ES2205825T3 - Antraciclinas hibridas procedentes de cepas de streptomyces galilaeus obtenidas por ingenieria genetica. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a nuevas antraciclinas generadas mediante clonación de genes fusionados en una variedad mutada de streptomyces galilaeus DMS11638. Esta variedad se obtiene mediante mutagenización del tipo salvaje de S. galilaeus (ATCC 31615). Los elementos aglicona de los compuestos obtenidos son aclavinones modificados, producidos mediante productos genéticos obtenidos en el mutante, y las fracciones de azúcar son las derivadas de la variedad anfitrión, por ejemplo, rodosamina-2-deoxifucosa-2-deoxifucosa ó 2-deoxifucosa-2-deoxifucosa-2-deoxifucosa, o las formas disacáridas o monosacáridas de éstas.

Description

Antraciclinas híbridas procedentes de cepas de streptomyces galilaeus obtenidas por ingenieria genética.

Campo del invento

El presente invento se refiere a nuevas antraciclinas generadas por clonación de genes fusionados en una cepa mutada de Streptomyces galilaeus. Los restos de aglicona de los compuestos obtenidos son aclavinonas modificadas, habiéndose producido modificaciones por los genes introducidos en el mutante y los restos de azúcar son aquellos derivados de la cepa hospedadora.

Antecedentes del invento

Las antraciclinas, que son producidas principalmente por especies de Streptomyces como metabolitos secundarios, comparten un gran valor como agentes antitumorales.Generalmente, la molécula de antraciclina consta de una estructura principal aglicona y de uno o más restos de azúcar unidos a ella. Las aclacinomicinas son un grupo de antraciclinas que comparten la aclavinona como resto de aglicona y un residuo de azúcar, como la rodosamina (aclacinomicina T), en el que 2-desoxifucosa (aclacinomicina S) y un tercer azúcar, originalmente rodinosa, pueden estar unidos consecutivamente. Las modificaciones del tercer residuo de azúcar son comunes. El primer complejo de aclacinomicina, que consistía en aclacinomicina A (AcmA), B (AcmB) e Y (AcmY), se aisló originalmente a partir de S. galilaeus por Oki et al., (1975). Posteriormente, la aclacinomicina A, aclarrubicina, pasó por ensayos clínicos para su uso en quimioterapia del cáncer. Se ha llevado a cabo investigación para obtener aclacinomicinas con modificaciones secundarias para encontrar nuevos candidatos en el desarrollo de fármacos. Durante estos estudios se han encontrado compuestos producidos por cepas mutantes de S.galilaeus que poseen modificaciones en el resto de azúcar (Matsuzawa et al., 1981).

La fórmula general de las aclacinomicinas (Acm), que consta de aclavinona y de un aminoazúcar, la rodosamina (Rhn), es como sigue

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en la que R es H o un residuo de azúcar que es un resto mono- o di-azucarado.

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dF es 2-desoxifucosa, Cin es cinerulosa, Acu es aculosa, Rho es rodinosa y Ami es amicetosa.

Además, los glicósidos de aclavinona que no tienen restos de aminoazúcar se han producido por cepas de S.gali- laeus obtenidas por tratamiento de mutagénesis (Matsuzawa et al., 1981 y Ylihonko et al., 1994).

La aclacinomicina A, denominada aclarrubicina, es un miembro único del grupo aclacinomicina que se usa en la quimioterapia del cáncer. Se usa principalmente para la leucemia. La doxorrubicina, una antraciclina que representa al grupo de la daunomicina es el antibiótico citostático que se usa más ampliamente, que muestra actividad frente a una gran variedad de tumores. Desafortunadamente, los efectos secundarios nocivos como la cardiotoxicidad acumulativa provocan que se aborte el tratamiento por doxorrubicina a pesar de su efectividad. En cambio, la cardiotoxicidad no es un efecto secundario común en el tratamiento con aclarrubicina. No obstante, la ausencia de actividad sobre tumores sólidos limita su uso a leucemia y linfomas principalmente. Por esta razón, una antraciclina óptima para el tratamiento del cáncer poseerá aplicación clínica similar a la de la doxorrubicina, mientras que los efectos secundarios deberían ser aquéllos de la aclarrubicina, de acuerdo con su modo de acción. El estado actual de la quimioterapia del cáncer perpetúa la necesidad de moléculas nuevas a fin de desarrollar nuevos fármacos citostáticos.

Matsuzawa et al. (1981) describen la producción de aclavinona-rodosamina-2-desoxifucosa-2-desoxifucosa. Esta aclacinomicina se ha aislado de las cepas mutantes de S.galilaeus 7U-491 y 7N-1881 derivadas de la cepa S.galilaeus ATCC 31133. También, las cepas 7U-491 y 7N-1881 producían aclavinona-Rhn-dF y, además, se ha obtenido aclavinona-dF-dF (MA144 U9) del cultivo de 7N-1881.

Compendio del invento

Nosotros mutamos una cepa silvestre de Streptomyces galilaeus (ATCC31615) a fin de crear un mutante que produjese una antraciclina modificada. El mutante de S.galilaeus obtenido se denominó H075 y se depositó según las reglas del tratado de Budapest el 30 de Junio de 1997 en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, Alemania, con el número de acceso DSM 11638. S.galilaeus H075 por sí misma produce aclavinona-rodosamina-2-desoxifucosa-2-desoxifucosa (H075-1a) como producto principal y cantidades menores de aclavinona-dF-dF-dF (H075-1d), una antraciclina que no tiene aminoglicósidos. Así, H075 difiere de las cepas productoras de Matsuzawa et al., (1981) dado que se produce también un compuesto nuevo, la aclavinona-desoxifucosa-desoxifucosa-desoxifucosa. Esta cepa mutante se usó como cepa hospedadora para expresar los genes conocidos de la biosíntesis de nogalamicina (sno) y rodomicina (rdm) para producir nuevas antraciclinas híbridas. Los genes sno1-3 derivados de S. nogalater provocan un reemplazo de un grupo etilo en C-9 a un grupo metilo de aclavinona. Los genes rdmB y E derivados de S. pupurascens son responsables de la hidroxilación en las posiciones 10 y 11, respectivamente, y el producto del gen rdmC descarboxila la posición 10 en el resto de aglicona. Esto da como resultado nuevos compuestos de utilidad en la quimioterapia del cáncer.

