ES2205545T3

ES2205545T3 - Procedimiento rapido de aislamiento de arn.

Info

Publication number: ES2205545T3
Application number: ES98944865T
Authority: ES
Inventors: Gerard J. Gundling
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1997-09-17
Filing date: 1998-09-11
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2018-09-11
Also published as: DE69817000T2; WO1999014224A1; CA2303398A1; JP2001516763A; EP1017705B1; EP1017705A1; US5817798A; DE69817000D1; ATE246698T1

Abstract

Un método para purificar ARN a partir de una muestra de ensayo que también contiene ADN, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra de ensayo con un ion de un metal de transición que tiene una valencia de al menos +2 para formar un precipitado que comprende ADN y otros contaminantes y un sobrenadante; (b) separar el precipitado del sobrenadante; y (c) recoger el sobrenadante para obtener una solución purificada de ARN total.

Description

Procedimiento rápido de aislamiento de ARN.

Campo de la invención

La invención se refiere a la purificación de ácido nucleico y en particular, se refiere a la purificación de ácido ribonucleico (ARN) y ARN mensajero (ARNm).

Antecedentes de la invención

El interés en los procedimientos para aislar o de otra forma purificar ácido nucleicos de muestras de ensayo, tales como sangre entera o suero, ha aumentado desde la introducción de las reacciones de amplificación de ácido nucleico tales como PCR o LCR. Se han hecho adaptaciones a estas reacciones de amplificación de tal forma que pueden emplearse para detectar una diversidad de enfermedades. Aunque se han hecho adaptaciones a procedimientos de amplificación que permiten una detección relativamente rápida de enfermedades, la preparación de ácidos nucleicos que se amplifican con tales procedimientos continua siendo un factor limitante en términos del tiempo total empleado en detectar una enfermedad usando un análisis basado en una reacción de amplificación.

Aunque se conocen bien muchos procedimientos de purificación de ácido nucleico y existen desde hace años, estos procedimientos pueden ser largos y pueden emplear reactivos que presentan peligros para los que realizan la purificación. Por ejemplo, se sabe desde hace tiempo que el ADN y el ARN pueden obtenerse fácilmente en una forma purificada a partir de una muestra de ensayo usando procedimientos de extracción orgánicos, pero tales procedimientos pueden requerir varias extracciones y por lo tanto pueden ser largos. Además, el uso de disolventes orgánicos es indeseable y peligroso si no se toman precauciones adecuadas.

Más recientemente, los procedimientos de purificación de ácidos nucleicos han explotado la afinidad que tienen los ácidos nucleicos por materiales de soporte sólidos, tales como vidrio, en presencia de un agente caotrópico. De acuerdo con tales procedimientos, una muestra de ensayo que comprende material celular o vírico puede estar en contacto con un reactivo caotrópico y un material de soporte sólido. El reactivo caotrópico lisa cualquier célula en la muestra de ensayo para liberar el ácido nucleico contenido en las células que después es capturado en el material de soporte sólido. Sin embargo, de acuerdo con estos procedimientos, pueden necesitarse etapas y reactivos adicionales para purificar diferencialmente ADN de ARN.

Un procedimiento para purificar selectivamente ARN mensajero (ARNm) de otros ácidos nucleicos se aprovecha de la cola poli A que se encuentra típicamente en cepas de ARNm. En particular, se emplea un material de soporte sólido recubierto con un oligonucleótido de poli timina para captar el ARNm en la muestra original y por lo tanto separarlo de otras especies de ácido nucleico tales como ADN. Normalmente, se usan "columnas oligo dT" para este propósito. Aunque las columnas de este tipo son eficaces, la cantidad de material pasado sobre la columna está relativamente limitada porque el material de partida es normalmente bastante viscoso debido a la presencia en el material de partida de ADN y ARN además del ARNm deseado. El ARNm puede purificarse con mayores volúmenes de material de partida, pero los métodos para las purificaciones con mayores volúmenes recurren normalmente al uso de procedimientos orgánicos de extracción preliminares para aislar el ARN total del ADN antes de separar el ARNm del ARN total con la columna oligo dT. Además de los problemas presentados por el uso de disolventes orgánicos, los procedimientos para separar diferencialmente ARN de ADN dejan al ARN en un estado insoluble. Como resultado, una vez que el ARN total se purifica del ADN debe resolubilizarse antes de purificar el ARNm del ARN total. Por tanto, además de las limitaciones presentadas por el uso de disolventes orgánicos, estos procedimientos requieren etapas adicionales para permitir una purificación adicional.

