ES2205226T3 - Complejo de carbohidratos extraido de mycobacterium tuberculosis y procedimiento para la preparacion del mismo. - Google Patents

Complejo de carbohidratos extraido de mycobacterium tuberculosis y procedimiento para la preparacion del mismo.

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ES2205226T3 ES97925325T ES97925325T ES2205226T3 ES 2205226 T3 ES2205226 T3 ES 2205226T3 ES 97925325 T ES97925325 T ES 97925325T ES 97925325 T ES97925325 T ES 97925325T ES 2205226 T3 ES2205226 T3 ES 2205226T3
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Abstract

La invención se refiere a un complejo de carbohidrato que es una mezcla de polisacáridos de bajo peso molecular de una estructura arabinomannam extraído del Microbacterium tuberculosis, que es altamente eficaz en el tratamiento de varios cánceres en pacientes sin incurrir en efectos secundarios adversos.

Description

Complejo de carbohidratos extraído de Mycobacterium tuberculosis y procedimiento para la preparación del mismo.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un complejo de carbohidratos extraído de Mycobacterium tuberculosis, que tiene una actividad anticancerígena, y a un procedimiento para la preparación del mismo.
Antecedentes de la invención
Se sabe generalmente que la actividad anticancerígena de Mycobacterium tuberculosis es atribuible a agentes activos de la membrana citoplásmica de la misma, particularmente los derivados de polisacáridos y lípidos.
Por ejemplo, Azuma y otros tuvieron éxito para aislar N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina (MDP) que es un componente activo de M. tuberculosis [Azuma y otros, J. Bact., 96, 1885-1887(1968)].
Barnes y otros, por otra parte, presentaron que el lipoarabinomanano promueve la producción de citoquina [Barnes, P.F. y otros, J. Immunol., 149, 541-547(1992)]. Chung y otros aislaron de M. tuberculosis una substancia que tiene una actividad anticancerígena y usaron esta substancia, denominada Tubercin-3, para tratar pacientes con cáncer terminal y lepra así como animales de laboratorio que sufrían síntomas tumorales [Chung, T.H., J. Korean Med. Ass., 17, 427-431(1974); Chung y otros, Yonsei Med. J., 17, 131-135(1976)].
También se presentó que un polisacárido extraído de Mycobacterium bovis BGC tiene una actividad anticancerígena (Patent Abstracts of Japan, vol.18, Nº 337, (c-1217), 1994; JP A 06 080 574, KICHIRO OZAKI).
Por otra parte, una persona infectada por bacilos de M. tuberculosis normalmente exhibe inflamación granulomatosa y, si el sitio infectado es el pulmón, la formación de la cavidad avanza junto con una reacción inflamatoria, inducida por secreción de proteínas y glicolípidos originalmente presentes en la pared celular de M. tuberculosis. Esto sugiere que, en caso de que se usen polisacáridos o proteínas de alto peso molecular, puede ser difícil suprimir efectos secundarios adversos tales como inmunorrespuestas indeseables y reacciones inflamatorias no controlables.
Sumario de la invención
De acuerdo con esto, un objetivo de la invención es proporcionar un complejo de carbohidrato extraído de Mycobacterium tuberculosis que tiene una alta actividad anticancerígena y al mismo tiempo no provoca esencialmente ninguno de los efectos secundarios indeseables mencionados previamente.
Otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento para la preparación de dicho complejo de carbohidratos.
De acuerdo con un aspecto de esta invención, se proporciona un complejo de carbohidratos, que es una mezcla de polisacáridos extraídos de Mycobacterium tuberculosis, caracterizado porque: los polisacáridos tienen el peso molecular de menos de 7.000 y se derivan de monosacáridos que consisten esencialmente en manosa, arabinosa, glucosa y galactosa, formando los monosacáridos enlaces glicosídicos de cadena lineal y/o cadena ramificada.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para la preparación del complejo de carbohidratos, que comprende las etapas de:
(a) cultivar Mycobacterium tuberculosis en un medio, calentar el cultivo diluido con agua a una temperatura que varía de 50 a 150ºC, bajo una presión que varía de 10 a 300 psi, y retirar residuos bacterianos de la solución de cultivo calentada.
