ES2204963T3 - Enzimas degradadoras de arabinoxilano. - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONAN METODOS Y CONSTRUCCIONES DE EXPRESION PARA LA CLONACION Y SOBREEXPRESION DE UNA ENZIMA DEGRADANTE DE ARABINOXILAN DE ORIGEN FUNGICIDA, EN UNA CELULA DE RETENCION DE MICROBIOS SELECCIONADOS. LA ENZIMA SE PRESENTA PARA SER ACTIVADA EN LA DEGRADACION DE SOLIDOS INSOLUBLES EN AGUA OBTENIDOS DE MAIZ. LA ENZIMA PUEDE SER USADA EN LA PREPARACION DE COMPUESTOS ALIMENTICIOS PARA ANIMALES, COMIDA HUMANA O PROCESOS INDUSTRIALES.

Description

Enzimas degradadoras de arabinoxilano.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular. Más en particular, la presente invención se refiere a la clonación y expresión de genes que codifican polipéptidos que muestran actividad degradadora de arabinoxilano. Estas enzimas se usan adecuadamente en procesos industriales tales como la fabricación de pan, el procesamiento del papel y de la pasta, y en la preparación de piensos y alimentos (aditivos).

Fundamento de la invención

La composición de una pared celular vegetal es compleja y variable. Los polisacáridos se encuentran principalmente en forma de largas cadenas de celulosa (el principal componente estructural de la pared celular vegetal), hemicelulosa (que comprende varias cadenas de \beta-xilano), y pectina. La existencia, la distribución y los aspectos estructurales de los polisacáridos de la pared celular vienen determinados por (1) la especie vegetal; (2) la variedad; (3) el tipo de tejido; (4) las condiciones de crecimiento; (5) el envejecimiento y (6) el procesamiento del material vegetal antes de alimentación.

Existen diferencias básicas entre monocotiledóneas (p. ej. cereales y pastos) y dicotiledóneas (p. ej. trébol, colza y soja), y entre la semilla y las partes vegetativas de la planta (Chesson, 1987; Carré y Brillouet, 1986).

Las monocotiledóneas se caracterizan por la presencia de un complejo de arabinoxilano como principal esqueleto de hemicelulosa. La estructura principal de la hemicelulosa en las dicotiledóneas es un complejo de xiloglucano. Además, se encuentran concentraciones de pectina más elevadas en las dicotiledóneas que en las monocotiledóneas. Las semillas tienen generalmente un contenido en sustancias pécticas muy alto, pero relativamente bajo en material celulósico.

En la pared celular pueden distinguirse tres estructuras de polisacárido más o menos interrelacionadas:

(1)

La lamela media forma la pared celular externa. Sirve también como punto de fijación para las células individuales entre sí, dentro de la matriz del tejido vegetal; la lamela media consiste principalmente en sales de calcio de pectinas altamente esterificadas.

(2)

La pared primaria está situada justo dentro de la lamela media. Es una estructura bien organizada de microfibrillas de celulosa incrustadas en una matriz amorfa de pectina, hemicelulosa, ésteres fenólicos y proteínas.

(3)

La pared secundaria se forma a medida que madura la planta. Durante el crecimiento de la planta y la fase de envejecimiento, se depositan microfibrillas de celulosa, hemicelulosa y lignina.

La pared celular primaria de células vegetales maduras metabólicamente activas (p. ej. mesófilo y epidermis) es más susceptible a la hidrólisis enzimática que la pared celular secundaria, que en esta etapa se ha vuelto muy lignificada.

Hay un alto grado de interacción entre celulosa, hemicelulosa y pectina en la pared celular. La degradación enzimática de estas estructuras de polisacárido más bien intensamente entrecruzadas no es un proceso simple. Al menos se necesitan cinco enzimas diferentes para romper completamente un arabinoxilano, por ejemplo. La endo-segmentación se efectúa mediante el uso de una endo-\beta(1\rightarrow4)-D-xilanasa. La exo-\beta(1\rightarrow4)-D-xilanasa libera unidades de xilosa en el extremo no reductor del polisacárido. Otras tres enzimas (\alpha-glucuronidasa, \alpha-L-arabinofuranosidasa y acetil esterasa) se usan para atacar a los sustituyentes en la cadena principal de xilano. Desde luego, la elección de las enzimas específicas depende de la hemicelulosa específica que se ha de degradar (McCleary y Matheson, 1986).

Las enzimas que atacan a las cadenas laterales de la cadena principal de xilano pueden ser de interés a causa de que cambian las características del polímero, haciéndole más adecuado para ciertas aplicaciones. Además, estas enzimas pueden actuar sinérgicamente con endoxilanasas que segmentan la cadena principal (para una amplia revisión, véase Kormelink, 1992, PhD thesis, Universidad de Wageningen).

Se conoce un fragmento de DNA que codifica una actividad degradadora de arabinoxilano. En la solicitud de patente europea 463 706, se describe el aislamiento, caracterización y clonación génica de una endoxilanasa de Aspergillus tubigensis. Esta enzima no es capaz de atacar a las cadenas laterales de la cadena principal de arabinoxilano.

También se conocen actividades enzimáticas capaces de atacar a cadenas laterales, a partir de Aspergillus niger (Kormelink, 1992, supra, capítulos 6 y 7). Una enzima llamada arabinofuranosidasa A (Arafur A) se caracteriza por la capacidad para liberar restos de arabinosa de estructuras de oligosacárido obtenidas a partir de arabinoxilanos. Sin embargo, el Arafur A no es activo sobre sustratos de alto peso molecular. Además, el Aspergillus niger produce una enzima llamada Arafur B que es activa en oligosacáridos, así como en estructuras de arabinoxilano de alto peso molecular. La acción enzimática del Arafur B se reduce a liberar restos de arabinosa de restos de xilosa con sustitución simple terminales. Hasta ahora no se conocen fragmentos de DNA.

Una actividad capaz de liberar restos de arabinosa de restos de xilosa con sustitución simple no terminales, tanto en oligosacáridos como en estructuras de arabinoxilano de alto peso molecular, ha sido aislada de Aspergillus awamori. Esta enzima se llama arabinoxilano arabinofuranosa hidrolasa (AXH). Hasta ahora no se dispone de fragmentos de DNA ni de datos de secuencia. Está claro que todavía no han sido detectadas todas las enzimas implicadas en la degradación del arabinoxilano (Kormelink 1990). Por ejemplo, todavía no se ha encontrado ninguna enzima que ataque a moléculas de xilosa con sustitución doble con arabinosa. La razón de ello es que estas enzimas suelen ser segregadas en bajas cantidades. La clonación molecular y la sobreproducción en un hospedador adecuado de estas enzimas, aunque no es fácil, es una forma de obtener suficientes cantidades de enzimas puras, lo que a su vez permite establecer su importancia en varias aplicaciones.

La presente invención sirve para superar el inconveniente de la técnica anterior, anteriormente mencionado, proporcionando un DNA recombinante que codifica un polipéptido con actividad de degradación del arabinoxilano. El polipétido tiene actividad de (1,4)-\beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrolasa, tiene actividad de liberación de arabinosa, no tiene actividad de \alpha-arabinofuranosidasa, no tiene actividad de endoxilanasa y no es una arabinasa.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona DNA recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de (1,4)-\beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrolasa, pero que no tiene actividad de endoxilanasa ni de \alpha-arabinofuranosidasa, o un polipéptido precursor del mismo, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos se elige entre:

(a)

Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 1 a 306, o un precursor de polipéptido de dicho polipéptido, representada por los aminoácidos -27 a 306 en la ID. SEC. No: 5;

(b)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 1 a 306, o un precursor de polipéptido de dicho polipéptido, representada por los aminoácidos -27 a 306 en la ID. SEC. No: 7;

(c)

una secuencia de nucleótidos representada por los nucleótidos 784 a 1779 en la ID. SEC. No: 5, o los nucleótidos 823 a 1818 en la ID. SEC. No: 7;

(d)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de (1,4)-\beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrolasa, pero no tiene actividades de endoxilanasa ni de \alpha-arabinofuranosidasa, la cual secuencia de nucleótidos es capaz de hibridarse con un fragmento de DNA como el representado por los nucleótidos 784 a 1779 en la ID. SEC. No: 5 o nucleótidos 823 a 1818 en la ID. SEC. No: 7, bajo condiciones de hibridación que incluyen un primer lavado a 65ºC durante 30 minutos en 5 x SSC/0,1% de SDS, seguido por un segundo lavado a 65ºC durante 30 minutos en 2 x SSC/0,1% de SDS, seguido por un tercer lavado a 65ºC durante 30 minutos en 0,1 x SSC/0,1% de SDS, seguido por un cuarto lavado a 65ºC durante 30 minutos en 0,1 x SSC. El DNA recombinante según la invención se obtiene preferentemente de un hongo filamentoso, más en particular de una especie de Aspergillus. Las secuencias de DNA recombinante especialmente preferidas comprenden fragmentos de DNA que codifican AXDA de Aspergillus niger o tubigensis.

De acuerdo con otra realización, el DNA recombinante de acuerdo con la invención comprende secuencias de DNA 5' y 3' reguladoras requeridas para la expresión del fragmento de DNA en una célula hospedadora procariota o eucariota cuando están presentes. Las secuencias de DNA reguladoras son preferentemente heterólogas con respecto a la secuencia que codifica el polipéptido de dicho fragmento de DNA, más preferentemente dichas secuencias de DNA reguladoras se eligen para mejorar la expresión del fragmento de DNA en un hospedador, en comparación con la expresión del fragmento de DNA en dicho hospedador cuando está unido a sus secuencias de DNA reguladoras homólogas.

De acuerdo con otra realización dicho DNA recombinante está en forma de un vector.

La invención proporciona además una célula hospedadora eucariota o procariota transformada que comprende DNA recombinante de acuerdo con la invención, preferentemente del género Aspergillus, así como un método para obtener una célula hospedadora capaz de mejorar la expresión de una enzima degradadora de arabinoxilano, tratando una célula hospedadora bajo condiciones de transformación con un DNA recombinante de acuerdo con la invención, y seleccionando basándose en la expresión mejorada de dicha enzima degradadora de arabinoxilano.

La invención proporciona también un método para obtener una enzima degradadora de arabinoxilano que comprende las etapas de desarrollar células hospedadoras capaces de producir dicha enzima bajo condiciones que conducen a ello, y recuperar dicha enzima, caracterizado porque dichas células hospedadoras, o sus antepasados, han sido transformadas con un DNA recombinante de acuerdo con la invención.

También se proporcionan métodos para usar un polipéptido de acuerdo con la invención, para ayudar a la degradación del arabinoxilano, como aditivo para piensos o alimentos, en el procesado del papel y la pasta, y en la fabricación del pan.

También se reivindican un pienso o un alimento que contiene un polipéptido de acuerdo con la invención.

De acuerdo con otra realización más, se proporciona DNA recombinante que comprende un fragmento de DNA representado por los nucleósidos 1 a 783 de la ID. SEC. No:5, o un subfragmento del mismo, capaz de regular la expresión de una secuencia de DNA unida a él, así como DNA recombinante que comprende un fragmento de DNA representado por los nucleótidos 1 a 822 de la ID. SEC. No: 7, o un subfragmento del mismo, capaz de regular la expresión de una secuencia de DNA unida a él.

La invención se ilustra con más detalle mediante la descripción de la figuras siguientes.

Breve descripción de las Figuras

Figura 1: perfil de elución (DO280) de la actividad degradadora de arabinoxilano en HPLC.

Figura 2: diagrama mostrando la actividad de AXDA en la fracción de sólidos insolubles en agua (WIS: Water Insoluble Solids) del maíz en función del pH.

Figura 3: porcentaje de digestión in vitro de los WIS de maíz en función de la cantidad de enzima AXDA cruda.

Figura 4: mapa de los sitios de restricción en pIM3001.

Figura 5: mapa de los sitios de restricción en pIM3002.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona moléculas de DNA purificado y aislado que comprenden la secuencia de genes de la enzima degradadora de arabinoxilano, y variantes genéticos de los mismos. Las moléculas de DNA pueden incluir la región que codifica la enzima degradadora de arabinoxilano así como sus regiones reguladoras 5' y 3' adyacentes. Las variantes genéticas incluyen moléculas de DNA que codifican proteínas de arabinoxilano mutantes y moléculas de DNA degeneradas en las que se conserva la actividad deseada de la enzima expresada a partir de las mismas.

La presente invención proporciona también construcciones de DNA para la expresión de enzimas degradadoras de arabinoxilano en un hospedador de expresión deseado. Estas construcciones de expresión incluyen moléculas de DNA híbridas que contienen las enzimas degradadoras de arabinoxilano que codifican regiones unidas operativamente a regiones reguladoras, tales como un promotor, señales de secreción y terminadoras que se originan a partir de organismos homólogos o heterólogos, siendo capaces estas regiones reguladoras de dirigir la expresión mejorada de la enzima codificada por la molécula de DNA que codifica la enzima degradadora del arabinoxilano, en un hospedador adecuado. Preferentemente, la construcción de expresión estará integrada en el genoma del hospedador de expresión elegido.

La presente invención proporciona además vectores, preferentemente plásmidos, para la clonación y/o la transformación de los hospedadores microbianos mediante la introducción en el hospedador microbiano de las construcciones de DNA para la expresión de las enzimas degradadoras de arabinoxilano.

