JPH1118785A - ナイセリア・コノルホエア−特異的オリゴヌクレオチド - Google Patents
ナイセリア・コノルホエア−特異的オリゴヌクレオチドInfo
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- JPH1118785A JPH1118785A JP10109737A JP10973798A JPH1118785A JP H1118785 A JPH1118785 A JP H1118785A JP 10109737 A JP10109737 A JP 10109737A JP 10973798 A JP10973798 A JP 10973798A JP H1118785 A JPH1118785 A JP H1118785A
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 細菌感染の１つである淋病の原因物質である
ナイセリア・コノルホエア以外のナイセリア種の少数単
離物におけるＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子配列に基づく検出ア
ッセイは誤った陽性結果を付与する。 【解決手段】 Ｎ．ゴノルホエアからのＮｇ−ＣＤＭＴ
遺伝子配列と新しく発見された単離物に見出されるその
対応するＮｇ−ＣＤＭＴ配列とを、選択ハイブリダイゼ
ーションにより識別するオリゴヌクレオチドに関する。
ナイセリア・コノルホエア以外のナイセリア種の少数単
離物におけるＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子配列に基づく検出ア
ッセイは誤った陽性結果を付与する。 【解決手段】 Ｎ．ゴノルホエアからのＮｇ−ＣＤＭＴ
遺伝子配列と新しく発見された単離物に見出されるその
対応するＮｇ−ＣＤＭＴ配列とを、選択ハイブリダイゼ
ーションにより識別するオリゴヌクレオチドに関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、分子生物学及び核
酸化学の分野に関する。より詳しくは、本発明はナイセ
リア・コノルホエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒ
ｒｈｏｅａｅ）核酸を増幅するための方法及び試薬に関
する。従って、本発明は、ナイセリア・コノルホエアの
検出、一般的に、医学的診断の分野、及び分子生物学の
分野に適用できる。
酸化学の分野に関する。より詳しくは、本発明はナイセ
リア・コノルホエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒ
ｒｈｏｅａｅ）核酸を増幅するための方法及び試薬に関
する。従って、本発明は、ナイセリア・コノルホエアの
検出、一般的に、医学的診断の分野、及び分子生物学の
分野に適用できる。
【０００２】
【従来の技術】ナイセリア・コノルホエアは、アメリカ
合衆国において最も一般的に報告される細菌感染の１つ
である淋病の病原体である。 Miyada and Born, 1991, Mol. Cell. Probes 5：327-33
5 ；アメリカ特許第５，２５６，５３６５号；及びアメ
リカ特許第５，５２５，７１７号は、Ｎ．ゴノルホエア
シトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子
（Ｍ．Ｎｇｏ ＰII）の配列と有意な相同性を有するオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）を含むゲノム
フラグメントに由来するＤＮＡプローブを用いてのＮ．
ゴノルホエアの検出を記載している。
合衆国において最も一般的に報告される細菌感染の１つ
である淋病の病原体である。 Miyada and Born, 1991, Mol. Cell. Probes 5：327-33
5 ；アメリカ特許第５，２５６，５３６５号；及びアメ
リカ特許第５，５２５，７１７号は、Ｎ．ゴノルホエア
シトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子
（Ｍ．Ｎｇｏ ＰII）の配列と有意な相同性を有するオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）を含むゲノム
フラグメントに由来するＤＮＡプローブを用いてのＮ．
ゴノルホエアの検出を記載している。
【０００３】この配列に由来するプローブは、ドット−
ブロット形式で試験された１０６のＮ．ゴノルホエア株
の１０５からの精製されたＤＮＡにハイブリダイズする
ことが示された。他のナイセリア種との交差反応性が
Ｎ．ムコサ（Ｎ．ｍｕｃｏｓａ）に対してのみ観察され
ているが、しかしながら、この交差反応性は高い緊縮洗
浄を用いて排除された。
ブロット形式で試験された１０６のＮ．ゴノルホエア株
の１０５からの精製されたＤＮＡにハイブリダイズする
ことが示された。他のナイセリア種との交差反応性が
Ｎ．ムコサ（Ｎ．ｍｕｃｏｓａ）に対してのみ観察され
ているが、しかしながら、この交差反応性は高い緊縮洗
浄を用いて排除された。
【０００４】核酸の特定の配列を増幅するための方法、
特にポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の発明は、これまで
検知できないほど少量の、サンプルに存在する核酸の急
速な検出を可能にした（アメリカ特許第４，６８３，１
９５号；第４，６８３，２０２号；及び第４，９６５，
１８８号を参照のこと）。ＰＣＲの開発及び適用は、文
献において広範に記載されている。
特にポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の発明は、これまで
検知できないほど少量の、サンプルに存在する核酸の急
速な検出を可能にした（アメリカ特許第４，６８３，１
９５号；第４，６８３，２０２号；及び第４，９６５，
１８８号を参照のこと）。ＰＣＲの開発及び適用は、文
献において広範に記載されている。
【０００５】たとえば、一連のＰＣＲ−関連トピックス
は、PCR Technology-principles and applications for
DNA amplification, 1989, (ed. H.A. Erlich) Stockt
on Press, New York ; PCR Protocols : A guide to me
thods and applications, 1990, (ed. M.A. Innis な
ど.) Academic Press, San Diego；及び PCR Strategie
s, 1995 (ed. M.A. Innis など.) Academic Press, San
Diegoに論じられている。商業的販売会社、たとえばPe
rkin Elmer (Norwalk, CT)は、ＰＣＲ試薬を市販してお
り、そしてＰＣＲプロトコールを公開している。
は、PCR Technology-principles and applications for
DNA amplification, 1989, (ed. H.A. Erlich) Stockt
on Press, New York ; PCR Protocols : A guide to me
thods and applications, 1990, (ed. M.A. Innis な
ど.) Academic Press, San Diego；及び PCR Strategie
s, 1995 (ed. M.A. Innis など.) Academic Press, San
Diegoに論じられている。商業的販売会社、たとえばPe
rkin Elmer (Norwalk, CT)は、ＰＣＲ試薬を市販してお
り、そしてＰＣＲプロトコールを公開している。
【０００６】核酸増幅の最初の記載以来、プライマーに
基づく核酸増幅の次の種々の方法が記載されて来たが、
但しそれらだけには限定されない：Ligase Chain React
ion(LCR, Wu and Wallase, 1989, Genomics 4:560-569
及びBarany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:18
9-193)；Polymerase Ligase Chain Reaction (Barany,
1991, PCR Mechods and Appli. 1:5-16); Gap-LCR(ＰＣ
Ｔ特許公開番号ＷＯ９０／０１０６９）；Repair Chain
Reaction(ヨーロッパ特許公開番号４３９，１８２Ａ
２）、３ＳＲ（Kwohなど., 1989, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 86:1173-1177 ; Guatelli など., 1990, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878；ＰＣＴ特許公開
番号ＷＯ９２／０８８０Ａ）及びＮＡＳＢＡ（アメリカ
特許第５，１３０，２３８号）。増幅システムの調査
が、Abramson and Myers, 1993, Current Opinion in B
iotechnology 4:41-47に提供されている。
基づく核酸増幅の次の種々の方法が記載されて来たが、
但しそれらだけには限定されない：Ligase Chain React
ion(LCR, Wu and Wallase, 1989, Genomics 4:560-569
及びBarany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:18
9-193)；Polymerase Ligase Chain Reaction (Barany,
1991, PCR Mechods and Appli. 1:5-16); Gap-LCR(ＰＣ
Ｔ特許公開番号ＷＯ９０／０１０６９）；Repair Chain
Reaction(ヨーロッパ特許公開番号４３９，１８２Ａ
２）、３ＳＲ（Kwohなど., 1989, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 86:1173-1177 ; Guatelli など., 1990, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878；ＰＣＴ特許公開
番号ＷＯ９２／０８８０Ａ）及びＮＡＳＢＡ（アメリカ
特許第５，１３０，２３８号）。増幅システムの調査
が、Abramson and Myers, 1993, Current Opinion in B
iotechnology 4:41-47に提供されている。
【０００７】Purohit and Silver（アメリカ特許第５，
５５０，０４０号）は、ＰＣＲ増幅／検出アッセイを用
いてのＮ．ゴノルホエアの検出を記載する。文献に記載
されるＮ．ゴノルホエアの種々の異なった株からのＤＮ
Ａ配列の比較に基づいて、プライマーはMiyada and Bor
n （前記）により提供される配列内の２０１ヌクレオチ
ド標的配列を増幅するように企画された。前記プライマ
ーは試験されたＮ．ゴノルホエアのすべての株からの標
的配列を増幅し、そしてＮ．ムコサのいくつかの株から
のＤＮＡをまた増幅した。
５５０，０４０号）は、ＰＣＲ増幅／検出アッセイを用
いてのＮ．ゴノルホエアの検出を記載する。文献に記載
されるＮ．ゴノルホエアの種々の異なった株からのＤＮ
Ａ配列の比較に基づいて、プライマーはMiyada and Bor
n （前記）により提供される配列内の２０１ヌクレオチ
ド標的配列を増幅するように企画された。前記プライマ
ーは試験されたＮ．ゴノルホエアのすべての株からの標
的配列を増幅し、そしてＮ．ムコサのいくつかの株から
のＤＮＡをまた増幅した。
【０００８】次に、増幅された生成物は、所望する特異
性を達成するためにＮ．ゴノルホエア−特異的プローブ
によりハイブリダイズされた。その得られる増幅／検出
アッセイは、非−Ｎ．ゴノルホエアＤＮＡとの交差反応
性を伴わないで、試験されたＮ．ゴノルホエアのすべて
の株を検出することが観察された。
性を達成するためにＮ．ゴノルホエア−特異的プローブ
によりハイブリダイズされた。その得られる増幅／検出
アッセイは、非−Ｎ．ゴノルホエアＤＮＡとの交差反応
性を伴わないで、試験されたＮ．ゴノルホエアのすべて
の株を検出することが観察された。
【０００９】Ｎ．ゴノルホエアにより感染された患者は
しばしばまた、クラミジア トラコマチス（Ｃｈｌａｍ
ｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）によっても感染さ
れる。前記’０４０特許に記載されるＮ．ゴノルホエア
プライマーが、単一の増幅反応においていづれかの生物
からの標的配列を増幅するためにＣ．トラコマチスの増
幅のためのプライマーと一緒に使用された。その同時増
幅反応、続く別々の種−特異的ハイブリダイゼーション
反応は、Ｎ．ゴノルホエアもしくはＣ．トラコマチス又
は両者による感染を検出し、そして区別することができ
る増幅／検出アッセイの基礎を形成した。
しばしばまた、クラミジア トラコマチス（Ｃｈｌａｍ
ｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）によっても感染さ
れる。前記’０４０特許に記載されるＮ．ゴノルホエア
プライマーが、単一の増幅反応においていづれかの生物
からの標的配列を増幅するためにＣ．トラコマチスの増
幅のためのプライマーと一緒に使用された。その同時増
幅反応、続く別々の種−特異的ハイブリダイゼーション
反応は、Ｎ．ゴノルホエアもしくはＣ．トラコマチス又
は両者による感染を検出し、そして区別することができ
る増幅／検出アッセイの基礎を形成した。
【００１０】Roche Diagnostic Systems, Inc. (Branch
burg, NJ）から市販されているＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録
商標）Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae
(CT/NG) Testは、前記’０４０特許に記載されるアッセ
イに基づく、臨床サンプルにおけるクラミジア・トラコ
マチス及び／又はナイセリア・コノルホエアの定性的検
出のためのインビトロアッセイである。ＡＭＰＬＩＣＯ
Ｒ（登録商標）Chlamydia trachomatis/Neisseria gono
rrhoeae (CT/NG) Test製品差込みを参照のこと。
burg, NJ）から市販されているＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録
商標）Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae
(CT/NG) Testは、前記’０４０特許に記載されるアッセ
イに基づく、臨床サンプルにおけるクラミジア・トラコ
マチス及び／又はナイセリア・コノルホエアの定性的検
出のためのインビトロアッセイである。ＡＭＰＬＩＣＯ
Ｒ（登録商標）Chlamydia trachomatis/Neisseria gono
rrhoeae (CT/NG) Test製品差込みを参照のこと。
【００１１】当業界の範囲内である、分子生物学及び核
酸化学の従来の技法は、文献において十分に説明されて
いる。たとえば、Sambrookなど., 1989, Molecular Clo
ning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labor