(b) añadir una sal inorgánica a la solución restante para formar un precipitado, y retirar el precipitado de la solución resultante;
(c) dializar la solución restante para obtener un producto de diálisis;
(d) añadir un alcohol al producto de diálisis para obtener un precipitado, lavar el precipitado con una mezcla de alcohol-éter y extraer el precipitado lavado con un disolvente orgánico; y
(e) purificar el extracto para obtener el complejo de carbohidratos.
Breve descripción de los dibujos
Los objetivos y las características previos y otros de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de la invención tomada junto con los dibujos adjuntos, en los que:
la figura 1 muestra la exploración Bio-LC del producto de hidrólisis de Tubercin-5 de la presente invención (obtenida usando un detector amperométrico pulsatorio: bloque);
la figura 2 reproduce exploraciones de ^{1}H-NMR de las fracciones de arabinomanano 1, 2, 3 y 4 que se toman del producto de hidrólisis de Tubercin-5 de la presente invención;
la figura 3 representa exploraciones de ^{13}C-NMR de las fracciones de arabinomanano 1 y 3;
la figura 4 ilustra el resultado del análisis por FAB-MS de derivados alditólicos de oligosacárido del componente de arabinomanano de Tubercin-5.
Descripción detallada de la invención
El complejo de carbohidratos de la presente invención, denominado Tubercin-5, se extrae de M. tuberculosis. Tubercin-5 es una mezcla de polisacáridos que tienen enlaces glicosídicos de cadena lineal y cadena lateral formados entre monosacáridos esenciales tales como manosa, arabinosa, glucosa y galactosa. El peso molecular de dichos polisacáridos esta por debajo de 7.000, preferiblemente en el intervalo de 2.500 a 3.500 daltons.
Tubercin-5 de la presente invención puede prepararse como sigue.
En primer lugar, se cultiva M. tuberculosis en un medio adecuado y el cultivo se diluye con agua. El cultivo diluido se calienta a un intervalo de temperatura de 50 a 150ºC, preferiblemente de 110 a 130ºC, bajo una presión que varía de 10 a 30 psi, preferiblemente de 15 a 20 psi. El medio adecuado para el cultivo puede ser preferiblemente medio de Sauton; y el agua para dilución puede emplearse en una cantidad que varía de 10 a 30 veces, preferiblemente 20 veces el volumen del cultivo. El cultivo calentado se deja para retirar residuos bacterianos del mismo. La retirada de los residuos bacterianos puede efectuarse mediante un método convencional, por ejemplo usando una centrífuga y/o un filtro.
Se añade a la solución de cultivo restante una sal inorgánica para formar un precipitado proteínico. La sal inorgánica que puede usarse en la presente invención incluye sulfato amónico, sulfato sódico, ácido sulfosalicílico y ácido fosfotúngstico, aunque se prefieren el ácido sulfosalicílico y el ácido fosfotúngstico. La sal inorgánica puede emplearse hasta una concentración final que varía de 1 a 15% en peso, preferiblemente de 8 a 10% en peso. A continuación, se retira de la solución resultante el precipitado de la misma mediante un método convencional, por ejemplo una centrifugación. La solución restante se dializa a continuación frente a agua destilada para retirar la sal inorgánica y para obtener un producto de diálisis. La etapa de procesamiento de retirada puede repetirse dos veces o más.
Se añade al producto de diálisis un alcohol para obtener un precipitado y el precipitado se lava con una mezcla de alcohol-éter. El alcohol que puede emplearse en la presente invención incluye etanol, propanol y butanol, aunque se prefiere el etanol. El éter puede ser preferiblemente éter dietílico. El precipitado lavado se extrae a continuación con un disolvente orgánico, por ejemplo fenol, éter dietílico o un alcohol, para retirar componentes lipídicos del mismo. La extracción puede efectuarse en presencia de una solución tamponadora, por ejemplo, una solución mixta de solución tamponadora de Tris-HCl-EDTA.
Finalmente, el precipitado obtenido se somete a una etapa de purificación para obtener el complejo de carbohidratos de la presente invención, denominado Tubercin-5. La purificación puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando una cromatografía en columna de intercambio iónico.