Además, la presente invención proporciona hospedadores homólogos o heterólogos transformados con vectores que contienen las construcciones de DNA descritas anteriormente. Los hospedadores heterólogos pueden elegirse entre bacterias, levaduras o hongos.

Dentro del contexto de la presente invención, se entiende que el término "homólogo" se refiere a todo lo que es originario o nativo para la molécula de DNA que codifica la enzima degradadora de arabinoxilano de interés, incluyendo sus regiones reguladoras. Un hospedador homólogo se define como la especie a partir de la cual pueden aislarse tales moléculas de DNA.

El término "heterólogo" se define entonces como todo lo que no es originario para la molécula de DNA que codifica la enzima degradadora de arabinoxilano de interés, incluyendo las regiones reguladoras. Un hospedador "heterólogo" se define como cualquier especie microbiana distinta de aquella a partir de la cual han sido aislados los genes que codifican la enzima degradadora del arabinoxilano.

Dentro del contexto de la presente invención, la frase "expresión mejorada de la enzima degradadora de arabinoxilano de interés" quiere decir la expresión de la enzima degradadora de arabinoxilano de interés, a niveles por encima del que se encuentra ordinariamente en el organismo homólogo de tipo silvestre. En el mismo contexto, expresión mejorada quiere decir también la expresión de las enzimas degradadoras de arabinoxilano de interés en un organismo heterólogo que normalmente no produce tales enzimas degradadoras de arabinoxilano excepto para la introducción de la molécula de DNA o construcción de expresión que codifica las enzimas degradadoras de arabinoxilano de interés en el hospedador de expresión heterólogo. También se ha de entender, desde luego, que la progenie de estos hospedadores de expresión está comprendida en la presente invención.

La presente invención incluye también secuencias de DNA que se hibridan con las secuencias de DNA que pueden obtenerse de los hongos descritos antes, pero que pueden diferir en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético o variación de especies cruzadas. Así, la invención incluye fragmentos de DNA que codifican enzimas degradadoras de arabinoxilano obtenibles de otras especies distintas de Aspergillus. Típicamente, los procedimientos para obtener fragmentos de DNA similares implican la selección de bacterias o placas de bacteriófagos, transformadas con plásmidos recombinantes que contienen fragmentos de DNA de un organismo que se sabe que produce, o se espera que produzca, una enzima degradadora de arabinoxilano de acuerdo con la invención. Después de la replicación in situ del DNA, el DNA se libera de las células o placas y se inmoviliza sobre filtros (generalmente de nitrocelulosa). Los filtros pueden después ser seleccionados en cuanto a fragmentos de DNA complementario, usando una sonda de ácido nucleico marcado basada en cualquiera de las secuencias determinadas para los genes axdA de Aspergillus. Dependiendo de si el organismo a seleccionar está o no relacionado de cerca o de lejos, las condiciones de hibridación y lavado han de ser adaptadas para escoger positivos verdaderos y reducir la cantidad de positivos falsos. Un procedimiento típico para la hibridación de DNA inmovilizado en filtros se describe en el Capítulo 5, Tabla 3, p. 120 y 121 en Nucleic acid hybridisation - a practical approach, B. D. Hames y S. J. Higgins eds., 1985, IRL Press, Oxford). Aunque las condiciones óptimas suelen determinarse empíricamente, pueden darse unas cuantas reglas útiles para secuencias estrechamente y menos estrechamente relacionadas.

Para identificar fragmentos de DNA muy estrechamente relacionadas con la sonda, la hibridación se realiza como se describe en la Tabla 3 de Hames y Higgins, supra (lo esencial de la cual se reproduce más adelante) con una etapa final de lavado con alta astringencia en tampón 0,1 x SET (20 por SET = NaCl 3M, EDTA 20 mM, Tris-HCl 0,4 M, pH 7,8), 0,1% de SDS) a 68ºC.

Para identificar secuencias con una homología con la sonda limitada, el procedimiento a seguir es como en la Tabla 3 de Hames y Higgins, supra, pero con temperaturas de hibridación y lavado reducidas. Un lavado final con tampón 2 x SET, 50ºC, por ejemplo, debe permitir la identificación de secuencias que tienen aproximadamente 75% de homología. Como es bien sabido por aquellos que tienen una experiencia normal en la técnica, la relación exacta entre homología y condiciones de hibridación depende de la longitud de la sonda, la composición en bases (% de G + C) y la distribución de los fallos o no coincidencias; una distribución aleatoria tiene un efecto de disminución sobre T_{m} más intenso que un patrón de no coincidencias no aleatorio o en racimo.

Las condiciones anteriores son válidas para sondas que tienen una longitud de al menos 300 pb (pares de bases), preferentemente al menos 500 pb, más preferentemente aproximadamente 1 kpb, y un contenido de GC del DNA a sondear de aproximadamente 50 \pm 10%. Si se conoce el contenido de GC de un organismo dado, las condiciones pueden entonces ser optimizadas empíricamente teniendo en cuenta la ecuación siguiente (a NaCl 1M, dentro del margen 35% s (% G + C) \leq 75%): T_{m} = 81,5ºC + 0,41x(% G + C). De forma aproximada, esto significa que si el contenido de GC (% G + C) es un 10% superior a la media, las condiciones de hibridación (astringentes) pueden ser ajustadas aumentando la temperatura de hibridación y lavado en aproximadamente 4ºC.

Para los fines de esta descripción, un fragmento de DNA que se afirma que se híbrida con el fragmento de DNA de acuerdo con la invención, se define como un fragmento que da una señal positiva en DNA inmovilizado después de la hidridación con una sonda de al menos 300 pb, preferentemente 500 pb, más preferentemente 1 kpb de cualquiera de las secuencias representadas en la ID. SEC. No: 5 ó 7, y lavando siguiendo el procedimiento de la Tabla 3 en el Capítulo 5 de Hames y Higgins (como se reproduce en esencia más adelante) a una temperatura de 50ºC, tampón 2xSET (es decir NaCl 0,3 M).

Lo esencial del procedimiento descrito en la Tabla 3, Capítulo 5 de Hames y Higgins es como sigue:

(1)

prehibridación de los filtros en ausencia de sonda,

(2)

hibridación a una temperatura comprendida entre 50 y 68ºC en tampón comprendido entre 0,1 y 4 x SET (dependiendo de la astringencia), 10xsolución de Denhardt (100 x solución de Denhardt contiene 2% de albúmina de suero bovino, 2% de Ficoll, 2% de polivinilpirrolidona), 0,1% de SDS, 0,1% de pirofosfato sódico, 50 \mug/ml de DNA de esperma de salmón (de una solución madre que puede obtenerse disolviendo 1 mg/ml de DNA de esperma de salmón, tratado con ultrasonidos hasta una longitud de 200 a 500 pb, que se deja reposar en un baño de agua durante 20 min, y diluido con agua a una concentración final de 1 mg/ml); el tiempo de hibridación no es demasiado crítico y puede ser cualquiera entre 1 y 24 horas, preferentemente aproximadamente 16 horas (o/n); la sonda se marca típicamente por traslación de mella usando ^{32}P como marcador radiactivo hasta una actividad específica de entre 5x10^{7} y 5x10^{8} c.p.m./\mug;

(3)

lavado (repetido) del filtro con 3xSET, 0,1% SDS, 0,1% de pirofosfato sódico a 68ºC a una temperatura entre 50ºC y 68ºC (dependiendo de la astringencia deseada), lavado repetido mientras se baja la concentración de SET a 0,1%, lavado una vez durante 20 min. en 4xSET a temperatura ambiente, secado de los filtros sobre papel 3MM, exposición de los filtros a película para rayos X en una casete a -70ºC durante un tiempo entre 1 hora y 96 horas (dependiendo de la fuerza de la señal) y desarrollo de la película.

Generalmente, el volumen de las mezclas de prehibridación e hibridación han de mantenerse al mínimo. Todas las etapas "húmedas" pueden llevarse a cabo en pequeñas bolsas selladas en un baño de agua precalentado.

El procedimiento anterior sirve para definir los fragmentos de DNA que se afirma se hibridan según la invención. Evidentemente, pueden hacerse numerosas modificaciones al procedimiento para identificar y aislar los fragmentos de DNA de acuerdo con la invención. Se ha de entender que los fragmentos de DNA así obtenidos entran dentro de los términos de las reivindicaciones siempre que se puedan detectar siguiendo el anterior procedimiento, al margen de si han sido realmente identificados y/o aislados usando este procedimiento.

Se han descrito en la bibliografía y en libros de texto numerosos protocolos que pueden ser usados adecuadamente para identificar y aislar fragmentos de DNA de acuerdo con la invención, incluyendo la obra citada de Hames y Higgins, supra.

El procedimiento anterior es para sondas de polinucleótido. Cuando se usan sondas de polinucleótido la relación entre la T_{d}, temperatura a la cual un híbrido con concordancia perfecta es semi-disociado, se estima por la relación: T_{d} = 4ºC por par de base GC + 2ºC por par de base AT. Basándose en protocolos existentes y usando esta regla empírica, también pueden diseñarse sondas de oligonucleótido para aislar efectivamente fragmentos de DNA que codifican enzimas degradadoras de arabinoxilano de acuerdo con la invención a partir de organismos relacionados y más distantes. El procedimiento usando oligonucleótidos es particularmente útil si se ha purificado una enzima de una fuente diferente y se ha determinado parte de la secuencia de aminoácidos. Usando esta secuencia, puede hacerse un juego de sondas degeneradas para seleccionar una genoteca de DNA o transferencia Southern, esencialmente como se describió anteriormente.

Buenos candidatos para la selección son otros hongos filamentosos, tales como Trichoderma, Penicillium, Dichotomitus squalus, Disporotrichum dimorphosporum, y bacterias tales como especies Bacillus, y similares. Si la selección inicial tiene por resultado clones que parecen contener fragmentos hibridantes, tales fragmentos pueden ser aislados y, si se desea, secuenciados para determinar las similitudes entre secuencias.

Una vez que ha sido identificada una enzima degradadora del arabinoxilano de interés, la secuencia de DNA que codifica tal enzima puede ser obtenida a partir del hongo filamentoso que la produce de forma natural, cultivando el hongo en un medio que contiene arabinoxilano, aislando la enzima degradadora del arabinoxilano deseada usando medios conocidos tales como los esquematizados en el Ejemplo 1, y determinando al menos una porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína purificada.

A continuación pueden obtenerse sondas de DNA diseñando secuencias de oligonucleótido basadas en la secuencia de aminoácidos parcial deducida. Las secuencias de aminoácidos pueden ser determinadas a partir del término N de la proteína completa y/o de los términos N de fragmentos de péptidos internos obtenidos por digestión proteolítica o química de la proteína completa. Una vez obtenida, la sonda (o sondas) de DNA se usa entonces para seleccionar una genoteca genómica o de cDNA.

Puede prepararse una genoteca genómica digiriendo parcialmente el DNA cromosómico fúngico con una enzima de restricción que reconoce una secuencia de DNA de cuatro nucleótidos sucesivos, p. ej. Sau3A, y clonando los fragmentos resultantes en un plásmido o un vector de fago lambda adecuados, p. ej. lambda GEM-11.

Alternativamente, puede prepararse una genoteca de cDNA clonando cDNA, sintetizado a partir de mRNA aislado de células fúngicas inducidas para la síntesis de una enzima degradadora de arabinoxilano, en un vector fago apropiado, p. ej. lambda gt10.

A continuación, después de cultivar en placa una cantidad suficiente de colonias o de halos, la genoteca genómica o de cDNA puede ser seleccionada con una sonda de DNA adecuada.

Si este método es infructuoso, la genoteca genómica o de cDNA puede ser seleccionada diferencialmente con sondas de cDNA obtenidas a partir de mRNA de células no inducidas e inducidas. El mRNA inducido se prepara a partir de células desarrolladas en un medio que contiene arabinoxilano como fuente de carbono, mientras que el mRNA no inducido ha de ser aislado de células desarrolladas en una fuente de carbono distinta del arabinoxilano, p. ej. glucosa. Entre los clones que solamente se hibridan con la sonda de cDNA inducida, puede recuperarse un clon que contiene el gen que codifica la enzima degradadora de arabinoxilano deseada. Alternativamente, un gen de la enzima degradadora de arabinoxilano puede ser identificado por hibridación cruzada con una secuencia relacionada.

Preferentemente, las sondas de oligonucleótido se obtienen a partir de las secuencias de aminoácidos N-terminales (véase el Ejemplo 1.5.1) de una enzima degradadora de arabinoxilano que tiene un peso molecular aparente de 32 kDa, purificada a partir de un filtrado de cultivo de Aspergillus niger y/o a partir de la secuencia de aminoácidos de un fragmento de péptido interno (véase el Ejemplo 1.5.2) obtenido por digestión de la enzima con CNBr.

Las mezclas de oligonucleótidos, tal como se desarrollan, pueden usarse para hibridarse con genotecas tanto genómicas como de cDNA. Alternativamente, y como se ilustra en el presente texto, la enzima AXDA purificada se usa para producir anticuerpos. Los anticuerpos se usan en la inmunoselección de genotecas de expresión. Así, se identifican clones de expresión de AXDA. Debe observarse que la proteína se aisla de A. niger var. tubigensis y el cDNA se aisla de A. niger N400, lo que ilustra que diferentes Aspergilli contienen actividad de AXDA.

Con la aparición de nuevas técnicas de amplificación del DNA, tal como PCR directa o inversa, es también posible clonar fragmentos de DNA in vitro una vez que se conocen las secuencias terminales de la región de codificación.