B.K. Raj et al., en Chemical Abstracts, vol. 69, no. 9, 26 de Agosto 1968, Columbus, Ohio, US; abstract no. 32950a: "A Simple Method for the Separation of Soluble Ribonucleic Acid from Ribosomal Nucleic Acids using Zinc Ions as a Precipitant", página 3070; columna 1; XP002093837 describen un método en el que se añaden a una muestra iones de zinc divalentes para separar el ARN soluble del ARN ribosómico después de la extracción con fenol de las proteínas, y la fracción soluble se purifica adicionalmente con una resina de intercambio iónico (Dowex).

P.K. Ganguli et al., Chemical Abstracts, vol. 80, no. 17, 29 de Abril de 1974, Columbus, Ohio, USA; abstracto no.92893w: "Simultaneous Extraction of RNA and DNA from Rat Liver with Cupric Sulfate", página 166, columna 1; XP002093839 describen un método en el que se realiza primero una desproteinización de una muestra que contiene ARN y ADN por extracción con CuSO_{4} 0,5 mM, dodecil sulfato sódico al 0,5% y fenol, y después, en la siguiente etapa se precipitan los ácidos nucleicos usando etanol al 95% en presencia de NaCl. El producto obtenido contenía un 20% de ADN y un 11% de ARN.

El documento WO 89/07603 describe un método en el que las sales orgánicas o inorgánicas precipitan la proteína en una muestra biológica de ácidos nucleicos, tanto el ARN y el ADN restantes en el sobrenadante. Algunas sales preferidas son cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro de magnesio, cloruro cálcico, acetato amónico, acetato sódico, acetato potásico, y benzoato sódico, siendo el acetato de amonio la sal más preferida entre las sales orgánicas e inorgánicas. El ADN se separa del ARN por tratamiento posterior del sobrenadante con etanol.

Por consiguiente, existe una necesidad de un método seguro, eficaz y práctico para separar el ARN total del ADN, así como para separar el ARNm de otras especies de ácidos nucleicos, que no esté limitado por la cantidad de material de partida que puede purificarse.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona métodos para separar el ARN total de otros ácidos nucleicos en una muestra de ensayo y proporciona además métodos para separar el ARNm del ARN total. Ventajosamente, el método proporcionado en este documento no requiere el uso de disolventes orgánicos para la separación de especies de ácido nucleico y puede usarse en muestras a gran escala. Por tanto, el método es más seguro y más fácil de realizar que los métodos conocidos previamente.

De acuerdo con la invención, el método para purificar o separar el ARN total de otras especies de ácidos nucleicos que puedan estar presentes en una muestra de ensayo comprende las etapas de (a) poner en contacto una muestra de ensayo con un ion de metal de transición con una valencia de al menos +2 para formar un precipitado que comprende ADN y otros contaminantes y un sobrenadante; (b) separar el precipitado del sobrenadante; y (c) recoger el sobrenadante para obtener de esta forma una solución purificada de ARN total. En los casos en los que el ácido nucleico está contenido dentro de organismos tales como partículas de virus o células, el método puede emplear la etapa adicional de exponer la muestra de ensayo a una agente lítico antes de, al mismo tiempo que, o después de poner en contacto la muestra de ensayo con el ion de metal de transición.

De acuerdo con una realización, el ARNm puede separarse de o purificarse de otras especies de ácidos nucleicos en una muestra de ensayo. De acuerdo con esta realización, el ARN total se recoge como se indica anteriormente y el ARNm se separa del ARN total. La separación del ARNm del ARN total puede realizarse usando metodologías conocidas en la técnica y las matrices oligo dT son adecuadas para este propósito.

Descripción detallada de la invención

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención proporciona métodos para separar el ARN total del ácido nucleico total en una muestra de ensayo, así como para separar el ARNm de una muestra de ensayo separando el ARNm del ARN total purificado.