Tubercin-5 así obtenido es una mezcla de polisacáridos que tienen una estructura de arabinomano construida a partir de monosacáridos tales como glucosa (Glu), arabinosa (Ara), galactosa (Gal) y manosa (Man); y se hace transparente cuando se somete sucesivamente a per-O-metilación, hidrólisis, reducción, acetilación y análisis por GLC-MS.
La estructura de Tubercin-5 se estudia adicionalmente examinando los fragmentos obtenidos mediante su hidrólisis. A saber, puede mostrarse por medio de cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC) que el producto de hidrólisis de Tubercin-5 está comprendido por un número de monosacáridos y oligosacáridos de diversas longitudes de cadena.
Cuatro fracciones de arabinomanano obtenidas a partir de la separación cromatográfica previa del producto de hidrólisis de Tubercin-5 se analizan adicionalmente mediante NMR. Los resultados de ^{1}H-NMR muestran la presencia de residuos de \alpha- o \beta-furanosilo y \alpha-piranosilo, mientras que los datos de ^{13}C-NMR revelan que Tubercin-5 posee: (1) una unidad (residuo) de \alpha-Araf de tipo de enlace 5, (2) una unidad de \alpha-Araf de tipo de enlace (3\rightarrow5) substituida con un residuo de \alpha-Araf de tipo de enlace 5 en la posición de ramificación, y (3) una unidad de disacárido, \beta-Araf-(1\rightarrow2)-\alpha-Araf, así como una unidad de Araf de tipo de enlace (3\rightarrow5) disubstituida.
Para un análisis estructural adicional, Tubercin-5 se somete sucesivamente a per-O-alquilación, hidrólisis parcial y reducción con borodeuteruro sódico (NaB[^{2}H]_{4}) y un análisis de FAB-MS de los derivados alditólicos de oligosacáricos así obtenidos muestra la presencia de unidades de (Man)_{2} simples así como (Man)_{6}(Ara)_{6}(Glu)(Gal), (Man)_{9}(Ara)_{6}(Glu)(Gal) y otras combinaciones de Man, Ara, Glu y Gal.
Los análisis previos muestran que el complejo de carbohidratos de la presente invención, Tubercin-5, está comprendido por polisacáridos que tienen cadenas lineales y ramificadas de manosa, arabinosa, glucosa y galactosa y que tienen un peso molecular de 7.000 o menos, preferiblemente de 2.500 a 3.500. Según se apunta previamente, los polisacáridos de peso molecular superior que tienen el peso molecular medio de, por ejemplo, 12.000 o más puede inducir efectos secundarios indeseables, por ejemplo, hipersensibilidad.
El complejo de carbohidratos de la presente invención, Tubercin-5, es notablemente eficaz para tratar a diversos pacientes con cáncer, particularmente los que sufren cáncer de pulmón, estómago o cuello uterino. Tubercin-5 tiene un valor de LD_{50} que es varios ordenes de magnitud superior que el nivel de dosificación recomendado. De acuerdo con esto, es seguro y atóxico, tiene efectos terapéuticos sobre síntomas cancerosos, incrementa el grado de supervivencia de los pacientes y elimina o reduce los tejidos cancerosos, todo en ausencia de efectos secundarios adversos discernibles.
Por lo tanto, Tubercin-5 puede emplearse solo o en combinación con otras substancias en una composición farmacéutica para el tratamiento de cánceres. La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender excipientes, portadores, diluyentes, agentes lubricantes, agentes humectantes y agentes saboreantes farmacéuticamente aceptables en combinación con Tubercin-5. La composición farmacéutica de la invención puede prepararse empleando cualquiera de los métodos convencionales conocidos en la técnica.
La composición farmacéutica que comprende Tubercin-5 puede administrarse a través de una variedad de rutas incluyendo introducción oral, trasdérmica, subcutánea, intravenosa e intramuscular. En el caso de que se use una formulación de inyección subcutánea, una dosis diaria típica del ingrediente activo puede variar de aproximadamente 0,001 a 1 \mug/kg de peso corporal, preferiblemente de 0,01 a 0,5 \mug/kg de peso corporal. Sin embargo, la dosificación del ingrediente activo puede variar dependiendo de diversos factores y una cantidad apropiada debe determinarse después de evaluar el método de administración, el síntoma así como la edad y el peso del paciente, entre otras cosas.
Los siguientes Ejemplos pretenden ilustrar adicionalmente la presente invención sin limitar su alcance.
