ES2205519T3

ES2205519T3 - Composicion antifungica.

Info

Publication number: ES2205519T3
Application number: ES98933769T
Authority: ES
Inventors: Andrew James Zeneca Agrochemicals Greenland; Angel Manuel Zeneca Agrochemicals Fuentes Mateos
Original assignee: Syngenta Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2018-07-09
Also published as: EP0999750A1; DE69819731T2; JP2002503113A; WO1999002038A1; US6599514B1; DK0999750T3; EP0999750B1; GB9714564D0; CA2291714A1; ATE253827T1; DE69819731D1; AU8347198A; PT999750E

Abstract

La invención se refiere a composiciones fungicidas que tienen actividad fungicida mejorada y comprenden un agente fungicida y un aditivo alimentario. La invención también se refiere a procedimientos para inhibir el crecimiento de hongos empleando las composiciones con actividad mejorada y al empleo de un aditivo alimentario para mejorar las propiedades fungicidas de un agente fungicida.

Description

Composición antifúngica.

Ámbito técnico

La presente invención se refiere a una composición que muestra actividad antifúngica aumentada, que comprende uno o más agentes antifúngicos y uno o más aditivos para alimentos según las reivindicaciones, al uso de aditivos para alimentos para aumentar las propiedades antifúngicas de un agente antifúngico y a un método para inhibir el crecimiento fúngico usando una composición según la invención.

Antecedentes de la invención

La contaminación en productos alimenticios debida a la presencia de organismos comunes que estropean los alimentos es un problema recurrente en la industria alimentaria. Lo más sorprendentemente, se ha observado un aumento en la actividad antifúngica cuando se combinan agentes antifúngicos con aditivos para alimentos comúnmente usados. Además, donde el aditivo para alimentos muestra actividad antifúngica, se ha observado un efecto aumentado por el cual la actividad antifúngica de la mezcla es mayor que lo que se podría esperar. Este aumento o efecto sinérgico hace posible usar una cantidad reducida de compuesto antifúngico y/o aditivo para alimentos presente en un producto alimenticio. Esto es particularmente ventajoso puesto que es altamente deseable minimizar la cantidad de cualquier aditivo presente en productos alimenticios tanto para el consumo humano como animal.

Sumario de la invención

De acuerdo con esto, en un primer aspecto, la invención crea una composición antifúngica que comprende uno o más agentes antifúngicos y uno o más aditivos para alimentos, con la condición de que dicha composición no contenga nisina, lactoferrina y sus derivados, tricorzianina o lisozima; siendo las cantidades relativas del (de los) agente(s) antifúngico(s) y del (de los) aditivo(s) para alimentos tales como para aumentar la actividad antifúngica global de la composición.

El aditivo para alimentos también puede exhibir cierta actividad antimicrobiana, especialmente actividad antifúngica, cuando se usa aisladamente, como se observa, por ejemplo, con los conservantes para alimentos, y en este caso la combinación del agente antifúngico y el aditivo para alimentos dará como resultado un efecto sinérgico donde la actividad antifúngica de la mezcla será mayor que la observada para cada uno aisladamente y comparada con la suma de los resultados individuales. Será fácilmente evidente para alguien experto en la técnica que, en este caso, el agente antifúngico y el aditivo para alimentos presentes en la composición no son los mismos, es decir, son diferentes. La invención por lo tanto se extiende a una composición antifúngica que comprende uno o más agentes antifúngicos y uno o más aditivos para alimentos, siendo las cantidades relativas de agente(s) antifúngico(s) y aditivo(s) para alimentos tales como para producir un efecto sinérgico. La invención se extiende además al uso de la composición sinérgica en los métodos de la invención descritos más adelante adicionalmente en esta invención.

En una realización preferida, la invención crea una composición antifúngica que comprende uno o más agentes antifúngicos y uno o más aditivos para alimentos, en la que uno o más de dicho(s) aditivo(s) para alimentos muestra(n) actividad antimicrobiana, con la condición de que dicha composición no contenga nisina, lisozima o lactoferrina y sus derivados; siendo las cantidades relativas del (de los) agente(s) antifúngico(s) y del (de los) aditivo(s) para alimentos tales como para producir un efecto sinérgico sobre la actividad antifúngica global de la composición.

En otra realización preferida, la invención crea una composición que comprende uno o más agentes antifúngicos y uno o más aditivos para alimentos según la reivindicación 1, que son seleccionados del grupo que consiste en agentes quelantes de metales, agentes humectantes, coadyuvantes, antioxidantes, colorantes, emulsionadores, estabilizadores, tensioactivos, agentes de blanqueo, agentes de control del pH, aromas y potenciadores del aroma, secuestrantes y conservantes para alimentos, con la condición de que dicha composición no contenga nisina, lactoferrina y sus derivados, tricorzianina o lisozima; siendo las cantidades relativas de agente antifúngico y aditivo para alimentos tales como para aumentar la actividad antifúngica global de la composición.

En otro aspecto, la invención crea el uso de un aditivo para alimentos para aumentar las propiedades antifúngicas de un agente antifúngico.

Como se usa en esta invención, el término aumentar se usa para indicar una mejora en la actividad antifúngica y esto se puede evidenciar, por ejemplo, mediante una reducción observada en la concentración de agente antifúngico requerida para dar una fuerte inhibición del crecimiento fúngico, por ejemplo, mayor que 90% de inhibición del crecimiento fúngico. Como se usa en esta invención, el término sinérgico se usa para indicar una mejora en la actividad antifúngica que se puede demostrar que es sinérgica, por ejemplo, mediante la aplicación de la fórmula de Colby (Colby S.R. (1967) Weeds 15, 20-22) o en la representación gráfica en isobologramas, como se describe por Parrish y Davidson (1993) (En: Antimicrobials in foods, Ed. By P. M. Davidson y A. L. Branen, Marcel Dekker, Inc., Nueva York.

Ejemplos de aditivos para alimentos incluyen los siguientes aditivos para alimentos comúnmente usados: ácido sórbico y sorbatos (E200-E203), ácido benzoico y benzoatos (E210-E213), hidroxibenzoatos (E214-E219), dióxido de azufre y sulfitos (E220-E228), bifenilo y sus derivados (E230-E232), nitritos (E249-E250), nitratos (E251-E252), ácido láctico (E270), lactatos (E325-E327), ácido cítrico y citratos (E330-E333), ácido tartárico y tartratos (E334-E337), ácido ortofosfórico y ortofosfatos (E338-E341), malatos (E350-E352), ácido adípico (E355), ácido succínico (E363), 1,4-heptanolactona (E370), ácido nicotínico (E375), citrato triamónico (E380), citrato férrico-amónico (E381), EDTA disódico cálcico (E385), glicerina (E422), di-, tri- y polifosfatos (E450a, E450b, E450c), ácidos grasos (E470), mono y diglicéridos de ácidos grasos (E471), ésteres de mono- y diglicéridos de ácidos grasos (E472a-E472f), carbonatos (E500, E501, E503, E504), gluconatos (E576-E578), cloro (E925), hexametafosfato sódico, hidroxianisol butilado (BHA)(E320), hidroxitolueno butilado (BHT)(E321), t-butilhidroquinona (THBQ), galato de propilo, heptonato cálcico, fitato cálcico, dietil-éter, EDTA, EDTA disódico dihidrógeno, acetato de etilo, mono-, di- y triacetatos de glicerina, glicina, oxiestearina, propan-1,2-diol y propan-2-ol, y heptonato sódico.

