JPH06248003A - 多糖体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】クロレラ属の単細胞緑藻が細胞外に産生する多
糖体であって、抗腫瘍作用を有し、かつ精製した状態で
少なくとも全中性糖中の80重量％のガラクトースを構成
糖として含有する多糖体。クロレラ属の単細胞緑藻を培
養液中で培養した後、この培養液を遠心して上清を分離
し、分離した上清から分子量15,000〜 25,000 の画分を
精製することにより製造できる。 【効果】抗腫瘍作用を有する新規多糖体が得られる。こ
の多糖体はクロレラ属の単細胞緑藻が培養液中に産生す
るものなので分離・精製が容易であり、生産性も高く安
価に製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、クロレラ属の単細胞
緑藻が細胞外に産生する新規多糖体に関し、とりわけ抗
腫瘍作用を有する多糖体に係る。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】従
来、抗腫瘍作用を示す多糖体として、一般にキノコや細
菌由来のものがよく知られているが、クロレラ属の単細
胞緑藻が細胞外に産生する物質の中にも抗腫瘍作用を示
すものが知られている。例えば、特開平 4-300898 号公
報には抗腫瘍作用を示す糖タンパク複合体が、また特開
昭 61-96992 号公報には同じく抗腫瘍作用を示す粘質ヘ
テロ多糖が開示されている。

【０００３】この発明は、クロレラ属の単細胞緑藻が細
胞外に産生する、抗腫瘍作用を示す多糖体であって、ガ
ラクトースをその主要な構成成分とする多糖体を提供す
ることを目的とする。従来、クロレラ属の単細胞緑藻が
細胞外に産生する多糖体で、抗腫瘍作用を示し、かつガ
ラクトースを主要な構成成分とするものは知られていな
い。したがって、本発明による多糖体は新規の多糖体で
ある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、クロレラ
属の単細胞緑藻（以下、単にクロレラと称することがあ
る）が培養液中に産生する多糖体の研究を行ない、特定
の多糖体が抗腫瘍作用を示すことを見出した。この多糖
体についてさらに詳細に検討したところ、この多糖体が
精製した状態で少なくとも全中性糖中の80重量％のガラ
クトースを構成糖として含む新規多糖体であることを見
出し、この発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、この発明による多糖体は、クロ
レラ属の単細胞緑藻が細胞外に産生する多糖体であっ
て、抗腫瘍作用を有し、かつ精製した状態で少なくとも
全中性糖中の80重量％のガラクトースを構成糖として含
有することを特徴とする。

【０００６】また、この発明による多糖体の製造方法
は、培養液中でクロレラ属の単細胞緑藻を培養し、培養
後の培養液の上清を精製して分子量15,000ないし25,000
の画分を得ることを特徴とする。以下、この発明をさら
に詳細に説明する。

【０００７】前述のように、この発明の多糖体は、精製
した状態で構成糖として少なくとも全中性糖中の80重量
％のガラクトースを含有する。ただし、多糖体が若干の
夾雑物を含有することを排除するものではなく、その際
にはガラクトースの含有率が80重量％を下回ることもあ
り得る。また、分子量は15,000ないし25,000である。

【０００８】この発明の多糖体は、クロレラを培養する
ことにより細胞外（培地中）に産生される。クロレラを
培養する際に用いられる培地、培養条件等は特に限定さ
れるものではなく、常法により行なうことができる。例
えば、培養法としては、独立栄養性（Autotrophic ）、
従属栄養性（Heterotrophic ）または混合栄養性（Mixo
trophic ）のいずれの方法をも用いることができる。た
だし、培養の能率を考慮すると、従属栄養条件下または
混合栄養条件下で行なうことが好ましい。この発明の多
糖体の製造は、典型的には、以下の通りに行なわれる。

【０００９】まず、寒天斜面培地等に保存しておいた種
株を坂口フラスコにとり、小規模液体培養を行なう。そ
の後、一般的なクロレラの液体培養用培地を用いて、徐
々にスケールアップしながら数日間ないし数週間培養を
行なう。次に、得られたクロレラ培養液を遠心により上
清とクロレラ細胞とに分離する。

