ES2206529T3

ES2206529T3 - Pegamento para tejidos a base de fibronogeno y su utilizacion para la preparacion de un hemostatico.

Info

Publication number: ES2206529T3
Application number: ES96107785T
Authority: ES
Inventors: Thomas Dr. Seelich; Peter Dr. Turecek
Original assignee: Baxter AG
Current assignee: Baxter AG
Priority date: 1995-06-12
Filing date: 1996-05-15
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2016-05-15
Also published as: DE19521324C1; EP0748633A2; CA2178789A1; EP0748633A3; US5883078A; JPH092971A; EP0748633B1; ATE248614T1

Abstract

SE DESCRIBE UN PEGAMENTO ESTABLE DE TEJIDOS, QUE COMPRENDE FIBRINOGENO Y UN ACTIVADOR O PROACTIVADOR DE PROTROMBINA, SIENDO SU CONTENIDO EN PROTROMBINA DE LA SANGRE, DE MENOS DE 5 UNIDADES/G DE FIBRINOGENO. ESTE PEGAMENTO TISULAR SE PUEDE PRESENTAR COMO UN PREPARADO LIQUIDO O SECO, Y PUEDE ESTAR OPCIONALMENTE EN UN MATERIAL PORTADOR HIDROSOLUBLE Y BIOLOGICAMENTE DEGRADABLE.

Description

Pegamento para tejidos de fibrinógeno y su utilización para la preparación de un hemostático.

La invención se refiere a un pegamento de tejidos y al empleo del mismo para la preparación de un hemostático, en particular la invención se refiere a una preparación farmacéutica, con estabilidad de almacenamiento, de carácter hemostático, para pegar tejidos lesionados y para activar la cicatrización a base de fibrinógenos y un activador del factor de coagulación de la sangre.

Los pegamentos de tejidos a base de fibrinógenos se emplean para unir sin sutura o para ayudar a suturar tejidos humanos o animales o partes de órganos, para sellar heridas, para cortar hemorragias y para activar la cicatrización.

Su funcionamiento se basa en que por la acción de la trombina, el fibrinógeno (líquido) contenido en el pegamento de tejido líquido, listo para la aplicación, se transforma en fibrina (insoluble) y el factor XIII contenido en el pegamento de tejidos se activa convirtiéndose en el factor XIIIa. Este retícula la fibrina que se ha formado para producir un macropolímero, que es esencial para la eficacia del pegamento de tejidos. La actividad de la trombina que se precisa puede proceder o bien del propio tejido que se trata de pegar (de las superficies de la herida) o se puede añadir al pegamento para tejidos en forma de una solución que contenga trombina y iones Ca^{2+} al efectuar el pegado.

Para contener la hemorragia o pegar los tejidos se conocen los siguientes medios que están basados en aprovechar la última fase de la coagulación de la sangre (transformación del fibrinógeno en fibrina y reticulación de la fibrina mediante el factor XIIIa):

a) Trombina sola (en forma de polvo, solución o en combinación con un soporte capaz de aspirar como, por ejemplo, un vellón de colágeno): un medio de esta clase activa la coagulación del fibrinógeno existente en la sangre del paciente. La solidez del coágulo que se forma depende sin embargo esencialmente de la concentración de fibrinógenos, que en este caso es relativamente baja (aprox. 3 mg/ml). El efecto hemostático o de pegado de tales preparaciones es por lo tanto relativamente reducido o incluso puede estar totalmente ausente en el caso de anemia hipofibrinógena.

b) Pegamentos a base de fibrinógenos y factor XIII, de acuerdo con las patentes AT-B-359 653, AT-B-359 652 y AT-B-369 990. Estas preparaciones presentan un contenido notablemente superior de fibrinógenos y factor XIII que la sangre humana; tras la acción de la trombina (en presencia de iones Ca^{2+}) estas preparaciones dan lugar a coágulos de gran resistencia y buena capacidad de adherencia al tejido de manera que con tales preparaciones se puede conseguir un buen efecto hemostático y de pegado.