Los aditivos para alimentos particularmente preferidos incluyen ácido sórbico y sorbatos (E200-E203), ácido benzoico y benzoatos (E210-E213), hidroxibenzoatos (E214-E219), ácido acético y acetatos (E260-E263), ácido láctico (E270), lactatos (E325-E327), ácido cítrico y citratos (E330-E333), ácido tartárico y tartratos (E334-E337), ácido ortofosfórico y ortofosfatos (E338-E341), malatos (E350-E352), ácido adípico (E355), ácido succínico (E363), ácido nicotínico (E375), EDTA disódico cálcico (E385), ácidos grasos (E470), mono y diglicéridos de ácidos grasos (E471), ésteres de mono- y diglicéridos de ácidos grasos (E472a-E472f), EDTA, EDTA disódico dihidrógeno, acetato de etilo, mono-, di- y triacetatos de glicerina.

Otros aditivos preferidos incluyen hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado y terc-butilhidroquinona.

Se ha encontrado que, cuando se usan agentes antifúngicos en presencia de iones calcio, se observa una reducción significativa en la actividad del agente antifúngico. Esta observación podría restringir la utilidad de la tecnología en alimentos ricos en calcio, tales como productos lácteos. Se ha encontrado ahora que eel problema asociado con alto niveles de calcio se puede superar mediante el uso de agentes quelantes en asociación con el agente antifúngico y, lo más sorprendentemente, que la presencia del agente quelante aumenta la actividad del agente antifúngico. Además, se ha encontrado que es posible conseguir esto con niveles de agentes quelantes, especialmente EDTA y sus sales, que sean sustancialmente menores que los recomendados por la bibliografía para obtener quelación eficaz.

Ejemplos de aditivos para alimentos particularmente preferidos son los agentes quelantes de metales tales como EDTA y su uso como sales disódica o cálcica disódica; disolventes y agentes humectantes tales como ácidos orgánicos, por ejemplo, ácido láctico; coadyuvantes; y conservantes para alimentos, incluyendo agentes que permeabilizan la membrana tales como, por ejemplo, ácido sórbico y su uso como sales cálcica, sódica o potásica, ácido benzoico y su uso como sales sódica, potásica o cálcica, antioxidantes tales como galato de propilo y éteres de alquilo de C_{1-6}, tales como hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado y terc-butilhidroquinona.

El uso de ácidos y sus derivados sales o ésteres o éteres de alquilo de C_{1-6} como aditivos para alientos es el más particularmente preferido.

Otros ejemplos de aditivos para alimentos se pueden encontrar en "Handbook of Food Additives", editado por Michael e Irene Ash, Gower (1995).

Los agentes antifúngicos que se prefieren particularmente para uso en la composición, los métodos y usos según la invención son los que son obtenibles de fuentes naturales. También se prefiere que los agentes antifúngicos sean estables al calor y preferiblemente también estables a la degradación proteolítica. Tal estabilidad es particularmente ventajosa puesto que los productos alimenticios se someten a veces a temperaturas muy altas durante la preparación, procesamiento y envasado. La composición antifúngica de la invención, por lo tanto, comprende preferiblemente uno o más agentes antifúngicos estables al calor.

Como se usa en esta invención, la expresión estable al calor se usa para indicar la retención de la actividad antifúngica después de incubación a 85ºC durante 20 minutos o a 90ºC durante 10 minutos, y la expresión estable a la degradación proteolítica se usa para indicar falta de susceptibilidad a la digestión por las proteasas comunes tales como la tripsina.

Además, se prefiere que los agentes antifúngicos ejerzan su actividad afectando a las membranas de la célula fúngica, tal como actuando como agentes que perturben la membrana. En una combinación particularmente preferida, el agente antifúngico es un agente que perturba la membrana que es estable al calor y estable a la degradación proteolítica.

En otro aspecto, la invención crea una composición antifúngica que comprende uno o más agentes antifúngicos, en la que uno o más de dichos agentes antifúngicos se deriva de una planta o sus semillas derivadas y uno o más aditivos para alimentos, en la que al menos uno de dichos aditivos para alimentos es un ácido o sus derivados sal o éster o un éter de alquilo de C_{1-6}, siendo las cantidades relativas del (de los) agente(s) antifúngico(s) y del (de los) aditivo(s) para alimentos tales como para aumentar la actividad antifúngica global de la composición.

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En una realización preferida del aspecto anterior de la invención, se crea una composición antifúngica en la que uno o más de dicho(s) aditivo(s) para alimentos muestra(n) actividad antifúngica; siendo las cantidades relativas del (de los) agente(s) antifúngico(s) y del (de los) aditivo(s) para alimentos tales como para producir un efecto sinérgico sobre la actividad antifúngica global de la composición.

En el aspecto anterior, el aditivo para alimentos se selecciona preferiblemente del grupo de EDTA, ácido sórbico, ácido láctico, ácido benzoico o un derivado sal o éster de los mismos, galato de propilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o terc-butilhidroquinona.

El agente antifúngico se deriva preferiblemente de plantas o semillas derivadas de las mismas que pertenecen a las familias de plantas tales como Brassicáceas, también conocidas como Crucíferas, Compuestas, Leguminosas, Amarantáceas, Hipocastanáceas, Saxifragáceas, Gramíneas, y Aliáceas, y más preferentemente de los géneros siguientes; Raphanus, Heuchera, Aesculus, Clitoria, Brassica, Briza, Sinapis, Cnicus, Allium, Amaranthus, Impatiens, Mirabilis y Capsicum, lo más preferiblemente de Raphanus, por ejemplo, Raphanus sativus; Sinapis, por ejemplo, Sinapis alba; Amaranthus, por ejemplo, Amaranthus caudatus; Impatiens, por ejemplo, Impatiens balsamina; Mirabilis, por ejemplo, Mirabilis japa; Brassica, por ejemplo, Brassica napus.

Ejemplos de agentes antifúngicos que son particularmente preferidos para uso en las composiciones, métodos y usos según la invención incluyen los capaces de ser aislados de fuentes naturales, tales como plantas y sus semillas derivadas, tales como, por ejemplo, las proteínas antifúngicas descritas en las solicitudes de patente internacional publicadas Nos. WO92/15691, WO92/21699, WO93/05153, WO93/04586, WO94/11511, WO95/04754, WO95/18229, WO95/24486, WO97/21814 y WO97/21815, que incluyen Rs-AFP1, Rs-AFP2, Dm-AMP1, Dm-AMP2, Hs-AFP1, Ah-AMP1, Ct-AMP1, Ct-AMP2, Bn-AFP1, Bn-AFP2, Br-AFP1, Br-AFP2, Sa-AFP1, Sa-AFP2, Cb-AMP1,
Cb-AMP2, Ca-AMP1, Bm-AMP1, Ace-AMP1, Ac-AMP1, Ac-AMP2, Mj-AMP1, Mj-AMP2, Ib-AMP1, Ib-AMP2, Ib-AMP3, Ib-AMP4, y los péptidos derivados de ellas o proteínas antifúngicas que muestren 85% de semejanza secuencial, preferiblemente mayor que 90% de semejanza secuencial, más preferiblemente mayor que 95% de semejanza secuencial, lo más preferiblemente 96%, 97%, 98% o 99% de semejanza secuencial con cualquiera de dichas proteínas y sean, lo más particularmente, aislables de sus variedades comestibles.

