PT85242B

PT85242B - Processo para a preparacao de uma cola monocomponente para tecidos vivos

Info

Publication number: PT85242B
Application number: PT85242A
Authority: PT
Inventors: Norbert Heimburger; Peter Fuhge; Hansjorg Ronneberger
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1986-07-05
Filing date: 1987-07-03
Publication date: 1990-03-30
Also published as: ES2018502B3; JPS6324951A; FI90826C; JP2511462B2; AU7509787A; US5407671A; FI872926L; CA1321138C; EP0253198A1; GR3030989T3; DE3765194D1; AU610504B2; EP0253198B1; EP0253198B2; DK342887D0; FI90826B; ATE56883T1; FI872926A0; DK174332B1; DE3622642A1

Description

Memória Descritiva

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma cola para tecidos que contém fibrinogénio, factor XIII, um inibidor da trombina, factores protrombina, iões cálcio e eventualmente um inibidor da plasmina. Por meio dos aceleradores naturalmente existentes no ferimento a colar é libertada a trombina necessária para a colagem a partir da protrombina da cola.

Como resultado dos processos fisiológicos na reparação de lesões em tecidos humanos ou animais a fibrina precipita-se na zona da ferida. Este processo é desencadeado pela tromboplastina libertada pelas células lesionadas, a qual em contacto com o factor VII do plasma dá origem ao activador do factor X, o qual então, em conjunto com o factor V e com o complexo com fosfolípidos e cálcio, transforma a protrombina em trombina. Sob a influência da trombina. formam-se por outro lado, a partir do fibrinogénio, através da hidrólise dos peptídeos da fibrina

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A e B, monómeros de fibrina, os quais por agregação formam as cadeias de fibrina, que são reticuladas, com formação de ligações covalentes isopeptidicas, pelo F XHIa, uma transglutaminase, que é igualmente activada pela trombina. Um inibidor, nomeadamente a antiplastina alfa₂ , é ligado às cadeias de fibrina pelo factor XIII e protege-as da destruição pela plasmina.

Através desta descrição do mecanismo da hemostase e da resposta do organismo às lesões verifica-se que além do fibrinogénio, que constituí o substrato, são necessárias duas enzimas:

a trombina e o factor XIII. Neste mecanismo a missão da trombina consiste na activação tanto do fibrinogénio como do factor XIII, isto é, em transforma-los na respectiva forma reactiva. Esta forma é, no caso do fibrinogénio, o monómero de fibrina e, no caso do factor XIII, a transglutaminase (F XlIIa) cataliticji mente activa.

A partir da EP 0 068 047 é conhecida uma fracção proveniente do plasma que é apropriada como meio de fechar ferimentos e que contém fibrinogénio, um inibidor de fibrinólise e trombina ou protrombina num sistema anidro. Esta cola não se pode dissolver em agua e apenas pode ser aplicada sob a forma de um pó, o que constitui um inconveniente para a utilização. Quando se dissolve a mistura em água, os componentes reagem entre si, resultando a coagulação da mistura.

. É difícil seleccionar as substâncias activas para uma cola mono componente com água como solvente a combiná-las em tais proporções que, durante a preparação da cola, durante a reconstituição com um solvente e durante a preparação final para utilização, não ocorra qualquer activação precoce não pretendida e por outro lado que se consiga, no entanto, após a aplicação no local de tratamento, uma estabilização relativamente rápida e suficientemente elevada.

Ί Surpreendentemente descobriram-se condições que possibilitam a ι

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preparação de forma reprodutível de uma cola monocomponente manuseável de modo prático utilizando um veículo fisiológico.

A condição prévia para a preparação e aptidão para uso de uma cola monocomponente com as propriedades descritas consiste no emprego de concentrações determinadas e optimizadas nas suas proporções relativas de fibrinogénio, inibidor de plasmina,

F XIII, concentrado de protrombina, inibidor de trombina e iões cálcio. É o caso, de modo especial, do uso de AT III como inibidor de trombina e de iões cálcio, uma vez que os iões cálcio são essenciais para a activação dos factores de coagulação. As altas concentrações aceleram a formação de trombina e as baixas concentrações retardam-na. Deste modo é necessário empregar uma concentração de iões cálcio óptima.

