ES2205121T3 - Amplificacion y deteccion de acidos dianausando una etapa de incubacion postamplificacion. - Google Patents
Amplificacion y deteccion de acidos dianausando una etapa de incubacion postamplificacion.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA AMPLIFICAR Y DETECTAR UN ACIDO NUCLEICO OBJETIVO. EL METODO CONSISTE EN PONER EN CONTACTO UNA MUESTRA QUE SE SUPONE CONTIENE EL ACIDO NUCLEICO OBJETIVO CON UNA POLIMERASA DE ADN TERMOESTABLE Y DOS PRIMEROS QUE SON SUSTANCIALMENTE COMPLEMENTARIOS AL ACIDO NUCLEICO OBJETIVO, BAJO CONDICIONES EN LAS QUE EL ACIDO NUCLEICO OBJETIVO SE AMPLIFICA. LOS ACIDOS NUCLEICOS OBJETIVO AMPLIFICADOS SE DESNATURALIZAN ENTONCES PARA FORMAR ACIDOS NUCLEICOS DE UNA SOLA CADENA. TRAS LA AMPLIFICACION, LA MUESTRA SE SOMETE A UN PASO DE INCUBACION DE PREDETECCION. LA MUESTRA SE INCUBA DURANTE UN PERIODO DE TIEMPO DE ENTRE 1 SEGUNDO Y 30 MINUTOS Y A UNA TEMPERATURA ENTRE 95 (GRADOS) C Y 120 (GRADOS) C PARA INACTIVAR DICHO AGENTE DE POLIMERIZACION. FINALMENTE SE DETERMINA LA PRESENCIA O AUSENCIA DE LOS ACIDOS NUCLEICOS OBJETIVO AMPLIFICADOS.
Description
Amplificación y detección de ácidos nucleicos
diana usando una etapa postamplificación de incubación.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para amplificar y detectar ácidos nucleicos diana. En
particular se refiere a procedimientos mejorados para detectar
productos amplificados de ácidos nucleicos. La presente invención se
puede usar en varios estudios médicos y de investigación,
investigaciones forenses y procedimientos diagnósticos tales como
los de detección de trastornos genéticos y enfermedades
infecciosas.
La tecnología para detectar cantidades pequeñas
de ácidos nucleicos ha avanzado rápidamente durante las dos últimas
décadas y el avance incluye el desarrollo de ensayos de hibridación
muy sofisticados usando sondas en técnicas de amplificación tales
como reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los investigadores han
reconocido fácilmente el valor de tal tecnología para detectar
enfermedades y rasgos genéticos en muestras de ensayo humanas y
animales. El uso de cebadores y sondas en la amplificación y
detección de ácidos nucleicos está basado en el concepto de
complementariedad, esto es, la unión de dos cadenas de un ácido
nucleico mediante puentes de hidrógeno entre nucleótidos
complementarios (que son conocidos como parejas de nucleótidos).
Se ha realizado mucha investigación para
encontrar caminos para amplificar y detectar pequeñas cantidades de
ADN. Son conocidos y se han usado varios procedimientos para
amplificar o multiplicar considerablemente el número de ácidos
nucleicos en una muestra para detección. Tales técnicas de
amplificación incluyen PCR, reacción en cadena de ligasa (LCR) y ADN
ramificado.
La PCR es el más conocido de estos procedimientos
de amplificación. Los detalles de la PCR figuran bien descritos en
la técnica, incluidas, por ejemplo, las patentes U.S. nº. 4.638.195
(concedida a Mullis y otros), nº. 4.683.202 (concedida a Mullis) y
nº. 4.965.188 (concedida a Mullis y otros). Sin entrar en extensos
detalles, puede decirse que la PCR implica la hibridación de
cebadores con las cadenas de un ácido nucleico diana en presencia de
un agente de polimerización (tal como una
ADN-polimerasa) y trifosfatos de
desoxirribonucleósidos en condiciones apropiadas. El resultado es la
generación de productos de extensión de cebadores a lo largo de los
moldes, productos que tienen añadidos a ellos nucleótidos que son
complementarios de los moldes.
Una vez que los productos de extensión de los
cebadores han sido desnaturalizados, se puede realizar cuantas veces
se quiera el ciclo de cebado, extensión y desnaturalización para
obtener un aumento exponencial de la cantidad de ácido nucleico que
tiene la misma secuencia que el ácido nucleico diana. De hecho, el
ácido nucleico diana se duplica (o "amplifica") muchas veces,
de manera que se detecte más fácilmente. Una vez que se ha
amplificado suficientemente el ácido nucleico, se pueden usar varios
procedimientos para detectar, cualitativamente y/o
cuantitativamente, la presencia de la diana.
Una vez que el ácido nucleico se ha amplificado
suficientemente, se pueden usar varios procedimientos de detección
para detectar su presencia. Un procedimiento estándar de detección
usado para detectar productos de PCR ha sido el de geles de agarosa
teñidos con bromuro de etidio. El uso de geles teñidos con bromuro
de etidio tiene, empero, varias desventajas, incluidas, por ejemplo,
una sensibilidad y una especifidad relativamente mediocres.
Se han desarrollado procedimientos mejorados para
detectar productos de PCR, que eliminan el uso de radiomarcadores y
electroforesis. Estos procedimientos no isotópicos de detección por
captura de oligonucleótidos descansan en la hibridación específica a
sondas y la generación de señales enzimáticas. Tales procedimientos
no isotópicos de detección por captura de oligonucleótidos,
conocidos también como detección inversa de mancha de transferencia,
están descritos en las patentes U.S. nº. 5.229.297 (concedida a
Schnepilsky y otros), nº. 5.328.825 (concedida a Warren y otros) y
nº. 5.422.271 (concedida a Chen y otros). Un procedimiento de este
tipo lo describen también Findlay y otros en Clinical Chemistry,
39:1927-1933 (1993).
Estos procedimientos de detección no isotópicos
tienen una sensibilidad y una especifidad más altas que el
procedimiento de detección por tinción con bromuro de etidio y
evitan el uso de radiactividad. Los procedimientos operan efectuando
la amplificación con cebador(es) biotinilado(s) o
usando una sonda biotinilada para detectar los ácidos nucleicos
amplificados. Los productos o sondas biotinilados se hacen
reaccionar posteriormente con una enzima conjugado de avidina o
estreptavidina tal como peroxidasa de rábano picante (HRP). Luego se
puede poner en contacto un precurso de colorante (o reactivo señal
generador de luz) con la enzima y se convierte en un colorante
(luminiscencia), con lo que se genera una señal detectable.