Un objeto específico de este invento es, de este modo, un procedimiento para producir nuevas antraciclinas híbridas por transformación de los genes de la biosíntesis de nogalamicina (sno) y/o rodomicina (rdm) a una cepa de S.galilaeus, preferiblemente al mutante H075.

Se incluyen en este invento los compuestos producidos por expresión de dichos genes en S.galilaeus H075 para cambiar los sustituyentes en las posiciones 9, 10 y 11 de la aclavinona.

Descripción detallada del invento

El mutante H075 de S.galilaeus (DSM 11638), que se usa como hospedador para la producción de nuevas antraciclinas de acuerdo con este invento, es un superproductor de glicósidos de aclavinona. La fórmula general II para dichos compuestos es

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en la que R_{1} = CH_{2}CH_{3} o CH_{3},

R_{2} = COOCH_{3}, H u OH y

R_{3} = OH o H.

TABLA 1

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En la siguiente descripción los compuestos se designan de acuerdo con la fórmula II anterior, de manera que se da un número a cada aglicona en base a los grupos R relacionados arriba, mientras que las letras minúsculas se refieren a los restos de azúcar de acuerdo con la fórmula II, a = Rhn-dF-dF; b = Rhn-dF; c = Rhn; d = dF-dF-dF; e = dF-dF. (Rhn = rodosamina, dF = desoxifucosa).

Las cepas transformadas que se obtienen al usar S.galilaeus H075 como hospedadora producen en conjunto 5 (restos de azúcar) x 11 (modificaciones de aglicona) antraciclinas diferentes.

El invento concierne específicamente a los nuevos compuestos H075-2a,b,c,d,e, H075-3a,d,e,H075-4a,b,c,d,e, H075-5a,b,c,d,e, H075-6a,b,c,d,e, H075-7a,b,c,d,e, H075-8a,b,c,d,e, H075-9a,b,c,d,e, H075-10a,d,e, H075-11a,b,c,d,e, H075-12a,b,c,d,e, según se indica arriba en la Tabla 1 y, en específico, a los compuestos nuevos H075-2a,-2b y -2d; H075-3d; H075-4a; H075-5e; H075-6b y -6c; H075-8a; H075-10a y H075-11b y 11e, según se define en la reivindicación 1.

Los compuestos de antraciclinas del invento preferidos específicamente incluyen los compuestos de fórmula II en los que R_{1} es CH_{2}CH_{3}, R_{2} es COOCH_{3}, R_{3} es OH y R_{4}es Rhn-dF-dF (= H075-4a) o R_{1} es CH_{3}, R_{2} es OH, R_{3} es OH y R_{4} es Rhn-dF (= H075-11b) o

R_{1} es CH_{2}CH_{3}, R_{2} es OH, R_{3} es OH y R_{4}es Rhn-dF-dF (= H075-10a).

El invento también concierne a los siguientes derivados del compuesto aclavinona-Rhn-dF-dF (producto principal de la cepa H075) que tienen la fórmula III

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en la que R_{1} es CH_{3} o CH_{2}CH_{3}, R_{2} es H u OH y R_{3} es H u OH, denominados H075-7a, H075-12a, H075-6a, H075-11a, H075-8a, H075-9a, H075-2a y H075-10a, de acuerdo con la Tabla 1.

Los compuestos conocidos previamente relacionados con los compuestos del presente invento-denominados de acuerdo con la fórmula II- son:

H075-1a (MA144 U1, Matsuzawa et al., 1981)

H075-1b (AcmS, Oki et al., 1977)

H075-1c (Aclavina, AcmT, Streliz et al., 1956)

H075-1e (MA144 U9, Matsuzawa et al., 1981)

H075-3b (Auramicina C, Hoshino et al., 1982)

H075-3c (Auramicina D, Hoshino et al., 1982)

H075-10b (Betaclamicina S, Yoshimoto et al., 1984) y

H075-10c (Betaclamicina T, Yoshimoto et al., 1984).

Un aspecto adicional del invento es un procedimiento para la producción de antraciclinas de fórmula II

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en la que R_{1} es CH_{2}CH_{3}, R_{2} es COOCH_{3}, R_{3} es H y R_{4} es Rhn-dF-dF, Rhn-dF, Rhn, dP-dF-dF o dF-dF, en la que Rhn es rodosamina y dF es desoxifucosa, que son los compuestos conocidos previamente H075-1a a H075-1e denominados de acuerdo con la Tabla 1 y cuyas referencias están relacionadas arriba. En el procedimiento la cepa Streptomyces galilaeus H075 (DSM 11638) se cultiva en condiciones que permiten la producción de antraciclinas y se recuperan las antraciclinas producidas.

El presente invento permite el desarrollo de fármacos de compuestos de fórmula II. De acuerdo con el invento, los compuestos del presente estudio son activos frente a la línea celular MES-SA según se compara con daunomicina y aclarrubicina. También, la actividad in vivo usando las células de leucemia P388 en ratones resultó comparable con aquélla de daunomicina. El panel de células tumorales empleadas para la investigación sobre la actividad citostática in vitro sugiere las propiedades relativas a aclacinomicinas o daunomicinas, dependiendo de los sustituyentes del resto aglicona. Los resultados de encontrar nuevos productos farmacéuticos para el tratamiento del cáncer son esperanzadores.

