CZ120596A3 - Enzymes containing arabinoxylan - Google Patents

Description

Enzymy degradující arabinoxylan

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká oblasti molekulární biologie. Předkládaný vynález se zvláště týká klonování a exprese genů kódujících polypeptidy, vykazující účinek degradace arabinoxylanu. Tyto enzymy jsou vhodné pro použití v průmyslových procesech, jako je pečení chleba, zpracování papíru a papíroviny a při přípravě krmiv a potravin (aditiva).

Dosavadní stav techniky

Složení stěny rostlinné buňky je složité a proměnné. Polysacharidy se v ní většinou nacházejí ve tvaru dlouhých řetězců celulosy (hlavní strukturální komponenta stěny rostlinné buňky), hemicelulosy (zahrnující různé řetězce /3-xylanu) a pektinu. Výskyt, distribuce a strukturální vlastnosti polysacharidů stěny rostlinné buňky jsou určeny (1) rostlinným druhem, (2) odrůdou, (3) typem tkáně, (4) růstovými podmínkami, (5) stářím a (6) zpracováním rostlinného materiálu před použitím jako krmivá.

Existují základní rozdíly mezi monocotyledony (např. obilninami a travinami) a dicotyledony (např. jetel, řepkové semeno a sojou) a mezi semeny a vegetativními částmi rostliny (Chesson, 1987, Carré a Brillouet, 1986).

- 2Monocotyledony jsou charakterizovány přítomností arabinoxylanového komplexu jakožto hlavní hemicelulosové součásti. Základní strukturou hemicelulosy v dicotyledonech je xyloglukanový komplex. Navíc byla v dicotyledonech nalezena vyšší koncentrace pektinu než v monocotyledonech. Semena mají obecně velmi vysoký obsah pektinových látek, ale relativně nízký podíl celulosového materiálu.

V buněčné stěně mohou být určeny tři více či méně interagující polysacharidové struktury:

1. střední lamelové tvary vnější buněčné stěny. Střední lamela, která také slouží jako místo připojení jedněch buněk k druhým v rostlinné tkáni, sestává hlavně z vápníkových solí vysoce esterifikovaných pektinů;

2. primární stěna je situována bezprostředně uvnitř střední lamely. Jedná se o dobře organizovanou strukturu celulosových mikrovláken vnořených do amorfní matrice pektinu, hemicelulosy, fenolových esterů a proteinů;

3. Sekundární stěna se vytváří během zrání rostliny. V průběhu růstu a stárnutí rostliny se ukládají celulosová mikrovlákna, hemicelulosy a lignin.

Primární buněčná stěna zralé, metabolicky aktivní rostlinné buňky (např. mesofyl a epidermis) je náchylnější k enzymatické hydrolýze než sekundární stěna, která se v této fázi stala vysoce lignifikovaná.

Mezi celulosou, hemicelulosou a pektinem v buněčné stěně dochází k vysokému stupni interakce. Enzymatická degradace

- 3těchto značně silně vzájemně vázaných polysacharidových struktur není jednoduchý proces. Nejméně pět různých enzymů je například třeba k úplnému rozkladu arabinoxylanu. Endo-štěpení se provádí použitím endo-/3(l-»4)-D-xylanasy. Exo-(l-»4)-D-xylanasa uvolňuje xvlosové jednotky na neredukčním konci polysacharidu. Tři další enzymy (α-glucuronidasa, a-L-arabinofuranosidasa a acetyl esterasa) se používají k napadení základní xylanové struktury. Volba specifických enzymů je pochopitelně závislá na specifickém typu hemicelulosy, která má být degradována (McCleary a Matheson, 1986).

Enzymy, které napadají boční řetězce základní xylanové struktury mohou být užitečné, neboť mění vlastnosti polymeru, činíce jej tím vhodnějším pro některá použití. Kromě toho mohou tyto enzymy působit synergicky s endo-xylasou štěpící hlavní řetězec (pro rozsáhlou rešerši viz např. Kormelink, 1992, PhD práce, Universita ve Wageningenu).

DNA fragment kódující účinek degradace arabinoxylanu je znám. V přihlášce evropského patentu č. 463 706 je popsána izolace, vlastnosti a genové klonování endoxylasy z Aspergillus tubigensis. Tento enzym není schopen napadat boční řetězce základní arabinoxylanové struktury.

Enzymatická aktivita, schopná napadat boční řetězce je také známa z Aspergillus niger (Kormelink, 1992, citováno výše, kapitoly 6 a 7). Enzym nazývaný Arabinofuranosidasa A (ArafurA) je charakterizován schopností uvolňovat arabinosová residua z oligosacharidové struktury, získané z arabinoxylanů. Nicméně ArafurA není účinný na substrátech o velké molekulové hmotnosti. Navíc Aspergillus niger produkuje enzym známý jako Ara- 4furB, který je účinný na oligosacharidech stejně tak jako na arabinoxylanových strukturách a vysokých molekulových hmotnostech. Enzymatická účinnost enzymu ArafurB je omezena na uvolňování arabinosových residuí z koncových jednoduše substituovaných xylosových residuí. Není pro něj dosud znám žádný DNA fragment.

Účinná látka schopná uvolňovat arabinosová residua z neterminálních jednoduše substituovaných xylosových residuí jak v oligosacharidech, tak i ve arabinoxylanových strukturách o vysokých molekulových hmotnostech byla izolována z Aspergillus awamori. Tanto enzym je nazýván arabinosylan arabinofuranosa hydrolasa (AXH). Dosud není k disposici ani DNA fragment ani popis sekvence. Je zřejmé, že dosud nebyly určeny všechny enzymy, které se zúčastňují degradace arabinoxylanu (Kormelink 1990).

Například dosud nebyl nalezen žádný enzym, napadající molekuly xylosy dvojnásobně substituované arabinosou. Důvodem je to, že tyto enzymy bývají často vylučovány v malých množstvích. Molekulární klonování a nadprodukce těchto enzymů ve vhodném hostiteli, přestože není snadná, je cestou k získám dostatečného množství těchto enzymů v čisté formě, což následně určuje jejich význam v různých aplikacích.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález podává rekombinantní DNA, obsahující DNA fragment kódující polypeptid mající účinek degradace ara- 0binoxylanu a nebo jeho polypeptidický prekursor, ve kterém je DNA fragment zvolen z následujícího souboru:

(a) DNA fragment kódující polypeptid, mající sekvenci aminokyselin představovanou aminokyselinami 1 až 306 nebo polypeptidický prekursor zmíněného polypeptidu, mající sekvenci aminokyselin představovanou aminokyselinami -27 až 306 v sekvenci SEQIDNO 5;

(b) DNA fragment kódující polypeptid, mající sekvenci aminokyselin představovanou aminokyselinami 1 až 306 nebo polypeptidický prekursor zmíněného polypeptidu, mající sekvenci aminokyselin představovanou aminokyselinami -27 až 306 v sekvenci SEQIDNO 7;

(c) DNA fragment kódující variantu nebo část polypeptidu, představovaného aminokyselinovými residuy 1 až 306 znázorněnými v SEQIDNO 5 nebo 7, mající stále účinek degradace arabinoxylanu a nebo jeho polypeptidický prekursor;

(d) DNA fragment kódující polypeptid, mající účinek degradace arabinoxylanu a mající sekvenci nukleotidů představovanou nukleotidy 784 až 1779 v SEQIDNO 5 nebo nukleotidy 823 až 1818 v SEQIDNO 7;

(e) DNA fragment kódující polypeptid mající účinek degradace arabinoxylanu nebo část takového polypeptidu, kterýžto DNA fragment je schopen hybridizace s DNA fragmentem, který je representován nukleotidy 784 až 1779 v SEQIDNO 5 nebo nukleotidy 823 až 1818 v SEQIDNO 7. Rekombinantní DNA podle vynálezu je výhodně získána z vláknitých hub, obzvláště z rodu Aspergillus. Obzvláště výhodná

- 6sekvence rekombinantní DNA zahrnuje DNA sekvenci kódující AXDA z Aspergillus niger nebo tubigensis.

Podle jiného provedení vynálezu rekombinantní DNA podle vynálezu zahrnuje 5’ a 3’ regulační DNA sekvence požadované pro expresi DNA fragmentu v prokaryotní nebo eukaryotní hostitelské buňce, pokud je v ní přítomen. Regulační DNA sekvence jsou výhodně heterologní vzhledem k sekvenci uvedeného DNA fragmentu, kódující polypeptid, obzvláště výhodně jsou regulační DNA sekvence zvoleny tak, aby zvyšovaly expresi DNA fragmentu v uvedeném hostiteli, pokud jsou spojeny s jeho homologními regulačními DNA sekvencemi.

Podle dalšího provedení vynálezu je uvedená rekombinantní DNA ve tvaru vektoru.

Vynález se dále týká transformované eukaryotní nebo prokaryotní hostitelské buňky, obsahující rekombinantní DNA podle vynálezu, výhodně z rodu Aspergillus, stejně tak jako způsob získání hostitelské buňky, schopné zvýšené exprese enzymu degradujícího arabinoxylan, pomocí působení na hostitelskou buňku za transformačních podmínek s rekombinantní DNA podle vynálezu a selekci pro zvýšenou expresi uvedeného enzymu, degradujícího arabinoxylan.

Vynález také podává způsob získání enzymu, degradujícího arabinoxylan, zahrnující kroky růstu hostitelské buňky schopné produkovat uvedený enzym za podmínek, které to umožňují a získání uvedeného enzymu, přičemž uvedené hostitelské buňky nebo jejich předchůdci byli transformovány rekombinantní DNA podle vynálezu.

- IPodle dalšího provedení vynálezu vynález poskytuje v podstatě čistý polypeptid, který má účinek degradace arabinoxylanu a který je charakterizován sekvencí aminokyselin znázorněnou jako SEQIDNO 6 nebo SEQIDNO 8, stejně tak jako jeho genetické obměny a části, které stále mají výše uvedený účinek. Vynález se také týká komposicí, obsahujících v podstatě čistý polypeptid podle nároku 14, použitý v krmivu, potravě a nebo ve zpracování papíru a papíroviny, přičemž je uvedený enzym popřípadě imobilizován.

Vynález také podává způsob použití polypeptidu podle vynálezu, napomáhající degradaci arabinoxylanu například jako aditiva v krmivu nebo potravinách, při zpracování papíru a papíroviny nebo při pečení chleba.

V přihlášce jsou také nárokovány krmivá a potraviny obsahující polypeptid podle vynálezu.

Podle dalšího provedení vynálezu je podána rekombinantní DNA, obsahující DNA fragment representovaný nukleotidy 1 až 783 v sekvenci SEQIDNO 5 a nebo její podfragment, schopný řídit expresi DNA sekvence k ní připojené stejně tak jako rekombinantní DNA obsahující DNA fragment representovaný nukleotidy 1 až 822 v sekvenci SEQIDNO 7 nebo její podfragment, schopný řídit expresi DNA sekvence k ní připojené.

Přehled obrázků na výkrese

Vynález je ilustrován pomocí popisu následujících obrázků:

- 8Obr. 1 je eluční křivka (OD289) účinku degradace arabinoxylanu na HPLC.

Obr. 2 je diagram, ukazující účinek AXDA na frakci ve vodě nerozpustných pevných látkách (WIS - water insoluble solids) kukuřice jako funkci pH.

Obr. 3 ukazuje procento natrávení in vitro kukuřičných WIS jako funkci množství surového enzymu AXDA.

Obr. 4 podává mapu restrikčních míst v pIM3001.

Obr. 5 podává mapu restrikčních míst v pIM3002.

Příklady provedení vynálezu

Předkládaný vynález podává purifikované a izolované molekuly DNA, obsahující sekvenci genů enzymu degradujícího arabinoxylan a jejich genetické varianty. DNA molekuly mohou obsahovat oblast kódující enzym degradující arabinoxylan stejně tak jako přilehlé 5’ a 3’ regulační oblasti. Genetické varianty zahrnují molekuly DNA kódující mutace arabinoxylanových proteinů a degenerované DNA molekuly, pokud požadovaný účinek jimi exprimovaného enzymu zůstává zachován.

Předkládaný vynález také podává DNA konstrukty pro expresi enzymu degradujícího arabinoxylan v požadovaném hostiteli exprese. Tyto konstrukty exprese zahrnují hybridní molekuly DNA, obsahující oblasti kódující enzymy degradující arabinoxylan, funkčně připojené k regulačním oblastem jako jsou

- 9promotor, terminátor a oblast kódující sekvenci, která řídí vylučování proteinu, pocházející z homologních a haterologních organizmů, přičemž tyto regulační oblasti jsou schopny řídit zvýšenou expresi enzymu kódovaného molekulou DNA, kódující enzym degradující arabinoxylan. ve vhodném hostiteli. Výhodně je konstrukt exprese integrován do genomu zvoleného hostitele exprese.

Předkládaný vynález dále podává vektory, výhodně plasmidy, pro klonování a/nebo transformaci mikrobiálního hostitele vložením DNA konstruktů pro expresi enzymů degradujících arabinoxylan do mikrobiálního hostitele.

Navíc předkládaný vynález podává homologní a heterologní hostitele, transformované vektory obsahujícími DNA konstrukty popsané výše. Heterologní hostitel může být zvolen ze souboru zahrnujícího bakterie, kvasinky a houby.

V kontextu předkládaného vynálezu výraz “homologní” znamená vše, co je přirozené molekule DNA, kódující uvažovaný enzym, degradující arabinoxylan, v to počítaje její regulační oblasti. Homologní hostitel je definován jako druh, ze kterého takové molekuly DNA mohou být izolovány.

Výraz “heterologní” je tedy definován jako vše, co není přirozené molekule DNA, kódující uvažovaný enzym, degradující arabinoxylan, v to počítaje její regulační oblasti. Heterologní hostitel je definován jako kterýkoliv mikrobiální druh, který je jiný než ten, ze kterého takové geny kódující enzym degradující arabinoxylan byly izolovány.

- ιόν kontextu předkládaného vynálezu je výraz “zvýšená exprese uvažovaného enzymu degradujícího arabinoxylan” definován jako exprese uvažovaného arabinoxylan degradujícího enzymu ve výši, která přesahuje úroveň produkce, se kterou je možno se obvykle setkat u homologního volně se vyskytujícího organismu. V tomtéž kontextu zvýšená exprese také znamená expresi uvažovaného enzymu degradujícího arabinoxylan v heterologním organismu, který za normálních okolností neprodukuje enzym degradující arabinoxylan, pokud do tohoto heterologního hostitele exprese není vložena molekula DNA nebo konstrukt exprese, kódující uvažovaný enzym, degradující arabinoxylan. Potomci takovýchto hostitelů exprese jsou pochopitelně také zahrnuti do předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález také zahrnuje sekvence DNA, které hybridisují sekvence, získané z výše uvedených hub, ale které se mohou odlišovat sekvencí kodónů v důsledku degenerace genetického kódu nebo na základě mezidruhových odlišností. Vynález tedy zahrnuje i DNA fragmenty, kódující enzym degradující arabinoxylan, které je možno získat z jiných rodů než je Aspergillus. Typický způsob získání podobných fragmentů DNA zahrnuje zkoumání bakterií nebo bakteriofágových plaků, transformovaných rekombinantními plasmidy, obsahujícími fragmenty DNA z organismů, o nichž je známo nebo se o nich předpokládá, že produkují enzym degradující arabinoxylan podle vynálezu. Po replikaci DNA in šitu je DNA uvolněna z buněk nebo plaků a imobilizována na filtrech (obvykle nitrocelulosových). Tyto mohou být prohledávány na komplementární DNA fragmenty použitím označených vzorků nukleových kyselin založených na jakékoliv sekvenci určené pro geny Aspergillus axdA. V závislosti na

- 11tom, zda zkoumaný organismus je blízký nebo vzdálený, je třeba volit hybridizaci a promývací podmínky tak, aby se zvýšil počet správných pozitivních reakcí a snížil počet falešných pozitivních reakcí. Typická procedura pro hybridizaci DNA imobilisované na filtru je popsána v kapitole 5, tabulka 3, str. 120 a 121 v B. D. Hames a S. J. Higgins, eds., Nucleic acid hybridization - a practical approach, IRL Press, Oxford, 1985. Ačkoliv optimální podmínky jsou obvykle určovány empiricky, je možno dát několik základních pravidel pro blíže i vzdáleněji se k sobě vztahující sekvence.

Aby bylo možno identifikovat fragmenty DNA, velmi blízké vzorku, hybridisace se provádí tak, jak je popsáno v tabulce 3 publikace Hames a Higgins, citované výše (což je v podstatě reprodukováno dále v textu) s konečným krokem o vysoké stringenci 0,lxSET pufr (20 krát SET = 3M NaCl, 20 mM EDTA, 0,4 M Tris-HCl. Ph 7,8, 0,1 % SDS) při 68°C.

K určení sekvencí s omezenou homologií ke vzorkuje vhodné postupovat podle tabulky 3 výše citované publikace Hames a Higgins. Závěrečné promývání například v 0,2xSET pufru, 50°C dovolí identifikaci sekvencí, majících zhruba 75 % homologie. Jak je známo osobám, majícím základní dovednosti v oboru, přesný vztah mezi homologií a hybridisačními podmínkami závisí na délce vzorku, složení bází (% G+C) a distribuci sobě neodpovídajících míst; náhodné rozložení má silnější účinek na snížení T_m než nenáhodný nebo shlukový výskyt neodpovídajících si míst.