Sin embargo, los procedimientos de detección no
isotópicos por captura de oligonucleótidos no están exentos de sus
propios inconvenientes. Si la detección no isotópica por captura de
oligonucleótidos se realiza usando condiciones estándar de
desnaturalización de PCR (95ºC) para desnaturalizar productos de
ácidos nucleicos amplificados concentrados o mínimamente diluidos,
las enzimas utilizadas para realizar la reacción de amplificación,
tales como polimerasas termoestables o ADN-ligasas,
estarán todavía presentes y serán activas. La presencia de tales
enzimas activas durante la detección da por resultado la competición
de unión entre la enzima y la sonda por el producto de
amplificación. Tal competición puede reducir la cantidad de
productos de ácidos nucleicos amplificados unidos a la sonda y, por
tanto, la señal de detección.
Una solución a este problema ha sido añadir
niveles altos de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), un agente
quelatante de Mg^{++}, a la mezcla de amplificación de la PCR
después de haber efectuado la amplificación, pero antes de al
detección. El EDTA es capaz de inhibir muchas enzimas que requieren
Mg^{++} para ser activas, incluidas
ADN-polimerasas y ADN-ligasas. El
uso de EDTA, sin embargo, añade una etapa adicional a la
amplificación de la PCR y al proceso de detección. Además, el uso
del EDTA requiere abrir el recipiente de reacción para añadir el
EDTA. Los expertos en la técnica son conscientes de que se ha de
evitar la apertura del recipiente de reacción por riesgos de
contaminación.
Así, no se desea bloquear el proceso de
amplificación durante la detección mediante la adición de EDTA u
otros inhibidores de enzimas de este tipo. Más bien, es deseable
tener un procedimiento para inactivar las enzimas de amplificación
antes de la detección sin el riesgo incrementado de
contaminación.
Es un objetivo de la presente invención superar
los problemas indicados antes usando una etapa
post-amplificación de incubación antes de la
detección para inactivar las enzimas de amplificación.
En una realización, la presente se refiere a un
método para amplificar y detectar un ácido nucleico diana, que
comprende:
(i) poner en contacto una muestra que se sospecha
que contiene el ácido nucleico diana con al menos dos
oligonucleótidos y una enzima termoestable de amplificación, siendo
los oligonucleótidos sustancialmente complementarios de una parte
del ácido nucleico diana, en condiciones tales que el ácido nucleico
diana se amplifique;
(ii) incubar la muestra durante entre 1 segundo y
30 minutos a entre 105ºC y 120ºC como etapa postamplificación de
inactivación para inactivar la enzima termoestable de activación;
y
(iii) detectar la presencia o ausencia de los
ácidos nucleicos diana amplificados.
En otra realización, la presente invención se
refiere a un procedimiento para amplificar y detectar un ácido
nucleico diana, que comprende:
(i) poner una muestra que se sospecha que
contiene el ácido nucleico diana con cuatro trifosfatos de
nucleósido diferentes, una ADN-polimerasa
termoestable y, como mínimo, dos cebadores, siendo los cebadores
sustancialmente complementarios del ácido nucleico diana, en
condiciones tales que se amplifique el ácido nucleico diana;
(ii) incubar la muestra durante entre 1 segundo y
30 minutos a entre 105ºC y 120ºC como etapa postamplificación de
inactivación para inactivar la enzima de activación termoestable;
y
(iii) detectar la presencia o ausencia de los
ácidos nucleicos diana amplificados.
En otra realización, la presente invención se
refiere a un procedimiento para amplificar y detectar un ácido
nucleico diana, que comprende:
(i) poner una muestra que se sospecha que
contiene el ácido nucleico diana con cuatro trifosfatos de
nucleósido diferentes, una ADN-polimerasa
termoestable y, como mínimo, dos cebadores, cebadores de los que al
menos uno está marcado con biotina y todos ellos son sustancialmente
complementarios del ácido nucleico diana, en condiciones tales que
se amplifique el ácido nucleico diana;
(ii) incubar la muestra entre 0,5 minutos y 5
minutos a aproximadamente 105ºC como etapa de incubación
postamplificación para inactivar la polimerasa; y
(iii) detectar la presencia o ausencia de los
ácidos nucleicos diana amplificados biotinilados haciendo reaccionar
los ácidos nucleicos diana amplificados biotinilados con un
conjugado de estreptavidina-enzima, a lo que sigue
la reacción de la enzima con un reactivo sustrato para producir una
señal colorimétrica o quimiluminescente detectable.
De la siguiente descripción de la invención
resultarán evidentes varios otros objetivos y ventajas de esta
invención.
Los principios generales y las condiciones para
la amplificación y detección de ácidos nucleicos usando la reacción
en cadena de polimerasa son bastante bien conocidos, cuyos detalles
se dan en numerosas referencias entre las que están incluidas las
patentes U.S. nº. 4.683.195 (concedida a Mullis y otros), nº.
4.683.202 (concedida a Mullis) y nº. 4.965.188 (concedida a Mullis y
otros). Así, a la vista de las enseñanzas de la técnica y la
información específica que se proporciona aquí, un experto en la
técnica no debe tener dificultad alguna en la práctica de la
invención añadiendo una etapa de incubación postamplificación para
inactivar las enzimas de amplificación antes de efectuar la
detección según se indica aquí para aumentar la sensibilidad de
detección.
En la práctica de la invención, se pueden usar
también otros procedimientos de amplificación y detección. La
presente invención proporciona una etapa postamplificación de
incubación previa la detección, que inactiva la(s)
enzima(s) termoestable(s) usada(s) durante la
amplificación. Por tanto, la presente invención es adecuada para uso
con cualquier procedimiento de amplificación que emplea una enzima
termoestable. Entre otros procedimientos de amplificación
termoestables está incluida la reacción en cadena de ligasa (LCR)
según se describe, por ejemplo, en los documentos
EP-A-0 320 308 (publicado en
diciembre de 1987) y EP-A-0 439 182
(publicado en enero de 1987), que utiliza una
ADN-ligasa termoestable para ligar sondas contiguas,
creándose así una secuencia complementaria de ácidos nucleicos. Los
ácidos nucleicos diana de LCR se amplifican usando 4 sondas de
oligonucleótidos y una ADN-ligasa termoestable. Dos
de las sondas de oligonucleótidos son complementarias de dos sitios
adyacentes en una cadena del molde de ADN a amplificar. Estas sondas
hibridan con esa cadena de ADN de manera que entre las dos sondas se
crea una muesca. La muesca la cierra luego una
ADN-ligasa termoestable creándose una nueva cadena
de ADN complementaria de la diana. Las sondas tercera y cuarta son
complementarias de la segunda cadena del molde de ADN y actúan como
el primer par de sondas para generar un ADN complementario. Los
productos amplificados de la LCR pueden detectarse usando
procedimientos estándar de detección. La etapa postamplificación de
incubación, previa a la detección, de la presente invención se puede
usar LCR para inactivar la ADN-ligasa antes de la
detección. Así, la información que se proporciona aquí permitirá a
un experto en la técnica adaptar la etapa postamplificación de la
desnaturalización de la enzima vista para la PCR a estos otros
procedimientos de amplificación y detección conocidos. El resto de
esta descripción está dirigido a la práctica de la invención usando
la PCR a fines ilustrativos.