Estas preparaciones se aplican en general en combinación con una solución de trombina, donde la solución que contiene el fibrinógeno se ha de mezclar inmediatamente antes de la aplicación de la forma más rápida y completa posible con la solución de trombina, para conseguir una efecto óptimo. Para aplicar de forma sencilla estos pegamentos de tejidos se ha desarrollado por lo tanto también un aparato de mezcla y aplicación específico (Duploject®, Immuno AG).

Ello no obstante, en el sector sanitario existe el deseo de unas preparaciones de aplicación sencilla y que sean muy eficaces para cortar las hemorragias y pegar los tejidos.

c) Preparaciones secas en forma de vellones con capacidad de aspiración, que contienen sustancias que liberan fibrinógenos y trombina o trombina en presencia de fluidos corporales (patentes DE 31 05 624 y DE 32 14 337).

Estas preparaciones se han de almacenar completamente en seco con el fin de evitar la activación prematura de la coagulación de la sangre por la acción de la trombina sobre el fibrinógeno, que comienza en la preparación incluso en presencia de sólo trazas de humedad. Por este motivo, estas preparaciones generalmente se envasan junto con un producto secante, de forma hermética al aire o estanca a los líquidos. Sin embargo, la sequedad necesaria de estas preparaciones da lugar sin embargo también a una acritud indeseable que dificulta la aplicación sobre las superficies de las heridas.

Otro problema fundamental de tales preparaciones consiste en que durante la aplicación, es decir, después de haberse humedecido con sangre o con secreción de la herida, la trombina, que tiene una mejor solubilidad, se disuelve en cualquier caso de forma notablemente más rápida que el fibrinógeno que está presente al mismo tiempo. Pero en un medio que contenga trombina, el fibrinógeno ya no se puede disolver tal como sería deseable: al iniciarse la disolución de una partícula de fibrinógenos se forma inmediatamente en su superficie una capa sólida de fibrina que impide que se continúe disolviendo la partícula de fibrinógenos. Por lo tanto, de la cantidad total de fibrinógenos presente en esa preparación solamente puede llegar a ser eficaz en el mejor de los casos una fracción reducida.

d) Por último se ha propuesto también un pegamento de un solo componente (patente EP-253 198), cuya aplicación parece ser más sencilla en comparación con los pegamentos de tejidos según las patentes AT-359 653 y AT-359 652. De acuerdo con esta propuesta, tales pegamentos monocomponentes contienen en la solución de aplicación fibrinógenos, factor XIII, un inhibidor de la trombina, una cantidad superior de protrombina y factores complejos de protrombina así como iones de calcio.

Esta clase de preparaciones son estables en forma liofilizada. La disolución antes de la aplicación debe efectuarse con una solución diluida de CaCl_{2}, donde entonces la preparación disuelta se debe coagular más o menos rápidamente durante la aplicación, en función de la concentración de Ca^{2+}. El activador propiamente dicho, que en última instancia provoca la coagulación, es el CaCl_{2} presente (en lugar de la trombina). Este se ha de dosificar con gran exactitud, por una parte para posibilitar la disolución antes de que se inicie la coagulación y, por otra parte, para conseguir a pesar de ello sobre la superficie de la herida una coagulación suficientemente rápida.

Asi pues, la aplicación de esta clase de preparaciones no aparenta ser en modo alguno más sencilla, sino más bien más difícil que la de los pegamentos de tejidos conocidos según b). Por lo tanto, no es sorprendente que esta clase de preparaciones según la patente EP-253 198 hasta ahora no se hayan llegado a imponer en la práctica.

El objetivo de la presente invención es por lo tanto proporcionar una preparación de gran eficacia y sencilla de aplicar para cortar las hemorragias, pegar tejidos lesionados y activar la cicatrización, y que no presente los inconvenientes que se acaban de indicar de las preparaciones conocidas.

