示している。APP 構築物による、改良されたYAC の形質転換該改良されたYAC(クローン９)の一つを、前に記載した如くスフェロプラスト化した。このpRS406/APP構築物をCelII で消化することにより線状化し、マジック(Magic^TM)クリーンアップ上で精製した。200 ngの構築DNA ＋５μｇのpBlues cript(登録商標)DNA を使用して、該スフェロプラスト化酵母細胞を形質転換した。次いで、-uraソルビトールプレート上で選別した。ポップ−インクローンの分析該APP 構築物の組み込みを行った形質転換体を、前に概説した条件を使用し、プライマー群２(配列表のSeq．ID Nos．3，4)、３(配列表のSeq．ID Nos．5，6) および４(配列表のSeq．ID Nos．7，8)（第１表）を用いた標準的PCR によってスクリーニングした。未精製のPCR 生成物をBclIで、50℃にて３時間消化し、該消化物を2%メタフォア(Metaphor^TM)/1%アガロースゲルを介する電気泳動によって分離した。ポップ−アウトクローンの製造および分析ポップ−インクローンC5の飽和培養物100 μｌを、1mg/mlの5-フロロオロチン酸(5FOA,シグマ(Sigma)²⁸)を補充した-lysプレート上で平板培養した。５個の正のコロニーを、プライマー群２(配列表のSeq．ID Nos．3，4)および３(配列表の Seq．ID Nos．5，6)を用いたPCR によって分析し、変異体エキソンの保持率および該ベクター配列の喪失につきチェックした。１種の正のクローン(C2)の完全性を以下のようなパルスフィールドマッピングによって評価した。 B142F9のアガロースプラグ、改良されたYAC9および変異体YAC C2を調製（上記参照）した。該酵母染色体を、切替え時間50-90 秒間、6V/cm にて25時間、14℃ にて、1%ゲルを介するPFGE(バイオラドチェフ(BioRad CHEF)III(登録商標))によって調製した。このDNA をハイボンド(Hybond^TM)N+ 上にブロッティングし、68 ℃にてクイック−ハイブ(Quick-hyb^TM)(ストラタジーヌ(Stratagene))内で、プライマー群２により増幅された精製APP PCR 生成物によって、１時間ハイブリッド形成した。このプローブを10分間37℃にて、レディー−ツー−ゴー(Ready-to- Go^TM)DNA標識キット(ファルマーシア(Pharmacia))を使用して、高い特異的活性にまで標識した。このブロットを、１×SSC(処方は、モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual),第２版，CHS プレス，1989，pg．B.13に与えられている)、0.1%SDS で２度、室温にて15分間、次いで0.1 ×SSC，0.1% SDS 中で１回、60℃にて30分間洗浄した。該 C2 YACを含有するアガロースプラグを、40ＵのBssHIIで消化し、切替え時間15 -45 秒でのPFGEにより11時間分離を行った。前に記載した如く、ブロットを調製し、かつ該APP プローブを使用してハイブリッド形成した。配列分析は、ビオチニル化2Rプライマー(Seq．Id．No．4)および標準2F(Seq． Id．No．3)を使用して増幅したPCR 生成物から得た。この生成物を、製造業者の勧めに従って、ダイナビーズ(Dynabeads)上で精製し、かつ配列決定した。該YAC の該URA3遺伝子を、前に記載²⁴されたように、pRV1を使用してノックアウトした。このノックアウト（改良）YAC を-lysプレート上で選別し、次いで-u raプレート上での成育性の欠如につきチェックした。分析した14個のクローンのうち、３種のクローンが正確に改良されていると考えられた。これら３種のクローンをパルスフィールド電気泳動に付し、ブロッティングしおよびネオマイシン遺伝子プローブを使用してハイブリッド形成して、該YAC が大幅に再配列されていないことを立証した。これら３種のクローンYAC5、YAC7およびYAC9は全て完全であると考えられた。