ES2338596T3

ES2338596T3 - Cepas de streptomyces modificadas geneticamente para biotransformaciones en la produccion de antraciclina.

Info

Publication number: ES2338596T3
Application number: ES07016622T
Authority: ES
Inventors: Michael Dr. Lambert; Kristiina Dr. Ylihonko; Maria Holmbaeck
Original assignee: WC Heraus GmbH and Co KG
Current assignee: WC Heraus GmbH and Co KG
Priority date: 2007-08-24
Filing date: 2007-08-24
Publication date: 2010-05-10
Anticipated expiration: 2027-08-24
Also published as: ATE457038T1; PL2042608T3; EP2042608B1; DE602007004672D1; PT2042608E; TW200916576A; EP2042608A1

Abstract

Una cepa microbiana seleccionada entre el género Streptomyces que convierte los metabolitos de antraciclina en antibióticos de antraciclina no naturales, caracterizada porque la cepa está bloqueada en la biosíntesis de daunomicinas naturales y comprende el gen de resistencia heteróloga snorO.

Description

Cepas de Streptomyces modificadas genéticamente para biotransformaciones en la producción de antraciclina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a cepas microbianas mejoradas del género Streptomyces y a su uso en un procedimiento de biotransformación para mejorar los rendimientos de antibióticos antitumorales de antraciclina, particularmente epirrubicina e idarrubicina.

Antecedentes de la invención

Las daunomicinas son un grupo de antibióticos antitumorales producidos por diversas Streptomyces sp., tales como S. peucetius, S. coerulorubidus, S. griseus, Streptomyces sp. C5, S. peucetius var. caesius, y S. bifurcus. El compuesto básico del grupo es daunomicina (DiMarco et al., 1964). Las daunomicinas pueden describirse mediante la fórmula general I

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1

Sus derivados más importantes se muestran en la Tabla 1.

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TABLA 1

2

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Los derivados semisintéticos de daunorrubicina, epirrubicina e idarrubicina pueden clasificarse como antibióticos de antraciclina no naturales ya que las cepas de origen natural no producen estas antraciclinas. La epirrubicina se usa clínicamente para muchos tipos de cáncer. El mercado está creciendo y compite con la doxorrubicina. Nuevas formulaciones, conjugados y nuevas combinaciones con otros fármacos para el cáncer expanden también el uso de epirrubicina. La epirrubicina se fabrica por un procedimiento que comprende producir daunorrubicina por fermentación y modificar sintéticamente el resto aglicona y azúcar, descrito por ejemplo en la Patente de Estados Unidos 5.874.550.

La idarrubicina (4-desmetoxi-daunorrubicina) se usa para tratar ciertos tipos de cáncer, incluyendo leucemia, linfoma, y otras enfermedades de la médula ósea. Se reivindica que provoca menos efectos secundarios que la doxorrubicina. El mercado anual global para idarrubicina, sin embargo, no es mayor de 20 kg, presumiblemente debido a su precio excepcionalmente alto, que se debe a un procedimiento de fabricación muy complicado. La idarrubicinona se fabrica a partir de daunomicinona, obtenida de la fermentación de daunorrubicina con hidrólisis ácida posterior. La daunorrubicinona se modifica sintéticamente adicionalmente para dar idarrubicinona. Un resto azúcar, daunosamina, se une mediante una serie de reacciones sintéticas complicadas, como se revela, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.325.946.

En la producción por fermentación de antraciclinas importantes tales como daunorrubicina y epidaunorrubicina los intermedios se acumulan en el caldo de fermentación. Un intermedio típico en ambos casos es \varepsilon-rodomicinona (Strohl et al., 1989). Sin embargo, como la epidaunorrubicina puede producirse por fermentación usando una cepa modificada genéticamente, la 13-dihidro-epidaunorrubicina (denominada 13-DHED) se acumula concomitantemente en el caldo de fermentación. Típicamente, estos metabolitos se consideran como un residuo. La Patente de Estados Unidos Nº 5.652.125 revela el uso de \varepsilon-rodomicinona para producir daunorrubicina, y Dickens et al. (1997) han descrito la oxidización de 13-dihidro-antraciclinas a sus formas 13-ceto. No se han localizado publicaciones que describan la biotransformación en procedimientos para antraciclinas no naturales.

Se ha descubierto un nuevo procedimiento para obtener mayores rendimientos de antraciclinas no naturales comercialmente importantes, epirrubicina e idarrubicina a un menor coste por utilización de los productos secundarios obtenidos en la producción por fermentación de daunomicina y epidaunorrubicina.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una presentación esquemática de la ruta biosintética para la clase daunomicina de antraciclinas.

La Figura 2 es una presentación esquemática del procedimiento para la producción de epirrubicina e idarrubicina de acuerdo con la presente invención.

