ES2206579T3

ES2206579T3 - Tiolacion de peptidos para radiodeteccion y radioterapia basada en radionuclidos.

Info

Publication number: ES2206579T3
Application number: ES96919062T
Authority: ES
Inventors: Serengulam V. Govindan; Gary L. Griffiths; Hans L. Hansen
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: CA2222966A1; EP0831936A4; ATE246009T1; WO1996040289A1; DE69629295T2; DE69629295D1; CA2222966C; AU6150096A; EP0831936B1; EP0831936A1; JPH11507623A; AU709219B2

Abstract

UN METODO PARA EL MARCAJE RADIACTIVO DE UN PEPTIDO, POR EJEMPLO SOMATOSTATINA O UN ANALOGO DEL MISMO O UN PEPTIDO INTESTINAL VASOACTIVO CON UN RADIOISOTOPO DE TECNECIO O RHENIO COMPRENDE LAS ETAPAS DE: (A) HACER REACCIONAR EL PEPTIDO CON UN AGENTE QUELANTE BIFUNCIONAL REACTIVO CON AMINA CONTENIENDO T IOL PROTEGIDO CON ACETILO; (B) DESPROTEGER EL GRUPO ACETILO T ZCLAR EL CONJUGADO CONTENIENDO PEPTIDO ESTANNOSA; Y (D) HACER REACCIONAR LA MEZCLA DE LA ETAPA (C) CON PERTECNETATO O PERRHENATO, O (C'') AÑADIR PERTECNETATO O PERRHENATO REDUCIDOS A DICHO CONJUGADO CONTENIENDO PEPTIDO OL, FORMANDO DE ESTE MODO UN PEPTIDO RADIOMARCADO. SE PROPORCIONAN KITS PARA PONER EN PRACTICA EL METODO DE MARCAJE Y METODOS PARA LA DETECCION/IMAGEN O TERAPIA DEL TUMOR.

Description

Tiolación de péptidos para radiodetección y radioterapia basadas en radionúclidos.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

Esta invención se refiere a métodos y kits de un vial para marcar radiactivamente péptidos con un ion metálico radiactivo de un radionúclido que se une fuertemente a grupos sulfhidrilo, donde el péptido está derivatizado con un agente quelante que contiene un tiol terciario. Un resto que contiene tiol protegido se conjuga con el péptido, después de lo cual el derivado puede desprotegerse para generar grupos sulfhidrilo libres sin escindir los enlace disulfuro. El derivado después puede marcarse en un lecho con un radionúclido.

2. Descripción de la técnica relacionada

Se sabe que ciertos metales radiactivos se unen fuertemente a ligandos de azufre, incluyendo, por ejemplo, Tc-99m de pertecnetato reducido, los iones Re-186 y Re-188 de perrenato reducido, iones Cu-67, iones Hg-197 e iones Bi-212. Algunos de estos metales radiactivos se han unido a proteínas, especialmente anticuerpos o fragmentos de anticuerpo. El tecnecio-99m es un radionúclido ideal para la formación de imágenes escintigráficas debido a sus propiedades nucleares. El tecnecio-99m tiene una energía de un solo fotón de 140 KeV, un vida media de aproximadamente 6 horas y se puede adquirir fácilmente a partir de un generador de ^{99}Mo-^{99m}Tc.

El elemento por debajo del tecnecio en la tabla periódica, renio, tiene propiedades químicas similares y puede marcar proteínas usando técnicas similares. Hay unos 34 isótopos de renio y dos de ellos en particular, el renio-186 (t_{1/2} 90 horas, gamma 137 KeV, beta 1,07, 0,93 MeV) y el renio-188 (t_{1/2} 17 horas, gamma 155 KeV, beta 2,12 MeV) son candidatos principales para radioterapia usando estrategias de dirección de péptidos.

El marcaje directo de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpo con metales radiactivos ha sido satisfactorio, en gran parte porque los enlaces disulfuro que unen las cadenas pesadas se han escindido selectivamente y sirven como sitios de unión al ligando para los iones de metales radiactivos. Esta estrategia ha sido particularmente satisfactoria con fragmentos de anticuerpo, especialmente fragmentos Fab y Fab'. Cuando un péptido que se desea marcar contiene un grupo disulfuro cuya integridad debe conservarse para retener la unión específica del péptido, es de poca utilidad una estrategia que escinde los grupos disulfuro.

Un segundo método para radiomarcar proteínas es el marcaje indirecto, en el que un agente complejante (quelante) se acopla a la proteína y el metal radiactivo se une a la proteína como un quelato. Algunos quelantes contienen grupos sulfhidrilo libres o protegidos que pueden formar complejos con el radionúclido reducido en un extremo y grupos capaces de reaccionar con el péptido en el otro extremo.

Se ha descubierto que algunos receptores para ciertos péptidos biológicos tales como somatostatina (SS) y el péptido intestinal vasoactivo (VIP) se expresan en diferentes tipos de sitios tumorales, así como en tejidos a lo largo de todo el cuerpo debido a la función fisiológica normal de estos péptidos. Virgolini et al., Cancer Res, 54:690-700, 1994; Virgolini et al., J Nucl Med, 35:97P, 1994. Por lo tanto, el marcaje de péptidos pequeños tales como SS y VIP sería ventajoso desde el punto de vista de la obtención de imágenes de tumores. Estos péptidos pequeños y sus análogos se han marcado con In-111 o I-123 para formar imágenes. Se sabe que el octreótido (OCT), un octapéptido con un bucle disulfuro de seis aminoácidos y un quelante de ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), marcado con In-111, puede formar imágenes de cánceres microcíticos de pulmón por la unión a receptores de SS. Maini et al., Nucl Med Commun, 14:962-968, 1993. Se ha demostrado que otro análogo de tirosina del octapéptido, Tyr^{3}-octreótido (T-OCT), marcado en la tirosina con I-123, se une a tumores endocrinos. Lamberts, et al., N Engl J Med, 323:1246-1249, 1990. Aunque se han examinado algunos péptidos sintéticos marcados con Tc-99m para la formación de imágenes de trombos o la formación de imágenes de infecciones, no han recibido mucha atención la SS o el VIP marcados con Tc-99m o renio para el diagnóstico y el tratamiento de cánceres.

Las estructuras de SS, OCT, T-OCT y VIP se muestran a continuación.

Somatostatina

1

VIP

2

Octreótido

3

Análogo de tirosina de octreótido

4

La SS, el OCT, el T-OCT y el VIP carecen de un grupo sulfhidrilo libre. Para conseguir un marcaje eficaz con, por ejemplo, iones de Tc o Re procedentes de pertecnetato o perrenato reducido, deben introducirse tioles. Esto se complica adicionalmente por el hecho de que la SS y sus análogos contienen un bucle disulfuro, cuya conservación es esencial para mantener una conformación que se una bien a su receptor. Por consiguiente, se excluye cualquier reacción que implique la escisión de enlaces disulfuro para generar tioles, e incluso el uso o la generación de tioles puede producir una escisión intermolecular o intramolecular del bucle disulfuro.