【００１０】この発明の多糖体は分離された上清中に含
まれる。したがって、得られた上清をそのまま抗腫瘍剤
として利用することもできるが、限外濾過、透析、ゲル
濾過クロマトグラフィー等を用いて精製することが好ま
しい。

【００１１】この発明の多糖体を抗腫瘍剤として利用す
る際には、薬剤学的に許容し得る添加剤を多糖体に添加
することができる。添加剤としては、通常医薬に用いら
れる添加剤を使用することができる。例えば、錠剤、散
剤として用いる場合には、乳糖、白糖、ブドウ糖、デン
プン等と任意に混合することができる。また、注射剤と
して用いる場合には、生理食塩水に溶解し、アンプルに
収容して製剤化することができる。

【００１２】培養の際にクロレラ以外の微生物が混入す
ると、クロレラの増殖や産生能に悪影響を及ぼすことが
ある。したがって、他の微生物が混入しないように、培
養に用いられる各機器類や培養液等の滅菌および取扱い
には十分注意を払うことが望ましい。

【００１３】

【実施例】

実施例１ クロレラの培養および多糖体の調製

【００１４】寒天斜面培地に保存しておいたクロレラの
種株（クロレラ工業社内番号ＣＫ−２０６）を坂口フラ
スコに１白金耳接種し、 5日間振とう培養した。次に、
培養液を10リットルのジャーファメンターに移して 4日
間培養し、培養液を回収した。ここで使用した培地の組
成および培養条件は以下の通りである。 培地組成（培地１リットル当り） グルコース 40 ｇ 硫酸アンモニウム 2.2ｇ リン酸一カリウム 1.0ｇ 硫酸マグネシウム 1.0ｇ 鉄−ＥＤＴＡ 30 ｍｇ アーノンＡ5 溶液 6 ｍｌ イ−ストエキス 10 ｍｇ ビタミンＢ1 20 μｇ 培養条件 ｐＨ 7.0（ＮａＯＨにより調整） 30℃

【００１５】得られたクロレラ培養液を6000ｒｐｍで15
分間遠心し、目的とする多糖体を含有する上清とクロレ
ラ細胞とに分離した。この上清から、ＰＴＨＫ膜（Mill
ipore Laboratory社製）を用いる限外濾過により多糖体
画分を得た後、これを凍結乾燥した。収量は培養液１リ
ットル当り 0.8〜 1.2ｇであった。 実施例２ 多糖体の精製とその化学的性状 実施例１で得られた多糖体画分を以下に示す方法で精製
した。

【００１６】まず、多糖体画分 5ｇを 0.1Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ 6.81 ）に溶解し、これをSephacryl S-300 HR
（Pharmacia 社製）を用いるゲル濾過クロマトグラフィ
−に流して２番目に溶出した抗腫瘍活性の高い画分を分
取した。この画分を脱塩した後、凍結乾燥し、目的とす
る多糖体 4.2ｇを得た。次に、得られた多糖体の化学的
性状を調べるために以下の測定を行なった。 ａ）一般分析

【００１７】糖はフェノール・硫酸法、タンパクはＬｏ
ｗｒｙ法、並びに脂質はクロロホルム・メタノール抽出
による重量法により測定した。10種のサンプルを測定し
て得られた結果の平均値を下記表１に示す。なお、糖は
ガラクトース換算、タンパクは牛血清アルブミン換算で
示した。 表 １ −−−−−−−−−−−−−−−−− 糖 ９４２μｇ／ｍｇ タンパク 痕跡 脂質 痕跡 −−−−−−−−−−−−−−−−− ｂ）糖組成

【００１８】中性糖は、 2.5Ｎトリフルオロ酢酸を用い
て 100℃で 7時間加水分解した後、トリフルオロ酢酸誘
導体としてガスクロマトグラフィーにより測定した。５
種のサンプルを測定して得られた結果の平均値を下記表
２に示す。 表 ２ −−−−−−−−−−−−−−−−− 成 分 ％ −−−−−−−−−−−−−−−−− ガラクトース ８６．７ マンノース ３．５ グルコース ３．０ ラムノース １．０ アラビノース 痕跡 −−−−−−−−−−−−−−−−− ウロン酸 陽性 −−−−−−−−−−−−−−−−− ウロン酸については、硫酸・カルバゾール反応により測
定を行なったが、他の糖の影響が強く、定量的な測定を
行なうことができなかった。