atory, Cold Spring Harbor,New York ; Oligonucleoti
de Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984) ; Nucleic Acid
Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.,
1984) ; 及び一連のMechods in Enzymology (Academic
Press, Inc.)を参照のこと。
酸化学の従来の技法は、文献において十分に説明されて
いる。たとえば、Sambrookなど., 1989, Molecular Clo
ning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labor
atory, Cold Spring Harbor,New York ; Oligonucleoti
de Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984) ; Nucleic Acid
Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.,
1984) ; 及び一連のMechods in Enzymology (Academic
Press, Inc.)を参照のこと。
【００１２】Miyada and Born （前記）により開示され
る推定上のシトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺
伝子配列（本明細書においては、“Ｎｇ−ＣＤＭＴ”と
称す）に基づく市販の検出アッセイが、一定の臨床サン
プル、特に咽喉スワブサンプルからの誤った陽性結果の
思いがけない高い割合を与えることが発見された。さら
に、それらの誤った陽性結果の原因が、意外に、Ｎ．ゴ
ノルホエア以外のナイセリアの種のいくつかの単離物に
おけるＮ．ゴノルホエア−特異的Ｎｇ−ＣＤＭＴ遺伝子
標的配列の少なくとも一部の存在であることが決定され
た。
る推定上のシトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺
伝子配列（本明細書においては、“Ｎｇ−ＣＤＭＴ”と
称す）に基づく市販の検出アッセイが、一定の臨床サン
プル、特に咽喉スワブサンプルからの誤った陽性結果の
思いがけない高い割合を与えることが発見された。さら
に、それらの誤った陽性結果の原因が、意外に、Ｎ．ゴ
ノルホエア以外のナイセリアの種のいくつかの単離物に
おけるＮ．ゴノルホエア−特異的Ｎｇ−ＣＤＭＴ遺伝子
標的配列の少なくとも一部の存在であることが決定され
た。
【００１３】誤った陽性結果を引き起こすヒト咽喉検体
及びいくつかの生殖器検体における多くのナイセリア単
離物が発現され、同定され、そして特徴づけられて来
た。前記単離物の生化学分析は、Ｎ．ゴノルホエア以外
のナイセリア種、特にＮ．サブフラバ又はＮ．シネレア
としてそれらを識別した。これまで、Ｎ．ゴノルホエア
以外のナイセリア種、たとえばＮ．スブフラバ又はＮ．
シネレアは、Ｎｇ−ＣＤＭＴ遺伝子配列を含まないよう
に思われており、そして単離物の大部分はＮｇ−ＣＤＭ
Ｔ遺伝子配列を含まないことが現在、確かめられた。
及びいくつかの生殖器検体における多くのナイセリア単
離物が発現され、同定され、そして特徴づけられて来
た。前記単離物の生化学分析は、Ｎ．ゴノルホエア以外
のナイセリア種、特にＮ．サブフラバ又はＮ．シネレア
としてそれらを識別した。これまで、Ｎ．ゴノルホエア
以外のナイセリア種、たとえばＮ．スブフラバ又はＮ．
シネレアは、Ｎｇ−ＣＤＭＴ遺伝子配列を含まないよう
に思われており、そして単離物の大部分はＮｇ−ＣＤＭ
Ｔ遺伝子配列を含まないことが現在、確かめられた。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】Ｎ．ゴノルホエア以外
のナイセリア種の幾つかの単離物におけるＮｇ−ＣＤＭ
Ｔ遺伝子配列の存在は、これまで認識されていないＮｇ
−ＣＤＭＴ遺伝子配列に基づく検出アッセイのための問
題を提供する。本発明は、この問題に対する解決策を提
供する。
のナイセリア種の幾つかの単離物におけるＮｇ−ＣＤＭ
Ｔ遺伝子配列の存在は、これまで認識されていないＮｇ
−ＣＤＭＴ遺伝子配列に基づく検出アッセイのための問
題を提供する。本発明は、この問題に対する解決策を提
供する。
【００１５】
【課題を解決するための手段】Ｎｇ−ＣＤＭＴ遺伝子配
列を含む、Ｎ．ゴノルホエア以外のナイセリア種の多く
の新しく発見された単離物からのＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子
の一部のヌクレオチド配列が決定された。それらの新し
く発現された単離物に含まれる遺伝子配列は、その対応
するＮ．ゴノルホエアＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子配列に対し
てわずかな差異を含む。Ｎ．ゴノルホエアＮｇ−ＣＤＭ
Ｔ遺伝子配列と新しく発見された単離物におけるＮｇ−
ＣＤＭＴ遺伝子配列とを区別するヌクレオチド配列差異
は、少数の位置に制限され、そしてそれらの単離物間に
保存されている。それらのヌクレオチド配列差異及び前
記差異の局在化された性質の発見は、本発明の重要な観
点である。
列を含む、Ｎ．ゴノルホエア以外のナイセリア種の多く
の新しく発見された単離物からのＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子
の一部のヌクレオチド配列が決定された。それらの新し
く発現された単離物に含まれる遺伝子配列は、その対応
するＮ．ゴノルホエアＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子配列に対し
てわずかな差異を含む。Ｎ．ゴノルホエアＮｇ−ＣＤＭ
Ｔ遺伝子配列と新しく発見された単離物におけるＮｇ−
ＣＤＭＴ遺伝子配列とを区別するヌクレオチド配列差異
は、少数の位置に制限され、そしてそれらの単離物間に
保存されている。それらのヌクレオチド配列差異及び前
記差異の局在化された性質の発見は、本発明の重要な観
点である。
【００１６】本発明の１つの観点は、Ｎ．ゴノルホエア
からのＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子配列と新しく発見された単
離物に見出されるその対応するＮｇ−ＣＤＭＴ配列と
を、適切な緊縮条件下で選択ハイブリダイゼーションに
より識別するオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌク
レオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとして、
又は好ましくは、増幅プライマーとして使用され得る。
そのオリゴヌクレオチドの使用は、Ｎｇ−ＣＤＭＴ遺伝
子配列を標的化するＮ．ゴノルホエア増幅／検出アッセ
イにおける誤った陽性結果の有意な低下を可能にする。
からのＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子配列と新しく発見された単
離物に見出されるその対応するＮｇ−ＣＤＭＴ配列と
を、適切な緊縮条件下で選択ハイブリダイゼーションに
より識別するオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌク
レオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとして、
又は好ましくは、増幅プライマーとして使用され得る。
そのオリゴヌクレオチドの使用は、Ｎｇ−ＣＤＭＴ遺伝
子配列を標的化するＮ．ゴノルホエア増幅／検出アッセ
イにおける誤った陽性結果の有意な低下を可能にする。
【００１７】本発明のもう１つの観点は、本発明のオリ
ゴヌクレオチドを包含するプライマー（又は連結される
べきオリゴヌクレオチド）を用いて増幅反応を実施する
ことを含んで成る、Ｎ．ゴノルホエアＮｇ−ＣＤＭＴ遺
伝子の領域を増幅するための方法に関する。本発明のも
う１つの観点は、本発明のオリゴヌクレオチドを、好ま
しくは増幅プライマーとしての使用のために含むキット
に関する。それらのキットは、追加の試薬、たとえば検
出プローブ、又は１もしくは複数の増幅試薬、たとえば
ポリメラーゼ、緩衝液及びヌクレオチド三リン酸を含む
ことができる。
ゴヌクレオチドを包含するプライマー（又は連結される
べきオリゴヌクレオチド）を用いて増幅反応を実施する
ことを含んで成る、Ｎ．ゴノルホエアＮｇ−ＣＤＭＴ遺
伝子の領域を増幅するための方法に関する。本発明のも
う１つの観点は、本発明のオリゴヌクレオチドを、好ま
しくは増幅プライマーとしての使用のために含むキット
に関する。それらのキットは、追加の試薬、たとえば検
出プローブ、又は１もしくは複数の増幅試薬、たとえば
ポリメラーゼ、緩衝液及びヌクレオチド三リン酸を含む
ことができる。
【００１８】本発明の理解を助けるために、いくつかの
用語が下記に定義される。用語“核酸”及び“オリゴヌ
クレオチド”とは、ポリデオキシリボヌクレオチド（２
−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオ
チド（Ｄ−リボースを含む）、及びプリンもしくはピリ
ミジン塩基、又は修飾されたプリンもしくはピリミジン
塩基のＮ−グリコシドであるいづれか他のタイプのポリ
ヌクレオチドを意味する。用語“核酸”と“オリゴヌク
レオチド”との間に長さの意図された区別は存在せず、
そしてそれらの用語は、交換可能的に使用されるであろ
う。それらの用語は、分子の一次構造のみを意味する。
従って、それらの用語は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、並
びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡを包含する。
用語が下記に定義される。用語“核酸”及び“オリゴヌ
クレオチド”とは、ポリデオキシリボヌクレオチド（２
−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオ
チド（Ｄ−リボースを含む）、及びプリンもしくはピリ
ミジン塩基、又は修飾されたプリンもしくはピリミジン
塩基のＮ−グリコシドであるいづれか他のタイプのポリ
ヌクレオチドを意味する。用語“核酸”と“オリゴヌク
レオチド”との間に長さの意図された区別は存在せず、
そしてそれらの用語は、交換可能的に使用されるであろ
う。それらの用語は、分子の一次構造のみを意味する。
従って、それらの用語は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、並
びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡを包含する。
【００１９】オリゴヌクレオチドは、適切な配列のクロ
ーニング及び制限酵素処理を包含するいづれか適切な方
法、及び一定の方法、たとえばNarangなど., 1979, Met
h. Enzymol. 68:90-99のホスホトリエステル方法；Brow
n など., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151のホスホジ
エステル方法；Beaucageなど., 1981, Tetrahedron Let
t. 22:1859-1862 のジエチルホスホラミジット方法；及
びアメリカ特許第４，４５８，０６６号の固体支持方法
による直接的な化学合成により調製され得る。合成方法
のレビューは、Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemis
try 1(3):165-187に提供されている。
ーニング及び制限酵素処理を包含するいづれか適切な方
法、及び一定の方法、たとえばNarangなど., 1979, Met
h. Enzymol. 68:90-99のホスホトリエステル方法；Brow
n など., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151のホスホジ
エステル方法；Beaucageなど., 1981, Tetrahedron Let
t. 22:1859-1862 のジエチルホスホラミジット方法；及
びアメリカ特許第４，４５８，０６６号の固体支持方法
による直接的な化学合成により調製され得る。合成方法
のレビューは、Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemis
try 1(3):165-187に提供されている。
【００２０】用語“ハイブリダイゼーション”とは、相
補的塩基対合のため２つの一本鎖核酸による複合構造体
の形成を意味する。ハイブリダイゼーションは、十分に
相補的な核酸鎖間で、又はミスマッチのわずかな領域を
含む“実質的に相補的な”核酸鎖間で生じることができ
る。十分に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズするで
あろう条件は、“緊縮ハイブリダイゼーション条件”又
は“配列−特異的ハイブリダイゼーション条件”として
言及される。実質的に相補的な配列の適切な複合体は低
い緊縮ハイブリダイゼーション条件下で達成され得；許
容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション
条件の適切な調整により調節され得る。
補的塩基対合のため２つの一本鎖核酸による複合構造体
の形成を意味する。ハイブリダイゼーションは、十分に
相補的な核酸鎖間で、又はミスマッチのわずかな領域を
含む“実質的に相補的な”核酸鎖間で生じることができ
る。十分に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズするで
あろう条件は、“緊縮ハイブリダイゼーション条件”又
は“配列−特異的ハイブリダイゼーション条件”として
言及される。実質的に相補的な配列の適切な複合体は低
い緊縮ハイブリダイゼーション条件下で達成され得；許
容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼーション
条件の適切な調整により調節され得る。
【００２１】核酸技法の当業者は、文献により提供され
る案内に従って、種々の変数、たとえばオリゴヌクレオ
チドの長さ及び塩基対濃度、イオン強度及びミスマッチ
される塩基対の発生率を経験的に考慮して複合体安定性
を決定することができる（たとえば、Sambrookなど., 1
989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, ColdSp
ring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Yo
rk ; 及びWetmur, 1991, Critical Review in Biochem.
and Mol. Biol 26 (3/4)：227-259 を参照のこと）。
る案内に従って、種々の変数、たとえばオリゴヌクレオ
チドの長さ及び塩基対濃度、イオン強度及びミスマッチ
される塩基対の発生率を経験的に考慮して複合体安定性
を決定することができる（たとえば、Sambrookなど., 1
989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, ColdSp
ring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Yo
rk ; 及びWetmur, 1991, Critical Review in Biochem.