Výše uvedené podmínky se vztahují na vzorky, mající délku alespoň 300 páru bází, výhodně alespoň 500 párů bází. ještě vý- 12hodněji okolo 1000 párů bází a GC-obsah testované DNA zhruba 50 ± 10 %. Jestliže je GC-obsah daného organismu znám, podmínky mohou být empiricky optimalizovány, berouce v úvahu následující rovnici; (při ÍM NaCl, v rozmezí % < ( %G + C < 75 %) :

Tm — 81,5°C + 0,41 x ( % G + C).

To zhruba znamená, že je-li GC-obsah ( % G + C) o 10 % vyšší než je průměr, (stringentní) hybridizační podmínky mohou být upraveny zvýšením hybridizační a promývací teploty o asi 4°C.

Pro účely popisu tohoto vynálezu je DNA fragment, o němž se řekne, že hybridizuje s DNA fragmentem podle vynálezu, definován jako ten, který dává pozitivní signál na imobilizované DNA po hybridizací se vzorkem o velikosti alespoň 300 párů bází, výhodně alespoň 500 párů bází, ještě výhodněji okolo 1000 párů bází kterékoliv sekvence, znázorněné na SEQIDNO 5 nebo SEIDNO 7 a promývání s použitím postupu z tabulky 3 v kapitole 5 publikace Hames a Higgins (jak je v zásadě popsáno níže) při teplotě 50°C, 2xSET pufr (to jest 0,3 M NaCl).

Postup z tabulky 3 v kapitole 5 publikace Hames a Higgins je v zásadě následující:

(1) prehybridizace na filtru bez vzorku, (2) hybridizace při teplotě mezi 50°C a 68°C při mezi 0,1 až 4xSET pufr (v závislosti na stringenci), lOxDenhardtův roz4

- 13tok (lOOxDenhardtův roztok obsahuje 2 % albuminu z hovězího séra, 2 % Ficollu a 2 % polyvinylpyrrolidonu), 0,1 % SDS, 0,1 % pyrofosforečnanu sodného, 50 μδ/πιΐ DNA z lososího sperma (z materiálu, který lze získat, rozpuštěním 1 mg/ml DNA z lososího sperma, upravené ultrazvukovou vibrací na délku 200 až 500 párů bází, ponecháním v klidu ve vodné lázni po 20 min. a rozpuštěním ve vodě na výslednou koncentraci 1 mg/ml); hybridizační čas není příliš kritický a může být mezi i a 24 hodinami, výhodně 16 hodin (přes noc); vzorek je běžně označen posunem jednořetězcového zlomu s použitím ³²P jako radioaktivním označením na specifickou aktivitu od 5x10' do 5xl0⁸ c.p.m./^g;

(3) (opakované) promývání filtru pomocí 3xSET, 0,1 % SDS, 0,1 % pyrofosforečnanu sodného při 68°C při teplotě mezi 50 a 68°C (v závislosti na požadované stringenci), opakované promývání za současného snižování SET koncentrací na 0,1 %, jedno promývání po 20 min. při 4xSET při pokojové teplotě, sušení filtru na papíru 3MM, exposice filtru na film v kazetě, citlivý na rtg paprsky, při -70°Cpo dobu od 1 do 96 hodin (v závislosti na síle signálu) a vyvolání filmu.

Obecně by měly být objemy prehybridisaČních a hybridisačních směsí udržovány na minimu. Všechny “mokré” kroky mohou být prováděny v malých uzavřených sáčcích v předehřívané vodní lázni.

Výše popsaný postup slouží k definování fragmentů DNA, o nichž je řečeno, že hybridisují podle vynálezu. Je zřejmé, že k identifikaci a izolaci fragmentů DNA podle vynálezu je možno použít početné modifikace tohoto postupu. Rozumí se, že DNA

- 14fragmenty získané způsobem podle vynálezu spadají do působnosti patentových nároků kdykoliv mohou být identifikovány výše popsaným postupem, bez ohledu na to, zda tímto postupem ve skutečnosti byly identifikovány a/nebo izolovány nebo ne.

V literatuře a příručkách, v to počítaje citace dané ve výše uvedené publikaci Hames a Higgins, bylo popsáno mnoho způsobů, vhodných k identifikaci a/nebo izolaci fragmentů DNA podle vynálezu.

Výše uvedený postup se týká polynukleotidových vzorků. Jestliže jsou používány oligonukleotidové vzorky, relace mezi T^, teplotou, při které perfektně spárovaný hybrid je napůl disociován, lze odhadnout vztahem

Td = 4°C na GC pár bází + 2°C na AT pár bází.

Užívajíce existující postupy a uvedené základní pravidlo je možné použít i oligonukleotidové vzorky pro účinnou izolaci DNA fragmentů kódujících enzymy degradující arabinoxylan podle vynálezu z příbuzných i vzdálenějších organismů. Postup používající oligonukleotidy je obzvláště užitečný, pokud je enzym purifikován z odlišného zdroje a byla určena část sekvence aminokyselin. Užívajíce tuto sekvenci, je možné vytvořit soubor degenerovaných vzorků pro prohledávání knihovny DNA nebo Southernův přenos, v zásadě tak jak bylo popsáno výše.

Vhodnými kandidáty pro prohledávání jsou další vláknité houby jako jsou Trichoderma, Penicillium, Dichotomitus squa- 15lus, Disporotrichum dimorphosum a bakterie jako jsou rody Bacillus a podobné. Jestliže počáteční prosívání dává klony, u niž se prokáže, že obsahují hybridizované fragmenty, mohou takovéto fragmenty být izolovány a je-li to požadováno, mohou být sekvencovány, aby se odhalily podobnosti sekvencí.

Jakmile je požadovaný enzym degradující arabinoxylan identifikován, sekvence DNA kódující takový enzym může být získána z vláknitých hub, které jej přirozeně produkují pěstováním hub v prostředí obsahujícím arabinoxylan, izolací požadovaného enzymu degradujícího arabinoxylan použitím známých metod jako jsou ty, které budou popsány v Příkladě 1 a určením alespoň části sekvence aminokyselin purifikovaného proteinu.

DNA vzorky potom mohou být získány navržením oligonukleotidových sekvencí, založených na dedukované částečné sekvenci aminokyslin. Sekvence aminokyselin mohou být určeny z N-konce úplného proteinu a/nebo z N-konců vnitřních peptidických fragmentů získaných proteolytickým nebo chemickým natrávením úplného proteinu. Poté co byl takto získán, DNA vzorek (nebo vzorky) jsou používány k prohledávání genomické nebo cDNA knihovny.

Genomická knihovna může být připravena Částečným natrávením chromosomální DNA houby restrikčním enzymem, který rozeznává DNA sekvence čtyř po sobě následujících nukleotidů, např. SauSA a klonováním výsledných fragmentů do vhodného vektoru plasmidu nebo lambda fágu, například lambda GEM-11.

Alternativně je možno připravit knihovnu cDNA klonováním cDNA, syntetizované z mRNA izolované z buněk hub indukova- 16ných pro syntézu enzymu degradujícího arabinoxylan do vhodného fágového vektoru, například lambda gt 10.

Následně může být po vypěstování dostatečného množství kolonií nebo plaků genomická nebo cDNA knihovna prohledávána pomocí vhodného DNA vzorku.

Jestliže tato metoda je neúspěšná, genomická nebo cDNA knihovna může být diferenčně prohledávána cDNA vzorky, získanými z mRNA z indukovaných a neindukovaných buněk. Indukovaná mRNA je získána z buněk, vypěstovaných v prostředí obsahujícím arabinoxylan jako zdroj uhlíku, zatímco neindukovaná mRNA musí být izolována z buněk pěstovaných na zdroji uhlíku jiném než je arabinoxylan, například na glukose. Mezi klony, které hybridizují pouze s indukovanými cDNA vzorky může být odhalen klon obsahující požadovaný gen, kódující enzym degradující arabinoxylan. Alternativně může být gen enzymu degradujícího arabinoxylan identifikován křížovou hybridizací s odpovídající sekvencí.

Výhodně jsou oligonukleotidové vzorky získány z N-konce sekvence aminokyselin (viz Příklad 1.5.1) enzymu degradujícího arabinoxylan, majícího zjevnou molekulovou hmotnost 32kDa, purifikovaného z filtrátu kultury Aspergillus niger a/nebo ze sekvence aminokyselin vnitřního peptidického fragmentu (viz příklad 1.5.2) získaného natrávením enzymu pomocí CNBr.

Takto získané směsi oligonukleotidů mohou být použity k hybridizací jak s genomickými tak i s cDNA knihovnami.

Alternativně a jak je zde ilustrováno. Purifikovaný enzym

- 17AXDA je použit k vytvoření protilátek. Protilátky jsou použity v imunitním prohledávání knihoven expresí. Takto jsou získány klony expresí AXDA. Je třeba se zmínit o tom, že protein je izolován z A. niger var tubigensis a cDNA je izolována z A. niger N400, což ilustruje, že různé Aspergilli obsahují AXDA účinek.

Se zavedením nových technik amplifikace DNA, jako jsou přímá a inverzní PCR je také možné klonovat DNA fragmenty in vitro pakliže jsou známy terminální sekvence kódujících oblastí.

Dostupnost DNA sekvence kódující enzym degradující arabinoxylan umožňuje konstrukci molekul mutace enzymu pomocí místně zaměřené mutagenese. Jestliže je známa terciální struktura enzymu degradujícího arabinoxylan a jsou lokalizovány jeho katalytické domény a domény vazby substrátu, mohou být zvoleny (například pomocí počítačového modelování) pro mutagenesi aminokyseliny, které nej pravděpodobněji ovlivní funkce katalýzy a vazby substrátu. Pokud terciální struktura proteinu není známa, je možno buď provádět náhodné mutace v celé délce kódující sekvence nebo může být terciální struktura proteinu předpověděna na základě porovnání s podobnými známými enzymy, izolovanými z jiných mikroorganizmů.

Pro usnadnění vložení fragmentu DNA, obsahující sekvenci kódující AXDA do konstruktů exprese, zahrnujících jednu nebo více heterologních regulačních oblastí, může být pro vložení vhodných míst enzymové restrikce na 5’ a 3’ konce sekvence kódující AXDA použita polymerasová řetězová reakce (PCR) (viz H. A. Ehrlich, editor. PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, New York, 1989). Volba restrikčních míst závisí na DNA sekvenci vektoru exprese, to jest

- 18na přítomnosti dalších restrikčních míst v molekule DNA.

K získání zvýšené exprese AXDA proteinu u původního (homologního) produkčního druhu nebo alternativně v heterologním kmenu hub jsou AXDA kódující oblasti DNA, obsahující vlastní řídící oblasti, vloženy do zvoleného hostitele exprese, aby byl zvýšen počet kopií genu a následně i exprese proteinu.

Jestliže je dávána přednost heterolognímu hostiteli exprese a je zvolen některý kmen kvasinek nebo bakterií, je pro konstrukci heterologního vektoru exprese použita nepřerušená molekula DNA (bez intronů), aby se předešlo možnosti, že sestřihové signály sídlící v genomickém fragmentu nejsou rozeznány heterologním hostitelem. Tato nepřerušená molekula DNA může být získána z cDNA knihovny konstruované z mRNA izolované z buněk, indukujících systézu AXDA. Tato knihovna může být prohledávána pomocí oligonukleotidového nebo cDNA vzorku, získaného tak jak bylo popsáno výše. Alternativně může být nepřerušená DNA molekula získána použitím polymerázové řetězové reakce s využitím vhodných 5’ a 3’ oligonukleotidů na první řetězec cDNA systetizovaný z RNA buňky indukované arabinoxylanem.

Zvýšená exprese pořadovaného AXDA může být také dosažena výběrem heterogenních regulačních oblastí, na příklad promotoru, oblasti k’odující sekvenci řídící vylučování a terminační oblasti, které slouží ke zvýšení exprese a jestliže je to požadováno, úroveň vylučování požadovaného proteinu ze zvoleného hostitele exprese a/nebo zajišťuje inducibilní kontrolu exprese požadovaného proteinu.

- 19Kromě původního promotoru požadovaného AXDA je možno pro řízení exprese použít dalších promotorů. Promotor může být zvolen pro jeho účinnost při řízení exprese požadovaného AXDA v požadovaném hostiteli exprese.

V dalším provedení vynálezu může být konstitutivní promotor zvolen tak, aby řídil expresi požadovaného AXDA, relativně nezávislého na ostatních enzymech. Takovýto konstrukt exprese je kromě toho výhodný, neboť překonává nutnost kultivovat hostitele exprese v prostředí obsahujícím arabinoxylan jako indukující substrát.

Příklady silně konstitutivních a/nebo inducibilních promotorů, které jsou výhodně užívány pro expresi v hostitelích představovaných houbami jsou promotory ATP-synthetasa, podjednotka 9 (oliC), triosafosfátisomerasa (tpi), alkohol dehydrogenasa (aclhA), α-amylasa, glukoamylasa (gam), acetamidasa (amdS) a glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa (gpd).

Příklady silných kvasinkových promotorů jsou promotory alkohol dehydrogenasa, laktasa, 3-fosfoglycerát kinasa a triosfosfát isomerasa.

Příklady silných bakteriálních promotorů jsou promotory a< amylasa a Spo% stejně tak jako promotory z genů extracelulární proteasy.

Hybridní promotory mohou také výhodně být používány pro zlepšení inducibilní regulace konstruktu exprese.

Často je požadováno, aby AXDA byl vylučován z hostitele exprese do kultivačního prostředí.

- 20Podle předkládaného vynálezu může být pro ovlivnění vylučování exprimovaného AXDA použita přirozená sekvence řídící vylučování uvažovaného AXDA.

Nicméně zvýšení exprese enzymu někdy vede k produkci proteinu v množstvích, která přesahují schopnost hostitele exprese jej zpracovat a vylučovat, čímž vzniká kritické místo celého procesu produkce, takže proteinový produkt se hromadí v buňce. V souladu s tím předkládaný vynález také umožňuje použití heterologních sekvencí řídících vylučování k zajištění co nejúčinnějšího vylučování enzymu ze zvoleného hostitele exprese.

Podle předkládaného vynálezu může být sekvence řídící vylučování zvolena s přihlédnutím ke zvolenému hostiteli exprese. Heterologní sekvence řídící vylučování může být zvolena tak, že je homologní ostatním regulačním oblastem konstruktu exprese. Například může být použit sekvence řídící vylučování vysoce vylučovaného proteinu glukoamylasy v kombinaci se samotným glukoamylasovým promotorem stejně tak jako v kombinaci s dalšími promotory. V kontextu předkládaného vynálezu mohou být také výhodně použity hybridní signální sekvence.

Příklady výhodných heterologních sekvencí řídících vylučování jsou ty, které pocházejí z genu glukoamylasy (houby), genu α-faktoru (kvasinky) nebo genu a-amylasy (Bacillus).

Terminátory nejsou obecně považovány za kritický prvek pro zvýšenou expresi genů. Je-li to považováno za potřebné, terminátor může být zvolen z téhož genu jako je promotor a nebo může alternativně být použita homologní sekvence.

- 21Kromě genomických fragmentů uvedených výše může transformovaná DNA obsahovat také selekční markér, který vyděluje buňky, které zahrnují požadovaný gen ze souboru netransformovaných buněk. Takovýto selekční markér, opatřený odpovídajícími 3’ a 5’ regulačními sekvencemi, může sídlit v téže molekule DNA, obsahující požadovaný gen a nebo být přítomen v oddělené molekule. V druhém případě musí být provedena kotransformace. Poměr vektor exprese/vektor selekce musí být nastaven tak, aby vysoké procento transformantu obsahujících vektor selekce také obsahovalo vektor obsahující konstrukt exprese požadovaného AXDA.

Nejvhodnější selekční systémy pro průmyslové mikroorganizmy jsou ty, které jsou tvořeny skupinami selekčních markérů, které nevyžadují mutaci organizmu hostitele. Příklady selekčních markérů u hub jsou geny pro acetamidasu (amdS), ATP syntetasu, podjednotku 9 (oliC) a pro benomylovou odolnost (benA). Příklady selekčních markérů u jiných organizmů než jsou houby jsou bakteriální gen resistence G418 (který může být také použit u kvasinek, ale ne u hub), gen odolnosti na ampicilin (E. coli) a gen resistence na neomycin (Bacillus).

Jakmile byl jednou konstrukt exprese sestaven, je transformován do vhodného hostitele klonování, jako je E. coli, aby byl rozmnožen. Poté je konstrukt exprese vložen do vhodného hostitele exprese, kde je konstrukt exprese výhodně integrován do genomu. Někteří hostitelé, jako je například rod Bacillus, mohou být používány jak pro klonování, tak i pro expresi, což vyloučí jeden transformační krok.

Podle předkládaného vynálezu může být pro produkci poža- 22dovaného AXDA použito jako hostitelé exprese řada organizmů.

Při jednom provedení vynálezu může být použit homologní hostitel exprese. Tento případ zahrnuje vložení konstruktu exprese zpět do kmene, ze kterého byla sekvence kódující AXDA izolována a to buď ve zvýšeném počtu kopií genu nebo s řízením pomocí heterologních regulačních oblastí popsaných výše a nebo s využitím obou těchto možností.