Para que com esta concentração não se desencadeie a formação da trombina é necessária a combinação com um inibidor de trombina, de preferência com AT III. Deste modo por um lado é necessário evitar a formação da trombina durante a preparação da cola, por outro lado a cola deve formar um coágulo sólido rapidamente quando se desencadeia, por contacto com a superfície do ferimen to, a coagulação, isto é, a segregação de uma película de fibri_ na. Em consequência não é possível conceber a preparação de uma cola monocomponente contendo trombina e a sua utilização em solução aquosa, e mesmo a protrombina só poderá ser usada em condições que evitem a sua activação com formação de trombina durante a sua produção ou as operações de preparação final. Dai a necessidade de estabelecer concentrações determinadas do inibidor de trombina e dos iões cálcio.

objecto da presente invenção é, por conseguinte, um processo para a produção de uma cola para tecidos contendo em solução aquosa fibrinogénio, F XIII, um inibidor de trombina, factores de protrombina, iões cálcio e, eventualmente, um inibidor de plasmina.

Foi surpreendente que fibrinogénio em conjunto com protrombina se pudessem reunir sob a forma duma solução designada por hiper

coagulável, a qual contém ainda além disso iões cálcio e

AT III, e que se pudesse utilizar esta solução como cola para tecidos.

A cola produzida de acordo com o processo da presente invenção pode ser levada a uma forma sólida, por exemplo liofilizada, e pode ser reconstituída com água. Pode ser obtida como substância activa sob forma pasteurizada e portanto isenta de risco de transmissão de hepatite e de HTLV III.

As proporções de mistura das substâncias activas, fibrinogénio, inibidor de plasmina, F XIII, factores de protrombina, iões cálcio e AT III são tais que não ocorra qualquer activação prematura e que, no entanto, a mistura cogule expontaneamente e segregue fibrina em contacto com as superfícies dos ferimentos .

período de tempo que demora a desencadear este mecanismo corresponde a uma necessidade clínica. A cola para tecidos monocomponente produzida de acordo com o processo da presente inven ção não se distingue dos sistemas de dois componentes de acordo com o estado da técnica no que se refere à respectiva actividade.

As substâncias activas estão misturadas nesta cola de tal modo que na solução pronta para utilização a concentração de fibrinogénio se situa entre 70 e 90 mg/ml e a de factores de trom bina entre 10 e 30 U/ml, em relação a F II.

A concentração de iões cálcio, que na cola se encontram em parte ligados a proteínas, deve situar-se, na solução pronta para utilização, entre 0,5 e 1 mmol/1. 0 inibidor de trombina usado, por exemplo AT III, hirudina ou heparina, é de preferência AT III numa concentração de 0,1 a 1 U/ml de cola para tecidos; nesta concentração inibe uma formação prematura de fibrina quando os factores de protrombina e os iões cálcio se encontram nas concentrações mencionadas. De outro modo a formação de fibrina pode ser favorecida quando tal se

_.Λ>·'¹ considerar desejável. Para este fim pode dissolver-se a cola liofilizada numa concentração final de iõès cálcio mais elevada do que 0,5 a 1 mmol/1. Neste caso torna-se porém necessário realizar uma utilização rápida após a reconstituição.

Para a preparação da cola preparam-se em primeiro lugar as subs tâncias activas sob forma tão activa quanto possível e eventual, mente pasteurizada e solúvel. A concentração de flbrinogénio deve ser tão alta quanto possível, já que a solidez do tecido aumenta com concentrações mais elevadas. 0 fibrinogénio pode ser preparado e pasteurizado por exemplo de acordo com a EP 0 103 196 e pode ser tornado solúvel no grau pretendido de acordo com a EP 0 085 923 por adição de compostos contendo resíduos do tipo ureia ou guanidina. 0 factor XIII pode ser pasteurizado de acordo com a EP 0 018 561 e os factores de protrombina de acordo com a EP 0 056 629.

As substâncias activas da cola produzida de acordo com o processo da presente invenção no modo de concretização preferido são constituídas em princípio por fibrinogénio humano na concentração mais alta possível, em conjunto com factor XIII e com os factores do complexo da protrombina (factor II, VII, IX e X), iões de cálcio bem como antitrombina III. A composição da cola para tecidos contém ainda um inibidor, que inibe o activador de plasminogénio e/ou da plasmina e portanto protege a fibrina presente de uma decomposição pela plasmina. Este inibidor pode estar presente junto com o fibrinogénio escolhido para a preparação mas de preferência é adicionado à cola sob a forma de aprotinina. Para melhorar a reconstituição da preparação da cola para tecidos após liofilização, esta pode conter albumina e/ou substâncias contendo o resíduo de ureia ou de guanidina bem como eventualmente também um ácido aminado com cadeia lateral hidrófoba ou um ácido gordo solúvel em água ou ainda heparina.