En una realización particularmente preferida de la invención, la composición antifúngica comprende uno o más de las proteínas o péptidos antifúngicos derivados de plantas y semillas listadas anteriormente, siendo particularmente ventajosas dichas proteínas antifúngicas debido a su estabilidad al calor y estabilidad a la degradación proteolítica.

Las composiciones particularmente preferidas según la invención y para uso en los métodos y usos de la invención comprenden una o más de las proteínas antifúngicas Rs-AFP2, Rs-AFP1, Sa-AFPs, Bn-AFPs, Mj-AMP2, Ac-AMP1, Ib-AMP1 o Ib-AMP2, o sus derivados o proteínas antifúngicas que muestren mayor que 85% de semejanza secuencial, preferiblemente mayor que 90% de semejanza secuencial, más preferiblemente mayor que 95% de semejanza secuencial, y uno o más de EDTA o una de sus sales, ácido láctico, sorbato potásico, benzoato sódico, galato de propilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o terc-butilhidroquinona.

La estructura, aislamiento y purificación de Rs-AFP2, Rs-AFP1, Bn-AFPs, Sa-AFPs, Ib-AMP1, Ib-AMP2,
Mj-AMP2, y Ac-AMP1 están descritos en las solicitudes de patente internacional publicadas Nos. WO93/05153,
WO95/24486, WO92/15691 y WO92/21699, respectivamente.

Como se usa en esta invención, el término derivados indica, inter alia, péptidos derivados de la secuencia de longitud completa tales como los descritos en la solicitud de patente internacional publicada Nº WO97/21815 y también aquellos donde los residuos hayan sido alterados con respecto a la secuencia natural, tales como los descritos en la solicitud de patente internacional publicada nº WO 97/21814.

En el contexto de la presente invención, dos secuencias de aminoácidos con al menos 85% de semejanza entre sí tienen al menos 85% de residuos de aminoácidos similares (idénticos o sustituidos de forma conservadora) en una posición similar cuando se alinean óptimamente permitiendo hasta 3 espacios, con la condición de que, respecto a los espacios, esté afectado un total no mayor que 15 residuos de aminoácido. Igualmente, dos secuencias de aminoácidos con al menos 90% de semejanza entre sí tienen al menos 90% de residuos de aminoácido idénticos o sustituidos de forma conservadora en una posición similar cuando se alinean óptimamente permitiendo hasta 3 espacios, con la condición de que, respecto a los espacios, esté afectado un total no mayor que 15 residuos de aminoácido.

Para el fin de la presente invención, un aminoácido conservador se define como uno que no altere la actividad/función de la proteína cuando se compara con la proteína sin modificar. En particular, se pueden hacer sustituciones conservadoras entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos:

(i)	Alanina, Serina, Glicina y Treonina
(ii)	Ácido glutámico y Ácido aspártico
(iii)	Arginina y Lisina
(iv)	Isoleucina, Leucina, Valina y Metionina
(v)	Fenilalanina, Tirosina y Triptófano.

La semejanza secuencial se puede calcular usando métodos muy conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, los descritos por Wilbur y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 726-730 (1983)), Meyers y Miller (Comput. Appl. Biosci., 4, 11-17, (1988)) o Watterman y Eggert (J. Mol. Biol. (1987), 197, 723-28). También se puede usar el método de un par MegAlign Lipman-Pearson (usando parámetros por defecto) que se puede obtener de DNAstar Inc., 1228 Selfpark Street, Madison, Wisconsin, 53715, Estados Unidos de América como parte del sistema Lasergene.

Ejemplos de otros agentes antifúngicos incluyen, por ejemplo, proteínas PR tales como quitinasas, glucanasas tales como beta 1,3- y beta 1,6-glucanasas, lectinas aglutinadas con quitina, zeamatinas, osmotinas, tioninas y proteínas que inactivan el ribosoma. Ejemplos de quitinasas y glucanasas apropiadas se pueden encontrar, por ejemplo, en la solicitud de patente europea publicada EP 440304; de osmotina en la solicitud de patente internacional publicada
nº WO91/18984; de quitinasa V en la solicitud de patente internacional publicada nº WO95/05467; de proteína aglutinada con quitina en la solicitud de patente internacional publicada nº WO94/08009; de beta 1,6 glucanasa en la solicitud de patente internacional nº PCT/EP98/02580.

Los agentes antifúngicos se puede sintetizar químicamente o producirse usando tecnología de ADN recombinante usando métodos muy conocidos en la técnica. Donde de produzcan agentes antifúngicos usando técnicas recombinantes en un microorganismo huésped, el huésped usado para la transformación y producción del agente deseado será un organismo GRAS. Los organismos GRAS son aquellos organismos tales como levadura, Pichia, bacterias de ácido láctico, y ciertas cepas de E. coli que están considerados por las Autoridades Reguladoras como que son "seguros". Las proteínas así producidas usando microorganismos GRAS se pueden purificar después y añadir a productos alimenticios en combinación con aditivos para alimentos. Los agentes antifúngicos también se pueden usar en forma de extractos, tales como extractos de semillas o plantas, donde el extracto contenga el agente antifúngico en forma parcialmente purificada o enriquecida, y el aditivo para alimentos se añade al extracto. Esto se describe más completamente en los ejemplos de esta invención.

Se ha encontrado que los métodos y composiciones de la invención son particularmente eficaces frente a los organismos comunes que deterioran los alimentos Fusarium culmorum, Penicillium chrysogenum, Penicillium roquefortii, Alternaria sp., Cladosporium sp., Trichoderma harzianum, Penicillium nalgiovense, Penicillium commune, Mucor plumbeus, Aspergillus versicolor y Scopulariopsis brevicaulis. Muestras de estos organismos están disponibles, por ejemplo, en The American Type Culture Collection (ATCC) en Rockville, Maryland, Estados Unidos de América.

En otro aspecto, la invención crea un método para inhibir el crecimiento fúngico en productos alimenticios que comprende exponer un ambiente en el que dicho crecimiento va a ser inhibido a una cantidad eficaz desde el punto de vista fungicida de una composición antifúngica según cualquiera de los anteriores aspectos de la invención.

Todavía en otro aspecto, la invención crea un método para inhibir el crecimiento fúngico en productos alimenticios que comprende aplicar a un producto alimenticio o al lugar de un producto alimenticio una cantidad eficaz desde el punto de vista fungicida de una composición antifúngica según cualquiera de los anteriores aspectos de la invención.

El método y las composiciones de la invención son particularmente apropiadas para uso con una amplia gama de alimentos y bebidas, incluyendo frutas y mermeladas y productos lácteos tales como yogures, quesos, postres cremosos y batidos de leche. Las composiciones antifúngicas según la invención están en una forma apropiada para el uso con productos alimenticios para consumo humano y animal. Otros componentes de la composición se pueden elegir según la naturaleza del producto alimenticio y su método de consumo y esto será fácilmente evidente para alguien experto en la técnica.

El ambiente en el que se desea inhibir el crecimiento fúngico se puede exponer a la composición que comprende el agente antifúngico y el aditivo para alimentos de diversas formas que estarán determinados, lo más normalmente, por la naturaleza del producto alimenticio que se va a proteger. El producto alimenticio y la composición de la invención pueden, por ejemplo, mezclarse juntos durante el proceso de fabricación. Alternativa o adicionalmente, el recipiente en el que se envasa el producto alimenticio se puede pulverizar con la composición antes de que sea añadido el producto alimenticio y/o pulverizar con la composición después del envasado y/o llenado. La composición de la invención también se puede usar junto con productos de revestimiento, por ejemplo, cera para el queso.