Při jiném provedení vynálezu může být požadovaný AXDA produkován na základě vložení a exprese konstruktu DNA, kódující požadovaný enzym degradující arabinoxylan za řízení vhodných regulačních oblastí, do heterologního hostitele jako jsou bakterie, kvasinky a houby. Pro tyto účely je DNA sekvence, kódující požadovaný AXDA, výhodně exprimována za řízení promotorem a terminační sekvencí, které pocházejí z heterologního hostitele. Kromě toho může být nutné nahradit původní sekvenci řídící vylučování sekvencí, která je homologní hostiteli exprese. aby bylo dosaženo co nejúčinnější exprese a vylučování produktu.

Faktory jako je velikost (molekulová hmotnost), potřeby vhodné glykosylace nebo požadavek extracelulárního vylučování uvažovaného AXDA hrají důležitou roli při výběru hostitele exprese.

Gram-negativní bakterie E. coli jsou široce používány jako hostitel heterologní exprese genu. Nicméně velká množství heterologního proteinu mají tendenci akumulovat uvnitř buňky. Následná purifikace požadovaného produktu z množství intracelulárních proteinů E. coli může být někdy obtížná.

- 2.3V kontrastu proti E. coli jsou bakterie rodu Bacillus velmi vhodné pro použití jako heterologní hostitel exprese díky jejich schopnosti vylučovat proteiny do kultivačního prostředí. V závislosti na povaze samotné molekuly DNA, kódující AXDA a/nebo na požadavku dalšího zpracování exprimovaného proteinu, mohou být výhodné použít eukariotní hostitele jako jsou kvasinky nebo houby. V obecnosti jsou kvasinkové buňky výhodnější než buňky hub, neboť lze s nimi snáze manipulovat. Nicméně některé proteiny jsou buď slabě vylučovány z buněk kvasinek nebo v některých případech nejsou vhodně zpracovány (například hyperglykosylace v kvasinkách). V těchto případech by měli být hostitelé zvoleni mezi houbami.

V některých případech může také být heterologní hostitel zvolen tak, aby exprimoval požadovaný AXDA prakticky bez dalších enzymů, degradujících polysacharidy, zvolením hostitele, který normálně takovéto enzymy neprodukuje, jako je například Kluyveromyces lactis.

Příklady výhodných hostitelů exprese v rozsahu předkládaného vynálezu jsou houby, jako je rod Aspergillus (popsaný v EP 184.438 a EP 284.603) a rod Trichoderma, bakterie jako je rod Bacz7bs(popsaný v EP 134.048) a kvasinky, jako je rod Kluyveromyces (popsaný v EP 96.430 a EP 301.670) a rod Saccharomyces.

Obzvláště výhodné je použití hostitelů exprese, zvolených ze souboru zahrnujícího Aspergillus niger, Aspergillus niger var awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus lichniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis a Saccharomyces cerevisiae.

- 24Exprese požadovaného enzymu AXDA je prováděna kultivováním hostitelů exprese, kteří byli transformováni vhodným konstruktem exprese, v běžném nutričním fermentačním prostředí.

FermentaČní prostředí sestává z obvyklého prostředí, obsahujícího zdroj uhlíku (například glukosa, maltosa, melasa a podobně) , zdroj dusíku (například síran amonný, dusičnan amonný, chlorid amonný a podobně), zdroj organického dusíku (například kvasinkový extrakt, sladový extrakt, pepton a podobně) a anorganické nutriční zdroje (například fosforečnany, hořčík, draslík, zinek, železo a podobně). Popřípadě může být přidán inducer (arabinoxylan).

Výběr vhodného prostředí může být založen na volbě hostitele exprese a/nebo na regulačních požadavcích konstruktu exprese. Takováto prostředí jsou dobře známa odborníkům. Prostředí může, pokud je to požadováno, obsahovat další složky, favorizující transformované hostitele exprese proti potenciálně kontaminujícím mikroorganizmům.

Fermentace je prováděna po dobu 0,5 - 20 dní dávkovým způsobem při teplotě, která je v rozmezí od 0°C do 45°C a pH v rozmezí od 2 do 10. Výhodné fermentační podmínky jsou teploty v rozmezí od 20°C do 37°C a pH v rozmězí od 3 do 9. Vhodné podmínky jsou zvoleny v závislosti na volbě hostitele exprese.

Po fermentaci jsou buňky odstraněny z fermentačního pro středí centrifugováním nebo filtrací. Po odstranění buněk může být získán enzym, který je popřípadě čištěn a izolován konvenčními prostředky.

i i

- 25Produkt se stabilně nachází v tekuté nebo pevné formě. Pro některé aplikace je výhodná imobilizace enzymu na pevné matrici.

Enzymy produkované způsobem podle předkládaného vynálezu mohou být použity buď samotné a nebo spolu s dalšími zvolenými enzymy v množství procesů, vyžadujících účinek degradace arabinoxylanu.

Enzym degradující arabinoxylan podle předkládaného vynlezu je používán při zpracování a přípravě potravin (například chéb), krmiv a nápojů (například pivo a ovocné šťávy).

Enzym degradující arabinoxylan je také výhodně používán při výrobě a zpracování papíru a papíroviny, obzvláště v kombinaci s endoxylanasami.

Jak je ilustrováno v předkládané přihlášce vynálezu, enzym degradující arabinoxylan je přidáván do zvířecích krmiv, která jsou bohatá na arabinoxylan. Jestliže je přidán do krmiv (včetně siláže) pro monogastrická zvířata (například drůběž a prasata), které obsahují obiloviny jako je ječmen, pšenice, kukuřice, žito a oves nebo obilné produkty jako je například pšeničné otruby nebo kukuřičné otruby, enzym významně zlepšuje odbourávání stěn rostlinných buněk, což vede k lepšímu využití rostlinných živin zvířaty. Jako důsledek je zlepšena rychlost růstu a/nebo přeměna potravin. Navíc mohou být enzymy degradující arabinoxylan použity pro snížení viskozity krmiv obsahujících arabinoxylan.

Enzym degradující arabinoxylan může být přidán do krmivá

- 26nebo siláže předem, pokud je dávána přednost navlhčenému nebo vlhkému krmivu. Výhodněji je ale AXDA vyrobený postupem podle předkládaného vynálezu používán tak, že pokračuje v hydrolýze arabinoxylanu krmivá in vivo.

Enzymy degradující arabinoxylan jsou také užitečné při přípravě chleba, jak je ilustrováno v příkladě 8.

Experimentální část

Kmeny

E. coli BB4 (Sllvay a kol., 1984):

el4 (mcrA) hsdR514, supE44, supF58, lacYl nebo Á(laclZY)6, galK’2, galT22, metBl, trpR55, A(argF-lac)U169 [F’, proAB, lacI^qZÁM15, TnlO, (tet^r)]

E. coli DH5o: (Hanahan, 1983):

supE44, &lacU169, (4?80kzcÁMl), hsdR17, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, relAl

E. colz LE 392 (Murray, 1977):

el4 (mcrA) hsdR514, supE44, supF58, lacYl nebo Á(laclZY)6, galK2, galT22, metBl, trpR55

E. coli XLl-Blue MRF’ (Jerpseth a kol., 1992):

A(mcrA)183,Á(mcrCB-hsdSMR-mrr(173, endAl, supE44, thi1, recAl, gyrA96, relAl, lac, [F’, proAB, lacI^ZÁMló, TnlO, (tet^r)j

Aspergillus niger N400 (CBS 120.49)

- 27Aspergillus niger N402 (cspAl (Goosen a kol., 1987)

Aspergillus niger NW219 (leuAl, nicAl, pyrA6)

Vektory:

pBluescript SK +/- (Short, J.M. a kol,, 1988) pUCl9 (Yanish-Perron a kol, 1985)

Následující roztok byl připraven podle Sambrook a kol., (1989): Pufry: TE, 5 %xTAE, 20xSSC, hybridizace, lOOxDenhardts, SM, DNA loading

Prostředí: NZYCM, LB a minimální prostředí

Visniacův roztok byl připraven podle Visniac a Santer (1957).

Příklady

Příklad 1: Izolace enzymu

Příklad 1.1: Purifikace a charakterizace proteinu A A. niger var tubigensis s účinkem degradace arabinoxylanu (AXDA)

A. niger var tubigensis DS 16813 byl pěstován způsobem popsaným v přihlášce EPA 0 463 706 bez kvasinkového extraktu a s 2 % frakce surového pšeničného arabinoxylanu namísto ovesného xylanu. Buňky byly odstraněny filtrací a povrchová vrstva byla sušena ultrafiltrací.

Po purifikaci AXDA bylo 5 gramů surového enzymového přípravku rozpuštěno v 100 ml 10 mM Tris-HCl pH 8,0. Roztok enzymu byl filtrován (Seitz/supro no 250 a Seitz/supro EKS)

- 28a zředěn na konečnou proteinovou koncentraci (Biorad protein assay) 5,2 g/1. Surový enzym byl frakcionován pomocí HPLC (Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System) na anionovém výměníkovém sloupci (600 ml) DEAE TSK 650 (M) (25 ml/min). Sloupec byl ekvilibrován pomocí 25 mM TrisHCI (pH 8,0). Vzorek (3 g proteinu) byl aplikován do sloupce a vymýván gradientem ekvilibračního pufru obsahujícího 100 mM NaCl. AXDA enzym byl vymýván při koncentraci NaCl rovné 53 mM, jak je znázorněno na obr. 1.

Příklad 1.2: Optimum pH

Pro stanovení optimálního pH surového AXDA enzymového přípravku byla jako substrát používána frakce vodou nerozpustných pevných látek (WIS - Water Insoluble Solids) kukuřice. 1,6 mg surového enzymového přípravku bylo přidáno k 0,5 g WIS a zředěno na 5 ml pufrem (100 mM NaAc) s pH měnícím se od 3,40 do 7,65. Vzorky byly inkubovány po 60 minut při 39°C a centrifugovány po 15 minut (2800 g). V povrchové vrstvě byly měřeny redukující cukry použitím Sumnerova reagentu.

Příprava Sumnerova reagentu: 10 g fenolu se přidá do 22 ml 10 % NaOH a objem je potom doplněn na 100 ml deminaralizovanou vodou. Přidá se 10 g NaHSO3. K 70 ml tohoto roztoku se přidá 300 ml 4,5 % NaOH a potom 255 g K/Na vínanu a 800 ml 1 % kyseliny 3,5-dinitrosalycilové. Směs se potom míchá při pokojové teplotě dokud se chemikálie nerozpustí.

0,5 ml Sumnerova reagentu se přidá do 200 ul vzorku a vaří se po 10 minut. Po ochlazení se přidá 5 ml demineraiizované vody. Extinkce je měřena při 525 nm. Obsah redukovaných cukrů

- 29vzorku se vypočítává pomocí kalibrační křivky xylosy.

Optimální pH pro enzym bylo 5,0, jak je ukázáno na obr. 2.

Příklad 1.3: Složení aminokyselin

Z AXDA frakcí z DEAE sloupce bylo měřeno složení aminokyselin na sloupci PICO-TAG 150 MM (detekce při 254 nm). Bylo zjištěno následující složení:

aminokyselina	mM	vypočteno mol( %)
ASP	Ull,	13,43
GLU	0,66	8,13
SER	1,00	12,13
GLN	0,00	0,00
GLY	0,84	10,25
HIS	0,12	1,30
ARG/ASN	0,18	2,12
THR	0,71	8,48
ALA	0,74	8,83
PRO	0,34	4,00
TYR	0,46	5,54
VAL	0,43	5,06
MET	0,11	1,30
ILE	0,29	3,42
LEU	0,52	6,12
PHE	0,43	5,18
LYS	0,38	4,59

Tabulka 1: Složení aminokyselin AXDA HPLC pumpa: CM4000; detekce M440, 254 nm; injekce 4 ul,

- 30Gilson 232; sloupec PICO-TAG 150 MM; datový systém Maxima.

Příklad 1.4: Biochémická charakterizace (IEP a molekulová hmot nost)

IEP enzymu AXDA bylo stanoveno na Pharmacia minigel pH

3-9. Protein byl označen pomocí označovacího roztoku Pharmacia na b8zi st59bra. IEP enzymu AXDA bylo odhadnuto na 3,6.

Molekulová hmotnost AXDA byla určena na Pharmacia mini gradient SDS-gelu (10-15 %) a proteiny byly určeny pomocí označení stříbrem (Pharmacia). Molekulová hmotnost AXDA byla odhadnut na 32 kDa.

Příklad 1.5: Sekvencování proteinu A A. niger var tubigensis s účinkem degradace arabinoxylanu (AXDA)

Příklad 1.5.1: Sekvencování aminokyselin pro N-konec proteinu A A. niger var tubigensis s účinkem degradace arabinoxylanu (AXDA)

Přibližně 1 nmol (« 30 pg) AXDA bylo podrobeno elektroforéze na 15 % SDS-polyakrylamidovém gelu, následované elektrickým přenosem na membránu Immobilon-P (Milipore) pomocí metody, kterou popsal Matsudaira (1987). Membránový fragment obsahující hlavní pásmo, mající zjevnou molekulovou hmotnost (SDS-page) 32 kDa byl podroben sekvenční analýze sekvencováním v plynné fázi (Amons, 1987) (laboratoře SON, Leiden). Byla určena následující sekvence:

Lys-??-Ala-Leu-Pro-Ser-Ser-Tyr (SEQIDNO 1).

- 31Příklad 1.5.2: Určení sekvence aminokyselin CNBr peptidu A s účinkem degradace arabinoxylanu (AXDA)

Přibližně 2 nmol AXDA byly podrobeny chemickému štěpení pomocí CNBr. Přibližně 2 nmol (« 60 ^g) AXDA byly vymraženy a resuspendovány v 60 μΐ 70 % kyseliny mravenčí, obsahující 125 μg CNBr (2,5 mg/ml). Reakční směs byla inkubována při pokojové teplotě po 48 hodin. Kapalina byla odpařena pomocí přístroje Speedvac, směs byla promývána sterilní dvakrát destilovanou vodou a opět odpařena. Tento promývací krok se opakoval dvakrát. Reakční směs byla poté podrobena elektroforéze na 15 % SDS-polyakrylamidovém gelu, následované elektropřenosem na membránu Immobilon-P (Millipore) pomocí metody, kterou popsal Matsudaira (1987). Membránový fragment obsahující hlavní pásmo, mající zjevnou molekulovou hmotnost (SDS-page) 9 kDa byl podroben sekvenční analýze sekvencováním v plynné fázi (Amons, 1987) (laboratoře SON, Leiden). Byla určena následující sekvence:

CNBr peptid:

Ile-Val-Glu-Ala-Ile-Gly-Ser-Thr-Gly-HisArg-Tyr-Phe-(Arg/Asn)-/Ser)- (Phe)-(Thr) (SEQIDNO 2). Aminokyselin, u nichž jsou pochybnosti jsou uvedeny v závorkách.

Příklad 2: Enzymatický profil AXDA

Účinek α-arabinofuranosidasy byl měřen na paranitrofenyl arabinofuranosidovém substrátu (Sigma). K 1 ml substrátu bylo přidáno 300 μΐ roztoku enzymu. Po 15 minutách inkubace při

- 3230°C byla reakce přerušena přidáním 5 ml NaoCO3 (5M). Extinkce byla měřena při 402 nm. Byl vypočten účinek a-arabinofuranosidasy (objem xextinkce)/(Ex čas).

Surový enzymový přípravek obsahoval účinek a-arabinofuranosidasy 0,30 pNPAF U/mg. Frakce z DEAE sloupce byly testovány na tento účinek. Složka s účinkem a-arabinofuranosidasy vykázala 3,0 pNPAF U/Mg (viz obr. 1). Jiné frakce s účinkem a-arabinofuranosidasy nebyly nalezeny. Složka s účinkem a-arabinofuranosidasy byla později testována na frakcích kukuřičných ve vodě nerozpustných pevných látek (WIS) a nebylo naměřeno žádné působení na tento substrát.

To indikuje, že AXDA namá žádný účinek a-arabinofuranosidasy na paranitrofenylovém substrátu.

Při dalším pokusu identifikovat enzymatickou aktivitu AXDA byly filtráty kultury Aspergillus niger transformované genem axdA Aspergillus tubigensis prohledávány na účinek na substrát sestávající z pšeničného arabinoxylanu. Gen tubigensis byl dán pod kontrolu (glykolytického) promotoru pyruvátkinasy a růstové podmínky byly zvoleny tak, aby favorizovaly expresi transgenu a vylučovaly expresi endogenních enzymů degradujících arabinosu.

Takto bylo zjištěno, že AXDA má účinek uvolňování arabinosy na arabinoxylanových substrátech s velkou molekulovou hmotností. Obsah proteinu byl určen použitím Sedmakovy metody. Účinek AXDA byl určen přidáním 100 μ\ různých zředění (v 10 mM Na-octanového pufru pH 5,0) filtrátů kultury do 150 μ\ 50 mM octanu sodného (pH 5,0) a 250 μ\ 0,4 % přeničného

- 33arabinoxylanu (Megazyme) a inkubací po jednu hodinu. Reakce byla přerušena zahřátím směsi po 10 minut na 100°C. Arabinoxylan degradující produkty byly monitorovány pomocí HPAEC (high performance anion exchange chromatography) s použitím teplem inaktivovaných produktů inkubace jako vzorků.