Se pretende que el término "ARN total" como se usa en este documento signifique todo el ARN que pueda estar presente en una muestra de ensayo. En otras palabras, secuencias de ácido nucleico que están hechas de monómeros de ribonucleótidos que pueden incluir, por ejemplo, ARN genómico, fragmentos de ARN subgenómico, ARNm, ARN de transferencia (ARNt) y ARN ribosómico (ARNr). El término "ácido nucleico total", como se usa en este documento contempla el ARN total comprendido en una muestra de ensayo y las secuencias de ácido nucleico compuestas de monómeros de desoxirribonucleótidos incluyendo, por ejemplo, ADN genómico, fragmentos de ADN subgenómico y productos de reacciones de amplificación de ADN.

Una "muestra de ensayo" es cualquier cosa que contiene ARN o ARNm junto con ADN y otros contaminantes. La muestra de ensayo es o puede derivarse de cualquier fuente biológica, tal como por ejemplo, sangre entera, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, leche, líquido ascítico, líquido sinovial, líquido peritoneal, líquido amniótico, tejido, brotes de fermentación, cultivos celulares y similares. La muestra de ensayo puede usarse (i) directamente como se obtiene de la fuente o (ii) después de un pre-tratamiento para modificar el carácter de la muestra de ensayo. De esta forma, la muestra de ensayo puede pre-tratarse antes del uso, por ejemplo, preparando plasma con la sangre entera, rompiendo células o partículas víricas, amplificando ácidos nucleicos, preparando líquidos con materiales sólidos, diluyendo fluidos viscosos, filtrando líquidos, destilando líquidos, concentrando líquidos, y similares.

La invención explota el descubrimiento de que los iones de metales de transición con una valencia de +2 o mayor, precipitan contaminantes eficaz y selectivamente (sustancias distintas de ARN total) que puedan estar presentes en una muestra de ensayo. Por ejemplo, en los casos en los que la solución de ensayo se deriva de una fuente biológica tal como por ejemplo sangre entera, los iones de metales de transición con estas propiedades precipitan eficazmente los contaminantes tales como residuos celulares, y otras proteínas. Además, aunque se precipitan tales contaminantes, el ARN total permanece en la solución y puede separarse fácilmente del material precipitado que incluye ADN. Como resultado, se recupera el ARN total y el ARNm de esta solución puede purificarse directamente poniéndola en contacto con, por ejemplo, una matriz oligo dT, sin usar disolventes orgánicos y sin necesidad de resolubilizar al ARN total antes de entrar en contacto con la matriz oligo dT.

Los iones de metales de transición con una valencia de +2 o mayor son los elementos conocidos tradicionalmente como "elementos de transición" y tienen un estado de oxidación de +2 o más. Aunque muchos de estos elementos tienen varias valencias, se prefieren las siguientes formas iónicas de los siguientes elementos: iones de Cobalto (Co^{+2} o Co^{+3}), iones de Cinc (Zn^{+2}), iones de Cobre (Cu^{+2}), iones de Vanadio (V^{+2} o V^{+3}) e iones de Níquel (Ni^{+2}). Debe apreciarse, por supuesto, que estos iones pueden entrar en contacto con una muestra de ensayo mediante el uso de una solución de sales de estos elementos que contenga estos iones. Por ejemplo, las sales sulfato y cloro de estos iones están disponibles y pueden solubilizarse para forma soluciones de los iones mencionados anteriormente.

\newpage

Normalmente, se emplean las soluciones que contienen concentraciones de estos iones mayores de 5 mM, preferiblemente la concentración está entre 10 mM y 500 mM, y más preferiblemente la concentración de tales iones está entre 15 mM y 150 mM.

Mientras que hay muestras de ensayo que pueden contener sólo ácidos nucleicos disueltos con otros pocos contaminantes, y por lo tanto estar relativamente "limpias", otras muestras de ensayo pueden contener partículas celulares o víricas intactas, de las cuales se tiene que desprender el ácido nucleico. Se conocen una diversidad de métodos y reactivos para ácidos nucleicos de partículas celulares y víricas y el especialista en la técnica puede escoger la más apropiada. En este documento se hará referencia a tales reactivos o métodos como "agentes líticos". Por ejemplo, algunos métodos químicos para lisar células o partículas víricas incluyen, sin limitación, poner en contacto las partículas celulares o víricas con una solución tampón que contiene un desnaturalizante tal como agentes caotrópicos, detergentes o urea. Tales desnaturalizantes están presentes normalmente en una concentración entre aproximadamente 2M y aproximadamente 5M en una solución tampón que tiene un pH neutro de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8. Adicionalmente, se sabe que las soluciones alcalinas con un pH mayor de 8,5 rompen las paredes celulares o los recubrimientos víricos de diversos organismos, y por lo tanto, pueden emplearse como agentes líticos. De forma similar, las soluciones ácidas con un pH de menos de aproximadamente 5 pueden emplearse también como agentes líticos por su capacidad para romper las paredes celulares o los recubrimientos víricos.