Los compuestos producidos por las cepas transformadas son más hidrofílicos que la aclarrubicina debido a sus estructuras químicas. Por esta razón, se asemejan a doxorrubicina más que a aclarrubicina en sus propiedades físico-químicas. Doxorrubicina actúa sobre las células tumorales con un mecanismo distinto al de aclarrubicina. Se sugiere que es un inhibidor de la topoisomerasa II que estabiliza un complejo fármaco-ADN-enzima para prevenir una ligación de las cadenas de ADN en la doble hélice. Ésto resulta en la parada del ciclo celular en fase G2. La aclarrubicina se cree que inhibe la interacción de las topoisomerasas con el ADN, aunque el mecanismo no se conoce bien y el compuesto se sabe que provoca parada del ciclo celular en fase G1. Se encontró que las antraciclinas híbridas del presente invento paran el ciclo celular en fase G1, el lugar de compromiso de la replicación cromosómica, lo que muestra, por tanto, un modo de acción similar al de aclarrubicina.

Los compuestos de este invento podrían producirse en cualquier célula microbiana capaz de expresar los genes de antraciclinas. Las especies de Streptomyces resultan ventajosas para los propósitos de este invento y una realización específica comprende el uso de S.galilaeus H075 (DSM 11638) modificada por ingeniería genética, obtenida por mutagénesis de S.galilaeus ATCC 31615 silvestre mediante NTG (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina).

En Streptomyces la biosíntesis de aclavinona transcurre vía la ruta de los policétidos. La policétido-sintasa (PKS) es responsable de la formación de la estructura principal de los policétidos. Los productos de tres genes específicos contituyen las "PKS mínimas" que controlan la aceptación de la unidad iniciadora, así como el número de unidades de extensión (acetatos) empleados en la unión de los policétidos. La unidad iniciadora para la biosíntesis de aglicona determina el sustituyente en posición 9 de la estructura mostrada arriba. Se sabía previamente que el propionato se usa como iniciador en la biosíntesis de aclavinona, en la que R_{1} es un grupo etilo. Este grupo se puede convertir en un grupo metilo al expresar los genes mínimos de PKS para nogalamicina en H075, ya que el acetato se usa de iniciador de la ruta biosintética de nogalamicina (Ylihonko et al., 1996). Los genes para las PKS mínimas de nogalamicina (sno1-3) pueden aislarse a partir del plásmido pSY15 (DSM 9436) como un fragmento de 5,4 kb de ADN digerido con las enzimas de restricción SacI-Bg/II para dar pSY21. El fragmento se clona en un vector plasmídico que produce múltiples copias al replicarse en las especies de Streptomyces.

El substituyente en la posición 10 de aclavinona (grupo R_{2}) es un grupo carbometoxi. Este grupo se elimina por la actividad de una esterasa, preferiblemente por RdmC, para producir los compuestos H075-7, H075-8, H075-9 y H075-12 (R_{2} = H). RdmC se obtiene por amplificación del gen rdmC por la técnica de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), que emplea pJN028 como modelo, y por inserción del fragmento amplificado en pIJ486 para dar pRdm52. R_{2} se convierte en un grupo hidroxilo por la acción concomitante de RdmC y RdmB, en la que el producto génico de rdmC es responsable de eliminar el grupo carbometoxi, mientras que rdmB codifica para una hidroxilasa que convierte a R_{2} en un grupo hidroxilo. rdmC y rdmB se clonan juntos para provocar la conversión de un grupo carbometoxi a un grupo hidroxilo.

El grupo 11-hidroxilo (R_{3}) se puede añadir por la acción del producto génico de rdmE, una hidroxilasa. El gen rdmE se obtiene a partir de pJN018 y se clona en pIJE486 para dar pRdm51. Los genes adecuadamente fusionados clonados en el vector de expresión pIJE486 provocan las modificaciones en base a las actividades separadas de los productos génicos para generar los derivados de los compuestos característicos de la cepa mutante H075 de acuerdo con el presente invento. Los constructos de expresión se construyeron preferentemente en S. lividans TK24 para generar grandes cantidades de plásmidos recombinantes que se introdujeron en S.galilaeus H039 que exhibe frecuencias de transformación superiores a otras cepas de S.galilaeus usadas. Los plásmidos que portan las combinaciones de dichos genes se aislan posteriormente de H039 para introducirse en S.galilaeus H075 a fin de producir compuestos con la fórmula general II anterior. Los plásmidos y genes relevantes se proporcionan en la Tabla 2.

TABLA 2

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Las antraciclinas que representan la fórmula general (II) se producen por fermentación de los clones H075, es decir, las cepas que portan los plásmidos relacionados en la Tabla 2. Las cepas son H075-pJN028, H075-pSY21, H075-pSYR_{1}, H075-pSYR2, H075-pSYR3, H075-pSYR4, H075-pSYR5, H075-pRdm51, H075-pRdm52, H075-pRdm53 y H075-pRdm54. Las antraciclinas producidas se aislan por extracción con disolventes orgánicos que emplean preferentemente una disolución diclorometano:meta-nol. La antraciclina de interés se separa de la mezcla mediante cromatografía de columna en dos etapas. Las actividades citostáticas de los compuestos purificados se estudian mediante el empleo de células tumorales in vitro y en un modelo de leucemia in vivo.

A continuación se describen las realizaciones detalladas del invento como ejemplos de

(i) realizar la mutagénesis de S.galilaeus silvestre (ATCC 31615),

(ii) construir los plásmidos para generar las modificaciones de aglicona,

(iii) introducir los plásmidos en S.galilaeus H075 para obtener los clones H075,

(iv) aislar los compuestos producidos por los clones H075 y procedimientos de purificación e identificar dichos compuestos que representan cada modificación provocada por los genes clonados y

(v) determinar las actividades citotóxicas in vitro e in vivo.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 Espectro ^{1}H-RMN del compuesto H075-4a.

Fig. 2 Espectro ^{13}C-RMN del compuesto H075-4a.

Fig. 3 Actividad del compuesto H075-4a frente a la línea celular MES-SA.