Výsledky byly následující:

Tabulka 0: Účinek AXDA Aspergillus tubigensis na pšeničný arabinoxylan

Vzorek	Obsah proteinu (mg/100 mg)	Jednotek AXDA/ml	Specifická aktivita
A3003#12 (conc)	0,057	22,4	191,5
B3003#15 (conc)	0,064	31,48	232,2
C3003#12 (perm)	*	0,028	-
D3003#15 ( perm )	*	0,032	-

* Jedna jednotka účinku arabinosofuranhydrolasy je definována jako množství enzymu, schopného uvolnit 1 μιηοΐ arabinosy z arabinoxylanu za minutu.

Bylo vyvozeno, že AXDA enzym Aspergillus tubigensis má účinek arabinosofuranhydrolasy (AXH).

Účinek arabinasy byl měřen na soupravě testování arabinasy od Megazyme a proveden podle instrukcí. V experimentu neukázala AXDA složka z DEAE sloupce žádný účinek na lineární arabinan.

To indikovalo, že AXDA není arabinasa.

- 34Účinek endoxylanasy byl měřen na ovesném xylanu. 10 ml 5 % xylanové suspense (100 mM NaAc pH 3,5) bylo vařeno po 10 minut. Po ochlazení byla suspenze inkubována při 39°C po 10 minut. Reakce byla započata přidáním 0,5 ml roztoku enzymu. Po několika periodách inkubace (10, 15, 20 a 25 minut) bylo 1,5 ml vzorku z 39°C inkubace přidáno do 1,5 ml demineralizované vody a vařeno po 10 minut. Vzorek byl centrifugován po 15 minut (2800 g). V povrchové vrstvě byly Sumnerovým reagentem detekovány redukující cukry (viz příklad 1.2).

U frakce AXDA byl zjištěn účinek endoxylanasy 399,0 U/mg. Endoxylanasa a AXDA byly potom testovány v in vitro trávicím systému (příklad 6).

Z něho bylo vyvozeno, že účinek endoxylanasy u frakce AXDA byl účinek asociovaný s odlišným polypeptidickým účinkem. Další indikace, že polypeptidy mající účinek endo-xylanasy jsou vymývány spolu s enzymem podobným AXDA byla nalezena v Kormelink (1992, PhD'práce, kapitola 6, str. 107, poslední dva odstavce a str. 108).

Z toho vyplynulo, že AXDA nemá sám o sobě účinek endoxylanasy.

Příklad 3: Konstrukce knihovny expresí cDNA

Příklad 3.1: Indukce a izolace mRNA

Kultura A. niger N400 byla pěstována po 69 resp. 81 hodin způsobem popsaným v EPA 0 463 706 bez kvasinkového extraktu a s 2 % surové frakce pšeničného arabinoxylanu na- 35místo ovesného xylanu, poté bylo mycelium sklizeno filtrací a promýváno sterilní solankou. Mycelium bylo následně zmraženo v tekutém dusíku a poté z něho byl vytvořen prášek, používajíce Microdismembrator (Braun). Totální RNA byla z myceliálního prášku izolována gaunidium thiokyanatan/CsCl protokolem, popsaným v Sambrook a kol. (1989) s výjimkou, že RNA byla centrifugována dvakrát použitím CsCl gradientu. Póly A⁺ mRNA byla izolována z 5 mg totální RNA oligo(dT)-celulocovou chromatografií (Aviv a Leder, 1972, Sambrook a kol., 1989) s následující modifikací: SDS byl vynechán ze všech roztoků a do pufru bylo přidáno 9 % (v/v) dimethylsulfoxidu.

Příklad 3.2: Konstrukce knihovny cDNA cDNA byla syntetizována z 7 pg póly A⁺ mRNA a ligována do bakteriofágu lambdaA Uni-ZAP XR použitím soupravy syntézy ZAP ® -cDNA (Stratagen), postupujíce podle instrukcí výrobce. Po ligaci cDNA do vektoru Uni-ZAP XR byla fágová DNA uzavřena pomocí Packagene® extraktu (Promega), postupujíce podle instrukcí výrobce. Ligace 120 ng cDNA do 1,2 μσ vektoru vytvořilo primární knihovnu obsahující 3, 5 x 10⁴ rekombinantních fágů. Tato primární knihovna byla amplifikována použitím E. coli XLl-Blue MRF’, titrována a uchovávána při 4°C.

Příklad 4: Prohlednávání knihovny cDNA A. niger N400 na (axdÁ) protilátkami vytvořenými proti AXDA a izolace klonů cDNA

Příklad 4.1: Příprava protilátek vytvořenými proti AXDA v králíku

- 36500 μ& AXDA bylo přidáno do 1 mM fosforečnanového pufru pH 7,0 a vymraženo. Protein byl resuspendován v 1 ml sterilní PBS (0,136 M NaCL; 2,7 mM KC1; 8 mM Na₂HPO₄; 1,75 mM KH₂PČ^; pH 7,4). Do této proteinové směsi byl přidán 1 ml Freundsova úplného adjuvans a byla míchána po 30 minut, aby byla získána stabilní emulze. Tato směs byla injektována subkutánně králíkovi. V týdnu 6 byl přidán booster injektováním 250 μξ AXDA v 0,5 ml sterilní PBS do které bylo přidáno 0,5 ml Freundsova neúplného adjuvans. V týdnu 7 byla králíkovi odebrána krev a sérum bylo testováno. V týdnu 13 byl králíkovi podán druhý booster 250 μ% následovaný odběrem krve v týdnu 14. Tato procedura podání boosteru v intervalu 6 týdnů následovaná odběrem krve může být opakována několikrát.

Odebraná krev byla inkubována po 30 minut při 37°C a poté uchovávána při 4°C po 16 hodin. Po centrifugaci při 5000 ot./min v centrifuze Sorvall Higli Speed bylo sérum odebráno.

Příklad 4.2: Imunoprohledávání knihovny cDNA A. niger N400 protilátkami vytvořenými proti AXDAtub

K prohledávání knihovny cDNA A. niger N400, sestrojené v příkladě 3.2 na axdk byly klony cDNA 5 x 10³ pfu na misku umístěny v NZYCM topagarose, obsahující 0,7 % agarosy na miskách o průměru 85 mm s NZYCM (1,5 % agaru) způsobem popsaným v Maniatis a kol., 1982, str. 64, používajíce E. coli BB4 jako miskovou bakterii. Dvě repliky každé misky byly vytvořeny na nitrocelulózových filtrech (Schleicher a Schtill BA 85) způsobem popsaným v Sambrook a kol. (1989, str. 12.16-12.17). AXDAjíig byl vizualizován použitím protilátek proti purifikovanému AXDAtub (příklad 4.1) po imunitním označení, které je

- 37popsáno v přihlášce Evropského patentu 91205844.5 (publikace č. 0 463 706 Al). Imunitně označené plaky, které se objevily v duplikátu na replikovaných filtrech, byly identifikovány; bylo vybráno 8 pozitivních plaků. Každý pozitivní plak byl odebrán z misky použitím Pasteurovy pipety a fágy byly vymyty z agaru v 1 ml SM pufru. obsahujícího 20 μ\ chloroformu, jak je popsáno v Maniatis a kol. 1982, str. 64). Získané fágy byly purifikovány opakováním postupu uvedeného výše, používajíce filtrové repliky z misek, obsahujících 50-100 plaků izolovaných fágů.

Po purifikaci byly fágy rozmnoženy umístěním 5 χ 10³ fágů na prostředí NZYCM. Po inkubaci přes noc při 37°C byly získány misky, z nichž byly fágy vymyty přidáním 5 ml SM pufru a uchováním misek po 2 hodiny při 4°C za občasného třepání. Po odebrání povrchové vrstvy pipetou byly z roztoku odstraněny bakterie centrifugováním při 4000 g po 10 min. při 4°C. K povrchové vrstvě bylo přidáno 0,3 % chloroformu a byl určen počet pfu. Tyto fágové soubory obsahovaly přibližně 10¹⁰ pfu/ml. Příklad 4.3: Restrikční analýza cDNA klonů axdA

Rekombinantní klony Uni-ZAP XR obsahující axdA cDNA byly konvertovány do fágemidu Bluescript užitím superinfekce s fágem ExAssist ® , který je obsažen v soupravě syntézy ZAP ® cDNA od firmy Stratagene, postupujíce podle instrukcí výrobce.

Potom byla izolována fágemidová DNA způsobem, který popisuje Sambrook a kol. (1989, str. 1.25-1.28).

Izolovaná DNA 8 klonů axdA cDNA byla podrobena restikční analýze s použitím následujících restrikčních enzymů: EcoRI a

- 38Xhol. DNA byla natrávena po 2 hodiny při 37°C v reakční směsi sestávající z následujících roztoků: 2 μΐ (« 1 μ%) roztoku DNA, 2 μϊ vhodného lOxReact pufru (BRL), 10 U každého restrikčního enzymu (BRL) a sterilní destilovaná voda do výsledného objemu 20 μ\. Po přidání 4 μΐ DNA loading pufru byly vzorky umístěny na 0,7 % TAE-agarosový gel. DNA fragmenty byly separovány elektroforézou při 80 V po 1,5 hodiny.

Restikční analýza odhalila, že klony axdk cDNA mají molekulovou hmotnost přibližně 1200 párů bází.

Příklad 4.4: Sekvenční analýza cDNA klonů axdk A. niger

Primární struktura cDNA klonů byla určena sekvenční analýzou kombinovanou s použitím specifických oligonukleotidů jako primerů sekvenčních reakcí.

Sekvence nukleotidů byly určeny postupem terminace řetězců dideoxynukleotidů (Sanger a kol. 1977) s použitím soupravy DNA polymerasového sekvencování Pharmacia T7. Počítačová analýza byla prováděna pomocí programu PC/GENE.

Příklad 4.5: Označování fragmentu pomocí³²P

Fragmenty klonů axdk cDNA A. niger byly izolovány a označeny způsobem popsaným v přihlášce Evropského patentu 91205944.5 (publikace č. 0 463 706 Al, příklady 2.2 a 7.1, zahrnutý zde jako reference).

Příklad 4.6: Prohledávání genomické knohovny A. niger var niger na gen axdk a izolace tohoto genu

- 39Pro prohledávání genomické knihovny A. niger var niger zkonstruované postupem podle Harmsena a kol. (1990), na gen axdA bylo umístěno na pět misek o průměru 85 mm s NZYCM (1,5 % agaru) 3 x 10³ pfu na misku na NZYCM top-agarosu, obsahující 0,7 % agarosy postupem podle Maniatis a kol., 1992, str. 64, používajíce E. coli LE392 jako miskových bakterií.

Po inkubaci misek přes noc při 37°C byly udělány dvě repliky každé misky na filtry HybondN (Amersham) způsobem popsaným v Maniatis a kol. (1982, str. 320-321).

Po navlhčení filtrů v 3xSSC byly filtry promývány po 60 minut při pokojové teplotě v 3xSSC. Filtry byly prehybridizovány při 65°C po dvě hodiny v prehybridizačním pufru, obsahujícícm 6xSSC, 0,5 % SDS, lOxDenhardtův roztok, 0,01 M EDTA a 100 jug/ml teplotně denaturovaného DNA spermatu slede (Boehring Mannheim). Po dvou hodinách prehybridizace byl prehybridizační pufr nahražen hybridizačním pufrem, který byl identický s prehybridizačním pufrem, ale obsahoval fragment o 1200 párech bází cDNA klonu axdA A. niger, označený ³²P (viz příklad 4.3) a připravený způsobem popsaným v příkladu 4.5. Filtry byly hybridizovány po 18 hodin při teplotě 65°C.

Po hybridizaci byly filtry nejprve promývány při 65°C po 30 minut v 5xSSC/0,l % SDS a potom podruhé promývány při 65°C po 30 minut v 2xSSC/0,l % SDS. Filtry byly potom promývány při 65°C po 30 minut v 0,lxSSC/0,l % SDS a naposledy promývány při 65°C po 30 minut v 0,lxSSC. Filtry usušené vzduchem byly páskou přilepeny na list papíru Whatman 3MM, byly provedeny značky radioaktivním inkoustem a Whatmanův papír a filtry potom byly pokryty pomocí Saran Wrap. Hybridi- 40zující plaky byly identifikovány expozicí rtg filmu Kodak XAR po 72 hodiny při -70°C, používajíce zesilující stínítko.

Bylo nalezeno deset pozitivních hybridizujících plaků, objevujících se dupliko vaně na replikovaných filtrech. Čtyři pozitivní plaky byly z misek odebrány pomocí Pasteurovy pipety a fágy byly vymyty z agaru v 1 ml SM pufru, obsahujícího 20 μ\ chloroformu způsobem popsaným v Maniatis a kol. (1982, str. 64). Získané fágy byly purifikovány opakováním výše popsaného postupu použitím replik filtrů z misek obsahujících 50-100 plaků izolovaných fágů.

Po purifikaci byly fágy rozmnoženy umístěním 5 x 10³ fágů na prostředí NZYCM. Po inkubaci přes noc při 37°C byly získány plaky, ze kterých byly vymyty fágy přidáním 5 ml SM pufru a uchováním misek po 2 hodiny při 4°C za občasného třepání. Po odebrání povrchové vrstvy pipetou byly bakterie odstraněny z roztoku centrifugováním při 4000 g po 10 minut při 4°C. K povrchové vrstvě bylo přidáno 0,3 % chloroformu a byl určen počet pfu. Tyto fágové soubory obsahovaly přibližně 10⁷ pfu/ml.

Příklad 4.7: Izolace DNA z bakteriofágu lambda

Každý z izolovaných fágů byl rozmnožen zkombinováním 5 x 10⁹ bakterií E. coli LE392 v 300 μϊ SM pufru s 2 x 10⁶ fágy a inkubací při 37°C po 15 minut. Po inkubaci byly infikované bakterie použity k inokulaci 100 ml předehřátého (37°C) NZYCM prostředí a byly následně inkubovány po 9-12 hodin při 37°C v rotačním míchači New Brunswick při 250 ot./min a poté byly bakterie lyžovány. Bakteriální zbytky byl odstraněn centrifugací po 10 minut při 10000 ot./min při 4°C v centrifuze Sor- 41« valí High speed. Fágy byly precipitovány ze získané povrchové vrstvy (100 ml) přidáním 10 g polyethylenglykolu-6000 a 11,7 g NaCl a uchováním roztoku přes noc při 4°C. Precipitované fágy byly odebrány centrifugací při 14000 g při 4°C po 20 minut. Povrchová vrstva byly odebrána odsátím, zatímco poslední stopy tekutiny byly odstraněny papírovým ručníkem. Fágy byly pečlivě resuspendovány v 4 ml SM pufru a jednou extrahovány stejným objemem chloroformu.

Dříve než byla DNA extrahována z fágových částic, DNA a RNA pocházející z lyžovaných bakterií byla odstraněna inkubací fágové suspenze s DNasou I a RNasou A (obě 100 ^g/ml) po 30 minut při 37°C. Fágová DNA byla následně uvolněna z fágů přidáním EDTA na konečnou koncentraci 20 mM, zatímco protein byl z roztoku odebrán extrakcí dvakrát stejným objemem fenolu/chloroformu/isoamyl alkoholu (25:24:1). Po separaci fází centrifugováním za použití centrifugy Sorvall (14000 g, 10 minut) byla vodná fáze extrahována jednou stejným objemem chloroformu/isoamyl alkoholu (24:1). Fáze byly separovány centrifugováním, po kterém byla DNA precipitována z vodné fáze přidáním 0,1 objemu 5 M chloristanu sodného a 0,1 objemu isopropanolu a inkubací na ledu po 30 minut. DNA byla získána centrifugováním po 10 minut při 4°C (14000 g). Povrchová vrstva byla odstraněna odsáním, po kterém byla DNA resuspendována v 400 μ\ TE pufru. DNA byla ještě jednou precipitována z roztoku přidáním 0,1 objemu 3 M octanu sodného a 2 objemů ethanolu. DNA byla získána centrifugováním po 10 minut při 4°C (14000 g). Povrchová vrstva byla odsáta, zbytek byl rychle sušen za vakua, poté byla DNA resuspendována v 125 μϊ TE pufru, obsahujícího 0,1 /xg/ml RNasy A. Touto procedu- 42rou purifikace bylo izolováno přibližně 50-100 pg DNA každého fágu.

Příklad 4.8: Southernova analýza fágů obsahujících axdA DNA A. niger var niger

Izolovaná DNA fágů A_ni_gaxdi až A_ni_gaxci4 byla analyzována Southernovou analýzou použitím následujících restrikčních enzymů: Kpnl·, Sáli] Sstl·, Xbal a Xhol a kombinací Kpnl· + Xba I\ Kpnl + Sstl a Kpnl + Xhol po 5 hodin při 37°C v reakční směsi složené z následujících roztoků: 5 μΐ (« 1 ^g) roztoku DNA, 2 μΐ vhodného 10 x Reakt pufru (BRL); 10 U restrikčního enzymu (BRL) a sterilní destilované vody do konečného objemu 20 μΐ. Po natrávení byla DNA precipitována přidáním 0,1 objemu 3 M NaAc a 2 objemů ethanolu. DNA byla získána centrifugací po 10 minut při pokojové teplotě (14000 g). Povrchová vrstva byla odsáta, zbytek byl rychle sušen za vakua a resuspendován ve sterilní destilované vodě. Po přidání 4 μΐ DNA loading pufru byly vzorky inkubovány po 10 minut při 65° C a rychle ochlazeny na ledě před vložením vzorků na 0,6 % agarosový gel v TAE pufru. DNA fragmenty byly separovány elektroforézou při 25 V po 15-18 hodin.

