ES2204922T3

ES2204922T3 - Terapia genica anticancerosa por modulacion de la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria.

Info

Publication number: ES2204922T3
Application number: ES94928924T
Authority: ES
Inventors: Bruce Acres
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1993-09-29
Filing date: 1994-09-28
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2014-09-28
Also published as: EP1156119B9; DE69434708T2; EP1156119A2; AU7815994A; WO1995009241A2; HK1042728B; DE69433060D1; AU709336B2; EP0721510A1; FR2710536A1; EP1156119B1; HK1042728A1; JPH09502993A; EP1156119A3; ATE323774T1; PT1156119E; PT721510E; JP4094053B2; DE69433060T2; DK1156119T3

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE AL USO DE UN VECTOR VIRAL EN CUYO GENOMA SE INSERTA UN FRAGMENTO DE ADN QUE COMPRENDE UNO O VARIOS GENES QUE CODIFICAN TODO O PARTE DE UN AGENTE MODULADOR DE LA RESPUESTA INMUNITARIA Y/O INFLAMATORIA, PARA LA PREPARACION DE UN MEDICAMENTO PARA EL TRATAMIENTO DE LOS CANCERES EN LOS MAMIFEROS. SE REFIERE MAS EN PARTICULAR AL USO DE UN VECTOR VIRAL DERIVADO DE UN POXVIRUS EN CUYO GENOMA SE INSERTA UN GEN QUE CODIFICA UNA CITOQUINA, PARTICULARMENTE UNA INTERLEUQUINA-2, 4, 5, 6 O 7, EL INTERFERON GAMMA, EL FACTOR QUE ESTIMULA LAS COLONIAS O EL FACTOR QUE NECROSA LOS TUMORES DE TIPO {BE}.

Description

Terapia génica anticancerosa por modulación de la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria.

La presente invención se refiere a un método para el tratamiento del cáncer mediante terapia génica. Se refiere, más particularmente, a la utilización de un vector viral para liberar a nivel de las células tumorales, un gen codificante para un agente modulador de la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria.

Generalmente, se admite que el cáncer es una enfermedad que resulta de una pérdida del control de la multiplicación celular. Sus causas pueden ser múltiples y debidas principalmente a un defecto del funcionamiento de los genes celulares (activación de genes potencialmente oncogénicos, por ejemplo por mutación(s) somática(s) de genes normales; desregulación de la expresión de los genes celulares; inhibición de la expresión de los genes supresores de tumores) o en la expresión indeseada de genes virales.

En el transcurso de los últimos 20 años, se ha demostrado que la mayor parte de las células tumorales presentan en su superficie unos antígenos específicos de tumores (antígenos de no-sentido) que no encuentran sus equivalentes en las células normales. Dichos antígenos tumor-específicos son por ejemplo (i) unos antígenos celulares en los que la expresión se mantiene durante el período de feto-embrionario y sufre una regresión en el nacimiento hasta desaparecer, (ii) unos antígenos que se expresan normalmente a un nivel muy bajo y que, expresados a un alto nivel, se caracterizan para un tumor o (iii) antígenos celulares de los que se ha modificado la estructura o la composición.

En principio, la expresión aberrante de estos antígenos tumor-específicos es susceptible de desencadenar una repuesta inmunitaria del mismo tipo que la inducida po cualquier antígeno de no-sentido. Dicho efecto pone en funcionamiento el conjunto de células del sistema inmunitario entre ellas los neutrófilos, linfocitos, monócitos y macrófagos.

De una forma general, existen dos grandes tipos de respuesta inmunitaria: la respuesta de tipo humoral que corresponde a la producción de anticuerpos mediante los linfocitos B y la respuesta inmunitaria por mediación celular con efecto citotóxico, que hace intervenir células efectoras, esencialmente los linfocitos T citotóxicos (T_{c}), células NK (por Natural Killer en inglés) y células fagocitárias. Unas células reguladoras modulan los dos tipos de respuestas inmunitarias: esencialmente los linfocitos T auxiliares (T_{h} por T helper en inglés) y los linfocitos T supresores (T_{s}).

Una respuesta inmunitaria es un fenómeno extremadamente complejo que requiere principalmente la cooperación de diferentes tipos celulares. Dicha cooperación se efectúa por mediación de las citoquinas, que son unas moléculas solubles que intervienen como mediador entre célula y célula.

En lo que se refiere a la inmunidad humoral, los linfocitos B son estimulados por los antígenos de no-sentido en su composición nativa. En respuesta a dicha estimulación, los linfocitos B producen los anticuerpos específicos dirigidos contra los antígenos extraños.

Los linfocitos T, por el contrario, solo pueden ser estimulados por los péptidos, producidos por la degradación de los anticuerpos de no-sentido, presentados a la superficie de las células presentadoras de antígenos (CPA) en asociación con antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH).

La activación de los linfocitos T tiene como efecto desencadenar su amplificación y la puesta en marcha de sus funciones; en particular, la destrucción de las células infectadas o tumorales por los linfocitos citotóxicos.

Únicamente una clase de antígenos denominada super-antígenos, no se presenta de forma convencional. Efectivamente, los super-antígenos son capaces de unirse a las moléculas del CMH sin haber sido previamente degradados en péptidos y pueden activar simultáneamente una cantidad de linfocitos T superior a la que sería activada por vía de los antígenos clásicos. Dichos super-antígenos son, por lo tanto, susceptibles de inducir una fuerte respuesta inmunitaria.