También sería deseable prolongar la vida media in vivo de los péptidos marcados para permitir la localización de un mayor porcentaje de la dosis inyectada en el sitio diana.

De esta manera, existe la necesidad de desarrollar un método para marcar péptidos pequeños tales como SS y VIP usando un reactivo quelante (i) que sea capaz de reaccionar con un péptido que no contiene grupos sulfhidrilo y (ii) que pueda transformarse en un ligando que contiene sulfhidrilo después de la conjugación con el péptido, sin la escisión de disulfuro antes o después de la generación del grupo sulfhidrilo libre, de forma que el conjugado pueda combinarse con iones estannosos y congelarse o liofilizarse sin la escisión de disulfuro, y forme un quelato estable con iones de tecnecio o renio reducido tras el contacto con radiopertecnetato o radioperrenato, en un proceso de marcaje de una sola etapa. También existe la necesidad de desarrollar un kit de marcaje para preparar SS y sus análogos y VIP radiomarcados, que sea fácil de usar y que no implique procedimientos sintéticos complicados o múltiples recipientes para el péptido y el agente reductor. También existe la necesidad de desarrollar un método para radiomarcar un péptido para uso en la formación de radioimágenes o en radioterapia, donde el péptido radiomarcado tenga una buena absorción por el tumor, una baja absorción renal, no se elimine totalmente en el hígado, se distribuya ampliamente a lo largo del cuerpo, pueda diseñarse para tener una alta vida media in vivo y proporcione una buena relación entre el tejido tumoral y el tejido no tumoral para poder obtener imágenes.

Sumario de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método y un kit útil para radiomarcar un péptido tal como somatostatina o péptido intestinal vasoactivo con un radioisótopo de Tc o Re, usando un agente quelante que se pueda sintetizar fácilmente, donde el método no implique procedimientos de reducción complicados incluyendo el uso de un exceso de agente reductor, y no ocasione la escisión prematura del péptido durante la incubación con el agente reductor para el radionúclido. También es un objeto de la presente invención proporcionar un método y un kit de un vial para radiomarcar el péptido con Tc o Re, que sea fácil de usar por un médico o un técnico. Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método y un kit para radiomarcar el péptido con Tc o Re para uso en la formación de imágenes o en terapia, donde el péptido radiomarcado tenga una buena absorción por el tumor, una baja absorción renal, no se elimine totalmente en el hígado, se distribuya ampliamente a lo largo del cuerpo, pueda diseñarse para tener una alta vida media in vivo y proporcione una buena relación entre el tejido tumoral y el tejido no tumoral para poder obtener imágenes.

De acuerdo con estos y otros objetos de la presente invención, se proporciona un método para radiomarcar un péptido con un radioisótopo de tecnecio o renio, que comprende las etapas de:

(a) hacer reaccionar un péptido que no contiene un grupo sulfhidrilo libre con un agente quelante bifuncional que contiene tiol terciario protegido con acetilo, que contiene un grupo funcional reactivo con amina, para formar un conjugado que contenga péptido-acetil-t-tiol;

(b) desproteger el grupo acetil-t-tiol para generar un grupo t-tiol libre;

y

(c) mezclar el conjugado que contiene el péptido-t-tiol con una sal estannosa para la reducción del pertecnetato o perrenato, el radionúclido a añadir en una etapa posterior, para formar una mezcla de agente reductor y conjugado que contiene péptido-t-tiol; y

(d) hacer reaccionar la mezcla de la etapa (c) con pertecnetato o perrenato, con lo que los cationes de Tc o Re se unen al grupo t-tiol, formándose de esta manera un péptido radiomarcado

o

(c') añadir pertecnetato o perrenato reducido a dicho conjugado que contiene péptido-t-tiol, formándose de esta manera un péptido radiomarcado.

Se proporcionan kits para realizar el método de radiomarcaje.

Descripción detallada

Los presentes inventores han descubierto que un péptido, por ejemplo, la somatostatina (SS) o el péptido intestinal vasoactivo (VIP), que tiene grupos sulfhidrilo colgantes, en virtud del uso de un agente quelante que contiene grupos tiol colgantes protegidos que posteriormente se desprotegen para generar grupos sulfhidrilo libres, puede unirse selectivamente a iones de metales radiactivos para formar enlaces fuertes con los grupos sulfhidrilo. Estos péptidos radiomarcados son muy eficaces cuando se usan en métodos de formación de radioimágenes y radioterapéuticos debido a su capacidad de unirse a tumores, de evitar una absorción renal excesiva, de evitar una eliminación excesiva en el hígado, de sobrevivir durante más tiempo in vivo y de proporcionar buenas relaciones entre tejidos tumorales y no tumorales. Además, el método de radiomarcaje permite el marcaje en una etapa de un péptido cuyos enlaces disulfuro no se han escindido prematuramente, es decir, SS, con lo que el péptido se conjuga con un agente quelante y después se pone en contacto con un agente reductor para el radionúclido de tal manera que el agente reductor no escinda el péptido. Los presentes inventores también han descubierto que un péptido puede marcarse de la forma anterior sin necesidad de reducir el péptido, evitando de esta manera el riesgo de escindir los enlaces disulfuro o alterar la especificidad o la afinidad de unión del péptido. Además, los presentes inventores han descubierto que el uso de un agente quelante que contiene tiol terciario permite la unión a un péptido sin generar grupos sulfhidrilo libres en el péptido o reducir el péptido, y sin escindir los grupos tiol protegidos del agente quelante, previniendo de esta manera la desprotección prematura y la pérdida oxidativa de los grupos tiol libres. En el método de la presente invención, tanto los reactivos como las condiciones están muy simplificados, y el método es particularmente adecuado para el marcaje con tecnecio o renio utilizando un transquelante tal como glucoheptonato o usando estaño como agente reductor en un kit de un vial.

A lo largo de esta descripción, el término "péptido" significa un compuesto biológico (es decir, natural) o sintético que contiene dos o más aminoácidos unidos por el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de otro. Cualquier péptido puede marcarse de acuerdo con los presentes métodos, pero en la práctica, típicamente se marcan los péptidos que son biológicamente útiles. Por lo tanto, son particularmente adecuados para uso en la presente invención péptidos que reconocen sitios receptores que se expresan en diversos tipos de sitios tumorales y otros tejidos a lo largo del cuerpo. De estos péptidos, se prefieren particularmente la SS y sus análogos y el VIP.