Po elektroforéze byla DNA přenesena a denaturována alkalickým vakuovým přenosem (VacuGene XL, Pharmacia LKB) na nylonovou membránu (HybondN, Amersham) způsobem popsaným v instrukčním manuálu (str. 25-26) a následně prehybreidizována a hybridizována použitím označeného kolonu axdA cDNA A. niger způsobem, popsaným v příkladě 4.6 a za hybridizačních podmínek popsaných v příkladě 3.3. Hybridizační vzor byl získán expozicí rtg filmu Kodak XAR-5 po 18 hodin při

- 43-70°C za použití intenzifikačního stínítka.

Ze získaných výsledků bylo vyvozeno, že DNA všech čtyř izolovaných klonů hybridizuje s axdk cDNA A. niger. Ve všech čtyřech klonech byly nalezeny fragmenty pocházející z téže genomické oblasti.

Příklad 4.9: Subklonování genu axdk A. niger var niger

Fragment Xhol o 3,7 kb z A_ní_gax<ii byl izolován z 0,7 % agarosového gelu pomocí metody “freeze-squeeze”: po elektroforéze bylo odebráno odpovídající pásmo a jemně třepáno po 30 minut v 1 ml FSl roztoku (0,3 M NaAc pH 7,0; 0,1 mM EDTA). Agarosová vrstva byla přenesena do 0,5 ml zkumavky, která obsahovala malý smotek silikonované skelné vlny a otvor ve dnu, a byla zmrazená v tekutém dusíku. 0,5 ml ze zkumavky bylo potom přeneseno do 1,5 ml zkumavky a následně centrifugováno po 10 minut. K povrchové vrstvě bylo přidáno 1/50 objemu FS2 roztoku (0,5 M MgCl·?; 5 % kyseliny octové) a 2,5 objemu 100 % ethanolu. Po 20 minutách inkubace při -70°C byla DNA odebrána centrifugací po 15 minut při 14000 g při 4°C. Po odstranění povrchové vrstvy byl zbytek s DNA sušen použitím vakuové centrifugy Savant Speedvac. DNA byla rozpuštěna v 10 μΐ TE pufru a koncentrace byla určena agarosovou elektroforézou, používajíce lambda DNA se známou koncentrací jako reference a ethiumbromidové označení pro detekci DNA.

Vektor Pbluescript SK“ natrávený Xhol a defosforylovaný alkalickou fosfatasou připravenou následovně: 1 μϊ (1 μζ/μϊ) pBluescript byl smíchán s 2 μΐ lOxReact 2 (BRL), 1 μϊ (1U/1 μΐ) Xhol a 16 μϊ sterilní destilované vody. DNA byla natrávena po

- 442 hodiny při 37°C, po nichž bylo přidáno 0,5 μ\ alkalické fosfatasy (lU/ΙμΙ) (Pharmacia) a následovala další inkubace při 37°C po dalších 30 minut. Linearizovaný vektor byl izolován z 0,7 % agarosového gelu způsobem popsaným výše.

Fragment Xhol o 3,7 kb byl ligován do defosforylovaného vektoru pBluescript SK, natráveného Xhol, následujícím postupem: 40 ng fragmentu pBluescript bylo smícháno s 300 ng fragmentu Xhol o 3,7 kb a 4 μΐ 5 xligační pufr (500 mM TrisHCl, pH 7,6; 100 mM MgClo; 10 mM ATP; 10 mM dithiothreitu; 25 % PEG-QQQ) a 1 μΐ (lU/μΙ) T4 DNA ligasy (BRL) bylo přidáno do této směsi na konečný objem 20 μϊ. Vzniklý plasmid byl označen pIM3002. Po inkubaci po 16 hodin při 16°C byla směs zředěna na 100 μΐ pomocí Ca-HEPES pH 7,0 pufru. 10 μϊ zředěné směsi bylo použito k transformaci vhodných buněk E. coli DH5a, připravených následujícím způsobem: 200 μϊ kultury E. coli DH5o předem vypěstované přes noc na LB prostředí (LB prostředí na 1000 ml: 10 g trypticasa peptonu (BBL), 5 g kvasinkového extraktu (BBL), 10 g NaCI, 0,5 mM Tris-HCl pH 7,5). Tato kultura byla inkubována v orbitálním míchači při 37°C dokud hustota neodpovídala Ο.ϋ.θοο θ hodnotě 0,15-0,2. Bakterie byly potom získány centrifugováním při 5000 ot/min při 4°C. Po odstranění povrchové vrstvy byly buňky uchovávány stále na vrstvě ledu. Bakteriální zbytek byl promýván v 100 ml 100 mM MgCb, 5 mM Tris-HCl pH 7,4 resuspendováním těchto buněk následovanou centrifugací způsobem popsaným výše. To bylo opakováno s 100 ml 100 mM CaCL2, 5 mM Tris-HCl pH 7,4. Nakonec byly buňky resuspendovány v 2 ml 100 mM CaCb, 5 mM Tris-HCl pH 7,4, 14 % glycerolu. Alikvoty (50 μϊ) byly buď použity okamžitě pro transformaci a nebo zmraženy při ~70°C.

- 45Buňky E. coli DH5o: byly použity při experimentech s transformací kombinováním 50 μΐ buněčné suspenze s 4,5 μΐ ligační směsi. Po 30 minutách inkubace na ledu byly buňky inkubovány po 2 minuty při 42°C. Potom byl přidán 1 ml LB prostředí a buňky byly inkubovány po 1 hodinu při 37°C. Bakterie potom byly získány centrifugováním při 14000 g po 30 s. Po odstranění povrchové vrstvy byly buňky resuspendovány v 200 μΐ LB prostředí. Vzniklá bakteriální suspenze byla umístěna na LB prostředí obsahující 100 μΐ/ml ampicilinu, 50 μδ/ηιΐ X-gal a 60 μ_δ/ιη1 ITPG.

Výběr dvanácti z vzniklých kolonií byl ponechán růst přes noc v LB prostředí obsahujícím 100 μg/ml ampicilinu. Z kultury byla izolována plasmidová DNA alkalickou lýzou, popsanou v Maniatis a kol. (1982, str. 368-369). DNA byla použita v restrikční analýze způsobem popsaným v příkladě 4.3 k výběru klonů, obsahujících požadovaný plasmid. Plasmidová DNA byla izolována ve velkém množství z 250 ml kultury E. coli DH5a, obsahující plasmid pIM3002, vypěstovaný v LB prostředí obsahujícím 100 μ§/ηι1 ampicilinu, užívajíce soupravu Nucleobond PC-500 (Nagel) způsobem podle instrukcí výrobce. Plasmid pIM3002 byl dále analyzován restrikčními enzymy, čímž byla získána restrikční mapa zobrazená na obr. 4. Vzorek E. coli DH5ce, obsahující pIM3002 byl dne 28. srpna 1995 deponován v CBS v Baarnu, Nizozemí, pod číslem 637.95.

Příklad 4.10: Zvýšená exprese klonovaného genu A. niger NW219

Příklad 4:10.1: Vložení axdA A. nigervar nigeráo A. nigerNW219 kotransformací

- 46Plasmid pIM3002, získaný v příkladě 4.9 byl vložen do A. niger kotransformací A. niger NW219, užívajíce A. niger pyrA jako selekční markér na plasmidů pGW635 (Goosen a kol., 1987) a plasmid pIM3002 jako kotransformující plasmid. Vzorek A. niger NW219 byl deponován dne 25. srpna 1995 v CBS, Baarn, Nizozemí pod číslem CBS 635.95.

Z mycelia byla připraveny protoplasty pěstováním A. niger NW219 na minimálním prostředí, doplněném o 0,5 % kvasinkový extrakt, 0,2 % casamino kyselin, 50 Mm glukosy, 10 Mm nicotinamidu a 10 Mm uridinu po 18 hodin při 30°C. Příprava protoplastů A. niger NW219 a transformační procedura byly prováděny způsobem, který popsal Goosen a kol., 1987. Vzniklé PYR⁺ transformanty byly analyzovány na expresi genu axdk A. niger var niger analýzou pomocí Western přenosu.

Příklad 4.10.2: Prohledávání transformantů na expresi genu axdk A. niger var niger

Transformanty získané v příkladě 4.10.1 byly analyzovány na vytváření produktu genu axdk A. niger var niger, proteinu AXDAnig· Devatenáct těchto transformantů bylo použito v růsto vém experimentu k analýza exprese AXDAnig· Kmen A. ni^erN402 byl použit jako “divoký” kontrolní typ. Transformanty byly pěstovány způsobem popsaným v příkladě 3.1 po 24, 40, 48 a 68 hodin. Po růstu bylo mycelium odstraněno filtrací a filtrát kultury byl analyzován Western přenosem za použití protilátek vytvořených proti AXDAtub ^v králíku (příklad 4.1). Osm z těchto devatenácti analyzovaných transformantů vykazovalo nadprodukci proteinu AXDAniq, jak bylo zjištěno tímto postupem.

- 47Příklad 4.11: Sekvenční analýza a popis genu axdA A. niger var niger

Sekvence genu axdA A. niger var niger, jeho promotor/regulační oblast, strukturální část genu a terminační oblast byly určeny subklonováním fragmentů pIM3002 v pBLuescript SK a pUC19 v kombinaci s použitím specifických oligonukleotidů jako primerů sekvenčních reakcí. Sekvence nukleotidů byla určena postupem popsaným v příkladě 4.4 (SEQIDNO 5).

Získaná sekvence obsahovala 2101 párů bází, 783 párů bází v 5’ nekódující oblasti a 322 párů bází v 3’ nekódující oblasti. V 5’ nekódující oblasti byl nalezen TATA-box v pozicích 665-670. Kódující oblast genu axdA A. nigerje 996 párů bází dlouhá a není přerušena introny. Gen kóduje protein o velikosti 332 aminokyselin. N-terminální sekvenci, určené v příkladě 1.5.1 na základě AXDA proteinu A. niger var tubigensis předchází prepeptid o délce 26 aminokyselin. Vlastní protein má délku 306 aminokyselin a má předpovězenou molekulární hmotnosti 33101 kDa a teoretický izoelektrický bod 4,07.

Příklad 5.1: Klonování fragmentu cDNA obsahujícího sekvence axdA A. niger var tubigensis, získaného pomocí PCR Příklad 5.1.1: Generování fragmentů cDNA pomocí PCR

Příklad 5.1.2: Klonování a analýza PCR fragmentů o 500 a 600 párech bází

Příklad 5.1.2.1: Klonování PCR fragmentů o 500 a 600 párech bází

- 48Jak PCR fragmenty o 500 párech bází, tak i PCR fragmenty o 600 párech bází byly ligovány do pGEM ® -T (Promega) vektoru podle návodu výrobce. Po inkubaci po 16 hodin při 14 °C bylo 4,5 μΐ ligační směsi použito k transformaci buněk E. Coli DH5a. Výběr šesti vzniklých kolonií z každé ligace bylo ponecháno růst přes noc v LB prostředí obsahujícím 100 ^g/ml ampicilinu. Plasmidová DNA byla izolována z kultury metodou alkalické lýzy popsanou Maniatisem a kol. (1982, str. 368-369).

Příklad 5.1.2.2: Sekvenční analýza PCR fragmentů o 500 a 600 párech bází

Primární struktura PCR fragmentů o 500 a 600 párech bází byla určena sekvencováním fragmentů způsobem popsaným v příkladě 4.4.

Počítačová analýza sekvencí nukleotidů obou PCR fragmentů ukázala, že PCR fragment o 600 párech bází nevykazoval žádnou podobnost s arabinoxylan degradujícími geny a byl proto považován za artefakt PCR. Sekvence nukleotidů PCR fragmentu o 500 párech bází byla velmi podobná sekvenci nukleotidů cDNA klonu zobrazeného na obr. 4 od nukleotidu 706 po nukleotid 1204.

Příklad 5.2: Označení PCR fragmentu o 500 párech bází pomocí 32 p

Fragment o 500 párech bází, získaný pomocí PCR, byl izolován a označen způsobem popsaným v přihlášce Evropského patentu 91205944:5 (č. publikace 0 463 706 Al, příklady 2.2 a 7.1, zahrnutý zde jako reference).

- 49Příklad 5.3: Prohledávání genomické knihovny A. niger var tubigensis na gen axdk

Pro prohledávání genomické knihovny A. niger var tubigensis, sestrojené postup,en popsaným v přihlášce Evropského patentu 91205944:5 (č. publikace 0 463 706 Al, příklad 2) na gen axdk bylo umístěno do misky 3 χ 10³ pfu na misku způsobem popsaným v příkladě 4.6 se zkušebním vzorkem tvořeným PCR fragmentem o 500 párech bází označeným ³²P, připraveným způsobem popsaným v příkladě 5.1.1.

Tři hybridizované plaky, které se objevily duplikátně na replikovaných filtrech, byly identifikovány a byly označeny A_tubaxbi až A_tubaxh3· Fágy byly izolovány a rozmnoženy způsobem popsaným v příkladě 4.6.

Příklad 5.4: Southernova analýza fágů obsahujících axdk DNA A. niger var tubigensis

DNA byla izolována z lambda bakteriofágů způsobem popsaným v příkladě 4.7. Izolovaná DNA fágů A_tubaxhl až A_tubaxh3 byla analyzována způsobem podle Southerna používajíce následující restrikční enzymy: BamHI, EcoRI, HindlII, KpnI, Sáli, Sstl a Xhol. Southernova analýza byla prováděna způsobem popsaným v příkladě 4.8.

Ze získaných výsledků bylo vyvozeno, že DNA všech tří izolovaných klonů hybridizuje s axdk DNA A. niger var tubigensis. Ve všech třech klonech byly nalezeny fragmenty pocházející z téže genomické oblasti.

Příklad 5.5: Subklonování genu axdk A. niger var tubigensis

- 50Sstl fragment o 5,5 kb z A_tubaxh3 byl izolován a ligován do vektoru pBluescript SK^- natráveného Sstl a defosforylovaného způsobem popsaným v příkladě 4.9, čímž byl získán plasmid pIM3001. Plasmid. pIM3001 byl dále analyzován restrikční analýzou pomocí restrikčních enzymů a tímto způsobem byla získána restrikční mapa zobrazená na obr. 6. Vzorek E. coli DH5o: obsahující pIM3001 byl deponován 28. srpna 1995 v CBS, Baarn, Nizozemí, pod číslem CBS 636.95.

Příklad 5.6: Exprese klonovaného genu axdA A. niger var tubigensis v A. niger NW219

Příklad 5.6.1: Vložení genu axdA A. niger var tubigensis do A. niýer NW219 kotransformací

Plasmid pIM3001, získaný v příkladě 5.5, byl vložen do A. niger kotransformací A. niger NW219 způsobem popsaným v příkladě 4.10.1. Vzniklé transformanty PYR⁺ byly potom analyzovány na expresi genu axdA A. niger var tubigensis pomocí analýzy Western přenosem.

Příklad 5.6.2: Prohledávání transformantů na expresi genu axdA A. niger var tubigensis

Transformanty získané postupem popsaným v příkladě 5.6.1 byly analyzovány na vytváření produktu genu axdA A. niger var tubigensis, proteinu AXDAjub- V růstovém experimentu na expresi AXDAtub bylo použito devatenáct těchto transformantů. Kmen A. niger N402 byl použit jako “divoký” kontrolní vzorek. Transformanty byly ponechány růst způsobem popsaným v příkladě 3.1 po 20, 41, 60 a 86 hodin. Po růstu bylo mycelium i

- 51odstraněno filtrací a filtrát kultury byl analyzován Western přenosem používajíce protilátky vytvořené proti AXDAtub ^v králíku (příklad 4.1). Jak bylo zjištěno touto metodou, dvanáct z devatenácti analyzovaných, transformantů produkovalo protein AXDAtub·

Příklad 5.7: Sekvenční analýza a popis genu axdA A. niger var tubigensis

Sekvence genu axdA A. niger var tubigensis, jeho promotor a regulační oblast, strukturální část genu a terminační oblast byly určeny subklonováním fragmentů z pIM3001 v pBluescript SK“ a pUCl9 spolu s použitím specifických oligonukleotidů jako primerů v sekvečních reakcích. Sekvence nukleotidů byla určena způsobem popsaným v příkladě 4.4. (Viz SEQIDNO 7).