Las soluciones tampón que contienen agentes líticos químicos pueden comprender también otros ingredientes que pueden, por ejemplo, crear en un entorno estable para los ácidos nucleicos liberados de materiales celulares o víricos. Otros de estos ingredientes pueden incluir sales tales como acetato de litio o cloruro sódico; o detergentes tales como N-lauroilsarcosina o TWEEN®.

Alternativamente, los agentes líticos pueden estar en forma de medios mecánicos para lisar células o partículas de virus para liberar de esta forma los ácidos nucleicos. Tales medios están disponibles y pueden incluir homogeneizantes, sonicadores, o batidoras de perlas. Por tanto, de acuerdo con la presente invención, puede tratarse una muestra de ensayo para desnaturalizar entidades que contienen ácidos nucleicos antes de, a la vez que, o después de poner en contacto la muestra con un ion de metal de transición con una valencia de +2 o superior.

Después de liberar los ácidos nucleicos de la entidad que los contiene, si es necesario, y poner en contacto la muestra de ensayo con ion de metal de transición con una valencia de +2 o superior para de esta forma precipitar el ADN y otros contaminantes tales como material celular, puede separarse el ARN total del precipitado. Como se ha indicado anteriormente, el ARN total permanece en solución y es parte del sobrenadante y recogiendo el sobrenadante se proporciona una solución de ARN total que puede purificarse adicionalmente para recoger en ARNm del ARN total. La separación y recogida del ARN puede realizarse por una diversidad de métodos conocidos por los especialistas. Por ejemplo, la separación y recogida del sobrenadante puede conseguirse a través de centrifugación, filtración o simplemente dejando sedimentar al precipitado y vertiendo con una pipeta el sobrenadante aparte del precipitado sedimentado.

Una vez que se ha separado y recogido el sobrenadante, puede procesarse adicionalmente para recuperar el ARNm del ARN total. Al ARNm puede recogerse del ARN total usando un miembro de unión específico unido a una material de soporte sólido. El término "miembro de unión específico" como se usa en este documento significa un miembro de un par de unión, es decir, dos moléculas diferentes, donde una de las moléculas se une, por medios químicos o físicos, a la otra molécula. Además de los pares de unión específicos de antígeno y anticuerpo, otros pares de unión específicos incluyen sin limitación avidina y biotina; haptenos y anticuerpos específicos de haptenos; así como secuencias de ácidos nucleicos complementarias o análogas de las mismas. El término "materiales de soporte sólido", se refiere a cualquier material que es insoluble, o que puede hacerse insoluble en una reacción posterior. El material de soporte sólido puede seleccionarse por su capacidad intrínseca de atraer e inmovilizar a un polinucleótido. De esta forma, la fase sólida puede ser un látex, un plástico, un plástico derivatizado, un metal magnético o no magnético, una superficie de vidrio o silicona, o superficies de tubos de ensayo, pocillos de microtitulación, láminas, perlas, micropartículas, obleas y otras configuraciones conocidas por los especialistas en la técnica. Los materiales de soporte sólido también pueden comprender materiales porosos, como por ejemplo carbohidratos naturales poliméricos y sus derivados reticulados o sustituidos modificados sintéticamente, tales como agar, agarosa, o ácido algínico reticulado. Todos estos materiales pueden usarse en formas adecuadas o formas tales como, por ejemplo, películas, láminas, placas, perlas, micropartículas y similares.