El marcaje indirecto de un péptido usando un agente quelante que contiene tiol terciario protegido para generar un derivado de péptido que contiene acetil-t-tiol permite la unión a sitios de unión que no son dianas específicas en el péptido sin una escisión prematura del tiol protegido en el otro extremo del agente quelante que contiene tiol terciario y sin la escisión de enlaces disulfuro del péptido. Este aspecto de la invención es particularmente importante para radiomarcar SS, donde la estructura de bucle debida al enlace disulfuro de cistina es importante en la unión al receptor. Además, los presentes inventores han descubierto que el enlace disulfuro del péptido en los conjugados de péptido-agente quelante de la presente invención, cuando se mezclan con un agente reductor de sal estannosa para un pertecnetato o perrenato, en un kit de un vial, no se escinde para producir fragmentos más pequeños que pueden no tener la especificidad de unión requerida o para producir grupos sulfhidrilo colgantes en el péptido. Por lo tanto, el uso de los agentes quelantes que contienen t-tiol de la presente invención permite marcar específicamente grupos sulfhidrilo colgantes del agente quelante desprotegido y no cualquier grupo sulfhidrilo libre presente en el péptido que pueda haberse generado por descuido por medio de reducción.

El agente quelante que contiene tiol terciario protegido tiene una mayor resistencia a reacciones de escisión de acilo, impidiendo de esta manera que las funcionalidades reactivas del péptido, es decir, las funcionalidades amino, desprotejan prematuramente los grupos tiol, y el uso de los agentes quelantes de la invención previene la reducción por descuido de los enlaces disulfuro presentes en el péptido. El presente método evita adicionalmente de forma substancial la formación indeseable de coloides durante el transcurso del proceso de marcaje y, en proporciones apropiadas de agente reductor y exclusión de oxígeno, el presente método previene la acumulación de pertecnetato residual como contaminante. Cuando el agente quelante que contiene t-tiol incluye además una aminoácido no natural, el péptido marcado resultante tiene potencialmente una mayor vida media in vivo debido a la incapacidad del cuerpo de reconocer y unirse o reaccionar con el aminoácido no natural.

A lo largo de esta descripción, la expresión "aminoácido no natural" significa un aminoácido que no se produce de forma natural por el cuerpo. Normalmente, estos aminoácidos no naturales incluyen isómeros de aminoácidos naturales u otras modificaciones químicas de aminoácidos naturales. Por ejemplo, la L-fenilalanina representa un aminoácido natural que se reconoce in vivo, y un ejemplo de un análogo de aminoácido no natural de L-fenilalanina sería D-fenilalanina. La D-fenilalanina es un aminoácido no natural particularmente preferido, aunque los especialistas en la técnica reconocen que en el contexto de la presente invención pueden sintetizarse y utilizarse otros numerosos aminoácidos no naturales.

Se entenderá que los péptidos, incluyendo SS y VIP, a radiomarcar también pueden ser péptidos que se dirigen a antígenos que incluyen, pero sin limitación, los antígenos producidos o asociados con tumores, lesiones infecciosas, microorganismos, parásitos, infartos de miocardio, coágulos, placas ateroscleróticas, u órganos o tejidos normales. Ventajosamente, los péptidos útiles en radioinmunoterapia son péptidos de dirección que se unen a células y tejidos que están asociados con un estado de enfermedad. Por lo tanto, al destruir estás células o tejidos, el estado de enfermedad puede aliviarse. Esta unión típicamente tiene lugar con moléculas complementarias y estructuras asociadas con o expresadas en la superficie de las células o tejidos enfermos, que preferiblemente no están asociadas con o no se expresan en la superficie de las células sanas.

Más típicamente, los restos complementarios estarán presentes en células sanas, pero en una menor medida que la que se observa en el estado de enfermedad. Por ejemplo, muchos mielomas muestran grandes aumentos de la expresión del receptor de interleuquina 6 (IL-6) en comparación con tejidos normales. Los péptidos marcados dirigidos al receptor IL-6 se unirían preferentemente a células de mieloma, conduciendo a una mayor concentración eficaz de péptido radiomarcado y produciendo un destrucción celular preferente en el sitio del tumor. Otro ejemplo es el antígeno carcinoembriónico (CEA) que se expresa en gran medida en la superficie de muchos tumores. Un fragmento peptídico radiomarcado que se dirija a CEA producirá una destrucción celular preferente en el sitio del tumor. Los especialistas en la técnica entenderán que se consigue una destrucción celular preferente usando iones de metales radiactivos que son terapéuticamente eficaces en radioinmunoterapia, tales como iones de renio y similares.

El presente método ventajosamente marca péptidos tales como SS, análogos de SS y VIP. Los análogos de SS incluyen péptidos más cortos que también contienen un bucle disulfuro y ciertos de los aminoácidos críticos presentes en SS. Como se ha indicado anteriormente, estos péptidos se han marcado con I-111 o I-123 para formar imágenes. Estos radioisótopos generalmente son menos deseables en los departamentos de medicina nuclear que el Tc-99m. Se ha descubierto que la reacción de SS, OCT, T-OCT y VIP con un agente quelante que contiene tiol terciario protegido, seguida de desacetilación y reacción con pertecnetato reducido, por ejemplo, usando un kit de glucoheptonato, produce un marcaje muy eficaz del péptido.

El método de la presente invención incluye la reacción del péptido con un agente quelante que contiene tiol terciario protegido para producir un conjugado de péptido-agente quelante que contenga al menos un grupo tiol terciario protegido. El agente quelante que contiene tiol terciario se une covalentemente al péptido y sirve para acoplar el péptido y el metal radiactivo después de la desprotección. Los especialistas en la técnica conocen bien métodos para realizar tal unión covalente. Por ejemplo, puede usarse un éster activo (por ejemplo, éster de N-hidroxisuccinimida) o un derivado de isotiocianato del agente quelante para unir el agente a funciones amino presentes en el péptido; puede usarse un derivado de 2-yodoacetilo o maleimido del agente quelante para unir el agente a grupos sulfhidrilo del péptido; puede usarse un derivado de hidrazida del agente para unir el agente a grupos carbohidrato oxidados presentes en el péptido; o puede usarse un reactivo de carbodiimida tal como 1-etil-3-(3-diaminopropil)carbodiimida para unir un grupo carboxilo del agente quelante a un grupo amino del péptido. Ventajosamente, el agente quelante que contiene tiol terciario protegido de la presente invención contiene un éster activo y se une a una función amina del péptido.

También es útil incluir un aminoácido no natural en el quelante. Se ha descubierto que esto prolonga la vida media in vivo del conjugado de péptido-quelante. Un aminoácido no natural preferido es D-fenilalanina.