La presente invención proporciona una
modificación de procedimientos de PCR conocidos con el fin de
mejorar la sensibilidad de detección. Se ha descubierto
sorprendentemente, de acuerdo con la presente invención, que se
puede usar una etapa postamplificación de incubación, previa a la
detección, para inactivar el agente de polimerización y reducir la
competición de unión entre la sonda y el agente por los ácidos
nucleicos diana amplificados. Esta reducida competición aumenta la
sensibilidad de detección.
La presente invención está dirigida a la
amplificación y detección de uno o más ácidos nucleicos diana
presentes en una muestra de ensayo. Las muestras de ensayo pueden
incluir material celular o de virus, fluidos corporales u otros
materiales celulares que contienen ADN o ARN genético que se puede
detectar.
Los ácidos nucleicos a amplificar y detectar
pueden obtenerse de varias fuentes, incluidos plásmidos y ADN o ARN
natural de cualquier fuente (tal como bacterias, levaduras, virus,
plantas, animales superiores o personas). Pueden extraerse de varios
tejidos, entre los que se incluye, pero no únicamente, sangre,
células mononucleares de sangre periférica (PBMC), material de
tejidos u otras fuentes conocidas en la técnica, usando
procedimientos conocidos. La presente invención es particularmente
útil para la amplificación y detección de una o varias secuencias de
ácidos nucleicos encontradas en ADN genómico, ADN bacteriano, ADN de
hongos, ARN vírico, o ADN o ARN encontrado en células bacterianas o
víricas infectadas.
El procedimiento descrito aquí se puede usar para
amplificar y detectar ácidos nucleicos diana asociados con
enfermedades infecciosas, trastornos genéticos y trastornos
celulares tales como cáncer. También se usar para investigaciones
forenses y registro de ADN. Es particularmente útil para la
detección de agentes infecciosos, tales como bacterias y virus, por
detección de ácidos nucleicos asociados con ellos. Tiene utilidad
particular cuando se requiere una sensibilidad y/o cuantificación
muy altas.
El grupo de bacterias que se pueden detectar por
la presente invención incluye, aunque no limitativamente, bacterias
encontradas en sangre humana, tales como las especies salmonela,
especie estreptococos, especies clamidia, especie gonococos, especie
micobacteria (tales como Mycobacterium tuberculosis y
Mycobacterium avium complex), especie micoplasma (tales como
Mycoplasma Hemophilus influenzae y Mycoplasma
pneumoniae), Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferei,
Pneumocystitis carinii, Clostridium difficile, especie
campliobacteria, especie yersinia, especie shigella y especie
listeria. El grupo de virus que son detectables incluye, aunque no
limitativamente, citomegalovirus, virus de herpex simple, virus de
Epstein Barr, virus de papiloma humano, virus de gripe, virus de
hepatitis y retrovirus (tales como HTLV-I,
HTLV-II, HIV-I y
HIV-II). También son detectables por la presente
invención parásitos protozoos, levaduras y mohos. Los expertos en la
técnica podrán identificar fácilmente otras especies
detectables.
Un "reactivo de PCR" se refiere a cualquiera
de los reactivos considerados esenciales para la PCR, a saber, una
serie de cebadores para cada ácido nucleico diana, una
ADN-polimerasa, un cofactor de
ADN-polimerasa y uno o más
desoxirribonucleósido-5'-trifosfatos
(dNTPs). Se describen más adelante otros reactivos y materiales
opcionales usados en PCR.
El término "cebador" se refiere a un
oligonucleótido, sea natural o producido sintéticamente, que es
capaz de actuar como punto de iniciación de la síntesis cuando se
pone en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto
de extensión del cebador, complementario de una cadena de ácido
nucleico (esto es, molde); tales condiciones incluyen la presencia
de otros reactivos de PCR y una temperatura y un pH adecuados.
Los cebadores de la presente invención se
seleccionan para que sean "sustancialmente complementarios" de
la secuencia específica de ácidos nucleicos a cebar y amplificar.
Esto significa que deben ser suficientemente complementarios para
hibridar con las respectivas secuencias de ácidos nucleicos para
formar los deseados productos híbridos y extenderse luego por una
ADN-polimerasa. Típicamente, un cebador
"sustancialmente complementario" contendrá al menos 70% o más
bases que son complementarias para la secuencia diana. Más
preferiblemente, 80% de las bases son complementarias, incluso más
preferiblemente, 90% de las bases son complementarias. En las
situaciones más preferidas, los cebadores tienen una
complementariedad entre 90% y 100% para la secuencia del ácido
nucleico diana.
Preferiblemente, el cebador es de una sola cadena
para una máxima eficiencia de amplificación, pero si se desea, puede
contener una región de doble cadena. Debe ser suficientemente larga
para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia de la
ADN-polimerasa. El tamaño exacto de cada cebador
variará dependiendo del uso contemplado, la concentración y
secuencia del cebador, la complejidad de la secuencia considerada
diana, la temperatura de reacción y la fuente del cebador. Por lo
general, los cebadores usados en esta invención tendrán de 12 a 60
nucleótidos y, preferiblemente, tienen de 16 a 40 nucleótidos. Más
preferiblemente, cada cebador tiene de 18 a 35 nucleótidos.
Los cebadores útiles en este contexto pueden
prepararse usando técnicas y equipos conocidos, entre los que están,
por ejemplo, un sintetizador ABI DNA (disponible en Applied
Biosystems), o un sintetizador Biosearch de la serie 8600 ó 8800
(disponible en Milligen-Biosearch, Inc.). Los
procedimientos para usar estos equipos son bien conocidos y se
describen, por ejemplo, en la patente U.S. nº. 4.965.188 (concedida
a Gelfand y otros). Los cebadores naturales aislados de fuentes
biológicas también pueden ser útiles (tales como digeridos de
restricción de endonucleasa). Generalmente se usa para cada ácido
nucleico diana un conjunto de al menos dos cebadores. Por tanto,
para amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos diana se puede
usar simultáneamente una pluralidad de conjuntos de cebadores.