Ejemplo 1 Preparación de Tubercin-5
Se inoculó M. tuberculosis (H_{37}R_{V}:ATCC 25618) en un medio de Sauton [Sauton, B., Internat. Cong. Appl. Chem., 19, 267-269(1912)] puesto en un matraz de 250 ml y se cultivó durante 4 semanas a 37ºC. Se diluyeron 300 g del cultivo con aproximadamente 6000 g de agua y el cultivo diluido así obtenido se calentó en un autoclave a 120ºC bajo una presión de 16 psi.
El cultivo calentado se centrifugó durante 30 minutos a 3500-4500 rpm, el sobrenadante se separó y se filtró con un filtro de Seilg que tenía un tamaño de poro de 0,1 \mum. La solución así obtenida se filtró de nuevo usando un filtro de Shämblan para retirar residuos bacterianos restantes.
Se añadió al filtrado así obtenido ácido sulfosalicílico hasta una concentración de 10% en peso y se centrifugó para retirar precipitados pardos amarillentos (proteínas). El sobrenadante se puso en una bolsa de membrana semipermeable (Thomas Co., EE.UU de A.) y se dializó frente a agua destilada durante 3 días para retirar el ácido sulfosalicílico.
La suspensión coloidal en la bolsa de membrana se concentró, se añadió a la misma ácido fosfotúngstico hasta una concentración de 7% en peso y el precipitado proteínico formado en la misma se retiró mediante centrifugación a 3500 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante así obtenido se puso en una bolsa de membrana semipermeable y se dializó frente a agua destilada para retirar sales inorgánicas presentes en la misma.
La solución de diálisis se diluyó a continuación con un volumen de 5 veces de etanol y la mezcla resultante se dejó reposar a 4ºC durante 24 horas para obtener un precipitado. El precipitado se lavó 2 veces con una mezcla de etanol-agua (1:3) y se añadió al precipitado lavado una solución mixta de tampón de Tris-HCl 20 mM (pH 8,0)-EDTA 5mM. La mezcla resultante se extrajo secuencialmente con un fenol, éter dietílico y etanol para retirar lípidos presentes en el precipitado.
Finalmente, las impurezas inorgánicas traza se eliminaron del precipitado usando una columna Bio-Gel P4 (1,2 x 65 cm.; Bio-Rad Laboratories, EE.UU. de A.) para obtener 100 mg del complejo de carbohidratos de la presente invención, denominado Tubercin-5.
Ejemplo 2 Análisis estructural de Tubercin-5
Para analizar los constituyentes de monosacárido de Tubercin-5 preparado en el Ejemplo 1, se disolvió Tubercin-5 en agua hasta una concentración de 500 \mug/ml y se analizó usando el método desarrollado por Oxford Glyco Systems of England usando diversas soluciones estándar de monosacárido como referencia.
Tubercin-5 se sometió a una serie de reacciones convencionales, es decir, per-O-metilación, hidrólisis catalizada por ácido, reducción y acetilación para obtener metilglicósido de per-O-trimetilsililo (TMS) y cada componente se identifico con GLC-MS. El análisis cuantitativo de cada metilglicósido de TMS se efectúo usando un detector de ionización a la llama (FID) y se determinaron las cantidades de los residuos glicosílicos presentes en Tubercin-5 según se muestra en las Tablas 1 y 2.
TABLA 1
1
TABLA 2
2
Según se muestra en las Tablas 1 y 2, Tubercin-5, el complejo de carbohidratos de la presente invención, posee una estructura de arabinomanano, similar a las encontradas en complejos de carbohidratos de otros bacilos de tuberculosis. Se clarifican además mediante este estudio los hechos de que el residuo de 4-manopiranosa (4-Manp) está presente en Tubercin-5 y que los contenidos de arabinosa y manosa son muy superiores que los contenidos de glucosa y galactosa.