Por lo tanto, puede aislarse el ARNm del ARN total usando un soporte sólido unido a un miembro de unión específico, como cuando se une una secuencia específica de una secuencia particular de ARNm al material de soporte. Alternativamente, una secuencia específica de una secuencia particular de ARNm puede derivatizarse con otro miembro de unión específico tal como, por ejemplo un antígeno, que une específicamente un anticuerpo en el material de soporte sólido. Los materiales de soporte sólido con oligonucleótidos inmovilizados que contienen secuencias que están normalmente en el intervalo de entre aproximadamente 10-50 restos de timina son adecuados para los fines de purificar ARNm del ARN total. En particular, tales polinucleótidos de timina sirven como agentes de afinidad para los restos polinucleotídicos de adenina que se encuentran generalmente en el ARNm. Un ejemplo particular de tal soporte sólido recubierto incluye una columna oligo dT.

Si se desea, el ARNm unido a un material de soporte sólido por medio de un miembro de unión específico, puede eluirse del material de soporte usando una diversidad de medios conocidos por los especialistas en la técnica, tales como cambiar la temperatura o la fuerza iónica en el entorno del material de soporte sólido. Como alternativa adicional, aunque el ARNm puede eluirse de una columna oligo dT usando una diversidad de técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica, el ARNm puede eluirse simplemente con agua.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la presente invención y no pretender limitar la invención.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos muestran el aislamiento de ARNm por el método rápido y eficaz de la presente invención. Este método se comparó con dos métodos conocidos en la técnica, usando uno RNAZol y el otro micropartículas oligo dT recubiertas, para aislar el ARNm de células en la sangre entera. Se seleccionó la línea celular de Carcinoma de Próstata en Nodo Linfático (LNCaP) como muestra experimental, usando RT/PCR para detectar el producto de ARNm antígeno de próstata específico (PSA) en todos los métodos. El método RT/PCR usó cebadores aligoméricos de ADN y sondas específicas para ARNm PSA de los exones 2 y 3 del gen PSA.

Ejemplo 1 Preparación de muestra de células LNCaP

Las células de Carcinoma de Próstata en Nodo Linfático son células de adenocarcinoma humanas prostáticas de una línea celular metastática. La línea celular LNCaP se obtuvo en American Type Culture Collection, ATCC No. 1730-CRL, Rockville, Maryland. La muestra de células LNCaP se preparó decantando primero el medio de cultivo del tejido de las células adherentes LNCaP en cultivo del tejido. Las células se aclararon con solución salina, después se trataron con tripsina durante 3 minutos a 37ºC para retirarlas del matraz de cultivo de tejido. Se añadió más medio de cultivo de tejido (RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10%) al matraz y las células se resuspendieron y se vertieron en un tubo de centrífuga. Las células se centrifugaron a 200 X g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células sedimentadas se resuspendieron en RPMI-160 frío que contenía albúmina de suero bovino (BSA), y después se pasaron a través de un filtro de nylon que se había humedecido anteriormente con RPMI-1640/BSA. Se contaron las células en un analizador hematológico automático Cell-Dyn, y se ajustó a 1 x 10^{5} células/ml en Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS).

Se colocó una unidad de sangre entera en un agitador durante 10 minutos para asegurar la homogeneidad mediante mezcla, después se dividió en fracciones de 4 x 100 ml. Las células LNCaP se diluyeron en serie en PBS y después se clavaron en las fracciones de sangre entera para dar concentraciones finales de 1, 10 ó 100 células LNCaP/ml de sangre entera. No se añadieron células LNCaP a una de las fracciones de 100 ml de sangre entera para usarla como control negativo. Después, se mezclaron todas las fracciones de 100 ml y se dividieron en fracciones de 5 ml.

Ejemplo 2 Aislamiento del ARNm usando el método de la invención

Las células se lisaron con duplicados de las fracciones de 5 ml que contenían 0, 1, 10 y 100 células LNCaP/ml de sangre entera, preparadas en el Ejemplo 1, mezclando cada fracción con un volumen igual de 2x Solución Tampón de Lisis que contaba de isotiocianato de guanidina 4,5M, acetato de litio 1M, y N-lauroilsarconina al 2%, agitado vorticialmente. Después, se añadieron 10 ml (igual al volumen previo total) de Solución de Precipitación consistente en Solución Tampón de Lisis 1X (isotiocianato 2,25M, acetato de litio 0,5M, y N-lauroilsarcosina al 1%) que contenía cloruro de cobalto 100 mM (CoCl_{2}) para precipitar los contaminantes celulares, se agitó vorticialmente, y se dejó precipitar durante 30 minutos. La mezcla se centrifugó a 1000 X durante 30 minutos para retirar el precipitado que contenía residuos celulares.