Experimental Materiales utilizados Cepas bacterianas

Streptomyces galilaeus ATCC 31615 produce aclacionomicinas. La cepa se usó aquí como la silvestre para mutagénesis por NTG.

Streptomyces galilaeus H039 (documento WO 96/10581) produce glicósidos de aclavinona. Se usa aquí como una cepa intermediaria debido a una mayor frecuencia de transformación que la H075.

Streptomyces lividans TK24 (documento WO 96/10581) no produce antraciclinas. Es una cepa libre de restricción y modificación que se usa como hospedador primario en clonaje.

Plásmidos

El promotor que permite expresión constitutiva de los genes clonados aguas abajo (downstream)ermE (Bibb. et al., 1985) se insertó en el MCS (sitio de clonaje múltiple) de pIJ486 y pIJ487 (Ward et al., 1986; obtenidos del Prof. Hopwood, John Innen Centre, UK); generalmente se usaron vectores de clonaje de Streptomyces para dar los plásmidos PIJE486 o pIJE487.

El plásmido pSY15 se incluye en S. lividans DSM 9436, cuyo plásmido contiene los genes para el cromóforo nogalamicina derivado de S. nogalater en el vector pIJ486. La descripción detallada de pSY15 se aporta en el documento WO 96/10581.

pSY21 se obtuvo por subclonación de un fragmento SacI-Bg/II de 3,5 kb de ADN de pSY15 en pIJ486 (Ylihonko et al., 1996).

EB3 es un plásmido que contiene un fragmento EcoRI-BamHI de 6 kb de Rdm6 (documento WO 92/16629) insertado en pIJ486. El inserto contiene los genes para la 11-hidroxilasa, la 10-demetilasa, la 10-hidroxilasa, una aminometilasa (rdmD) y un gen incompleto para una ciclasa (rdmA). Los dos últimos genes, rdmD y rdmA, no participan en las modificaciones de aclavinona.

pJN028 es una construcción de expresión para los genes rdmB,C,D. Un fragmento StyI de 2,8 kb se clonó en pIJE487 (Niemi y Mäntsälä, 1995).

pJN018 es un plásmido que contiene un fragmento PpuMI-BamHI de 2,7 kb de EB3 clonado en pIJ487. Se usaron extremos romos para la ligación. El inserto contiene un gen completo de la 11-hidroxilasa (Niemi y Mäntsälä, 1995).

Medios de nutrientes y disoluciones

NTG (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina) (SIGMA)

Tioestreptona (SIGMA), disolución madre de 50 \mug por ml de DMSO

TSB (caldo de triptona soja)

Por litro: 30 g de caldo de triptona soja de Oxoid en polvo.

ISP4 Medio 4-Bacto ISP, Difco; 37 g/l.

E1 Por litro: 20 g de glucosa, 20 g de almidón, 5 g de farmamedia, 2,5 g de extracto de levadura, 13 g de K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O, 1g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 3 g de NaCl, 3 g de CaCO_{3}. Se añade agua de grifo hasta 1 litro y se ajusta el pH a 7,4.

Ejemplo 1 Mutagénesis de S.galilaeus ATCC 31615 y caracterización de la cepa mutante

Para la mutagénesis se cultivó S.galilaeus ATCC 31615 en 50 ml de medio TSB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Todos los matraces de mutagénesis contenían un imán en el fondo de la botella para dispersar los micelios durante el cultivo. El cultivo de la cepa se llevó a cabo durante dos días a 30ºC, 330 rpm en un agitador. Posteriormente se inoculó 1 ml del cultivo a la siguiente botella que contenía 50 ml de TSB y el cultivo se continuó durante un día (30ºC, 330 rpm). Este cultivo joven se ajustó a pH 8,5 con un 2% de NaOH y se añadieron 800 \mug/ml de NTG para que actuasen sobre las células durante 20 minutos a 37ºC. El cultivo mutagenizado de la cepa se dividió en dos tubos y se centrifugó a 300 rpm, 10 minutos. Los sedimentos combinados se usaron para inocular 50 ml de medio TSB. Después de un día de cultivo a 30ºC, 330 rpm, todo el cultivo se centrifugó y se resuspendió en 10 ml de medio TSB. El título de las células en suspensión se determinó por siembra en placas de las diluciones apropiadas, por ejemplo 1:10 en placas ISP4. Las colonias de los cultivos mutagenizados se compararon con aquéllas de la cepa silvestre y aquéllas que exhibían distintos rasgos que la silvestre se seleccionaron para caracterización adicional.

Uno de los mutantes se denominó H075. Era diferente al S.galilaeus ATCC 31615 silvestre, ya que apareció de color amarillo intenso en la placa de agar. No se encontraron otros rasgos que difiriesen de la cepa silvestre.

Los mutantes seleccionados se cultivaron en 60 ml de medio E1 durante cuatro días (28ºC, 330 rpm). Se añadieron 250 \mul de un tampón fosfato 1 M a 250 \mul de cultivo E1 y el sedimento se separó del líquido sobrenadante por centrifugación. El sedimento se extrajo con 500 \mul de tolueno-metanol (1:1) por agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. La fase orgánica se separó del agua por adición de 250 \mul de tampón fosfato y centrifugación. 10 \mul de muestra de la fase orgánica se aplicaron en placa (Kieselgel 60, Merck) TLC (cromatografía de capa fina) y se desarrollaron con tolueno:acetato de etilo:metanol:ácido fórmico (50:50:15:3). El compuesto principal obtenido del cultivo de dicha cepa mutante dio un valor Rf de 0,016, mientras que los compuestos principales de la cepa silvestre dieron valores Rf de 0,11, 0,13 y 0,23, que corresponden a aclacinomicina A, Y y B, respectivamente. La cantidad total de glicósidos de aclavinona comparados con la cantidad de aclavinona obtenida a partir de las fracciones hidrolizadas fue al menos cinco veces la producida por la silvestre.