Después del análisis previo, 10 mg de Tubercin-5 se hidrolizaron en HCl 6N durante 24 horas a 70ºC, se neutralizaron con NaOH 6N y se sometieron a cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC) usando una columna CarboPac PA1 (4 x 250 mm: Dionex) con una columna de seguridad CarboPac PA (3 x 25 mm) en Bio-LC equipado con un detector amperométrico pulsatorio (Dionex), que empleaba un electrodo con oro depositado bajo la siguiente condición:
tamaño de la muestra: 26 \mul
potencial del impulso del bloque, E_{1} = 0,05 V
t_{1} = 480 ms
E_{2} = 0,06 V
t_{2} = 120 ms
E_{3} = -80 V
t_{3} = 60 ms
tiempo de respuesta del detector = 1 segundo
eluyente 1 = solución de acetato sódico 1 M
eluyente 2 = solución de hidróxido sódico 200 mM o 375 mM
eluyente 3 = agua destilada
programas de gradiente de elución usados:
(1)
Programa A
eluyente 1: 5% en 0 minutos, 50% en 45 minutos
eluyente 2 (NaOH 200 mM): 50% en de 0 a 45 minutos.
(2)
Programa B
eluyente 1: 5% en 0 minutos, 15% en 5 minutos, 25% en 20 minutos, 35% en 45 minutos y 45% en 65 minutos.
eluyente 2 (NaOH 375 mM): 40% en 0,65 minutos.
caudal del eluyente = 1 ml/minuto
Las respuestas de los picos observados se calibraron usando soluciones estándar que contenían cantidades conocidas de compuestos de referencia.
La exploración Bio-LC de los productos de hidrólisis de Tubercin-5, según se definía mediante el detector amperométrico pulsatorio, se muestra en la figura 1. Tubercin-5 es, como sugiere la exploración de la figura 1, una mezcla de polisacáridos que tienen diversos constituyentes de monosacáridos y diferentes longitudes de cadena. Esta mezcla de hidrólisis se dividió en cuatro fracciones y cada una se analizó como sigue:
Cada una de las cuatro fracciones de arabinomanano se disolvió en 1 ml de ^{2}H_{2}O, se añadió 1 \mul de acetona como un patrón interno y se sometió a análisis de NMR (Bruker ACE-300). Una exploración de ^{13}C-NMR mostraba un pico en \delta 31,4 con relación al patrón de acetona, mientras que ^{1}H-NMR exhibía un pico a \delta 2,04 con relación al pico de acetona. Las exploraciones de ^{1}H-NMR de la fracción de arabinomanano 1, 2, 3 y 4 de Tubercin-5 se reproducen en la figura 2, que muestra la presencia de residuos de cadena de sacárido en las fracciones 1 y 3 (se identifica que los picos marcados por flechas en las exploraciones para las fracciones 1 y 3 son la señal H-1 de un residuo de \beta-glicosilo). Otros protones de cada uno de los polisacáridos muestran picos en \delta 5,0-4,5 y estos corresponden a los residuos de \alpha- o \beta-furanosilo así como \alpha-piranosilo.
Las exploraciones de ^{13}C-NMR de las fracciones 1 y 3 de Tubercin-5 de la presente invención se ilustran en la figura 3. Basándose en los resultados conocidos para el componente de arabinomanano soluble presente en M. tuberculosis [Daffe, M. y otros, J. Biol. Chem, 265, 6734-6743 (1990)], puede deducirse el desplazamiento químico del extremo no reducible de la cadena de arabinano. Se ha encontrado así que el t-\beta-Araf terminal (C-1, \delta 101-102) está unido a la posición 2 de \alpha-Araf (C-1, \delta 106-108) y que este disacárido está a su vez unido a las posiciones 3 y 5 del residuo \alpha-Araf. Se confirmó que los restantes residuos de Ara y Man eran de naturaleza furanoide basándose en los valores de los desplazamientos químicos (\delta 107-109). A saber, los valores de los desplazamientos químicos para C-1 de t-\beta-Araf y \alpha-Araf de tipo de enlace 2, C-2 del residuo de arabinosa y C-5 de t-\beta-Araf presentados en la literatura citados previamente están muy cerca de los observados en este estudio. En el caso del residuo de furanosilo, los datos disponibles para residuos de Araf de tipo de enlace 2, 3 y 5 y los del residuo de 5-Galf se basaban en elucidar el hecho de que el pico de C-1 que aparece en \delta 108-109 se debe principalmente a las unidades \alpha-Araf/\beta-Araf [Gorin, P.A.J. y otros, Carbohydrate Res., 48, 171-186 (1976); Joseleau, J. P. y otros, Carbohydrate Res., 58, 165-175 (1977); Mizutani, K. y otros, Carbohydrate Res., 185, 27-38 (1989)]. La gran similitud observada en los datos de ^{13}C-NMR para los dos componentes de arabinomanano solubles de la pared celular de M. tuberculosis sugieren que estos componentes tienen características estructurales similares. Se ha observado que dichas características estructurales pueden expresarse como sigue:
(a) residuo de \alpha-Araf de tipo de enlace 5;
(b) unidad de \alpha-Araf de tipo de enlace (3\rightarrow5) ramificada substituida con residuo de \alpha-Araf de tipo de enlace 5 en la posición de ramificación, y
(c) disacárido, \beta-Araf-(1\rightarrow2)-\alpha-Araf, y unidades de \alpha-Araf de tipo de enlace (3\rightarrow5).