La Figura 3 es un cromatograma que muestra el perfil de producción de una biotransformación de la cepa de acuerdo con la presente invención después de alimentarla con 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona.

Rt = 6,0: 13-dihidro-idarrubicina, Rt = 6,9: idarrubicina, Rt = 8,1: 13-desoxi-idarrubicina.

Rt = 11,0: 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona.

Breve descripción de la invención

La presente invención se refiere a una cepa microbiana del género Streptomyces, que convierte los metabolitos de antraciclina, tales como epidaunorrubicina, 13-dihidroepidaunorrubicina, 4'-epi-feudomicina y \varepsilon-rodomicinona, en antibióticos de antraciclina no naturales, tales como epirrubicina e idarrubicina. Preferiblemente, dichas cepas se seleccionan entre la especie Streptomyces peucetius, y más preferiblemente entre la subespecie Streptomyces peucetius var. caesius. En la presente invención, dicha cepa está bloqueada en la biosíntesis de daunomicinas naturales y comprende un gen de resistencia heteróloga snorO, aislado de la especie Streptomyces nogalater.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para convertir metabolitos de antraciclina tales como 13-dihidroepidaunorrubicina, y \varepsilon-rodomicinona, en antibióticos de antraciclina no naturales, tales como epirrubicina e idarrubicina usando una cepa microbiana de acuerdo con la presente invención. En una realización preferida de acuerdo con la presente invención, en dicho procedimiento una resina, seleccionada preferiblemente entre el grupo constituido por adsorbentes iónicos y no iónicos, más preferiblemente entre poliestirenos, y más preferiblemente entre el grupo constituido por XAD-7 y Diaion HP-20, se usa en cualquier momento para adsorber los metabolitos de antraciclina o los antibióticos de antraciclina.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a cepas de Streptomyces mejoradas, que son capaces de convertir los intermedios de antraciclina modificados en fármacos antitumorales de antraciclina importantes, idarrubicina y epirrubicina. Dichas cepas son útiles en un procedimiento para convertir los metabolitos de antraciclina en los productos finales.

Por tanto, un objeto de la presente invención proporciona una cepa de Streptomyces mejorada, modificada para poder convertir de forma estable 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona en idarrubicina a un alta velocidad. Dicha cepa, bloqueada para producir daunorrubicina, procedía de una cepa G001 (DSM 12245) como se revela en el Ejemplo 1 (la cepa G001 procedía por mutagenización de S. peucetius var. caesius de tipo silvestre ATCC 27952). Esta cepa mutante mejorada procedente de la cepa G001 es capaz de convertir la 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona en idarrubicina aunque la repitiblidad era mala. Para mejorar la conversión, se introdujeron genes de resistencia en esta cepa.

El gen snorO se aisló de S. nogalater (ATCC 27952) y se sugiere que es el responsable de la resistencia a nogalamicina (Torkkell 2001). Basándose en el análisis de la secuencia, el producto génico, SnorO es un producto génico multifunción para resistencia, con dominios para la proteína de reparación de la excisión UvrA, y proteína de unión a ATP transportadora de ABC. La expresión heteróloga de snorO en TK24 de S. lividans mostró que el gen protegía a la cepa de todas las antraciclinas, nogalamicina, aclarubicina y daunorrubicina diferentes ensayadas. La introducción del gen snorO en la cepa mejorada procedente de G001 proporcionó una cepa de biotransformación, que presenta una mayor resistencia a idarrubicina. Sorprendentemente, snorO, cuando se introducía en la cepa mejorada procedente de G001 en el vector E. coli, mejoraba la velocidad de conversión y estabilizaba la cepa para mantener la conversión dentro del \pm10%, incluso en seis secuencias de cultivo.

Dicha nueva cepa de biotransformación puede alimentarse mediante intermedios de antraciclina naturales tales como aclavinona y \varepsilon-rodomicinona y se forman antraciclinas naturales, las daunomicinas.

Sorprendentemente, la cepa es capaz de realizar la conversión de metabolitos no naturales y la alimentación con 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona no natural dio como resultado la formación de idarrubicina. Además, la cepa es capaz de convertir 13-DHED en epidaunorrubicina. Se presenta la conversión sintética de \varepsilon-rodomicinona en 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona. De acuerdo con la presente invención la 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona se biotransforma posteriormente en idarrubicina mediante la nueva cepa de biotransformación mencionada anteriormente, que no produce metabolitos de daunomicina. 13-DHED se convirtió adicionalmente en epidaunorrubicina por biotransformación usando la misma cepa mutante.