Tal como se usa aquí, una "sonda" es un
oligonucleótido que sustancialmente es complementario de una
secuencia de ácidos nucleicos del ácido nucleico diana y que se usa
para detección o captura del ácido nucleico diana amplificado.
Los cabadores y/o las sondas usados en la
presente invención pueden estar, opcionalmente, marcados. Los
cebadores y/o sondas se pueden marcar usando procedimientos
conocidos con un ligando de unión específico (tal como biotina), una
enzima (tal como glucosaoxidasa, peroxidasas, uricasa y fosfatasa
alcalina), radioisótopos, reactivos de alta densidad de electrones,
cromógenos, fluorógenos, restos fosforescentes o ferritina.
Preferiblemente, el marcador es un ligando de unión específico. Más
preferiblemente, el ligando es biotina o uno de sus derivados,
estreptavidina o uno de sus derivados, o un hapteno.
Entre los reactivos de PCR adicionales necesarios
para PCR, están incluidos ADN-polimerasa
(preferiblemente una ADN-polimerasa termoestable),
un cofactor de ADN-polimerasa y dNTPs apropiados.
Estos reactivos se pueden proporcionar individualmente, como parte
de un kit de ensayo o en cámaras de reactivos de dispositivos de
ensayo.
Una ADN-polimerasa es una enzima
que añadirá moléculas de monofosfato de desoxinucleósidos al
terminal 3'-hidroxi del cebador en un complejo de
cebador y molde, pero esta adición es de modo dependiente del molde.
Por lo general, la síntesis de los productos de extensión transcurre
en la dirección de 5' a 3' de la cadena nuevamente sintetizada hasta
que termina la síntesis. El grupo de ADN-polimerasas
útiles incluye, por ejemplo, ADN-polimerasa I de
E. Coli, ADN-polimerasa T4, polimerasa de
Klenow, transcriptasa inversa y otras conocidas en la técnica.
Preferiblemente, la ADN-polimerasa es termoestable,
lo que significa que es estable al calor y preferentemente activa a
temperaturas más altas, especialmente a las altas temperaturas
usadas para cebar y extender cadenas de ADN. Más en particular, las
ADN-polimerasas no son sustancialmente inactivas a
las altas temperaturas usadas en reacciones en cadena de polimerasa
descritas aquí. Tales temperaturas dependerán de varias condiciones
de reacción, incluidos el pH, la composición del nucleótido, la
longitud de los cebadores, la concentración salina y otras
condiciones conocidas en la técnica.
Se ha dado cuenta en la técnica de varias
ADN-polimerasas termoestables; entre ellas, las
mencionadas detalladamente en las patentes U.S. nº. 4.965.188
(concedida a Gelfand y otros) y nº. 4.889.818 (concedida a Gelfand y
otros). Son polimerasas particularmente útiles las obtenidas de
varias especies bacterianas Thermus, tales como Thermus
aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus filiformis y Thermus
flavus. Se obtienen otras polimerasas termoestables útiles de
otras fuentes microbianas, entre las que están Thermococcus
literalis, Pyrococcus furiosis, especie Thermotoga y las
descritas en el documento
WO-A-89/06691 (publicado el 27 de
julio de 1989). Son asequibles comercialmente varias polimerasas
termoestables tales como AppliTaq®, Tth y UlTma^{MC} de Perkin
Elmer, Pfu de Stratagene, y Vent y Deep-Vent de New
England Biolabs. También se conocen varias técnicas para aislar
polimerasas naturales de organismos y para producir enzimas por
ingeniería genética usando técnicas recombinantes.
Un factor de ADN-polimerasa se
refiere a un compuesto no proteínico del que depende una enzima para
su actividad. Así, la enzima es catalíticamente inactiva sin la
presencia del cofactor. Varios materiales son cofactores conocidos,
entre ellos, aunque no únicamente, sales de manganeso y magnesio
tales como cloruros, sulfatos, acetatos, y sales de ácidos grasos.
Son preferidos cloruros y sulfatos de magnesio.
También son necesarios para PCR dos o más
desoxirribonucleósido-5'-trifosfatos,
tales como dATP, dCTP, dGTP, dTTP y dUTP. También son útiles
análogos tales como dITP y
7-deaza-dGTP. Preferiblemente, se
usan juntos los cuatro fosfatos comunes (dATP, dCTP, dGTP y
dTTP).
Los reactivos para PCR descritos aquí se
proporcionan y usan para PCR en concentraciones adecuadas para que
haya amplificación del ácido nucleico diana. Son bien conocidas en
la técnica las cantidades mínimas de cebadores,
ADN-polimerasa, cofactores y
desoxirribonicleósiso-5'-trifosfatos
necesarios para amplificación y los intervalos adecuados. La
cantidad mínima de ADN-polimerasa generalmente es de
como mínimo aproximadamente 0,5 unidades /100 \mul de solución,
prefiriéndose de aproximadamente 2 a aproximadamente 25 unidades/100
\mul de solución y, prefiriéndose más, de aproximadamente 7
unidades a aproximadamente 20 unidades/100 \mul de solución. Para
sistemas de amplificación dados pueden ser útiles otras cantidades.
Una "unidad" se define aquí como la actividad de enzima
requerida para incorporar 10 nmoles de la totalidad de nucleótidos
(dNTPs) en una cadena en extensión de ácido nucleico en 30 minutos a
74ºC. La cantidad mínima de cebador es como mínimo aproximadamente
0,075 \mumolar, siendo preferida la cantidad de aproximadamente
0,1 a aproximadamente 2 \mumolar; pero son bien conocidas otras
cantidades en la técnica. Generalmente, el cofactor está presente en
una cantidad de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 mmolar. La
cantidad de cada dNTP generalmente es de aproximadamente 0,25 a
aproximadamente 3,5 mmolar.
Los reactivos para PCR pueden suministrarse
individualmente o en varias combinaciones, o todos en una solución
tamponada que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 7 a
aproximadamente 9, usando cualquier tampón adecuado, muchos de los
cuales son conocidos en la técnica.