La disponibilidad de una secuencia de DNA que codifica una enzima degradadora de arabinoxilano permite la construcción de moléculas de enzima mutantes por mutagénesis dirigida al sitio. Si se conoce la estructura terciaria de la enzima degradadora de arabinoxilano, y están localizados sus dominios catalítico y de unión al sustrato, pueden elegirse los aminoácidos para mutagénesis (por ejemplo, con ayuda de modelos de ordenador) que más probablemente afectan a las funciones catalítica y/o de unión con el sustrato. Si no se dispone de la estructura terciaria de la proteína, pueden ser generados mutantes aleatorios junto con la secuencia de codificación entera, o bien puede predecirse la estructura terciaria de la proteína por comparación con enzimas similares conocidas aisladas de otro microorganismo.

Para facilitar la inserción del fragmento de DNA que contiene la secuencia de codificación de AXDA, en construcciones de expresión que comprenden una o más regiones reguladoras heterólogas, puede usarse la reacción en cadena de polimerasa (PCR) (PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (1989) H. A. Ehrlich, ed., Stokton Press, Nueva York) para la introducción de sitios para enzimas de restricción apropiados en los extremos 5' y 3' de la secuencia de codificación de AXDA. La elección de los sitios de restricción depende de la secuencia de DNA del vector de expresión, es decir, de la presencia de otros sitios de restricción dentro de la molécula de DNA.

Para obtener la expresión potenciada de las proteínas AXDA en la especie de producción original (homóloga), o alternativamente en una cepa fúngica heteróloga, las regiones de DNA que codifican AXDA, incluyendo su propia región de control, son introducidas en el hospedador de expresión seleccionado para aumentar el número de copias del gen y, en consecuencia, la expresión de la proteína.

Si se prefiere un hospedador de expresión heterólogo, y se elige una levadura o cepa bacteriana, se usa una molécula de DNA ininterrumpida (sin intrones) para la construcción de un vector de expresión heterólogo con el fin de evitar la posibilidad de que las señales de ayuste residentes en el fragmento genómico no sean reconocidas por el hospedador heterólogo. Esta molécula de DNA ininterrumpida puede ser obtenida de una genoteca de cDNA construida a partir de mRNA aislado de células, inducido para la síntesis de AXDA. Esta genoteca puede ser seleccionada con una sonda de oligonucleótido o de cDNA obtenida como se describió antes. Alternativamente, puede obtenerse una molécula de DNA ininterrumpida aplicando una reacción en cadena de polimerasa usando oligonucleótidos 5' y 3' apropiados en la primera cadena de cDNA sintetizada a partir del RNA de células inducidas por arabinoxilano.

La expresión potenciada de la AXDA de interés puede también conseguirse por la selección de regiones reguladoras heterólogas, p. ej. regiones promotoras, guía de secreción y terminadoras, que sirve para aumentar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés desde el hospedador de expresión elegido y/o para proporcionar el control inducible de la expresión de la AXDA de interés.

Aparte del promotor nativo de la AXDA de interés, pueden usarse otros promotores para dirigir su expresión. El promotor puede elegirse por su eficacia en dirigir la expresión de la AXDA de interés en el hospedador de expresión deseado.

En otra realización, puede elegirse un promotor constitutivo para dirigir la expresión de la AXDA deseada, relativamente libre de otras enzimas. Tal construcción de expresión es además ventajosa ya que soslaya la necesidad de cultivar los hospedadores de expresión en un medio que contiene arabinoxilanos como sustrato de inducción.

Ejemplos de promotores potentes constitutivos y/o inducibles que se prefieren para ser usados en hospedadores fúngicos de expresión, son los promotores de ATP-sintetasa, subunidad 9 (oliC), triosa fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa (adhA), \alpha-amilasa (amy), glucoamilasa (gam), acetamidasa (amdS) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gpd).

Ejemplos de promotores de levadura potentes son los promotores de alcohol deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfoglicerato quinasa y triosafosfato isomerasa.

Ejemplos de promotores bacterianos potentes son los promotores de \alpha-amilasa y Spo2, así como promotores a partir de genes de proteasa extracelular.

También pueden usarse ventajosamente promotores híbridos para mejorar la regulación inducible de la construcción de expresión.

Con frecuencia es deseable que la AXDA de interés sea segregada del hospedador de expresión en el medio de cultivo.

De acuerdo con la presente invención, la secuencia líder de secreción nativa de la AXDA de interés puede ser usada para realizar la secreción de la AXDA expresada.

Sin embargo, un aumento en la expresión de la enzima tiene a veces por resultado la producción de la proteína en niveles más allá de aquellos que el hospedador de expresión es capaz de procesar y segregar, creando un cuello de botella por el cual el producto proteico se acumula dentro de la célula. En consecuencia, la presente invención también proporciona secuencias guía heterólogas para proporcionar la secreción más eficiente de la enzima desde el hospedador de expresión escogido.

De acuerdo con la presente invención, la guía de secreción puede seleccionarse sobre la base del hospedador de expresión deseado. Puede elegirse una guía de expresión heteróloga que es homóloga para las otras regiones reguladoras de las construcción de expresión. Por ejemplo, puede usarse la guía de la proteína glucoamilasa altamente segregada, en combinación con el propio promotor de glucoamilasa, así como en combinación con otros promotores. Las secuencias señal híbridas pueden usarse también ventajosamente dentro del contexto de la presente invención.

Los ejemplos de secuencias guía de secreción heterólogas preferidas son aquellas que proceden del gen de la glucoamilasa (hongos), el gen del factor \alpha (levaduras) o el gen de la \alpha-amilasa (Bacillus).

En general, no se considera que los terminadores sean elementos críticos para la expresión mejorada de genes. Si se desea, puede elegirse un terminador entre los mismos genes que los promotores o, alternativamente,puede emplearse el terminador homólogo.

Además del fragmento genómico mencionado anteriormente, el DNA transformante puede contener un marcador de selección para discriminar las células que han incorporado el gen deseado desde la masa de células no transformadas. Este marcador de selección, provisto de las secuencias reguladoras 5' y 3' apropiadas, puede residir en la misma molécula de DNA que contiene el gen deseado o estar presente en una molécula distinta. En este último caso, ha de llevarse a cabo una co-transformación. La relación del vector de expresión/vector de selección ha de ser ajustada de manera que un elevado porcentaje de los transformantes seleccionados tengan incorporado también el vector que contiene la construcción de expresión de la AXDA de interés.

Los sistemas de selección más adecuados para microorganismos industriales son los formados por el grupo de marcadores de selección que no requieren una mutación en el organismo hospedador. Los ejemplos de marcadores de selección fúngicos son los genes para acetamidasa (amdS), para ATP sintetasa, subunidad 9 (oliC) y para la resistencia al benomilo (benA). Son ejemplos de marcadores de selección no fúngicos el gen de la resistencia al tóxico bacteriano G418 (este puede usarse en levaduras pero no en hongos), el gen de la resistencia a la ampicilina (E. coli) y el gen de la resistencia a la neomicina (Bacillus).

Una vez que la construcción de expresión deseada ha sido ensamblada, es transformada en un hospedador de clonación adecuado tal como E. coli, para propagar la construcción. Después de ello, la construcción de expresión es introducida en un hospedador de expresión adecuado, en el que la construcción de expresión se integra preferentemente en el genoma. Ciertos hospedadores tales como especies de Bacillus pueden ser usados como hospedadores tanto de clonación como de expresión, evitándose así una etapa extra de transformación.

De acuerdo con la presente invención, pueden usarse diversos organismos como hospedadores para la producción de la AXDA de interés.

En una realización, puede usarse un hospedador de expresión homólogo. Esto implica la introducción de la construcción de expresión de nuevo en la cepa de la que fue aislada la secuencia de DNA que codifica AXDA, bien en números incrementados de copias de genes o bajo el control de regiones reguladoras heterólogas como se describió anteriormente, o ambas cosas.

En otra realización, puede producirse una AXDA de interés introduciendo y expresando la construcción de DNA que codifica la enzima degradadora de arabinoxilano de interés, bajo el control de las regiones reguladoras apropiadas en hospedadores heterólogos tales como bacterias, levaduras u hongos. Para ese fin, las secuencias de DNA que codifican la AXDA de interés se expresan preferentemente bajo el control de secuencias promotoras y terminadoras que se originan a partir del hospedador heterólogo. Además, puede ser necesario reemplazar la secuencia guía de secreción nativa con una secuencia guía homóloga para el hospedador de expresión, con el fin de conseguir la más eficaz expresión y secreción del producto.

Factores tales como el tamaño (peso molecular), la necesidad de una glicosilación apropiada, o el deseo de que se realice la secreción extracelular de la AXDA de interés, juegan un importante papel en la selección del hospedador de expresión.

La bacteria gram-negativa E. coli se usa mucho como hospedador para la expresión génica heteróloga. Sin embargo, grandes cantidades de proteína heteróloga tienden a acumularse en el interior de la célula. La subsiguiente purificación de la proteína deseada, a partir de la masa de proteínas intracelulares de E. coli, puede ser a veces difícil.

Al contrario que E. coli, las bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como hospedadores heterólogos por su capacidad para segregar proteínas al medio de cultivo.

Dependiendo de la naturaleza de la propia molécula de DNA que codifica la AXDA, y/o el deseo de posterior procesamiento de la proteína expresada, pueden preferirse hospedadores eucariotas tales como levaduras u hongos. En general, las células de levaduras se prefieren sobre las células fúngicas porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas o son escasamente segregadas desde la célula de levadura, o bien en algunos casos no son procesadas apropiadamente (p. ej. hiperglicosilación en levadura). En estos casos debe elegirse un organismo hospedador fúngico.

También puede elegirse un hospedador heterólogo para expresar la AXDA de interés sustancialmente libre de otras enzimas degradadoras de polisacárido, escogiendo un hospedador que normalmente no produce tales enzimas, tal como Kluiveromyces lactis.

Son ejemplos de hospedadores de expresión preferidos dentro del alcance de la presente invención los hongos tales como la especie Aspergillus (descrita en los documentos EP 184.438 y EP 284.603) y la especie Trichoderma, bacterias tales como la especie Bacillus (descrita en el documento EP 134.048) y levaduras tales como la especie Kluyveromyces (descrita en los documentos EP 96.430 y EP 301.670) y la especie Saccharomyces.

Pueden elegirse hospedadores de expresión particularmente preferidos entre Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis y Saccharomyces cerevisiae.

La expresión de la enzima AXDA de interés se realiza cultivando los hospedadores de expresión, que han sido transformados con la apropiada construcción de expresión, en un medio de fermentación convencional.

El medio de fermentación consiste en un medio de cultivo ordinario que contiene una fuente de carbono (p. ej. glucosa, maltosa, melazas, etc.), una fuente de nitrógeno (p. ej. sulfato amónico, nitrato amónico, cloruro amónico, etc.), una fuente de nitrógeno orgánico (p. ej. extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc.) y fuentes de nutriente inorgánicos (p. ej. fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro, etc.). Opcionalmente, puede incluirse un inductor (arabinoxilano).

La selección del medio apropiado puede basarse en la elección de los hospedadores de expresión y/o en los requerimientos reguladores de la construcción de expresión. Tales medios son bien conocidos por los expertos en la técnica. Si se desea, el medio puede contener componentes adicionales que favorecen a los hospedadores de expresión transformados, sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes.

La fermentación se realiza durante un periodo de 0,5 a 20 días en un proceso por tandas o por tandas alimentadas ("fed-batch") a una temperatura en el intervalo entre 0 y 45ºC y un pH entre 2 y 10. Las condiciones de fermentación preferidas son una temperatura en el intervalo entre 20 y 37ºC y un pH entre 3 y 9. Las condiciones apropiadas se eligen basándose en la elección del hospedador de expresión.

Después de la fermentación, las células se eliminan del caldo de fermentación por medio de centrifugación o filtración. Después de eliminar las células, puede recuperarse la enzima y, si se desea, purificarla y aislarla por medios convencionales.

El producto se formula establemente en forma líquida o bien seco. Para ciertas aplicaciones, puede preferirse la inmovilización de la enzima sobre una matriz sólida.

Las enzimas producidas por medio de la presente invención pueden ser aplicadas solas o bien junto con otras enzimas seleccionadas, en una diversidad de procesos que requieren la acción de una enzima degradadora de arabinoxilano.

La enzima degradadora de arabinoxilano de la presente invención se usa en el tratamiento o la preparación de alimentos (p. ej. pan), piensos o bebidas (por ejemplo, cerveza y zumos de frutas).

La enzima degradadora de arabinoxilano se usa también ventajosamente en la preparación y tratamiento de papel y pasta, especialmente en combinación con endoxilanasas.

Como se ilustra en la presente invención, la enzima degradadora de arabinoxilano es añadida a piensos para animales ricos en arabinoxilanos. Cuando se añade a un pienso (incluyendo ensilaje) para animales monogástricos (p. ej. pollos o cerdos), que contienen cereales tales como cebada, trigo, maíz, centeno o avena, o subproductos de cereales tales como salvado de trigo o salvado de maíz, la enzima mejora de forma significativa la rotura de las paredes de las células vegetales, lo que conduce a una mejor utilización de los nutrientes vegetales por el animal. Como consecuencia de ello, se mejoran la velocidad de crecimiento y/o la conversión del pienso. Además las enzimas degradadoras del arabinoxilano pueden usarse para reducir la viscosidad de piensos que contienen arabinoxilanos.