Los aspectos importantes de una cepa de biotransformación adecuada para usarla en la presente invención son:

i): se aceptan sustratos naturales y no naturales para la conversión;

ii): la cepa tiene una mayor resistencia contra antraciclinas naturales y no naturales;

iii): la cepa realiza funciones esenciales necesarias para la conversión, y

iv): la cepa no acumula cantidades detectables de daunomicinas naturales.

Puede usarse cualquier cepa de Streptomyces adecuada para la biotransformación del intermedio 4-desoxi-semisintético en idarrubicina. Independientemente de ello, es crítico que la cepa tenga genes expresables endógenos o transferidos para las siguiente reacciones: modificaciones de glucosa para formar daunosamina, actividad 10-esterasa para retirar un grupo metilo con la actividad 10-descarboxilasa conectada, 13-oxigenasa y la actividad glicosil transferasa adecuada. Adicionalmente, el procedimiento aguas abajo después de la biotransformación es rentable sólo si no se acumulan o lo hacen en cantidades mínimas los metabolitos de antraciclina natural en la cepa usada como huésped en la biotransformación.

Es ventajoso usar un mutante de S. peucetius var. caesius bloqueado en la fase temprana de la biosíntesis de daunomicina; preferiblemente un mutante bloqueado en PKS mínima (la PoliCetidoSintasa mínima cataliza las primeras reacciones, el montaje del policetido en antraciclina y otra ruta de policetido Tipo II).

La nueva cepa de biotransformación derivada de Streptomyces peucetius var. caesius de tipo silvestre ATCC 27952 como se ha descrito anteriormente es una cepa muy preferida, aunque cualquier cepa que comparta las siguientes características es adecuada para el procedimiento de conversión de acuerdo con la presente invención.

1. Bloqueo en la ruta temprana para daunomicinas. Alteración del gen dpsG de PKS mínima (datos no mostrados) basada en el experimento de complementación del gen correspondiente.

2. No produce cantidades detectables de daunomicinas, mientras que acumula una sustancia ácida de color amarillo en medio sólido. La estructura del compuesto no se conoce, pero no es un miembro de las antraciclinas.

3. En las placas ISP4+tsr- y ISP2+tsr la cepa de biotransformación normalmente es no esporulante y forma hifas aéreas incoloras.

4. Expresa resistencia a diversas antraciclinas diferentes como consecuencia de la función snorO.

5. Convierte la 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona en dos productos principales: idarrubicina y 13-dihidroidarrubicina. Algunos otros metabolitos de idarrubicina se encuentran en pequeñas cantidades.

La presente invención se refiere adicionalmente a un procedimiento para la producción de antibióticos de antraciclina no naturales, epirrubicina e idarrubicina aprovechando los productos de derivación, \varepsilon-rodomicinona, formada en la producción por fermentación de daunorrubicina y epidaunorrubicina, y 13-DHED, formada en la producción por fermentación de epidaunorrubicina.

Por tanto, otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para preparar antibióticos de antraciclina comercialmente útiles mediante biotransformación usando una cepa huésped bacteriana mejorada de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, dicha cepa huésped es la nueva cepa de biotransformación descrita anteriormente, derivada de S. peucetius var. caesius.

En la técnica, se sabe que la idarrubicinona puede convertirse en idarrubicina mediante una serie de síntesis químicas complicadas, como se revela, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 7.053.191. En el procedimiento de acuerdo con la presente invención se usa una serie de reacciones biosintéticas endógenas de una cepa bacteriana para convertir la 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona en idarrubicina. Se sabe que la biosíntesis transcurre en la secuencia mostrada en la Figura 1. La aclavinona, un precursor típico para diversas antraciclinas, se 11-hidroxila para formar \varepsilon-rodomicinona, que se glucosila. Las modificaciones en la posición 10 necesitan una forma glucosilada incluso aunque otros restos azúcar, tales como rodosamina, son sustratos aceptados. Después de las modificaciones en la posición 10, tiene lugar la oxigenación en la posición 13 y la última etapa para la biosíntesis de daunorrubicina es una O-metilación en C-4. Sorprendentemente, las últimas modificaciones en las posiciones 10 y 13, así como la glucosilación fueron satisfactorias a pesar de la forma 4-desoxi. Ambas 4-desoxiaclavinona y 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona se convierten en idarrubicina usando una cepa de biotransformación adecuada. Sin embargo, los productos génicos para estas modificaciones necesitan un sustrato en el que el sustituyente en C-10 sea un grupo COOCH_{3}.