La inflamación se desencadena mediante la respuesta del organismo contra una agresión, por ejemplo una herida o una infección. La respuesta inflamatoria comprende toda una serie de reacciones, principalmente la liberación de moléculas quimiotácticas o quimioatractivas (igualmente designadas con el término quemoquinas) que van a atraer las células del sistema inmunitario en el lugar mismo de la inflamación.

Los linfocitos T activados producen entre otras, unas moléculas inhibidoras de los fenómenos de migración celular, como el MIF (por Migration Inhibition Factor en inglés). Como su nombre indica, el MIF tiene como papel inhibir la migración de los macrófagos, y por consiguiente, favorecer su concentración a nivel del lugar de la inflamación para que ejerzan su función de fagocitosis en unas condiciones óptimas.

En el caso de un cáncer declarado, la respuesta inmunitaria anti-tumoral resulta deficiente, sea porque el sistema inmunitario por él mismo es deficiente, o bien porque los cambios fenotípicos de las células tumorales inhiben o no son suficientes para desencadenar la respuesta inmunitaria.

Con el fin de tratar los cánceres, ya se ha propuesto anteriormente reforzar la respuesta inmunitaria anti-tumoral con la administración a los pacientes, de dosis sistemáticas y repetidas de citoquinas tales como la interleuquina-2 (IL-2), el interferón (IFN_{\gamma}) o el factor necrósante de los tumores (TNF) del tipo \alpha (Rosenberg, 1992, J. Clin. Oncology, 10, 180-199). Desgraciadamente, no se pueden descuidar los efectos secundarios, partiendo de la náusea hasta la muerte. Además, dicho tratamiento resulta extremadamente costoso.

Con el mismo espíritu, se ha propuesto también un método alternativo basado en la transferencia ex vivo de un gen codificante para una molécula inmuno-estimulante, en las células de un paciente; con fines de expresión. Brevemente, (i) se extraen de un paciente, unas células tumorales o linfocitos que infiltran los tumores (TIL por Tumor Infiltrating Lymphocyte en inglés); (ii) se transfectan ex vivo mediante un vector que presenta un gen codificante para una molécula inmuno-estimulante tal como la IL-2, la IL-4, la IL-6 y el TNF\alpha y (iii) se reimplantan en el paciente del que se han extraído.

Como anteriormente, los ensayos clínicos no han dado hasta el momento actual más que resultados modestos, decir insatisfactorios. Numerosos investigadores dan muestras de una baja expresión (Anderson, 1993, Science, 259, 1391-1392). Además, dicho protocolo es muy difícil de aplicar a gran escala. En efecto, se necesita el cultivo en masa de células por cada enfermo a tratar, con los inconvenientes que esto implica desde el punto de vista de los costes, del tiempo y del riesgo. Además, no se puede garantizar la ausencia de expresión de nuevas variantes de antígenos tumorales durante la fase de cultivo in vitro.

Muy recientemente, Plautz et al (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 4645-4649) han presentado la transfección directa in vivo de las células tumorales de ratones por un retrovirus recombinante. Este último fue modificado con el fin de permitir la expresión de un ADN complementario (ADNc) codificante para un antígeno de superficie murino del CMH. El antígeno retenido es alogénico, es decir que presenta una variación genética con respecto al ratón huésped, con el propósito de estimular la respuesta inmunitaria contra las células tumorales que expresan dicho antígeno. Si dicho método suprime la necesidad de establecer una línea celular para cada enfermo, sin embargo, solamente es aplicable a los tumores accesibles por cirugía.

Actualmente, se ha encontrado que un virus de la vacuna administrado a un ratón que desarrolla un tumor, infecta preferentemente los tejidos cancerosos. Cuando el virus de la vacuna es portador de un gen codificante para una molécula inmuno-estimulante, se observa una inhibición del crecimiento de los tumores y en determinados casos una regresión completa.

El documento WO92/20356 describe la utilización del virus de la vacuna que expresa diversos genes codificantes para unos antígenos específicos del tumor y de las moléculas que actúan como moduladoras de la respuesta inmunitaria de los citoquinas o de los antígenos del complejo mayor de la histocompatibilidad para el tratamiento de los cánceres en el hombre.

Por lo que se añade a la presente invención, la misma se refiere a la utilización de un vector viral derivado de un virus de la vacuna en el genoma del cual se inserta un fragmento de ADN que presenta uno o varios genes codificantes por lo menos un agente que interviene en la destrucción de las células cancerígenas, por ejemplo, un agente tóxico para las células cancerígenas o un agente modulador de la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria; para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en los mamíferos, destinado a ser administrado por vía intravenosa o intramuscular.

Por "vector viral", se entiende un virus cuyo genoma se ha modificado de tal manera para permitir la transferencia y la expresión de un gen de interés en una célula eucariota. Un vector viral que se puede utilizar en la presente invención, puede ser derivado principalmente de un poxvirus, de un virus del herpes, de un retrovirus o de un adenovirus. Ventajosamente, se tratará de un vector no-integrante, no replicativo y para el que la célula-huésped de origen no es humana, como por ejemplo el poxvirus del canario. Tales vectores así como sus técnicas de preparación con conocidos por la persona experta en la técnica.