Získaná sekvence obsahovala 2859 párů bází, 823 párů bází v 5’ nekódující oblasti a 1041 párů bází v 3’ nekódující oblasti. V 5’ nekódující oblasti byl nalezen CAAT-box v posici 651-655 a TATA-box v posici 713-720. Kódující část genu axdA A. niger var tubigensis je 996 párů bází dlouhá a není přerušována introny. Gen kóduje protein o velikosti 332 aminokyselin. Nterminální sekvence, která byla určena v příkladě 1.5.1, je předcházena prepeptidem o délce 26 aminokyselin. Vlastní protein má délku 306 aminokyselin a má předpovězenou molekulovou hmotnost 33.250 kDa a teoretický isoelektrický bod 4,20.

Příklad 6: Natrávení kukuřice in vitro enzymem AXDA

Příklad 6.1: Izolace vodou nerozpustných pevných látek (WIS Water Insoluble Solids)

- 52Pro natrávení in vitro byly izolovány ve vodě nerozpustné polymerové frakce kukuřice. Kukuřice byla mleta (3 mm) Retschovým mlýnkem a odtučněna hexanem po 6 hodin (Soxletův přístroj pro destilaci). Po odtučnění byla kukuřice sušena při 105 °C a mleta znovu (1 mm, Retschův mlýnek). Do 400 g odtučněné kukuřice bylo přidáno 1,5 1 1,5 % SDS/0,05 % /3-merkaptoetanolu a mícháno po 1 hodinu při pokojové teplotě po 1 hodinu (aby byly rozloženy proteiny) a poté byla směs centrifugována po 15 minut při 24.000 g. Po denaturaci proteinů byl zbytek promýván 3 krát 11 SDS//3-merkaptoetanolem a 2 krát 1 1 demineralizované vody. Zbytek byl resuspendován v 4 1 demineralizované vody a prosíván na 32 μηι. Promývání a prosívání bylo opakováno. Hrubý zbytek frakce WIS (větší než 32 ^m) byl rozpuštěn v 1 1 maleátového pufru (pH 6,5) a inkubován při 90 °C po 50 minut. Byly přidány 2 mg or-amylasy (Maxamyl® Gist-brocades) a směs byla inkubována po 16 hodin při 30°C, poté byla centrifugována po 15 minut (24.000 g). Enzymatické natrávení bylo opakováno a potom byl zbytek promýván 3 krát demineralizovanou vodou při 65°C. Zbytek (WIS) byl sušen vymrazením. WIS obsahoval 30 % xylosy, 29 % arabinosy, 23 % glukosy a 7 % galaktosy. Bylo zjištěno, že glukosa nebyla škrob (Boeringer Mannheim, souprava testování škrobu).

Příklad 6.2: Drůbeží trávicí systém in vitro

Byl určen obsah pevných látek ve WIS (95,73 %) stanovením hmotnosti WIS před a po sušení při 120 °C.

V drůbežím trávicím systému in vitro bylo k 1 g WIS přidáno 200 μΝηΝβ (Merck) a 1 ml vnitřního standardu (sorbitol, 35 mg/ml, Sigma). Pro enzymatické natrávení obilí (s (200 μ% i

- 53proteinu) a bez enzymu) byl vzorek doplněn pufrem (NaAc, pH 5,5) na 15 ml a inkubován po 1 hodinu při 39 °C. K provedení žaludečního trávení bylo přidáno 5 ml pepsinu (5,28 g/1, pH 3,0, Merck) a směs byla inkubována po 1,5 hodiny při 39°C. K provedení střevního trávení bylo přidáno 2,5 ml směsi pankreatin/žlučová sůl (16 g/1 resp. 0,1 g/1, Merck) a směs byla inkubována po 1,5 hodiny při 39 °C. Vzorek byl centrifugován po 15 minut (2800 g). Povrchová vrstva byla použita k měření monocukrů (HPLC, Spectra Physics, sloupec HPX-87P, Biorad), které byly uvolněny během enzymatického trávení. Zbytek byl usušen při 120 °C a byla určena jeho hmotnost. Bylo vypočteno procento pevných látek.

V systému in vitro byla pro kontrolu přidána dávka surového enzymu (výsledky jsou znázorněny na obr. 3). AXDA enzym (bylo přidáno 200 /zg AXDA proteinu) způsobil významné zvýšení natrávení pevných látek ve srovnání s kontrolním experimentem.

Percentuální velikost natrávení pevných látek ve výši 15,8 % frakce WIS kukuřice při použití enzymu byl vzrůst oproti 4,1 % kukuřičných WIS při kontrolním pokusu.

Příklad 7: Trávicí experiment in vitro s kukuřičnými WIS

Příklad 7.1: Izolace kukuřičných WIS

Izolace kukuřičných WIS byla provedena způsobem popsaným v příkladě 6 s několika modifikacemi, neboť SDS/merkaptoetanolová inkubace nemůže být použita na zvířecí potravu. Postup izolace byl aplikován na 1 kg odtučněné kukuřice. K 1 kg

- 54odtučněné kukuřice byly přidány 4 g papainu (Gist-brocades)/100 g kukuřičného proteinu a suspendovány při 30 °C po 2 hodiny. Poté byla suspense natrávena Maxymylem® (Gist-brocades) (2 ml/1) při 100 °C a centrifugována (15 minut, 24.000 g). Povrchová vrstva byla odstraněna a enzymatická trávicí procedura byla opakována na zbytek. Suspense byla znovu centrifugována a promývána 3 krát demineralizovanou vodou (11). Po promývání byl zbytek (WIS) sušen vy mrazením.

Obsah mono/oligo sacharidů v kukuřičných WIS byl určen pomocí TriFluorAcetic (TFA) analýzy. K 0,3 g WIS byly přidány 1 ml 35 mg/ml sorbitolu (vnitřní standard), 2 ml demineralizované vody a 450 μΐ TFA a následovala hydrolýza po 1 hodinu při 120 °C. Po ochlazení byly vzorky sušeny vymrazením a resuspendovány v 3 ml demineralizované vody. Monosacharidy byly odstraněny na sloupci HPX-87P (Biorad) v systému HPPC (Spectra Physics). WIS polymerová frakce kukuřice obsahovala 124,8 mg/g xylosy, 96,6 mg/g arabinosy, 28,3 mg/g galaktosy a 156,0 mg/g glukosy. Vzhledem k vysokému obsahu glukosy byla WIS frakce analyzována na škrob (souprava testu na škrob, Boehringer Mannheim). Byl ozjištěno, že WIS frakce neobsahuje žádný škrob.

Příklad 7.2: Trávicí experiment s brojlery.

Byl proveden pokus, jehož cílem bylo zjistit vliv anzymu AXDA na skutečný metabolizovatelný energetický obsah diety, do které bylo přidáno 20 % kukuřičných WIS. Použitá metody byl modifikovaný “sibbald-assay”.

Brojleři (samečci, stáří 3 týdny) byli umístěni individuálně v

- 30klecích v klimatizované místnosti. Zvířata byla podrobena hladovění po 48 hodin. Potom bylo podáno přesně určené množství potravy. Pro opravu na ztrátu komponent obsahujících endogenní energii byla v pokuse použita kontrolní skupina. Tato zvířata byla krmena 10 g D-glukosy, zatímco ostatní dostávala 10 g krmivá. Každý typ potravy byl podán 6 zvířatům. Glukosová kontrolní skupina sestávala z 5 zvířat.

Zvířata byla podrobena hladovění po dalších 48 hodin, během nichž byly kvantitativně shoromaždbvány výměšky, které byly uchovávány při -20 °C až do provedení analýzy. Ptáci měli k disposici vodu v průběhu této doby jednou, zatímco jednou jim byla podána voda trubicí.

Shromážděná produkty trávení byly sušeny vymrazením a váženy s provedením opravy na vzduch. Ve vzorcích krmivá a vzorcích pevných látek z produktů trávení byl analyzován obsah dusíku a energie.

Výsledky skupiny kontrolních zvířat byly použity k opravě výsledků pro zvířata krmená zkoušeným krmivém. Použitá metoda byla přizpůsobením experimentálního postupu, který popsali McNab a Blair, 1988. V tomto článku je popsána metoda analýzy a výpočtů.

Bylo také provedeny měření trávení pevných látek in vitro podle metody, popsané v příkladě 6.2

Výsledky pokusů byly následující:

- 56I základní kukuřičné krmivo (tabulka 2)

II základní kukuřičné krmivo + 10 % kukuřičných WIS

III základní kukuřičné krmivo + 20 % kukuřičných WIS

IV základní kukuřičné krmivo + 20 % kukuřičných WIS + 100 mg/kg AXDA

V základní kukuřičné krmivo + 20 % kukuřičných WIS + 45 mg/kg surového enzymu

VI základní kukuřičné krmivo + 20 % kukuřičných WIS + 90 mg/kg surového enzymu

VII základní kukuřičné krmivo + 20 % kukuřičných WIS + 200 mg/kg endoxylanasy

Složení základní diety je dána v tabulce 2.

Tabulka 2: Složení základní diety použité v pokuse

složka základního krmivá	obsah ( %)
kukuřice	50,00
tapioka	19,69
sojová mouka (50 % surového proteinu)	19,45
maso a kostní moučka	3,60
hrách (22,8 % cp)	3,50
rybí moučka	1,00
sojový olej	1,00
drůbeží maso (hydrolyzované)	1,00
fosforečnan vápenatý	1,23
vápenec	0,90
sůl	0,30
L-lysin.HCl	0,13
DL-methionin	0,20
vitaminová a minerální směs*	1,00

- 57bO bD * Vitaminová a minerální směs obsahovala na 1 kg krmivá: č mg riboflavinu, 40 mg niacinu, 12 mg kyseliny cl-pantothenové, 500 mg cholinchloridu, 15 μ% B12, 15 mg E, 5 mg K3, 3,44 mg retinylacetátu, 50 /zg cholekalciferolu, 0,1 mg biotinu, 0,75 mg kyseliny listové, 300 mg FeSC>4.7H2O, 100 mg Mn02, 100 m CUSO4.5H2O, 150 mg ZnSO4.7H2O, 0,15 mg Na2SeC>3, 100 m antioxidantu a 20 mg virginiamycinu.

Výsledky (“True Metabolisable Energy” (TMEn) - skutečná metabolizovatelná energie korigovaná na dusík) a výsledky pokusu in vitro jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3: Skutečná využitelná energie (korigovaná na dusík: TMEn) a stravitelnost pevných látek in vitro

dieta	přidaný enzym	TMEn (KJ/g)	stravitelnost in vitro
I	-	13,59 a *)	36,4
II	-	12,39 b	36,2
III	-	11,17 c	31,9
IV	AXDA	12,37	39,7
v	surový enzym	11,87 bc	31,4
VI	surový enzym	11,63 bc	33,2
VI	endoxylanasa	11,95 b	32,6

*) Residuální standardní chyba: 0,42 LSD (5 %): 0,76

Hodnoty TMEN s různými písmeny byly podle LSD-testu významně odlišné (P<0,05)

Hodnoty TMEn významně klesaly s rostoucím obsahem kukuřičných WIS.

- 58Všechny enzymové přípravky zlepšovaly hodnoty TMEn, ale pouze pro endoxylanasu (+7 %) a pro AXDA (+10,7 %) byla zlepšení významná. Vzhledem ke střední hodnotě zlepšoval AXDA energetické hodnoty na úroveň základního krmivá s přidáním 10 % kukuřičných WIS.

Ve in vitro modelu (simulujícím trávicí proces drůbeže) zlepšil AXDA trávení pevných látek významně (+24,5 %). Endoxyíanasa a surový enzym nebyly v tomto modelu tak efektivní jako AXDA.

Příklad 8: AXDA v pečení chleba

AXDA byl testován v testu pečení bochníků užívajícím chléb pečený ve formě. Bochníky byly pečeny z 150 g kusů těsta vzniklých smícháním 200 g mouky (Robijn® /Columbus® 80/20), 104 ml vody, 1,4 g sušených pekařských kvasnic (Baker Yeast, Fermiplan® ), 4 g soli, 3 g cukru, 400 mg CaCLYh^O, 3 mg (15ppm) kyseliny askorbové a 5 mg (25 ppm) fungální alfaamylasy (Fermizyme® P200) a 20 /.zg čištěného AXDA. Po míchání po 6 minut a 15 s při 52 ot./min v hnětači bylo těsto rozděleno, kynulo po 45 minut při 30 °C, bylo propíchnuto, kynulo dalších 25 min, bylo vytvarováno a vloženo do forem. Po závěrečném kynutí po 70 min při 30 °C bylo těsto pečeno po 20 min při 225 °C. Objem bochníků byl určen pomocí metody posunutí řepkových semen. Objem bochníků vzrosti o 490 ml u kontrolních vzorků a o 535 ml u bochníků obsahujících AXDA, to je vzrůst o 9 %.

- 59Literatura

Amons, R. (1987), FEBS lett., 212: 68-72.

Carré, B. a Brillouet, J.M. (1986), J. Science and Food Agric. 37: 341-351.

Chesson, A. (1987), Recent Advances in Animal Food Nutrition. Goosen T. a kol. (1987) Curr. Genet. 11: 499-503.

Hanahan, D. (1983), J. Mol. Biol. 166: 557.

Harmsen, J.A.M. a kol. (1990 Curr. Genet. 18: 161-166 Haresign, W. a Cole, D.J.A., eds., Butterworth, London, 71-89. Jerpseth, B. a kol. (1992), Strategies 5: 81-83.

Maniatis, T., E.F. Fritsch, J. Sambrook (1982): Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

Matsudaira, P. (1987), J. Biol. Chem. 262: 10035-10038. McCleary, B.V. a Matheson, N.K. (1986), Adv. Carb. Chem. and Biochem. 44: 147-276.

McNab, J.M. a Blair J.C. (1988), British Poultry Science 29: 697-707.

Murray, N. (1977), Meol. Gen. Genet. 150: 53-58.

Saiki, R.K. a kol. (1988), Science, 239, 487-491.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989), In Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edn., Cold Spring HArbor Laboratory Press, NY.

Sanger, F., Nickelsen, S. a Coulson, A.R. (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, vol. 74: 5463-5467.

Silvay, T.J., Berman, M.L. a Enquist, L.W. (1984) Experiments with gene fusions, Cold Spring Harbor Laboratory New York, str. xi-xii.

Short, J.M. a kol. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 7583-7600.

- 60Visniac, W. a Santer, M. (1957), Bact. Rev. 21: 195-213 Yanish.perron, C. a kol. (1985) Gene 33: 103-119.

- 61SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL (A) JMÉNO: Gist-brocades B.V.

(B) ULICE: Wateringseweg 1 (C) MĚSTO: Delft (E) ZEMĚ: Nizozemí (F) POŠTOVNÍ KÓD: 2611 XT (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: arabinoxylan degradující enzymy (iii) POČET SEKVENCÍ: 8 (iv) POČÍTAČEM ZPRACOVATELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) INFORMACE PRO SEKVENCI ID Č.: 1:

(i) CHARAKTERIZACE SEKVENCE (A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iii) ANTI-SENSE: ne

- 62(v) TYP FRAGMENTU: N-terminál (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Aspergillus niger var. tubigensis (B) KMEN: DS16813 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

Lys Xaa Ala Leu Pro Ser Ser Tyr 1 5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI ID 0.: 2:

(i) CHARAKTERIZACE SEKVENCE (A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iii) ANTI-SENSE: ne (v) TYP FRAGMENTU:

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Aspergillus niger var. tubigensis (B) KMEN: DS16813 (ix) PODOBA:

(A) JMÉNO/KLÍC: residuum aminokyseliny (B) POLOHA: 14 (D) DALŠÍ INFORMACE: Arg nebo Asn (ix) PODOBA:

- 63(A) JMÉNO/KLÍČ: residuum aminokyseliny (B) POLOHA: 15 (D) DALŠÍ INFORMACE: residuum = neurčité (ix) PODOBA:

(A) JMÉNO/KLÍČ: residuum aminokyseliny (B) POLOHA:16 (D) DALŠÍ INFORMACE: residuum = neurčité (ix) PODOBA:

(A) JMÉNO/KLÍČ: residuum aminokyseliny (B) POLOHA: 17 (D) DALŠÍ INFORMACE: residuum = neurčité (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Ile Val Glu Ala Ile Cly Ser Thr Gly His Arg Tyr Phe Xaa Ser Phe Thr 1 5 10 15 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI ID Č.: 3:

(i) CHARAKTERIZACE SEKVENCE (A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iii) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Aspergillus niger var. tubigensis

- 64(B) KMEN: DS16813 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

ATGATKGTIG ARGCIATKGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI ID C.: 4:

(i) CHARAKTERIZACE SEKVENCE (A) DÉLKA: 17 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iii) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Aspergillus niger var. tubigensis (B) KMEN: DS16813 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4: AATACGACTC ACTATAG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI ID C.: 5:

(i) CHARAKTERIZACE SEKVENCE (A) DÉLKA: 2101 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická)

- 65(iii) HYPOTETICKÁ: ne (iii) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Aspergillus niger (B) KMEN: CBS 120.49 (ix) PODOBA:

(A) JMÉNO/KLÍC: TATA_signál (B) POLOHA: 665..670 (ix) PODOBA:

(A) JMÉNO/KLÍC: CDS (B) POLOHA:784. .1779 (D) DALŠÍ INFORMACE:

/product= “arabinoxylan degradující enzym” /gene= “axdA” /standard_name= “arabinoxylan degradující en zym” (ix) PODOBA:

(A) JMÉNO/KLÍC: sig_peptide (B) POLOHA: 784..861 (ix) PODOBA:

(A) JMÉNO/KLÍC: mat_peptide (B) POLOHA: 862..1779 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

CTGATTGGGA	TTCTGCAGGA	ATTCTCTGGG	GTATGCCAAA	AAAGTATACC	GACCTGTAAA	60
AGTCCAACCA	GTTCGAAATT	ACTAACAATA	TGTTTTTGAT	CAGGATATCT	TTGGCATCTA	120
TGGTGAGAGC	CATATCATCA	TCTCTTCTTC	CGGCAGCTGT	CAACTGCCTG	CCGAAAGTAC	180
TGGAAGCCAT	TGTGTTTTAA	GGTGAAACAA	GATCAGGGCG	GCTATGTGTC	AGGGTAGAAC	240
CAGTTTGCTT	AGCGCCATCA	GGGTCCACGT	CTAGACTTTC	GATGCCCGGA	GTTATTCGCC	300
TTCCCACAGC	AGTCATTTCC	CCGAATCTAA	ACCGATGGAC	GGATATTGTG	GTGTAATGAT	360
AGAACAACAC	GGTGTAGTGT	AGTTTTAAGT	GCCGTGCTAG	ACACGGCAAC	GTTCCGGTGG	' 420
GCGATTGTTT	CTGGCTAATG	TACTCCGTAG	TTTAGGCAAC	AGGCCGATCA	TCTTCCCCCA	480
TAGGAAAGGA	CCCTGAATAG	TGCGTCAAAA	AGAGCTTGAG	GCAAAGGAGG	ACTGCACTTT	540
CCAAGGCCGA	AGTGGGGGGG	GGGGATAACC	AAGCAGCCCA	ACTTTTATCC	GAAACCTTTC	600
aggtgtcatc	TAATTTGGAT	AAATCCGGAT	TGTTCTTCGG	CATATGTGGA	TGTCACCATG	660
AGCCATAAAT	ACAAATATCT	GGACAAGCTG	TTGCCCTTTG	TTCAAGTTAT	TCGTTCTCTG	720
TGGACCACGA	TCCCAACCAT	TGATCTCTTT	TGTTTGTTCC	TCAGCGGATA	AAGTCATACG	780

AAA

ATG

AAA

TTC

CTC AAA

GCC

AAG

GGT

AGC

TTG

CTG

TCG

TCT

GGC

ATA

828

Met

Lys

Phe

Leu Lys

Ala

Lys

Gly

Ser

Leu

Leu

Ser

Ser

Gly

Ile

-25

-20

-15

TAC

CTC

ATT

GCA

TTG GCC

CCC

TTT

GTC

AAC

GCA

AAA

TGC

GCT

CTT

CCG

876

Tyr

Leu

Ile

Ala

Leu Ala

Pro

Phe

Val

Asn

Ala

Lys

Cys

Ala

Leu

Pro

-10

- 5

1

5

TCG

ACA

TAT

AGT

TGG ACT

TCG

ACC

GAT

GCT

CTC

GCC

ACC

CCA

AAG

TCC

924

Ser

Thr

Tyr

Ser

Tm Thr

Ser

Thr

Asp

Ala

Leu

Ala

Thr

Pro

Lvs

Ser

10

15

20

GGA

TGG

ACT

GCA

CTC AAG

GAC

TTC

ACC

GAT

GTC

GTC

TCT

AAC

GGC.

AAA

972

Gly

Trp

Thr

Ala

Leu Lys

Asp

Phe

Thr

Asp

Val

Val

Ser

Asn

Gly

Lys

25

30

35

CAT

ATT

GTC

TAT

C-CG TCC

ACT

ACC

GAC

ACA

CAG

GGA

AAT

TAC

GGC

TCC

1020

His

Ile

Val

Tyr

Ala Ser

Thr

Thr

Asp

Thr

Gin

Gly

Asn

Tyr

Gly

Ser

40

45

·· 50

ATG

GGC

TTT

GGC

GCC TTT

TCG

GAC

TGG

TCG

GAC

ATG

GCA

TCC

GCT

AGT

1068

Met

Gly

Phe

Gly

Ala Phe

Ser

Aso

Trp

Ser

Asp

Met

Ala

Ser

Ala

Ser

55

60

65

CAA

ACG

GCC

ACA

AGC TTC

AGC

GCC

GTA

GCT

CCA

ACC

TTG

TTC

TAC

TTC

1116

Gin

Thr

Ala

Thr

Ser Phe

Ser

Ala

Val

Ala

Pro

Thr

Leu

Phe

Tyr

Phe

70

75

80

85

CAG

CCA

AAG

AGT

ATC TGG

GTT

CTG

GCC

TAC

CAA

TGG

GGC

TCC

AGC

ACT

1164

Gin

Pro

Lys

Ser

Ile Trp

Val

Leu

Ala

Tyr

Gin

Trp

Gly

Ser

Ser

Thr

90

95

100

i

TTC Phe

ACC Thr

TAC Tyr

CGC ACC Arg Thr 105

TCT Ser

•CAA Gin

GAT Asp

CCC Pro 110

ACC Thr

AAT Asn

GTC. Val

AAC Asn

GGC Gly 11Š

TC-G Trp

TCA Ser

TCC Ser

GAG Glu

CAA Gin 120

GCT CTT Ala Leu

—e

ACG Thr

GGC Giv 125

AAA Lys

ATC Ile

AGC Ser

GGC Gly

TCA Ser 130

AGT Ser

ACC Thr

GGT Gly

GCC Ala

ATT Ile 135

GAT Asp

CAG ACT Gin Thr

C-TG Val

ATT Ile 140

GGT Gly

GAT Asp

GAT Asp

ACG Thr

AAT Asn 145

ATG Met

TAT Tyr

CTT Leu

TTC Phe

TTT Phe 150

GCC Ala

GGC Gly

GAC AAT Asp Asn

GGC Gly 155

AAG Lys

ATC Ile

TAC Tyr

CGA Arg

TCC Ser 160

AGC Ser

ATG Met

TCT Ser

ATC Ile

AAT Asn 155

GAC Asp

TTC Phe

CCC Pro

GGA AGC Gly Ser 170

TTC Phe

GGC Gly

AGC Ser

CAG Gin

TAC Tyr 175

GAG Glu

GAG Glu

ATC Ile

CTC Leu

AGC Ser 130

GGC Gly

GCG Ala

ACC Thr

AAC Asn

GAT T »5 Asp Leu 135

TTC Phe

GAG Glu

GCG Ala

GTC Val 190

CAA Gin

GTG Val

TAC Tyr

ACC Thr

GTC Val 195

GAC Asp

GGC Gly

GGC Gly

GAG Glu

GGT Gly 200

GAC AGC Asp Ser

AAG Lys

TAC Tyr

CTC Leu 205

ATG Met

ATC Ile

GTC Val

GAG Glu

GCG Ala 210

ATC Ile

GGT Gly

TCC Ser

ACC Thr

GGA Gly

CAT Eis

CGT TAT Arg Tyr

TTC Phe

CGC Arg

TCC Ser

TTC Phe

ACG Thr

GCC Ala

AGC Ser

AGT Ser

CTC Leu

GGC Gly

GGA Gly

215 220 225

GAG Glu 230	TGG Trp	ACA GCC CAG GCG GCA AGT GAA GAT	CAA Gin 240	CCC Pro	TTC GCG GGC AAA Phe Ala Gly Lys 245
Thr	Ala Gin Ala Ala Ser 235	Glu Asp
GCC	AAC	AGT	GGC GCC ACC TGG ACC	GAC GAC	ATC	AGT	CAT GGT GAC TTG
Ala	Asn	Ser	Gly Ala Thr Trp Thr	Asp Aso	Ile	Ser	His Gly Asp Leu
			250	255			260
GTT	CGC	AAC	AAC CCT GAT CAA ACC	ATG ACG	GTC	GAT	CCT TGC AAC CTC
Val	Arg	Asn	Asn Pro Aso Gin Thr	Met Thr	Val	Asp	Pro Cys Asn Leu
			265	270			275
CAG	CTT	CTC	TAC CAG GGC CAT GAC	CCC AAC	AGC	AAT	AGT GAC TAC AAC
Gin	Leu	Leu	Tyr Gin Gly His Asp	Pro Asn	Ser	Asn	Ser Asp Tyr Asn
		280	235				290
CTC	TTG	CCC	TGG AAG CCA GGA GTT	CTT ACC	TTG	AAG	CAG TGAAAGGCTT
Leu	Leu	Pro	Trp Lys Pro Gly Val	Leu Thr	Leu	Lys	Gin
	295		300			305

ATCATTTGGT	TGCAGACCC-G	GGTTTTCTTC	CCCTTCCTTG	AGTAGTATTG	TTGGTGGAAG
ACAGCGGGAT	GGGGAGTCAA	TACTATCTTG	GGCTCAATTG	AGGTGGAATC	CTC-TCAGACT
GTGTACATAG	GCTACATGCG	AATGATTTGG	TTTATTCACA	AATAGTATTA	ACAGATAGTG
TAGTATACAC	CTCTGTATTC	ACAGGTGATA	GCCTGTCTAC	TAGTAGTAGA	GATGTGGCTC
GAGATC-ACTG	CACGTC-ATGA	TCACATCATC	ATCATCGCAG	TCGCTCACGC	GACAGTCTCA
GACACACACA	TA

1212

1250

1303

1355

04

1452

1500

1543

1595

1544

1592

1740

1739

1349

1909

1959

2029

2039

2101

- 68(2) INFORMACE PRO SEKVENCI ID C.: 6:

(i) CHARAKTERIZACE SEKVENCE (A) DÉLKA: 332 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

Kec

Lys -25

Phe

Leu

Lys

Ala

Lys -20

Gly

Ser

Leu

Leu

Ser -1S

Ser

Gly

Ile

Tyr

Leu -IQ

Ile

Al a

Leu

Ala

Pro - 5

Phe

Val

Asn

Ala

Lys ‘ 1

Cys

Ala

Leu

Pro 5

Ser

Tyr

Ser

Trp 10

Thr

Ser

Thr

Asp

Ala 15

Leu

Ala

Thr

Pro

Lys 20

Ser

Gly

Trp

Thr

Ala 25

Leu

Lys

Asp

Phe

Thr 30

Asp

Val

Val

Ser

Asn 35

Gly

Lys

His

Ile

Val 40

Tyr

Ala

Ser

Thr

Thr 45

Asp

Thr

Gin

Gly

Asn 50

Tyr

Gly

Ser

Met

Gly SS

Phe

Gly

Ala

Ser SO

Asp

Trp

Ser

Asp

Met SS

Ala

Ser

Ala

Ser

Gin 70

Thr

Ala

Thr

Ser

Prie

Ser

Ala

Val

Ala

Pro

Thr

Leu

Phe

Tyr

Phe

Gin

75

80

85

Pro

Lys

Ser

Ile

Trp

Val

Leu

Ala

Tyr

Gin

Trp

Gly

Ser

Ser

Thr

Phe

90

95

100

Thr

Tyr

Arg·

Thr

Ser

Gin

Asp

Pro

Thr

Asn

Val

Asn

Gly

Trp

Ser

Ser

105

110

.115

Glu

Gin

Ala

Leu

Phe

Thr

Gly

Lys

Ile

Ser

Gly

Ser

Ser

Thr

Gly

Ala

120

125

130

Ile

Asp

Gin

Thr

Val

Ile

Gly

Asp

Asp

Thr

Asn

Met

Tyr

Leu

Phe

Phe

135

140

145

ISO

Ala

Gly

Asp

Asn

Gly

Lys

Ile

Tyr

Arg

Ser

Ser

Met

Ser

Ile

Asn

Asp

15 5

ISO

165

Phe

Pro

Gly

Ser

Phe

Gly

Ser

Gin

Tyr

Glu

Glu

Ile

Leu

Ser

Gly

Ala

170

175

180

Thr

Asn Asn 13Š

Leu

Phe Glu

Ala

Val 190

Gin

Val

Tyr Thr

Val 195

Asp

Gly

Gly

Glu

Gly

Asp

Ser

Lys Tyr

Leu

Met

Ile

Val

Glu Ala

Ile

Gly

Ser

Thr

200

205

210

Gly

His

Arg

Tyr

Phe Arg

Ser

Phe

Thr

A— 2.

Ser Ser

Leu

Gly

Gly

Glu

215

220

225

230

Trp

Thr

Ala

Gin

Ala Ala

Ser

Glu

Asp

Gin

Pro Phe

Ala

Gly

Lys

Ala

235

240

245

Asn

Ser

Gly

Ala

Thr Trp

Thr

Asp

Asn

T 1 A

Ser His

Gly

Asp

Leu

Val

250

255

260

Arg

Asn

Asn

Pro

Asp Gin

Thr

Mec

Thr

Val

Asp Pro

Cys

Asn

Leu

Gin

265

270

275

Leu

Leu

Tyr

Gin

Gly His

Asp

Pro

Asn

Ser

Asn Ser

Asp

Tyr

Asn

Leu

230

235

290

Leu

Pro

Trp

Lys

Pro Gly

Val

Leu

Thr

Lys Gin

295 300 3OS (2) INFORMACE PRO SEKVENCI ID Č.: 7:

(i) CHARAKTERIZACE SEKVENCE (A) DÉLKA:2859 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iii) ANTI-SENSE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Aspergillus niger var. tubigensis

- 70(B) KMEN: DS16813 (ix) PODOBA:

(A) JMÉNO/KLÍC: CAATjsignál (B) POLOHA: 651..655 (ix) PODOBA:

(A) JMÉNO/KLÍC: TATA_signál (B) POLOHA: 713..720 (ix) PODOBA:

(A) JMÉNO/KLÍC: CDS (B) POLOHA: 823..1818 (D) DALŠÍ INFORMACE:

/product= “arabinoxylan degradující enzym” /gene= “axdA” /standard_name= “arabinoxylan degradující en zym” (ix) PODOBA:

(A) JMÉNO/KLÍC: sig.peptide (B) POLOHA: 823..901 (ix) PODOBA:

(A) JMÉNO/KLÍC: mat.peptide (B) POLOHA: 901..1818 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

CATACTGGGT	GTGGTAC7GT	AGGGAACC7G	CAGATGCTCT	Gi_CGAAGGTC	TGCAAATAGT	60
CCCTGGAGTT	TGGTAGTAAA	GAG7ACCAAC	TCGTAAAAGT	AG7ATGTCCA	ACCAATTTGA	120
AAGTACAAAC	TTTTAGTTTG	ATTGATTAAA	ATACTTTTGG	TGTGTACAC-T	GACAGCCAAA	130
ATATCATCTC	TTCAGCCGAT	AGA7GTCAAC	TGCCCGCCGA	AAGTACCC-GA	AGGTCGTGGT	240
GTTTTAAGGT	GAAACACTAT	CAGGGCGGCA	ATGTGTCAAA	GTAGAACCAG	TTTGCTTAGC	300
GCCATTAGGG	TCCACGCCTA	GACCCCTCGA	TGCCCGGGAG	TCATCCGTCC	TGTCACAGCA	' 350
ATTATTTCCC	CGAGTCTACT	GCCGAAGAAG	AGCTATTGTG	GCGTAATCAT	GGAATTACCC .	420
TCTGTGTAGG	GTAGTCTTGA	ACGCCGTTCT	AGACACGGCA	ACGTTCCGGT	GGACGATCGT	480
TTCTGGC7AA	TGTACTCCGT	AGTTTAGGCA	GCTAGCTGAT	CATCTTCCCC	CTAGGGAAAG	540
GACCTGAATA-	GTGCGCCAAA	ATGAGCTTGA	GCAAAGGAAT	GTTCTTTCTA	AGCCAAAGTG	500
GGGGAAA7AA	CCAAGCAGCC	CACTTTTATC	CGAAACGTTT	CTGGTGTCAT	CCAATATGGA	550
TAAATCCCGA	TTG7TCTTC7	GCACGTATCA	GTATTGCCAT	CAACGTAACT	ACATATATTT	720
GAACATGGTC	TGGTCCTCCG	TTC GATTTAT	TCGTTCTCCG	TGGCCAACGA	CTTCAGCCAT	780
TGATCTCTTT	TGTTTCTTTC	CTGCGGCTAA	ACCCATTCGA	AG ATG AAG Met Lys	TTC TTC Phe Phe	834

AAA

GCC

AAA

GGC

AGC

TTG

CTG TCA

TCA

GGC

ATC

TAC

CTC

ATT

GCA

TTA

882

Lys

Ala

Lys

Gly

Ser

Leu

Leu Ser

Ser

Gly

Ile

Tyr

Leu

Ile

Ala

Leu

-20

-15

-10

ACC

CCC

TTT

GTC

AAC

GCC

AAA TGT

GCT

CTT

CCG

TCG

TCC

TAT

AGT

TGG

930

Thr

Pro

Phe

Val

Asn

Ala

Lys Cys

Ala

Leu

Pro

Ser

Ser

Tyr

Ser

Trp

-5

1

5

10

AGT

TCA

ACC

GAT

GCT

CTC

GCA ACT

CCA

AAG

TCA

GGA

TGG

ACC

GCA

CTG

978

Ser

Ser

Thr

Asp

Ala

Leu

Ala Thr

Pro

Lys

Ser

Gly

Trp

Thr

Ala

Leu

15

20

25

AAG

GAC

TTT

ACT

GAT

GTT

GTC TCG

GAC

GGC

AAA

CAT

ATT

GTC

TAT

GCG

1025

Lys

Asp

Phe

Thr

Asp

Val

Val Ser

Asp

Gly

Lys

His

Ile

Val

Tyr

Ala

30

3 5

40

TCC

ACT

ACT

GAT

GAA

GCG

GGA AAC

TAT

GGC

TCG

ATG

ACC

' TTT.