La \varepsilon-rodomicinona, obtenida como un producto de derivación por un procedimiento de fermentación de metabolitos de daunomicina, se procesa en 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona por química sintética. Son posibles diversas trayectorias sintéticas para retirar un grupo hidroxilo de la posición 4 de \varepsilon-rodomicinona. Sin embargo, se ha preferido realizar la serie de cuatro reacciones empezando por la protección de los grupos hidroxilo C7 y C9 por cetalización. Después de esto, la trifilación del grupo OH en C4 tiene lugar después por reducción para retirar el sustituyente en C4. Después de cada etapa el producto se aísla o purifica por precipitación/cristalización y se obtiene un rendimiento global de > 20%, preferiblemente > 30%, más preferiblemente > 40%. La pureza de la 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona obtenida en este procedimiento es > 60%, preferiblemente > 80%, más preferiblemente > 90%, siendo un sustrato adecuado para la biotransformación. La \varepsilon-rodomicinona típicamente se acumula en el caldo de fermentación en grandes cantidades y la purificación por procedimientos convencionales es satisfactoria. La conversión sintética de \varepsilon-rodomicinona proporciona > 20%, preferiblemente > 30%, más preferiblemente > 40% de 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona pura, que se suministró a la cepa mutante no productora de S. peucetius var. caesius. La eficacia de biotransformación de 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona en idarrubicina fue > 20%, preferiblemente > 30%, más preferiblemente > 40%. Pueden suministrarse más de 100 mg del intermedio semisintético a un litro del cultivo de la cepa de biotransformación. La temporización para el suministro del intermedio no es crítica. Pueden usarse cualquiera condiciones de fermentación que permitan el crecimiento de estreptomicetos y metabolismo secundario, aunque es ventajoso el uso de medio E1 y un intervalo de temperatura de 25-35ºC en pH entre 6 y 8.

La recuperación de idarrubicina del cultivo puede realizarse con cualquier procedimiento adecuado, tal como centrifugación, filtración o mediante un adsorbente iónico o no iónico adecuado. Para la inserción de idarrubicina, puede usarse cualquier disolvente orgánico soluble en agua, aunque se prefieren los alcoholes ácidos. Las agliconas se retiran con extracción ácida después de lo cual los glucósidos se extraen de nuevo de la fase acuosa a la fase de cloroformo a alto pH. Dependiendo del perfil de los compuestos después de la evaporación del último extracto, la idarrubicina se purifica finalmente por cristalización o, preferiblemente, por cromatografía y cristalización. Es ventajoso usar una columna de sílice para la purificación.

Conversión de 13-DHED en epidaunorrubicina

Se sabe bien que las 13-dihidro-antraciclinas se acumulan en el caldo de fermentación junto con las formas 13-ceto. Sin embargo, 13-DHED no es comercialmente útil y, basándose en su naturaleza citotóxica, debe manipularse como un residuo tóxico. Para nuestra sorpresa, aunque este metabolito no es natural, se convirtió en epidaunorrubicina mediante la cepa de biotransformación a una velocidad útil, por ejemplo > 20%, preferiblemente > 30%, más preferiblemente >
40%.

13-DHED, un producto secundario en la fermentación de la epidaunorrubicina, se separa fácilmente de la fracción glucosídica por cromatografía seguido de cristalización junto con la separación de la epidaunorrubicina. 13-DHED podría adsorberse en una resina añadida al caldo de cultivo de la cepa de Streptomyces con capacidades para síntesis de daunomicina y especialmente las últimas etapas. Aunque cualquier cepa es adecuada, es ventajoso usar la cepa que está bloqueada en la ruta temprana biosintética y es incapaz de acumular metabolitos de daunomicina.

En una realización preferida de la presente invención, la nueva cepa de biotransformación, procedente de S. peucetius var. caesius se usa para biotransformación para convertir 13-DHED en epidaunorrubicina.

Las velocidades de conversión en las condiciones descritas para la producción de epidaunomicinas de acuerdo con la presente invención son > 20%, preferiblemente > 30%, más preferiblemente > 40%. La epidaunorrubicina obtenida de esta manera puede purificarse a partir de otros metabolitos unidos a la resina por cualquier procedimiento convencional usado para la recuperación de antraciclinas mientras que la cromatografía y especialmente la cromatografía de fase inversa se usa preferiblemente para proporcionar epidaunorrubicina adecuadamente purificada para la síntesis.

Conversión de epidaunorrubicina en epirrubicina

La epidaunorrubicina bruta (pureza > 60%, preferiblemente > 80%, más preferiblemente > 90%) se usa como un material de partida para química sintética para obtener epirrubicina, que es un fármaco para el cáncer usado frecuentemente. Puede usarse cualquier serie de reacciones sintéticas o biocatalíticas para la 14-hidroxilación.