Tratándose de un vector derivado de un adenovirus, éste se constituirá preferentemente por el genoma completo del adenovirus o al menos desprovisto del gen E1A situado en el extremo 5' y codificante para una proteína trans- activadora esencialmente en la réplica del adenovirus. Por lo tanto, se propagará en una línea celular de complementación que proporciona en trans el producto de expresión del gen E1A. Hay que decir que se pueden modificar o deleccionar otras regiones del genoma adenoviral, en particular de la región E3 no esencial y, de forma alternativa, las otras regiones esenciales para la replicación viral en la medida en que las funciones faltantes sean complementadas en trans. Tal vector comprende al menos las secuencias esenciales para la encapsidación, a saber los ITRs (Inverted Terminal Repeat) 5' y 3' y la región de encapsidación. Los diferentes vectores adenovirales así como sus técnicas de preparación son convencionales y se presentan en Graham y Prevect (Methods in Molecular Biology, vol 7, p 109-128; Ed: E.J. Murey, The human Press Inc.).

Según una forma particularmente preferida, un vector viral útil para los fines de la presente invención se deriva de un poxvirus, especialmente de un virus de la vacuna o de un poxvirus de aves, tal como el poxvirus del canario, se prefiere este último.

Se han descrito las condiciones generales de obtención de un virus de la vacuna capaz de expresar un gen heterólogo, en la patente europea EP 83 286 y en la solicitud EP 206 920. Según una forma ventajosa, dicho fragmento de ADN se insertará en el gen TK del virus de la vacuna, con el fin de inactivar el gen viral y facilitar la selección de los virus recombinantes de la vacuna.

Conforme con los objetivos perseguidos por la presente invención, un vector viral puede además comprender un bloque de expresión de un gen marcador de la selección con el fin de facilitar las etapas de aislamiento y de purificación del virus recombinante. Se puede citar principalmente el gen Neo que confiere la resistencia al antibiótico G418 o al gen TK del virus del herpes simple del tipo 1 (HSV-1) que confiere la sensibilidad a ciertos análogos de nucleósidos tales que el ganciclovir o el aciclovir.

Tal vector viral puede igualmente incluir un gen distinto de los que se definen a continuación, y que puede actuar de forma cooperativa con el efecto modulador de la reacción inmunitaria y/o inflamatoria buscada. Se tratará, ventajosamente, de un gen codificante para todo o para una parte de un antígeno específico de los tumores. Se pueden citar más particularmente las proteínas E6, E7 del virus HPV, principalmente del tipo 16 ó 18 implicadas en los cánceres de útero, la proteína MUC1 y, más particularmente la región repetida de la última, implicada en los cánceres de pecho y por fin el antígeno GA. 733.2 implicado en los cánceres colorectales. Las secuencias codificantes para dichos antígenos se describen en la técnica anterior. Está al alcance del profesional aislarlos, por ejemplo por la técnica del PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando bases complementarias, insertándolas en el vector viral retenido en consigna o como soporte del gen modulador y colocarlos bajo el control de los elementos necesarios para su expresión.

Para los fines de la presente invención, se introduce un fragmento de ADN que presenta uno o varios genes codificantes para todo o parte de un agente modulador de la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria, denominado a continuación como agente modulador, en un vector viral, un vehículo de transferencia y de expresión del (de los) dicho(s) gen(es). Los métodos para insertar un fragmento del ADN en un vector viral son conocidos por la persona experta en la técnica.

Por otra parte, el gen codificante para un agente modulador puede ser del tipo genómico (que presenta todo o una parte del conjunto de los intrones del gen natural), del tipo ADN complementario (ADNc) desprovisto del intrón o del tipo minigen es decir mixto presentando al menos un intrón. Puede codificar para un agente modulador nativo como el encontrado en un mamífero, para una parte de éste último, para una molécula quimérica que procede de la fusión de las secuencias de origen diverso o un mutante que presenta las propiedades biológicas mejoradas o modificadas, a condición de que dichas moléculas ejerzan una función inmunomoduladora o moduladora de la respuesta inflamatoria. Tal mutante puede obtenerse por mutación, delección, substitución y/o adición de uno o más nucleótido(s) del gen codificante para dicho agente modulador. El gen en cuestión puede codificar para (i) una molécula soluble, ya sea intracelular o bien segregada en el medio exterior o (ii) una molécula anclada en la membrana y por lo tanto, presente en la superficie de las células que la expresan.

Los genes codificantes para un agente modulador pueden obtenerse por clonación, por PCR o por síntesis química según las técnicas convencionales comúnmente utilizadas.

Bien entendido, el fragmento de ADN puede comprender elementos adecuados de regulación de la transcripción así como unas señales de iniciación y de terminación de la traducción permitiendo la expresión del o de los gen(es) codificantes para un agente modulador. Entre dichos elementos, la región promotora reviste una importancia particular.

De una forma general, tendremos acceso a una región promotora funcional en las células de mamífero que queremos tratar, preferentemente en las células humanas. Puede tratarse de la región promotora que regula naturalmente la expresión de dicho gen o de una región promotora de origen diferente, por ejemplo obtenida de genes eucariotas o virales. Por otra parte, la región promotora se puede modificar para contener unas secuencias reguladoras, por ejemplo un elemento activador de la transcripción (enhancer) o secuencias que responden a determinadas señales celulares.

La región promotora retenida podrá ser constitutiva o regulable, y en éste último caso, regulable en respuesta a ciertas señales celulares, tejido-específicas o sucesos específicos. Resultará ventajoso utilizar una región promotora tejido-específica, cuando el tumor a tratar se obtiene de un tipo celular particular. De forma alternativa, la utilización de un promotor que responde a unas señales específicas tumorales (por ejemplo, regulable por la presencia de factores de crecimiento generalmente liberados por las células tumorales) puede resultar ventajoso puesto que la expresión se limitará a las células tumorales.