En otra realización preferida, la composición antifúngica muestra actividad antifúngica frente a uno o más de Fusarium culmorum, Penicillium chrysogenum, Penicillium roquefortii, Alternaria sp., Cladosporium sp., Trichoderma harzianum, Penicillium nalgiovense, Penicillium commune, Mucor plumbeus, Aspergillus versicolor y Scopulariopsis brevicaulis.

Las proteínas antifúngicas Rs-AFP2, Ib-AMP1, Ib-AMP2, Mj-AMP2, Bn-AFPs, Sa-AFPs y Ac-AMP1 han sido ensayadas como proteínas purificadas y como extractos de semillas en combinación con diferentes aditivos para alimentos frente a cepas de hongos que estropean los alimentos. Ejemplos de aditivos para alimentos que han sido identificados como que potencian la actividad antifúngica cuando se combinan con las proteínas antifúngicas se listan en la Tabla 1 que también incluye una indicación de las cantidades máximas permitidas actualmente en diferentes productos alimenticios. La relación del agente antifúngico y el aditivo para alimentos será generalmente tal que el nivel de aditivo para alimentos en la composición según la invención será significativamente menor que la concentración máxima permitida. Por ejemplo, el aditivo para alimentos puede estar presente en la composición a o entre un nivel dos hasta cien veces menor, más preferiblemente cuatro hasta cincuenta veces menor, y lo más preferentemente cuatro hasta diez veces menor, que la concentración máxima permitida para un producto alimenticio particular.

El agente antifúngico y el aditivo para alimentos estarán generalmente presentes en las composiciones según la invención y para uso en el método de la invención en una relación respectiva desde 1:0,5 hasta 1:900.000, más preferiblemente desde 1:10 hasta 1:10.000, y lo más preferiblemente desde 1:5 hasta 1:500.

TABLA 1 Cantidades máximas permitidas en alimentos de los aditivos que han demostrado que tienen efecto antifúngico sinérgico cuando se combinan con diferentes AFPs.

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Breve descripción de los dibujos

La invención se ilustra adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos y figuras, en los que:

La Figura 1 muestra un isobolograma de la combinación de Ib-AMP1 con Na_{2}H_{2}EDTA frente a P. chrysogenum

La Figura 2 muestra un isobolograma de la combinación de Ac-AMP1 con sorbato de K frente a P. roquefortii

La Figura 3 muestra un isobolograma de la combinación de Rs-AFP2 con sorbato de K frente a P. roquefortii

La Figura 4 muestra un isobolograma de la combinación de Ib-AMP1 con benzoato de Na frente a P. chrysogenum

La Figura 5 muestra un isobolograma de la combinación de Ib-AMP1 con ácido láctico frente a P. chrysogenum

La Figura 6 muestra un isobolograma de la combinación de Ib-AMP1 con BHA frente a P. chrysogenum

La Figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos para Rs-AFP1, Rs-AFP2, Dm-AMP1 y Dm-AMP2, Hs-AFP1, Ah-AMP1, Ct-AMP1, Bn-AFP1, Bn-AFP2, Br-AFP1, Br-AFP2, Sa-AFP1, Sa-AFP2, Cb-AMP1, Cb-AMP2,
Ca-AMP1, Bm-AMP1, Ace-AMP1, Ac-AMP1, Ac-AMP2, Mj-AMP1, Mj-AMP2, Ib-AMP1, Ib-AMP2, Ib-AMP3 e Ib-AMP4.

Descripción detallada de la invención Ejemplos Materiales y métodos Materiales

Se obtuvieron semillas de Raphanus sativus, Amaranthus caudatus, Mirabilis jalapa, e Impatiens balsamina de Ciltern Seeds (Cumbria, Reino Unido). Semillas de Brassica napus y Sinapis alba fueron donadas amablemente por Cargill, Plc. En todos los experimentos se usaron microplacas de 96 pocillos, de fondo plano y no estériles. El benzoato de Na fue suministrado amablemente por Pfizer Ltd. El sorbato de K se obtuvo de Hoechst. El EDTA y sus sales de Na y CaNa_{2} fueron comprados en SIGMA.

Ensayos antifúngicos

Se llevaron a cabo ensayos de rutina con 20 \mul de solución de ensayo y 80 \mul de una suspensión de esporas fúngicas (1 x 10^{4} esporas/ml) en Medio A (caldo de dextrosa de patata de concentración media o CDP 1/2) o Medio B (CDP 1/2 suplementado con CaCl_{2} 1 mM y KCl 50 mM). Los microcultivos testigos contenían 20 \mul de agua destilada estéril y 80 \mul de suspensión de esporas fúngicas.

A menos que se diga de otra forma, la incubación se llevó a cabo a 24ºC durante 48 horas. Los porcentajes de crecimiento fúngico se estimaron por examen microscópico de las microplacas después del periodo de incubación. Los microcultivos testigos se usaron como referencia con el fin de estimar la inhibición del crecimiento fúngico. La concentración mínima de proteína o compuesto químico requerida para dar una inhibición del crecimiento fúngico fuerte, por ejemplo, mayor que 90% de inhibición de crecimiento fúngico, se tomó como la concentración inhibitoria mínima (CIM) de la proteína o compuesto considerados.

Purificación de proteínas antifúngicas

La purificación de las proteínas antifúngicas Ac-AMP1, Mj-AMP1, Rs-AFP2, Ib-AMP1 e Ib-AMP2 se llevó a cabo como se describe por Broekaert et al. (1992, Biochem., 31, 4308-4314), Bruno et al. (1992, J. Biol. Chem., 267, 4, 2228-2233), Terras et al. (1992, J. Biol. Chem., 267, 22: 15301-15309) y por Broekart et al. (en la solicitud de patente internacional publicada nº WO95/24486), respectivamente.

Resultados Potencia antifúngica de las proteínas antifúngicas

La potencia antifúngica de las proteínas purificadas se ensayó en diferentes hongos que estropean los alimentos usando el ensayo descrito anteriormente. El crecimiento de los hongos, la recogida y recolección de las esporas fúngicas se hicieron como se describe previamente (Broekaert et al, 1990, FEMS Microbiol. Lett., 69:55-60).

Se usaron las siguientes cepas fúngicas: Fusarium culmorum, Penicillium chrysogenum, Penicillium roquefortii, Penicillium commune, Penicillium nalgiovense, Mucor plumbeus, Scopulariopsis breviccaulis, Aspergillus versicolor, Alternaria sp., Cladosporium sp. y Trichoderma harzianum.

Se aplicaron diluciones en serie de las proteínas antifúngicas en agua doblemente destilada a las suspensiones de esporas fúngicas preparadas o en el medio de crecimiento A (caldo de dextrosa de patata de concentración media, CDP 1/2) o medio B (medio A suplementado con CaCl_{2} 1 mM y KCl 50 mM). El porcentaje de inhibición del crecimiento se estimó por inspección microscópica de las placas de microtitulación, tomando el testigo de microcultivo sin proteína antifúngica añadida como referencia para el crecimiento fúngico normal. La concentración mínima requerida para inhibir fuertemente el crecimiento fúngico, por ejemplo, mayor que 90% de inhibición del crecimiento, después de 48 horas de incubación (valor de CIM) se calculó así.