Hay varias posibilidades de convertir la epidaunorrubicina en su forma 14-hidroxilada, epirrubicina. El producto génico endógeno solo, 14-hidroxilasa, no es suficientemente activo en las condiciones de cultivo para convertir toda la epidaunorrubicina formada en epirrubicina aunque se encuentren cantidades minoritarias de epirrubicina en el caldo de cultivo. De acuerdo con nuestros experimentos (datos no mostrados), incluso grandes copias del gen para 14-hidroxilasa, fallaban a la hora de completar el procedimiento de producción de epirrubicina. Independientemente de ello, dos patentes de Estados Unidos, US 5.955.319 y US 6.210.930 revelan la conversión de daunorrubicina en doxorrubicina a un nivel bajo por el producto génico de doxA. Aparentemente, la bioconversión es altamente dependiente de las condiciones, y no hemos conseguido volver a repetir el procedimiento.

Hay diversas posibilidades para añadir un grupo hidroxilo en el C-14 de la epidaunorrubicina intacta, análogamente a la síntesis de doxorrubicina a partir de daunorrubicina.

La purificación de epirrubicina se realiza por cromatografía y/o por cristalización después de la extracción de epirrubicina de la mezcla de síntesis. Sin embargo, para conseguir la calidad requerida para el ingrediente farmacéutico activo, la separación cromatográfica para dar epirrubicina con una pureza > 97% es esencial.

En los siguientes ejemplos se da una revelación más detallada de la presente invención.

Para un especialista en la técnica será obvio que, a medida que avanza la tecnología, el concepto inventivo puede realizarse de forma práctica de diversas maneras. La invención y sus realizaciones no se limitan a los ejemplos descritos más adelante, sino que pueden variar dentro del alcance de las reivindicaciones.

La Figura 1a revela una ruta biosintética para daunorrubicina. Las baumicinas se forman a partir de daunorrubicina. La ruta biosintética se ramifica para (i) doxorrubicina y (ii) baumicina después de la daunorrubicina. Estas etapas no se muestran en la figura.

La Figura 1b revela una ruta biosintética para dTDP-daunosamina, que se usa para la glucosilación en C-7 en la Figura 1a.

La Figura 2 revela un esquema para un procedimiento de biotransformación.

La Figura 3 revela un cromatograma que muestra el perfil de producción de la cepa de biotransformación después de alimentarla con 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de una cepa de biotransformación

Para la cepa de mutagenización G001, procedente de S. peucetius var. caesius de tipo silvestre ATCC 27952 por mutagenización se cultivó en 50 ml de medio de TSB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Todos los matraces para la mutagénesis contenían un cordel en el fondo del matraz para dispersar las micelas durante el cultivo. El cultivo se realizó durante dos días a 30ºC y 330 rpm en un agitador. Un ml del cultivo se inoculó adicionalmente al siguiente frasco que contenia 50 ml de TSB y el cultivo continuó durante un día (30ºC, 330 rpm). Este cultivo más joven se adaptó al pH alcalino con NaOH y se añadió NTG para que actuara sobre las células durante 20 minutos a > 30ºC. El cultivo mutagenizado de dicha cepa se dividió en dos tubos y se hizo sedimentar por centrifugación (300 rpm, 10 minutos). Los sedimentos combinados se usaron para inocular 50 ml de medio de TSB. Después de un día (30ºC, 330 rpm), la valoración de la suspensión celular se determinó poniendo en placas las diluciones adecuadas, por ejemplo 1:10 - 1: 100000 sobre placas ISP4. Las colonias de cultivos mutagenizados se compararon con las de tipo silvestre y las que presentaban características diferentes de las del tipo silvestre se seleccionaron para caracterización adicional.

Los mutantes se seleccionaron basándose en el color pálido respecto al tipo silvestre que está pigmentado de color rojo oscuro en la placa de ISP4-agar.

El gen snorO (Torkkell, 2001) se introdujo en los mutantes con el vector E. coli, pCNB3033. Se sugirió que la integración ocurría en el sitio attP. La cepa de biotransformación mejorada obtenida dio velocidades de conversión repetidas para > 20%, preferiblemente > 30%, más preferiblemente > 40% de 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona suministrada en los metabolitos de idarrubicina como se describe detalladamente en el Ejemplo 5.

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Ejemplo 2 Cultivo de cepas de biotransformación para la producción de metabolitos de antraciclina y para biotransformación

Los mutantes adecuados seleccionados como se ha descrito en el ejemplo 1 se cultivaron en 50 ml de medio E1 complementado con resina adsorbente (15 g/l). (E1: por litro de agua del grifo: glucosa 20 g; almidón soluble 20 g; péptido 5 g; extracto de levadura 2,5 g; K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O 1,3 g; MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 1 g; NaCl 3 g; CaCO_{3} 3 g; pH 7-7,5).