Este objetivo se resuelve de acuerdo con la invención mediante una preparación que contiene como componentes activos fibrinógenos y un activador o proactivador de la protrombina (presente en la sangre), pero que no reacciona con el fibrinógeno propiamente dicho. De esta manera, la protrombina presente en la sangre del paciente se transforma en trombina, que a su vez provoca la formación del coágulo de fibrina.

El pegamento de tejidos objeto de la invención está enriquecido, por lo que respecta a la presencia de protrombina, de tal manera que el contenido es inferior a 5 E de protrombina/g de fibrinógenos, preferentemente inferior a 1 U/g, y más preferentemente inferior al límite de determinación por los métodos analíticos usuales conocidos. Como activador de la protrombina se emplea preferentemente factor Xa preparado por ejemplo de acuerdo con la patente DE 43 25 872.

Una preparación de esta clase contiene ventajosamente además fosfolípidos, preferentemente asociados con el activador en forma vesicular, pero también factor de coagulación XIII, iones Ca^{2+} o una sal de calcio, o un inhibidor de la fibrinolisis, que no frene al activador o que lo haga de una forma moderada. Inhibidores preferidos de fibrinolisis son la aprotinina o el \alpha_{2}-inhibidor de plasmina.

El factor XIII puede estar contenido en una cantidad mínima de 80 unidades/g de fibrinógenos, preferentemente en una cantidad mínima de 150 unidades/g de fibrinógenos.

Para mejorar la estabilidad de almacenamiento esta clase de preparación puede contener además pequeñas cantidades de un inhibidor de la coagulación, por ejemplo, un inhibidor de trombina tal como AT-III, un complejo de AT-III-heparina o hirudina.

La preparación puede presentarse en forma líquida o en forma líquida ultracongelada o como liofilizado, preferentemente unida a un material soporte biológicamente resorbible, insoluble en agua o difícilmente soluble en agua, tal como vellón de colágeno, espuma de fibrina, gelatina o celulosa, eventualmente en forma modificada tal como oxicelulosa.

Igualmente se pueden emplear también como materiales de soporte ácido poliláctico, quitina, quitosan, proteoglicanos, glicosaminglicanos tales como sulfato de condroitina, ácidos hialurónicos o queratán sulfatos, heparán sulfatos, dextranos, elastina, fibronectina, vitronectina, laminina, tenascina, material óseo esponjoso, preferentemente en forma descalcificada, de acuerdo con la patente EP-321 442, y/o hidroxilapatita.

Los componentes de la preparación de pegamento de tejidos se obtienen preferentemente de plasma sanguíneo humano, y se trata para inactivar posibles virus que pueda haber presentes. Pero también la propia preparación de pegamento de tejidos se puede tratar de forma correspondiente, por ejemplo, mediante un tratamiento de calor, por ejemplo según la patente EP-159 311.

La preparación puede contener además otras sustancias activas tales como antibióticos, hormonas del crecimiento, otras proteínas plasmáticas, tales como por ejemplo fibronectina, así como otros factores de coagulación, en particular el factor V (con excepción de la protrombina).

La activación, es decir, la conversión de fibrinógenos en fibrina, y la reticulación de la fibrina mediante el factor XIIIa solamente tiene lugar en contacto con la sangre o con el tejido lesionado, y esencialmente por la protrombina que allí está presente y eventualmente el factor XIII. La protrombina se transforma en trombina por el activador de protrombina contenido en la preparación, preferentemente el factor Xa. La trombina activa a continuación el proceso de coagulación propiamente dicho, es decir, que el fibrinógeno que también está presente en la preparación así como el fibrinógeno de la propia sangre se transforma en fibrina; el factor XIII se activa mediante la trombina pasando a factor XIIIa. Este reticula la fibrina que se ha formado dando lugar a un macropolímero, con lo cual aumenta considerablemente la resistencia del coágulo de fibrina que se ha formado. En esta última reacción se basa esencialmente el efecto hemostático y adhesivo de la preparación.