Los resultados obtenidos para Ib-AMP1 y Rs-AFP2 frente a una gama de cepas de hongos en ambos medios A y B se resumen en la Tabla 2. Ambos péptidos muestran un amplio espectro de actividad frente a las cepas fúngicas ensayadas. En el de concentración iónica baja (medio A), los valores de CIM están generalmente por debajo de 25 \mug/ml. La actividad de los péptidos es sensible a las condiciones iónicas usadas en el ensayo, y en el medio altamente salino (medio B) su actividad está reducida.

TABLA 2 Comparación de las actividades antifúngicas de Rs-AFP2 e Ib-AMP1 en el medio A de baja salinidad (CDP 1/2) y en el medio B (medio A que contiene CaCl_{2} 1 mM y KCl 50 mM).

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Potencia antifúngica de la combinación de proteínas antifúngicas y aditivos para alimentos a) Potencia antifúngica de la combinación de proteína antifúngica/EDTA

El aditivo para alimentos EDTA se usa en alimentos como un antioxidante debido a su papel para quelar cationes metálicos. No se han asignado propiedades antifúngicas al EDTA a las concentraciones usadas en alimentos. No obstante, la combinación de una proteína antifúngica con EDTA en el medio B tuvo como resultado una actividad antifúngica aumentada frente a la cepa fúngica ensayada, Penicillium chrysogenum y Penicillium roquefortii. Algunos de los resultados observados han sido resumidos en la Tabla 3 siguiente. La potenciación de las actividades de las proteínas antifúngicas por el EDTA y sus sales en el medio que contiene CaCl_{2} 1 mM y KCl 50 mM son capaces de proporcionar fuerte inhibición del crecimiento fúngico in vitro después de 48 horas de incubación a 24ºC con concentraciones de ambos agentes que son mucho menores que las requeridas si fueran usados individualmente. De manera similar, la aplicación de combinaciones de las proteínas antifúngicas junto con otros aditivos para la conservación de alimentos permitirá una reducción en la cantidad de tales aditivos añadidos al alimento.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Concentraciones requeridas de los agentes antifúngicos cuando se usan solos y en combinación para dar fuerte inhibición del crecimiento después de 48 horas de incubación a 24ºC en el medio B (CDP 1/2 que contieneCaCl_{2} 1 mM y KCl 50 mM).

3

4

5

6

b) Potencia antifúngica de la combinación de sorbato de K con proteínas antifúngicas

El ácido sórbico y sus sales sódica, potásica y cálcica se usan actualmente en productos alimenticios como conservantes, actuando como retardadores del moho. Las cantidades máximas permitidas en alimentos se muestran en la Tabla 1. Las combinaciones de sorbato con las proteínas antifúngicas muestran una inhibición aumentada del crecimiento fúngico. Ejemplos de algunas de las combinaciones que son capaces de inhibir fuertemente el crecimiento fúngico en los ensayos in vitro se muestran en las tablas 4 y 5.

TABLA 4 Concentraciones requeridas de las proteínas antifúngicas y sorbato de K cuando se usan solos y en combinación para dar fuerte inhibición del crecimiento de la cepa de Penicillium chrysogenum que estropea los alimentos después de 48 horas de incubación a 24ºC en el medio B (CDP 1/2 que contiene CaCl_{2} 1 mM y KCl 50 mM).

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TABLA 5 Concentraciones requeridas de las proteínas antifúngicas y sorbato de K cuando se usan solos y en combinación para dar fuerte inhibición del crecimiento de la cepa de Penicillium roquefortii que estropea los alimentos después de 48 horas de incubación a 24ºC en el medio B (CDP 1/2 que contiene CaCl_{2} 1 mM y KCl 50 mM).

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c) Potencia antifúngica de la combinación de ácido benzoico y sus sales con Ib-AMP1 y Rs-AFP2

El ácido benzoico y sus sales de Na y K están siendo usados como conservantes de alimentos debido a su actividad antifúngica, siendo las levaduras y los mohos más afectados que las bacterias. La concentración máxima permisible de ácido benzoico y sus sales en alimentos es de 0,1%. Su presencia puede ser perceptible fácilmente en el aroma de los alimentos a los que se añade.

El efecto del benzoato de Na sobre el crecimiento fúngico cuando se combina con las proteínas antifúngicas
Ib-AMP1 y Rs-AFP2 se ensayó sobre Penicillium chrysogenum. Los resultados, resumidos en las tablas 6 y 7, muestran claramente un efecto antifúngico sinérgico que podría ser usado para la aplicación de las proteínas antifúngicas a la conservación de los alimentos ayudando a reducir la cantidad requerida de benzoato de Na.

TABLA 6 Concentraciones requeridas de los agentes antifúngicos Ib-AMP1 y benzoato de Na cuando se usan solos y en combinación para dar fuerte inhibición del crecimiento después de 48 horas de incubación a 24ºC en el medio B (CDP 1/2 que contiene CaCl_{2} 1 mM y KCl 50 mM).

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TABLA 7 Concentraciones requeridas de los agentes antifúngicos Rs-AFP2 y benzoato de Na cuando se usan solos y en combinación para dar fuerte inhibición del crecimiento después de 48 horas de incubación a 24ºC en el medio B (CDP 1/2 que contiene CaCl_{2} 1 mM y KCl 50 mM).

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d) Potencia antifúngica de la combinación de ácido láctico con Ib-AMP1 sobre Penicillium chrysogenum

El ácido láctico es un aditivo para alimentos con diferentes aplicaciones posibles: acidulante, conservante, coadyuvante, potenciador del aroma o agente de levantamiento. Está considerado como GRAS y no tiene límite ADI.

El efecto del ácido láctico sobre el crecimiento fúngico cuando se combina con la proteína antifúngica Ib-AMP1 se ensayó sobre Penicillium chrysogenum. Los resultados, resumidos en la tabla 9, muestran un efecto antifúngico sinérgico de la combinación de los dos agentes.

TABLA 8 Concentraciones requeridas de los agentes antifúngicos Ib-AMP1 y ácido láctico cuando se usan solos y en combinación para dar fuerte inhibición del crecimiento después de 48 horas de incubación a 24ºC en el medio B (CDP 1/2 que contiene CaCl_{2} 1 mM y KCl 50 mM).

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e) Potencia antifúngica de extractos de semillas combinados con aditivos para alimentos

Se usaron semillas de rábano (Raphanus sativa), colza (Brassica napus) y mostaza blanca (Sinapis alba) para preparar extractos enriquecidos en proteínas antifúngicas básicas que se pueden aplicar a la conservación de alimentos combinándolas con los aditivos para alimentos actualmente usados, tales como sorbato, benzoato sódico y EDTA. Los extractos que contienen la proteína básica se prepararon como se publicó por Terras et al. (J. Biol. Biochem. (1992), 267, 22, 15301-15309). La actividad antifúngica de los extractos se evaluó microscópicamente y se expresó en unidades de actividad, donde 10 unidades representan la actividad antifúngica requerida para inhibir el crecimiento fúngico en 1 ml de medio durante 48 horas a 24ºC.