Para determinar los metabolitos de antraciclina los compuestos se extrajeron en el décimo día de incubación. Para el análisis, la resina adsorbente se decantó con agua desde un matraz de cultivo y la resina lavada se extrajo con 40 ml de alcohol ácido agitando durante al menos 30 min. Se usó HPLC para analizar las muestras. Se sabe que el uso de una resina adsorbente en medio E1 aumenta la producción de metabolitos de antraciclina en dichas condiciones. No se encontraron cambios en la morfología de la colonia al final del cultivo en presencia del adsorbente.

La producción de metabolitos de antraciclina no se detectó en el caldo de cultivo de las cepas mutantes.

Sin embargo, las cepas mutantes tienen los genes biosintéticos funcionales para la glucosilación y modificación de agliconas de acuerdo con la ruta de biosíntesis de la Figura 1 y como se demostró mediante experimentos de suministro. Las agliconas naturales, \varepsilon-rodomicinona y aclavinona se suministraron a las cepas mutantes (al menos 100 mg de la aglicona por 1 litro del caldo de cultivo) y la aglicona suministrada se convirtió en metabolitos de daunomicina en dos días. Sin embargo, el suministro de las cepas mutantes con 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona falló a la hora de dar una conversión repetida a metabolitos de idarrubicina. Se sugirió que la razón del fallo podía estar provocada por una mala resistencia contra el producto suministrado o formado.

La cepa de biotransformación mejorada era capaz de convertirse en las agliconas naturales, \varepsilon-rodomicinona y aclavinona como se esperaba. También convirtió el intermedio biosintético no natural análogo, 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona y 13-DHED en idarrubicina y en epidaunorrubicina, como se describe en el ejemplo 4 más adelante.

Ejemplo 3 Conversión sintética de \varepsilon-rodomicinona en 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona

Se usó \varepsilon-rodomicinona purificada con una pureza cromatográfica > 60%, preferiblemente > 80%, más preferiblemente > 90% para la síntesis de 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona.

La síntesis de 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona consiste en cuatro etapas:

A) protección, B) trifilación, C) reducción y D) desprotección.

Después de cada etapa el producto se aisló por precipitación/cristalización en mezclas cloroformo-metanol. Las reacciones de síntesis se controlaron con TLC.

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A) Protección

Se disolvió \varepsilon-rodomicinona en cloroformo a temperatura ambiente. Se añadieron 2 eqv. de 2-metoxipropeno a una mezcla seguido de 1 eqv. de TMSCI. La reacción se siguió por TLC. Cuando la reacción hubo terminado, según se detecta en la placa de TLC, la mezcla se dejó enfriar y el precipitado se recogió y se secó para la siguiente etapa.

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B) Trifilación

Un material de partida de la etapa de protección se disolvió en cloroformo. Se añadieron NMP (N-metil pirrolidona) y di-isopropiletilamina (DIPEA) y finalmente PhNTf2. La reacción se controló con TLC. El compuesto se precipitó añadiendo agua y ácido cítrico a la mezcla. El precipitado se filtró y se lavó con KHSO_{4}. Los cristales se filtraron y se secaron al vacío.

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C) Reducción

El material de la trifilación se suspendió en ACN en atmósfera de argón. Se añadió (Ph3P)4Ph seguido de la adición de (Etil)_{3}N y HCOOH. La mezcla de reacción se calentó y la reacción se siguió por TLC. Después de 1 h la reacción había terminado. La mezcla de reacción se dejó enfriar y el producto se retiró por filtración.

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D) Desprotección

El producto de la reducción se disolvió en cloroformo y se añadió 1 eqv. de TsOH x H_{2}O a TA. La reacción transcurre en 0,5 h. La solución se lavó con NaHCO_{3} 1 M, se secó con MgSO_{4} y se evaporó a sequedad.

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Purificación de 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona

Una mezcla de reacción de desprotección (CHCl_{3}/TsOH x H_{2}O) se diluyó con cloroformo, y se lavó con NaHCO_{3} 1 M. La fracción de cloroformo se secó con MgSO_{4} anhidro, se filtró y se evaporó a sequedad. La cristalización se realizó en cloroformo-metanol. Los cristales se filtraron y se secaron al vacío.

Ejemplo 4 Recuperación de 13-DHED del caldo de cultivo de una cepa mutante productora de epidaunorrubicina procedente de Streptomyces peucetius var. caesius

El caldo de fermentación para la producción de epidaunorbicina contiene tres metabolitos principales, en este orden: epidaunorrubicina, 13-DHED y epi-feudomicina (Ref. solicitud epi-patent). Los sustituyentes adsorbidos a una resina se decantaron del caldo de cultivo de 20 litros obtenido de la fermentación. La resina se lavó para retirar los restos celulares con agua. El sedimento se extrajo con alcohol de una a cinco veces. Las agliconas se extrajeron con cloroformo añadiendo cloroformo a los extractos de alcohol combinados. Las fases de disolvente y acuosa se separaron. Los glucósidos en la fase acuosa se extrajeron en cloroformo a un pH ligeramente alcalino y el pH se estabilizó con NaHCO_{3} saturado. Las sales se retiraron lavando con agua. Finalmente la fase de cloroformo se filtró a través de un filtro de tipo cartucho.