【００１９】なお、測定を行なった５種のサンプルにお
ける各糖成分の割合は、ガラクトースが81.4〜91.9％、
マンノースが 3.2〜 3.8％、グルコースが 2.8〜 3.2、
ラムノースが 0.9〜 1.1の範囲にあった。 ｃ）赤外線吸収スペクトル 多糖体の赤外線吸収スペクトルを図１に示す。測定は以
下に示す条件で行なった。 使用機器： Nicoret FT-520 ＫＢｒ錠剤法 分解能： 4ｃｍ^-1 スキャン回数： 128 ｄ）分子量 以下に示す条件で行なったゲル濾過クロマトグラフィー
の測定結果から、分子量既知の種々のプルランをマーカ
ーとして分子量を決定した。 測定条件 ａ）カラム：Sephacryl S-300 HR（10× 460ｍｍ） ｂ）溶出液： 0.1Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ6.81） ｃ）検出器：示差屈折計

【００２０】具体的には、種々の分子量のプルランを用
いて分子量とクロマトグラフィーの保持時間との関係を
示すグラフ（検量線）を予め作成し、同じ条件下で測定
した多糖体の保持時間から分子量を求めた。多糖体のゲ
ル濾過クロマトグラフィーの結果を示すチャートを図２
に、３種のプルラン（Ｐ-200（ＭＷ＝ 186,000）、Ｐ-5
0 （ＭＷ＝ 48,000 ）、Ｐ-5（ＭＷ＝ 4,800））を用い
て作成した分子量と保持時間との関係を示す検量線を図
３にそれぞれ示す。これらの結果より算出された多糖体
の分子量は15,000〜25,000であり、平均分子量は 20,00
0 であった。 ｅ）溶解性 水に易溶であった。 実施例３ 毒性試験

【００２１】6週齢の雌性ＩＣＲマウス30匹を10匹ずつ
3群に分け、うち 2群にそれぞれ腹腔内注射および皮下
注射により多糖体を投与し、残りの 1群は非投与（対
照）として毒性試験を行なった。多糖体の投与濃度は 5
ｍｇ／ｍｌ（生理食塩水）とし、 1匹当り 0.2ｍｌを２
日毎に 1回投与して平均体重の変化を測定した。結果を
下記表３に示す。 表 ３ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 平均体重 投与法 −−−−−−−−−−−−−−−−−− 開始時 ７日後 １４日後 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 非投与（対照） ２１．６ ２４．９ ２７．５ 腹腔内注射 ２１．９ ２４．９ ２７．１ 皮下注射 ２１．１ ２４．４ ２７．０ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

【００２２】表３から明らかなように、対照群と投与群
との間には平均体重に差は見られなかった。また、いず
れの群においても、平均体重の測定結果に異常は認めら
れなかった。したがって、この発明の多糖体には毒性が
ないことが明らかである。 実施例４ ザルコーマ180 に対する抗腫瘍効果

【００２３】8週齢の雌性ＩＣＲマウスを用いてザルコ
ーマ180 に対する抗腫瘍効果を試験した。試験は、ザル
コーマ180 を 1×10⁶ 細胞ずつ腹腔内に接種したマウス
60匹を10匹ずつ 6群に分け、各群に対して下記表４に示
す投与方法で試料を投与して、接種後の平均生存日数を
測定することにより行なった。

【００２４】試料の投与濃度は 1ｍｇ／ｍｌ（生理食塩
水）とし、 1匹当り 0.2ｍｌを腫瘍移植の翌日から 1日
1回ずつ計10回投与した。ただし、経口投与のみは投与
濃度を10ｍｇ／ｍｌとした。