Como se ve de las tablas siguientes, la actividad antifúngica de los extractos que contienen la fracción de proteína básica es reducida espectacularmente por la adición de CaCl_{2} 1 mM y KCl 50 mM al medio de crecimiento (caldo de dextrosa de patata de concentración media). Se puede recuperar una proporción significativa de la actividad si se añaden aditivos para alimentos usados corrientemente, tales como EDTA, benzoato sódico y sorbato de K, en combinación con los extractos. La potenciación de la actividad antifúngica presente en los extractos por los aditivos para alimentos hace posible usar tales combinaciones como parte de los sistemas de conservación en una amplia gama de productos alimenticios.

TABLA 10 Actividad antifúngica de las fracciones de proteína básica obtenidas de semillas comestibles frente a P. roquefortii.

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Las unidades de actividad antifúngica han sido expresadas por gramo de semilla. El aumento de la actividad antifúngica de los extractos en el medio B por diferentes aditivos para alimentos se demuestra claramente. Las concentraciones de los aditivos sorbato de K y benzoato de Na están dentro del máximo permitido en alimentos. El EDTA es un aditivo para alimentos indirecto que se añade como antioxidante a los materiales envasados. También se han observado efectos potenciadores similares por el Na_{2}H_{2}EDTA.

TABLA 11 Potenciación de la actividad antifúngica del extracto de proteína básica de semilla de colza por sorbato de K frente al Penicillium spp. que estropean los alimentos.

13

Las unidades de actividad antifúngica se han expresado por gramo de semilla.

TABLA 12 Potenciación de la actividad antifúngica del extracto de proteína básica de colza por benzoato de Na frente a cepas que estropean los alimentos.

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Las unidades de actividad antifúngica se han expresado por gramo de semilla.

TABLA 13 Potenciación de la actividad antifúngica del extracto de proteína básica de semilla de rábano por sorbato de K frente al Penicillium roquefortii.

15

Las unidades de actividad antifúngica se han expresado por gramo de semilla.

f) Potencia antifúngica de la combinación de antioxidantes fenólicos e Ib-AMP1

Los antioxidantes fenólicos incluyen hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), terc-butilhidroquinona (TBHQ) y galato de propilo (PG). Estos compuestos se añaden a los alimentos para impedir la autooxidación de los lípidos insaturados. En los Estados Unidos y al menos otros 60 países, son GRAS para uso en alimentos como antioxidantes a una concentración máxima de 200 ppm de contenido de aceite o grasa (Davidson, P. M. (1993) Parabens and phenolic compounds. En Antimicrobials in foods. Editado por P. M. Davidson y A. L. Branen. Marcel Dekker, Inc., Nueva York). A esta concentración máxima permitida en alimentos no actúan como conservantes de alimentos, aunque muestran actividades antibacterianas y antifúngicas a mayores concentraciones.

La actividad antifúngica de bajas concentraciones de BHA usado en combinación con la proteína antifúngica
Ib-AMP1 se estudió in vitro frente a una gama de cepas que estropean los alimentos. El BHA se disolvió en etanol al 50% y se añadió al medio de cultivo (caldo de dextrosa de patata de concentración media que contenía CaCl_{2} 1 mM y KCl 50 mM) para dar las concentraciones finales requeridas (200, 100, 50 y 25 ppm). La proteína pura Ib-AMP1 se añadió a la solución de ensayo y se mezcló con la suspensión de esporas fúngicas como se describe anteriormente. A continuación de la inoculación, las placas se incubaron a 24ºC durante 48 horas. La inhibición del crecimiento fúngico se evaluó microscópicamente por comparación con testigos que no contenían ni BHA no Ib-AMP1. En la tabla 14 se muestra un resumen de los resultados obtenidos.

TABLA 14 Concentraciones inhibitorias mínimas de la proteína antifúngica Ib-AMP1 y el antioxidante BHA capaces de fuerte inhibición del crecimiento fúngico cuando se usan solos y en combinación en el medio B, después de 48 horas de incubación a 24ºC.

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Por lo tanto, se determinó una clara potenciación de la actividad antifúngica de la proteína antifúngica Ib-AMP1 por bajas concentraciones de BHA. A la máxima concentración de BHA ensayada (200 ppm) no se observó actividad antifúngica si se añadía BHA sólo al medio de cultivo. De manera similar, la adición de 100 o 200 ppm de Ib-AMP1 al medio de cultivo fue suficiente para inhibir fuertemente el crecimiento de varias de las cepas fúngicas ensayadas, pero no de todas ellas. La aplicación combinada de BHA e Ib-AMP1 fue, no obstante, capaz de inhibir fuertemente el crecimiento de todas las cepas ensayadas. Tal observación hace posible intentar conservar alimentos combinando un extracto que contiene proteína antifúngica con un antioxidante fenólico GRAS sin exceder la concentración máxima permitida del antioxidante presente en el alimento.

g) Potencia antifúngica de la combinación de sorbato de K con quitinasa-I y glucanasa-I.

Las enzimas quitinasa-I y \beta-1,3-glucanasa son capaces de degradar las paredes de la célula fúngica de hifas en crecimiento cuando se usan en combinación, idealmente en una relación de 1:1. Esta observación explica el papel de estas proteínas en el mecanismo de defensa de la planta frente a patógenos fúngicos. La inhibición de la germinación de las esporas, no obstante, parece estar relativamente inafectada por la presencia de estas enzimas. Además, se ha observado que las hifas fúngicas son capaces de llegar a ser resistentes cuando se germinan en presencia de

\hbox{quitinasa-I}

y \beta-1,3-glucanasa.

Estas observaciones dificultan la aplicación de extractos que contienen las enzimas quitinasa-I y \beta-1,3-glucanasa a la conservación de alimentos, donde la inhibición de la germinación de las esporas es de extrema importancia.

Es en este contexto en el que se consideró la posible aplicación combinada de Qui/Glu con aditivos para alimentos para intentar impedir el estropeo fúngico de alimentos. La quitinasa-I y \beta-1,3-glucanasa se extrajeron y purificaron de tabaco según el método publicado por Sela-Buurlage, M. B. et al., en 1993 (Plant Physiol., 101, 857-863). Las enzimas purificadas se mezclaron en una relación 1:1 y después se ensayaron para determinar la actividad antifúngica frente a cepas fúngicas que estropean los alimentos Penicillium roquefortii y P. chrysogenum. Los ensayos antifúngicos se llevaron a cabo como se describe anteriormente. La evaluación de la inhibición del crecimiento se llevó a cabo por examen microscópico después de 48 y 96 horas de incubación a 24ºC.

Como se ve en la tabla siguiente, se observó una clara potenciación sinérgica de la actividad antifúngica de las enzimas mediante el aditivo sorbato de K. La sinergia se mostró claramente después de 96 horas de incubación, mientras que el sorbato de K sólo fue claramente incapaz de retrasar el crecimiento fúngico durante más de 48 horas. De hecho, se estimó que la inhibición del crecimiento fúngico por el sorbato de K era de solo 10-20% de los testigos después de 96 horas de incubación. El crecimiento fúngico en presencia de hasta 100 ppm de cada una de las enzimas quitinasa-I y \beta-1,3-glucanasa fue equivalente al crecimiento del testigo, es decir, no se observó inhibición. Por lo tanto, se esperaba que el efecto de la aplicación combinada de los agentes antifúngicos fuese el mismo de la aplicación de sorbato de K sólo. Sorprendentemente, se detectó una fuerte inhibición del crecimiento, es decir, inhibición del crecimiento mayor que 90% comparada con el testigo.