クローニング法の選択には多数の制約があり、該挿入断片中の固有の制限サイトが該構築物を線状化して、組み込みを促進する必要があり、かつこの組み込みは該変異サイトからある距離隔たっていて、該変異塩基の不適切な修復を防止する必要がある。相同配列の長さが十分である場合、第１図に示したように、相同組み換えが生ずる可能性がある。これらの制約のために、本出願人は、第１表に与えられた配列（プライマー群１，Seq．ID Nos．1,2）を使用して、HindIII を尾部にもつプライマーで、エキソン17をPCR 増幅することを選択する。得られた増幅体をHindIII で消化し、pRS406の該HindIII サイトにクローニングした。選択された形質転換体の82%が、予想されたPCR 生成物を生成した。これら組み換えクローンのうち、44% が、ヘテロ接合性DNA 集団に対して、該期待された50% 予想値に近かった。該変異クローンの62% が、所定の配向の該APP フラグメントを含んでいた。これらクローンの１種（クローン８）を両配向において配列決定し、該変異の存在および該配列の完全性を確認した。改良したYAC9を該線状化した変異APP シャトルベクターで形質転換し、-uraプレート上で平板培養し、該ベクターの組み込みにつき選別した。更なる分析のために６個のコロニーを選択した。該ポップ−イン組み換え事象は、該YAC 内の該エキソン17フラグメントの複製に導くことが予想され、該変異型および野性型のエキソンは該pRS406ベクター配列により分離されていた。３種のプライマー群（第１表）を使用して、該ポップ−イン事象が、第２図に示されたように、予想通り生じているか否かを確認した。プライマー2F(Seq．ID No．3)および2R(Seq．I D No．4)の配列は、該エキソン内に位置しており、従って鋳型として該変異および内在性のエキソン両者を使用して、385 bpのフラグメントを増幅する。該選択的酵素(BclI)⁹による該PCR 生成物の消化は、該変異型および野性型配列両者が存在することを示した。しかしながら、この変異はプライマーサイト2Fおよび2R から殆ど等距離であり、かつこの消化によって生成した該２つのフラグメントを分離することは不可能であった。プライマー3R(Seq．ID No．6）の配列は該変異構築物の外部に位置し、従って該YAC 中の該APP 配列を識別する。該ベクターに特異的なプライマー（プライマー3F，Seq．ID No．5)と組み合わせた場合には、増幅される唯一のフラグメントは、変異エキソン17構築体のものである。このフラグメントのBclIによる消化は、この変異の指標となる２つのバンドを生成する。この結果を、プライマー3R/2F を使用して確認した。これら両PCR 反応におけるプライマ-3Rの使用は、該変異エキソン（該pRS406ベクターと共に）が該YAC の正確な位置に組み込まれたことを立証する。プライマー群４(Seq．ID Nos．7 ，8)は、該APP プローモータが、依然として該クローン中に存在することを示した。分析した６個のクローンのうち、ただひとつ(C5)が正確なPCR プロフィールを示した。該ポップ−アウト事象は自然に発生し、またポップ−インクローンC5を、リジンを含まないが、5FOAを含有する寒天上で平板培養することにより直接選別した。ポップ−アウト（除去事象）した唯一のコロニーは、URA3遺伝子をコードするベクターを失い、かつ5FOAプレート上で成育できる。５種のこのようなコロニーを、更に分析するために選択した。このポップ−アウトクローンを、まずプライマー群２（Seq．ID Nos．3，4)で増幅し、次いで該生成物をBclIで消化することによりスクリーニングした。これら５種のクローンのうちの２種は、該APP プライマーによって増幅されなかったが、このことは該エキソン17領域の喪失を示唆する。残りの３種のクローンはプライマー群２によるPCR 生成物を生成した。該生成物の消化は、２種のクローン（C1およびC3）が該野性型のエキソンのみを保持し、一方でC2は該変異エキソンのみを保持していることを示した。