Una enzima degradadora de arabinoxilano puede ser añadida de antemano al pienso o ensilaje si se prefieren dietas pre-empapadas o húmedas. Más ventajosamente, la AXDA producida mediante la presente invención continúa la hidrólisis de los arabinoxilanos in vivo.

Las enzimas degradadoras del arabinoxilano son también útiles en la preparación del pan, como se ilustra en el Ejemplo 8.

Parte experimental Cepas

E. coli BB4 (Silvay et al., 1984):

el4 (mcrA) hsdR514, supE44, supF58, lacY1, o \Delta (lac1ZY)6, galK2, galT22, metB1, trpR55, \Delta (argF-lac)U169 [F', proAB, lacI^{q}Z \Delta M15, TN10, (tet^{r})]

E. coli DH5\alpha (Hanahan, 1983):

supE44, \Delta lacU169, (\Phi80lacZ \Delta M15), hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1.

E. coli LE 392 (Murray, 1977):

el4 (mcrA) hsdR514, supE44, supF58, lacY1, o \Delta (lac1ZY)6, galK2, galT22, metB1, trpR55

E. coli XL1-Blue MRF' (Jerpseth et al., 1992):

\Delta (mcrA)183, \Delta (mcrCB-hsdSMR-mrr)173, endA1, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, lac, [F', proAB, lacI^{q}Z \Delta M15, TN10, (tet^{r})]

Aspergillus niger N400 (CBS 120.49)

Aspergillus niger N402 (cspA1) Goosen et al, 1987)

Aspergillus niger NW219 (leuA1, nicA1, pyrA6)

Vectores

pBluescript SK +/- (Short, J.M. et al., 1988)

pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985)

Las soluciones siguientes fueron preparadas de acuerdo con Sambrook et al. (1989):

Tampones: TE, 50xTAE, 20xSSC; hibridación, 100x

Denhardts, SM, carga de DNA

Medios: NZYCM, LB y medio mínimo.

La solución de Visniac se preparó de acuerdo con Visniac y Santer (1957).

Ejemplos Ejemplo 1 Asilamiento de la enzima

Ejemplo 1.1

Purificación y caracterización de la actividad A degradadora de arabinoxilano (AXDA) de A. niger var. tubigensis

Se desarrolló A. niger var. tubigensis DS 16813 como se describe en el documento EPA 0 463 706 sin extracto de levadura y 2% de una fracción cruda de arabinoxilano de trigo en vez de xilano de avena espelta. Las células se eliminaron por filtración y el sobrenadante se secó mediante ultrafiltración.

Para la purificación de la AXDA, se diluyeron 5 gramos del preparado enzimático crudo en 100 ml de Tris/HCl 10 mM pH 8,0. La solución de enzima se filtró (Seitz/supro no 250 y Seitz/supro EKS) y se diluyó hasta una concentración final de proteína (ensayo de proteínas BioRad) de 5,2 g/l. La enzima cruda se fraccionó por HPLC (Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System) en una columna de intercambio aniónico (600 ml) DEAE TSK 650 (M) (velocidad 25 ml/min). La columna se equilibró con Tris/HCl 25 mM (pH 8,0). La muestra (3 g de proteína) fue aplicada a la columna y eluída con un gradiente del tampón de equilibración que contiene NaCl 100 mM. La enzima AXDA fue eluida a una concentración de NaCl de 53 mM como se muestra en la Figura 1.

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Ejemplo 1.2

pH óptimo

Para la determinación del pH óptimo del preparado de enzima AXDA crudo, se usó como sustrato la fracción polímera de los sólidos insolubles en agua (WIS: Water Insoluble Solids) del maíz. Se añadieron 1,6 mg del preparado de enzima crudo a 0,5 g de WIS y se diluyó a 5 ml con tampón (NaAc 100 mM) de pH variable de 3,40 a 7,65. Las muestras fueron incubadas durante 60 minutos a 39ºC y centrifugadas durante 15 minutos (2800 g). En el sobrenadante se midieron los azúcares reductores usando reactivo de Sumner.

Preparación del reactivo de Sumner: se añaden 10 g de fenol a 22 ml de NaOH al 10% y después se ajusta el volumen a 100 ml con agua desmineralizada. Se añaden 10 g de NaHSO_{3}. A 70 ml de esta solución se añaden 300 ml de NaOH al 4,5%, seguido por 255 g de tartrato de Na/K y 800 ml de ácido 3,5-dinitrosalicílico al 1%. Después se agita al mezcla a temperatura ambiente hasta que se disuelven las sustancias. Se añaden 0,5 ml de reactivo de Sumner a una muestra de 200 \mul, y se hierve durante 10 minutos. Después de enfriar se añaden 5 ml de agua desmineralizada. Se mide la extinción a 515 nm. El contenido de azúcar reductor de las muestras se calcula usando una curva de calibración de xilosa.

El pH óptimo para la enzima fue 5,0, como se muestra en la Figura 2.

Ejemplo 1.3

Composición en aminoácidos

De las fracciones de AXDA de la columan DEAE se midió la composición en aminoácidos en una columna PICO-TAG 150 MM (detección a 254 nm). Se encontró la composición siguiente:

TABLA 1

1

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Ejemplo 1.4

Caracterización bioquímica (IEP y peso molecular)

El IEP de AXDA fue determinado en un minigel Pharmacia pH 3-9. La proteína fue teñida con una solución de tinción de plata Pharmacia. Se estimó que el IEP de la enzima AXDA es 3,6.

El peso molecular de AXDA fue determinado en un gel SDS mini-gradiente Pharmacia (10-15%) y las proteínas fueron detectadas con tinción con plata (Pharmacia). Se estimó que el peso molecular de AXDA es 32 kDa.

Ejemplo 1.5

Secuenciación de proteína de la actividad A degradadora de arabinoxilano (AXDA) de A. niger var. tubigensis

Ejemplo 1.5.1

Secuenciación de aminoácidos del término N de la actividad A degradadora de arabinoxilano (AXDA) de A. niger var. tubigensis

Se sometió aproximadamente 1 nmol (\approx 30 \mug) de AXDA a electroforesis en un gel de poliacrilamida-15% SDS, seguido por transferencia electroforética a una membrana Immobilon-P (Millipore). de acuerdo con el método descrito por Matsudaira (1987). El fragmento de membrana que contiene la banda principal que tiene un peso molecular aparente (SDS-PAGE) de 32 kDa fue sometido a análisis de secuencia en un secuenciador en fase gaseosa (Amons, 1987) (aparato SON, Leiden). Se determinó la secuencia siguiente:

Lys- ¿ -Ala-Leu-Pro-Ser-Ser-Tyr

(ID SEC NO: 1)

Ejemplo 1.5.2

Determinación de la secuencia de aminoácidos de un péptido CNBr de actividad A degradadora del arabinoxilano (AXDA)

Aproximadamente 2 nmoles de AXDA fueron sometidos a segmentación química mediante CNBr. Aproximadamente 2 nmoles (\approx 60 \mug) de AXDA se liofilizaron y se resuspendieron en 60 \mul de ácido fórmico al 70% que contiene 125 \mug de CNBr (2,5 mg/ml). Esta mezcla de reacción se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 48 horas. El líquido fue evaporado en un Speedvac, se lavó con agua bidestilada estéril y se evaporó de nuevo. Esta etapa de lavado se repitió dos veces. La mezcla de reacción se sometió después a electroforesis en un gel de 15% SDS-poliacrilamida, seguido por transferencia electroforética a una membrana Immobilon-P (Millipore), de acuerdo con el método descrito por Matsudaira (1987). El fragmento de membrana que contiene la banda principal que tiene un peso molecular aparente (SDS-PAGE) de aproximadamente 9 kDa fue sometido a análisis de secuencia en un secuenciador en fase gaseosa (Amons, 1987) (aparato SON, Leiden). Se determinó la secuencia siguiente:

Péptido CNBr:

Ile-Val-Glu-Ala-Ile-Gly-Ser-Thr-Gly-His-Arg-Tyr-Phe-(Arg/Asn)-(Ser)-(Phe)-(Thr) (ID. SEC. NO: 2)

Los aminoácidos ambíguos se dan entre paréntesis.

Ejemplo 2 Perfil enzimático de AXDA

La actividad de \alpha-arabinofuranosidasa fue medida en un sustrato de paranitro-fenil-arabinofuranósido (Sigma). A 1 ml de sustrato se añadieron 300 \mul de solución enzimática. Al cabo de 15 minutos de incubación a 30ºC, la reacción se detuvo con 5 ml de Na_{2}CO_{3} (SM). Se midió la extinción a 402 nm. La actividad de \alpha-arabinofuranosidasa fue calculada (volumen x extinción)/(E x tiempo).

El preparado enzimático crudo contenía una actividad de \alpha-arabinofuranosidasa de 0,30 pNPAF U/mg. Las fracciones de la columna DEAE fueron ensayadas en relación con su actividad. El agrupamiento ("pool") activo de arabinosidasa contenía 3,0 pNPAF U/mg (véase la Figura 1). No se encontraron otras fracciones con actividad de \alpha-arabinofuranosidasa. El "pool" activo de \alpha-arabinofuranosidasa se ensayó más tarde en una fracción polímera insoluble en agua de maíz y no se midió actividad en este sustrato.

Esto indicaba que AXDA no tiene actividad de \alpha-arabinofuranosidasa en sustrato de paranitrofenilo.

En otro intento de identificar la actividad enzimática de AXDA, filtrados de un cultivo de Aspergillus niger transformado con el gen axdA de Aspergillus tubigensis fueron seleccionados por su actividad en un sustrato consistente en arabinoxilano de trigo. El gen tubigensis se puso bajo control del promotor de piruvato-quinasa (glicolítico) y las condiciones de crecimiento fueron elegidas para favorecer la expresión del transgen, evitando la expresión de enzimas degradadoras de arabinosa endógenas.

En consecuencia, se determinó que AXDA tenía actividad liberadora de arabinosa en sustratos de arabinoxilano de alto peso molecular. El contenido de proteína fue determinado usando el método de Sedmak. La actividad de AXDA fue determinada añadiendo 100 \mul de diferentes diluciones (en tampón de acetato Na 10 mM, pH 5,0) de los filtrados del cultivo a 150 \mul de acetato Na 50 mM (pH 5,0) y 250 \mul de arabinoxilano de trigo al 0,4% (Megazyme) e incubando a 40ºC durante una hora. La reacción se detuvo calentando las mezclas durante 10 minutos a 100ºC. Los productos de degradación del arabinoxilano fueron controlados usando HPAEC (cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento), usando como muestras las incubaciones inactivadas por calor. Los resultados fueron los siguientes:

TABLA 0

3

Se llegó a la conclusión de que la enzima AXDA de Aspergillus tubigensis tiene actividad de arabinofuranohidrolasa (AXH).

La actividad de arabinasa fue medida con un kit de ensayo de arabinasa de Megazyme, y ejecutada siguiendo las instrucciones. En el experimento, el "pool" de AXDA de la columna DEAE no mostró actividad sobre arabinano lineal.

Esto indicó que la AXDA no es una arabinasa.

La actividad de endoxilanasa se midió en xilano de avena espelta. Se hirvieron 10 ml de suspensión de xilano al 5% (NaAc 100 mM, pH 3,5) durante 10 minutos. Después de enfriar, la suspensión se incubó a 39ºC durante 10 minutos. La reacción se inició añadiendo 0,5 ml de solución de enzima. Después de varios periodos de incubación (5, 10, 15, 20 y 25 minutos), se añadió una muestra de 1,5 ml, procedente de la incubación a 39ºC, a 1,5 ml de agua desmineralizada y se hirvió durante 10 minutos. Las muestras se centrifugaron durante 15 minutos (2800 g). En el sobrenadante, los azúcares reductores se detectaron con el reactivo de Sumner (véase el Ejemplo 1.2).

En el "pool" de la fracción de AXDA se encontró una actividad de endoxilanasa de 399,0 U/mg. La endoxilanasa y la AXDA fueron ensayadas más tarde en un sistema de digestión in vitro (véase el Ejemplo 6).

De ello se sacó la conclusión de que la actividad de endoxilanasa en el "pool" de la fracción de AXDA era una actividad asociada con una actividad de polipéptido diferente. Otra indicación de que un polipéptido que tiene endo-xilanasa coeluye con una enzima similar a la AXDA, es encontrada por Kormelink (1992, PhD. Thesis, capítulo 6, p. 107, dos últimos párrafos, y página 108). Se llega a la conclusión de que AXDA no tiene actividad de endo-xilanasa por sí misma.

Ejemplo 3 Construcción de la genoteca de expresión de cDNA

Ejemplo 3.1

Inducción y aislamiento del mRNA

Se desarolló un cultivo de A. niger N400 durante 69 y 81 h respectivamente, como se describe en el documento EPA 0 463 706, sin extracto de levadura y 2% de una fracción cruda de arabinoxilano de trigo en vez de xilano de avena espelta, después de lo cual se cosechó el micelio por filtración y luego se lavó con solución salina estéril. A continuación el micelio se congeló en nitrógeno líquido, después de lo cual se pulverizó usando un aparato Microdismembrator (Braun). El RNA total se aisló del polvo micelial de acuerdo con el protocolo de tiocianato de guanidio/CsCl descrito en Sambrook et al. (1988), excepto que el RNA fue centrifugado dos veces usando un gradiente de CsCl. Se aisló el mRNA poli A+ de 5 mg de RNA total por cromatografía en oligo(dT)-celulosa (Aviv y Leder, 1972, Sambrook et al., 1989) con las siguientes modificaciones: se omite el SDS de todas las soluciones y el tampón de carga fue suplementado con dimetilsulfóxido al 9% (v/v).