La cromatografía en gel de sílice se realizó para separar los metabolitos. El filtrado se bombeó a una columna de sílice y se purificó por cromatografía usando una solución de cloroformo-metanol como fase móvil. Se recogieron fracciones puras de cada uno de los tres metabolitos, y las fracciones de cada producto se combinaron para la cristalización. Las fracciones de 13-DHED se cristalizaron en soluciones de etanol-agua. Los cristales se filtraron y adsorbieron en una resina adsorbente.

Ejemplo 5 Conversión biosintética de 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona y metabolitos relacionados en idarrubicina

El cultivo de siembra se realizó cultivando una cepa de biotransformación en dos matraces de 400 ml del medio E1 durante tres días. Los cultivos se combinaron y los 800 ml del caldo de cultivo se usaron para inocular 20 litros de medio E1 complementado con XAD-7. La fermentación se realizó en un volumen de 20 litros durante 8 días a la temperatura de 30ºC, a 350 rpm con una aireación de 10 l/min. El pH tenía que mantenerse ligeramente ácido, lo que asegura una conversión más estable de la 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona suministrada a la idarrubicina. La 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona se suministró continuamente durante 4 días empezando 24 horas después de la inoculación con al menos 5 mg/ml de 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona en EtOH. La cantidad de 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona suministrada es de al menos 100 mg/l.

Durante la biotransformación con la cepa mutante se produjeron dos metabolitos secundarios principales a partir de la 4-desoxi-\varepsilon-rodomicinona suministrada; en concreto idarrubicina y 13-dihidro-idarrubicina. Otros metabolitos minoritarios fueron idarrubicinona, 13-dihidroidarrubicinona, baumicinas y 13-desoxi-idarrubicina y sus agliconas. La valoración estable de idarrubicina es > 20 mg/l, produciéndose adicionalmente > 20 mg/l del intermedio previo 13-DHI; por lo tanto, la cantidad realmente es > 40 mg/l. Las baumicinas pueden hidrolizarse a idarrubicina por calentamiento en condiciones ácidas (+45ºC, 1 hora). En la Figura 3 se muestra el cromatograma de los productos obtenidos a partir de la cepa de biotransformación.

Ejemplo 6 Conversión biosintética de 13-DHED en epidaunorrubicina

El pre-cultivo de la cepa de biotransformación se realizó como se ha descrito detalladamente en el Ejemplo 5.

La 13-DHED adsorbida a la resina correspondía a al menos 50 mg/l del caldo de cultivo añadido al cultivo después de un día y el cultivo continuó durante cuatro días. Las fermentaciones se realizaron en matraces que contenían 50 ml de medio E1, a 34ºC, y 300 rpm.

De acuerdo con el análisis cromatográfico, el 50% de la 13-DHED se convirtió en epidaunorrubicina. Se detectaron cantidades minoritarias de epirrubicina, en el intervalo de < 10%.

Ejemplo 7 Medición analítica de agliconas y antraciclinas

TLC

1.: 0,5 MQ-agua

2.: 0,1 HCOOH

3.: 25 MeOH

4.: 75 CHCl_{3}, mezclado con las soluciones 1, 2 y 3 cuidadosamente

HPLC

Equipo: equipo de cromatografía Hewlett-Packard que pertenece a la serie 1100 con detector de serie de diodos.

Columna: Zorbax, SB-C8, Agilent, 4,6 x 150 mm, de 3,5 micrómetros

Disolventes usados: TFA al 0,05%, y MeCN-tetrahidrofurano 1:1

Temperatura de la columna: 30ºC

Velocidad de la corriente: 1 ml/min

Detección: 254 \pm 8 nm, longitud de onda de referencia 600 nm \pm 50 nm

Volumen de inyección: 5 \mul

Presión: mín. 20 bar, máx. 300 bar.

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Parámetros usados

3

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Lista de referencias

Dickens M, Priestley N y Strohl W: In vivo and in vitro bioconversion of \varepsilon-rhodomycinone glycoside to doxorubicin: Function of DauP, DauK, and DoxA. (1997) J. Bacteriol. 179: 2641-2650.

Di Marco A, Silvestrini R, Gaetani M, Soldati M, Orezzi P, Dasdia T, Scarpinato BM, Valentini L: "daunomycin", a new antibiotic of the rhodomycin group. (1964) Nature 15: 706-707.