Ejemplo 2 Construcción de los plásmidos para generar las modificaciones de aclavinona y transformación de los plásmidos en H075 2.1 Métodos generales

Los plásmidos responsables de las modificaciones de aclavinona, el resto aglicona de los productos de H075, están relacionados en la Tabla 2. Los plásmidos usados como fuentes de los genes se describen anteriormente en "Materiales utilizados". Los plásmidos se aislaron de cepas relevantes de S.lividans TK24 y las fusiones de genes se llevaron a cabo mediante el empleo de los sitios de restricción convenientes. Las digestiones se hicieron mediante el empleo de enzimas de restricción de MBI Fermentas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para las ligaciones de extremos romos el inserto y el vector digeridos con una enzima de restricción apropiado se trataron con polimerasa Klenow (Promega Corp. Madison, WI) en presencia de nucleótidos para permitir el relleno de los extremos 5' pegajosos usando las condiciones recomendadas por el fabricante. Los vectores se trataron con CLAP (fosfatasa alcalina intestinal de ternero, Promega) para retirar los fosfatos de los extremos 5' para prevenir el cierre intramolecular de la molécula de vector. Las ligaciones se llevaron a cabo con ligasa T4 de ADN (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.2 Construcciones de los plásmidos

pRdm51: el gen responsable de la hidroxilación de aclavinona en la posición 11 (rdmE) derivó de pJN018. El plásmido pJN018 se digirió con enzima de restricción BamHI y se ligó en el sitio BamHI de pIJE486. Se comprobó la orientación paralela con el promotor ermE mediante el empleo de XhoI para dar los fragmentos de 2,2 kb y 7 kb.

pRdm52: se fabricó por amplificación mediante la técnica de PCR de un fragmento de 900 bp de ADN de EB3. Las secuencias nucleotídicas flanqueantes de la región amplificada fueron: 5'-ACAT-GTCCGAACGCATCGTGCCG-3' y 5'-AGCAGCGGGCGGG AGAGACGATG-3'. Se introdujeron los sitios de restricción para BamHI y XbaI en los extremos de la región amplificada y el fragmento se clonó dentro de pIJE487 en la orientación determinada.

pRmd53: pJN018 se digirió con BamHI y los extremos del fragmento de dentro de 2,8 kb se hicieron romos. El fragmento se clonó en pRdm52 de extremos romos (sitio HindIII tratado con enzima Klenow).

\newpage

pRdm54: un fragmento de 6 kb de ADN se separó de EB3 por digestión con Bg/II y el fragmentose clonó en el sitio BamHI de pIJE486. Para determinar la orientación de los genes de expresión bajo el promotor ermE se empleó el sitio MluI.

pSYR1: el plásmido responsable de las modificaciones en las posiciones 9 y 11 en aclavinona se construyó por subclonaje de un fragmento de ADN que llevaba el gen para la 11-hidoxilasa de pJN018 en pSY21. pJN018 se digirió con EcoRI y HindIII y el extremo 5' se hizo romo con la polimerasa Klenow. El fragmento de 2,9 kb se ligó al sitio XbaI hecho romo de psY21. La orientación del fragmento clonado no fue crítica, ya que la expresión de rdmE se promovió por su propio promotor.

pSYR2: un fragmento de 1,2 kb de ADN se digirió del plásmido pRdm52 con EcoRI-HindIII. El fragmento se clonó en pSY21 como extremos romos.

pSYR3: un fragmento EcoRI-HindIII de 3 kb se clonó en pSY21 como ligación de extremos romos.

pSYR4: se digirió pRdm54 con Bg/II y el fragmento de 6,2 kb de ADN que contenía el promotor ermE se ligó en pSY21 digerido con XbaI y hecho romo con polimerasa Klenow.

pSYR5: un fragmento Bg/II de 3 kb de pRdm53 se clonó en el sitio XbaI hecho romo de pSY21.

2.3 Protocolos de transformación

Las mezclas de ligación se introdujeron en S. lividans TK24 por transformación protoplástica y se comprobó el plásmido mediante el método de miniprep (Hopwood et al., 1985). Para algunos plásmidos se comprobó que la orientación fuese aguas abajo del promotor ermE mediante el uso de los sitios de restricción adecuados.

Las construcciones plasmídicas correctas se aislaron de TK24 y se introdujeron en S.galilaeus H039. La técnica que se usó para transformación protoplástica en cepas de S.galilaeus se describe en el documento WO 96/10581. Los plásmidos amplificados en H039 se introdujeron subsecuentemente en S.galilaeus H075 para generar las reacciones modificadas de las antraciclinas características. Se obtuvieron 11 cepas transformadas, es decir, "clones de H075", y éstos se nombraron como H075-pJN028, H075-pSY21, H075-pSYR_{1}, H075-pSYR2, H075-pSYR3, H075-pSYR4, H075-pSYR5, H075-pRdm51, H075-pRdm52, H075-pRdm53 y H075-pRdm54.

Ejemplo 3 Producción, aislamiento y purificación de los compuestos acumulados por los clones H075 de S.galilaeus 3.1 Condiciones de cultivo para la producción de antraciclinas

Dos matraces erlenmeyer de 250 ml que contenían 60 ml de medio E1 suplementado con tioestreptona (10 \mug/ml) se inocularon con el cultivo de la placa de los clones H075. Después de cuatro o cinco días los matraces se emplearon para inocular un fermentador Biostat que contenía 13 litros de medio E1 suplementado con tioestreptona (10 \mug/ml) y la fermentación se llevó a cabo durante cuatro a seis días (330 rpm, 30ºC, proporción de aireación de 13 l/min).