and Mol. Biol 26 (3/4)：227-259 を参照のこと）。
【００２２】用語“プローブ”とは、適切な条件下で標
的核酸に選択的にハイブリダイズすることができるオリ
ゴヌクレオチドを意味する。プローブは、標的配列に対
して正確に又は実質的に相補的な“ハイブリダイズする
領域”を含み、そして可変部位で標的配列に対して正確
に相補的であろう。十分に緊縮なハイブリダイゼーショ
ン条件下でプローブを用いて実施されるハイブリダイゼ
ーションアッセイは、特定の標的配列の選択的検出を可
能にする。配列における単一のヌクレオチド差異の識別
のためのハイブリダイゼーションアッセイへの使用のた
めには、プローブハイブリダイズ領域は、好ましくは、
約１５〜約３５個の長さのヌクレオチドである。当業者
は、一般的に、与えられたプローブの正確な相補体が同
様に、プローブとして有用であることを認識するであろ
う。
的核酸に選択的にハイブリダイズすることができるオリ
ゴヌクレオチドを意味する。プローブは、標的配列に対
して正確に又は実質的に相補的な“ハイブリダイズする
領域”を含み、そして可変部位で標的配列に対して正確
に相補的であろう。十分に緊縮なハイブリダイゼーショ
ン条件下でプローブを用いて実施されるハイブリダイゼ
ーションアッセイは、特定の標的配列の選択的検出を可
能にする。配列における単一のヌクレオチド差異の識別
のためのハイブリダイゼーションアッセイへの使用のた
めには、プローブハイブリダイズ領域は、好ましくは、
約１５〜約３５個の長さのヌクレオチドである。当業者
は、一般的に、与えられたプローブの正確な相補体が同
様に、プローブとして有用であることを認識するであろ
う。
【００２３】用語“プライマー”とは、核酸鎖に対して
相補的なプライマー延長生成物の合成が誘発される条件
下で、すなわち適切な緩衝液中で及び適切な温度での４
種の異なったヌクレオシド三リン酸及び重合のための剤
（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存
在下で、ＤＮＡ合成の開始点として作用することができ
るオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、標的
配列に対して正確に又は実質的に相補的な“ハイブリダ
イズする領域”を含み、そして可変部位で標的配列に対
して正確に相補的であろう。
相補的なプライマー延長生成物の合成が誘発される条件
下で、すなわち適切な緩衝液中で及び適切な温度での４
種の異なったヌクレオシド三リン酸及び重合のための剤
（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存
在下で、ＤＮＡ合成の開始点として作用することができ
るオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、標的
配列に対して正確に又は実質的に相補的な“ハイブリダ
イズする領域”を含み、そして可変部位で標的配列に対
して正確に相補的であろう。
【００２４】プライマー延長が十分な緊縮ハイブリダイ
ゼーション条件下で実施される増幅は、特定の標的配列
の選択的増幅を可能にする。配列における単一のヌクレ
オチド変化の識別のための配列−特異的増幅反応への使
用のためには、プライマーハイブリダイズ領域は、約１
５〜約３５個の長さのヌクレオチドである。プライマー
延長はオリゴヌクレオチドの３′末端で生じるので、可
変部位は好ましくは、配列識別を促進するためにプライ
マーの３′末端に位置する。
ゼーション条件下で実施される増幅は、特定の標的配列
の選択的増幅を可能にする。配列における単一のヌクレ
オチド変化の識別のための配列−特異的増幅反応への使
用のためには、プライマーハイブリダイズ領域は、約１
５〜約３５個の長さのヌクレオチドである。プライマー
延長はオリゴヌクレオチドの３′末端で生じるので、可
変部位は好ましくは、配列識別を促進するためにプライ
マーの３′末端に位置する。
【００２５】プローブ及びプライマーは、ハイブリダイ
ズする領域のオリゴヌクレオチドから完全に成るか、又
はオリゴヌクレオチドの検出又は固定化を可能にする
が、しかしハイブリダイズする領域のハイブリダイゼー
ション特性を有意に変更しない追加の特徴を含むことが
できる。たとえば、プローブハイブリダイズ領域は、逆
ドット−ブロット分析への使用のために固体支持体にプ
ローブを固定するために使用されるポリ−Ｔ“テール”
に結合され得る。
ズする領域のオリゴヌクレオチドから完全に成るか、又
はオリゴヌクレオチドの検出又は固定化を可能にする
が、しかしハイブリダイズする領域のハイブリダイゼー
ション特性を有意に変更しない追加の特徴を含むことが
できる。たとえば、プローブハイブリダイズ領域は、逆
ドット−ブロット分析への使用のために固体支持体にプ
ローブを固定するために使用されるポリ−Ｔ“テール”
に結合され得る。
【００２６】同様に、プライマーは、プライマーの検出
又は固定化を可能にするが、しかしＤＮＡ合成の開始点
として作用するプライマーの基本的性質を変更しない追
加の特徴を組込むことができる。たとえば、プライマー
は、標的核酸に対してハイブリダイズしないが、しかし
増幅された生成物のクローニングを促進する、５′末端
での追加の核酸配列を含むことができる。
又は固定化を可能にするが、しかしＤＮＡ合成の開始点
として作用するプライマーの基本的性質を変更しない追
加の特徴を組込むことができる。たとえば、プライマー
は、標的核酸に対してハイブリダイズしないが、しかし
増幅された生成物のクローニングを促進する、５′末端
での追加の核酸配列を含むことができる。
【００２７】本明細書で使用される場合、“上流”のプ
ライマーとは、その延長生成物がコード鎖のサブ配列で
あるプライマーを意味する。“下流”のプライマーと
は、その延長生成物が相補的非コード鎖のサブ配列であ
るプライマーを意味する。用語“標的配列”、“標的領
域”、及び“標的核酸”とは、増幅され、検出され、又
は他方では分析される予定である核酸の領域を意味す
る。用語“可変部位”又は“可変位置”とは、存在する
ヌクレオチドが、異なる生物源から得られた配列におい
て異なる、Ｎｇ−ＣＤＭＴ遺伝子内のそれらのヌクレオ
チド位置を意味する。
ライマーとは、その延長生成物がコード鎖のサブ配列で
あるプライマーを意味する。“下流”のプライマーと
は、その延長生成物が相補的非コード鎖のサブ配列であ
るプライマーを意味する。用語“標的配列”、“標的領
域”、及び“標的核酸”とは、増幅され、検出され、又
は他方では分析される予定である核酸の領域を意味す
る。用語“可変部位”又は“可変位置”とは、存在する
ヌクレオチドが、異なる生物源から得られた配列におい
て異なる、Ｎｇ−ＣＤＭＴ遺伝子内のそれらのヌクレオ
チド位置を意味する。
【００２８】本明細書で使用される場合、オリゴヌクレ
オチドは、該オリゴヌクレオチドと標的配列との間に存
在するミスマッチの数がサンプルに存在する可能性があ
る非標的配列と前記オリゴヌクレオチドとの間に存在す
るミスマッチの数よりも少ない場合、標的配列に対して
“特異的”である。ハイブリダイゼーション条件は、存
在するミスマッチの数がオリゴヌクレオチドと標的配列
との間に存在するミスマッチの数よりも多くない場合に
おいてのみ、安定した複合体が形成される条件として選
択され得る。
オチドは、該オリゴヌクレオチドと標的配列との間に存
在するミスマッチの数がサンプルに存在する可能性があ
る非標的配列と前記オリゴヌクレオチドとの間に存在す
るミスマッチの数よりも少ない場合、標的配列に対して
“特異的”である。ハイブリダイゼーション条件は、存
在するミスマッチの数がオリゴヌクレオチドと標的配列
との間に存在するミスマッチの数よりも多くない場合に
おいてのみ、安定した複合体が形成される条件として選
択され得る。
【００２９】そのような条件下で、標的−特異的オリゴ
ヌクレオチドが、標的配列に対してのみ安定した複合体
を形成することができる。従って、適切な緊縮増殖条件
下での標的−特異的プライマーの使用は、標的プライマ
ー結合部位を含むそれらの配列の特異的増幅を可能にす
る。同様に、適切な緊縮ハイブリダイゼーション条件下
での標的−特異的プローブの使用は、特異的標的配列の
検出を可能にする。
ヌクレオチドが、標的配列に対してのみ安定した複合体
を形成することができる。従って、適切な緊縮増殖条件
下での標的−特異的プライマーの使用は、標的プライマ
ー結合部位を含むそれらの配列の特異的増幅を可能にす
る。同様に、適切な緊縮ハイブリダイゼーション条件下
での標的−特異的プローブの使用は、特異的標的配列の
検出を可能にする。
【００３０】用語“増幅反応混合物”とは、増幅反応を
実施するために必要な試薬を含む溶液を意味し、そして
典型的には、適切な緩衝液にプライマー、熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及び二価金属カチオンを含
む。反応混合物は、それが反応を実施するために必要な
すべての試薬を含む場合、「完全」として言及され、そ
してそれが必要な試薬のサブセットのみを含む場合、
「不完全」として言及される。反応成分が、便利さ、貯
蔵安定性のために、又は成分濃度の適用−依存性調節を
可能にするために、別々の溶液（個々の溶液は合計成分
のサブセットを含む）として通常貯蔵され、そして反応
成分が完全な反応混合物を形成するために、反応の前に
組合されることは、当業者に理解されるであろう。
実施するために必要な試薬を含む溶液を意味し、そして
典型的には、適切な緩衝液にプライマー、熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及び二価金属カチオンを含
む。反応混合物は、それが反応を実施するために必要な
すべての試薬を含む場合、「完全」として言及され、そ
してそれが必要な試薬のサブセットのみを含む場合、
「不完全」として言及される。反応成分が、便利さ、貯
蔵安定性のために、又は成分濃度の適用−依存性調節を
可能にするために、別々の溶液（個々の溶液は合計成分
のサブセットを含む）として通常貯蔵され、そして反応
成分が完全な反応混合物を形成するために、反応の前に
組合されることは、当業者に理解されるであろう。
【００３１】さらに、反応成分が商品化のために別々に
包装され、そして有用な商業用キットが本発明の修飾さ
れたプライマーを包含する反応成分のいづれかのサブセ
ットを含むことができることは当業者により理解される
であろう。用語、与えられた核酸の“相補体”又は“正
確な相補体”とは、特に、その与えられた核酸と同じ長
さであり、そしてその核酸に対して正確に相補的である
核酸を意味する。従って、核酸の相補体は、単一のユニ
ークに定義された配列を意味する。
包装され、そして有用な商業用キットが本発明の修飾さ
れたプライマーを包含する反応成分のいづれかのサブセ
ットを含むことができることは当業者により理解される
であろう。用語、与えられた核酸の“相補体”又は“正
確な相補体”とは、特に、その与えられた核酸と同じ長
さであり、そしてその核酸に対して正確に相補的である
核酸を意味する。従って、核酸の相補体は、単一のユニ
ークに定義された配列を意味する。
【００３２】推定上のＮ．ゴノルホエア シトシンＤＮ
Ａメチルトランスフェラーゼ（Ｎｇ−ＣＤＭＴ）遺伝子
の遺伝子配列は、下記表１に示される。その配列は、Mi
yadaand Born （前記）により提供されるが、但し配列
の修正を有するＯＲＦ１配列に対応する。Miyada and B
orn の配列における配列の誤りは、実際の停止コドンの
上流の停止コドンの不適切な識別をもたらし、そして結
果的に、実際の読取り枠の切断されたバージョンが報告
されている。下記配列は、読取り枠の最初の１０６７個
の塩基を包含する。核酸の１本の鎖（コード配列）のみ
が表１に示されているが、当業者は、配列番号１は二本
鎖ゲノム核酸の領域を表わし、そして両鎖の配列は提供
される配列情報により十分に特定されることを理解する
であろう。
Ａメチルトランスフェラーゼ（Ｎｇ−ＣＤＭＴ）遺伝子
の遺伝子配列は、下記表１に示される。その配列は、Mi
yadaand Born （前記）により提供されるが、但し配列
の修正を有するＯＲＦ１配列に対応する。Miyada and B
orn の配列における配列の誤りは、実際の停止コドンの
上流の停止コドンの不適切な識別をもたらし、そして結
果的に、実際の読取り枠の切断されたバージョンが報告
されている。下記配列は、読取り枠の最初の１０６７個
の塩基を包含する。核酸の１本の鎖（コード配列）のみ
が表１に示されているが、当業者は、配列番号１は二本
鎖ゲノム核酸の領域を表わし、そして両鎖の配列は提供
される配列情報により十分に特定されることを理解する
であろう。
【００３３】
【表１】
【００３４】Ｎ．ゴノルホエアＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子配
列を区別するために使用され得る配列番号１内の可変部
位は、ヌクレオチド位置番号６１８，６２１，６２７，
６３０，６３６，６５３，６５４，６６９，６７８，６
８１，６８３、及び７０２に存在する。それらの可変位
置は表１に強調され、そして下線で示されている。いく
つかの新しく発見された非Ｎ．ゴノルホエア株の対応す
るＮｇ−ＣＤＭＴ配列内の可変部位で見出される特定の
変異体ヌクレオチドが下記表２に示される。示される配
列変異体は、新しく発見された株のほとんどを代表す
る。“−”は、ヌクレオチドが配列番号１におけるのと
同じであることを示す。示される配列は、非Ｎ．ゴノル
ホエア株内の配列の保存された性質を示す。
列を区別するために使用され得る配列番号１内の可変部
位は、ヌクレオチド位置番号６１８，６２１，６２７，
６３０，６３６，６５３，６５４，６６９，６７８，６
８１，６８３、及び７０２に存在する。それらの可変位
置は表１に強調され、そして下線で示されている。いく
つかの新しく発見された非Ｎ．ゴノルホエア株の対応す
るＮｇ−ＣＤＭＴ配列内の可変部位で見出される特定の
変異体ヌクレオチドが下記表２に示される。示される配
列変異体は、新しく発見された株のほとんどを代表す
る。“−”は、ヌクレオチドが配列番号１におけるのと
同じであることを示す。示される配列は、非Ｎ．ゴノル
ホエア株内の配列の保存された性質を示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】上記に示される代表的な配列変動の他に、
上記可変位置の間で、位置６８３及び７０２（それぞ
れ、“Ａ”及び“Ｇ”）でのみ配列番号１と異なる配列
を含むＮ．Ｓ．フラバ（Ｎ．Ｓ．ｆｌａｖａ）の単一の
単離物が発見された。この単離物の低い頻度のために、
他の可変位置に基づいて識別するオリゴヌクレオチド
は、誤った陽性結果の発生を有意に減じるであろう。
上記可変位置の間で、位置６８３及び７０２（それぞ
れ、“Ａ”及び“Ｇ”）でのみ配列番号１と異なる配列
を含むＮ．Ｓ．フラバ（Ｎ．Ｓ．ｆｌａｖａ）の単一の
単離物が発見された。この単離物の低い頻度のために、
他の可変位置に基づいて識別するオリゴヌクレオチド
は、誤った陽性結果の発生を有意に減じるであろう。
【００３７】Ｎ．ゴノルホエア−特異的オリゴヌクレオ
チド 本発明の１つの観点は、Ｎ．ゴノルホエアに対して特異
的であり、そしてＮ．ゴノルホエアＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝
子配列と新しく発見された単離物に見出されるその対応
する配列とを区別するオリゴヌクレオチドに関する。本
発明のＮ．ゴノルホエア−特異的オリゴヌクレオチド
は、少なくとも１つの、好ましくは複数の上記固定され
た可変位置を包含する領域において配列番号１（標的配
列）のいづれかの鎖に対して正確に相補的であるオリゴ
ヌクレオチドである。
チド 本発明の１つの観点は、Ｎ．ゴノルホエアに対して特異