Tales promotores son generalmente conocidos la persona experta en la técnica. Se pueden citar principalmente los promotores SV40 (Virus Simian 40), HMG (Hydroxy-Methyl-Glutaryl-coenzyme A), TK (Thymidine Kinase), los LTRs (Long Terminal Repeat) del RSV (Rous Sarcoma Virus), del Mo-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus), el MLP (Major Late Promoter) del adenovirus, los promotores 7,5K y H5R del virus de la vacuna, los promotores hígado-específicos de los genes de l'\alpha 1 antitripsina, de la albúmina, del factor IX de la coagulación y de la transferrina y los promotores de los genes de las inmunoglobulinas que permiten la expresión de los genes que gobiernan en los linfocitos. Dichos ejemplos no son limitativos.

En el marco de la presente invención, un fragmento de ADN puede presentar uno o varios gen (es) que codifican para un agente modulador que se pueden sustituir bajo el control de los elementos permitiendo su expresión, de forma independiente o común. En otros términos, el fragmento de ADN podrá contener uno o varios casetes de expresión de uno o varios genes que codifican para un agente modulador.

Por otra parte, el fragmento de ADN puede igualmente incluir una secuencia señal permitiendo la secreción del agente modulador en cuestión fuera de la célula. Puede tratarse de la secuencia señal natural del gen que codifica para dicho agente modulador o bien de una secuencia señal heteróloga funcional en las células eucariotas, por ejemplo la secuencia señal del gen codificante para la transferrina o la \alpha1 antitripsina.

Por agente modulador de la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria, se entiende toda molécula que principalmente sea capaz:

- de estimular una respuesta inmunitaria humoral, activando los linfocitos B, con el fin de amplificar la producción de anticuerpos dirigidos contra los antígenos específicos de los tumores;

- de estimular una respuesta inmunitaria por mediación celular, activando los linfocitos T, con el fin de desencadenar una respuesta citotóxica o del tipo hipersensible retrasada (DTH) significativa en contra de las células tumorales;

- de inducir o de estimular una respuesta inflamatoria, con el fin de drenar las células del sistema inmunitario al nivel del lugar tumoral; o

- de inhibir los fenómenos de migración celular, con el fin de conservar las células del sistema inmunitario en el lugar mismo o próximo al lugar tumoral.

Una molécula que presenta una o varias funciones definidas anteriormente, se puede seleccionar principalmente de entre (I) los citoquinas, (II) las moleculas co-estimulantes de la superficie celular, (III) las quemoquinas, (IV) los anticuerpos monoclonales dirigidos contra los marcadores de superficie linfocitaria, (V) los super-antígenos característicos de un organismo infeccioso (bacteria, virus o parásito) y (VI) los polipéptidos con función adyuvante.

(I)

Unas citoquinas ventajosas para los fines de la presente invención, son las producidas por las células del sistema inmunitario, principalmente los linfocitos y los macrófagos o bien sus células madre progenitoras y que intervienen en la activación de las células del sistema inmunitario, el transporte de señales entre las células del sistema inmunitario y la diferenciación celular de las células madre en las células maduras de la circulación sanguínea.

Como citoquinas útiles para los fines de la presente invención, se mencionan principalmente:

(1) Las interleuquinas (IL). En el momento actual, se han identificado 16 interleuquinas. Resulta particularmente difícil atribuirles una función específica porque ejercen efectos pleitropos. En el marco de la presente invención, todas las interleuquinas presentan un interés, pero se cita más particularmente:

-: La IL-1, que se produce por los macrófagos como consecuencia de una estimulación por los compuestos bacterianos. Su papel se ejerce a nivel de la activación linfocitaria. La IL-1 es también una molécula pro-inflamatoria y a dicho título induce la producción de quemoquinas.

-: La IL-2, que es responsable de la proliferación de los linfocitos T activados, y que, en asociación con el IFN\gamma, estimula la producción de anticuerpos por los linfocitos B. Además, ciertos estudios tienden a mostrar que tiene un papel quimiotáctico para los linfocitos cuando se produce a nivel de un tumor.

-: La IL-4, que se produce por los linfocitos T activados y estimula el crecimiento de los linfocitos B y, en algunos casos, los linfocitos T.

-: La IL-5, que favorece la multiplicación y la diferenciación de los leucocitos eosinófilos así como, en una mínima medida, la producción de anticuerpos.

-: La IL-6, que se produce por los macrófagos y los linfocitos T. Tiene un efecto pleïtrópico e interviene entre otros como estimulante de la actividad citotóxica de los linfocitos T y de la producción de anticuerpos. Se trata igualmente de una molécula pro-inflamatoria.

-: La IL-7, que se produce por las células del estroma de la médula ósea e interviene en la proliferación de los linfocitos pre-B y -T.

-: La IL-12, se produce por los macrófagos activados e induce la producción del IFN\gamma.

(2) Los interferones (IFN), que presentan unas propiedades antivirales e inmunomoduladoras. Pueden activar las células fagocitarias y aumentan la expresión de los antígenos de superficie de clase I y II del CMH y estimular igualmente la citotoxicidad de las células NK contra las células tumorales. Existen tres clases principales de IFNs, cada una presenta un interés en el ámbito de la presente invención. Dichas diferentes clases,respectivamente \alpha, \beta y \gamma, comprenden cada una numerosos subtipos.

(3) Los factores que estimulan las colonias CSF (por Colony Stimulating Factor en inglés), que intervienen a nivel de la maduración de las células madre hematopoiéticas y su diferenciación en células maduras de la circulación sanguínea. Se distinguen los GM-CSF, G-CSF y M-CSF (por Granulocyte-Macrophage, Granulocyte y Macrophage respectivamente) según el estadio de maduración y el tipo celular sobre el que dichos factores ejercen su influencia.