【００２５】また、同時に、培養したクロレラの細胞内
から抽出した内容物（抽出物）についても、上と同様に
ザルコーマ180 を接種した雌性ＩＣＲマウス20匹を用い
て同じ条件で試験を行なった。結果を下記表４に示す。 表 ４ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 投与法 平均生存日数（日） 延命効果^* （％） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 多糖体 非投与（対照） １６．５ ０ 腫瘍内注射 ３４．４ １０８．５ 静脈内注射 ３０．０ ８１．８ 腹腔内注射 ２５．５ ５４．５ 皮下注射 ２２．２ ３４．５ 経口投与 １９．０ １５．２ 抽出物 腫瘍内注射 ２９．９ ８１．２ 経口投与 １８．２ １０．３ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ＊延命効果＝（試験群の平均生存日数−対照群の平均生
存日数）×１００／（対照群の平均生存日数）

【００２６】表４より明らかなように、この発明による
多糖体についてはいずれの投与方法においても延命効果
が認められ、なかでも腫瘍内注射において非常に高い延
命効果が認められた。また、クロレラ細胞からの抽出物
も、多糖体よりは活性は弱いものの、延命効果が認めら
れた。 実施例５ Ｍｅｔｈ Ａ 繊維肉腫に対する抗腫瘍効果

【００２７】8週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて
Ｍｅｔｈ Ａ 繊維肉腫に対する抗腫瘍効果を試験し
た。試験は、Ｍｅｔｈ Ａ 繊維肉腫を 3×10⁶ 細胞ず
つ皮下に接種したマウス50匹を10匹ずつ 5群に分け、各
群に対して下記表５に示す投与方法で試料を投与して、
接種後13日目の腫瘍の大きさを測定することにより行な
った。試料の投与濃度は 1ｍｇ／ｍｌ（生理食塩水）と
し、 1匹当り 0.2ｍｌを腫瘍移植の 2日後から 2日に 1
回ずつ投与した。結果を下記表５に示す。 表 ５ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 投与法 腫瘍の大きさ^* 腫瘍増殖抑制率^** 完全退縮個体数 （mm² ） （％） （匹） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 非投与（対照） ３２５ ０ ０ 腫瘍内注射 ７１ ７８．２ ５ 静脈内注射 １１５ ６４．６ ４ 腹腔内注射 １２２ ６２．４ ４ 皮下注射 １８２ ４３．６ ２ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ＊ 腫瘍の大きさ＝13日後の腫瘍の長径（mm）×短径
（mm） ＊＊腫瘍増殖抑制率＝（対照群の腫瘍の大きさ−試験群
の腫瘍の大きさ）×１００／（対照群の腫瘍の大きさ）

【００２８】表５より明らかなように、この発明の多糖
体はいずれの投与法においても腫瘍増殖抑制効果がみら
れる。特に、腫瘍内注射により投与した場合に最も高い
抑制効果が認められ、完全退縮個体数も群全体の半数に
及んでいる。

【００２９】

【発明の効果】以上のように、この発明によると、クロ
レラ属の単細胞緑藻が細胞外に産生し、抗腫瘍作用を有
する新規多糖体が提供される。この発明の多糖体は、細
胞外、すなわち培養液中に産生されるので分離・精製が
容易であり、加えて生産性も高く、安価に製造すること
ができる。クロレラの培養液は従来廃棄していたもので
あり、この発明は産業廃棄物の有効利用という観点から
も有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明による多糖体の赤外吸収スペクトルを
示す図。

【図２】カラムに Sephacry S-300 HR、溶出液にリン酸
緩衝液（ｐＨ6.81）を用いて行なった、この発明の多糖
体のゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図。

【図３】分子量とゲル濾過クロマトグラフィーにおける
保持時間との関係を、分子量マーカーとしての３種のプ
ルランについて示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 安藤 洋太郎 福岡県久留米市津福本町660 (72)発明者 佐野 利彦 福岡県久留米市国分町1012−６ (72)発明者 奥田 正男 福岡県春日市春日９−64

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 クロレラ属の単細胞緑藻が細胞外に産生
   する多糖体であって、抗腫瘍作用を有し、かつ精製した
   状態でガラクトースを少なくとも全中性糖中の80重量％
   含有する多糖体。
2. 【請求項２】 培養液中でクロレラ属の単細胞緑藻を培
   養し、該培養液の上清を精製して分子量15,000ないし2
   5,000の画分を得ることを特徴とする請求項１記載の多
   糖体の製造方法。
3. 【請求項３】 請求項１記載の多糖体を主成分として含
   有する抗腫瘍剤。