的であり、そしてＮ．ゴノルホエアＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝
子配列と新しく発見された単離物に見出されるその対応
する配列とを区別するオリゴヌクレオチドに関する。本
発明のＮ．ゴノルホエア−特異的オリゴヌクレオチド
は、少なくとも１つの、好ましくは複数の上記固定され
た可変位置を包含する領域において配列番号１（標的配
列）のいづれかの鎖に対して正確に相補的であるオリゴ
ヌクレオチドである。
【００３８】可変位置の接近性のために、典型的には、
オリゴヌクレオチドは、複数の可変部位を包含するよう
選択され得る。たとえば、下記増幅プライマー、すなわ
ちＬＷ８０（配列番号３）は、位置６１８，６２１，６
２７，６３０及び６３６を包含する。ハイブリダイゼー
ション領域により包含される可変位置の数及び意図され
た使用に依存して、本発明のＮ．ゴノルホエア−特異的
オリゴヌクレオチドは好ましくは、約１５〜約５０個の
ヌクレオチドの長さ、より好ましくは約１５〜約３５個
のヌクレオチドの長さである。
オリゴヌクレオチドは、複数の可変部位を包含するよう
選択され得る。たとえば、下記増幅プライマー、すなわ
ちＬＷ８０（配列番号３）は、位置６１８，６２１，６
２７，６３０及び６３６を包含する。ハイブリダイゼー
ション領域により包含される可変位置の数及び意図され
た使用に依存して、本発明のＮ．ゴノルホエア−特異的
オリゴヌクレオチドは好ましくは、約１５〜約５０個の
ヌクレオチドの長さ、より好ましくは約１５〜約３５個
のヌクレオチドの長さである。
【００３９】本発明のＮ．ゴノルホエア−特異的オリゴ
ヌクレオチドは、Ｎ．ゴノルホエア核酸を検出し、又は
固定するためにオリゴヌクレオチドの選択的ハイブリダ
イゼーションに依存する反応において有用である。選択
的ハイブリダイゼーションは、相補性の程度で異なる、
標的及び非標的核酸配列とのハイブリダイゼーション複
合体の安定性における差異に基づく。十分な緊縮ハイブ
リダイゼーション条件下で、オリゴヌクレオチドと標的
配列との間で形成される複合体のみが安定しているであ
ろう。安定性ハイブリダイゼーション複合体の存在は、
多くのよく知られた方法のいづれかにより、たとえばラ
ベルされたオリゴヌクレオチド、すなわちプローブの使
用により、又は増幅反応におけるように、プライマー延
長反応又は連結反応を実施する可能性により検出され得
る。
ヌクレオチドは、Ｎ．ゴノルホエア核酸を検出し、又は
固定するためにオリゴヌクレオチドの選択的ハイブリダ
イゼーションに依存する反応において有用である。選択
的ハイブリダイゼーションは、相補性の程度で異なる、
標的及び非標的核酸配列とのハイブリダイゼーション複
合体の安定性における差異に基づく。十分な緊縮ハイブ
リダイゼーション条件下で、オリゴヌクレオチドと標的
配列との間で形成される複合体のみが安定しているであ
ろう。安定性ハイブリダイゼーション複合体の存在は、
多くのよく知られた方法のいづれかにより、たとえばラ
ベルされたオリゴヌクレオチド、すなわちプローブの使
用により、又は増幅反応におけるように、プライマー延
長反応又は連結反応を実施する可能性により検出され得
る。
【００４０】他の態様において、本発明のＮ．ゴノルホ
エア−特異的オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ、
好ましくは複数の可変位置を包含する領域において配列
番号１（標的配列）のいづれかの鎖に対して実質的に相
補的であり、すなわち約３個よりも多くないミスマッチ
を含み、そして包含される１又は複数の可変位置に標的
配列に対して正確に相補的である。非可変位置に存在す
るミスマッチはＮ．ゴノルホエア標的配列及び密接に関
連する非Ｎ．ゴノルホエア、非標的配列の両者とのミス
マッチであるので、標的配列と共に形成される複合体及
びその対応する非標的配列と共に形成される複合体にお
けるミスマッチの数の差異は、標的配列に対して正確に
相補的なオリゴヌクレオチドが使用される場合と同じで
ある。
エア−特異的オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ、
好ましくは複数の可変位置を包含する領域において配列
番号１（標的配列）のいづれかの鎖に対して実質的に相
補的であり、すなわち約３個よりも多くないミスマッチ
を含み、そして包含される１又は複数の可変位置に標的
配列に対して正確に相補的である。非可変位置に存在す
るミスマッチはＮ．ゴノルホエア標的配列及び密接に関
連する非Ｎ．ゴノルホエア、非標的配列の両者とのミス
マッチであるので、標的配列と共に形成される複合体及
びその対応する非標的配列と共に形成される複合体にお
けるミスマッチの数の差異は、標的配列に対して正確に
相補的なオリゴヌクレオチドが使用される場合と同じで
ある。
【００４１】この態様において、ハイブリダイゼーショ
ン条件は、非標的配列との安定した複合体の形成を妨げ
る十分な緊縮性を維持しながら、標的配列との安定した
複合体の形成を可能にするために十分に緩和される。そ
のような十分な緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、
１又は複数の可変位置を包含する領域におけるＮ．ゴノ
ルホエア標的配列に対して実質的に相補的であり、そし
ていづれかの可変位置で標的配列に対して正確に相補的
であるオリゴヌクレオチドは、標的配列に対してのみハ
イブリダイズするであろう。従って、少なくとも１つの
可変位置を包含する領域において配列番号１（標的配
列）のいづれかの鎖に対して実質的に相補的であり、そ
して包含される１又は複数の可変位置で標的配列に対し
て正確に相補的であるオリゴヌクレオチドは、本発明の
範囲内である。
ン条件は、非標的配列との安定した複合体の形成を妨げ
る十分な緊縮性を維持しながら、標的配列との安定した
複合体の形成を可能にするために十分に緩和される。そ
のような十分な緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、
１又は複数の可変位置を包含する領域におけるＮ．ゴノ
ルホエア標的配列に対して実質的に相補的であり、そし
ていづれかの可変位置で標的配列に対して正確に相補的
であるオリゴヌクレオチドは、標的配列に対してのみハ
イブリダイズするであろう。従って、少なくとも１つの
可変位置を包含する領域において配列番号１（標的配
列）のいづれかの鎖に対して実質的に相補的であり、そ
して包含される１又は複数の可変位置で標的配列に対し
て正確に相補的であるオリゴヌクレオチドは、本発明の
範囲内である。
【００４２】正確によりもむしろ実質的に相補的なオリ
ゴヌクレオチドの使用は、ハイブリダイゼーション条件
の最適化が制限されるアッセイ形式において所望され
る。ミスマッチはプローブ／標的物ハイブリダイゼーシ
ョン複合体の安定性を低め、そしてそれ故に、アッセイ
のための十分な緊縮性を提供するために必要とされるハ
イブリダイゼーション条件を変更するので、プローブの
デザインへのミスマッチの導入は、アッセイ形式がハイ
ブリダイゼーション条件の調節を妨げる場合、複合体安
定性を調節するために使用され得る。複合体安定性に対
する特定の導入されたミスマッチの効果はよく知られて
おり、そして得られる複合体安定性は通常、上記のよう
にして、評価され、そして経験的に決定され得る。
ゴヌクレオチドの使用は、ハイブリダイゼーション条件
の最適化が制限されるアッセイ形式において所望され
る。ミスマッチはプローブ／標的物ハイブリダイゼーシ
ョン複合体の安定性を低め、そしてそれ故に、アッセイ
のための十分な緊縮性を提供するために必要とされるハ
イブリダイゼーション条件を変更するので、プローブの
デザインへのミスマッチの導入は、アッセイ形式がハイ
ブリダイゼーション条件の調節を妨げる場合、複合体安
定性を調節するために使用され得る。複合体安定性に対
する特定の導入されたミスマッチの効果はよく知られて
おり、そして得られる複合体安定性は通常、上記のよう
にして、評価され、そして経験的に決定され得る。
【００４３】増幅プライマーとしてのＮ．ゴノルホエア
−特異的オリゴヌクレオチド 本発明の１つの態様において、配列−特異的増幅は、本
発明のＮ．ゴノルホエア−特異的オリゴヌクレオチドを
プライマーとして用いて実施される。増幅条件は、標的
配列がサンプルに存在する場合のみ増幅が生じるよう
に、選択される。この態様において、Ｎ．ゴノルホエア
Ｎｇ−ＣＤＭＴ配列は、増幅生成物の存在又は不在によ
り同定される。増幅された生成物の検出は、当業界にお
いて良く知られているいづれかの方法、たとえばゲル電
気泳動による分析により実施され得る。増幅された生成
物の追加の配列分析は必要とされないが、検出は好まし
くは、追加のレベルの特異性を提供するためにＮ．ゴノ
ルホエア−特異的プローブとのプローブハイブリダイゼ
ーションにより実施される。
−特異的オリゴヌクレオチド 本発明の１つの態様において、配列−特異的増幅は、本
発明のＮ．ゴノルホエア−特異的オリゴヌクレオチドを
プライマーとして用いて実施される。増幅条件は、標的
配列がサンプルに存在する場合のみ増幅が生じるよう
に、選択される。この態様において、Ｎ．ゴノルホエア
Ｎｇ−ＣＤＭＴ配列は、増幅生成物の存在又は不在によ
り同定される。増幅された生成物の検出は、当業界にお
いて良く知られているいづれかの方法、たとえばゲル電
気泳動による分析により実施され得る。増幅された生成
物の追加の配列分析は必要とされないが、検出は好まし
くは、追加のレベルの特異性を提供するためにＮ．ゴノ
ルホエア−特異的プローブとのプローブハイブリダイゼ
ーションにより実施される。
【００４４】プライマーのハイブリダイゼーション特異
性は、配列−特異的増幅を可能にするプライマーの決定
的な性質である。一般的に、プライマー延長部位である
３′末端は、その３′末端でのミスマッチがその３′末
端を不安定化し、そしてプライマーの５′部分が標的配
列に対してハイブリダイズしたとしても、プライマー延
長を妨害するので、プライマーの特異性に対してより決
定的である。従って、配列における単一のヌクレオチド
変更の識別のために、及び配列における複数のヌクレオ
チド変更を識別する能力を最大にするためには、プライ
マーの３′末端が可変位置で又はその近くでハイブリダ
イズするよう、プライマー配列が標的配列に対してハイ
ブリダイズすることが好ましい。
性は、配列−特異的増幅を可能にするプライマーの決定
的な性質である。一般的に、プライマー延長部位である
３′末端は、その３′末端でのミスマッチがその３′末
端を不安定化し、そしてプライマーの５′部分が標的配
列に対してハイブリダイズしたとしても、プライマー延
長を妨害するので、プライマーの特異性に対してより決
定的である。従って、配列における単一のヌクレオチド
変更の識別のために、及び配列における複数のヌクレオ
チド変更を識別する能力を最大にするためには、プライ
マーの３′末端が可変位置で又はその近くでハイブリダ
イズするよう、プライマー配列が標的配列に対してハイ
ブリダイズすることが好ましい。
【００４５】同等に言及すれば、プライマーがハイブリ
ダイズする標的配列の領域は好ましくは、領域の５′末
端で又はその近くで可変位置を含むべきである（プライ
マーの３′末端は標的配列の領域の５′末端に結合す
る）。配列−特異的増幅及びプライマーミスマッチの効
果はUgozzoliなど., 1991, Methods : A Companion toM
ethods in Enzymology 2:42-48 : Kwokなど., 1990, Nu
clein Acids Research18:999-1005 ; 及びKwokなど., 1
994, PCR Methods and Applications 3S:39-47に記載さ
れる。
ダイズする標的配列の領域は好ましくは、領域の５′末
端で又はその近くで可変位置を含むべきである（プライ
マーの３′末端は標的配列の領域の５′末端に結合す
る）。配列−特異的増幅及びプライマーミスマッチの効
果はUgozzoliなど., 1991, Methods : A Companion toM
ethods in Enzymology 2:42-48 : Kwokなど., 1990, Nu
clein Acids Research18:999-1005 ; 及びKwokなど., 1
994, PCR Methods and Applications 3S:39-47に記載さ
れる。
【００４６】制限酵素切断部位（制限部位）を含む追加
の配列は、プライマーの延長される能力に影響を及ぼさ
ないでプライマーの５′末端に付加され得る。増幅され
た生成物中に導入される制限部位は、たとえば配列決定
への使用のために増幅された生成物のクローニングを促
進する（アメリカ特許第４，６８３，１９５号を参照の
こと）。典型的には、標的配列に対して相補的でない約
２〜約１０個の長さの塩基の配列が、Ｎ．ゴノルホエア
Ｎｇ−ＣＤＭＴ配列の特異的増幅を触媒するプライマー
の能力を実質的に変更することなしに、プライマーハイ
ブリダイズ領域の５′末端に付加され得る。
の配列は、プライマーの延長される能力に影響を及ぼさ
ないでプライマーの５′末端に付加され得る。増幅され
た生成物中に導入される制限部位は、たとえば配列決定
への使用のために増幅された生成物のクローニングを促
進する（アメリカ特許第４，６８３，１９５号を参照の
こと）。典型的には、標的配列に対して相補的でない約
２〜約１０個の長さの塩基の配列が、Ｎ．ゴノルホエア
Ｎｇ−ＣＤＭＴ配列の特異的増幅を触媒するプライマー
の能力を実質的に変更することなしに、プライマーハイ
ブリダイズ領域の５′末端に付加され得る。
【００４７】付加される５′末端配列の正確な長さ及び
配列は、所望される制限部位により決定されるであろ
う。当業者は、増幅条件のわずかな最適化が付加される
配列に依存して必要であることを十分に理解するであろ
う。しかしながら、当業者はまた、本発明への使用のた
めには、制限酵素切断部位を含む５′末端での追加の配
列により延長されたプライマーが延長されていないプラ
イマーに実質的に等しいことも理解するであろう。
配列は、所望される制限部位により決定されるであろ
う。当業者は、増幅条件のわずかな最適化が付加される
配列に依存して必要であることを十分に理解するであろ
う。しかしながら、当業者はまた、本発明への使用のた
めには、制限酵素切断部位を含む５′末端での追加の配
列により延長されたプライマーが延長されていないプラ
イマーに実質的に等しいことも理解するであろう。
【００４８】好ましい態様において、本発明のＮ．ゴノ
ルホエア−特異的オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ
鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして使用され
る。しかしながら、本発明はいづれか特定の増幅システ
ムには制限されない。一般的に、プライマーに基づく増
幅反応の特異性は、プライマーハイブリダイゼーション
の特異性に依存する。従って、本発明のＮ．ゴノルホエ
ア−特異的オリゴヌクレオチドは、プライマーに基づく
増幅反応のいづれか、たとえば上記、背景のセクション
において引用された文献に記載されるそれらの増幅方法
の特異性を改良することができる。他のシステムが開発
されるにつれて、それらのシステムは、本発明の増強さ
れた特異性から利益を得ることができる。
ルホエア−特異的オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ
鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして使用され
る。しかしながら、本発明はいづれか特定の増幅システ
ムには制限されない。一般的に、プライマーに基づく増
幅反応の特異性は、プライマーハイブリダイゼーション