(4) Los factores necrosantes de los tumores (TNF). Se distingue el TNF\alpha producido por los macrófagos y el TNF\beta producido por los linfocitos T. Los dos son responsables de la actividad citotóxica antitumoral de los macrófagos y linfocitos y de la alteración tisular local observada en la reacción inflamatoria.

(5) Los factores MIF, que inhiben la migración de los macrófagos.

(6) Los fragmentos C5a del complemento, que es un factor quimiotáctico de los macrófagos.

Para los fines de la presente invención, se prefieren particularmente, la IL-2, la IL-4, la IL-5, la IL-6, la IL-7, el IFN\gamma, el GM-CSF y el TNF\beta.

(II)

Las moléculas co-estimulantes son unas moléculas presentes en la superficie celular que participan de una forma indirecta en la reacción inmunitaria y/o inflamatoria; por ejemplo, unas moléculas que intervienen en el proceso de presentación del antígeno bajo una forma reconocida por las células del sistema inmunitario.

Como moléculas co-estimulantes útiles para los propósitos de la presente invención, se mencionan principalmente:

(1) Los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). En el hombre, la mayor parte de las células nucleadas expresan en su superficie unas cantidades variables de antígenos de clase I, mientras que los antígenos de clase II presentan una distribución restringida a los linfocitos B, células fagocitarias y linfocitos T activados. Dichos marcadores de superficie celular están implicados en los fenómenos de reconocimiento inmune, principalmente tal como se ha descrito anteriormente, en la interacción entre linfocitos T y células CPA y entre linfocitos T_{c} y células diana que presentan en su superficie unos antígenos de no-sentido. Se puede, por lo tanto, pensar que la intensidad de la respuesta inmunitaria se puede mejorar aumentando la expresión de los antígenos del CMH en el lugar tumoral.

(2) Los ligandos de los marcadores en el hombre CD27, CD28, CD30 y CD40. En particular, el ligando del marcador CD40 se sitúa en la superficie de los linfocitos T activados y está implicado en la estimulación y la proliferación de los linfocitos B. Por otra parte, unos estudios in vitro han demostrado que los ligandos de los marcadores CD27 y CD30 inducen la proliferación de los linfocitos T. En cuanto al ligando del marcador CD28, aún denominado por determinados autores como proteína B7, se sintetiza por las CPA e interviene en el reconocimiento de las células diana que presentan unos antígenos de no- sentido en su superficie por las células NK permitiendo de este modo su destrucción.

(3) El antígeno de función linfocitária de tipo 1 LFA-1 (por Leukocyte Function Antigen en inglés). Se trata de un receptor de superficie común a todos los leucocitos y asimismo presente sobre los macrófagos, que juega un papel importante en los fenómenos de adhesión celular no específica. Estos últimos intervienen en el proceso de quimiotactismo participando en la migración de las células del sistema inmunitario hacia un lugar inflamatorio.

(4) La molécula de adhesión intercelular de tipo 1 (ICAM-1) presente en la superficie de numerosos tipos celulares. ICAM-1 es uno de los ligandos de la molécula LFA-1.

(III)

Tal como se ha presentado anteriormente, las quemoquinas son unas moléculas sintetizadas próximas o a nivel de un sitio inflamatorio y que drenan las células del sistema inmunitario hacia dicho lugar. De una forma general, las quemoquinas actúan mediante unas interacciones entre por una parte, unas moléculas de adhesión presentes en la superficie de los leucocitos y por otra parte unas moléculas de adhesión presentes en la superficie de las células endoteliales (por ejemplo LFA-1 y ICAM-1). El anclaje de los leucocitos a las células endoteliales de la pared vascular se sigue a través de su migración hacia el lugar inflamatorio.

Como quemoquinas útiles para los fines de la presente invención, se menciona principalmente:

(1) El PF-4 (por Platelet Factor-4 en inglés; Denel et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 2256):

(2) El RANTES, factor quimiotáctico de los diferentes tipos de leucocitos (Schall et al., 1988, J. Immunol., 141, 1018); y

(3) El ACT-2 (Ziptel et al., 1989, J. Immunol., 142, 1587). Se trata de una proteína que favorece la adhesión de los linfocitos T que interviene en el reconocimiento del antígeno asociado a las moléculas de clase I del CMH.

(IV)

Un anticuerpo monoclonal útil para los fines de la presente invención se dirige por ejemplo, contra el marcador de la superficie celular CD2, CD3, CD28 o CD40. En efecto, determinados estudios han mostrado el papel de tal anticuerpo en la estimulación de la proliferación de los linfocitos T.

(V)

Un super-antígeno útil para los fines de la presente invención es por ejemplo, la nucleoproteína del virus de la rabia o una enterotoxina bacteriana, producida principalmente por una bacteria del género Staphylococcus.

(VI)

Un adyuvante de naturaleza polipeptídica, útil para los fines de la presente invención es por ejemplo, un producto de expresión de un gen bacteriano "layer" 20S.

El medicamento derivado de la presente invención se destina al tratamiento de un cáncer en los mamíferos, más particularmente en el hombre. Los cánceres que podrían ser asimismo tratados son, ventajosamente, los tumores sólidos tales como los cánceres de pecho, de pulmón y de colon. Se indica que tal tratamiento debería, más particularmente, permitir tratar los tumores secundarios que son unas complicaciones frecuentes presentadas en numerosos tipos de cáncer y para las que actualmente no existe una terapia satisfactoria.