Los agentes quelantes que contienen tiol terciario protegidos útiles en la presente invención son cualquier agente quelante que contenga (i) un grupo funcional capaz de formar un enlace estable con una funcionalidad del péptido, como se ha descrito anteriormente, y (ii) una porción complejante que contiene al menos un grupo tiol terciario protegido, siendo dicha porción capaz de formar complejos con un radionúclido deseado después de la desprotección, y que no reaccione con la funcionalidad del péptido para desproteger prematuramente el grupo tiol. Ventajosamente, el agente quelante que contiene tiol terciario forma un complejo de anillo de 5 ó 6 miembros con el radionúclido deseado.

Es conveniente que el grupo tiol terciario forme parte un ácido carboxílico, de manera que pueda unirse fácilmente al péptido o a un enlazador corto que finalmente se une al péptido. El documento WO 95/33495 describe varios quelantes adecuados para uso en la presente invención. Los ejemplos preferidos de tales quelantes incluyen, pero sin limitación, glicinato de (N-hidroxisuccinimidil)-N-(3-metil-3-acilmercapto butirilo) (compuesto I mostrado a continuación) y productos de reacción de este compuesto con diglicina o triglicina. Como alternativa, el agente quelante puede incluir, pero sin limitación, derivados de D-fenilalanina de glicinato de (N-hidroxisuccinimidil)-N-(3-metil-3-acilmercapto butirilo) y productos de reacción de este compuesto con diglicina o triglicina (compuesto II mostrado a continuación). Estos agentes quelantes particularmente preferidos se representan por las siguientes fórmulas.

5

6

Los grupos sulfhidrilo colgantes presentes en el agente quelante pueden ser incompatibles con un electrófilo selectivo por sulfhidrilo que puede formar parte del mismo agente quelante. Lo que es más importante, cuando el péptido a conjugar con el quelante también contiene un puente o bucle disulfuro, un grupo sulfhidrilo libre presente en el quelante podría escindir el bucle o puente y fragmentar el péptido o destruir una conformación esencial para la unión al receptor. Tales casos, el grupo sulfhidrilo se protege convenientemente durante la unión del agente quelante. El tiol protegido después puede desprotegerse usando mecanismos bien conocidos para los especialistas en la técnica. La expresión "tiol protegido", como se usa en este documento, denota un resto que contiene tiol donde el grupo tiol se modifica reversiblemente de tal forma que el tiol se vuelve no reactivo. Después de la unión al substrato peptídico, el resto quelante puede desprotegerse para desenmascarar la funcionalidad quelante para la unión del radionúclido. En particular, el tiol protegido se desprotege para generar grupos sulfhidrilo libres colgantes capaces de formar complejos con el radionúclido.

Los grupos que son adecuados para proteger el tiol de la reacción son grupos orgánicos e inorgánicos que puede retirarse fácilmente en condiciones suaves para regenerar el sulfhidrilo libre en presencia del péptido sin alterar substancialmente la actividad del péptido. Ventajosamente, el grupo protector de tiol es un grupo acilo que forma un tiol éster. Preferiblemente, el grupo acilo es un grupo acilo inferior, especialmente un grupo acetilo.

Los especialistas en la técnica están familiarizados con los procedimientos para proteger y desproteger grupos tiol y está dentro del alcance del especialista habitual en la técnica hacerlo dentro de los límites de la presente invención. Un método preferido para escindir un grupo protector de acilo sobre un tiol terciario es la reacción con hidroxilamina. Ésta es una reacción suave que normalmente no afecta a otros grupos funcionales del péptido y que tampoco escinde enlaces disulfuro.

Una vez desprotegido el tiol, se añade un radionúclido que se une a sulfhidrilo. En particular, pertecnetato o perrenato reducido. Como es bien conocido en la técnica, los radioisótopos de tecnecio o renio se suministran convenientemente en forma de "generadores", es decir, otros precursores radiactivos que se desintegran para dar sales de pertecnetato o perrenato solubles que pueden "extraerse" del generador usando solución salina. Estas especies reducidas se estabilizan convenientemente con un transquelante tal como glucoheptonato y similares, de los que muchos están disponibles como kits comerciales. Los quelatos estabilizados de las sales de Tc o Re se añaden al conjugado de quelante-péptido y el sulfhidrilo de unión más fuerte desplaza al transquelante y absorbe el ion metálico radiactivo.

Un inconveniente del proceso anterior es que es un proceso de dos etapas, donde primero se añade el pertecnetato o perrenato a una mezcla de un agente reductor, típicamente una sal de ion estannoso, y se deja que el transquelante, en un primer vial, forme un quelato de la especie de Tc o Re reducida. A continuación, el quelato de Tc o Re se añade a un segundo vial que contiene el conjugado de péptido-quelante para efectuar la reacción de transquelación/marcaje. Son inevitables pérdidas en la transferencia de los quelatos de Tc o Re y existe riesgo de derrame y contaminación. Seria deseable añadir el efluente del generador directamente a un solo vial para el marcaje.

Esto se consigue de acuerdo con la invención añadiendo al conjugado de péptido desprotegido-agente quelante un agente reductor para reducir un radionúclido, añadiéndose el radionúclido posteriormente. El agente reductor preferido es una sal de ion estannoso, por ejemplo, cloruro estannoso. La reducción de enlaces disulfuro por iones estannosos es una reacción relativamente lenta. El conjugado de péptido desprotegido-agente quelante y el agente reductor típicamente se congelan o liofilizan, impidiendo de esta manera la escisión de enlaces disulfuro en el péptido debido a la presencia del agente reductor.

La presente invención también incluye un kit que incluye un conjugado de péptido desprotegido-agente quelante y, opcionalmente, un agente reductor para reducir un radionúclido, donde el radionúclido se va a añadir posteriormente. Es posible usar un conjugado de tiol terciario protegido y añadir el agente desprotector antes o junto con el radionúclido. Los viales o kits únicos de la presente invención están diseñados para contener el péptido apropiado, complejado con el agente quelante que contiene tiol terciario, para cualquier procedimiento particular de inmunodiagnóstico o inmunoterapéutico.

De acuerdo con el presente método, los viales o kits ventajosamente se cierran herméticamente y disponen de un mecanismo para introducir o eliminar reactivos en condiciones estériles o semiestériles. Preferiblemente, en el presente método se usa un vial que contiene un orificio para la inyección con una jeringa. Los reactivos de los viales o kits típicamente se proporcionan en forma acuosa, congelada o liofilizada. En una realización, los reactivos pueden almacenarse a baja temperatura, por ejemplo, en el refrigerador o congelador o a las temperaturas del hielo seco o del nitrógeno líquido, durante un período de varios días a varias semanas, preferiblemente a un pH de aproximadamente 3,5-5,5, más preferiblemente a pH 4,5-5,0, ventajosamente en una atmósfera de gas inerte, por ejemplo nitrógeno o argón.