Entre otros reactivos que se pueden usar en PCR
están incluidos, por ejemplo, anticuerpos específicos de la
ADN-polimerasa termoestable, exonucleasas y/o
glicosilasas. Se pueden usar anticuerpos para inhibir la polimerasa
antes de la amplificación. Los anticuerpos útiles en la presente
invención son específicos para la ADN-polimerasa
termoestable, inhiben la actividad enzimática de la
ADN-polimerasa a temperaturas por debajo de 50ºC y
se desactivan a temperaturas más altas. Entre los anticuerpos útiles
están incluidos anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y
fragmentos de anticuerpos. Preferiblemente, el anticuerpo es
monoclonal. Los anticuerpos útiles en la presente invención se
pueden preparar usando procedimientos conocidos, tales como los
descritos por Harlow y otros en Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor, NY (1988).
Se describen anticuerpos monoclonales
representativos en la patente U.S. nº. 5.338.671 (concedida a
Scalice y otros). Dos de estos anticuerpos monoclonales los puede
obtener fácilmente un experto en la técnica usando procedimientos y
materiales de partida convencionales, incluida cualquiera de las
líneas de células de hibridoma HB 11126 o 11127, depositadas en la
American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD. El
anticuerpo monoclonal está presente en una cantidad en la relación
molar de 5:1 a 500:1 con la ADN-polimerasa.
Los anticuerpos específicos de la
ADN-polimerasa se pueden usar en la presente
invención solos o en combinación con una exonucleasa y/o una
glicolasa según se describe en el documento
EP-A-0 726 324.
El uso combinado de un antibiótico, una
exonucleasa y una glicosilasa reduce la formación de artefactos de
ciclo cero. El grupo de exonucleasa adecuadas para uso en PCR
incluye, aunque no limitativamente, exonucleasa III, exonucleasa I,
exonucleasa, T7 exonucleasa, ribonucleasa II,
polinucleótido-fosforilasa y BAL
31-nucleasa. Tales exonucleasas son asequibles
comercialmente o se pueden obtener por procedimientos conocidos en
la técnica. Son glicolasas útiles en la presente invención las que
escinden específicamente bases no convencionales, esto es, bases que
no son A, G, C o T en ADN, A, G, C y U en ARN. Entre las glicolasas
preferidas están incluidas
uracil-N-glicolasa (UNG),
hipoxantina-ADN glicolasa y
3-metiadenina-ADN glicolasas I y II.
En una realización preferente, se emplean
Taq-polimerasa, un anticuerpo monoclonal frente a la
Taq-polimerasa, exonucleasa III y
uracil-N-glicosilasa.
Un ácido nucleico diana (ADN o ARN) se puede
obtener de cualquiera de varias fuentes, como se ha indicado antes.
Por lo general, la muestra se trata de alguna manera para hacer que
el ADN esté disponible para tener contacto con los cebadores y otros
reactivos de PCR. Usualmente, esto implica eliminar proteínas no
necesarias y materia celular de la muestra usando uno de los varios
procedimientos conocidos en la técnica.
Dado que el ácido nucleico a amplificar y
detector frecuentemente está en forma de doble cadena, se deben
separar las dos cadenas (esto es, desnaturalizar) antes de que pueda
tener lugar el cebado y la amplificación. La desnaturalización se
puede efectuar usando un tratamiento solo o en combinación con
cualquier otro medio físico, químico o enzimático adecuado para
separar las cadenas, como se describe en la técnica. Por lo general,
la desnaturalización inicial se efectúa calentando la muestra
sospechosa de contener el ácido nucleico diana a una primera
temperatura de aproximadamente 85ºC a aproximadamente 100ºC durante
un tiempo adecuado, por ejemplo de aproximadamente 1 segundo a 3
minutos.
Las cadenas desnaturalizadas se enfrían luego a
una temperatura que generalmente está en el intervalo de
aproximadamente 55ºC a aproximadamente 70ºC para cebar las cadenas.
El tiempo necesario para enfriar las cadenas después de la
desnaturalización inicial dependerá del tipo de aparato usado para
el proceso de PCR.
Una vez que las cadenas se han enfriado a la
segunda temperatura, las cadenas desnaturalizadas se incuban junto
con la mezcla de reacción que contiene los reactivos de PCR a una
temperatura adecuada para efectuar el anillamiento (hibridación) de
los cebadores a las cadenas y la extensión de los cebadores para
formar productos de extensión del cebador. Por lo general, esta
temperatura es de, como mínimo 50ºC y, preferiblemente, está en el
intervalo de aproximadamente 62ºC a aproximadamente 75ºC. El tiempo
de incubación puede variar ampliamente dependiendo de la temperatura
de incubación y la longitud deseada de los productos de extensión;
pero, en realizaciones preferentes, es de aproximadamente 1 segundo
a aproximadamente 120 segundos. Cada ciclo de PCR puede efectuarse
usando dos o tres temperaturas, una para la desnaturalización y una
segunda o tercera temperatura para cebado y/o formación de productos
de extensión del cebador.
En cualquier punto después de la generación de
como mínimo un producto de extensión del cebador, se puede parar la
amplificación y detectar el producto de extensión diana del cebador
(la diana "amplificada"). Sin embargo, si luego se
desnaturalizan los productos de extensión del cebador hibridados, la
PCR se puede realizar más en tantos ciclos de cebado, extensión y
desnaturalización como se desee. El número de ciclos de PCR
efectuados dependerá, en parte, de la cantidad de diana amplificada
deseada y lo pueden determinar fácilmente los expertos en la
técnica. Por lo general, se realizarán al menos 20 ciclos,
prefiriéndose de 20 a 50 ciclos.
Cuando se amplifican múltiples ácidos nucleicos
diana, en especial casos en que una de las dianas es una diana de un
número bajo de copias y una es una diana de un número alto de
copias, se puede emplear una etapa secundaria de renaturalización
después de haber llevado a cabo ciclos principales de PCR, según se
describe en el documento EP-A-0 694
617.
Después de como mínimo 15 ciclos principales de
amplificación, (un ciclo principal de amplificación comprende
desnaturalización, cebado y extensión), se realizan ciclos
secundarios de amplificación que tienen las mismas etapas, excepto
que se incluye una etapa de renaturalización después de cada etapa
de desnaturalización y antes del anillamiento del cebador. La
renaturalización se efectúa enfriando la mezcla de reacción a una
cuarta temperatura, según se describe en el documento
EP-A-0 694 617.