\newpage

La cantidad preferida de activador está dentro del rango de 0,001 a 10 U de factor Xa o su equivalente, preferentemente de 0,1 a 1 unidad por cm^{3} de pegamento de tejidos. En el caso de un vellón se prefiere emplear una cantidad tal de activador o proactivador de protrombina por cm^{3} que se activen de 5 a 500 \mug, preferentemente de 10 a 100 \mug de protrombina en menos de 60 segundos, preferentemente en menos de 30 segundos.

Una característica especial de la preparación objeto de la invención es su estabilidad, y no sólo en estado seco sino también en presencia de agua o como solución. El fibrinógeno solamente se activa al efectuar la aplicación, es decir, al establecer contacto con la sangre o la secreción de las heridas del paciente, consiguiéndose un efecto hemostático y adhesivo sorprendentemente bueno.

En lugar del factor Xa se pueden emplear también otros activadores o proactivadores de protrombina que no reaccionen con fibrinógenos o lo hagan muy lentamente, como por ejemplo, factores de coagulación activados, excepto trombina, entre ellos los factores VIIa, IXa, XIa y XIIa, pero también "Tissue-Factor". Igualmente se pueden emplear también activadores adecuados procedentes de venenos de serpiente adecuados o bacterias adecuadas, que se describen por ejemplo en Thromb. Haemostas. 65, 627-630 (1991).

La preparación puede existir también como "pegamento en seco" en forma sólida, preferentemente como vellón delgado o polvo. El contenido residual de agua en esta preparación no es crítico. Preferentemente el contenido residual de agua es inferior al 10%, y muy preferentemente inferior al 5%. Una preparación de esta clase se presenta preferentemente como un vellón delgado con muy poco o ningún contenido de material de soporte insoluble en agua, tal como colágeno o fibrina. Para pegar dos partes (blandas) de tejido se coloca un trozo adecuado del "pegamento en seco" sobre una superficie de la herida y a continuación se adapta la segunda superficie de la herida (la segunda parte del tejido) y se aprieta brevemente. Debido a la sangre o secreción de la herida existente, la preparación se disuelve rápidamente y se solidifica a continuación al solidificarse la coagulación, con lo cual se produce el efecto adhesivo y hemostático. Mediante el "material seco" objeto de la invención se ofrece por lo tanto un pegamento de tejidos sólido, que pega por ambas caras, que resulta especialmente adecuado para pegar partes blandas tales como hígado o bazo.

Ejemplo 1

Vellón de colágeno con fibrinógenos factor XIII, factor Xa y fosfolípidos (como complejo Xa de factor fosfolípido).

1.1 Preparación

Un vellón de colágeno comercial (Tissue Vlies, Immuno, aprox. 5 mm de espesor) se cortó en trozos de unos 2 x 2 cm y los trozos se embebieron en la composición siguiente, se ultracongelaron y se liofilizaron:

fibrinógenos	10 mg/ml
Factor XIII	3,5 U/ml
Factor Xa	0,13 U/ml	Complejo Xa Factor
PCPS*	0,0025 ml/mg	Fosfolípido
Albúmina humana	1,5 g/l
Ca^{2+}	5 mmol/l
NaCl	180 mmol/l
Tris-HCl	20 mmol/l
Sacarosa	50 mg/l
pH	7,3
* Fosfatidilcolina + fosfatidilserina

Las sustancias activas contenidas en la solución se prepararon de la forma siguiente:

Fibrinógenos

Un crioprecipitado obtenido de plasma con citrato humano se disolvió con una cantidad 10 veces superior de una solución tampón que contenía por litro 6 g de citrato de sodio\cdot2H_{2}O, 7 g de NaCl, 13 g de ácido \varepsilon-aminocaprónico y 600 UI de heparina y se ajustó el valor pH a 7,3. A continuación se añadieron agitando 150 g de glicina sólida por litro de solución y se reajustó el valor pH a 7,3.