También está dentro del alcance de la presente invención proporcionar los reactivos en forma liofilizada para facilitar el almacenamiento y la estabilización. Esto se realiza ventajosamente a un pH de aproximadamente 5,5, desde una solución de un tampón volátil, por ejemplo, acetato amónico, y preferiblemente también en presencia de un estabilizador para prevenir la agregación, por ejemplo, un azúcar tal como trehalosa o sacarosa. Tales condiciones de liofilización son convencionales y bien conocidas para el especialista habitual en la técnica. Los reactivos también pueden congelarse y después descongelarse antes del uso, pero este procedimiento lleva asociado un mayor riesgo de reoxidación y agregación del conjugado de péptido-agente quelante.

Cuando el kit no contiene un agente reductor, se añaden quelatos catiónicos de Tc o Re pre-reducidos para efectuar el marcaje. Si en el kit están presentes sales estannosas, es suficiente añadir un efluente generador de pertecnetato o perrenato para la reducción y el marcaje in situ. El contenido del vial después se mezcla y se incuba durante un período de tiempo suficiente para efectuar el marcaje de la proteína. La duración y las condiciones de la incubación no son críticas, pero la incubación típicamente se realiza durante un período de tiempo suficiente para obtener una incorporación substancialmente del 100% de ^{99m}Tc en el péptido. "Incorporación de substancialmente el 100%", según se refiere al marcaje con tecnecio, indica una incorporación mayor del 98%, ventajosamente mayor del 99% y más ventajosamente una incorporación del 100%. Normalmente, la incubación se realiza durante un período de tiempo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 60 minutos, y ventajosamente durante un período de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 minutos. El péptido radiomarcado después puede extraerse del vial y usarse inmediatamente, ya que no se requiere separación o purificación.

El agente reductor para el radionúclido ventajosamente es estaño (II), preferiblemente en forma de iones estannosos. Típicamente, se añade cloruro estannoso a la mezcla que contiene el conjugado de péptido-agente quelante. Los especialistas en la técnica entenderán que los iones estannosos pueden generarse in situ a partir de metal de estaño, por ejemplo, láminas, gránulos, polvos, limaduras y similares, por contacto con un ácido acuoso, por ejemplo HCl, y normalmente se añaden en forma de SnCl_{2}, ventajosamente en una solución que también es aproximadamente 0,1 mM en HCl.

En general, es ventajoso trabajar con una concentración de péptido de aproximadamente 0,01-10 mg por ml, preferiblemente de aproximadamente 0,1-5 mg/ml, de solución, generalmente en solución salina, preferiblemente tamponada a un pH levemente ácido de aproximadamente 4,0-4,5. En tal caso, la cantidad de ion estannoso necesaria para la reducción de una actividad de formación de imágenes normal de pertecnetato es de aproximadamente 0,1-50 \mug/ml, preferiblemente de aproximadamente 0,5-25 \mug/ml, en proporción con la cantidad de péptido. Cuando se marca la cantidad anterior de péptido, la cantidad de pertecnetato generalmente es de aproximadamente 2-50 mCi/mg de péptido y el tiempo de reacción es de aproximadamente 0,1-30 minutos. Con las concentraciones preferidas de péptido e iones estannosos, la cantidad de pertecnetato preferiblemente es de aproximadamente 5-30 mCi/mg y el tiempo de reacción preferiblemente es de aproximadamente 1-20 minutos.

El pertecnetato generalmente se obtiene a partir de un generador disponible en el mercado, más comúnmente en forma de NaTcO_{4}, normalmente en solución salina. Pueden usarse otras formas de pertecnetato, con una modificación apropiada del procedimiento, como se sugeriría por el proveedor de una nueva forma de generador o como sería evidente para el especialista habitual en la técnica. El pertecnetato generalmente se usa a una actividad de aproximadamente 0,2-10 mCi/ml en solución salina, por ejemplo, en solución salina ("fisiológica") al 0,9%, tamponada a un pH de aproximadamente 3-7, preferiblemente de 3,5-5,5, y más preferiblemente de aproximadamente 4,5-5,0. Los tampones adecuados incluyen, por ejemplo, acetato, tartrato, citrato, fosfato y similares. La reducción del pertecnetato normalmente se realiza en una atmósfera de gas inerte, por ejemplo, nitrógeno, argón o similares. La temperatura de reacción generalmente se mantiene a aproximadamente la temperatura ambiente, por ejemplo, de 18 a 25ºC.

A lo largo de esta descripción, las expresiones, "pertecnetato reducido" o "perrenato reducido" denotan las especies de ion tecnecio o renio formadas por reducción con ion estannoso del pertecnetato o perrenato y queladas por el o los grupos tiol. Generalmente se cree que el pertecnetato reducido está en forma de Tc(III) y/o Tc(IV) y/o Tc(V) en tales quelatos, y que el perrenato reducido está en forma de Re(III) y/o Re(IV) y/o Re(V), pero dentro del alcance de la presente invención se incluyen estados de oxidación superiores o inferiores y/o estados de oxidación múltiple.

El renio se encuentra justo debajo del tecnecio en la tabla periódica, tiene la misma configuración electrónica en la envuelta externa y, por lo tanto, es de esperar que tenga propiedades químicas muy similares al tecnecio, especialmente su comportamiento con compuestos análogos. De hecho, los compuestos de renio se comportan de una forma cualitativamente similar a los compuestos de tecnecio por lo que respecta a la reducción y a la quelación, pero sus velocidades de reacción son bastante diferentes y son distintos en ciertos aspectos importantes. A pesar de estas diferencias, el especialista en la técnica puede modificar la presente invención basándose en la descripción del marcaje con tecnecio para conseguir un marcaje con renio eficaz (véase, por ejemplo, Griffiths, Patente de Estados Unidos Nº 5.128.119, cuya descripción se incorpora en este documento como referencia en su totalidad).

El radioisótopo Re-186 es atractivo para terapia y también puede usarse para formar imágenes. Tiene una vida media de aproximadamente 3,7 días, una alta emisión beta LET (1,07 MeV) y una energía de emisión gamma conveniente (0,137 MeV). Por analogía al tecnecio, el renio se produce a partir de perrenato, y los iones de renio reducidos pueden unirse de forma no específica a péptidos. Por consiguiente, sería ventajoso un método para el marcaje de péptidos con Re-186, donde el perrenato reducido se une a grupos sulfhidrilo en un complejo de péptido-agente quelante. El Re-188 es un emisor beta y gamma producido por un generador con una vida media de aproximadamente 17 horas y es adecuado para formar imágenes y para terapia. Actualmente está en marcha el desarrollo de generadores comerciales para renio-188; y en un escenario preferido, se añade renio-188 sin vehículo directamente a un vial que contiene iones estannosos y un complejo de péptido-agente quelante, para producir un péptido radiomarcado con renio que está listo para uso en menos de aproximadamente 2 horas.