Ejemplo 3.2

Construcción de la genoteca de cDNA

Se sintetizó cDNA a partir de 7 \mug de mRNA poli A+ y se ligó en bacteriófago lambda\lambda Uni-ZAP XR usando el kit de síntesis ZAP^{TM}-cDNA (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la ligación del cDNA en los brazos del vector Uni-ZAP XR, el DNA del fago fue empaquetado usando extractos Packagene^{TM} (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La ligación de 120 ng de DNA en 1,2 \mug de brazos de vector, y el subsiguiente empaquetamiento de la mezcla de reacción, tuvo por resultado una genoteca primaria consistente en 3,5x10^{4} fagos recombinantes. Esta genoteca primaria fue amplificada usando XL1-Blue MRF' de E. coli, titulada y guardada a 4ºC.

Ejemplo 4 Selección de la genoteca de cDNA de A. niger N400 por los (axdA) con anticuerpos producidos contra AXDA y aislamiento de clones de cDNA

Ejemplo 4.1

Preparación de anticuerpos producidos contra AXDA en un conejo

Se dializaron 500 \mug de AXDA frente a tampón de fosfato 1 mM, pH 7,0, y se liofilizaron. La proteína se resuspendió en 1 ml de PBS estéril (NaCl 0,136 M; KCl 2,7 mM; Na_{2}HPO_{4} 8 mM; K_{2}HPO_{4} 1,75 mM; pH 7,4). A esta mezcla proteica se añadió 1 ml de coadyuvantes completos de Freund y se agitó en vórtice durante 30 minutos para obtener una emulsión estable. Esta mezcla se inyectó en un conejo por vía subcutánea. En la semana 6 se administró un refuerzo inyectando 250 \mug de AXDA en 0,5 ml de PBS estéril al cual se añadieron 0,5 ml de cosdyuvantes incompletos de Freund. El conejo fue sangrado en la semana 7 y se ensayó el suero. En la semana 13 se administró al conejo un segundo refuerzo de 250 \mug, seguido por un sangrado en la semana 14. Este procedimiento de refuerzos con un intervalo de seis semanas, seguido por un sangrado, puede repetirse varias veces.

La sangre recogida fue incubada durante 30 minutos a 37ºC y a continuación fue guardada a 4ºC durante 16 horas. Después de centrifugación a 5000 rpm en una centrífuga de alta valocidad Sorvall, se recogió el suero.

Ejemplo 4.2

Inmunoselección de la genoteca de cDNA de A. niger N400 con anticuerpos producidos contra AXDA_{TUB}

Para seleccionar la genoteca de cDNA de A. niger N400 construida como se describió en el Ejemplo 3.2 para clones de cDNA axdA, 5x10^{3} pfu por placa fueron plaqueados en topagarosa NZYCM que contiene 0,7% de agarosa en placas NZYCM (1,5% de agar) de 85 mm de diámetro, como se ha descrito (Maniatis et al, 1982, p. 64), usando E. coli BB4 como bacteria de plaqueo.

Se hicieron dos replicados de cada placa en filtros de celulosa (Schleicher y Schüll BA85) como se describe en Sambrook et al. (1989, p. 12.16-12.17). El AXDA_{NIG} fue visualizado usando anticuerpos producidos contra AXDA_{TUB} purificado (Ejemplo 4.1) después de inmunotinción, como se describe en la solicitud de patente europea 91205944.5 (publicación nº 0 463 706 A1). Los halos líticos inmunoteñidos, que aparecen por duplicado en los filtros de réplica, fueron identificados; se seleccionaron 8 halos positivos. Cada halo positivo fue levantado de la placa usando una pipeta Pasteur y los fagos fueron eluidos del tapón de agar en 1 ml de tampón SM que contiene 20 \mul de cloroformo, como se describe en Maniatis et al. (1982, p. 64). Los fagos obtenidos fueron purificados repitiendo el procedimiento descrito anteriormente, usando réplicas de filtro de las placas que contienen 50-100 halos de los fagos aislados.

Después de la purificación, los fagos fueron propagados plaqueando 5x10^{3} fagos en medio NZYCM. Después de incubar durante la noche a 37ºC, se obtuvieron placas confluentes, a partir de la cual se eluyeron los fagos añadiendo 5 ml de tampón SM y guardando la placa durante 2 h a 4ºC con agitación intermitente. Después de recoger el sobrenadante empleando una pipeta, las bacterias fueron eliminadas de la solución por centrifugación a 4.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Se añadió al sobrenadante cloroformo al 0,3% y se determinó el número de pfu. Estos materiales de fago contienen aproximadamente 10^{10} pfu/ml.

Ejemplo 4.3

Análisis de restricción en clones de cDNA de axdA

Los clones Uni-ZAP XR recombinantes que contienen cDNA de axdA fueron convertidos en fagómidos Bluescript usando la superinfección con el fago colaborador filamentoso ExAssist^{TM}, que está incluido en el kit de síntesis de cDNA ZAP^{TM} de Stratagene, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El DNA de fagómido fue subsiguientemente aislado como se describe en Sambrook et al. (1989, p. 1.25-1.28).

El DNA aislado de los 8 clones de cDNA de axdA fue sometido a análisis de restricción usando las siguientes enzimas de restricción: EcoRI y XhoI. El DNA fue digerido durante 2 horas a 37ºC en una mezcla de reacción compuesta por las soluciones siguientes: 2 \mul (\approx 1 \mug) de solución de DNA; 2 \mul del apropiado tampón 10 x React (BRL); 10 U de cada enzima de restricción (BRL) y agua destilada estéril para dar un volumen final de 20 \mul. Después de la adición de 4 \mul de tampón de carga de DNA, las muestras se cargaron en un gel de 0,7% TAE-agarosa. Los fragmentos de DNA fueron separados por electroforesis a 80 V durante 1,5 horas.

Los análisis de restricción revelaron que los clones de cDNA de axdA tenían un tamaño molecular de aproximadamente 1,2 kb.

Ejemplo 4.4

Análisis de la secuencia en clones de cDNA de axdA de A. niger

La estructura primaria de los clones de cDNA fue determinada por análisis de secuencia combinado con el uso de oligonucleótidos específicos como cebadores en las reacciones de secuenciación.

Las secuencias de nucleótidos fueron determinadas por el procedimiento de terminación de cadena de didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977) usando el kit de secuenciación de DNA polimerasa Pharmacia T7. El análisis por ordenador se hizo usando el programa PC/GENE.

Ejemplo 4.5

Marcaje del fragmento con ^{32}P

El fragmento de clon de cDNA de axdA de A. niger fue aislado y marcado como se describe en la solicitud de patente europea 91205944.5 (publicación nº 0 463 706 A1, Ejemplos 2.2 y 7.1, incorporada al presente texto como referencia).

Ejemplo 4.6

Selección de la genoteca genómica de A. niger var niger por el gen axdA, y aislamiento del gen

Para la selección de la genoteca genómica de A. niger var niger, construida como se describe en Harmesen et al. (1990), por el gen axdA, se plaquearon 3 x 10^{3} pfu por cada placa en top-agarosa NZYCM que contiene 0,7% de agarosa, en cinco placas NZYCM (1,5% de agar%) de 85 mm de diámetro como se ha descrito (Maniatis et al., 1982, p. 64), usando E. coli LE392 como bacteria de cultivo en placa.

Después de incubar las placas durante la noche a 37ºC, se hicieron dos replicados de cada placa en filtros HybondN (Amersham) como se describe en Maniatis et al (1982, p. 320-321).

Después de humedecer los filtros en 3XSSC, los filtros se lavaron durante 60 minutos a temperatura ambiente en 3xSSC. Los filtros se prehibridaron a 65ºC durante dos horas en tampón para prehibridación que contiene 6xSSC, 0,5% de SDS, 10xsolución de Denhardt, EDTA 0,01 mM y 100 \mug/ml de DNA de esperma de arenque desnaturalizado térmicamente (Boerhinger Mannheim). Después de dos horas de prehibridación, el tampón para prehibridación fue reemplazado por tampón para hibridación que era idéntico al tampón para prehibridación pero que contenía clon de cDNA de axdA de A. niger que contiene un fragmento de 1,2 kb marcado con ^{32}P (véase el Ejemplo 4.3) y se preparó como se describe en el Ejemplo 4.5. Los filtros fueron hibridados durante 18 h a una temperatura de 65ºC.

Después de la hibridación, los filtros se lavaron primero a 65ºC durante 30 minutos en 5 x SSC/0,1% de SDS, seguido por un segundo lavado a 65ºC durante 30 minutos en 2 x SSC/0,1% de SDS. Después se lavaron los filtros a 65ºC durante 30 minutos con 0,1 x SSC/0,1% de SDS, seguido por un último lavado a 65ºC durante 30 minutos en 0,1 x SSC. Los filtros secados con aire se aprietan sobre una hoja de papel Whatman 3MM, se hacen marcas clave con tinta radiactiva, y el papel Whatman y los filtros de cubren con envoltura Saran Wrap. Los halos hibridantes fueron identificados por exposición de película para rayos X Kodak XAR durante 72 h a -70ºC usando una pantalla de intensificación.

Se encontraron diez halos hibridantes positivos que aparecen duplicados en las réplicas. Cuatro halos positivos fueron levantados de la placa, usando una pipeta Pasteur, y los fagos fueron eluidos del tapón de agar en 1 ml de tampón SM que contiene 20 \mul de cloroformo, como se describe en Maniatis et al. (1982, p. 64). Los fagos obtenidos fueron purificados repitiendo el procedimiento descrito anteriormente, usando réplicas de filtro de las placas que contienen 50-100 halos de los fagos aislados.

Después de la purificación, los fagos fueron propagados plaqueando 5x10^{3} fagos en medio NZYCM. Después de incubar durante la noche a 37ºC, se obtuvieron placas confluentes, a partir de la cual se eluyeron los fagos añadiendo 5 ml de tampón SM y guardando la placa durante 2 h a 4ºC con agitación intermitente. Después de recoger el sobrenadante empleando una pipeta, las bacterias fueron eliminadas de la solución por centrifugación a 4.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Al sobrenadante se añadió cloroformo al 0,3% y se determinó el número de pfu. Estos materiales de fago contienen aproximadamente 10^{7} pfu/ml.

Ejemplo 4.7

Aislamiento del DNA del bacteriófago lambda

Cada uno de los fagos aislados fueron propagados combinando 5x10^{9} bacterias E. coli LE392 en 300 \mul de tampón SM con 2x10^{6} fagos e incubando a 37ºC durante 15 minutos. Después del periodo de incubación, las bacterias infectadas se usaron para inocular 100 ml de medio NZYCM precalentado (37ºC) y subsiguientemente se incubaron durante 9-12 horas a 37ºC en un agitador de rotación New Brunswick a 250 rpm, periodo después del cual las bacterias fueron lisadas. Los residuos bacterianos fueron eliminados mediante centrifugación durante 10 minutos a 10.000 rpm a 4ºC, en una centrífuga de alta velocidad Sorvall. Los fagos fueron precipitados del sobrenadante obtenido (100 ml) mediante la adición de 10 g de polietilenglicol-6000 y 11,7 g de NaCl y almacenando la solución durante la noche a 4ºC. Los fagos precipitados se recogieron por centrifugación a 14.000 x g a 4ºC durante 20 minutos. El sobrenadante se retiró mediante aspiración, mientras que las últimas trazas de líquido se eliminaron usando una toalla de papel. Los fagos se resuspendieron cuidadosamente en 4 ml de tampón SM y se extrajeron una vez con un volumen igual de cloroformo.

Antes de que fuese extraído el DNA de las partículas de fago, el DNA y el RNA procedentes de las bacterias lisadas se eliminaron mediante incubación de la suspensión de fago con DNasa I y RNasa A (100 \mug/ml de ambos) durante 30 minutos a 37ºC. El DNA de fago fue posteriormente liberado de los fagos mediante la adición de EDTA a una concentración final de 20 mM, mientras que la proteína fue eliminada de la solución extrayendo dos veces con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1). Después de la separación de las fases por centrifugación usando una centrífuga Sorvall (14.000 x g, 10 minutos), la fase acuosa se extrajo una vez con un volumen igual de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Las fases se separaron mediante centrifugación, después de lo cual el DNA se precipitó de la fase acuosa mediante la adición de 0,1 vol. de perclorato sódico 5 M y 0,1 vol. de isopropanol, e incubación en hielo durante 30 min. El DNA se recuperó por centrifugación durante 10 minutos a 4ºC (14.000 x g). El sobrenadante se eliminó por aspiración, después de lo cual el DNA fue resuspendido en 400 \mul de tampón TE. El DNA se precipitó otra vez de esta solución mediante la adición de 0,1 vol. de acetato sódico 3 M y 2 vol. de etanol. El DNA se reocgió mediante centrifugación durante 10 minutos a 4ºC (14.000 x g). El sobrenadante se eliminó por aspiración, el sedimento que queda se secó brevemente bajo vacío, después de lo cual el DNA fue resuspendido en 125 \mul de tampón TE que contiene 0,1 \mug/ml de RNasa A. Este procedimiento de purificación tiene por resultado el aislamiento de aproximadamente 50-100 \mug de DNA de cada fago.