GGC

GCC

1074

Ser

Tlix

Thr

Asp

Glu

Ala

Glv Asn

Tyr

Gly

Ser

Mec

Thr

Phe

Gly

Ala

45

50

55

TTC

TCA

GAG

TGG

TCG

AAC

ATG GCA

TCC

GCT

AGC

CAG

ACA

GCC

ACC

CCC

1122

Phe

Ser

Glu

Trp

Ser

Asn

Mec Ala

Ser

Ala

Ser

Gin

Thr

Ala

Thr

Pro

60

6 5

70

TTC

AAT

GCC

GTG

GCT

CCT

ACC CTG

TTC

TAC

TTC

AAG

CCG

AAA

AGT

ATC

1170

Phe

Asn

Ala

Val

Ala

Pro

Thr Leu

Pne

Tyr

Phe

Lys

Pro

Lys

Ser

Ile

75

30

85

90

TGG

GTT

CTG

GCC

TAC

CAA

TGG

GGC

TCC

AGC

ACA

TTC

ACC

TAC

CGC

ACC

1218

Trp

Val

Leu

Ala

Tyr 95

Gin

Trp

Gly

Ser

Ser 100

Thr

Phe

Thr

Tyr

Arg 105

Thr

TCC

CAA

GAT

CCC

ACC

AAT

GTC

AAT

GGC

TGG

TCG

TCG

GAG

CAG

GCG

CTT

1256

Ser

Gin

Asp

Pro 110

Thr

Asn

Val

Asn

Gly 115

Trp

Ser

Ser

Glu

Gin 120

Ala

Leu

TTC

ACC

GGC

AAA

ATC

AGC

GAC

TCA

AGC

ACC

AAT

GCC

ATT

GAC

CAG

ACG

1314

Phe

Thr

Gly 125

Lys

Ile

Ser

Asp

Ser 130

Ser

Thr

Asn

Ala

Ile 135

Asp

Gin

Thr

GTG

ATT

GGC

GAT

GAT

ACG

AAT

ATG

TAT

CTC

TTC

TTC

GCC

GGC

GAC

AAC

1352

Val

Ile 140

Gly

Asp

Asp

Thr

Asn 145

Met

Tyr

Leu

Phe

Phe 150

Ala

Gly

Asp

Asn

GGC

AAG

ATC

TAC

CGA

TCC

AGC

ATG

TCC

ATC

AAT

GAC

TTC

CCC

GGA

AGC

1410

Gly

Lys

Ile

Tyr

Arg

Ser

Ser

Met

Ser

Ile

Asn

Asp

Phe

Pro

Gly

Ser

155 ISO 1S5 170

TTC GGC AGC CAG TAC GAG GTG ATC CTG AGT GGC GCC CGC AAC GAT CTA 1458

Phe Gly Ser Gin Tyr Glu Val Ile Leu Ser Gly Ala Arg Asn Asp Leu

175 180 185

TTC GAG GCG GTC CAA GTA TAC ACC GTC GAC GGC GGT GAG GGC GAC ACG 1S0S

Phe	Glu	Ala Val 190	Gin Val	Tyr	Thr	Val Aso 195	Gly Gly	Glu Gly 200	Asp Thr
AAG	TAT	CTC· ATG	ATC GTT	C-AG	GCG	ATC GGG	TCC ACC	GGA CAT	CGT TAT 1554
Lys	Tyr	Leu Met 205	Ile Val	Glu	Ala 210	Ile Gly	Ser Thr	Gly Kis 215	Arg Tyr
TTC	CGC	TCC TTC	ACG GCC	AGC	AGT	CTG GGT	GGA GAG	TGG ACA	GCC CAG 1502
Phe	Arg 220	Ser Phe	Thr Ala	Ser 225	Ser	Leu Gly	Gly Glu 230	Trp Thr	Ala Gin
GCG	GCA	AGT GAG	GAT CAA	CCC	TTC	GCA GGC	AAA GCC	AAC AGT	GGT GCC 1550
Ala 235	Ala	Ser Glu	Aso Gin ' 240	Pro	Pne	Ala Gly	Lys Ala 245	Asn Ser	Gly Ala 250
ACC	TGG	ACC GAA	GAC ATT	AGC	CAT	GGT GAC	TTG GTT	CGC AAC	AAC CCT 1698
Thr	Trp	Thr Glu	Asp Ile 255	Ser	His	Gly Aso 250	Leu Val	Arg Asn	Asn Pro 255
GAT	CAA	ACG ATG	ACT GTC	GAT	CCT	TGC AAC	CTC CAG	TTG CTC	TAT CAG 1746
Asp	Gin	Thr Met 270	Thr Val	Asp	Pro	Cys Asn 275	Leu Gin	Leu Leu 280	Tyr Gin
GGC	CAT	GAC CCC	AAC AGC	AGT	GGC	GAC TAC	AAC CTC	TTG CCG	TGG AAG 1794
Gly	His	ASO Pro 285	Asn Ser	Ser	Gly 290	Asp Tyr	Asn Leu	Leu Pro 29S	Trp Lys
CCG Pro	GGC Gly 300	GTC CTT Val Leu	ACC TTG Thr Leu	AAG Lys 305	CAG Gin	TGAAGGTATT ATAATTAGTT GCAGATTGTG 1848
TTTTCATTCC TTCTTCAAGA GTGCTTAGTG	GTGGAAGACA GCAGAAGGTG GTCACTATCT 1908
TAGGCTCAGT TGGGGTGGGC TTGTGTCCAT	AGGCTAGTAA TGTGCGCATA ATTCAGTTCA 1953
TTGGCAAGGA GTGCGGTATA AATACC	TGTT	CTCACAAAAA AAAATAGGCC CGGTGGTCAT. 2028

- 73ACTCCGTATT GGGATAGAGA TCTCGTAGTA GTAGGATTGT GGGCCTCAGA GGATGACCGA 2083'

CACGTGAGCA GTCTCCTTCT ACGGCTAGTC GCGTTCTACA TAAGAAATAG TCAGCTCAGA 2143

GTTTGTTTTT TGGCTACTTT GAAGGATGGC CTATCGAATC GCACGTCTCC TCAATTGGCC 2208

AGGTATTGGC ATTCACTCTC CGCGCTTTGC GGGTGCCGGC ACGAGATGTC TCCTGGAGAA 2253

ACTGGGCAAC GAGCAGACTA CGGATATGGG AGATTGTTGA CGACGTTCTT CTTGGTAAAT 2323

TTGAACCCTT CAGGGGCTCT ATAAAGC-CGG AAATCTAAAT CTCA7G7GCC CTAACGTGTC 23 8-8

CGACCACGGT GTTGATCAGC ACCTATTAGA TCAGACAACA ACCTTTGGCT CGGAAATTGA 2448

ACAGGTAGCT CTTGAATGAC ACTCTGGATC CTGATTCAAT TTATAATGCG TCACTTGAGC 2508

GTGCAAGGGG TGCTATATTC ACATCTTGCC CCAATCCAAG GGGCGTCGGA TCCCATTGTG 2553

CTCGACAGCC TGGAACTTCG CCGACAGTAT TCTTACGACG TCGATACTGA AATAGTCCAC 2528

CTGGTGTGCA TTCGTACGCC GGAAAGACCC TCGTCCC-ACC GCGTGCCCTT C-ATTCTGACG 2588

AGATGCTTCA ACAAGCGGCC AATTCGATGC CAGCTGTTCA TCGGTTAGAT GTGCTACACA 2748

GTGACCTGAT TCCAGGAAAC ATATTCTGGA ACGAAGGAAA TGGCCGCGTC AATTTTCATT 2808

GACTTTGAGT GTGCAATAAC CCAAAATAAC GAAATAATGA ACGACCGCTG 7 2858 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI ID 0.: 8:

(i) CHARAKTERIZACE SEKVENCE (A) DÉLKA: 332 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

Met Lys Phe Phe Lys Ala Lys Gly Ser Leu Leu Ser Ser Gly Ile Tyr -25 -20 -15

Leu Ile Ala Leu Thr Pro Phe Val Asn Ala Lys Cys Ala Leu Pro Ser -10 -5 15

Ser Tyr Ser Tno Ser Ser Thr Aso Ala Leu Ala Thr Pro Lys Ser Gly 10 ’ 15 20

Trp Thr Ala Leu Lys Asp Phe Thr Asp Val Val Ser Asp Gly Lys His

lle

Val 40

Tyr

Ala

Ser Thr

Thr 45

' Asp

i Glu

. Ala Gly

Asn 50

Tyr

• Gly Ser

' Met

Thr 55

Phe

Gly

Ala

Phe Ser 60

' Glu

Trp

Ser

Asn Met 65

Ala

Ser

Ala Ser

Gin 70

Thr

Ala

Thr

Pro

Phe Asn 75

Ala

Val

Ala

Pro Thr 80

Leu

Phe

Tyr Phe 85

Lys

Pro

Lys

Ser

lle 90

Trp Val

Leu

Ala

Tyr 95

Gin Trp

Gly

Ser

Ser Thr 100

Phe

Thr

Tyr

Arg 105

Thr

Ser Gin

Asp

Pro 110

Thr

Asn Val

Asn

Gly lis

Trp Ser

Ser

Glu

Gin 120

Ala

Leu

Phe Thr

Gly 125

Lys

lle

Ser Asp

Ser 130

Ser

Thr Asn

Ala

lle 135

Asp

Gin

Thr

Val lle 140

Gly

Asp

Asp

Thr Asn 145

Met

Tyr

Leu Phe

Phe 150

Ala

Gly

Asp

Asn

Gly Lys 155

lle

Arg

Ser Ser 160

Met

Ser

lle Asn 155

Asp

Phe

Pro

Gly

Ser 170

Phe Gly

Ser

Gin

Tyr 175

Glu Val

lle

Leu

Ser Cly 130

Ala

Arg

Asn

Asp 135

Leu

Phe Glu

Ala

Val 190

Gin

Val Tyr

Thr

Val 195

Asp Gly

Gly

Glu

Gly 200

Asp

Thr

Lys Tyr

Leu 203

Met

lle

Val Glu

Ala 210

lle

Gly Ser

Thr

Gly 215

Eis

Arg

Tyr

Phe Arg 220

Ser

Phe

Thr

Ala Ser 225

Ser

Leu

Gly Giv

Glu 230

Trp

Thr

Ala

Gin

Ala Ala 235

Ser

Glu

Asp

Gin Pro 240

Phe

Ala

Gly Lys 245

Ala

Asn

Ser

Gly

Ala 250

Thr Trp

Thr

Glu

Aso 255

lle Ser

Eis

Gly

Aso Leu 260

Val

Arg

Asn

Asn 2S5

Pro

Asp Gin

Thr

Met 270

Thr

Val Asp

Pro

Cys 275

Asn Leu

Gin

Leu

Leu 230

Tyr

Gin

Gly Eis

Aso 235

Pro

Asn

Ser Ser

Gly Aso 290

Tyr Asn

Leu

Leu 29S

Pro

Trp

Lys

Pro Gly 300

Val

Leu

Thr

Leu Lys 305

Gin

Zastupuje:

JUDr. Milán Hořejš

—
Ό	-o i- X > CS co 2 c	O	σ	cn	ΓΛ
	-< SX Z γ. > 25° -i	-ť: tO ‘ I σ»	o czx ε	cn

- ÍO-

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantní DNA obsahující fragment DNA kódující polypeptid mající účinek degradace arabinoxylanu a nebo jeho polypeptidický prekursor, vyznačující se tím, že zmíněný fragment DNA je zvolen ze souboru, zahrnujícího (a) fragment DMA kódující polypeptid mající sekvenci aminokyselin reprezentovanou aminokyselinami 1 až 306 a nebo polypeptidický prekursor uvedeného polypeptidu reprezentovaný aminokyselinami -27 až 306 v sekvenci SEQIDNO 5, (b) fragment DNA kódující polypeptid mající sekvenci aminokyselin reprezentovanou aminokyselinami 1 až 306 nebo prekursor uvedeného polypeptidu, reprezentovaný aminokyselinami -27 až 306 v sekvenci SEQIDNO 7, (c) fragment DNA kódující obměnu nebo část polypeptidu, reprezentovaného aminokyselinovými residui 1 až 306 znázorněnými v sekvenci SEQIDNO 5 nebo v sekvenci SEQIDNO 7 a mající stále účinek degradace arabinoxylanu a nebo jeho polypeptidický prekursor, (d) fragment DNA kódující polypeptid, mající účinek degradace arabinoxylanu a mající sekvenci nukleotidů reprezentovanou nukleotidy 784 až 1779 ve sekvenci SEQIDNO 5 nebo nukleotidy 823 až 1818 v sekvenci SEQIDNO 7, (e) fragment DNA kódující polypeptid, mající účinek degradace arabinoxylanu a nebo část takového polypeptidu, jehož DNA je schopna hybridizace s fragmentem DNA reprezentovaným nukleotidy 784 až 1779 v sekvenci SEQIDNO 5 nebo s nukleotidy 823 až 1818 v sekvenci SEQIDNO 7.
2. 2. Rekombinantní DNA podle nároku 1, vyznačující

   - 76s e t í m, že účinek degradace arabinoxylanu je získatelný z vláknitých hub.
3. 3. Rekombinantní DNA podle nároku 2, vyznačující se t í m, že vláknitá houba je z rodu Aspergillus.
4. 4. Rekombinantní DNA podle nároku 3, vyznačující se t í m, že Aspergillus je Aspergillus niger nebo Aspergillus tubigensis.
5. 5. Rekombinantní DNA podle nároku 1, dále obsahující regulační DNA sekvence potřebné pro expresi fragmentu DNA v prokaryotní nebo eukaryotní hostitelské buňce, pokud je v ní přítomna.
6. 6. Rekombinantní DNA podle nároku 5, vyznačující se t í m, že regulační DNA sekvence jsou heterologní vzhledem k polypeptid kódující sekvenci uvedeného fragmentu DNA.
7. 7. Rekombinantní DNA podle nároku 6, ve které heterologní regulační DNA sekvence jsou voleny tak, aby zvyšovaly expresi fragmentu DNA v hostiteli ve srovnání s expresí fragmentu DNA v uvedeném hositeli, pokud je spojena se svými homologními regulačními DNA sekvencemi.
8. 8. Rekombinantní DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, která je ve formě vektoru.
9. 9. Transformovaná eukaryotní nebo prokaryotní hostitelská buňka obsahující rekombinantní DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až

   8.

   - 7710. Transformovaná eukaryotní hostitelská buňka podle nároku 9, ve které hostitel patří do rodu Aspergillus.
10. 11. Způsob získání hostitelské buňky schopné zvýšené exprese * enzymu degradujícího arabinoxylan působením na buňku za trans • formačních podmínek rekombinantní DNA podle nároku 8 a se* lekcí na zvýšenou expresi uvedeného enzymu degradujícího arabinoxylan.
11. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedená hostitelská buňka je buňka hostitele z rodu Aspergillus.
12. 13. Způsob získání enzymu degradujícího arabinoxylan, zahrnující kroky pěstování hostitelských buněk schopných produkovat uvedený enzym za podmínek k tomu vedoucích a izolace uvedeného enzymu, vyznačující se tím, že uvedené hostitelské buňky nebo jejich předchůdci byly transformovány rekombinantní DNA podle nároku 8.
13. 14. Prakticky čistý polypeptid mající účinek degradace arabinoxylanu, vyznačující se t í m, že jeho sekvence aminokyselin je sekvence SEQIDNO 6 nebo sekvence SEQIDNO 8, stejně tak jako jeho genetické variace a části, mající stále uvedený účinek.

    *
14. 15. Komposice obsahující prakticky čistý polypeptid podle ná* roku 14, vytvořená pro použití jako krmivo, potravina a nebo při zpracování papíru nebo papíroviny.
15. 16. Komposice podle nároku 16, kde enzym je imobilizován.

    i

    - 7817. Použití polypeptidu podle nároku 14 pro usnadnění degradace arabinoxylanu.
16. 18. Použití polypeptidu podle nároku 14 jako aditivum v krmivu nebo potravině.
17. 19. Použití polypeptidu podle nároku 14 při zpracování papíru nebo papíroviny.
18. 20. Použití polypeptidu podle nároku 14 při pečení chleba.
19. 21. Krmivo nebo potravina obsahující polypeptid podle nároku

    14.
20. 22. Rekombinantní DNA obsahující fragment DNA reprezentovaný nukleotidy 1 až 783 v sekvenci SEQIDNO 5 nebo jeho subfragment, schopný regulace exprese DNA sekvence k němu připojené.
21. 23. Rekombinantní DNA obsahující fragment DNA reprezentovaný nukleotidy 1 až 822 v sekvenci SEQIDNO 7 nebo jeho subfragment, schopný regulace exprese DNA sekvence k němu připojené.