El sobrenadante que contenía el ARN solubilizado se aplicó a una columna de 20 mg de oligo-dT celulosa (Collaborative Biomedical Product Type T3, No. 20003, Bedford, MA) en un colector de vacío Promega Vac-Man (Promega, Madison, WI). La columna se lavó con 5 ml de Solución Tampón de Lisis 1X, seguido de 5 ml de NaCl 100 mM en Tris 10 mM, pH 7,2. Después, la columna se pasó a un tubo de micro centrífuga y se centrifugó para retirar el líquido residual. La columna se lavó dos veces con 200 \mul de NaCl 100 mM en Tris 10 mM, pH 7,2. La columna se pasó a un tubo de microcentrífuga nuevo y el ARNm se eluyó con 3 volúmenes de 75 \mul cada uno (en total 225 \mul) de agua de calidad Biológica Molecular. Todo el procedimiento se realizó a temperatura ambiente.

Ejemplo 3 Aislamiento del ARNm usando RNAZol

Las células se aislaron con duplicados de las fracciones de 5 ml que contenían 0, 1, 10 y 100 células LNCaP/ml de sangre entera, preparadas en el Ejemplo 1, usando Ficoll-hypaque, después se lavaron con 10 ml de PBS. Las células se sedimentaron por centrifugación durante 10 minutos a 2000 rpm en un centrifugador Beckman J6 y se resuspendieron en 1 ml de PBS. Las células resuspendidas se pasaron a un tubo de microcentrífuga y se sedimentaron mediante micro centrifugación durante 5 a 10 minutos.

El sedimento se disolvió en RNAZol (Tel-Test, Inc., Friendswood, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante, y el ARN se purificó usando el método que se indica a continuación. Se añadieron cien \mul de cloroformo de calidad biológica molecular a 1 ml de la mezcla de RNAZol y se agitó vorticialmente durante 50 segundos, después se colocó en hielo durante 5 minutos. Después de micro centrifugar durante 15 minutos, la capa acuosa se retiró y se puso en un tubo de microcentrífuga nuevo. Se añadió un volumen igual de isopropanol frío y la mezcla se agitó vorticialmente durante 15 segundos, después se incubó durante una noche a -20ºC para precipitar el ARN. Después de la precipitación la mezcla se micro centrifugó a 14.000 X g durante 30 minutos a 4ºC para sedimentar el precipitado. Después, se añadió un ml de etanol frío al 75% al sedimento y la mezcla se agitó vorticialmente hasta que el sedimento flotaba, después se micro centrifugó a 14.000 X g durante 15 minutos a 4ºC para aglomerar el precipitado. Se añadió otra vez 1 ml de etanol frío al 75% al sedimento, se agitó vorticialmente, y después se micro centrifugó como se hizo anteriormente. Después de decantar y secar sobre un papel secante el exceso de líquido del tubo, el sedimento se dejó secar al aire durante 30 minutos, después se disolvió en 12 \mul de agua sin RNasa. El ARN purificado se cuantificó por espectrofotometría usando una lectura de absorbancia a 260 nm y un coeficiente de extinción de 40. Después, la mezcla se diluyó para contener 1 \mug de ARN en 25 \mul de agua sin RNasa.

Ejemplo 4 Aislamiento del ARNm usando micropartículas oligo dT

Las células se aislaron con duplicados de las fracciones de 5 ml que contenían 0, 1, 10 y 100 células LNCaP/ml de sangre entera, preparadas en el Ejemplo 1, mezclando cada fracción con un volumen igual de Solución de Lisis 2X que constaba de isotiocianato de guanidina 4M, ditiotreitol 8mM, sarcosil al 1%, Triton X-100 al 1%, NaCl 100 mM en MOPS 20 mM, pH 7,0 hasta que ocurrió la lisis (aproximadamente 30 segundos).