Ejemplo 4.8

Análisis de Southern de fagos que contienen DNA de axdA de A. niger var. niger

El DNA aislado de los fagos \lambda_{nigaxd1} a \lambda_{nigaxd4} fue analizado usando las siguientes enzimas de restricción: KpnI; SalI; SstI; XbaI y XhoI, y las combinaciones KpnI + XbaI; KpnI + SstI y KpnI + XhoI, durante cinco horas a 37ºC, en una mezcla de reacción compuesta por las soluciones siguientes: 5 \mul (\approx 1 \mug) de solución de DNA; 2 \mul del tampón 10 x React (BRL) apropiado; 10 U de enzima de restricción (BRL) y agua destilada estéril para dar un volumen final de 20 \mul. Después de la digestión, el DNA fue precipitado mediante la adición de 0,1 vol. de NaAc 3 M y 2 vol. de etanol. El DNA se recogió por centrifugación durante 10 minutos a temperatura abmiente (14.000 x g). El sobrenadante se eliminó por aspiración, el sedimento que queda se secó brevemente bajo vacío y se resuspendió en agua destilada estéril. Después de la adición de 4 \mul de tampón de carga de DNA, las muestras se incubaron durante 10 minutos a 65ºC y se enfriaron rápidamente en hielo, antes de cargarlas en un gel de agarosa al 0,6% en tampón TAE. Los fragmentos de DNA fueron separados por electroforesis a 25 V durante 15-18 horas.

Después de la electroforesis, el DNA fue transferido y desnaturalizado por transferencia alcalina a vacío (VacuGene XL, Pharmacia LKB) a membrana de nilón (HybondN, Amersham) como se describe en el manual de instrucciones (p. 25-26), y a continuación fue prehibridado e hibridado usando el clon de cDNA de axdA de A. niger marcado, como se describió en el Ejemplo 4.6., y condiciones de hibridación como se describen en el Ejemplo 3.3. El patrón de hibridación se obtiene por exposición de película para rayos X Kodak XAR-5 durante 18 horas a -70ºC usando una pantalla de intensificación.

De los resultados obtenidos se llegó a la conclusión de que el DNA de los cuatro clones aislados se hibridó con el cDNA de axdA de A. niger. En los cuatro clones se encontraron fragmentos procedentes de la misma región genómica.

Ejemplo 4.9

Subclonación del gen axdA de A. niger var niger

El fragmento xhoI de 3,7 kb de \lambda_{nigaxd1} fue aislado del gel de agarosa al 0,7% por el método "freeze-squeeze" (congelar-exprimir): Después de la electroforesis, la banda apropiada se corta y se agita suavemente durante 30 minutos en 1 ml de solución de FS1 (NaAc 0,3 M, pH 7,0; EDTA 1 mM). El corte de agarosa fue transferido a un tubo Eppendorf de 0,5 ml, que contenía un pequeño tapón de lana de vidrio siliconizada y un orificio en el fondo, y se congeló en nitrógeno líquido. El tubo de 0,5 ml se transfirió después a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y a continuación se centrifugó durante 10 minutos. Al sobrenadante se añadió 1/50 volumen de solución FS2 (MgCl_{2} 0,5 M; 5% de ácido acético) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Después de 20 minutos de incubación a -70ºC, el DNA se recogió por centrifugación durante 15 minutos a 14.000 x g a 4ºC. Después de eliminar el sobrenadante, el sedimento de DNA se seó usando una centrífuga a vacío Savant Speedvac. El DNA se disuelve en 10 \mul de tampón TE y se determina la concentración por electroforesis en agarosa, usando DNA de lambda con una concentración conocida como referencia, y tinción con bromuro de etidio para detectar el DNA.

El vector Pbluescript SK^{-} digerido con XhoI y desfosforilado con fosfatasa alcalina se preparó como sigue: se mezcló 1 \mul (1 \mug/\mul) de pBluescript con 2 \mul de 10xReact 2 (BRL), 1 \mul (IU/\mul) de XhoI y 16 \mul de agua destilada estéril. El DNA fue digerido durante 2 horas a 37ºC, después de lo cual se añadieron 0,5 \mul de fosfatasa alcalina (1 U/\mul) (Pharmacia), seguido por otra incubación a 37ºC durante 30 minutos más. El vector linealizado se aisló de un gel de agarosa al 0,7% como se describió antes.

El fragmento XhoI de 3,7 kb fue ligado en el vector pBluescript SK^{-} digerido con XhoI, desfosforilado, por el procedimiento siguiente: se mezclaron 40 ng de fragmento pBluescript con 300 ng de fragmento XhoI de 3,7 kb y 4 \mul de 5 x tampón para ligación (Tris-HCl 500 mM, pH 7,6; MgCl_{2} 100 mM; ATP 10 mM; ditiotreitol 10 mM; 25% de PEG-600) y se añadió a esta mezcla 1 \mul (1 U/\mul) de DNA ligasa T4 (BRL), dando por resultado un volumen final de 20 \mul. El plásmido resultante fue designado pIM3002. Después de la incubación durante 16 h a 16ºC, la mezcla se diluye a 100 \mul con tampón Ca-HEPES pH 7,0. Se usan 10 \mul de la mezcla diluida para transformar células competentes de E. coli DH5\alpha preparadas como sigue: 200 \mul de un cultivo durante la noche de E. coli DH5\alpha predesarrollado en medio LB (medio LB por 1000 ml: 10 g de peptona tripticasa (BBL), 5 g de extracto de levadura (BBL), 10 g de NaCl, Tris-HCl 0,5 mM pH 7,5). Este cultivo fue incubado en un agitador orbital a 37ºC hasta que su densidad correspondía a una D.O._{600} de 0,15-0,2. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación a 5000 rpm a 4ºC. Después de desechar el sobrenadante, las células se mantuvieron en hielo constantemente. El sedimento bacteriano se lavó en 100 ml de MgCl_{2} 100 mM, Tris-HCl 5 mM pH 7,4 resuspendiendo estas células, y a continuación se centrifugó como se describió antes. Esto se repitió con 100 ml de CaCl_{2} 100 mM, Tris-HCl 5 mM pH 7,4. Finalmente, las células fueron resuspendidas en 2 ml de CaCl_{2} 100 mM, Tris-HCl 5 mM pH 7,4, 14% de glicerol. Partes alícuotas (50 \mul) fueron usadas inmediatamente para transformación, o bien se congelaron a -70ºC.

Las células competentes de E. coli DH5\alpha fueron usadas en experimentos de transformación combinando 50 \mul de la suspensión de células con 4,5 \mul de la mezcla de ligación. Después de un periodo de incubación en hielo de 30 minutos, las células se incubaron durante 2 minutos a 42ºC. Después se añadió 1 ml de medio LB y las células se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Después se recogieron las bacterias por centrifugación a 14.000 g durante 30 s. Después de desechar el sobrenadante, las células se resuspendieron en 200 \mul de medio LB. La suspensión bacteriana resultante fue plaqueada en medio LB que contiene 100 \mug/ml de ampicilina, 50 \mug/ml de X-gaI y 60 \mug/ml de ITPG.

Una selección de doce de las colonias resultantes se desarrolló durante la noche en medio LB que contiene 100 \mug/ml de ampicilina. De los cultivos se aisla el DNA de plásmido por el método de la lisis alcalina como se describe en Maniatis et al. (1982, p. 368-369), que se usa en análisis de restricción, como se describe en el Ejemplo 4.3 para seleccionar un clon que alberga el plásmido deseado. El DNA de plásmido es aislado a gran escala a partir de cultivos de 250 ml de E. coli DH5\alpha que contienen el plásmido pIM3002 desarrollado en medio LB que contiene 100 \mug/ml de ampicilina usando el kit Nucleobond PC-500 (Nagel) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido pIM3002 se analiza con más detalle mediante enzimas de restricción dando por resultado el mapa de restricción mostrado en la Fig. 4. Una muestra de E. coli DH5\alpha que contiene pIM3002 ha sido depositada el 28 de agosto de 1995 en CBS, Baarn, Holanda, bajo el número CBS 637.95.

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Ejemplo 4.10

Sobreexpresión del gen clonado en A. niger NW219

Ejemplo 4.10.1

Introducción del axdA de A. niger var. niger en A. niger NW219 por cotransformación

El plásmido pIM3002 obtenido en el Ejemplo 4.9 fue introducido en A. niger por cotransformación de A niger NW219 usando el pyrA de A. niger como marcador selectivo en el plásmido pGW635 (Goosen et al., 1987) y el plásmido pIM3002 como plásmido cotransformante. Una muestra de A. niger NW219 fue depositada el 25 de agosto de 1995 en CBS, Baarn, Holanda, bajo el número CBS 635.95.

Se prepararon protoplastos de micelio desarrollando A. niger NW219 en medio mínimo suplementado con 0,5% de extracto de levadura, 0,2% de casaminoácidos, glucosa 50 mM, nicotinamida 10 mM y uridina 10 mM durante 18 h a 30ºC. La preparación de protoplastos de A. niger NW219 y el procedimiento de transformación se realizaron como se describe en Goosen et al., 1987. Los transformantes PYR^{+} resultantes fueron analizados en relación con la expresión del gen axdA de A. niger var niger mediante análisis de transferencia Western.

Ejemplo 4.10.2

Selección de transformantes por la expresión del gen axdA de A. niger var niger

Los transformantes obtenidos en el Ejemplo 4.10.1 fueron analizados en relación con la formación del producto del gen axdA de A. niger var niger, la proteína AXDA_{NIG}. Diez y nueve de estos transformantes fueron usados en un experimento de crecimiento para analizar la expresión de AXDA_{NIG}. Se usó la cepa A. niger N402 como testigo de tipo silvestre. Los transformantes fueron desarrollados, como se describió en el Ejemplo 3.1, durante 24, 40, 48 y 68 horas. Después del desarrollo, el micelio se eliminó por filtración, y el filtrado del cultivo fue analizado mediante transferencia Western usando anticuerpos producidos contra AXDA_{TUB} en un conejo (Ejemplo 4.1). Ocho de los diez y nueve transformantes analizados sobre produjeron la proteína AXDA_{NIG}, como se detecta por este procedimiento.

Ejemplo 4.11

Análisis de la secuencia y descripción del gen axdA de A. niger var niger

La secuencia del gen axdA de A. niger var niger, su región promotora-reguladora, la parte estructural del gen y la región de terminación, se determinaron subclonando fragmentos de pIM3002 en pBluescript SK^{-} y pUC19 en combinación con el uso de oligonucleótidos específicos como cebadores en las reacciones de secuenciación. La secuencia de nucleótidos se determinó como se describe en el Ejemplo 4.4 (ID. SEC. No:5).

La secuencia obtenida comprende 2101 pb, 783 pb en la región no codificadora 5' y 322 pb en la región no codificadora 3'. En la región no codificadora 5' se encuentra una secuencia (box) TATA en las posiciones 665-670. La parte codificadora del gen axdA de A. niger tiene una longitud de 996 pb y no está interrumpida por intrones. El gen codifica una proteína de un tamaño de 332 aminoácidos. La secuencia N-terminal, como se determina en el Ejemplo 1.5.1 basado en la proteína AXDA de A. niger var. tubigensis, está precedida por un prepéptido de 26 aminoácidos de longitud. La proteína madura tiene un tamaño de 306 aminoácidos y tiene un peso molecular previsto de 33.101 kDa y un punto isoeléctrico teórico de 4,07.

Ejemplo 5.1

Clonación del fragmento de cDNA que contiene secuencias de axdA de A. niger var. tubigensis obtenido por PCR

Ejemplo 5.1.1

Generación de fragmentos de cDNA mediante PCR

La secuencia parcial de aminoácidos del fragmento CNBr interno (ID. SEC. No: 2) como se determinó para AXDA_{TUB}, se usó para diseñar una mezcla de oligonucleótidos. Se derivó la mezcla siguiente:

5'-ATG ATK GTI GAR GCI ATK GG-3' (20-mero) (SEC. ID. No: 3) en donde I representa inosina; K representa A, T o C y R representa A o G. Este oligonucleótido fue derivado de la secuencia interna de aminoácidos de AXDA_{TUB}, como se describió antes en el Ejemplo 1.4.2 desde el aminoácido 1 (I) al aminoácido 6 G. El ATG se derivó de la metionina que se sabe que está presente en el extremo N-terminal del fragmento de péptido a causa del mecanismo de segmentación con CNBr.

La mezcla de oligonucleótidos se usó en una PCR (Saiki et al., 1988) en combinación con el oligonucleótido T7 (Stratagene) 5'-AAT ACG ACT CAC TAT AG-3' (17-mero) (ID. SEC. No: 4) usando cDNA que fue aislado como se describió en el Ejemplo 4.7.

Para una PCR, 2 \mul del \lambda-cDNA resultante se combinaron con 5 \mul de 10 x tampón para reacción (Tris-HCl 100 mM, pH 8,3; KCl 500 mM; MgCl_{2} 15 mM; 0,01% de gelatina), 4 \mul de cada uno de los cuatro trifosfatos de desoxinucelótido 1,25 mM y 0,5 \mug de los oligonucleótidos, en un volumen final de 50 \mul. La mezcla de reacción se agitó y se añadieron 0,5 \mul de TAQ polimerasa (5 U/\mul) (HT Biotechnology, Cambridge UK). El DNA se desnaturalizó térmicamente por incubación durante 3 minutos a 95ºC seguida por 25 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 42ºC y 1 minuto a 72ºC. Después de estos 25 ciclos, la mezcla se incubó durante 5 minutos a 72ºC. El análisis de los productos de reacción reveló dos productos discretos de aproximadamente 500 pb y 600 pb. Basándose en un peso molecular aparente de 32 kDa para AXDA y un peso molecular aparente de 9 kDa para el péptido de CNBr, el fragmento estaba en los límites esperados.