の特異性に依存する。従って、本発明のＮ．ゴノルホエ
ア−特異的オリゴヌクレオチドは、プライマーに基づく
増幅反応のいづれか、たとえば上記、背景のセクション
において引用された文献に記載されるそれらの増幅方法
の特異性を改良することができる。他のシステムが開発
されるにつれて、それらのシステムは、本発明の増強さ
れた特異性から利益を得ることができる。
【００４９】ＰＣＲ増幅プライマーとして好ましく使用
するための特定のオリゴヌクレオチドが下記に示され
る。プライマーは、それらがＮ．ゴノルホエアＮｇ−Ｃ
ＤＭＴ配列と、Ｎｇ−ＣＤＭＴ配列を含むナイセリアの
非Ｎ．ゴノルホエア種とをそれらの単離物に見出される
Ｎｇ−ＣＤＭＴ配列との間で識別することにおいて、こ
れまでに記載されるプライマーよりも有意な改良点を示
す。下記に示されるオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにお
ける上流プライマーとしての使用のために適切である。
するための特定のオリゴヌクレオチドが下記に示され
る。プライマーは、それらがＮ．ゴノルホエアＮｇ−Ｃ
ＤＭＴ配列と、Ｎｇ−ＣＤＭＴ配列を含むナイセリアの
非Ｎ．ゴノルホエア種とをそれらの単離物に見出される
Ｎｇ−ＣＤＭＴ配列との間で識別することにおいて、こ
れまでに記載されるプライマーよりも有意な改良点を示
す。下記に示されるオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにお
ける上流プライマーとしての使用のために適切である。
【００５０】それらのオリゴヌクレオチドの正確な相補
体がＰＣＲにおける下流プライマーとして有用であり、
そしてさらに、それらのオリゴヌクレオチド又はその正
確な相補体がまた、Ｎ．ゴノルホエアＮｇ−ＣＤＭＴ配
列を固定するためのハイブリダイゼーションプローブと
しても使用され得ることは、当業者に明らかであろう。
５′側から３′側への配向で左側から右側に示される、
プライマーのヌクレオチド配列が下記に提供される。
体がＰＣＲにおける下流プライマーとして有用であり、
そしてさらに、それらのオリゴヌクレオチド又はその正
確な相補体がまた、Ｎ．ゴノルホエアＮｇ−ＣＤＭＴ配
列を固定するためのハイブリダイゼーションプローブと
しても使用され得ることは、当業者に明らかであろう。
５′側から３′側への配向で左側から右側に示される、
プライマーのヌクレオチド配列が下記に提供される。
【００５１】
【表３】
【００５２】上記に示される特定のオリゴヌクレオチド
は、ＰＣＲにおいて上流プライマーとして使用される場
合、適切な下流プライマーと対合される。使用される特
定の下流プライマーは、本発明の決定的な観点ではな
い。適切な下流プライマーは、引用文献に記載されるプ
ライマーから選択され、又は本明細書に提供される案内
に従って、配列番号１から設計することができる。上記
上流プライマーと共に使用するための特に好ましい下流
プライマーが下記に示される。
は、ＰＣＲにおいて上流プライマーとして使用される場
合、適切な下流プライマーと対合される。使用される特
定の下流プライマーは、本発明の決定的な観点ではな
い。適切な下流プライマーは、引用文献に記載されるプ
ライマーから選択され、又は本明細書に提供される案内
に従って、配列番号１から設計することができる。上記
上流プライマーと共に使用するための特に好ましい下流
プライマーが下記に示される。
【００５３】プライマーＳＳ０２（配列番号５）は、ア
メリカ特許第５，５５０，０４０号に記載されている。
当業者は、前記’０４０特許に記載されるオリゴヌクレ
オチドのいづれか、たとえばプローブ配列、又は上流プ
ライマー配列の相補体が、下流プライマーとして使用さ
れ得る。下記に示されるＪＷ下流プライマー配列は、改
良された増幅特異性及び感受性を提供するよう企画され
た。５′側から３′側への方向で左側から右側に示され
る下流プライマーのヌクレオチド配列が下記に提供され
る。
メリカ特許第５，５５０，０４０号に記載されている。
当業者は、前記’０４０特許に記載されるオリゴヌクレ
オチドのいづれか、たとえばプローブ配列、又は上流プ
ライマー配列の相補体が、下流プライマーとして使用さ
れ得る。下記に示されるＪＷ下流プライマー配列は、改
良された増幅特異性及び感受性を提供するよう企画され
た。５′側から３′側への方向で左側から右側に示され
る下流プライマーのヌクレオチド配列が下記に提供され
る。
【００５４】
【表４】
【００５５】増幅は、Ｎ．ゴノルホエアエＮｇ−ＣＤＭ
Ｔ遺伝子配列の増幅を可能にするが、しかし非標的配列
の増幅を回避するために十分に緊縮性である条件下で実
施される。好ましい増幅反応条件は、アメリカ特許第
５，５５０，０４０号における実施例に、及びＡＭＰＬ
ＩＣＯＲ（登録商標）Chlamydia trachomatis/Neisseri
a gonorrhoeae (CT/NG) Testの製品差込みに記載されて
いる。正確な条件は、本発明の決定的な観点ではない。
増幅条件の最適化は、本明細書に提供される案内に、通
常、基づいて実施され得る。
Ｔ遺伝子配列の増幅を可能にするが、しかし非標的配列
の増幅を回避するために十分に緊縮性である条件下で実
施される。好ましい増幅反応条件は、アメリカ特許第
５，５５０，０４０号における実施例に、及びＡＭＰＬ
ＩＣＯＲ（登録商標）Chlamydia trachomatis/Neisseri
a gonorrhoeae (CT/NG) Testの製品差込みに記載されて
いる。正確な条件は、本発明の決定的な観点ではない。
増幅条件の最適化は、本明細書に提供される案内に、通
常、基づいて実施され得る。
【００５６】本発明のプライマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡ
のいづれかを増幅するために使用され得る。逆転写／ポ
リメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてのＲＮＡの
増幅は、当業界において良く知られており、そしてアメ
リカ特許第５，３２２，７７０号及び第５，３１０，６
５２；Myers and Gelfand, 1991, Biochemistry 30(3
1):7661-7666；及びYoung など., 1993, J. Clin. Micr
obiol. 31(4):882-886に記載されている。
のいづれかを増幅するために使用され得る。逆転写／ポ
リメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてのＲＮＡの
増幅は、当業界において良く知られており、そしてアメ
リカ特許第５，３２２，７７０号及び第５，３１０，６
５２；Myers and Gelfand, 1991, Biochemistry 30(3
1):7661-7666；及びYoung など., 1993, J. Clin. Micr
obiol. 31(4):882-886に記載されている。
【００５７】Ｎ．ゴノルホエアエ核酸の増幅のために適
切なサンプル分離方法は、たとえばアメリカ特許第５，
５５０，０４０号、及びＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）
Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/N
G) Testの製品差込みに記載される。使用される特定の
方法は、本発明の決定的な観点ではない。当業者は、本
明細書に提供される案内に基づいて適切なサンプル調製
方法を選択し、そして最適化することができる。Ｎ．ゴ
ノルホエアエＤＮＡの増幅のための適切なサンプル調製
キットは、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）Chlamydia tr
achomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG) Testの一部
として市販されている。
切なサンプル分離方法は、たとえばアメリカ特許第５，
５５０，０４０号、及びＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）
Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/N
G) Testの製品差込みに記載される。使用される特定の
方法は、本発明の決定的な観点ではない。当業者は、本
明細書に提供される案内に基づいて適切なサンプル調製
方法を選択し、そして最適化することができる。Ｎ．ゴ
ノルホエアエＤＮＡの増幅のための適切なサンプル調製
キットは、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）Chlamydia tr
achomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG) Testの一部
として市販されている。
【００５８】本発明の増幅プライマー及び方法は、増幅
された核酸を使用するいづれかの用途のために適切であ
る。たとえば、Ｎ．ゴノルホエアエ配列のクローニング
及び／又は配列決定は、本発明のプライマーの使用によ
り促進される。ＰＣＲ増幅された核酸を検出するための
方法は、当業界において良く知られている。増幅された
核酸を分析するために使用される方法は本発明の決定的
な観点ではなく、そしていづれかの適切な方法が使用さ
れ得る。
された核酸を使用するいづれかの用途のために適切であ
る。たとえば、Ｎ．ゴノルホエアエ配列のクローニング
及び／又は配列決定は、本発明のプライマーの使用によ
り促進される。ＰＣＲ増幅された核酸を検出するための
方法は、当業界において良く知られている。増幅された
核酸を分析するために使用される方法は本発明の決定的
な観点ではなく、そしていづれかの適切な方法が使用さ
れ得る。
【００５９】プローブとしてのＮ．ゴノルホエアエ−特
異的オリゴヌクレオチド 上記可変位置の個々は、Ｎ．ゴノルホエアエ標的配列と
非Ｎ．ゴノルホエアエ種に見出される密接に関連する配
列との間の単一の塩基対差異を表わす。配列における単
一の塩基対差異は、オリゴヌクレオチドプローブの分別
ハイブリダイゼーションにより検出され得る。プローブ
ハイブリダイズ配列及び配列−特異的ハイブリダイゼー
ション条件は、多型部位での単一のミスマッチがハイブ
リダイゼーション複合体を、それが効果的に形成されな
いよう十分に不安定化するよう選択される。ハイブリダ
イゼーション条件は、プローブの正確なサイズ及び配列
に依存し、そして本明細書及び従来技術に提供される案
内を用いて経験的に選択され得る。配列における単一の
塩基対差異を検出するためのオリゴヌクレオチドプロー
ブの使用は、Connerなど., 1983, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 80:278:282（引用により本明細書に組込まれ
る）に記載されている。
異的オリゴヌクレオチド 上記可変位置の個々は、Ｎ．ゴノルホエアエ標的配列と
非Ｎ．ゴノルホエアエ種に見出される密接に関連する配
列との間の単一の塩基対差異を表わす。配列における単
一の塩基対差異は、オリゴヌクレオチドプローブの分別
ハイブリダイゼーションにより検出され得る。プローブ
ハイブリダイズ配列及び配列−特異的ハイブリダイゼー
ション条件は、多型部位での単一のミスマッチがハイブ
リダイゼーション複合体を、それが効果的に形成されな
いよう十分に不安定化するよう選択される。ハイブリダ
イゼーション条件は、プローブの正確なサイズ及び配列
に依存し、そして本明細書及び従来技術に提供される案
内を用いて経験的に選択され得る。配列における単一の
塩基対差異を検出するためのオリゴヌクレオチドプロー
ブの使用は、Connerなど., 1983, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 80:278:282（引用により本明細書に組込まれ
る）に記載されている。
【００６０】好ましく適合されたハイブリダイゼーショ
ン複合体と単一の塩基のミスマッチハイブリダイゼーシ
ョン複合体との間の安定性における釣り合った差異（pr
oportional difference ）は、特に、ハイブリダイズさ
れたオリゴヌクレオチドの長さに依存する。より短いプ
ローブ配列により形成される複合体は、ミスマッチの存
在により、比例的に不安定化される。実際、約15〜約35
個の長さのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド
が、配列−特異的検出のために好ましい。
ン複合体と単一の塩基のミスマッチハイブリダイゼーシ
ョン複合体との間の安定性における釣り合った差異（pr
oportional difference ）は、特に、ハイブリダイズさ
れたオリゴヌクレオチドの長さに依存する。より短いプ
ローブ配列により形成される複合体は、ミスマッチの存
在により、比例的に不安定化される。実際、約15〜約35
個の長さのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド
が、配列−特異的検出のために好ましい。
【００６１】さらに、ハイブリダイズされたオリゴヌク
レオチドの末端は、熱エネルギーにより連続したランダ
ム解離及び再アニーリングを受けるので、いづれかの末
端でのミスマッチは、内部的に生じるミスマッチよりも
ハイブリダイゼーション複合体を少なく不安定化する。
好ましくは、標的配列における単一の塩基対変化の識別
のためには、多型部位がプローブの内部領域に存在する
ように標的配列に対してハイブリダイズするプローブ配
列が選択される。
レオチドの末端は、熱エネルギーにより連続したランダ
ム解離及び再アニーリングを受けるので、いづれかの末
端でのミスマッチは、内部的に生じるミスマッチよりも
ハイブリダイゼーション複合体を少なく不安定化する。
好ましくは、標的配列における単一の塩基対変化の識別
のためには、多型部位がプローブの内部領域に存在する
ように標的配列に対してハイブリダイズするプローブ配
列が選択される。
【００６２】好ましく適合されたハイブリダイゼーショ
ン複合体とミスマッチされたハイブリダイゼーション複
合体との間の安定性における差異はまた、ミスマッチさ
れたハイブリダイゼーション複合体におけるミスマッチ
の数に依存する。可変位置の接近性のために、複数の位
置を包含するプローブは、容易に企画され、そして安定
性の大きな差異のために、好ましい。安定性の大きな差
異はまた、最とも接近した非標的配列を識別する能力を
維持しながら、標的特異性を高める、より長いハイブリ
ダイゼーションプローブの使用を可能にする。複数の可
変位置を包含するプローブは、少なくとも約５０個まで
のヌクレオチドの長さをもつことができる。
ン複合体とミスマッチされたハイブリダイゼーション複
合体との間の安定性における差異はまた、ミスマッチさ
れたハイブリダイゼーション複合体におけるミスマッチ
の数に依存する。可変位置の接近性のために、複数の位
置を包含するプローブは、容易に企画され、そして安定
性の大きな差異のために、好ましい。安定性の大きな差
異はまた、最とも接近した非標的配列を識別する能力を
維持しながら、標的特異性を高める、より長いハイブリ
ダイゼーションプローブの使用を可能にする。複数の可
変位置を包含するプローブは、少なくとも約５０個まで
のヌクレオチドの長さをもつことができる。
【００６３】配列番号１に対してハイブリダイズするプ
ローブ配列を選択するための上記基準は、プローブのハ
イブリダイズする領域、すなわち標的配列のハイブリダ
イゼーションに関与するプローブのその部分に適用され
る。プローブは、そのプローブのハイブリダイゼーショ
ン特徴を実質的に変更しないで、追加の核酸配列、たと
えばプローブを固定するために使用されるポリ−Ｔテー