En general, la concentración de péptido no complejado, por ejemplo SS o VIP, los tiempos de reacción, las actividades de perrenato y otras condiciones serán substancialmente las mismas que para el marcaje con Re-186 o Re-188, con la excepción de que se usa una mayor cantidad de ion estannoso. Cuando el radioisótopo en el radioperrenato es Re-188 substancialmente sin vehículo, la concentración de péptido en la solución ventajosamente es de aproximadamente 1-20 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 10-20 mg/ml y la cantidad de ion estannoso es de aproximadamente 500-10.000 \mug/ml, preferiblemente de aproximadamente 500-5.000 \mug/ml. Cuando el radioisótopo en el radioperrenato es Re-186 al que se le ha añadido un vehículo, a la misma concentración de anticuerpo o fragmento de anticuerpo, la cantidad de ion estannoso es de aproximadamente 5-1.000 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 50-500 mg/ml.

Los iones de cobre también se quelan fuertemente por quelantes de azufre. El Cu-67 es otro radionúclido atractivo para formar imágenes y para terapia. Tiene una vida media de aproximadamente 2,6 días, una emisión beta (0,57 MeV) y una emisión gamma (0,185 MeV), aunque la energía beta es relativamente baja. El Cu-67 es relativamente caro y no se puede adquirir fácilmente en el momento actual, aunque tales condiciones pueden cambiar según aumente la demanda. El Cu-67 tiene la ventaja de que forma quelatos fuertes con tioles, el marcaje es sencillo y rápido, y no requiere agentes reductores para el metal radiactivo.

Otros radionúclidos con un comportamiento de quelación similar al cobre, por ejemplo, el mercurio, la plata y el plomo, también podrían unirse a compuestos que contienen tiol de acuerdo con el método de la presente invención. Hg-197 tiene una vida media de aproximadamente 1,5 días y emite radiación gamma en un intervalo de energía de 78-268 KeV, y Pb-203 es un emisor gamma fuerte de aproximadamente 275 KeV con una vida media de aproximadamente 51 horas, lo cual hace que el mercurio y el plomo sean adecuados para la escintigrafía gamma. Ag-111 tiene una vida media de 7 días y emite radiación beta a aproximadamente 1,02 MeV, y Bi-212 es un emisor alfa con una vida media de aproximadamente 1 hora y una energía de 6,09 MeV, lo cual hace que tengan un interés considerable para la terapia in vivo. Bi-212 se produce in situ a partir de un precursor de Pb-212 con emisión de radiación gamma de 239 KeV, con una vida media de aproximadamente 10,6 horas. De esta manera, los conjugados de péptido-agente quelante que contiene tiol terciario para la terapia con Bi-212 serán conjugados marcados con Pb-212, y en este documento se usa la notación abreviada plomo/bismuto o Pb/Bi para indicar esto. Se entenderá que la invención no se limita al radionúclido ilustrado, sino que, en general, se puede aplicar a iones que se unen fuertemente a grupos sulfhidrilo.

Las condiciones de marcaje mencionadas anteriormente típicamente dan como resultado una incorporación substancialmente del 100%, o una incorporación substancialmente cuantitativa, del marcador en el complejo de péptido-agente quelante. A lo largo de esta descripción, la expresión "incorporación cuantitativa substancial", en relación con el marcaje con renio, denota una incorporación mayor que aproximadamente un 80%, ventajosamente mayor que aproximadamente un 85% y más ventajosamente mayor que aproximadamente un 90%. Por ejemplo, ahora es posible marcar consistentemente el péptido, complejado con un agente quelante que contiene tiol terciario, con una cantidad de 5 a 200 microgramos de Sn(II) por miligramo de péptido, con un rendimiento esencialmente cuantitativo. Además, la inmunorreactividad de este péptido marcado apenas se reduce después de esta incubación del suero, lo que demuestra que los conjugados de péptido radiomarcado-agente quelante siguen siendo agentes de formación de imágenes completamente viables después de al menos 24 horas.

En las condiciones de reacción mencionadas anteriormente, para el marcaje con tecnecio, no se requiere ningún transquelante tal como fosfonato, tartrato, glucoheptonato u otro agente quelante de Sn(II) bien conocido para mantener el estaño en solución, sin embargo, pueden usarse tales transquelantes de acuerdo con la presente invención. Para uso en el presente método se prefieren compuestos de Sn(II) tales como cloruro estannoso, aunque también son eficaces otras sales de Sn(II) convencionales y fácilmente adquiribles. Sólo hay tres ingredientes esenciales; el conjugado de péptido desprotegido-agente quelante, el ion estannoso acuoso y la solución de pertecnetato. En las condiciones de reacción descritas en este documento, puede conseguirse fácilmente una incorporación substancialmente del 100% de Tc-99m en el péptido.

El péptido radiomarcado resultante es adecuado para uso en la formación de imágenes escintigráficas de, por ejemplo, tumores, lesiones infecciosas, microorganismos, coágulos, infartos de miocardio, placas ateroscleróticas, u órganos y tejidos normales. Tales métodos de formación de imágenes son bien conocidos en la técnica. Las soluciones de péptido radiomarcado como se han preparado anteriormente están listas para la inyección inmediata si se hacen reaccionar en un vial sin pirógenos esterilizado de forma apropiada. Además, no se necesita el bloqueo de los grupos sulfhidrilo libres después de la unión del tecnecio para conseguir la estabilización.

El conjugado de péptido-agente quelante-ion de metal radiactivo preferido de la presente invención se representa por la siguiente fórmula I

Fórmula I[PÉPTIDO] - X_{n} - [I] - M

donde:

n es cero o 1;

x representa un aminoácido no natural tal como D-fenilalanina;

I representa el agente quelante representado por el compuesto I, donde el grupo tiol protegido se ha desprotegido; y

M representa un ión de metal radiactivo tal como tecnecio-99m reducido.

Preferiblemente, el péptido se une a X (o directamente a I cuando n es cero) a través del grupo amino del extremo N del péptido, aunque dentro del contexto de la presente invención también se incluye la unión a través del grupo amina libre de restos de lisina o arginina presentes en el cuerpo del péptido.