Ejemplo 5.1.2

Clonación y análisis de los fragmentos de PCR de 500 pb y 600 pb

Ejemplo 5.1.2.1

Clonación de los fragmentos de PCR de 500 pb y 600 pb

Ambos fragmentos de PCR de 500 pb y de 600 pb fueron ligados en un vector pGEM^{TM}-T (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de una incubación durante 16 horas a 14ºC, se usaron 4,5 \mul de la mezcla de ligación para transformar células competentes de E. coli DH5\alpha. Una selección de seis de las colonias resultantes procedentes de cada ligación se desarrollo durante la noche en medio LB que contiene 100 \mug/ml de ampicilina. De los cultivos se aisló DNA de plásmido por el método de la lisis alcalina, como se describe en Maniatis et al. (1982, p. 368-369).

Ejemplo 5.1.2.2

Análisis de la secuencia de los fragmentos de PCR de 500 pb y 600 pb

Las estructuras primarias de ambos fragmentos de PCR, de 500 pb y de 600 pb, fueron determinadas mediante la secuenciación de los fragmentos, como se describe en el Ejemplo 4.4.

El análisis por ordenador de las secuencias de nucleótidos de ambos fragmentos de PCR indicó que el fragmento de PCR de 600 pb no tenía ninguna similitud con genes degadadores de arabinoxilano conocidos, o por tanto se le considera como un artefacto de la PCR. La secuencia de nucleótidos del fragmento de 500 pb fue muy similar a la secuencia de nucleótidos del clon de cDNA mostrado en la Figura 4 desde el nucleótido 706 al 1204.

Ejemplo 5.2

Marcaje con ^{32}P del fragmento de PCR de 500 pb

El fragmento de 500 pb obtenido por PCR fue aislado y marcado como se describe en la solicitud de patente europea 91205944.5 (publicación nº 0 463 706 A1, Ejemplos 2.2 y 7.1, incorporada al presente texto como referencia).

Ejemplo 5.3

Selección de la genoteca genómica de A. niger var. tubigensis por el gen axdA

Para la selección de la genoteca genómica de A. niger var. tubigensis construida como se describe en la solicitud de patente europea 91205944.5 (publicación nº 0 463 706 A1), Ejemplo 2, por el gen axdA, se plaquearon 3 x 10^{3} pfu por placa como se describe en el Ejemplo 4.6, con fragmento de PCR de 500 pb marcado con ^{32}P, preparado como se describe en el Ejemplo 5.1.1, como sonda.

Se identificaron tres de los halos hibridantes, que aparecen duplicados en los filtros de réplica, y se designaron \lambda_{tubaxh1} a \lambda_{tubaxh3}. Los fagos fueron aislados y propagados como se describe en el Ejemplo 4.6.

Ejemplo 5.4

Análisis Southern de los fagos que contienen DNA de axdA de A. niger var. tubigensis

Se aisló el DNA de bacteriófagos lambda como se describe en el Ejemplo 4.7. El DNA aislado de fagos \lambda_{tubaxd1} a \lambda_{tubaxd3} fue analizado por análisis Southern usando las siguientes enzimas de restricción: BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, SalI, SstI y XhoI. El análisis Southern se realizó como se describe en el Ejemplo 4.8.

De los resultados obtenidos se llegó a la conclusión de que el DNA de los tres clones aislados se hibridó con el cDNA de axdA de A. niger var. tubigensis. En los tres clones se encontraron fragmentos procedentes de la misma región genómica.

Ejemplo 5.5

Subclonación del gen axdA de A. niger var. tubigensis

El fragmento SstI de 5,5 kb procedente de \lambda_{tubaxd3} fue aislado y ligado en el vector pBluescript SK^{-}, digerido con SstI y desfosforilado como se describe en el Ejemplo 4.9, dando por resultado un plásmido designado como pIM3001. El plásmido pIM3001 se analiza posteriormente mediante enzimas de restricción, resultando el mapa de restricción mostrado en la Figura 6. Una muestra de E. coli DH5\alpha que alberga pIM3001 fue depositada el 28 de agosto de 1995 en CBS, Baam, Holanda, bajo el número CBS 636.95.

Ejemplo 5.6

Expresión del gen axdA de A. niger var. tubigensis clonado, en A. niger NW219

Ejemplo 5.6.1

Introducción del gen axdA de A. niger var. tubigensis en A. niger NW219 por cotransformación

El plásmido pIM3001 obtenido en el Ejemplo 5.5 fue introducido en A. niger por cotransformación de A. niger NW219 como se describe en el Ejemplo 4.10.1. Los transformantes PYR^{+} resultantes fueron después analizados en cuanto a la expresión del gen axdA de A. niger var. tubigensis mediante análisis de transferencia Western.

Ejemplo 5.6.2

Selección de transformantes por la expresión del gen axdA de A. niger var. tubigensis

Los transformantes obtenidos en el Ejemplo 5.6.1 fueron analizados en relación con la formación del producto del gen axdA de A. niger var. tubigensis, la proteína AXDA_{TUB}. Diez y nueve de estos transformantes fueron usados en un experimento de crecimiento para analizar la expresión de AXDA_{TUB}. Se usó la cepa A. niger N402 como testigo de tipo silvestre. Los transformantes fueron desarrollados, como se describió en el Ejemplo 3.1, durante 20, 41, 60 y 86 horas. Después del desarrollo, el micelio se eliminó por filtración, y el filtrado del cultivo fue analizado mediante tranferencia Western usando anticuerpos producidos contra AXDA_{TUB} en un conejo (Ejemplo 4.1). Doce de los diez y nueve transformantes analizados produjeron la proteína AXDA_{TUB}, como se detecta por este procedimiento.

Ejemplo 5.7

Análisis de la secuencia y descripción del gen axdA de A. niger var tubigensis

La secuencia del gen axdA de A. niger var tubigensis, su región promotora/reguladora, la parte estructural del gen y la región de terminación, se determinaron subclonando fragmentos de pIM3001 en pBluescript SK^{-} y pUC19 en combinación con el uso de oligonucleótidos específicos como cebadores en las reacciones de secuenciación. La secuencia de nucleótidos se determinó como se describe en el Ejemplo 4.4 (ID. SEC. No: 7).

La secuencia obtenida comprende 2859 pb, 823 pb en la región 5' no codificadora y 1041 pb en la región 3' no codificadora. En la región 5' no codificadora se encuentra una secuencia (box) CAAT en las posiciones 651-655 y la secuencia TATA se encuentras en las posiciones 713-720. La parte codificadora del gen axdA de A. niger var. tubigensis tiene una longitud de 996 pb y no está interrumpida por intrones. El gen codifica una proteína de un tamaño de 332 aminoácidos. La secuencia N-terminal, como se determina en el Ejemplo 1.5.1, está precedida por un prepéptido de 26 aminoácidos de longitud. La proteína madura tiene un tamaño de 306 aminoácidos y tiene un peso molecular previsto de 33.250 kDa y un punto isoeléctrico teórico de 4,20.

Ejemplo 6 Digestión in vitro del maíz con AXDA Aislamiento de los sólidos insolubles en agua (WIS: Water Insoluble Solids)

Para el sistema de digestión in vitro se aisló la fracción polímera insoluble del maíz. El maíz se molió (3 mm) en un molino Retsch y se desengrasó con hexano (construcción de soxlet para destilación) durante 6 horas. Después de desengrasar, el maíz se secó a 105ºC y se molió de nuevo (1 mm, molino Retsch). A 400 g del maíz desengrasado se añadió 1,5 1, 1,5% SDS/0,05% \beta-mercapto-etanol y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h (para degradar las proteínas) después de lo cual se centrifugó durante 15 minutos a 24.000 g. Después de la desnaturalización de la proteína, el sedimento se lavó 3 veces con 1 l de SDS/\beta-mercapto-etanol y dos veces con 1 l de agua desmineralizada. El sedimento se resuspendió en 4 l de agua desmineralizada y se tamizó sobre 32 \mum. El procecedimiento de lavado y tamización fue repetido. El sedimento grueso de fracción WIS (mayor que 32 \mum) se disolvió en 1 l de tampón de maleato (pH 6,5) y se incubó a 90ºC durante 50 minutos. Se añadieron 2 mg de \alpha-amilasa (Maxamyl^{TM} Gist-brocades) y se incubó durante 16 horas a 30ºC, después de lo cual se centrifugó durante 15 minutos (24.000 g). La digestión enzimática se repitió y después de ello el sedimento se lavó 3 veces con agua desmineralizada a 65ºC. El sedimento (WIS) se liofilizó. Los WIS contenían 30% de xilosa, 29% de arabinosa, 23% de glucosa y 7% de galactosa. Se determinó que la glucosa no era almidón (Boeringer Mannheim, kit de ensayo de almidón).

Ejemplo 6.2

Sistema de digestión in vitro del pollo

Se determinó el contenido de materia seca de los WIS (95,73%) determinando el peso de WIS antes y después de secar a 120ºC.

En el sistema de digestión in vitro del pollo, a 1 g de WIS se añadieron 200 \mu de NaN_{3} (Merck) y 1 ml de patrón interno (sorbitol; 35 mg/ml, Sigma). Para la digestión enzimática en el buche (con (200 \mug de proteína) o sin enzima), la muestra se colmó con tampón (NaAc, pH 5,5) hasta 15 ml, y se incubó a 39ºC durante 1 hora. Para la digestión en el estómago, se añadieron 5 ml de pepsina (5,28 g/l, pH 3,0; Merck) y se incubó durante 1,5 hora a 39ºC. Para la digestión en el intestino, se añadieron 2,5 ml de pancreatina/sales biliares (16 g/0,1 g/l, respectivamente; Merck) y se incubó durante 1,5 horas a 39ºC. La muestra se centrifugó durante 15 minutos (2800 g). El sobrenadante se usó para medir los monoazúcares (HPLC, Spectra Physics; columna HPX-87P, BioRad) que se liberaron durante la digestión enzimática. El sedimento se secó a 120ºC y se determinó el peso. Se calculó el porcentaje de materia seca.

Como testigo, en el sistema in vitro, se añadió una respuesta a la dosis del preparado enzimático crudo (los resultados se muestran en la Figura 3). La enzima AXDA (se añadieron 200 \mug de proteína AXDA) mostró un considerable aumento de la digestión de materia seca en comparación con el blanco. El porcentaje de digestión de materia seca de 15,8% en los WIS de maíz fue un incremento de 4,1% respecto de los WIS de maíz del blanco.

Ejemplo 7 Experimento de digestibilidad in vitro con WIS de maíz

Ejemplo 7.1

Aislamiento de los WIS del maíz

El aislamiento de los WIS del maíz se realizó como se describe en el Ejemplo 6 con algunas modificaciones a causa de la incubación con SDS/mercapto-etanol que no puede ser aplicada al pienso animal. El procedimiento de aislamiento se realizó sobre 1 kg de maíz desengrasado. A 1 kg de maíz desengrasado, se añadieron 4 g de papaína (Gist-brocades)/100 g de proteína de maíz y se suspendió a 30ºC durante 2 horas. Después de esto, la suspensión se digirió con Maxamyl^{TM} (Gist-brocades) (2 ml/l) a 100ºC y se centrifugó (15 minutos, 24.000 g). El sobrenadante fue desechado y el procedimiento de digestión enzimática se repitió en el sedimento. La suspensión se centrifugó de nuevo y se lavó 3 veces con agua desmineralizada (1 L). Después del lavado, el sedimento (los sólidos insolubles en agua (WIS)) fue liofilizado.

El contenido de mono/oligosacáridos en los WIS del maíz se determinó mediante un análisis con ácido trifluoroacético (TFA). A 0,3 g de WIS se añadieron 1 ml de solución de sorbitol 35 mg/ml (patrón interno), 2 ml de agua desmineralizada y 450 \mul de TFA, seguido por la hidrólisis durante 1 hora a 120ºC. Después de enfriar, se añadieron 20 ml de agua desmineralizada y la hidrólisis continuó durante 1 hora a 120ºC. Después de enfriar, las muestras se liofilizaron y se resuspendieron en 3 ml de agua desmineralizada. Los monosacáridos se eliminaron en una columna HPX-87P (Biorad) en un sistema de HPLC (Spectra Physics). La fracción polímera de WIS del maíz contenía: 124,8 mg/g de xilosa; 96,6 mg/g de arabinosa; 28,2 mg/g de galactosa y 156,0 mg/g de glucosa. A causa del alto contenido en glucosa, se analizó almidón en la fracción de WIS (kit de ensayo de almidón, Boehringer Mannheim). Se encontró que la fracción WIS no contenía nada de almidón.

Ejemplo 7.2

Experimento de digestibilidad con pollos de engorde

Se llevó a cabo un experimento para detectar la influencia de la enzima AXDA sobre el contenido de energía metabolizable verdadera de una dieta, a la que se añadió un 20% de WIS de maíz. El método usado fue un "ensayo de Sibbald" modificado.