Después, el ARNm se aisló añadiendo 120 \mul de micropartículas Dynal oligo (dT)_{25} magnéticas (catálogo Dynal No. 61.005, Oslo, Noruega), que se habían prelavado y resuspendido en Solución de Lisis 1X (isotiocianato de guanidina 2 M, ditiotreitol 3mM, sarcosil al 0,5%, Triton X-100 al 0,5%, NaCl 50 mM en MOPS 10 mM, pH 7,0), a cada muestra lisada y agitando durante 15 minutos. Las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 2.500 rpm en un centrifugador Beckman GS-6R. Las micropartículas sedimentadas (perlas) se lavaron resuspendiéndolas en 0,5 ml Solución de Lisis 1X. Usando el soporte magnético Dynal (catálogo de Dynal No. 190.02, Oslo, Noruega), se capturaron las cuentas y se aspiró la solución de lavado. Las perlas se lavaron con 0,5 ml más de Solución de Lisis, se capturaron y se aspiró la solución de lavado. Después, las perlas se lavaron dos veces con 200 \mul de Solución de Lavado fría (MOPS 10 mM, pH 7,0 que contenía NaCl 50 mM, Triton X-100 0,5%) agitando vorticialmente suavemente para resuspender, seguido de la captura de las perlas usando el soporte magnético, aspirando la solución de lavado y repitiendo el proceso. Después, las perlas unidas con el ARNm se resuspendieron en 25 \mul de una solución fría de ARNr 16S y 23S (Boehringer Mannheim, catálogo No. 206938, Indianapolis, IN) diluida a 20 ng/ml en agua.

Ejemplo 5 Detección de ARNm PSA por RT/PCR

Se calculó la cantidad de ARNm PSA presente en cada una de las 4 fracciones preparadas con los 3 métodos distintos de los Ejemplos anteriores 2, 3 y 4, y la hibridación de oligonucleótidos con sonda marcada como se describe en el documento WO 97/07235.

Los cebadores de objetivo específico y la sonda se diseñaron para detectar una secuencia diana de ARNm (SEC. ID. NO. 1) en los exones 2 y 3 del gen PSA mediante hibridación de oligonucleótido PCR. El cebador cadena arriba (SEC. ID. NO. 2) se encuentra en el exón del gen PSA, y el cebador cadena abajo (SEC. ID. NO. 3) contiene dos nucleótidos que hibridan en el extremo 3' del exón 2, con el resto de los nucleótidos cebadores hibridando con la región contigua de ARNm del exón 3 del gen PSA. La sonda de detección (SEC. ID. NO. 4) se encuentra en el exón 2 del gen PSA y se diseñó como una sonda de hibridación interna para la secuencia diana amplificada de PSA.

Las secuencias cebadoras se sintetizaron usando técnicas de metodologías de síntesis de oligonucleótidos convencionales y se haptenaron con adamantano en sus extremos usando química de acoplamiento de cianoetil fosforamidita como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5.424.414. La secuencia de la sonda se sintetizó también usando una metodología de síntesis de oligonucleótidos convencional en el extremo 3' y un carbazol en el extremo 5' usando química de acoplamiento de cianoetil fosforamidita como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5.464.746.

Las muestras de ARN resultantes de los Ejemplos anteriores 2, 3 y 4, se transcribieron inversamente, se amplificaron con PCR y se detectaron usando los cebadores PSA y la sonda de detección PSA descrita anteriormente como se indica a continuación: Se usó polimerasa recombinante Thermus thermophilus a una concentración de 5 unidades/reacción, con cada uno de dATP, dGTP, dTTP, y dCTP presentes a una concentración final de 0,15 mM, y con dUTP presente a una concentración final de 0,2 mM en un volumen de reacción total de 0,2 ml. Todas la reacciones se realizaron usando una solución tampón Bicine 5X, pH 8,24, que constaba de Bicine 50 mM, acetato potásico 92 mM, hidróxido potásico 19 mM, glicerol 0,858 M, a una concentración final de 1X. Las mezclas de reacción usaron cebadores a una concentración de acetato de manganeso 2,5 mM. Los ensayos se realizaron en muestras duplicadas usando 25 \mul.

Las mezclas de reacción se incubaron primero a 68ºC durante 60 minutos para transcribir inversamente el ARN, seguido de la amplificación PCR por incubación a 94ºC durante 2 minutos, después ciclado a 94ºC durante 60 segundos/66ºC durante 80 segundos durante 40 ciclos en un Perkin-Elmer 480 Thermal Cycler. Después las mezclas de reacción se ciclaron térmicamente, las mezclas se mantuvieron a 97ºC durante 5 minutos y se consiguió la oligo hibridación de la sonda reduciendo la temperatura a 15ºC en aproximadamente 2 minutos. Después de la hibridación de la sonda, las muestras se mantuvieron a 15ºC hasta 24 horas antes de analizarse.