Para a composição da preparação da cola para tecidos utiliza-se de preferência fibrinogénio purificado contendo já o factor

XIII. No entanto também é apropriado um crioprecipitado no qual, de acordo com a experiência, juntamente com o factor XIII também estão presentes antiplasmina alfa₂ e albumina humana. No entanto também é possível preparar uma preparação de cola de actividade comparável por mistura a partir dos componentes isolados, nomeadamente: fibrinogénio humano, factor XIII (de plasma ou de placenta), inibidor de plasmina, factores de protrombina (factor II, VII, IX e X), albumina, AT III e iões cálcio, um composto com um resíduo de ureia ou de guanidina ou um ácido aminado com cadeia lateral hidrófoba ou um ácido gordo solúvel em água.

A mistura das substâncias activas para a composição da cola é apresentada de preferência no estado sólido, de preferência sob a forma de liofilizado.

De preferência a cola para tecidos contém as seguintes quantidades das substâncias activas eventualmente pasteurizadas referidas a 1 ml da solução pronta para utilização:

a 115, de preferência 70 a 90 mg de fibrinogénio humano puríssimo, a 80 U de factor XIII, a 50, de preferência 10 a 30 UI de PPSB (factores de protrombina), sendo a quantidade referida a F II (protrombina),

0 a	10	000	UIK de aprotinina,
0,01	a	50,	de	preferência 0,1 a	1	UI de antitrombina III,
0 a		5	U -	USP de heparina e
0,1	a	5,	de	preferência 0,5 a	1	mmol/1 de iões cálcio, de
preferência	sob	a forma de cloreto	de	cálcio.

Como estabilizadores e agentes de dissolução a cola pode conter por exemplo, glutaminato, L-isoleucina, L-arginina ou albumina humana.

A mistura das substâncias activas sólidas da preparação da cola para tecidos pode ser dissolvida rapidamente a 20°C em água ou num solvente contendo iões cálcio. A cola desenvolve imediatamente ou num período suficientemente curto um grande poder de aderência ao ser aplicada no tecido a unir ou a colar sem ser necessário adicionar trombina como segundo componente.

Por conseguinte a cola pode ser aplicada com uma unica pulverização sob forma líquida de tal modo que a preparação final, o manuseamento e a utilização são de grande simplicidade. A cola é compatível e é totalmente reabsorvida.

Esta cola monocomponente distingue-se tanto no período de colagem como na resistência após aplicação de uma cola bicomponente como se verificou nos ensaios de colagem de ferimentos por perfuração na pele do rato e na colagem de pequenas anastomoses no intestino de porcos. Por escolha de uma concentração óptima de iões cálcio da solução de dissolução das substâncias activas liofilizadas é possível ainda tornar mais forte o poder de cola gem.

Os seguintes exemplos destinam-se a elucidar a presente invenção .

Exemplo 1

Para a preparação de 500 ml de cola para tecidos dissolveramse 580 g de fibrinogénio humano pasteurizado de alta pureza contendo 2 iões cálcio por mole, que tinha sido obtido de acordo com a EP 0 103 196, em 580 ml de tampão de pH 7,5 (tampão de diálise) com a seguinte composição:

0,05 mol/1 de

NaCl,

0,005 mol/1 de citrato trissódico e

0,3 g/lOOml de monocloridrato de L-arginina.

A solução de fibrinogénio obtida deste modo foi submetida a diálise por duas vezes durante 16 horas e uma vez durante 8 horas cada vez contra 36 1 de tampão da mesma composição a +4°C.

Após diálise a solução de fibrinogénio tinha um volume de 1,53

1.

A solução foi em seguida centrifugada durante 20 minutos a 8 000 g. A densidade óptica da solução, medida a 280 nm, era de 47. Esta solução foi diluída com o tampão acima definido, ao qual se tinham adicionado os outros componentes da cola (ver abaixo) até uma densidade óptica (280 nm) de 35 a 37, isto é, até uma concentração de fibrinogénio humano de cerca de 20 g/1.

Em pormenor o processo foi realizado do modo seguinte: Filtrouse sucessivamente por filtros de dimensão de poro de 0,65 e de 0,2 já. a uma temperatura entre 35 e 37°C a solução de fibrino génio humano dializada e centrifugada (1,53 1). λ solução estéril de fibrinogénio assim obtida adicionaram-se 117,5 ml de um concentrado de F XIII pasteurizado contendo 350 U de F XIII por ml em solução de cloreto de sódio fisiológica através dum filtro de 0,2 U de dimensão de poro.

Em seguida adicionaram-se 515 000 UIK (Unidades de inibidor de Kallikrein) de aprotinina, 5,13 g de glutaminato de sódio,

33,9 ml duma solução de albumina humana contendo 20 g/100 ml, 6,78 g de isoleucina e 10 000 U de concentrado de PPSB pasteurizado (concentrado de factores de protrombina; actividade em unidades referidas a F II), 100 U de AT III (pasteurizada) e

3,1 ml de 0,1 mol/1 de solução de CaC^.