Para analizar el componente de arabinomanano con más detalle, una fracción de arabinomanano per-O-metilada se trató con CF_{3}COOH 1M a 75ºC durante una hora para realizar la hidrólisis parcial de la misma, y el material resultante se redujo usando NaB[^{2}H]_{4} para obtener derivados alditólicos de oligosacárido, que se convirtieron a continuación en alditoles de oligosacárido per-O-alquilados que habían de someterse a análisis de FAB-MS.
La figura 4 muestra el resultado del análisis de FAB-MS de los iones positivos de los alditoles de oligosacárido derivados de Tubercin-5 y pueden observarse los picos de iones moleculares intensos correspondientes a [M+Na]^{+} y [M+NH_{4}]^{+}, en donde los picos en 408, 612, 932, 1862, 2270 y 2882 se asignan a (Man)_{2}, (Man)_{3}, (Man)_{3}(Ara), 
\hbox{(Man) _{4} }
(Ara)_{6}, (Man)_{6}(Ara)_{6}(Glu)(Gal) y (Man)_{9}(Ara)_{9}(Glu)(Gal), respectivamente.
Las estructuras de los fragmentos previos se muestran en la Tabla 3
TABLA 3
3
El polisacárido que tiene un peso molecular de más de 3.000 tiene la estructura que sigue:
4
en la que l, m, n, o y p son individualmente un número entero; y X es una cadena de residuos de glucosa y galactosa.
Los polisacáridos que tienen un peso molecular mayor que 3.500 constituyen menos de 10% de los polisacáridos totales.
Ejemplo de prueba 1
Toxicidad aguda de Tubercin-5 para ratas y ratones
Tubercin-5 preparado en el Ejemplo 1 se disolvió en solución salina fisiológica hasta una concentración de 2 mg/ml, diversas cantidades de la cual se administraron a ratones de 6 semanas de edad (ratones ICR: 20-25 g) y ratas (rata SD: 150 g) por medio de inyecciones intravenosas o subcutáneas para observar la mortalidad de la misma. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
TABLA 4
5
Los resultados de la Tabla 4 muestran que, independientemente del animal de prueba usado, el valor de LD_{50} de Tubercin-5 es mayor que 20 \mug/kg en caso de inyección intravenosa, mientras que está por encima de 50.000 \mug/kg cuando se administra mediante inyecciones subcutáneas. De acuerdo con esto, considerando que una dosificación diaria eficaz de Tubercin-5 para un paciente humano puede variar de aproximadamente 0,01 a 1 \mug/kg, preferiblemente de 0,01 a 0,5 \mug/kg del peso corporal, Tubercin-5 es esencialmente atóxico.
Los animales de prueba sometidos a los tratamientos previos se examinaron durante un periodo de 14 días para medir los cambios de peso y a continuación fueron sacrificados para eliminar los tejidos del hígado, el riñón, el bazo, el estomago, el pulmón y el corazón de los mismos. Además, cada una de las muestras de órgano se fijó en una solución de formaldehído al 10% para preparar un espécimen patológico que se tiñó con hematosilina-eosina y se examinó con un microscopio. No se detectaron anormalidades en ninguno de los especímenes examinados.