TABLA 15 Concentraciones requeridas de las proteínas quitinasa-I y glucanasa-I y de sorbato de K cuando se usan solos y en combinación para dar fuerte inhibición del crecimiento de las cepas que estropean los alimentos Penicillium roquefortii y P. chrysogenum después de 96 horas de incubación a 24ºC en el medio B (CDP 1/2 que contiene CaCl_{2} 1 mM y KCl 50 mM).

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En todos los ejemplos incluidos anteriormente, se ha obtenido una fuerte inhibición del crecimiento fúngico, equivalente a más del 90% de inhibición del crecimiento, combinando concentraciones sub-inhibitorias de cada uno de los compuestos cuando se usan solos. Con el fin de evaluar la naturaleza de la interacción entre dos agentes, ya sea una interacción aditiva, sinérgica o antagonista, se puede usar una expresión matemática descrita por Colby (Colby, S. R. (1967), Calculating synergistic and antagonistic responses of herbicide combinations. Weeds 15, 20-22).

En la fórmula de Colby, E_{1}=X_{1}Y_{1}/100, X_{1} e Y_{1} representan el crecimiento como porcentaje del testigo con el compuesto A (dosis p) y el compuesto B (dosis q), respectivamente. E_{1} es el crecimiento esperado como porcentaje del testigo con la mezcla de A y B (dosis p+q). La respuesta observada (E_{obs}), expresada como porcentaje de inhibición del testigo, se obtiene combinando los dos compuestos a dosis p y q, respectivamente. La comparación de las respuestas como porcentaje de inhibición observada y esperada (E_{obs}/E_{esp}) indica sinergia (E_{obs}/E_{esp} > 1) o antagonismo

\hbox{(E _{obs} /E _{esp}  < 1).}

La ecuación de Colby ha sido aplicada a varios ejemplos tomados de las tablas mostradas anteriormente con el fin de demostrar que se han observado efectos sinérgicos. La aplicación de la ecuación de Colby a algunas de las combinaciones presentadas se presenta más adelante, para servir como ejemplo de cómo se identificó la interacción sinérgica.

En los experimentos descritos, donde la actividad antifúngica se mide usando ensayos de dilución, la presencia de un efecto sinérgico también se puede determinar usando isobologramas (Parish, M. E. y Davidson, P. M. (1993) Methods for evaluation. En: Antimicrobials in foods. Editado por P. M. Davidson y A. L. Branen, Marcel Dekker, Inc., Nueva York). Los isobologramas son representaciones gráficas de las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) de dos agentes antifúngicos diferentes requeridas para inhibir fuertemente el crecimiento de un hongo. Las concentraciones de los dos agentes antifúngicos están ordenadas en cada eje de la menor a la mayor concentración. Si las concentraciones que inhiben fuertemente el crecimiento caen en una línea aproximadamente recta que conecta los valores CIM individuales en cada eje, el efecto combinado es aditivo. La desviación de la linealidad a la izquierda de la línea aditiva significará sinergia. Se incluyen isobologramas para algunas de las combinaciones en los ejemplos dados anteriormente, con el fin de confirmar los resultados obtenidos aplicando la fórmula de Colby.

a) Combinación de 12,5 ppm de Ib-AMP1 con 75 ppm de Na_{2}H_{2}EDTA

La aplicación individual de 12,5 ppm de Ib-AMP1 a una suspensión de esporas de Penicillium chrysogenum en el medio B tuvo como resultado 100% de crecimiento fúngico, comparado con el testigo. Por otra parte, la aplicación de 75 ppm de Na_{2}H_{2}EDTA tuvo como resultado 90% de crecimiento de P. chrysogenum. Según la ecuación de Colby, el crecimiento esperado sería E_{1} = 100x90/100=90%. No obstante, el crecimiento observado de P. chrysogenum en presencia de 12,5 ppm de Ib-AMP1 con 75 ppm de Na_{2}H_{2}EDTA se estimó que era de sólo el 5% del testigo. Por lo tanto, la relación entre las respuestas observada y esperada es E_{obs}/E_{esp} = 95/10=9,5, que indica claramente una interacción sinérgica entre Ib-AMP1 y Na_{2}H_{2}EDTA.

b) Combinación de 25 ppm de Ac-AMP1 con 500 ppm de sorbato de K frente a P. roquefortii

La aplicación individual de 25 ppm de Ac-AMP1 a una suspensión de esporas de Penicillium roquefortii en el medio B tuvo como resultado 100% de crecimiento fúngico, comparado con el testigo. La aplicación de 500 ppm de sorbato de K sólo tuvo como resultado 90% de crecimiento de P. roquefortii. Según la ecuación de Colby, el crecimiento esperado sería E_{1}= 100x90/100=90%. No obstante, el crecimiento observado de P. roquefortii en presencia de 25 ppm de Ac-AMP1 y 500 ppm de sorbato de K se estimó que era de sólo el 5% del testigo. Por lo tanto, la relación entre las respuestas observada y esperada es E_{obs}/E_{esp} = 95/10=9,5, que indica claramente una interacción sinérgica entre Ac-AMP1 y sorbato de K.

c) Combinación de 3,1 ppm de Rs-AFP2 con 500 ppm de sorbato de K frente a P. roquefortii

La aplicación individual de 3,1 ppm de Rs-AFP2 a una suspensión de esporas de Penicillium roquefortii en el medio B tuvo como resultado 100% de crecimiento fúngico, comparado con el testigo. La aplicación de 500 ppm de sorbato de K sólo tuvo como resultado 90% de crecimiento de P. roquefortii. Según la ecuación de Colby, el crecimiento esperado sería E_{1} = 100x90/100=90%. No obstante, el crecimiento observado de P. roquefortii en presencia de 3,1 ppm de Rs-AFP2 y 500 ppm de sorbato de K se estimó que era de sólo el 5% del testigo. Por lo tanto, la relación entre las respuestas observada y esperada es E_{obs}/E_{esp} = 95/10=9,5, que indica claramente una interacción sinérgica entre
Rs-AFP2 y sorbato de K.

d) Combinación de 100 ppm de Ib-AMP1 con 500 ppm de benzoato de Na frente a P. chrysogenum

La aplicación individual de 100 ppm de Ib-AMP1 a una suspensión de esporas de Penicillium chrysogenum en el medio B tuvo como resultado 100% de crecimiento fúngico, comparado con el testigo. La aplicación de 500 ppm de benzoato de Na sólo tuvo como resultado un crecimiento estimado de 99% de P. chrysogenum. Según la ecuación de Colby, el crecimiento esperado sería E_{1} = 100x99/100=99%. No obstante, el crecimiento observado de P. chrysogenum en presencia de 100 ppm de Ib-AMP1 y 500 ppm de benzoato de Na se estimó que era de sólo el 5% del testigo. Por lo tanto, la relación entre las respuestas observada y esperada es E_{obs}/E_{esp} = 95/1=95, que indica claramente una interacción sinérgica entre Ib-AMP1 y benzoato de Na.

e) Combinación de 200 ppm de Ib-AMP1 con 2.500 ppm de ácido láctico frente a P. chrysogenum