El medicamento derivado de la presente invención se puede administrar según cualquier vía general que se utiliza habitualmente, principalmente por vía parenteral tal como la vía sistémica, intramuscular, sub-cutánea o intraperitoneal. De una forma general, la vía intravenosa se indica por resultar particularmente ventajosa. Alternativamente, en el caso de un tumor accesible, el medicamento puede asimismo administrarse por inyección directa en el lugar del tumor o por aplicación tópica. De una forma general, la administración puede producirse en una dosis única o repetida, uno o varia veces después de un determinado intervalo de tiempo.

Según una forma de realización preferida de la invención, el medicamento comprenderá, además una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho vector viral, un soporte aceptable desde un punto de vista farmacéutico. Puede asimismo comprender un vehículo, un diluyente o un adyuvante aceptable desde un punto de vista farmacéutico y presentarse en forma líquida o liofilizada.

La dosificación adecuada varía en función de los diferentes parámetros, por ejemplo de la vía de administración, del individuo a tratar, de la naturalezza y de la gravedad del estado tumoral, del tipo de vector viral utilizado o más del gen o genes codificando para el agente modulador. Uno de los criterios que permite evaluar la dosificación adecuada es la medición de la actividad sérica del agente modulador. Dichos ensayos son unos ensayos estándar. En particular, se puede citar el ensayo de bioactividad en la IL-2 (Gillis et al, 1978, J. Immunol., 120, 2027-2032).Sin embargo, en general la dosis de vector viral/kilo será de 10^{4} a 10^{11}, ventajosamente 10^{7} y 10^{10} y preferentemente de 10^{7} a 10^{9} unidades formantes de colonias (upf)/kilo.

Por último, la presente invención se refiere asimismo a:

(i) la utilización de un vector viral que presenta un tropismo positivo por las células cancerosas, en cuyo genoma se inserta un fragmento de ADN que presenta uno o varios genes codificando para por lo menos un agente que interviene en la destrucción de las células cancerosas, por ejemplo un agente modulador de la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria, situada bajo el control de los elementos necesarios para la expresión, principalmente para liberar de manera especifica dicho agente a nivel del tumor canceroso;

(ii) un método de tratamiento del cáncer en los mamíferos, según el que se inyecta a un individuo que precisa tal tratamiento, una cantidad eficaz desde un punto de vista farmacéutico de un vector viral en cuyo genoma se inserta un fragmento de ADN que presenta uno o varios genes que codifican para por lo menos un agente que interviene en la destrucción de las células cancerosas, por ejemplo un agente modulador de la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria; y

(iii) un método para liberar de un manera específica un agente que interviene en la destrucción de las células cancerosas, por ejemplo un agente modulador de la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria, según el que se administra por vía general un vector viral en cuyo genoma se inserta un fragmento de ADN que presenta uno o varios genes codificando para todo o parte de dicho gen.

La presente invención se ilustra con los ejemplos siguientes, sin por ello limitarse a los mismos:

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de los virus recombinantes de la vacuna portadores de un gen codificante para una citoquina

Las construcciones descritas a continuación se realizaron según las técnicas generales de ingeniería genético y de clonación molecular descritos en el Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). El conjunto de las etapas de clonación utilizando unos plásmidos bacterianos se lleva a cabo por pase de la cepa Escherichia coli (E. Coli) 5K o XL1-Blue (Stratagène), mientras que las que utilizan unos vectores derivados del fago M13 se realizan en E. coli NM522.

En lo que se refiere a las mutagénesis dirigidas por oligodesoxinucleótidos sintéticos, se aplica el protocolo descrito por Zoller y Smith (1982, Nucleic Acids Res., 10, 6487) en la que se utiliza el kit comercial según las recomendaciones del fabricante.

Los fragmentos de ADN que presentan los genes codificantes para el GM-CSF, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-7, se someten a una etapa de mutagénesis dirigida con el fin de introducir los sitios de restricción adecuados en vistas a su inserción en un vector de transferencia, después del promotor de 7,5 K del virus de la vacuna. Se utilizan dos vectores de transferencia: pTG186-poli (descrito en la solicitud de patente EP 206 920) y pTG194. Este último difiere del pTG186-poli en la orientación del polilinker.

Más precisamente:

Un fragmento que presenta el ADNc codificante para el GM-CSF murino tal como se ha descrito en Gough et al. (1984, Nature, 309, 763) se somete a una mutagénesis dirigida después de la clonación en M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene, 26, 91), con el fin de crear el sitio BamH1 en posición -17 en relación con el ATG iniciador de la traducción. El fragmento BamH1-SalI aislado del vector resultando insertado entre los mismos sitios de pTG194.

Un fragmento EcoRI-BamHI que presenta el ADNc codificante para la IL-4 murina tal como se ha descrito en Lee et al. (1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2061) se introduce en el vector M13TG130 y después se somete a una mutagénesis dirigida, con el fin de crear un sitio BglII inmediatamente antes del ATG iniciador de la traducción. El vector tratado de este modo, se digiere por EcoRI y BglII y el fragmento correspondiente se introduce entre los mismos sitios de pTG194.

Un fragmento EcoRI-BamHI que presenta el ADNc codificante para la IL-5 murina tal como se ha descrito en Kinashi et al. (1986, Nature, 324,70) se subclona primeramente en el vector M13TG130 y después se somete a una mutagénesis dirigida, con el fin de introducir un sitio PstI en posición -10 y una A en posición -3 en relación con el ATG iniciador de la traducción. El vector tratado de este modo, se digiere por EcoRI y PstI y el fragmento correspondiente se inserta entre los mismos sitios de pTG186-poli.