En la presente invención, después de haber
amplificado el ácido nucleico diana usando el número deseado de
ciclos de PCR, se realiza una etapa postamplificación de incubación,
previa a la detección, para inactivar la
ADN-polimerasa y aumentar así la sensibilidad de
detección. Las condiciones bajo las cuales se efectúa la etapa
postamplificación de incubación, dependerán de la enzima
termoestable usada, pero la temperatura y el período de incubación
combinados serán tales que se inactive la enzima. Preferiblemente,
esta etapa postamplificación de incubación se realiza incubando la
mezcla de PCR de amplificación que contiene la diana amplificada a
una temperatura entre aproximadamente 105ºC y aproximadamente 120ºC
durante entre aproximadamente 1 segundo y aproximadamente 30
minutos. Preferiblemente, la etapa postamplificación de incubación
implica un calentamiento a una temperatura entre 105ºC y 110ºC
durante 15 segundos a 10 minutos, más preferiblemente a una
temperatura de aproximadamente 105ºC durante como máximo 5
minutos.
Una vez realizada la incubación
postamplificación, se pueden detectar las dianas de ácido nucleico
amplificado. La detección se puede efectuar de varias maneras
conocidas, tales como las descritas en la patente U.S. nº. 4.965.188
(concedida a Gelfand y otros). Por ejemplo, los ácidos nucleicos
amplificados se pueden detectar usando transferencia Southern,
técnicas de transferencia de mancha, o la detección no isotópica por
captura de oligonucleótidos con una sonda marcada. Alternativamente,
la amplificación se puede realizar usando cebadores que se han
marcado apropiadamente, y los productos de extensión de cebadores
amplificados se pueden detectar usando procedimientos y equipos para
la detección de la marca.
En una realización preferente, el ácido nucleico
diana se detecta usando una sonda de nucleótido que está marcada
para detección y se puede hibridar directa o indirectamente con la
diana amplificada. La sonda debe ser soluble o estar unida a un
soporte sólido. En otra realización preferente, se marcan uno o más
de los cebadores usados para amplificar el ácido nucleico diana, por
ejemplo con un resto específico de unión. El producto de extensión
del cebador resultante puede capturarse con una sonda. La detección
de la diana amplificada hibridada a la sonda se puede lograr
detectando la presencia de la sonda marcada o la diana marcada
amplificada usando equipos y procedimientos de detección adecuados
que son bien conocidos en la técnica. Ciertos marcadores pueden ser
visibles a simple vista sin usar un equipo de detección.
En una realización más preferente, se marcan con
biotina uno o varios de los cebadores usados para amplificar el
ácido nucleico diana y los ácidos nucleicos diana amplificados,
biotinilados, se hibridan a sondas unidas a un soporte sólido. Las
dianas unidas se detectan luego poniéndolas en contacto con un
conjugado de estreptavidina-peroxidasa en presencia
de un oxidante, tal como peróxido de hidrógeno, y una composición
adecuada que forma un colorante. Por ejemplo, entre los reactivos
útiles que forman un colorante están incluidos tetrametilbencidina y
sus derivados, y colorantes leuco tales como colorantes leuco de
triarilimidazol, según se describe en la patente U.S. nº. 4.089.747
(concedida a Bruschi).
Tal como se usa aquí, cuando se hace referencia a
tiempos, el término "aproximadamente" se refiere a \pm 10%
del tiempo indicado. Cuando se hace referencia a temperaturas, el
término "aproximadamente" se refiere a \pm 5ºC.
Los ejemplos siguientes se incluyen para ilustrar
al práctica de esta invención y no significan que sean limitativos
de alguna manera. Todos los porcentajes son en peso a no ser que se
indique lo contrario.
\newpage
Se preparó ADN-polimerasa
recombinante a partir de Thermus aquaticus usando
procedimientos conocidos tales como el descrito en el documento
EP-A-0 482 714, y tenía una
actividad de aproximadamente 250.000 unidades/mg de proteína.
Los cebadores usados en los Ejemplos siguientes
tenían las siguientes secuencias:
5'-CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT-3'-(SEQ.
ID
NO.1)
5'-TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT-3'
(SEQ ID NO.
2).
La sonda de captura tiene la secuencia
siguiente:
5'-GAACCGAGGGCCGGCTCACCTCTATGTTGG-3'
(SEQ.ID NO.
3).
Los cebadores y sondas usados en los Ejemplos
siguientes se prepararon usando materiales de partida y
procedimientos conocidos, usando un sintetizar de ADN de tres
columnas, de Applied Bioystems, modelo 380B, empleando química
estándar de fosforamidita y la escala 1 \mumolar de ABI, protocolo
de ciclo rápido. Los soportes de poro controlado para
nucleósido-3'-fosforamiditas y
derivatizados de nucleósidos se obtuvieron de Applied
Biosystems.
Los cebadores tenían las secuencias identificadas
antes. Se funcionalizaron en el extremo 5' con dos espaciadores
aminotetraetilenglicol de acuerdo con la patente U.S. nº. 4.962.029,
y seguidamente por una sola fosforamidita de biotina comercialmente
disponible en DuPont. Las sondas se funcionalizaron en el extremo 3'
con dos especiadores tetraetilenglicol y seguidamente por un solo
grupo de unión aminodiol de acuerdo con la patente U.S. nº.
4.914.210. Todas las purificaciones se efectuaron usando una columna
de purificación de ácidos nucleicos y seguidamente por técnicas de
HPLC en fase inversa. Los desoxirribonucleótidos (dNTPs) se
obtuvieron de Sigma Chemical Co.
Se usó una solución de conjugado de
estreptavidina-peroxidasa que comprendía un
conjugado adquirible comercialmente (Sigma Chemical Co.) de
estreptavidina y peroxidasa de rábano picante, caseína (0,5%) y
mertiolato (0,5%) en una solución salina tamponada con fosfato
(fosfato sódico 24 mmolar y cloruro sódico 75 mmolar). Como
estabilizador del conjugado se añadió
4'-hidroxiacetanilida 10 mmolar. En los Ejemplos 1 y
2, la concentración final de conjugado era 0,28 nM.
El ADN de citomegalovirus, cepa AD 169, se
recibió de Applied Biotechnology. En resumen el ADN se extrajo de
líneas de células de fibroblastos de prepucio humano usando
procedimientos convencionales:
| Virus: | Citomegalovirus, cepa AD 169 |
| Línea de células para propagación: | Fibroblastos de prepucio humano |
| Preparación del virus: | Purificado en gradiente de densidad de sacarosa, concentración 1000x |
| Recuento de partículas de virus: | 1,65 x 10^{10} pv/ml a 1000x |
| Título de TCID_{50} sobre virus activo | 10^{7} unidades de TCID_{50}/ml a 1000x |
| Volumen: | 0,1 ml |
| Tampón de la suspensión: | Tris 10 mM/EDTA 1 mM, pH 8,0 |
| Preparación del extracto: | SDS, digestión de proteinasa K seguida de extracción con fenol/cloroformo |
| y precipitación con etanol. Preparado 1 ml de extracto a partir de 1 ml de | |
| virus purificado | |
| Envío y almacenamiento: | envío de 6 x 0,1 ml congelado a -70ºC. Almacenado a -20ºC o más frío. |
La dispersión del colorante leuco contenía
agarosa (0,5%), leucocolorante
4,5-bis(4-dimetilaminofenil)-2-(4-hidroxi
-3-metoxifenil)imidazol (250 \mumolar),
ácido dietilentriaminapentaacético (100 \mumolar),
3'-cloro-4'-hidroxiacetanilida
(5 mmolar), polivinilpirrolidona (112 mmolar), fosfato sódico,
monobásico, 1-hidrato (10 mmolar) y peróxido de
hidrógeno (H_{2}O_{2}) (8,82 mmolar).