Em seguida preencheu-se o volume a 407,5 ml com tampão de diálise. Filtrou-se esta solução através de um filtro com dimensão de poro de 0,2 JJ. para a solução de fibrinogénio contendo

F XIII. Obtiveram-se 2 055 ml de solução de pH 7,5 com a seguir^ te composição:

fibrinogénio humano albumina humana

2,0 g/100 ml

0,33 g/100 ml

arginina	0,3	g/100 ml
glutaminato de Na	2,5	g/i
isolencina	3,3	g/1
factor XIII	20 000	U/l
aprotinina	250 000	UIK/1
protrombina	5 000	U/l (como
antitrombina III	50	U/l
NaCl	0,05	mol/1
citrato trissódico	0,005	mol/1
CaCl₂	0,15	mmol/1
Dividiu-se a solução estéril em	porções	de 4 ml e liofil
Obteve-se um liofilizado incolor	e muito	solúvel.

Para utilização como cola para tecidos tomou-se uma porção em ml de solvente.

Exemplo 2

Para a preparação de 125 ml de cola para tecidos dissolveram-se 100 g de uma fracção de fibrlnogénio humano de alta pureza pasteurizado, obtido de acordo com a EP 0 103 196, em 112 ml de tampão de diálise e submeteu-se a diálise por três vezes contra 10 1 em cada vez do mesmo tampão como no exemplo 1. Após diálise, o volume da solução concentrada de fibrinogénio era de 269 ml. Centrifugou-se durante 20 minutos a 8 000 g. A densidade óptica da solução a 280 nm era de 69,2. Diluiu-se a solução com um tampão de composição correspondente à do tampão de diálise contendo em mistura todos os outros componentes da cola 1 de tal modo que se atingiu uma densidade óptica a 280 nm de I a 37, em relação ao fibrinogénio.

Esta solução é processada de modo seguinte:

Adicionam-se a 127 ml do tampão antes definido 8,2 ml de solução de albumina humana, contendo 20 g de albumina humana por

100 ml de solução, 6 ml de aprotinina com 125 000 UIK e 50 ml ί ¹ η ... ..y de concentrado de protrombina, contendo 2 500 U de factor II e 25 U de AT III. Na solução obtida dissolveram-se 1,65 g de L-isoleucina e 1,25 g de glutaminato de sódio e em seguida adicionaram-se 40 ml de concentrado de F XIII contendo 10 000 U de F XIII, misturou-se até obter uma mistura homogénia e corrigiu-se o pH da solução a 7,5.

Em seguida misturou-se esta solução com a solução de fibrinogénio acima descrito e com 0,75 ml duma solução 0,1 molar de CaCl^ até se obter uma mistura homogénia e filtrou-se esterilmente a uma temperatura de 35 a 37°C através dum filtro de dimensão de poro de 0,2 JJ- . Obtiveram-se 500 ml de solução estéril de composição idêntica à do exemplo 1. Esta solução foi dividida em porções de 4 ml e liofilizada. Obteve-se um liofilizado incolor e muito solúvel.

Para utilização como cola para tecidos toma-se uma porção em ml de solvente.

Claims

REIVINDICAÇÃO

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Processo para a preparação de uma cola para tecidos caracterizado por se adicionar a uma solução aquosa isotónica de pH 7,5 eventualmente pasteurizada e eventualmente esterilizada por filtração contendo pelo menos 16 g/1 de fibrinogénio humano, 2 átomo-g de cálcio por mole de fibrinogénio e 1 a 6 g/1 de monocloridrato de L-arginina, uma quantidade tal de uma solução eventualmente pasteurizada de factor XIII humano, de albumina humana, de concentrado de protrombina, de antibrombina III e de aprotinina, bem como eventualmente de glutaminato de sódio e de isolencina, que a solução liofilizada após reconstituição contenha em cada porção as substâncias mencionadas nas seguintes gamas de concentração:

65 a 115 mg/ml de fibrinogénio humano, 40 a 80 U/ml de factor XIII, 4 a 40 mg/ml de albumina Humana, 1 a 50 U/ml de PPSB (factores de protrombina referidos a F II (protrombina)) 0, 01 a 50 Ul/ml de antitrombina III

e eventualmente 1 a 10 000 UIK de aprotinina/ml e 0 a 20 g/i de glutaminato de Na e 0 a 20 g/i de isolencina.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi depositado na República Federal Alemã em 5 de Julho de 1986, sob ο η^ P 36 22 642.4.