Un fragmento EcoRI que presenta el ADNc codificante para la IL-6 murina tal como se ha descrito en Van Snick et al. (1988, Eur. J. Immunol., 18, 193) se subclona en el vector M13TG131 (Kieny et al., supra) y se somete a una mutagénesis dirigida, con el fin de introducir un sitio BamHI en posición -9 y una A en posición -3 en relación con el ATG iniciador de la traducción. El vector tratado de este modo, se digiere por EcoRI y BamHI y el fragmento correspondiente se inserta entre los sitios BamHI y EcoRI de pTG194.

Un fragmento SstI-HindIII que presenta el ADNc codificante para la IL-7 murina tal como se ha descrito en Naman et al. (1988, Nature, 333, 571) se subclona en el vector M13TG130 y después se somete a una mutagénesis dirigida, con el fin de crear un sitio EcoRV en posición -11 y un A en posición -3 en relación con el ATG iniciador de la traducción. Se aísla un fragmento EcoRV-PstI del vector obtenido de este modo que se clona entre los sitios SmaI y PstI del pTG194.

Con la ayuda de los vectores de transferencia obtenidos de este modo, se producen los virus de la vacuna correspondientes según el método de recombinación homóloga descrito por Kieny et al., (1984, Nature, 312, 163). Los virus recombinantes obtenidos de este modo se denominan VV-GM-CSF, VV-IL-4, etc..

Se han descrito con anterioridad otros virus recombinantes de la vacuna; en particular los que presentan el ADNc codificante (i) para la IL-2 humana (solicitud de patente EP 206 939), (ii) para la IL-6 humana (Nakagawa et al., 1991, Eur. Cytokine Net., 2, 11-16) y (iii) para el IFN\gamma humano (solicitud de patente EP 206 920).

Ejemplo 2 Tratamiento de ratones Swiss nude portadores de tumores con un virus de la vacuna que presenta el gen codificante para la IL-6 (VV-IL-6) 1.Preparación de los ratones Swiss nude portadores de tumores

La línea celular SW948 (ATCC CCL 237) generada a partir de un tumor humano colorectal se cultiva en cultivo continuo según las recomendaciones del proveedor. Las células que se recogen se tratan con tripsina y después con desoxiribonucleasa (10 \mug/ml) durante 5 min. A continuación, se lavan con PBS (tampón fosfato salino Dulbecco; Sigma, D5652) y se resuspenden en el mismo tampón a la concentración de 10^{7} células/100 \mul.

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Unos ratones hembras Swiss nude (Iffa credo, Francia) de 6 a 8 semanas de edad, reciben cada una 100 \mul de la suspensión celular obtenida de este modo, por vía subcutánea. Siete días más tarde, se seleccionan los ratones portadores de tumores palpables.

2. Ensayo

Dichos ratones se dividen en unos lotes de ocho aproximadamente. Se destinan dos lotes como lotes control: los ratones reciben o bien 10^{7}, o bien 10^{8} upf de un virus de la vacuna no recombinante, TK-, generada a partir de un vector de transferencia pTG186-poli (VV-186). Los ratones del tercer lote (lote-control negativo) reciben únicamente 100 \mul de PBS. Por último, los ratones de los otros dos lotes reciben o bien 10^{7}, o bien 10^{8} upf de VV IL-6 murina obtenida en el ejemplo 1.

Los virus se administran en solución de PBS, por vía intravenosa a través de la cola.

Siete días después de las inyecciones, se retiran 3 ratones de cada uno de los lotes, y se sacrifican para analizar el contenido viral de sus sangres, órganos y tumores, tal como s explica a continuación.

Los tumores y diferentes órganos (hígado, bazo, cerebro, etc..) una vez extraídos, se tratan con tripsina y se disgregan mecánicamente hasta obtener una suspensión. La sangre extraída se diluye volumen a volumen en un tampón PBS que contiene 20 mM de EDTA.

Las células obtenidas de este modo, se lavan dos veces con PBS, se resuspenden en un medio de cultivo MEM Dulbecco (Modified Eagles Medium; Gibco BRL) que comprende 10% de suero bovino fetal. Se estima el número de células (viables y no viables) por recuento según los métodos clásicos. Después, se efectúan unas diluciones en serie de 10 en 10 en un tampón de PBS. Se añade 1 \mul, 10 \muL o 100 \mul de cada una de las diluciones en unos cultivos de células BHK establecidos en placas de petri de 3 cm de diámetro (Falcon 3001). Las placas se incuban toda la noche a una temperatura de 37ºC al 5% de CO_{2} y se cuentan las colonias de lisis al día siguiente.

En lo que se refiere a los ratones no sacrificados, se registra la evolución del crecimiento de los tumores a lo largo del tiempo, midiendo la longitud, el ancho y la profundidad de los tumores con la ayuda de un pie de rey. El volumen de cada tumor se calcula aplicando la fórmula de elipsoides 4/3 \pi r_{1}r_{2}r_{3}, en la que r_{1}, r_{2} y r_{3} representan respectivamente la longitud, el ancho y la profundidad reducidas a la mitad.

3. Resultados

Cualquiera que sea el tipo de virus inyectado, se constata que la tasa de infección de las células tumorales resulta muy superior a la de los tejidos sanos.

El crecimiento de los tumores de los ratones que han recibido el VV-IL-6, cualquiera que sea la dosis, resulta inferior en relación con el de los lotes control y del control negativo. Unos ratones presentan una regresión total de los tumores aproximadamente 15 días después de la administración de VV-IL-6.