ルに結合され得る。当業者は、本発明の方法に使用する
ためには、標的配列に対して相補的でなく、そして従っ
て、ハイブリダイゼーションに関係しない追加の核酸配
列に対して結合されるプローブが、結合されないプロー
ブと実質的に同等であることを理解するであろう。
ローブ配列を選択するための上記基準は、プローブのハ
イブリダイズする領域、すなわち標的配列のハイブリダ
イゼーションに関与するプローブのその部分に適用され
る。プローブは、そのプローブのハイブリダイゼーショ
ン特徴を実質的に変更しないで、追加の核酸配列、たと
えばプローブを固定するために使用されるポリ−Ｔテー
ルに結合され得る。当業者は、本発明の方法に使用する
ためには、標的配列に対して相補的でなく、そして従っ
て、ハイブリダイゼーションに関係しない追加の核酸配
列に対して結合されるプローブが、結合されないプロー
ブと実質的に同等であることを理解するであろう。
【００６４】好ましくは、１又は複数の可変位置を含む
Ｎ．ゴノルホエアエＮｇ−ＣＤＭＴ配列遺伝子からの核
酸配列は、適切な緊縮ハイブリダイゼーション条件下で
のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーシ
ョンの前に増幅される。その増幅は、プローブハイブリ
ダイゼーションによる分析のための十分な核酸を供給す
るために実施される。この態様においては、配列特異性
がプローブハイブリダイゼーション段階により提供され
るので、関連する非標的配列の同時増幅はこの態様にお
いては問題ではない。従って、可変位置を包含するＮ．
ゴノルホエアエＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子の領域を増幅する
いづれかのプライマーが適切である。
Ｎ．ゴノルホエアエＮｇ−ＣＤＭＴ配列遺伝子からの核
酸配列は、適切な緊縮ハイブリダイゼーション条件下で
のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーシ
ョンの前に増幅される。その増幅は、プローブハイブリ
ダイゼーションによる分析のための十分な核酸を供給す
るために実施される。この態様においては、配列特異性
がプローブハイブリダイゼーション段階により提供され
るので、関連する非標的配列の同時増幅はこの態様にお
いては問題ではない。従って、可変位置を包含するＮ．
ゴノルホエアエＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子の領域を増幅する
いづれかのプライマーが適切である。
【００６５】核酸を検出するための方法 本発明の方法は、Ｎｇ−ＣＤＭＴ遺伝子の領域の増幅、
続く本発明のＮ．ゴノルホエアエ−特異的プローブを用
いての検出、又は本発明のＮ．ゴノルホエアエ−特異的
プライマーを用いてのＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子の増幅、好
ましくはプローブを用いての増幅された核酸の続く検出
のいづれかを包含する。相補的オリゴヌクレオチドプロ
ーブによるハイブリダイゼーションにより標的核酸を検
出するための方法は、当業界において良く知られてい
る。特定のアッセイ形式は本発明の決定的な観点ではな
い。標的プローブハイブリダイゼーションを検出するた
めの適切なアッセイ形式は、ドット−ブロット及び逆ド
ット−ブロットアッセイ形式を包含する。
続く本発明のＮ．ゴノルホエアエ−特異的プローブを用
いての検出、又は本発明のＮ．ゴノルホエアエ−特異的
プライマーを用いてのＮｇ−ＣＤＭＴ遺伝子の増幅、好
ましくはプローブを用いての増幅された核酸の続く検出
のいづれかを包含する。相補的オリゴヌクレオチドプロ
ーブによるハイブリダイゼーションにより標的核酸を検
出するための方法は、当業界において良く知られてい
る。特定のアッセイ形式は本発明の決定的な観点ではな
い。標的プローブハイブリダイゼーションを検出するた
めの適切なアッセイ形式は、ドット−ブロット及び逆ド
ット−ブロットアッセイ形式を包含する。
【００６６】ドット−ブロット形式においては、増幅さ
れた標的ＤＮＡが固体支持体、たとえばナイロン膜上に
固定される。膜−標的複合体がラベルされたプローブと
共に適切なハイブリダイゼーション条件下でインキュベ
ートされ、ハイブリダイズされなかったプローブが適切
な緊縮条件下で洗浄することにより除去され、そして膜
が結合されたプローブの存在についてモニターされる。
ＰＣＲ増幅生成物のドット−ブロット検出は、たとえば
Saiki など.,１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３
−１６６及びアメリカ特許第５，４６８，６１３号に記
載されている。
れた標的ＤＮＡが固体支持体、たとえばナイロン膜上に
固定される。膜−標的複合体がラベルされたプローブと
共に適切なハイブリダイゼーション条件下でインキュベ
ートされ、ハイブリダイズされなかったプローブが適切
な緊縮条件下で洗浄することにより除去され、そして膜
が結合されたプローブの存在についてモニターされる。
ＰＣＲ増幅生成物のドット−ブロット検出は、たとえば
Saiki など.,１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３
−１６６及びアメリカ特許第５，４６８，６１３号に記
載されている。
【００６７】逆ドット−ブロット形式においては、プロ
ーブが固体支持体、たとえばナイロン膜上に固定され、
そして増幅された標的ＤＮＡがラベルされる。その標的
ＤＮＡは典型的には、ラベルされたプライマーの導入に
より増幅の間にラベルされる。１又は両プライマーがラ
ベルされ得る。膜−プローブ複合体が、ラベルされ、増
幅された標的ＤＮＡと共に適切なハイブリダイゼーショ
ン条件下でインキュベートされ、ハイブリダイズされな
かった標的ＤＮＡが適切な緊縮条件下で洗浄することに
より除去され、そして次に、フィルターが、結合された
標的ＤＮＡの存在についてモニターされる。逆ドット−
ブロット方法は、たとえばSaiki など.,1989, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 86:6230 及びアメリカ特許第５，
４６８，６１３号に記載されている。
ーブが固体支持体、たとえばナイロン膜上に固定され、
そして増幅された標的ＤＮＡがラベルされる。その標的
ＤＮＡは典型的には、ラベルされたプライマーの導入に
より増幅の間にラベルされる。１又は両プライマーがラ
ベルされ得る。膜−プローブ複合体が、ラベルされ、増
幅された標的ＤＮＡと共に適切なハイブリダイゼーショ
ン条件下でインキュベートされ、ハイブリダイズされな
かった標的ＤＮＡが適切な緊縮条件下で洗浄することに
より除去され、そして次に、フィルターが、結合された
標的ＤＮＡの存在についてモニターされる。逆ドット−
ブロット方法は、たとえばSaiki など.,1989, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 86:6230 及びアメリカ特許第５，
４６８，６１３号に記載されている。
【００６８】あるいは、逆ドット−ブロットアッセイ
は、多くのプローブハイブリダイゼーション部位又はウ
ェルを有する固体支持体を用いて実施され得る。たとえ
ば、マイクロウェルプレートは、本発明の方法の大規模
な臨床用途において特に有用である。プローブは、受動
的結合により又はマイクロウェルプレートに付着するタ
ンパク質中間体、たとえばウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を通して、マイクロウェルプレートに固定され得る
（Tungなど., 1991, Bioconjugate Chem. 2:464-465 を
参照のこと）。
は、多くのプローブハイブリダイゼーション部位又はウ
ェルを有する固体支持体を用いて実施され得る。たとえ
ば、マイクロウェルプレートは、本発明の方法の大規模
な臨床用途において特に有用である。プローブは、受動
的結合により又はマイクロウェルプレートに付着するタ
ンパク質中間体、たとえばウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を通して、マイクロウェルプレートに固定され得る
（Tungなど., 1991, Bioconjugate Chem. 2:464-465 を
参照のこと）。
【００６９】マイクロウェルプレートにおいて実施され
る、増幅されたＮ．ゴノルホエアエ配列の検出のための
逆ドット−ブロット方法は、アメリカ特許第５，５５
０，０４０号及びＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）Chlamy
dia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG) Test
の製品差込みに記載される。マイクロウェルプレートア
ッセイの使用は、さらに例に記載される。
る、増幅されたＮ．ゴノルホエアエ配列の検出のための
逆ドット−ブロット方法は、アメリカ特許第５，５５
０，０４０号及びＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）Chlamy
dia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG) Test
の製品差込みに記載される。マイクロウェルプレートア
ッセイの使用は、さらに例に記載される。
【００７０】あるいは、ＢＳＡ−接合されたプローブが
磁気微粒子に結合される。結合されたプローブがラベル
された増幅生成物に対して溶液においてハイブリダイズ
され、そしてその得られるハイブリダイゼーション複合
体が磁気的に溶液から除去される。次に、磁気的に固定
されたハイブリダイゼーション複合体が上記方法におけ
るようにして検出される。５′−ヌクレアーゼアッセイ
として言及されるもう１つの適切なアッセイ方法は、ア
メリカ特許第５，２１０，０１５号及び第５，４８７，
９７２号及びHolland など., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88:7276-7280に記載される。その５′−ヌクレアー
ゼアッセイにおいては、ＤＮＡ合成のためのプライマー
として作用しないようにプローブが変性された、ラベル
された検出プローブが、増幅反応の間、混合物に添加さ
れる。
磁気微粒子に結合される。結合されたプローブがラベル
された増幅生成物に対して溶液においてハイブリダイズ
され、そしてその得られるハイブリダイゼーション複合
体が磁気的に溶液から除去される。次に、磁気的に固定
されたハイブリダイゼーション複合体が上記方法におけ
るようにして検出される。５′−ヌクレアーゼアッセイ
として言及されるもう１つの適切なアッセイ方法は、ア
メリカ特許第５，２１０，０１５号及び第５，４８７，
９７２号及びHolland など., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88:7276-7280に記載される。その５′−ヌクレアー
ゼアッセイにおいては、ＤＮＡ合成のためのプライマー
として作用しないようにプローブが変性された、ラベル
された検出プローブが、増幅反応の間、混合物に添加さ
れる。
【００７１】個々の合成段階の間、すなわちプライマー
延長の間、標的ＤＮＡに対してハイブリダイズするいづ
れかのプローブが、ＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼの５′〜３′側エキソヌクレアー
ゼ活性により分解される。次にプローブからの分解生成
物が検出される。従って、プローブ分解生成物の存在
は、プローブと標的ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーシ
ョンが生じ、そして増幅反応が生じたことの両者を示
す。アメリカ特許第５，４９１，０６３号及び第５，５
７１，６７３号は、増幅と同時に生じるプローブの分解
を検出するための改良された方法を記載する。
延長の間、標的ＤＮＡに対してハイブリダイズするいづ
れかのプローブが、ＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼの５′〜３′側エキソヌクレアー
ゼ活性により分解される。次にプローブからの分解生成
物が検出される。従って、プローブ分解生成物の存在
は、プローブと標的ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーシ
ョンが生じ、そして増幅反応が生じたことの両者を示
す。アメリカ特許第５，４９１，０６３号及び第５，５
７１，６７３号は、増幅と同時に生じるプローブの分解
を検出するための改良された方法を記載する。
【００７２】上記アッセイ形式は典型的には、ハイブリ
ッド複合体の検出を促進するためにラベルされたオリゴ
ヌクレオチドを利用する。オリゴヌクレオチドは、分
光、光化学、生化学、免疫化学、又は化学手段により検
出できるラベルを組込むことによってラベルされ得る。
有用なラベルは、32Ｐ、蛍光色素、電子−密集試薬、酵
素（ＥＬＩＳＡに通常使用されるような）、ビオチン、
又は抗血清又はモノクローナル抗体が利用できるハプテ
ン及びタンパク質を包含する。本発明のラベルされたオ
リゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを合成するた
めの上記技法を用いて合成され、そしてラベルされ得
る。
ッド複合体の検出を促進するためにラベルされたオリゴ
ヌクレオチドを利用する。オリゴヌクレオチドは、分
光、光化学、生化学、免疫化学、又は化学手段により検
出できるラベルを組込むことによってラベルされ得る。
有用なラベルは、32Ｐ、蛍光色素、電子−密集試薬、酵
素（ＥＬＩＳＡに通常使用されるような）、ビオチン、
又は抗血清又はモノクローナル抗体が利用できるハプテ
ン及びタンパク質を包含する。本発明のラベルされたオ
リゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを合成するた
めの上記技法を用いて合成され、そしてラベルされ得
る。
【００７３】反応混合物における二本鎖ＤＮＡの合計量
の上昇をモニターすることによってＮ．ゴノルホエアエ
核酸の増幅を検出するためのもう１つの方法が、Higuch
i など., １９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１０：４１３−４１７；Higuchi など., １９９３，Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６−１０３
０；及びヨーロッパ特許公開第５１２，３３４号に記載
される。二本鎖標的ＤＮＡの検出は、臭化エチジウム
（ＥｔＢｒ）及び他のＤＮＡ結合色素が、二本鎖ＤＮＡ
に結合される場合に示す高められた蛍光に依存する。Ｄ
ＮＡ結合ラベルは、増幅反応混合物に添加される。標的
配列の増幅は、蛍光の検出できる上昇をもたらす、二本
鎖ＤＮＡの量の上昇をもたらす。
の上昇をモニターすることによってＮ．ゴノルホエアエ
核酸の増幅を検出するためのもう１つの方法が、Higuch
i など., １９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１０：４１３−４１７；Higuchi など., １９９３，Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６−１０３
０；及びヨーロッパ特許公開第５１２，３３４号に記載
される。二本鎖標的ＤＮＡの検出は、臭化エチジウム
（ＥｔＢｒ）及び他のＤＮＡ結合色素が、二本鎖ＤＮＡ
に結合される場合に示す高められた蛍光に依存する。Ｄ