3.2 Aislamiento y purificación de las antraciclinas

El caldo de fermentación (13 1) se ajustó a pH 7,0 con tampón fosfato 1 M y los micelios se separaron del caldo por centrifugación. Los micelios se extrajeron dos veces con metanol (2x 1 l). Los extractos de metanol se combinaron con los líquidos sobrenadantes y la mezcla se extrajo dos veces con diclorometano/metanol (3:1) a pH = 7,5. Las fases orgánicas combinadas se concentraron a vacío y el residuo viscoso se disolvó en cloroformo: ácido acético (99:1) y se cargó en una columna de sílice de desarrollo rápido (5 cm.). La columna se desarrolló en un gradiente lineal creciente de metanol. Las fracciones puras se combinaron, se neutralizaron con tampón fosfato pH = 7,0 y se lavaron dos veces con agua. Los disolventes se eliminaron en un evaporador de rotación. El residuo se disolvió en acetato de etilo y se precipitó con hexano. Los sólidos sedimentados se secaron a vacío.

3.3 Estructuras de los nuevos compuestos

Las estructuras de las antraciclinas puras se determinaron de acuerdo con los datos recogidos del espectro de RMN. Las señales de los datos RMN se muestran en las Tablas 3 a 6. En las Fig. 1 y 2 se proporcionan los espectros ^{1}H-RMN y ^{13}C-RMN de H075-4a. Las señales obtenidas se compararon con las obtenidas a partir del producto aclavinona-Rhn-dF de H075 y la elucidación estructural de los nuevos compuestos se dedujo a partir de las diferencias.

Las estructuras de las antraciclinas se dedujeron de los datos de RMN dados en las Tablas 3 a 6.

8

9

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TABLA 5

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TABLA 6

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TABLA 6 (Continuación)

17

Los cambios individuales en la molécula se tomaron como cambios en el espectro RMN (Tablas 3, 4, 5 y 6 arriba) como sigue:

Cambios en la parte aglicona

R_{9}: El metilo en R_{9} da un singlete de 3 hidrógenos en 1,20 - 1,35 ppm en vez del multiplete conectado en 1,3 - 1,8 ppm y el triplete 1 ppm que procede de la cadena lateral etilo.

R_{10}: La eliminación del sustituyente de R_{10} se interpreta como ausencia de señales de C-15 y C-16 en el espectro de carbono y ausencia de singlete del grupo metoxi. Los compuestos decarboxilados (H075-7, 8, 9 y 12) dan un doblete doble y un doblete que procede de un grupo CH2 mientras que los compuestos hidroxilados (H075-2, 6, 10 y 11) dan un singlete de 1 hidrógeno en 4,5 – 4,8 ppm.

R_{11}: La hidroxilación de la posición 11 se interpreta como ausencia de señal de H-11.

Cambios en el residuo de azúcar

Los glicósidos neutrales se indentifican debido a la ausencia de los singletes de 6H que proceden del grupo N(CH_{3})_{2} de C_{3}.

Los mono- y disacáridos se compararon con el espectro del trisacárido y se encontró que tenían o bien una rodosamina o una desoxifucosa como primer azúcar y en todos los casos se encontró que el segundo azúcar era una desoxifucosa como en los disacáridos.

Los compuestos H075-8a, -2b, -2a, -3d, -4a, -11b, -5e, -2d, -11e, -6b, -6c y -10a se identificaron de acuerdo con estos criterios como aquellos presentados en la fórmula II.

Ejemplo 4 Actividades citotóxicas in vitro 4.1 Tamizaje selectivo IN VITRO de nuevos compuestos 4.1.1 Cultivos celulares

Las citotoxicidades de las nuevas antraciclinas se sometieron a ensayo in vitro con dos líneas celulares: los sarcomas de útero humano MES-SA (CRL-1976; American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, EE.UU.) y MES-SA/Dx5 (CRL-1977; ATCC, Rockville, Maryland, EE.UU.). MES-SA/Dx5 se ha desarrollado por crecimiento de células MES-SA en concentraciones crecientes de doxorrubicina (Harker and Sikic, 1985). La variante seleccionada es 100 veces más resistente a doxorrubicina y también muestra una resistencia cruzada marcada a otros fármacos citotóxicos varios (resistencia a múltiples fármacos, MDR).

Se crecieron cultivos en monocapa en medio McCoy 5A con L-glutamina (GIBCO BRL) suplementado con 10% FBS (suero bovino fetal, Gibco BRL). No se añadieron antibióticos. Dado que la resistencia resulta estable durante al menos 20 pases, se cultivaron las células MES-SA/Dx5 sin selección de antraciclina (Harker and Sikic, 1985). Las células se mantuvieron a 37ºC con 5% de CO_{2} y se subcultivaron cada 3-5 días.

4.1.2 Ensayos citotóxicos

Los ensayos de citotoxicidad se llevaron a cabo en placas de microtitulación de 96 pocillos (placas blancas estériles con fondo transparente, Corning Costar Corporation, Cambridge, Mass., EE.UU.). Las antraciclinas se pipetearon en las placas en 10 \mul de etanol; en las placas control se empleó etanol puro. Daunorrubicina y aclarrubicina se usaron como controles positivos. Cuando el etanol se hubo evaporado, las células se sembraron en las placas en 100 \mul de medio apropiado. El número de células sembradas por pocillo fue de 2.500 MES-SA, 3.000 MES-SA/Dx5, 3.000 LL/2, 2.000 B16-F0 y B16-F1, 2.000 KLN-205 y 8.000 MLTC-1. El contenido de ATP de las células se midió tras incubación de las células durante tres días a 37ºC con 5% de CO_{2}.

4.1.3 Detección luminiscente de ATP

Se retiró el medio de crecimiento por inversión de las placas y se añadieron a los pocillos 200 \mul de reactivo de extracción de ATP, Somalyze. Las placas se incubaron entonces durante 30 minutos a temperatura ambiente. La medición del ATP se efectuó con un luminométro Luminoskan (Labsystems Oy, Helsinki, Finlandia) a 22ºC. Se dispensaron 20 \mul de reactivo para monitorizar el ATP que contenían luciferina y luciferasa y se efectuó una medida integral de 10 s con 2 s de retardo para cada pocillo. Todos los reactivos empleados los proporcionó Bio-Orbit Oy, Turku, Finlandia.