Ejemplo 3 Tratamiento de ratones DBA/2 portadores de tumores con un virus de la vacuna que presenta el gen codificante para la IL-2 (VV-IL-2)

Se repite el Ejemplo 2 utilizando:

(i): el virus de la vacuna que presenta el gen codificante para la IL-2 humana, tal como se ha descrito en la solicitud de patente EP 206 939;

(ii): la línea celular murina P815 (ATCC TIB 64) derivada de un mastocitoma de ratón DBA/2; y

(iii): unos ratones hembras DBA/2 (Iffa Credo, Francia) de 6 a 8 semanas de edad.

Las variantes son tal como sigue: se inyectan a los ratones DBA/2 10^{5} células P815 en un volumen de 100 \mul. Se inyectan 10^{8} upf de virus a los ratones de cada uno de los lotes. Los ratones destinados a los análisis biológicos se retiran de los lotes 3 días después de la inyección.

Se observan unos resultados comparables a los que se presentan en el Ejemplo 2.

Ejemplo 4 Tratamiento de ratones DBA/2 portadores de tumores con un virus de la vacuna que presenta el gen codificante para el GM-CSF (VV-GM-CSF)

Se repite el ejemplo 3 utilizando 10^{8} upf de VV-GM-CSF. Se registra la evolución del crecimiento de los tumores a lo largo del tiempo tal como se indica en el Ejemplo 1. Tal como en el anterior, se observa en algunos animales del lote ensayo, una ralentización del crecimiento de los tumores en relación con los lotes control y al control negativo. Tres ratones de 10 presentan una regresión total de los tumores 15 días después de la administración del vector viral.

Claims

1. Utilización de un vector viral derivado de un virus de la vacuna, en cuyo genoma se inserta un fragmento de ADN que presenta uno o varios genes que codifican para todo o una parte de un agente modulador de la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria seleccionado de entre las moléculas co-estimulantes de la superficie celular, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en los mamíferos destinado para ser administrado por vía intravenosa o intramuscular.

2. Utilización de un vector viral según la reivindicación 1, en la que las moléculas co-estimulantes de la superficie celular se seleccionan de entre los antígenos de las clases I y II del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), los ligandos de los marcadores CD27, CD28, CD30 y CD40, el antígeno de función linfocitária del tipo 1 (LFA-1) y la molécula de adhesión intercelular de tipo 1 (ICAM-1).

3. Utilización de un vector viral según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en el hombre.

4. Utilización de un vector viral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor canceroso sólido en los mamíferos.

5. Utilización de un vector viral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el vector presenta además un gen codificante para un antígeno específico del tumor.

6. Utilización de un vector viral derivado de un virus de la vacuna que presenta un tropismo positivo para las células cancerosas, en cuyo genoma se inserta un fragmento de ADN que presenta uno o varios genes que codifican para por lo menos un agente que interviene en la destrucción de las células cancerosas, situado bajo el control de los elementos necesarios para la expresión, para la preparación de un medicamento destinado para ser administrado por vía intravenosa o intramuscular.

7. Utilización de un vector viral según la reivindicación 6, en cuyo genoma se inserta un fragmento de ADN que presenta uno o varios genes que codifican para un agente modulador de la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria, situado bajo el control de los elementos necesarios para la expresión, para liberar de forma específica dicho agente modulador de la respuesta inmunitaria y/o inflmatoria a nivel de un tumor canceroso.

8. Utilización de un vector viral según la reivindicación 7, en la que dicho agente modulador de la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria se selecciona de entre las moléculas co-estimulantes de la superficie celular, las quemoquinas, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra unos marcadores de la superficie linfocitária, los super-antígenos característicos de un organismo infeccioso (bacteria, virus o parásito), y los polipéptidos a modo de adyuvante.

9. Utilización de un vector viral según la reivindicación 8, en la que las moléculas co-estimulantes de superficie celular se seleccionan de entre los antígenos de clases I y II del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), los ligandos de los marcadores de los marcadores CD27, CD28, CD30 y CD40, el antígeno de función linfocitaria del tipo 1 (LFA-1) y la molécula de adhesión intercelular del tipo 1 (ICAM-1).

10. Utilización de un vector viral según la reivindicación 8, en la que las quemiquinas se seleccionan de entre el PF-4 (Platelet Factor-4), el RANTES y el ACT-2.

11. Utilización de un vector viral según la reivindicación 1, en la que los anticuerpos monoclonales se seleccionan de entre los anticuerpos monoclonales anti-CD2, anti-CD3, anti-CD28 y anti-CD40.

12. Utilización de un vector viral según la reivindicación 6, en la que dicho agente que interviene en la destrucción de las células cancerosas es una citoquina.

13. Utilización de un vector viral según la reivindicación 12, en la que las citoquinas se seleccionan de entre las interleuquinas, los interferones, los factores que estimulan las colonias (CSF), los factores necrosantes de los tumores (TNF), los factores que inhiben la migración de los macrófagos (MIF) y el fragmento C5a del complemento.

14. Utilización de un vector viral según la reivindicación 13, en la que las citoquinas se seleccionan de entre las interleuquinas 2, 4, 5, 6 y 7, el interferón gamma, el factor estimulante de las colonias de tipo granulocito-macrófago (GM-CSF) y el factor necrosante de los tumores de tipo \beta (TNF \beta).

15. Utilización de un vector viral según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, en la que el vector viral presenta además un gen codificante para un antígeno específico del tumor.

16. Utilización de un vector viral según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en el hombre.

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17. Utilización de un vector viral según una de las reivindicaciones 6 a 16, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor canceroso sólido en los mamíferos.