ＮＡ結合ラベルは、増幅反応混合物に添加される。標的
配列の増幅は、蛍光の検出できる上昇をもたらす、二本
鎖ＤＮＡの量の上昇をもたらす。
【００７４】本発明はまた、本発明を実施するための有
用な成分を含んで成る複数容器単位のキットにも関す
る。有用なキットは、たとえば意図された使用に依存し
て、本発明のオリゴヌクレオチド、Ｎ．ゴノルホエアエ
−特異的プライマー又はＮ．ゴノルホエアエ−特異的プ
ローブを含む。キットの他の任意の成分は、たとえば増
幅反応試薬、たとえばプライマー延長生成物の合成を触
媒するための剤、基質ヌクレオチド三リン酸、ラベルす
るために使用される手段（たとえば、アビジン−酵素接
合体、及び酵素基質、並びにラベルがビオチンである場
合、クロモゲン）、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーション
反応のための適切な緩衝液、及び本発明を実施するため
の説明書を包含する。
用な成分を含んで成る複数容器単位のキットにも関す
る。有用なキットは、たとえば意図された使用に依存し
て、本発明のオリゴヌクレオチド、Ｎ．ゴノルホエアエ
−特異的プライマー又はＮ．ゴノルホエアエ−特異的プ
ローブを含む。キットの他の任意の成分は、たとえば増
幅反応試薬、たとえばプライマー延長生成物の合成を触
媒するための剤、基質ヌクレオチド三リン酸、ラベルす
るために使用される手段（たとえば、アビジン−酵素接
合体、及び酵素基質、並びにラベルがビオチンである場
合、クロモゲン）、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーション
反応のための適切な緩衝液、及び本発明を実施するため
の説明書を包含する。
【００７５】下記に示される本発明の例は、例示目的の
みのためであって、本発明を限定するものではない。請
求の範囲内の本発明の多くの態様は、次の例から当業者
に明らかになるであろう。
みのためであって、本発明を限定するものではない。請
求の範囲内の本発明の多くの態様は、次の例から当業者
に明らかになるであろう。
【００７６】
【実施例】例１．反応プロトコール この例は、次の例に使用されるＮ．ゴノルホエアエＤＮ
Ａの増幅及び検出のための反応プロトコールを記載す
る。
Ａの増幅及び検出のための反応プロトコールを記載す
る。
【００７７】サンプル調製 咽喉スワブ検体を、次のようにして、AMPLICORTM STD S
wab Sample Collection and Tronsport Kit (Roche Dia
gnostics Systems, Branchburg, NJ）を用いて収集し
た。咽喉スワブ検体を、０．４％のドデシル硫酸ナトリ
ウム及び１０mMのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）から成
るサンプル担持媒体（ＳＴＭ）中に配置した。スワブを
ＳＴＭ中で１５秒間、激しく撹拌し、液体を管の側壁の
方に送り、そしてスワブを除去した。
wab Sample Collection and Tronsport Kit (Roche Dia
gnostics Systems, Branchburg, NJ）を用いて収集し
た。咽喉スワブ検体を、０．４％のドデシル硫酸ナトリ
ウム及び１０mMのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）から成
るサンプル担持媒体（ＳＴＭ）中に配置した。スワブを
ＳＴＭ中で１５秒間、激しく撹拌し、液体を管の側壁の
方に送り、そしてスワブを除去した。
【００７８】増幅の前、サンプルを９５℃に１０分間、
加熱し、細胞を溶解し、室温に冷却し、そして２０％
Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレン−ソルビタンモ
ノラウレート）、１０mMのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）及び０．１０％のアジ化ナトリウムから成る、同体
積の検体希釈溶液（ＳＤ）と共に混合した。次に、サン
プルを５〜１０秒間振盪し、そして室温で少なくとも１
０分間（但し、２時間よりも長くない）インキュベート
した。細胞のサンプルを、咽喉スワブ検体について記載
されるようにして調製した。精製されたＤＮＡサンプル
を同体積のＳＴＭ及びＳＤについて希釈し、そして加熱
しないで、室温でインキュベートした。
加熱し、細胞を溶解し、室温に冷却し、そして２０％
Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレン−ソルビタンモ
ノラウレート）、１０mMのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）及び０．１０％のアジ化ナトリウムから成る、同体
積の検体希釈溶液（ＳＤ）と共に混合した。次に、サン
プルを５〜１０秒間振盪し、そして室温で少なくとも１
０分間（但し、２時間よりも長くない）インキュベート
した。細胞のサンプルを、咽喉スワブ検体について記載
されるようにして調製した。精製されたＤＮＡサンプル
を同体積のＳＴＭ及びＳＤについて希釈し、そして加熱
しないで、室温でインキュベートした。
【００７９】増幅 個々の増幅を、クラミジア・トラコマチス及びＮ．ゴノ
ルホエアエからの核酸の同時増幅を可能にするために２
対のプライマーを用いて実施した。Ｃ．トラコマチスＤ
ＮＡの増幅に対して特異的なプライマーＣＰ２４及びＣ
Ｐ２７は、すべての反応に包含された。Ｎ．ゴノルホエ
アエの増幅のために、ＳＳ０１、ＪＷ７９（配列番号
２）又はＪＷ８０（配列番号３）から選択された上流プ
ライマー及び下流プライマーＳＳ０２から成るプライマ
ー対を使用した。プライマーＣＰ２４，ＣＰ２７，ＳＳ
０１及びＳＳ０２は、アメリカ特許第５，５５０，０４
０号に十分に記載されている。
ルホエアエからの核酸の同時増幅を可能にするために２
対のプライマーを用いて実施した。Ｃ．トラコマチスＤ
ＮＡの増幅に対して特異的なプライマーＣＰ２４及びＣ
Ｐ２７は、すべての反応に包含された。Ｎ．ゴノルホエ
アエの増幅のために、ＳＳ０１、ＪＷ７９（配列番号
２）又はＪＷ８０（配列番号３）から選択された上流プ
ライマー及び下流プライマーＳＳ０２から成るプライマ
ー対を使用した。プライマーＣＰ２４，ＣＰ２７，ＳＳ
０１及びＳＳ０２は、アメリカ特許第５，５５０，０４
０号に十分に記載されている。
【００８０】ＰＣＲ増幅を、５０μｌの反応混合物に添
加される５０μｌのＤＮＡサンプル又は臨床検体１００
μｌの合計反応体積において実施した。それらの最終反
応濃度は次の通りであった：２５ｐモルの個々のプライ
マー、５０μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ、及びｄＧ
ＴＰ、１５０μＭのｄＵＴＰ、５０mMのＫＣｌ、１０mM
のトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、１．５mMのＭｇＣ
ｌ2 、１０％のグリセロール、 ５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ* ２Ｕのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ* * ：Roche Molecular Systems により開発、製造され、
そしてPerkin Elmer (Norwalk, CT)により市販されてい
る。反応は、次の熱サイクル条件を用いて、GeneAmp PC
R System 9600 (Perkin Elmer, Norwalk, CT）により実
施した：
加される５０μｌのＤＮＡサンプル又は臨床検体１００
μｌの合計反応体積において実施した。それらの最終反
応濃度は次の通りであった：２５ｐモルの個々のプライ
マー、５０μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ、及びｄＧ
ＴＰ、１５０μＭのｄＵＴＰ、５０mMのＫＣｌ、１０mM
のトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、１．５mMのＭｇＣ
ｌ2 、１０％のグリセロール、 ５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ* ２Ｕのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ* * ：Roche Molecular Systems により開発、製造され、
そしてPerkin Elmer (Norwalk, CT)により市販されてい
る。反応は、次の熱サイクル条件を用いて、GeneAmp PC
R System 9600 (Perkin Elmer, Norwalk, CT）により実
施した：
【００８１】
【表５】
【００８２】検出 増幅された生成物を、アメリカ特許第５，５５０，０４
０号に記載のようにして、Ｃ．トラコマチス−特異的プ
ローブ、すなわちＣＰ３５、及びＮ．ゴノルホエアエ−
特異的プローブ、すなわちＳＳ０６−Ｔ５、並びに高い
緊縮性のハイブリダイゼーション緩衝液（４．０ＭのＮ
ａＳＣＮ）を用いて、マイクロウェルプレートアッセイ
において検出した。０．２５以下又はそれに等しいシグ
ナル（４５０nmで測定される）を陽性であるとして判断
し、０．２５〜１．０の間のシグナルを、不明であると
して判断し、そして１．０以上のシグナルを陽性である
として判断した。
０号に記載のようにして、Ｃ．トラコマチス−特異的プ
ローブ、すなわちＣＰ３５、及びＮ．ゴノルホエアエ−
特異的プローブ、すなわちＳＳ０６−Ｔ５、並びに高い
緊縮性のハイブリダイゼーション緩衝液（４．０ＭのＮ
ａＳＣＮ）を用いて、マイクロウェルプレートアッセイ
において検出した。０．２５以下又はそれに等しいシグ
ナル（４５０nmで測定される）を陽性であるとして判断
し、０．２５〜１．０の間のシグナルを、不明であると
して判断し、そして１．０以上のシグナルを陽性である
として判断した。
【００８３】例２．ナイセリア属内での特異性 プライマー対の特異性を評価するために、増幅を、ナイ
セリア種の種々の株からの、精製された標的ＤＮＡ又は
細胞の希釈溶液を用いて実施した。サンプルを、二重反
復反応において増幅し、そして上記プロトコールを用い
て、マイクロウェルプレートハイブリダイゼーションア
ッセイにおいてアッセイした。細胞のサンプル及び精製
されたＤＮＡサンプルは、少なくとも１０6 個のコピー
の標的ＤＮＡを含むが、但し、Ｎ．ゴノルホエアエのサ
ンプルはまた、反応当たり１００個のコピーの濃度で使
用された。次のプライマー対が比較された：
セリア種の種々の株からの、精製された標的ＤＮＡ又は
細胞の希釈溶液を用いて実施した。サンプルを、二重反
復反応において増幅し、そして上記プロトコールを用い
て、マイクロウェルプレートハイブリダイゼーションア
ッセイにおいてアッセイした。細胞のサンプル及び精製
されたＤＮＡサンプルは、少なくとも１０6 個のコピー
の標的ＤＮＡを含むが、但し、Ｎ．ゴノルホエアエのサ
ンプルはまた、反応当たり１００個のコピーの濃度で使
用された。次のプライマー対が比較された：
【００８４】
【表６】
【００８５】増幅されたサンプルを、例１に記載のよう
にして、マイクロウェルプレートアッセイにおけるＮ．
ゴノルホエアエ−特異的プローブとのハイブリダイゼー
ションによりアッセイした。そのハイブリダイゼーショ
ンの結果は、下記表に示される。陽性、不明、及び陰性
シグナルは、それぞれ“＋”，“＋／−”及び“−”と
して示される。
にして、マイクロウェルプレートアッセイにおけるＮ．
ゴノルホエアエ−特異的プローブとのハイブリダイゼー
ションによりアッセイした。そのハイブリダイゼーショ
ンの結果は、下記表に示される。陽性、不明、及び陰性
シグナルは、それぞれ“＋”，“＋／−”及び“−”と
して示される。
【００８６】Ｎ．サブフラバ（Ｎ．ｓｕｂｆｌａｖａ）
の命名法は、十分には解決されていない。いくつかの現
在の文献においてまた使用される１つの分類は、別々の
種としてＮ．サブフラバ、Ｎ．ペルフラバ（Ｎ．ｐｅｒ
ｆｌａｖａ）及びＮ．フラバ（Ｎ．ｆｌａｖａ）を見な
している。１９７４年以来、種Ｎ．サブフラバ、Ｎ．ペ
ルフラバ、及びＮ．フラバは、第一の種Ｎ．サブフラバ
の変異体として再分類されている。Ｎ．サブフラバのそ
れらの変異体は、生化学的に及び微生物学的に区別され
得るＮ．サブフラバの３種のビオヴァル（ビオヴァルサ
ブフラバ、ビオヴァルフラバ及びビオヴァルペルフラ
バ）として特徴づけられる。表に使用されるＮ．サブフ
ラバの命名法は、この慣例に従がう。ビオヴァルが決定
されなかったそれらの単離物は、Ｎ．サブフラバとして
命名される。
の命名法は、十分には解決されていない。いくつかの現
在の文献においてまた使用される１つの分類は、別々の
種としてＮ．サブフラバ、Ｎ．ペルフラバ（Ｎ．ｐｅｒ
ｆｌａｖａ）及びＮ．フラバ（Ｎ．ｆｌａｖａ）を見な
している。１９７４年以来、種Ｎ．サブフラバ、Ｎ．ペ
ルフラバ、及びＮ．フラバは、第一の種Ｎ．サブフラバ
の変異体として再分類されている。Ｎ．サブフラバのそ
れらの変異体は、生化学的に及び微生物学的に区別され
得るＮ．サブフラバの３種のビオヴァル（ビオヴァルサ
ブフラバ、ビオヴァルフラバ及びビオヴァルペルフラ
バ）として特徴づけられる。表に使用されるＮ．サブフ
ラバの命名法は、この慣例に従がう。ビオヴァルが決定
されなかったそれらの単離物は、Ｎ．サブフラバとして
命名される。
【００８７】
【表７】
【００８８】Ｎ．ゴノルホエアエを、すべての３種の対
のプライマーを用いて検出した。１００個のコピーの標
的物の好結果をもたらす増幅は、本発明のプライマーが
同等の感度を提供することを示唆する。プライマーＳＳ
０１及びＳＳ０２（配列番号５）を用いて、誤った陽性
結果が、５つのＮ．シネレア（Ｎ．ｃｉｎｅｒａｅ）の
株のうち２つの株及び１５のＮ．サブフラバの株のうち
５つの株から観察された。上流プライマーとしてのＪＷ
７９（配列番号２）の使用はすべての誤った陽性結果を
排除したが、但し、不明瞭な結果がＮ．サブフラバの１
つの単離物から観察された。上流プライマーとしてのＪ
Ｗ８０（配列番号３）の使用はすべての誤った陽性結果
を排除した。
のプライマーを用いて検出した。１００個のコピーの標
的物の好結果をもたらす増幅は、本発明のプライマーが
同等の感度を提供することを示唆する。プライマーＳＳ
０１及びＳＳ０２（配列番号５）を用いて、誤った陽性
結果が、５つのＮ．シネレア（Ｎ．ｃｉｎｅｒａｅ）の
株のうち２つの株及び１５のＮ．サブフラバの株のうち
５つの株から観察された。上流プライマーとしてのＪＷ
７９（配列番号２）の使用はすべての誤った陽性結果を
排除したが、但し、不明瞭な結果がＮ．サブフラバの１
つの単離物から観察された。上流プライマーとしてのＪ
Ｗ８０（配列番号３）の使用はすべての誤った陽性結果
を排除した。
【００８９】例３．咽喉スワブ検体による特異性 正常な志願者から得られた咽喉スワブ検体を例１に記載
のようにして調製した。すべての検体は、独立したアッ
セイにより決定される場合、Ｎ．ゴノルホエアエによる
感染を有さなかった。増幅を、例２に記載されるプライ
マーの組合せを用いて実施した。増幅されたサンプル
を、例１に記載のようにしてマイクロウェルプレートア
ッセイにおけるＮ．ゴノルホエアエ−特異的プローブ及
びＣ．トラコマチス−特異的プローブによる、ゲル電気
泳動及びハイブリダイゼーションの両者によりアッセイ
した。すべての検体は、Ｃ．トラコマチスＤＮＡに対し
て陰性であった。Ｎ．ゴノルホエアエ−特異的プローブ
によるハイブリダイゼーションから得られた結果は下記
表に示される。陽性、不明及び陰性シグナルは、それぞ
れ“＋”，“＋／−”及び“−”として示される。
のようにして調製した。すべての検体は、独立したアッ
セイにより決定される場合、Ｎ．ゴノルホエアエによる