Pollos de engorde machos (de 3 meses de edad) fueron albergados individualmente en jaulas en una sala de ambiente controlado. Los animales fueron mantenidos en ayunas durante 48 horas. Después, se alimentaron por tubo con una cantidad de pienso determinada exactamente. Para corregir la pérdida de componentes que contienen energía endógena, se incluyó en el experimento un grupo testigo. Estos animales fueron alimentados con 10 g de glucosa, mientras que los otros recibieron 10 g de pienso. Cada pienso se le dio a 6 animales. El grupo testigo de glucosa consistió en 5 animales.

\newpage

Los animales fueron mantenidos en ayunas durante otras 48 horas, periodo durante el cual se recogieron las excretas de forma cuantitativa. Las excretas fueron almacenadas a -20ºC hasta que se realizaron los análisis. Durante este periodo los animales dispusieron de agua una vez, aunque también se les dio agua una vez mediante un tubo.

Las digestas recogidas fueron liofilizadas y pesadas después de equilibrarlas con el aire. En las muestras del pienso y en las muestras de materia seca de digesta se analizó el contenido de nitrógeno y energía.

Los resultados de los animales testigo se usaron para corregir los resultados de los animales alimentados con las dietas experimentales. El método aplicado es una adaptación de los procedimientos experimentales descritos por McNab y Blair, 1988. En dicha publicación se da una descripción de los métodos de análisis y de cálculo.

También se realizaron medidas de digestibilidad de la materia seca in vitro, de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 6.2.

Los tratamientos experimentales fueron los siguientes:

I.

alimentación basal con maíz (tabla 2)

II.

alimentación basal con maíz + 10% de WIS de maíz

III.

alimentación basal con maíz + 20% de WIS de maíz

IV.

alimentación basal con maíz + 20% de WIS de maíz + 100 mg/kg de AXDA

V.

alimentación basal con maíz + 20% de WIS de maíz + 45 mg/kg de enzima cruda

VI.

alimentación basal con maíz + 20% de WIS de maíz + 90 mg/kg de enzima cruda

VII.

alimentación basal con maíz + 20% de WIS de maíz + 200 mg/kg de endoxilanasa.

La composición de la dieta basal se da en la tabla 2.

TABLA 2

4

* La premezcla vitaminas/minerales suministrada por kg de pienso: riboflavina, 4 mg; niacina, 40 mg; ácido d-pantoténico, 12 mg; cloruro de colina, 500 mg; B12, 15 \mug; E, 15 mg; K3, 5 mg; acetato de retinilo, 3,44 mg; colecalciferol, 50 \mu; biotina, 0,1 mg; ácido fólico, 0,75 mg; Fe-SO_{4}. 7H_{2}O, 300 mg; MnO_{2}, 100 mg; CuSO_{4}.5H_{2}O, 100 mg; ZnSO_{4}.7H_{2}O, 150 mg; Na_{2}SeO_{3}. 0,15 mg; antioxidante, 100 mg y virginiamicina, 20 mg.

Los resultados (Energía metabolizable verdadera corregida para nitrógeno (TMEn) y los resultados del ensayo in vitro) se dan en la Tabla 3.

TABLA 3

5

*) Error estándar residual: 0,42. LSD (5%): 0,76. Los valores de TMEn con una letra diferente son significativamente distintos (P< 0,05) de acuerdo con el test LSD.

El nivel de TMEn disminuyó significativamente al aumentar la adición de WIS de maíz.

Todos los preparados enzimáticos mejoraron los valores de TMEn, pero esto fue significativo sólo para la endoxilanasa (+7,0%) y para la AXDA (+10,7%). De acuerdo con los valores medios, la AXDA mejoró el valor de la energía hasta el nivel del pienso basal suplementado con 10% de WIS de maíz.

En el modelo in vitro (que simula el proceso digestivo en el pollo), la AXDA mejoró la digestión de la materia seca de manera importante (24,5%). La endoxilanasa y el preparado enzimático crudo no fueron en este modelo tan efectivos como AXDA.

Ejemplo 8 AXDA en la cocción del pan

Se ensayó la AXDA en una prueba de hogaza "puploaf" usando panes de miga. Las hogazas se cocieron a partir de piezas de masa de 150 g obtenidas mezclando 200 g de harina (Robijn^{TM}/Columbus^{TM} 80/20), 104 ml de agua, 1,4 g de levadura de panadería seca (Fermipan^{TM}), 4 g de sal, 3 g de azúcar, 400 mg de CaCl_{2}.2H_{2}O, 3 mg (15 ppm) de ácido ascórbico, y 5 mg (25 ppm) de alfa-amilasa fúngica (Fermizyme^{TM} P200) y 25 \mug de AXDA purificada. Después de mezclar durante 6 minutos a 52 rpm en un mezclador de pasadores, la masa fue dividida, probada durante 45 minutos a 30ºC, punzonada, probada durante otros 25 minutos, moldeada y puesta en artesa. Después de una prueba final de 70 minutos a 30ºC, la masa se coció durante 20 minutos a 225ºC. Se determinó el volumen de la hogaza por el método de desplazamiento de colza. El volumen de la hogaza aumentó desde 490 ml (testigo) hasta 535 ml para las hogazas que contienen XDA, es decir, un aumento del 9%.

Referencias

Amons, R. (1987), FEBS lett., 212: 68-72.

Carré, B y Brillouet J.M. (1986), J. Science and Food Agric. 37: 341-351.

Chesson, A. (1987), Recent Advances in Animal Food Nutrition. Goosen, T. et al. (1987) Curr. Genet. 11: 499-503.

Hanahan, D. (1983). J. Mol. Biol. 166: 557.

Harmsen, J.A.M. et al., (1990) Curr. Genet. 18: 161-166.

Haresign, W. Y Cole, D.J.A., eds., Butterworth, Londres, 71-89. Jerpseth, B. et al. (1992), Strategies 5: 81-83

Maniatis, T., E.F. Fritsch, J. Sambrook (1982): Molecular cloning, a laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York.

Matsudaira, P. (1987), J. Biol. Chem., 262: 10035-10038.

McCleary, B.V. Y Matheson, N.K. (1986), Adv. Carb. Chem. and Biochem. 44: 147-276.

McNab, J.M. Y Blair, J.C. (1988), British Poultry Science 29: 697-707.

Murray, N. (1977), Mol. Gen. Genet. 150: 53-58.

Saiki R.K. et al. (1988), Science, 239, 487-491

Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989). En: Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.

Sanger, F., Nickelen, S. y Coulson, A.R. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 74: 5463-5467

Silvay, T.J., Berman, M.L., y Enquist, L.W. (1984) Experiments with gene fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Nueva York. p. xi-xii

Short, J.M. et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16: 7583-7600. Visniac, W. Y Santer, M. (1957), Bact. Rev. 21: 195-213 Yanish_perron, C. et al. (1985) Gene 33, 103-119.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Gist-brocades B.V

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: Waterringsweg 1

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Delft

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: Holanda

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (CP): 2611 XT

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: Enzimas degradadoras de arabinoxilano

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NUMERO DE SECUENCIAS: 8

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR.

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disco blando

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPRATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25 (EPO)

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. No: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Aspergillus niger var. Tubigensis

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CEPA: DS 16813

\vskip1.000000\baselineskip

xaa = cys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. No.: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Xaa Ala Leu Pro Ser Ser Tyr}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. No: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Aspergillus niger var. Tubigensis

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CEPA: DS 16813

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: resto de aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 14

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Arg o Asn

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: resto de aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 15

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: resto = incierto

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: resto de aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 16

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: resto = incierto

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: resto de aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 17

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: resto = incierto

\vskip1.000000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. No.: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Val Glu Ala Ile Gly Ser Thr Gly His Arg Tyr Phe Xaa Ser Phe Thr}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. No: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Aspergillus niger var. tubigensis

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CEPA: DS 16813

\vskip1.000000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. No.: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATGATKGTIG ARGCIATKGG

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. No: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Aspergillus niger var. tubigensis

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CEPA: DS 16813

\vskip1.000000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. No.: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AATACGACTC ACTATAG

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. No: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2101 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Aspergillus niger var. tubigensis

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CEPA: CBS 120.49

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: TATA_signal

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 665..670

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 784..1779

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/product= "arabinoxilan degrading enzyme"

\hskip2,3cm

/gene = "axdA" /standard_name = "arabino xilan degrading enzyme"

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sig_peptide

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 784..861

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 862..1779

\vskip1.000000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. No.: 5:

6

7

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. No: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 332 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. No.: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. No: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2859 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTETICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Aspergillus niger var. tubigensis

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CEPA: DS16813

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CART_signal

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 651..655

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: TATA_signal

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 713..720

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 823..1818

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN:/product= "arabinoxilan degrading enzyme"

\hskip2,3cm

/gene = "axdA" /standard_name = "arabinoxilan degrading enzyme"

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sig_peptide

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 823..901

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 901..1818

\vskip1.000000\baselineskip

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. No.: 7:

10

11

12

13

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. No: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 332 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. No.: 8:

14

15

Claims (16)

1. Un fragmento de DNA que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de (1,4)-\beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrolasa, pero que no tiene actividad de endoxilanasa ni de \alpha-arabinofuranosidasa, o un polipéptido precursor del mismo, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos se elige entre:

(a)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 1 a 306, o un polipéptido precursor de dicho polipéptido representado por los aminoácidos -27 a 306 en la ID SEC No: 5;

(b)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 1 a 306, o un polipéptido precursor de dicho polipéptido representado por los aminoácidos -27 a 306 en la ID SEC No: 7;

(c)

una secuencia de nucleótidos representada por los nucleótidos 784 a 1779 en la ID SEC No: 5 o los nucleótidos 823 a 1818 en la ID SEC No: 7;

(d)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de (1,4)-\beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrolasa, pero no tiene actividad de endoxilanasa ni de \alpha-arabinofuranosidasa, la cual secuencia de nucleótidos es capaz de hibridarse con un fragmento de DNA como el representado por los nucleótidos 784 a 1779 en la ID SEC No: 5 o nucleótidos 823 a 1818 en la ID SEC No: 7, bajo condiciones de hibridación que incluyen un primer lavado a 65ºC durante 30 minutos en 5 x SSC/0,1% SDS, seguido por un segundo lavado a 65ºC durante 30 minutos en 2 x SSC/0,1% SDS, seguido por un tercer lavado a 65ºC durante 30 minutos en 0,1 x SSC/0,1% SDS, seguido por un cuarto lavado a 65ºC durante 30 minutos en 0,1 x SSC.

2. Un fragmento de DNA según la reivindicación 1ª, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de (1,4)-\beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrolasa puede obtenerse a partir de un hongo filamentoso.

3. Un fragmento de DNA según la reivindicación 2ª, en el que el hongo filamentoso es una especie Aspergillus.

4. Un fragmento de DNA según la reivindicación 3ª, en el que el Aspergillus es Aspergillus niger o tubigensis.

5. Un fragmento de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de (1,4)-\beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrolasa está unido operativamente a secuencias de DNA reguladoras requeridas para la expresión del fragmento de DNA en una célula hospedador a procariota o eucariota.

6. Un fragmento de DNA según la reivindicación 5ª, en el que las secuencias de DNA reguladoras son heterólogas con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido que tiene actividad de (1,4)-\beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrolasa.

7. Un fragmento de DNA según la reivindicación 6ª, en el que las secuencias de DNA reguladoras heterólogas se eligen para que potencien la expresión del fragmento de DNA en un hospedador, en comparación con la expresión del fragmento de DNA en dicho hospedador cuando está unido a sus secuencias de DNA reguladoras homólogas.

8. Un fragmento de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 7ª, que está en forma de un vector.

9. Una célula hospedadora eucariota o procariota transformada con un fragmento de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 8ª, en la que la célula hospedadora es capaz de una expresión mejorada de un polipéptido que tiene actividad de (1,4)-\beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrolasa, en comparación con la célula hospedadora no trasformada.

10. Una célula hospedadora transformada según la reivindicación 9ª, el cual hospedador pertenece al género Aspergillus.

11. Un método para obtener una célula hospedadora capaz de la expresión mejorada de un polipéptido que tiene actividad de (1,4)-\beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrolasa, tratando una célula hospedadora bajo condiciones de trasformación con un fragmento de DNA recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 8ª, y seleccionar sobre la base de la expresión mejorada de dicho polipéptido que tiene actividad de (1,4)-\beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrolasa.

12. Un método según la reivindicación 11ª, en el que dicha célula hospedadora es una célula hospedadora de Aspergillus.

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13. Un método para obtener un polipéptido que tiene actividad de (1,4)-\beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrola, que comprende las etapas de cultivar células hospedadoras transformadas capaces de producir dicho polipéptido bajo condiciones apropiadas para ello, y recuperar dicho polipéptido, caracterizado porque dichas células hospedadoras transformadas han sido transformadas con un fragmento de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 8ª.

14. Una composición para alimentos o para piensos, que comprende un polipéptido inmovilizado que tiene actividad de (1,4)-\beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrolasa, pero que no tiene actividad de endoxilanasa ni de \alpha-arabinofuranosidasa, pudiendo ser producido dicho polipéptido por el método según la reivindicación 13ª.

15. El uso de un polipéptido que tiene actividad de (1,4)-\beta-D-arabinoxilano arabinofuranohidrolasa, pero que no tiene actividad de endoxilanasa ni de \alpha-arabinofuranosidasa, como aditivo para alimentos o piensos, pudiendo ser producido dicho polipéptido por el método según la reivindicación 13ª.

16. El uso de un polipéptido según la reivindicación 15ª para la fabricación del pan.