Esquema de reacción I

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Esquema de reacción II

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El esquema general para el radiomarcaje de un péptido tal como SS, OCT, T-OCT o VIP normalmente implica primero hace reaccionar el péptido con el agente quelante: I en el caso del uso del compuesto I, o X-I en el caso del uso del compuesto II. El grupo tiol protegido después se desprotege y el conjugado de péptido-agente quelante desprotegido resultante se incuba con un ion metálico radiactivo tal como tecnecio. La síntesis del conjugado de péptido-agente quelante desprotegido de acuerdo con la presente invención puede realizarse de acuerdo con el esquema de reacción I (para el compuesto I) y con el esquema de reacción II (para el compuesto II) indicados anteriormente. Se proporcionan más detalles en el documento WO 95/33495.

El método de la presente invención es particularmente atractivo para marcar SS, OCT, T-OCT y VIP, aunque también pueden marcarse péptidos que funcionan como fármacos, citoquinas, enzimas, hormonas, inmunomoduladores, péptidos receptores y similares. Los péptidos pueden contener uno o más enlaces disulfuro que forman puentes o bucles dentro de la estructura del péptido. Se conocen métodos que implican la escisión de estos enlaces disulfuro destinados típicamente para escindir selectivamente sólo los enlaces disulfuro que no juegan un papel significativo en la unión al receptor. Desafortunadamente, algunas veces estos métodos, si no se realizan con precaución, pueden producir una escisión indeseable de los enlaces disulfuro que juegan un papel significativo en la unión a los receptores, haciendo de esta manera que el péptido sea esencialmente inútil. Además, el uso de agentes quelantes que tienen grupos tiol libres también puede ocasionar una escisión indeseable similar de enlaces disulfuro en el péptido. El presente método evita específicamente tal escisión indeseable usando el agente quelante que contiene tiol terciario protegido o un agente quelante que contiene tiol terciario protegido que contiene un aminoácido no natural, y complejando el agente quelante con un grupo funcional del péptido, preferiblemente un grupo amino, permaneciendo intactos de esta manera los enlaces disulfuro del péptido.

El método de la presente invención también incluye el uso de un ligando de transferencia soluble en agua que forma complejos con el radionúclido reducido. En general, los ligandos de transferencia útiles en una realización alternativa de la presente invención son quelantes solubles en agua (o pueden hacerse solubles en agua) que son capaces de formar complejos con tecnecio-99m o con cualquiera de los radioisótopos de renio en el estado reducido o con otros radioisótopos conocidos para formar un complejo estable de ion metálico/ligando. El complejo además es capaz de intercambiar el radioisótopo con los grupos sulfhidrilo colgantes presente en el conjugado de péptido-agente quelante, después de la desprotección del o de los grupos tiol. Los ejemplos de ligandos de transferencia adecuados incluyen glucoheptonato, tartrato, DTPA, EDTA, di, tri o polialquilfosfonatos, pirofosfato o glicina y sus derivados. Los especialistas en la técnica reconocen que cualquier agente quelante capaz de complejar con radionúclidos reducidos y posteriormente transferir el radionúclido reducido a grupos sulfhidrilo colgantes es útil de acuerdo con la presente invención (véase, por ejemplo, Dean, Patente de Estados Unidos Nº 5.180.816 y/o Shochat et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.061.641, cuyas descripciones se incorporan en este documento como referencia en su totalidad).

La presente invención también incluye una realización alternativa en la que el metal radiactivo unido al tiol está "protegido terminalmente" con uno o más ligandos exógenos (véase, Shochat et al., supra). Estos ligandos generalmente están diseñados para completar la esfera de coordinación del ion y complementar el o los grupos sulfhidrilo ya proporcionados por el conjugado de péptido-agente quelante. Debe romperse el equilibrio entre los ligandos que se unen al ion tan fuertemente que debilitan el o los enlaces de azufre-metal con el o los grupos reactivos del péptido y reducen la estabilidad del marcador de metal radiactivo en suero, y los que proporcionan una potencia quelante insuficiente de forma que el ion se extraiga fácilmente del péptido por otros ligandos exógenos en el suero o en la médula ósea, o en órganos tales como el hígado, el bazo o los riñones, donde se produce aclaramiento. Los especialistas en la técnica pueden romper este equilibrio usando principios químicos conocidos, y pueden diseñar un ligando de protección terminal exógeno adecuado.

Un kit para uso en el radiomarcaje de un péptido, por ejemplo, SS, OCT, T-OCT o VIP, con Tc-99m, usando pertecnetato producido por un generador, incluiría aproximadamente 0,01-10 mg por dosis unitaria de un péptido que se dirige específicamente a un antígeno asociado con un tumor, una lesión infecciosa, un microorganismo, un infarto de miocardio, un coágulo, una placa aterosclerótica o un tejido u órgano normal, y que además está conjugado con un agente quelante que contiene tiol terciario protegido para formar un derivado de péptido-acetil-t-tiol protegido que se desprotege para formar un derivado de péptido-t-tiol. Como alternativa, el agente quelante puede incluir un aminoácido no natural tal como D-fenilalanina o similares. El kit también incluiría de aproximadamente 0,1 a 50 \mug por dosis unitaria de iones estannosos. Los constituyentes del kit se combinan justo antes del uso con aproximadamente 2-50 mCi de pertecnetato Tc-99m por mg de péptido. El derivado de péptido-t-tiol y el agente reductor de Sn(II) ventajosamente se combinan en una sola solución en un vial que puede almacenarse, por ejemplo, en un baño de nitrógeno líquido, o liofilizarse, preferiblemente añadiendo azúcar como es bien conocido en la técnica, antes de la adicción del pertecnetato. Ciertas variaciones que incluyen la adicción de reactivos convencionales de los kits anteriores están bien dentro de la experiencia rutinaria de los especialistas en la técnica.

Si se usa el derivado de péptido-acetil-t-tiol, puede desprotegerse antes de la mezcla con el agente reductor o después de la mezcla. Sin embargo, el derivado de péptido protegido-acetil-t-tiol debe desprotegerse antes de la reacción con el radionúclido. Aunque el agente de desprotección y el radionúclido pueden añadirse a la solución simultáneamente, la secuencia de reacción generalmente es (i) desprotección del derivado protegido de péptido-acetil-t-tiol y reducción del radionúclido, y (ii) marcaje del conjugado. Sin embargo, ventajosamente, el derivado de péptido-acetil-t-tiol se desprotege antes de la mezcla con el agente reductor y del almacenamiento en un kit. Tras la lectura de la presente memoria descriptiva, los especialistas en la técnica serán capaces de diseñar un método y kit usando un derivado de péptido-acetil-t-tiol protegido o desprotegido.