El precipitado de proteína formado se separó por centrifugación, se volvió a disolver igual que antes, y se repitió la precipitación con glicina como antes. El precipitado obtenido después de la centrifugación se lavó a 0-2ºC con otra solución tampón (pH 6,5), que contenía por litro 6,6 g de citrato sódico\cdot2H_{2}O, 3,4 g de NaCl y 200 UI de heparina, se ajustó la concentración de proteína a 40 g/l y el valor pH a 7,3, se añadió albúmina humana depurada (6 g/l) y se ultracongeló y liofilizó la solución.

Para inactivar los virus que posiblemente estuvieran presentes se calentó el material con una humedad residual del 7,5% en peso durante 10 horas a 60ºC, y durante 1 hora a 80ºC. La preparación de fibrinógenos liofilizada y depurada obtenida de esta manera contenía, además de la albúmina humana que se había añadido, únicamente trazas de otras proteínas plasmáticas. La protrombina también estaba contenida ya únicamente en una cantidad de 4 U/g de fibrinógenos.

La determinación de la composición de la proteína se efectuó mediante electroforesis de gel SDS de poliacrilamida, de una muestra no reducieda y de una muestra reducida de la preparación, coloración con azul de Coomassie, y evaluación densitométrica.

La determinación del contenido de protrombina se efectuó por el método de una sola etapa basado en el tiempo de protrombina según Quick, Journal Biological Chemistry 109, pp. 73 (1935).

La preparación y ensayo de un concentrado de factor XIII depurado e inactivado en cuanto a virus se efectuó de acuerdo con el ejemplo 3C de la patente europea EP-0637451, a la que aquí se hace referencia.

El factor Xa se preparó y ensayó tal y como se describe en la patente DE-43 25 872.

La preparación del fosfolípido complejo (PCPS) factor Xa se efectuó mediante la preparación de vesículas de (PCPS) por el procedimiento de extrusión de Olson y cols., Biophysica et Biochimica, Acta 557, pp 9-23, 1979, formando a continuación el complejo con el factor Xa. En un matraz de 100 ml, 40,0 mg de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina y 10,0 mg de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoserina (Avanti Polar Lipids) se disolvieron en 5 ml de cloroformo y se redujeron mediante un evaporador de rotación a presión reducida y a una temperatura de 30ºC. Después de eliminar totalmente el disolvente se siguió manteniendo en vacío a lo largo de 30 minutos a 30 mbar. La película de fosfolípido se hidratizó a continuación mediante la adición de 5 ml de tampón TBS (20 mM tris, 150 mM NaCl, pH 7,4) y agitando ligeramente a lo largo de una hora a temperatura ambiente, y a continuación se liofilizó. Después de añadir 5 ml de agua, la dispersión resultante de vesículas multilaminares se prensó diez veces a través de dos filtros de policarbonato de 100 nm colocados uno sobre otro con N_{2} a presión (extrusora Thermobarrel de 10 ml, Lipex-Biomembranes Inc., Vancouver, Canadá). La determinación del tamaño de partículas mediante la dispersión dinámica de la luz dio un diámetro medio de aprox. 100 nm. A la dispersión de vesícula preparada de esta manera se le añadió factor Xa (tampón TBS).

A continuación se ajustó una concentración de CaCl_{2} de 5 mM así como una concentración de sacarosa al 5% (peso/volumen) y se liofilizó. Un liofilizado preparado de esta manera presentó una concentración de fosfolípido de 2,9 mg/ml, después de la reconstitución con el correspondiente volumen de H_{2}O, así como una concentración de factor Xa de 79 U/ml.

1.2 Eficacia

Se ensayó la eficacia, es decir, el efecto adhesivo y hemostático de las preparaciones preparadas según 1.1 en un modelo de resección de polo renal en un conejo. Para ello se deja al descubierto en el animal objeto del ensayo, narcotizado con quedamina y xilacina (dosificación posterior de pentobarbital), un riñón y con el bisturí se separa el polo renal. Se produce una superficie aproximadamente circular de aprox. 1-1,5 cm de diámetro, que sangra abundantemente de modo uniforme. La preparación objeto del ensayo se colocó sobre la superficie sangrante y se apretó ligeramente con el dedo exactamente durante 30 segundos y luego se soltó. Se observa la adherencia de la preparación y se mide el tiempo hasta que se corta totalmente la hemorragia.