Los productos de reacción se detectaron en un sistema Abbot LCx® (disponible en Abbot Laboratories, Abbott Park, IL). Se usaron una suspensión de micropartículas de anticuerpos anti-carbazol recubiertas y un conjugado de anticuerpo anti-adamantano/alcalina fosfatasa (todas las cuales están disponibles en Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) junto con el LCx® para capturar y detectar los productos de reacción. Los resultados de este experimento (calculados como cuentas/segundo/segundo; c/s/s) se presentan en la Tabla 1 y muestran la detección de ARNm PSA en células LNCaP por los distintos métodos empleados.

TABLA 1

	Tasa de LCx® (c/s/s)
células LNCaP/ml de sangre entera	Ejemplo 2	Ejemplo 3	Ejemplo 4
0	35,3	28,5	43,2
0	32,2	27,5	65,5
1	720,9	378,0	62,6
1	550,4	403,1	55,9
10	1216,1	1231,0	1180,8
10	1249,0	1199,1	183,4
100	1290,1	1246,4	1287,6
100	1444,9	1363,9	1270,0

El método de la presente invención demostró ser el más sensible de los 3 métodos para detectar ARNm PSA como muestra consiguiendo la mayor tasa LCx® en la concentración de 1 célula LNCaP/ml. Este método también implicó la menor manipulación de las muestras y fue el más rápido de realizar; el ARNm se aisló con este procedimiento en unos 90 minutos aproximadamente, mientras que con el procedimiento de RNAZol (Ejemplo 3) se necesitaron 2 días, y el método de las micropartículas oligo-dT (Ejemplo 4) empleó aproximadamente 2 horas en completarse.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: G. Gundling

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO RÁPIDO DE AISLAMIENTO DE ARN

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Abbott Laboratories

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(B): CALLE: 100 Abbott Park Road

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(C): CIUDAD: Abbott Park

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(D): ESTADO: Illinois

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(E): PAÍS: ESTADOS UNIDOS

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(F): CÓDIGO POSTAL: 60064-3500

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(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B): ORDENADOR: PC IBM compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatenIn Release No. 1.0, Versión No. 1.25

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: (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: Paul D. Yasger

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 37.477

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 6179.US.01

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: 847/938-3508

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(B): TELEFAX: 847/938-2623

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(C): TELEX:

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 200 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (exones PSA 2 y 3)

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 1:

1

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 2:

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\dddseqskip

GCACCCCTCA TCCTGTCTCG GATTGT

\hfill

26

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 27 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 3:

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\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCGACCCAGC AAGATCACGA TTTTGTT

\hfill

27

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 4:

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\dddseqskip

CAGGTGCTTG TGGC

\hfill

14

Claims

1. Un método para purificar ARN a partir de una muestra de ensayo que también contiene ADN, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con un ion de un metal de transición que tiene una valencia de al menos +2 para formar un precipitado que comprende ADN y otros contaminantes y un sobrenadante;

(b) separar el precipitado del sobrenadante; y

(c) recoger el sobrenadante para obtener una solución purificada de ARN total.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de separar ARNm de dicho ARN total.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicha etapa de separación comprende poner en contacto dicho sobrenadante con una matriz oligo dT.

4. El método de la reivindicación 2, en el que dicha etapa de separación comprende poner en contacto dicho sobrenadante con un miembro de unión específico unido a una fase sólida.

5. El método de la reivindicación 4, en el que dicho miembro de unión específico es una secuencia de ácido nucleico, o un análogo de la misma, específica para una secuencia de ARNm particular.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dicho ion metálico polivalente se selecciona entre el grupo compuesto por Co^{+3}, Co^{+2}, Zn^{+2}, Cu^{+2}, V^{+2} y Ni^{+2}.

7. El método de la reivindicación 1, en el que dicho ion metálico polivalente está a una concentración mayor de
5 mM.

8. El método de la reivindicación 1, en el que antes de o concomitantemente con la etapa (a), dicha muestra de ensayo se pone en contacto con un agente lítico.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho agente de lisado comprende un agente caotrópico, una sal y un detergente.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que no se añade un disolvente orgánico a la muestra de ensayo.