C1およびC2を、更に以下のプライマー群（第 2B図）で増幅することにより特徴付けした。これら両クローンはプライマー群３により増幅されなかったが、このことは該ベクターが欠如していることを示す。群3R/2F により増幅されたPCR 生成物の消化は、C1が該変異フラグメントを失い、かつC2がこれを保持していることを立証した。該変異YAC の完全性を幾つかのレベルにおいて評価した。まず、該元のB142F9 から調製したアガロースプラグおよび該改良クローン９を、該変異YAC C1と並べて電気泳動処理した。このDNA をブロッティングし、かつAPP エキソン17PCR プローブでハイブリッド形成した。約650 kbであると見積もられた、３種のサンプル全てにおける等価なサイズをもつ単一のバンドにまで、該プローブをハイブリッド化した（第3A図）。第二に、該３種のアガロースプラグをBssHIIで消化し、かつ上記のように電気泳動させた。該エキソン17プローブを、３種のサンプル全てにおける約200 kbの単一のバンドにまでハイブリッド化した（第3B図）。第三に、該変異YAC の直接的PCR 配列決定を実施して、該変異がこの手順中に該YAC 内に挿入された唯一の変化であったことをチェックした。上記データは、本発明に従って構築された該YAC が、具体的に定義されたように、元のYAC とは異なることを示している。遺伝的には、この差異は、コドンAP P717における病原的変異の置換にあるに過ぎない。これらのYAC は、アルツハイマー疾患のアミロイド沈着の発病性を更に検討するように工夫された、トランスジェニック実験における有用性が見出される。実際に、本発明による改良が、より迅速なアミロイドの沈着に導くYAC を与えるであろうことが、高い確率で予想できる。というのは、これらの配列がヒトにおける高率での沈着¹をもたらすからである。トランスジェニック実験におけるB142F9の使用は、このYAC の使用がヒトAPP mRNA¹⁵およびタンパク質の正確な発現をもたらすことを示す。APP 遺伝子がノックアウトされているマウス内での、APP 変異YAC の使用は、ヒトの疾患に対応する正確な動物モデルを得ることを可能とする。より一般的には、本発明は、公知技術に関連して上で論じた如く、酵母における目的の相同組み換えが実用的かつ比較的迅速な、直接胚の幹細胞を標的とする遺伝子に対する即効性の代用物である。本発明の手順は迅速（これらの実験は３カ月以内の短期間で実施された）で、安価（標準的な分子生物学的装置のみを使用した）で、しかも最小量の配列情報（１kb末満）が各変異サイト近傍で知られていることのみを必要とする。これとは対照的に、該ヒットアンドラン(hit and run)プロトコール⁴を使用した哺乳動物細胞中の効果的な相同組み換えに対しては、５kbを越える同質配列情報が必要とされる。これは、通常ヒト遺伝子のマウス同族体の単離および特徴付けを必要とする。また、YAC 変異形成は、酵母内でクローニング可能なヒト並びにネズミ遺伝子全てに対して適用できる。本発明の方法は、また他の哺乳動物遺伝子に対しても利用可能であることが予想される。同様に注目すべきは、該ヒトゲノムプロジェクトにより、多くの遺伝子由来のYA Cが主として入手可能となっているという事実である。かくして、これらの手順の実施可能性は、該分子的資源の入手可能性によって制限されない。上記のような観点から、本発明は、変異タンパク質配列、例えば変異APP を発現するマウス等の動物を、YAC トランスジェニック法を利用して製造するために有用な方法を提供する。この方法によって製造したトランスジェニックマウスは、上記したものであり、これは変異ヒトAPP 配列を発現することにより特徴付けられる表現型をもつ。最後に、上記した本発明は、上記の方法によって変性されたマウス胚幹細胞を与える。以上本発明を例示的に説明してきたが、使用してきた用語は、限定的というよりも寧ろ説明上の用語の特徴を意図していることを理解すべきである。明らかに、本発明の多くの改良並びに変更が、上記の教示に照らして可能である。従って、添付した請求の範囲内で、具体的に説明した以外にも本発明を実施できるものと理解すべきである。