Los péptidos de los kits de la presente invención ventajosamente se congelan o se liofilizan, en recipientes estériles, y en un atmósfera de gas inerte, ventajosamente se enfrían y se almacenan en un baño de nitrógeno líquido y se descongelan suavemente justo antes del uso. Los kits convenientemente se suplementan con viales estériles de tampones, solución salina, jeringas, filtros, columnas y auxiliares similares para facilitar la preparación de preparaciones inyectables listas para el uso por el médico o el técnico.

En una realización particularmente preferida de la presente invención, el radiomarcaje de un péptido se realiza conjugando glicinato de (N-hidroxisuccinimidil) N-(3-metil-3-acilmercapto butirilo) ("agente quelante") con SS, OCT, T-OCT o VIP por reacción del péptido con al menos un equivalente molar, y más preferiblemente con un exceso molar de agente quelante a temperatura ambiente y a un pH dentro del intervalo de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0. El número de tioles añadidos a los péptidos puede alterarse variando el exceso molar del agente quelante empleado. El conjugado de péptido-agente quelante después preferiblemente se purifica por medios convencionales (es decir, HPLC de fase inversa) y en el conjugado purificado puede desprotegerse el tiol como y cuando sea necesario, y una vez desprotegido el tiol, el producto resultante se formula inmediatamente con cloruro estannoso y se almacena como un kit en forma de un liofilizado, en viales cerrados herméticamente, en una atmósfera de argón o al vacío. Este kit entonces está listo para mezclarse con el radionúclido.

Será evidente para un especialista habitual en la técnica que los péptidos radiomarcados, especialmente SS, OCT, T-OCT y VIP, preparados de acuerdo con el método de la invención, serán adecuados, y de hecho particularmente eficaces y convenientes, en métodos de formación de imágenes escintigráficas no invasivos y para radioterapia de tumores y lesiones. En particular, será una mejora con respecto al uso como péptido radiomarcado de un péptido marcado obtenido de acuerdo con el método de la presente invención, un método para formar imágenes de un tumor, una lesión infecciosa, un infarto de miocardio, un coágulo, placas ateroscleróticas o un órgano tejido normal, donde a un paciente humano se le inyecta por vía parenteral un péptido que se dirige específicamente a un antígeno producido o asociado con el tumor, etc., y radiomarcado con un radioisótopo farmacéuticamente inerte que puede detectarse externamente y, después de un periodo de tiempo suficiente para que el péptido radiomarcado pueda localizarse y para eliminar el efecto de fondo indeseado, se detecta el sitio o sitios de acumulación del péptido radiomarcado por una cámara de formación de imágenes externa. Tal péptido radiomarcado no se eliminará significativamente en el hígado, proporcionará una buena relación entre el tejido tumoral y no tumoral, y proporcionará una excelente dirección in vivo al tumor.

Otra aplicación importante será para la detección directa de márgenes de tumores en un examen intraoperatorio, intravascular o endoscópico y en cirugía. El péptido pequeño radiomarcado puede usarse solo o en combinación con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo radiomarcado, como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos 4.932.412.

Además, un método de radioterapia para un paciente que padece un tumor o una lesión infecciosa, donde al paciente humano que padece el tumor o la lesión infecciosa se le inyecta por vía parenteral un péptido que se dirige específicamente a un antígeno producido por o asociado con el tumor o la lesión infecciosa, y radiomarcado con un radioisótopo terapéuticamente eficaz, representará una mejora con respecto al uso como péptido radiomarcado de un péptido radiomarcado con renio obtenido de acuerdo con el método de la presente invención.

Se cree que un especialista en la técnica, sin elaboración adicional, usando la descripción anterior, puede utilizar la presente invención en su mayor extensión. Por lo tanto, las realizaciones específicas preferidas anteriores deben considerarse simplemente ilustrativas y no limitantes de la descripción de manera alguna.

Claims

1. Un método para radiomarcar un péptido con un radioisótopo de tecnecio o renio, que comprende las etapas de:

(b) desproteger el grupo acetil-t-tiol para generar un grupo t-tiol libre;

y

(d) hacer reaccionar la mezcla de la etapa (c) con pertecnetato o perrenato, con lo que los cationes de Tc o Re se unen al grupo t-tiol, formándose de esta manera un péptido radiomarcado,

o

2. El método de la reivindicación 1, donde la etapa de desprotección (b) se realiza con hidroxilamina.

3. El método de la reivindicación 1, donde dicho agente quelante bifuncional que contiene tiol terciario protegido con acetilo es glicinato de N-hidroxisuccinimidil N-(3-metil-3-acilmercaptobutirilo).

4. El método de la reivindicación 3, donde dicho agente que contiene tiol terciario protegido con acetilo es un éster de N-hidroxisuccinimidilo de la N-(3-metil-3-acilmercaptobutiril)glicilamida de un aminoácido no natural.

5. El método de la reivindicación 4, donde dicho aminoácido no natural es D-fenilalanina, y dicho agente quelante bifuncional que contiene tiol terciario protegido con acetilo es N-(3-metil-3-acilmercaptobutiril)glicil-D-fenilalaninato de N-hidroxisuccinimidilo.

6. El método de la reivindicación 1, donde dicho péptido es: somatostatina o un análogo de la misma; o un péptido intestinal vasoactivo.

7. El método de la reivindicación 1, donde dicho radionúclido es Tc-99m; Re-186; o Re-188.

8. Un kit adecuado para formar un péptido radiomarcado con tecnecio o renio a administrar a un paciente humano, que comprende un recipiente estéril que contiene una cantidad eficaz de un conjugado que contiene péptido-t-tiol preparado de acuerdo con las etapas (a) y (b) de la reivindicación 1 y radiopertecnetato reducido o radioperrenato reducido respectivamente a añadir en una etapa posterior.

9. Un kit adecuado para formar un péptido radiomarcado con tecnecio o renio a administrar a un paciente humano, que comprende un recipiente estéril que contiene (i) una cantidad eficaz de un conjugado que contiene péptido-t-tiol preparado de acuerdo con las etapas (a)-(c) de la reivindicación 1, y (ii) una cantidad suficiente para reducir de una forma sustancialmente completa el radiopertecnetato o radioperrenato añadidos respectivamente, de una sal estannosa, siendo dicho radiopertecnetato o radioperrenato respectivamente para añadirse en una etapa posterior.

10. El kit de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, donde el contenido de dicho recipiente estéril está liofilizado.

11. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde dicho péptido es somatostatina o un análogo de la misma o el péptido intestinal vasoactivo.

12. Somatostatina o un análogo de la misma marcado con Tc-99m, o péptido intestinal vasoactivo marcado con Tc-99m, producidos por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en la detección o en la formación de imágenes de tumores.

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13. Somatostatina o un análogo de la misma marcado con Re-186 o Re-188, o péptido intestinal vasoactivo marcado con Re-186 o Re-188, producidos por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para uso en una terapia tumoral.