Hopwood DA, Bibb MJ, Chater KF, Kieser T, Bruton CJ, Kieser HM, Lydiate DJ, Smith CP, Ward JM y Schrempf H: Genetic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manual. (1985) John Innes Foundation, Norwich.

Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T: Molecular Cloning: a Laboratory Manual. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

Strohl W.R, Bartel P, Connors NC, Zhu C, Dosch D, Beale JM, Floss HG, Stuzman-Engwall K, Otten SL y Hutchinson CR: Biosynthesis of natural and hybrid polyketides by anthracycline-producing streptomycetes. (1989) p. 68-84, C.L. Hershberger, SW Queener y G Hegeman (ed.) Genetics and molecular biology of industrial micro-organisms. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

Torkkell S, Kunnari T, Palmu K, Mäntsälä P, Hakala J e Ylihonko K: The entire nogalamycin biosynthetic gene cluster of Streptomyces nogalater: characterization of a 20-kb DNA region and generation of hybrid structures. (2001) Molecular Genetics and Genomics 266: 276-288.

Torkkell S: Anthracycline antibiotics: Biosynthetic pathway and molecular genetics of nogalamycin, a product of Streptomyces nogalater. (2001) Publicaciones en Annales Universitatis Turkuensis-series Nº 275.

Claims

1. Una cepa microbiana seleccionada entre el género Streptomyces que convierte los metabolitos de antraciclina en antibióticos de antraciclina no naturales, caracterizada porque la cepa está bloqueada en la biosíntesis de daunomicinas naturales y comprende el gen de resistencia heteróloga snorO.

2. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dichos metabolitos de antraciclina se seleccionan entre el grupo constituido por epidaunorrubicina, 13-dihidroepidaunorrubicina, 4'-epi-feudomicina y \varepsilon-rodomicinona.

3. La cepa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que dichos antibióticos de antraciclina no naturales se seleccionan entre el grupo constituido por epirrubicina e idarrubicina.

4. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha cepa se selecciona entre la especie Streptomyces peucetius.

5. La cepa de acuerdo con la reivindicación 4, en la que dicha cepa se selecciona entre la subespecie Streptomyces peucetius var caesius.

6. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho gen se aísla del género Streptomyces.

7. La cepa de acuerdo con la reivindicación 6, en la que dicho gen se aísla de la especie Streptomyces nogalater.

8. La cepa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha cepa proporciona una velocidad de conversión de los metabolitos de antraciclina en los antibióticos de antraciclina no naturales de > 20%.

9. La cepa de acuerdo con la reivindicación 8, en la que dicha cepa proporciona una velocidad de conversión de los metabolitos de antraciclina en los antibióticos de antraciclina no naturales de > 30%.

10. La cepa de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicha cepa proporciona una velocidad de conversión de los metabolitos de antraciclina en los antibióticos de antraciclina no naturales de > 40%.

11. Un procedimiento para convertir los metabolitos de antraciclina en antibióticos de antraciclina usando una cepa microbiana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dichos metabolitos de antraciclina se seleccionan entre el grupo constituido por epidaunorrubicina, 13-dihidroepidaunorrubicina, 4'-epi-feudomicina y \varepsilon-rodomicinona.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, en el que dichos antibióticos de antraciclina se seleccionan entre el grupo constituido por epirrubicina e idarrubicina.

14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que dicha cepa proporciona una velocidad de conversión de los metabolitos de antraciclina en los antibióticos de antraciclina no naturales de > 20%.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicha cepa proporciona una velocidad de conversión de los metabolitos de antraciclina en los antibióticos de antraciclina no naturales de > 30%.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicha cepa proporciona una velocidad de conversión de los metabolitos de antraciclina en los antibióticos de antraciclina no naturales de > 40%.

17. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que la pureza de los metabolitos de antraciclina brutos usados para la biotransformación es > 60%.

18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la pureza de los metabolitos de antraciclina brutos usados para la biotransformación es > 80%.

19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la pureza de los metabolitos de antraciclina brutos usados para la biotransformación es > 90%.

20. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en el que se usa una resina en cualquier momento para adsorber los metabolitos de antraciclina o antibióticos de antraciclina.

21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicha resina se selecciona entre el grupo constituido por adsorbentes iónicos y no iónicos.

\newpage

22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que dicha resina se selecciona entre el grupo de los poliestirenos.

23. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que dicha resina se selecciona entre el grupo constituido por XAD-7 y Diaion HP-20.

24. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que dicha resina se añade en una cantidad de 1 - 100 g/l.

25. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, en el que dicha resina se añade en una cantidad de 10 - 50 g/l.

26. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dicha resina se añade en una cantidad de 15 - 30 g/l.