Resultados

La preparación preparada según 1.1 se adhirió bien sobre la superficie que sangraba abundantemente. La hemorragia se cortó totalmente al cabo de 1 minuto.

Claims

1. Pegamento de tejidos estable a base de fibrinógenos, caracterizado porque éste contiene un activador o proactivador de la protrombina presente en la sangre, que no reacciona directamente con el fibrinógeno, conteniendo el pegamento de tejidos menos de 5 unidades de protrombina/g de fibrinógenos.

2. Pegamento de tejidos según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende menos de 1 unidad de protrombina/g de fibrinógenos.

3. Pegamento de tejidos según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque contiene como activador el factor Xa.

4. Pegamento de tejidos según la reivindicación 3, caracterizado porque por cm^{3} de pegamento de tejidos contiene de 0,001 a 10 unidades de factor Xa o su equivalente, preferentemente de 0,1 a 1 unidad.

5. Pegamento de tejidos según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque contiene adicionalmente un inhibidor de la coagulación o de la fibrinolisis.

6. Pegamento de tejidos según la reivindicación 5, caracterizado porque el inhibidor de la coagulación es antitrombina III o un complejo de antitrombina III-heparina, o hirudina.

7. Pegamento de tejidos según la reivindicación 5, caracterizado porque el inhibidor de la fibrinolisis es aprotinina o alfa-2-antiplasmina.

8. Pegamento de tejidos según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque contiene adicionalmente fosfolípidos.

9. Pegamento de tejidos según la reivindicación 8, caracterizado porque los fosfolípidos están asociados al activador en forma vesicular.

10. Pegamento de tejidos según una o varias de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque contiene adicionalmente factor V.

11. Pegamento de tejidos según una o varias de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque contiene adicionalmente factor XIII.

12. Pegamento de tejidos según la reivindicación 11, caracterizado porque contiene factor XIII en una cantidad de como mínimo 80 unidades/g de fibrinógenos.

13. Pegamento de tejidos según la reivindicación 11, caracterizado porque contiene factor XIII en una cantidad de como mínimo de 150 unidades/g de fibrinógenos.

14. Pegamento de tejidos según una o varias de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque los componentes del pegamento de tejidos o el propio pegamento de tejidos han sido sometidos a un tratamiento previo para la inactivación de virus.

15. Pegamento de tejidos según una o varias de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque contiene adicionalmente fibronectina y eventualmente un inhibidor de la fibrinolisis.

16. Pegamento de tejidos según una o varias de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque contiene adicionalmente como otras sustancias activas antibióticos, hormona del crecimiento y/o factores de coagulación distintos a la protrombina.

17. Pegamento de tejidos según una o varias de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque se presenta como preparación líquida.

18. Pegamento de tejidos según la reivindicación 17, caracterizado porque se presenta en forma líquida-ultracongelada.

19. Pegamento de tejidos según una o varias de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque se presenta en forma sólida o liofilizada, preferentemente como pegamento en seco.

20. Pegamento de tejidos según una o varias de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque está aplicado sobre un material de soporte biológicamente resorbible, insoluble en agua o difícilmente soluble en agua.

21. Pegamento de tejidos según la reivindicación 20, caracterizado porque como material de soporte se emplea vellón, espuma de colágeno, fibrina, gelatina o celulosa, eventualmente en forma modificada tal como oxicelulosa.

22. Pegamento de tejidos según la reivindicación 21, caracterizado porque por cada cm^{2} de vellón contiene una cantidad de tal activador de protrombina capaz de activar de 5 a 500 \mug, preferentemente de 10 a 100 \mug de protrombina en menos de 60 segundos, preferentemente en menos de 30 segundos.

23. Utilización del pegamento de tejidos según una o varias de las reivindicaciones 1 a 22, para la preparación de un medicamento hemostático.