Los resultados directos del luminómetro (en unidades relativas de luz, RUL) se emplearon para calcular el efecto citotóxico. Esta señal luminosa es directamente proporcional a la cantidad de ATP en un amplio intervalo (determinado con el ATP estándar de Bio-Orbit, datos no mostrados). Por otro lado, la cantidad de ATP es directamente proporcional a la cantidad de células vivas (Kangas et al., 1984). Los resultados se expresan como porcentajes del valor control de células no tratadas. Un valor IC_{50} (la concentración de fármaco que resulta en una señal de ATP del 50% de la señal del control no tratado) se estimó gráficamente a partir de la gráfica de % del control frente a la concentración de fármaco.

4.1.4 Actividades in vitro de nuevas antraciclinas

(Tabla pasa página siguiente)

TABLA 7

18

De acuerdo con la Tabla 7, H075-4a muestra actividad potencial frente a las líneas celulares humanas estudiadas. Su actividad es similar a la de aclarrubicina. Todos los compuestos que tienen un aminoazúcar (a, b, c) exhibieron actividad frente a MES-SA. Además, las antraciclinas que poseen el disacárido dF-dF (e) mostraron una actividad moderada frente a MES-SA.

4.2 Estudios adicionales en H075-4a 4.2.1 Actividades in vitro frente a líneas celulares murinas

Se ensayó también H075-4a con varias líneas celulares in vitro (todas adquiridas de ATCC, Rockville, Maryland, EE.UU.): carcinoma pulmonar de Lewis (LL/2) (CRL-1642), melanoma B16-F0 (CRL-6322), melanoma B16-F1 (CRL-6323), carcinoma de células escamosas de pulmón KLN-205 (CRL-1453) y células de tumor de Leydig MLTC-1 (CRL-2065) y se emplearon daunorrubicina, aclarrubicina y H075-1a (MA 144U1) como referencias.

Todas las células crecieron como monocapas y se cultivaron a 37ºC con 5% de CO_{2} de acuerdo con las instrucciones estándares de la ATCC para cada línea celular: LL/2 en medio Eggle modificado por Dulbecco con 4,5 g/l de glucosa y 10% de FCS, B16-F0 y B16-F1 en MEM (Eagle) en BSS de Earle con aminoácidos no esenciales y 10% de FCS, KLN-205 en MEM (Eagle) en BSS de Earle con aminoácidos no esenciales y 10% de FCS, MLTC-1 en RPMI 1640 con 25 mM de Hepes y 10% de FBS. Todos los medios se adquirieron de Gibco BRL, el suero fue suero bovino fetal de Gibco BRL.

Los ensayos de citotoxicidad y la monitorización del ATP se llevaron a cabo de la misma manera a la descrita para líneas celulares humanas.

TABLA 8

19

Según se deduce de la Tabla 8, el compuesto H075-4a es activo frente a una variedad de líneas celulares ensayadas. Las actividades son similares a la de aclarrubicina.

4.2.2 Citometría de flujo (modo de acción de H075-4a)

Las células de leucemia linfocítica murina L1210 que crecen en cultivo en suspensión se mantuvieron en crecimiento exponencial en medio Eagle modificado por Dulbecco con 4,5 g/l de glucosa y un 10% de FBS a 37ºC con un 5% de CO_{2}. Los experimentos se iniciaron tras adición, a frascos de cultivo de células de 25 cm^{2}, de las antraciclinas disueltas en etanol en cantidades que proporcionaban las concentraciones finales apropiadas. Una vez se evaporó el etanol, se añadieron a los frascos 5 ml de una suspensión con aproximadamente 50.000 células por ml. Se realizó el análisis de citometría de flujo de la suspensión de células original y después de uno, dos y tres días de incubación, con y sin los fármacos.

Las células se prepararon para análisis de ADN por citometría de flujo de acuerdo con el método de Vindelov et al. (1955). El análisis se llevó a cabo con un citómetro de flujo Epics XL (Coulter Corporation, Miami, Fla.). Las muestras se iluminaron con un láser de ion argón enfriado por aire de 15 mV (488 nm) y la fluorescencia del yoduro de propidio se detectó a través de un filtro de paso de banda de 620 nm. El número de células en cada muestra se contó separadamente por adición de un calibrador interno (50 \mul de una suspensión que contenía 1 x 10^{6} bolitas de Fluoresbrite/ml) a 50 \mul de suspensión de células.

Basados en los estudios de citometría de flujo se pudieron detectar las fases del ciclo celular de las células estudiadas. La fase G1 es el estadío de síntesis de ARN y proteína, pero no de replicación. La transición de la fase G1 a la fase S indica la iniciación de la replicación y la fase durará hasta que todo el ADN se haya replicado. El período desde fase S hasta mitosis (M) es la fase G2. La antraciclina híbrida H075-4a paró las células en fase G1, como lo hizo la aclarrubicina, lo que sugiere que este compuesto previno la iniciación de la replicación.

(Tabla pasa página siguiente)

TABLA 9

20

Ejemplo 5 Actividad citotóxica in vivo; modelo de leucemia

La leucemia P388 se mantuvo mediante transplantes intraperitoneales (i. p.) seriados en ratones hembra DBA/
2JBom adquiridos de M & B A/S, Ry, Dinamarca. Los animales se mantuvieron en los animalarios del Laboratorio Central Animal, Universidad de Turku. El manejo de la unidad animal se basa en las siguientes directrices: "European Convention for the protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes, European Treaty Series No. 123 (EU No. 609/86), Official Journal of European Communities No. L358, Estrasburgo 24 de Noviembre de 1986" y "The Statute No. 1360/90 of the Finnish Law, Helsinki 21 de Diciembre de 1990: Asetus kokeellisiin ja muihin tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien selkärankaisten eläinten suojelemiseksi tehdyn eurooppalaisen yleissopimuksen voimaansaattamisesta. Suomen säädöskokoelma."