La aplicación individual de 200 ppm de Ib-AMP1 a una suspensión de esporas de Penicillium chrysogenum en el medio B tuvo como resultado 100% de crecimiento fúngico, comparado con el testigo. La aplicación de 2.500 ppm de ácido láctico sólo tuvo como resultado un crecimiento estimado de 90% de P. chrysogenum. Según la ecuación de Colby, el crecimiento esperado sería E_{1} = 100x90/100=90%. No obstante, el crecimiento observado de P. chrysogenum en presencia de 200 ppm de Ib-AMP1 y 2.500 ppm de ácido láctico se estimó que era de sólo el 5% del testigo. Por lo tanto, la relación entre las respuestas observada y esperada es E_{obs}/E_{esp} = 95/10=9,5, que indica claramente una interacción sinérgica entre Ib-AMP1 y ácido láctico.

f) Combinación de Ib-AMP1 y BHA

La aplicación individual de 25 ppm de Ib-AMP1 a una suspensión de esporas de Penicillium chrysogenum en el medio B tuvo como resultado 100% de crecimiento fúngico, comparado con el testigo. La aplicación de 50 ppm de BHA tuvo como resultado 99% de crecimiento de P. chrysogenum. Según la ecuación de Colby, el crecimiento esperado sería E_{1} = 100x99/100=99%. No obstante, el crecimiento observado de P. chrysogenum en presencia de 25 ppm de Ib-AMP1 y 50 ppm de BHA se estimó que era de sólo el 5% del testigo. Por lo tanto, la relación entre las respuestas observada y esperada es E_{obs}/E_{esp} = 95/1=95, que indica claramente una interacción sinérgica entre
Ib-AMP1 y BHA.

Claims

1. Una composición antifúngica que comprende uno o más agentes antifúngicos y uno o más aditivos para alimentos, en la que dicho uno o más agentes antifúngicos es una proteína antifúngica y dicho uno o más aditivos para alimentos es un ácido o un derivado sal o éster del mismo o un éter de alquilo de C_{1-6}, y en la que las cantidades relativas del (de los) agente(s) antifúngico(s) y el (los) aditivo(s) para alimentos son tales que produzcan un efecto sinérgico sobre la actividad antifúngica global de la composición en comparación con la actividad antifúngica del agente antifúngico sólo, con la condición de que dicha composición no contenga nisina, lactoferrina y sus derivados, tricorzianina o lisozima.

2. Una composición antifúngica según de la reivindicación 1, en la que dicho uno o más aditivo(s) para alimentos muestra actividad antifúngica.

3. Una composición antifúngica según la reivindicación 1 ó 2, que comprende uno o más agentes antifúngicos y uno o más aditivos para alimentos seleccionados del grupo que consiste en agentes quelantes de metales, disolventes, agentes humectantes, coadyuvantes, antioxidantes, colorantes, emulsionadores, estabilizadores, tensioactivos, agentes de blanqueo, agentes de control del pH, aromas y potenciadores del aroma, secuestrantes o conservantes para alimentos.

4. Una composición antifúngica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el aditivo para alimentos se selecciona del grupo de EDTA, ácido sórbico, ácido benzoico, ácido láctico o un derivado sal o éster de los mismos, galato de propilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o t-butilhidroquinona.

5. Una composición antifúngica según la reivindicación 1, en la que el agente antifúngico es estable al calor.

6. Una composición antifúngica según la reivindicación 5, en la que el agente antifúngico es capaz de ser aislado de fuentes naturales tales como una planta o sus semillas.

7. Una composición antifúngica según la reivindicación 6, en la que el agente antifúngico es capaz de ser aislado de una planta comestible o sus semillas.

8. Una composición antifúngica que comprende uno o más agentes antifúngicos, en la que uno o más de dichos agentes antifúngicos es una proteína antifúngica derivada de una planta o derivada de semillas de la misma y uno o más aditivos para alimentos en la que al menos uno de dichos aditivos para alimentos es un ácido o un derivado sal o éster del mismo o un éter de alquilo de C_{1-6}, y en la que las cantidades relativas del (de los) agente(s) antifúngico(s) y el (los) aditivo(s) para alimentos son tales que produzcan un efecto sinérgico sobre la actividad antifúngica global de la composición en comparación con la actividad antifúngica del agente antifúngico sólo.

9. Una composición antifúngica según la reivindicación 8, en la que dicho uno o más aditivo(s) para alimentos muestra actividad antifúngica.

10. Una composición antifúngica según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en la que el aditivo para alimentos se selecciona del grupo de EDTA, ácido sórbico, ácido láctico, ácido benzoico, o un derivado sal o éster de los mismos, galato de propilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o t-butilhidroquinona.

11. Una composición antifúngica según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que el agente antifúngico es estable al calor.

12. Una composición antifúngica según la reivindicación 11, en la que el agente antifúngico se deriva de una semilla o planta comestibles.

13. Una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el agente antifúngico se deriva de plantas que pertenecen a las familias Brassicáceas (Crucíferas), Compuestas, Leguminosas, Amarantáceas, Hipocastanáceas, Saxifragáceas, Gramíneas, y Aliáceas, o de los géneros: Raphanus, Heuchera, Aesculus, Clitoria, Brassica, Briza, Sinapis, Cnicus, Allium, Amaranthus, Impatiens, Mirabilis y Capsicum, o de derivados de semillas de las mismas.

14. Una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una o más de las proteínas antifúngicas Rs-AFP2, Rs-AFP1, Sa-AFPs, Bn-AFPs, Mj-AMP2, Ac-AMP1, Ib-AMP1 o Ib-AMP2, o sus derivados o proteínas antifúngicas que muestren mayor que 85% de semejanza secuencial, preferiblemente mayor que 90% de semejanza secuencial, más preferiblemente mayor que 95% de semejanza secuencial a una cualquiera de Rs-AFP2, Rs-AFP1, Sa-AFPs, Bn-AFPs, Mj-AMP2, Ac-AMP1, Ib-AMP1 o Ib-AMP2.

15. Una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el agente antifúngico y el aditivo para alimentos están presentes en una relación desde 1:0,5 hasta 1:900.000, más preferiblemente desde 1:10 hasta 1:10.000, y lo más preferiblemente 1:5 hasta 1:500, respectivamente.

16. Una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el agente antifúngico está en forma de extracto de plantas o de semillas.

17. Un método para inhibir el crecimiento fúngico en productos alimenticios, que comprende exponer un ambiente en el que se va a inhibir dicho crecimiento a una cantidad eficaz desde el punto de vista fungicida de una composición antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

18. Un método para inhibir el crecimiento fúngico en productos alimenticios, que comprende aplicar a un producto alimenticio o al lugar de un producto alimenticio una cantidad eficaz desde el punto de vista fungicida de una composición antifúngica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

19. El uso de un aditivo para alimentos para aumentar las propiedades antifúngicas de un agente antifúngico, en el que el aditivo para alimentos es un ácido o un derivado sal o éster del mismo o un éter de alquilo de C_{1-6}.

20. El uso de un aditivo para alimentos según la reivindicación 19, en el que el aditivo para alimentos se selecciona del grupo de EDTA, ácido sórbico, ácido láctico, ácido benzoico, o un derivado sal o éster de los mismos, galato de propilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o t-butilhidroquinona.

21. El uso de un aditivo para alimentos según la reivindicación 19 o la reivindicación 20, en el que el agente antifúngico es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 y 16.

22. El uso de un aditivo para alimentos según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que el agente antifúngico y el aditivo para alimentos están presentes en una relación desde 1:0,5 hasta 1:900.000, más preferiblemente desde 1:10 hasta 1:10.000, y lo más preferiblemente 1:5 hasta 1:500, respectivamente.