感染を有さなかった。増幅を、例２に記載されるプライ
マーの組合せを用いて実施した。増幅されたサンプル
を、例１に記載のようにしてマイクロウェルプレートア
ッセイにおけるＮ．ゴノルホエアエ−特異的プローブ及
びＣ．トラコマチス−特異的プローブによる、ゲル電気
泳動及びハイブリダイゼーションの両者によりアッセイ
した。すべての検体は、Ｃ．トラコマチスＤＮＡに対し
て陰性であった。Ｎ．ゴノルホエアエ−特異的プローブ
によるハイブリダイゼーションから得られた結果は下記
表に示される。陽性、不明及び陰性シグナルは、それぞ
れ“＋”，“＋／−”及び“−”として示される。
【００９０】
【表８】
【００９１】プライマーＳＳ０１及びＳＳ０２（配列番
号５）を用いて、誤った陽性結果が２３の臨床咽喉スワ
ブサンプルのうち１０のサンプルから観察された。上流
プライマーとしてのＪＷ７９（配列番号２）の使用は、
すべての誤った陽性結果を排除した。上流プライマーと
してのＪＷ８０（配列番号３）の使用は、すべての誤っ
た陽性結果を排除したが、但し、不明瞭な結果が１つの
サンプルから観察された。
号５）を用いて、誤った陽性結果が２３の臨床咽喉スワ
ブサンプルのうち１０のサンプルから観察された。上流
プライマーとしてのＪＷ７９（配列番号２）の使用は、
すべての誤った陽性結果を排除した。上流プライマーと
してのＪＷ８０（配列番号３）の使用は、すべての誤っ
た陽性結果を排除したが、但し、不明瞭な結果が１つの
サンプルから観察された。
【００９２】
（１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：Ｆ．Ｈｏｆｔｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ
ＡＧ （Ｂ）通り：Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒ． １２４ （Ｃ）市：Ｂａｓｅｌ （Ｄ）州：Ｂａｓｅｌ Ｃｉｔｙ （Ｅ）国：スイス （Ｆ）郵便番号：４００２ （ii）発明の名称：ネイセリア ゴノルホエアエ−特異
的オリゴヌクレオチド （iii)配列の数：８ （vi) 従来の出願のデータ： （Ａ）出願番号：ＵＳ６０／０７９１４ （Ｂ）出願日：４月１８日、１９９７年 （２）配列番号１についての情報：
ＡＧ （Ｂ）通り：Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒ． １２４ （Ｃ）市：Ｂａｓｅｌ （Ｄ）州：Ｂａｓｅｌ Ｃｉｔｙ （Ｅ）国：スイス （Ｆ）郵便番号：４００２ （ii）発明の名称：ネイセリア ゴノルホエアエ−特異
的オリゴヌクレオチド （iii)配列の数：８ （vi) 従来の出願のデータ： （Ａ）出願番号：ＵＳ６０／０７９１４ （Ｂ）出願日：４月１８日、１９９７年 （２）配列番号１についての情報：
【００９３】（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０６７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi) 配列：配列番号１：
【表９】
【００９４】（２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi) 配列：配列番号２： CATATGTAAC AGCAGGTCAG GCC 23
【００９５】（２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi) 配列：配列番号３： TAACAGCAGG TCAGGCCATA TCC 23
【００９６】（２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２２個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi) 配列：配列番号４： CGGTAAAACA CGCCGTATGT TC 22
【００９７】（２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi) 配列：配列番号５： AACAGCATTA CCAATCTGGC GAC 23
【００９８】（２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi) 配列：配列番号６： GACGTACTTC AGTTGTTGAT CCG 23
【００９９】（２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi) 配列：配列番号７： CGACGTACTT CAGTTGTTGA TCCG 24
【０１００】（２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi) 配列：配列番号８： CAGTTGTTGA TCCGACAAAC TCA 23
Claims (14)
- 【請求項１】 ナイセリア・コノルホエア（Ｎｅｉｓｓ
ｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）−特異的オリゴヌ
クレオチドであって、該オリゴヌクレオチドがヌクレオ
チド位置番号６１８，６２１，６２７，６３０，６３
６，６５３，６５４，６６９，６７８，６８１，６８３
及び７０２から選択されたヌクレオチド位置を包含する
領域において配列番号１のいづれかの鎖に対して実質的
に相補的なヌクレオチド配列から成り；そして前記配列
が前記領域内に包含されるヌクレオチド位置番号６１
８，６２１，６２７，６３０，６３６，６５３，６５
４，６６９，６７８，６８１，６８３及び７０２から選
択された個々のヌクレオチド位置において配列番号１に
対して正確に相補的であることを特徴とするヌクレオチ
ド。 - 【請求項２】 前記オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチ
ド位置番号６１８，６２１，６２７，６３０，６３６，
６５３，６５４，６６９，６７８，６８１，６８３及び
７０２から選択されたヌクレオチド位置を包含する領域
において配列番号１のいづれかの鎖に対して正確に相補
的であるヌクレオチド配列から成る請求項１記載のオリ
ゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 前記領域が、ヌクレオチド位置番号６１
８，６２１，６２７，６３０，６３６，６５３，６５
４，６６９，６７８，６８１，６８３及び７０２から選
択された２個のヌクレオチド位置を包含する請求項１記
載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 前記領域がヌクレオチド位置番号６１
８，６２１，６２７，６３０，６３６，６５３，６５
４，６６９，６７８，６８１，６８３及び７０２から選
択された５′末端位置を有する請求項１記載のオリゴヌ
クレオチド。 - 【請求項５】 ＪＷ７９（配列番号２）、ＪＷ８０（配
列番号３）又はＪＷ８７（配列番号４）である請求項１
記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項６】 請求項５記載のオリゴヌクレオチドと、
ＳＳ０２（配列番号５）、ＪＷ８８（配列番号６）、Ｊ
Ｗ８９（配列番号７）又はＪＷ９０（配列番号８）であ
るオリゴヌクレオチドとから成る一対のオリゴヌクレオ
チドプライマー。 - 【請求項７】 請求項１〜５のいづれか１項記載のオリ
ゴヌクレオチドを含んで成る、ナイセリア・コノルホエ
アの核酸を検出するためのキット。 - 【請求項８】 請求項６記載の一対のオリゴヌクレオチ
ドを含んで成る、ナイセリア・コノルホエア核酸を増幅
するためのキット。 - 【請求項９】 ナイセリア・コノルホエアの核酸を検出
するための方法であって、 （ａ）一対のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応
を実施し、ここで前記一対のプライマーが、ヌクレオチ
ド位置番号６１８，６２１，６２７，６３０，６３６，
６５３，６５４，６６９，６７８，６８１，６８３及び
７０２から選択されたヌクレオチド位置を包含する領域
において配列番号１のいづれかの鎖に対して実質的に相
補的なヌクレオチド配列から成り；そして前記配列が前
記領域内に包含されるヌクレオチド位置番号６１８，６
２１，６２７，６３０，６３６，６５３，６５４，６６
９，６７８，６８１，６８３及び７０２から選択された
個々のヌクレオチド位置において配列番号１に対して正
確に相補的であり、そして（ｂ）増幅されたナイセリア
・コノルホエアの核酸を検出することを含んで成る方
法。 - 【請求項１０】 前記ナイセリア・コノルホエア−特異
的プライマーが、ヌクレオチド位置番号６１８，６２
１，６２７，６３０，６３６，６５３，６５４，６６
９，６７８，６８１，６８３及び７０２から選択された
ヌクレオチド位置を包含する領域において配列番号１の
いづれかの鎖に対して正確に相補的であるヌクレオチド
配列から成る請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 前記領域が、ヌクレオチド位置番号６
１８，６２１，６２７，６３０，６３６，６５３，６５
４，６６９，６７８，６８１，６８３及び７０２から選
択された２個のヌクレオチド位置を包含する請求項９記
載の方法。 - 【請求項１２】 前記領域が、ヌクレオチド位置番号６
１８，６２１，６２７，６３０，６３６，６５３，６５
４，６６９，６７８，６８１，６８３及び７０２から選
択された５′末端位置を有する請求項９記載の方法。 - 【請求項１３】 前記ナイセリア・コノルホエア−特異
的プライマーが、ＪＷ７９（配列番号２）、ＪＷ８０
（配列番号３）又はＪＷ８７（配列番号４）である請求
項９記載の方法。 - 【請求項１４】 前記一対のプライマーが、ＪＷ７９
（配列番号２）、ＪＷ８０（配列番号３）又はＪＷ８７
（配列番号４）であるナイセリア・コノルホエア−特異
的プライマー；及びＳＳ０２（配列番号５）、ＪＷ８８
（配列番号６）、ＪＷ８９（配列番号７）又はＪＷ９０
（配列番号８）であるプライマーから成る請求項９記載
の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7091497P | 1997-04-18 | 1997-04-18 | |
| US60/070914 | 1997-04-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1118785A true JPH1118785A (ja) | 1999-01-26 |
| JPH1118785A5 JPH1118785A5 (ja) | 2005-08-25 |
Family
ID=22098134
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10109737A Pending JPH1118785A (ja) | 1997-04-18 | 1998-04-20 | ナイセリア・コノルホエア−特異的オリゴヌクレオチド |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6090557A (ja) |
| EP (1) | EP0872561B1 (ja) |
| JP (1) | JPH1118785A (ja) |
| DE (1) | DE69822242T2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004094986A2 (en) * | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| EP1584923A3 (en) * | 2004-04-07 | 2006-01-04 | Roche Diagnostics GmbH | Stabilization of biomolecules in samples |
| US7575863B2 (en) * | 2004-05-28 | 2009-08-18 | Applied Biosystems, Llc | Methods, compositions, and kits comprising linker probes for quantifying polynucleotides |
| US7642055B2 (en) * | 2004-09-21 | 2010-01-05 | Applied Biosystems, Llc | Two-color real-time/end-point quantitation of microRNAs (miRNAs) |
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| CN100415900C (zh) * | 2005-01-21 | 2008-09-03 | 尹一兵 | 淋病奈瑟菌荧光定量pcr检测试剂盒 |
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| PL437280A1 (pl) * | 2021-03-12 | 2022-09-19 | Genomtec Spółka Akcyjna | Zestaw starterów do powielania, sposób wykrywania infekcji bakteryjnej przenoszonej drogą płciową oraz zestaw do wykrywania infekcji |
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| WO1994005813A1 (en) * | 1992-09-10 | 1994-03-17 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Compositions and methods for treatment of hepatitis c virus-associated diseases |
| US5550040A (en) * | 1993-06-23 | 1996-08-27 | Hoffman-La Roche Inc. | Method, reagents and kits for the detection of Neisseria gonorrhoeae |
-
1998
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- 1998-04-14 EP EP98106718A patent/EP0872561B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-14 DE DE1998622242 patent/DE69822242T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-20 JP JP10109737A patent/JPH1118785A/ja active Pending
Also Published As
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|---|---|
| DE69822242T2 (de) | 2005-01-13 |
| EP0872561A2 (en) | 1998-10-21 |
| DE69822242D1 (de) | 2004-04-15 |
| EP0872561B1 (en) | 2004-03-10 |
| US6090557A (en) | 2000-07-18 |
| EP0872561A3 (en) | 1999-11-17 |
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