La solución de lavado (pH 7,4) contenía cloruro
sódico (373 mmolar), sal disódica del ácido
(etilendinitrilo)-tetraacético (2,5 mmolar), sulfato
decilsódico (38 mmolar) y ácido etilceritiosalicílico, sal sódica
(25 \mumolar) en tampón de fosfato sódico, monobásico,
1-hidrato (25 mmolar).
En la mezcla de reacción se usaron anticuerpos
monoclonales. Estos anticuerpos, "TP1-12.2" y
"TP4-9.2" son específicos para la
ADN-polimerasa de Thermus acquaticus y se
describen detalladamente en el documento
EP-A-0 726 324.
La mezcla de reacción en cadena de polimerasa (75
ml) contenía tampón tris(hidroximetil)aminometano (10
mmolar, pH 8), cloruro potásico (50 mmolar), cloruro magnésico (4
mmolar), dATP, dCTP, dGTP y dTTP (0,3 mM cada uno), los cebadores
SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 2 (cada uno 0,4 \mumolar), gelatina de
tipo IV (100 mg/ml), Taq-polimerasa (16 unidades/100
\mul) y glicerol (9,5%). Se usó un exceso molar de 50 veces
(respecto a polimerasa) de TP1-12.2 y un exceso de
5x de TP4-9.2.
La purificación por PCR se realizó usando un
procesador automático de PCR descrito en la patente U.S. nº.
5.089.233.
Para formar los reactivos de captura, las sondas
se unieron covalentemente a partículas polímeras (diámetro medi, 1
\mum) preparadas usando técnicas convencionales de polimerización
en emulsión, a partir de
poli[estireno-co-3-(p-vinil-benciltio)ácido
propiónico] (relación ponderal 95:5, diámetro medio 1 \mum). Se
lavó con tampón de ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico (0,1 M, pH 6)
una suspensión de las partículas en agua y se ajustó la suspensión a
aproximadamente 10% de sólidos. Una muestra (3,3 ml) de las
partículas lavadas, diluida a 3,33% de sólidos en el tampón (0,1
molar), se mezcló con hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(2,1 ml de 84 mg/ml de agua) y la sonda (983 \mul de 44,44 OD/ml
de agua nanopura). La suspensión resultante se calentó a 50ºC en
baño maría durante aproximadamente dos horas con mezcladura y
centrifugación intermitentes. Las partículas se lavaron luego tres
veces con tampón de tris(hidroximetil)aminometano
(0,01 molar, pH 8) que contenía sal disódica del ácido
(etilendinitrilo)tetra-acético (0,001 molar)
y se pusieron en suspensión a un contenido de 4% de sólidos. Las
partículas se inmovilizaron luego como manchas discretas en una
bolsa de PCR de Clinical Diagnostic a 25 de sólidos más pegamento.
Los productos de la PCR se detectaron usando el sistema de detección
Clinical Diagnostic's Pouch.
Se obtuvieron otros reactivos y materiales de
fuentes comerciales o se prepararon usando materiales de pattida
fácilmente adquiribles y procedimientos convencionales.
Este ejemplo demuestra la presente invención para
detectar productos de ácidos nucleicos que se han producido usando
la PCR empleando una etapa postamplificación de incubación para
desnaturalizar la polimerasa.
Se crearon reservas positivas amplificando diana
de CMV usando 40-45 ciclos del siguiente protocolo
de PCR:
1. Desnaturalización por calentamiento a 95ºC
durante 15 segundos y
2. Ciclos de cebado y extensión a 70ºC durante 30
segundos.
La concentración de producto se cuantificó por
electroforesis en gel con concentraciones conocidas de patrones de
ADN. La mezcla de reacción PCR postamplificación resultante se usó
luego como se describe más adelante.
Además de generar la mezcla de reacción
post-PCR, se preparó una reserva negativa de
producto de CMV efectuando la amplificación de PCR sobre la mezcla
de reacción de PCR sin la adición de diana de ADN de CMV usando el
anterior protocolo de PCR.
La mezcla postamplificación de la reacción de
PCR (10^{-7} a 10^{-8} M) se diluyó 1:100 a 1:5.000 con reserva
de producto negativo de CMV para obtener una concentración final de
ADN de CMV de 1 x 10^{-10} M, 2,5 x 10^{-11} M o 5 x 10^{-11}
M. La mezcla de postamplificación de la reacción PCR diluida se
sometió luego a una etapa postamplificación de incubación para
desactivar la polimerasa. La etapa postamplificación de incubación
se realizó durante 2 minutos a 97ºC o 100ºC, o durante 5 minutos a
100ºC.
Después de la incubación postamplificación, el
producto amplificado se detectó capturando los ácidos nucleicos
diana con los reactivos de captura a 58ºC durante 1 minuto en una
bolsa de PCR de Clinical Diagnostic. Los productos capturados se
pusieron luego en contacto y se incubaron con la solución de
estreptavidina-peroxidasa a 55ºC durante 1 minuto.
Se hizo un lavado usando la solución de lavado durante 1 minuto a
55ºC, después de lo cual se añadió la composición que proporciona el
colorante y se dejó que incubara durante 4 minutos a 40ºC. La señal
resultante se leyó con un dispositivo de rastreo de disposición en
línea. El rastreo determinó el cambio de la densidad de reflectancia
(\DeltaDr). \DeltaDr es la diferencia de la densidad de
reflectancia entre una lectura inicial antes de la iniciación del
revelado del colorante y una lectura final hecha 4 minutos después
de haberse revelado el colorante. El fondo del dispositivo de
rastreo sobre lechos de captura visualmente negativos variaba de
0,05 a 0,1 unidades Dr.
Los resultados siguientes revelan que una etapa
de incubación postamplificación aumenta la sensibilidad de
detección.