Claims

【特許請求の範囲】１．変異遺伝子を発現する動物を製造するのに使用できるように、相同組み換えによって、酵母の人工的染色体内に該変異を挿入する方法。２．病原性変異をクローニングするために、発病したヒト由来のDNA を使用する請求の範囲第１項に記載の方法。３．ヒト変異タンパク質配列を発現するマウスの製法であって、ａ）酵母の人工的な染色体内に含まれる遺伝子の一部または全体を得、ｂ）相同組み換えによって、該酵母の人工的な染色体内に所定の変異遺伝子配列を導入し、ｃ）トランスジェニック体を利用して、該変異遺伝子を胚幹細胞に挿入し、およびｄ）該幹細胞を胚盤胞に注入して、該ヒトタンパク質配列を発現するトランスジェニックマウスを誘発する、ことを特徴とする上記方法。４．該変異体が、ヒト病原性タンパク質配列を発現する、請求の範囲第３項に記載の方法。５．該変異が、ヒト病原性タンパク質配列を発現できる、ヒト病原性変異である請求の範囲第４項に記載の方法。６．YAC トランスジェニック体を利用する上記工程が、更に「ポップ−イン／ポップ−アウト」法を使用して、該所定の変異を該YAC 内に挿入し、次いで該YAC をマウスゲノム内に導入する工程として規定される、請求の範囲第３項に記載の方法。７．ヒトAPP 含有YAC を、そのura 遺伝子の破壊によりウラシル依存性とし、機能性URA3遺伝子をもつ該所定の変異を挿入するためのベクターを使用して、該YA C をウラシル栄養素要求体に転化し；該所定の変異を含む少なくとも一つのエキソンを、ura3を含む酵母シャトルベクター内でクローニングし；該YAC 含有酵母を、線状化された構築物で形質転換し、かつウラシルを含まない培地中で選別を行い、これにより該「ポップ−イン」事象を誘発し；該形質転換された酵母を、 5-フロロ−オロチン酸(5-FOA)を含有する培地または栄養物上で成育させて、該「ポップアウト」事象を誘発させ；および該変異を含むYAC についてスクリーニングする、請求の範囲第６項に記載の方法。８．該所定の変異が、ヒトタンパク質配列を発現する、請求の範囲第７項に記載の方法。９．該変異がヒト病原性タンパク質配列を発現できるヒト病原性変異である、請求の範囲第７項に記載の方法。 10．APP7171 を含有するエキソン16を、該酵母シャトルベクターpYAC4 内でクローニングする、請求の範囲第６または７項に記載の方法。 11．該YAC が本質的にB142F9、B142F9r、B142F9r670/1、B142F9r717およびB142F 9r670/671/717からなる群から選ばれる、請求の範囲第３項に記載の方法。 12．該幹細胞がC1細胞である、請求の範囲第３項に記載の方法。 13．変異タンパク質配列を発現するマウスを得る方法によって製造されるトランスジェニックマウスであって、該方法が、ａ）変異タンパク質配列を発現する所定の変異を含む遺伝子の一部または全体を得、ｂ）酵母の人工的な染色体(YAC)トランスジェニックを利用して、該遺伝子を胚幹細胞に挿入し、これにより該変異を該ES細胞ゲノム内に導入し、ｃ）該幹細胞を胚盤胞に注入して、該変異タンパク質配列を発現するトランスジェニックマウスを発生させる、工程を含むことを特徴とする上記方法トランスジェニックマウス。 14．変異ヒトアミロイドプリカーサタンパク質(APP)配列を発現することにより特徴付けられる表現型をもつ、トランスジェニックマウス。 15．該表現型が、変異形成されたヒト配列を含み、該変異ヒトAPP 配列をコードする導入遺伝子により与えられる、請求の範囲第14項に記載のマウス。 16．該導入遺伝子が、全APP 遺伝子を含むヒト−由来のYAC に挿入された、APP7 171 変異を含む、請求の範囲第15項に記載のマウス。 17．ａ）酵母の人工的染色体(YAC)中に含まれる遺伝子の一部または全部を得、かつ相同組み換えによって、変異タンパク質配列を発現する所定の変異を導入する工程、およびｂ）トランスジェニック体を使用して、該変異YAC 遺伝子を、マウス胚幹細胞内に挿入し、それによって該変異を該マウスゲノムに導入する工程、を含む方法により修飾されたマウス胚幹細胞。