Ejemplo de prueba 2
El efecto del uso de Tubercin-5 y ciclofosfamida
Se dividieron en siete grupos 56 ratones blancos macho que pesaban cada uno aproximadamente 22 g (ratones ICR: 20-25 g), y a cada ratón se le administraron, mediante una inyección subcutánea en su sección abdominal, 0,2 ml de solución de células tumorales de ascitis de Ehrlich al 10% (1,4 x 10^{7} células) de acuerdo con el método de Baillif [Baillif, R.N., Cancer Research, 15, 554-558 (1954)]. Subsiguientemente, cada ratón se sometió a uno de los siguientes tratamientos:
Grupo de control: inyección abdominal de 0,2 ml de solución salina fisiológica al 0,9%;
Grupo 1: inyección subcutánea de una solución de 1 \mug/ml de Tubercin-5 en solución salina fisiológica al 0,9%;
Grupo 2: inyección subcutánea de una solución de 2 \mug/ml de Tubercin-5 en solución salina fisiológica al 0,9%;
Grupo 3: inyección intraperitoneal de 0,55 mg (correspondientes a 25 mg por kg de peso corporal) de ciclofosfamida disuelta en 0,2 ml de agua;
Grupo 4: inyección intraperitoneal de 1,1 mg (correspondientes a 50 mg por kg de peso corporal) de ciclofosfamida disuelta en 0,2 ml de agua;
Grupo 5: inyección intraperitoneal de 0,55 mg de ciclofosfamida acoplada con inyección subcutánea de 1 \mug de Tubercin-5; y
Grupo 6: inyección intraperitoneal de 1,1 mg de ciclofosfamida acoplada con inyección subcutánea de 1 \mug de Tubercin-5.
Cada uno de los tratamientos de inyección previos se repitió 6 veces durante un periodo de 6 días. Quince días después de la inoculación inicial con células cancerosas, cada uno de los ratones así tratados se anestesió con éter dietílico y se sacrificó. El tumor sólido que crecía en la sección abdominal se aisló cuidadosamente de otros tejidos de órganos, se limpió usando papeles de filtro y se pesó. Para cada grupo el peso medio del tejido canceroso se tabuló y se evaluó mediante la prueba t, cuyos resultados se muestran en la Tabla 5.
TABLA 5
6
* Cada grupo contenía 8 ratones
Como sugieren los datos de la Tabla 5, la administración de ciclofosfamida o Tubercin-5 sólo producía efectos anticancerígenos de magnitud similar, mientras que el uso combinado de ciclofosfamida y Tubercin-5 daba como resultado una disminución notable en el crecimiento canceroso. Este resultado demuestra la utilidad de Tubercin-5 en terapias para el cáncer, particularmente cuando se combina con uno o más de otros agentes anticancerígenos existentes.
Como en los ejemplos previos, Tubercin-5 de la presente invención es un agente anticancerígeno extraordinariamente eficaz que es seguro para usar sin efectos secundarios adversos.

Claims (4)

1. Una mezcla de polisacáridos que consiste esencialmente en manosa, arabinosa, glucosa y galactosa como constituyentes de la misma extraídos de Mycobacterium tuberculosis, en la que cada uno de los polisacáridos tiene un peso molecular de 7.000 o menos y comprende una de las siguientes estructuras:
7
en las que l, m, n, o y p son individualmente un número entero; y X es una cadena de residuos de glucosa y galactosa.
2. La mezcla de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el peso molecular de los polisacáridos varía de 2.500 a 3.500.
3. Un procedimiento para la preparación de la mezcla de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de:
(a)
cultivar Mycobacterium tuberculosis en un medio, calentar el cultivo diluido con agua a una temperatura que varía de 50 a 150ºC, bajo una presión que varía de 10 a 300 psi, y retirar residuos bacterianos de la solución de cultivo calentada.
(b)
añadir un compuesto seleccionado del grupo que consiste en sulfato amónico, sulfato sódico, ácido sulfosalicílico y ácido fosfotúngstico a la solución restante para formar un precipitado y retirar el precipitado de la solución resultante;
(c)
dializar la solución restante para obtener un producto de diálisis;
(d)
añadir un alcohol al producto de diálisis para obtener un precipitado, lavar el precipitado con una mezcla de alcohol-éter y extraer el precipitado lavado con un disolvente orgánico; y
(e)
purificar el extracto para obtener la mezcla de carbohidratos.
\newpage
4. Una composición farmacéutica para tratar un síntoma canceroso, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la mezcla de acuerdo con la reivindicación 1, y un portador farmacéuticamente aceptable.
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