Estos resultados revelan que una etapa
postamplificación de incubación a 100ºC durante 5 minutos aumenta el
límite de detección efectiva por encima del fondo en al menos cuatro
veces y, probablemente, en al menos cinco veces. Sobre la base de
estos resultados, especialmente de la mejora por aumento del período
de incubación a 100ºC desde 2 minutos a 5 minutos, se realizó un
segundo experimento con una incubación postamplificación de 15
minutos a 100ºC.
En este segundo experimento, la amplificación del
ADN de CMV se realizó como se ha descrito en el Ejemplo 1. La mezcla
de reacción postamplificación de PCR se diluyó con reserva de
producto negativo de CMV y se sometió a una incubación
postamplificación para inactivar la polimerasa como se ha descrito
en el Ejemplo 1. La etapa de incubación postamplificación se realizó
durante 15 minutos a 100ºC. Después de la incubación
postamplificación, el producto amplificado se detectó como se ha
descrito en el Ejemplo 1.
Los resultados siguientes demuestran que una
etapa postamplificación de incubación aumenta la sensibilidad de
detección.
Estos resultados sugieren que el aumento del
tiempo de incubación postamplificación aporta beneficios
adicionales.
\newpage
Para determinar si se podría beneficiar
adicionalmente la sensibilidad de detección elevando la temperatura
de incubación, la amplificación del ADN de CMV se realizó como se ha
descrito en el Ejemplo 1 y la incubación postamplificación se
realizó a 100ºC ó 103ºC. Se investigaron varios tiempos de
incubación a 103ºC. Además, este experimento se realizó con una
química de detección menos sensible que tiene una concentración
final de conjugado de 0,28 nM. los resultados de este experimento
fueron:
Estos resultados demuestran que, aumentando la
temperatura de la etapa postamplificación de incubación de 100ºC a
103ºC y manteniendo el período de incubación de 5 minutos, se puede
lograr un aumento de como mínimo dos veces y, probablemente, de tres
veces.
Claims (22)
1. Un procedimiento para amplificar y detectar un
ácido nucleico diana, que comprende:
(i) poner en contacto una muestra que se sospecha
que contiene el ácido nucleico diana con al menos dos
oligonucleótidos y una enzima termoestable de amplificación, siendo
los mencionados oligonucleótidos sustancialmente complementarios de
una parte del ácido nucleico diana, en condiciones tales que el
ácido nucleico diana se amplifique;
(ii) amplificar el mencionado ácido nucleico
diana;
(iii) incubar la muestra durante entre 1 segundo
y 30 minutos a entre 105ºC y 120ºC como etapa postamplificación de
incubación para inactivar la mencionada enzima termoestable de
activación; y
(iv) detectar la presencia o ausencia de los
mencionados ácidos nucleicos diana amplificados.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que se usan cuatro oligonucleótidos y una ADN-ligasa
termoestable.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la etapa (i) comprende poner en contacto la muestra que se
sospecha que contiene el mencionado ácido nucleico diana con cuatro
diferentes trifosfatos de nucleósidos, una
ADN-polimerasa termoestable y dos cebadores, en el
que los mencionados cebadores son sustancialmente complementarios
del mencionado ácido nucleico diana, en condiciones tales que el
mencionado ácido nucleido diana sea amplificable.
4. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la mencionada etapa
postamplificación de incubación se realiza durante entre 15 segundos
y 10 minutos, preferiblemente entre 0,5 minutos y 5 minutos, a entre
105ºC y 120ºC.
5. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la mencionada etapa
postamplificación de incubación se realiza a entre 110ºC y
120ºC.
6. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la mencionada etapa
postamplificación de incubación se realiza durante entre 15 segundos
y 10 minutos, preferiblemente entre 0,5 y 5 minutos a
aproximadamente 105ºC.
7. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el mencionado ácido nucleico
diana es ADN o ARN.
8. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el mencionado ácido nucleico diana es
ADN.
9. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el mencionado ácido nucleico diana es
ARN.
10. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que los mencionados trifosfatos
de nucleósidos son trifosfatos de desoxirribonucleósidos.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que los mencionados trifosfatos de nucleósidos son dATP, dCTP,
dGTP y dTTP.
12. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la mencionada
ADN-polimerasa termoestable se selecciona entre el
grupo constituido por polimerasa de thermus aquaticus,
polimerasa de thermus thermophilus y polimerasa de
theromococcus litoralis.
13. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que al menos uno de los
mencionados cebadores está marcado.
14. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que los mencionados cebadores
están marcados.
15. El procedimiento de la reivindicación 13 ó
14, en el que al menos uno de los mencionados cebadores está marcado
con un ligando de unión específico.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que el mencionado ligando de unión específico es biotina.
17. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los
mencionados ácidos nucleicos diana se detectan usando una sonda
marcada que se puede hibridar con uno o más ácidos nucleicos
diana.
\newpage
18. El procedimiento de la reivindicación 17, en
el que la mencionada sonda marcada está unida a un soporte
sólido.
19. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que al menos uno de los mencionados cebadores está marcado con un
ligando de unión específico y los mencionados ácidos nucleicos diana
amplificados se detectan usando una sonda que puede hibridar con uno
de los ácidos nucleicos diana.
20. El procedimiento de la reivindicación 19, en
el que la mencionada sonda marcada está unida a un soporte
sólido.
21. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la muestra que se sospecha que contiene
el mencionado ácido nucleico diana se pone en contacto con cuatro
diferentes trifosfatos de nucleósidos, una
ADN-polimerasa termoestable y dos cebadores, y al
menos uno de los mencionados cebadores está marcado con biotina y
los mencionados cebadores son sustancialmente complementarios del
mencionado ácido nucleico diana, y la muestra se incuba durante
entre 0,5 minutos y 5 minutos a aproximadamente 105ºC, y la
presencia o ausencia de ácidos nucleicos diana amplificados
biotinilados se detecta haciendo reaccionar los mencionados ácidos
nucleicos diana amplificados biotinilados con un conjugado de
avidina-enzima, a lo que sigue la reacción de la
mencionada enzima con un reactivo sustrato para producir una señal
colorimétrica o quimiluminiscente detectable.
22. El procedimiento de la reivindicación 21, en
el que los mencionados ácidos nucleicos diana amplificados se
detectan poniéndolos en contacto con un conjugado de
avidina-peroxidasa, a lo que sigue la reacción de
la peroxidasa, en presencia de un oxidante, con: luminol para
producir una señal quimiluminiscente detectable o un colorante leuco
para producir una señal colorimétrica detectable.
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