Los ensayos in vivo se empezaron el día 0 inyectando i.p. 10^{6} células P388 suspendidas en tampón fosfato salino de Dulbecco en los ratones. Se emplearon grupos de 3 ratones. Los medicamentos se administraron i.p. el día 1 en base al peso individual. El grupo control recibió excipiente (10% de etanol en tampón fosfato salino de Dulbecco). Los tiempos de supervivencia de los animales se registraron y se muestran en la Tabla 10. De acuerdo con estos datos los compuestos del presente invento muestran un aumento de la actividad comparada con la de daunomicina.

TABLA 10

21

Microorganismos depositados

Los siguientes microorganismos se depositaron bajo las reglas del tratado de Budapest en el DMSZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania.

22

Referencias

Bibb, M.J., Janssen, G.R. and Ward, J.M. (1985). Cloning and analysis of the promoter region of the erythromycin resistance gene (ermE) of Sptreptomyces erythraeus. Gene 38, 215-226.

Harker W.G. and Sikic B.I. (1985). Multidrug (pleiotropic) resistance in doxorubicin-selected variants of the human sarcoma cell line MES-SA. Cancer Research 45, 4091-4096.

Hopwood, D.A., Bibb, M.J., Chater, K.F., Kieser, T., Bruton, C.J., Kieser, H.M., Lydiate, D.J., Smith, C.P., Ward, J.M. and Schrempf, H. (1985). Genetic manipulations of Streptomyces: a laboratory manual. The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom.

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Claims (8)

1. Compuestos de antraciclinas útiles en terapia del cáncer que tienen la fórmula II,

23

en la que

R_{1}es CH_{2}CH_{3}, R_{2} es COOCH_{3},R_{3}es OH yR_{4}es Rhn-dF-dF (= H075-4a) o

R_{1}es CH_{3}, R_{2} es OH,R_{3}es OH yR_{4}es Rhn-dF (= H075-11b) o

R_{1}es CH_{2}CH_{3}, R_{2} es H,R_{3}es H yR_{4}es Rhn-dF-dF (= H075-8a) o

R_{1}es CH_{3}, R_{2} es OH,R_{3}es H yR_{4}es Rhn-dF (= H075-6b) o

R_{1}es CH_{2}CH_{3}, R_{2} es OH,R_{3}es H yR_{4}es Rhn-dF (= H075-2b) o

R_{1}es CH_{3}, R_{2} es OH,R_{3}es OH yR_{4}es dF-dF (= H075-11e) o

R_{1}es CH_{2}CH_{3}, R_{2} es OH,R_{3}es H yR_{4}es Rhn-dF-dF (= H075-2a) o

R_{1}es CH_{3}, R_{2} es OH,R_{3}es H yR_{4}es Rhn (= H075-6c) o

R_{1}es CH_{3}, R_{2} es COOCH_{3},R_{3}es OH yR_{4}es dF-dF (= H075-5e) o

R_{1}es CH_{2}CH_{3}, R_{2} es OH,R_{3}es H y R_{4}es dF-dF-dF (= H075-2d) o

R_{1}es CH_{3}, R_{2} es COOCH_{3},R_{3}es H y R_{4}es dF-dF-dF (= H075-3d) o

R_{1}es CH_{2}CH_{3}, R_{2} es OH,R_{3}es OH y R_{4}es Rhn-dF-dF (= H075-10a)

en la que Rhn es rodosamina y dF es desoxifucosa.

2. Compuestos de antraciclina, de acuerdo a la reivindicación 1, en los que

R_{1}es CH_{2}CH_{3}, R_{2} es COOCH_{3},R_{3}es OH y R_{4}es Rhn-dF-dF (= H075-4a) o

R_{1}es CH_{3}, R_{2} es OH,R_{3}es OH y R_{4}es Rhn-dF (= H075-11b) o

R_{1}es CH_{2}CH_{3}, R_{2} es OH,R_{3}es OH y R_{4}es Rhn-dF-dF (= H075-10a).

3. Derivados del compuesto aclavinona-Rhn-dF-dF que tienen la fórmula III

24

en la que R_{1}es CH_{3} o CH_{2}CH_{3}, R_{2} es H u OH yR_{3}es H u OH.

4. Un procedimiento para la producción de antraciclinas híbridas que comprende

transferir en el hospedador Streptomyces galilaeus H075 los genes para la biosíntesis de nogalamicina y/o rodomicina, lo que permite el cambio de sustituyentes de al menos una de las posiciones 9, 10 y 11 de la estructura principal de aclavinona,

cultivar las cepas obtenidas en condiciones que permitan la expresión de dichos genes y

recuperar las antraciclinas híbridas producidas.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, para la producción de un compuesto de fórmula II

25

en la que R_{1}es CH_{2}CH_{3} o CH_{3}, R_{2} es COOCH_{3}, H u OH,R_{3}es OH o H y R_{4}es Rhn-dF-dF, Rhn-dF, Rhn, dF-dF-dF o dF-dF, en la que Rhn es rodosamina y dF es desoxifucosa.

6. Un procedimiento para la producción de antraciclinas de fórmula II

26

en la que R_{1}es CH_{2}CH_{3}, R_{2} es COOCH_{3},R_{3}es H y R_{4}es Rhn-dF-dF, Rhn-dF, Rhn, dF-dF-dF o dF-dF, en la que Rhn es rodosamina y dF es desoxifucosa, que comprende cultivar la cepa Streptomyces galilaeus H075 (DSM 11638) en condiciones que permitan la producción de antraciclinas y la recuperación de las antraciclinas producidas.

7. Streptomyces galilaeus H075 (DSM 11638).

8. Una cepa H075 de Streptomyces galilaeus que lleva al menos una de las combinaciones de los genes clonados en los plásmidos pSY21, pJN028, pSYR1, pSYR2, pSYR3, pSYR4, pSYRS, pRdm51, pRdm52, pRdm53 y pRdm54, cuya construcción se describe en el Ejemplo 2.