ES2206588T3 - Preparaciones antigenicas. - Google Patents

Preparaciones antigenicas.

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ES2206588T3 ES96928443T ES96928443T ES2206588T3 ES 2206588 T3 ES2206588 T3 ES 2206588T3 ES 96928443 T ES96928443 T ES 96928443T ES 96928443 T ES96928443 T ES 96928443T ES 2206588 T3 ES2206588 T3 ES 2206588T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A PREPARACIONES ANTIGENICAS QUE COMPRENDEN POLISACARIDOS Y/O GLUCOPEPTIDOS QUE PUEDEN PREPARARSE A PARTIR DE HONGOS QUERATINOFILICOS ASI COMO DE LEVADURAS, PROCESOS PARA LA PREPARACION DE ESTAS PREPARACIONES ANTIGENICAS, SU USO COMO SUSTANCIAS FARMACEUTICAS ASI COMO SU USO COMO VACUNAS, INCLUIDAS PERO NO LIMITADAS A, LA PROFILAXIS Y EL TRATAMIENTO DE ALERGIA, ASI COMO PARA MODULAR LA RESPUESTA INMUNE.

Description

Preparaciones antigénicas.
El presente invento se refiere a preparaciones antigénicas que comprenden polisacáridos y/o glicopéptidos, que pueden prepararse a partir de hongos queratinófilos así como de levaduras, a los procedimientos para preparar estas preparaciones antigénicas, a su uso como sustancias farmacéuticas así como a su uso como vacunas, incluyendo pero sin limitarse a ello, la profilaxis y el tratamiento de alergias, y también la modulación de la respuesta inmunitaria.
La alergia en una u otra forma afecta a más del 20 por ciento de la población humana, y el aumento alarmante en su prevalencia, morbilidad y mortalidad durante la pasada década ha conducido a su designación como enfermedad medioambiental número uno (Sutton y Gould, Nature 1993, 366, págs. 421-428). La población humana y la población animal presentan un grado similar de afectación por alergias.
En el desarrollo de las alergias, las reacciones inmunológicas desempeñan un papel clave (Paul, William E. (Redactor), Fundamental Immunology, Raven Press Books Ltd., Nueva York, 1984). En principio se han descrito dos tipos diferentes de reacciones alérgicas. Uno es la hipersensibilidad de tipo inmediato (ITH), en la que la respuesta alérgica máxima frente al alérgeno se observa en un plazo de minutos a horas. El segundo tipo es la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) (del inglés, " Delayed Type Hypersensitivity"). En el caso de la DTH, la respuesta alérgica frente al alérgeno normalmente alcanza su máximo después de 24 a 48 horas. Es muy probable que la ITH esté medida de manera predominante a través de la ruta de la IgE, mientras que la DTH es más compleja. En el desarrollo de la DTH es probable que estén implicadas otras respuestas mediadas por células (es decir, por linfocitos B y linfocitos T). Por ejemplo, después de transferir linfocitos y anticuerpos de animales donantes alérgicos a animales receptores no alérgicos, los receptores desarrollaron una DTH (Askenase, P.W. (1973), J. Exp. Med., 138, págs. 1144-1155).
Debido a su exposición directa a antígenos medioambientales, los tejidos más afectados por alergias son los tejidos epiteliales, especialmente la piel. Por ejemplo, en clínica dermatológica, las dermatitis alérgicas agudas por contacto y el eccema alérgico crónico por contacto son responsables de hasta el 15% de todas las dermatosis. El asma alérgico es responsable de aproximadamente el 20% de todos los casos de asma en seres humanos.
Las enfermedades alérgicas que pueden clasificarse como ITH, son por ejemplo el eccema atópico, asma alérgico bronquial, fiebre del heno, rinitis, conjuntivitis. Estas enfermedades pueden también evolucionar hacia formas crónicas y no se las debe considerar exclusivamente como reacciones dependientes de IgE. Son ejemplos de DTH la dermatitis alérgica aguda por contacto y el eccema alérgico crónico por contacto, los cuales pueden también clasificarse como DTH (de tipo IV) con implicación epidérmica. Un paciente de esas enfermedades se habría sensibilizado previamente a través del contacto con un alérgeno y habría desarrollado una hipersensibilidad. El contacto renovado con el alérgeno produce una dermatitis inflamatoria por contacto, aguda, subaguda o crónica.
Un ejemplo de dermatitis alérgica en clínica veterinaria es el Eccema de Verano, también denominado "Sweet" o sarna de "Queens Land". El Eccema de Verano es una dermatitis alérgica de los caballos, perteneciente a la forma atópica de enfermedades alérgicas (en la que están involucradas reacciones de Tipo I y Tipo IV). El Eccema de Verano lo produce la picadura de moscas de agua de las familias Culicidae y Ceratopgonidae, y se caracteriza por lesiones cutáneas con erosiones y exudados permanentes, principalmente en las regiones de la crin, cola y abdomen. Los animales afectados presentan una fuerte sensibilidad de la piel en lo que respecta a irritaciones, es decir, por contacto, lluvia, viento, etc., que alteran su estado general de salud y su comportamiento. Al igual que sucede con otras alergias, se piensa que en el desarrollo de esta enfermedad también influyen factores nutricionales. Los síntomas de esta enfermedad son sólo visibles de marzo a septiembre, mientras que la sensibilidad de la piel inducida por un alérgeno se observa durante todo el año. El Eccema de Verano proporciona un interesante sistema de modelo general para el estudio de la alergia y para el desarrollo de sustancias antialérgicas.
Se han propuesto muchos tratamientos para la alergia dependiendo del cuadro clínico. Para el tratamiento de la dermatitis alérgica aguda por contacto, del eccema alérgico crónico por contacto y/o del eccema atópico, normalmente se utilizan cremas lipófilas que contienen glucocorticoides, sustancias antimicrobianas, fármacos antiinflamatorios y/o calcio. Para el tratamiento del Eccema de Verano se han aplicado diferentes compuestos por vía local o parenteral, por ejemplo, preparaciones esteroideas, insecticidas, diferentes formulaciones galénicas, salicilatos, aceites o péptidos aislados de microorganismos. Todos los tratamientos anteriormente mencionados sólo combaten los síntomas y no las causas de la alergia.
La respuesta inmunitaria deficiente o inmunodeficiencia suele desempeñar papeles importantes en el desarrollo de la alergia. Por lo tanto, también se han utilizado métodos inmunoterapéuticos, por ejemplo, la administración de inmunoestimuladores como BCG, levamisol y otros estimuladores, en el tratamiento del eccema, eccema atópico, abcesos de la piel y también de enfermedades autoinmunitarias (A.M. Tschernucha (Redactor) Koscha, publicado por Medicina en 1982, Moscú).
Para el tratamiento de la dermatitis alérgica producida por pulgas, la administración de péptidos derivados de anticuerpos se ha usado con éxito (solicitud de Patente británica n.º 8913737). Para el tratamiento del eccema atópico, también se ha utilizado la desensibilización con resultados relativamente buenos (A. M. Tschernucha (Redactor), Koscha, publicado por Medicina en 1982, Moscú).
A pesar de las diferentes estrategias empleadas en el tratamiento de alergias, hasta donde el conocimiento llega, en el tratamiento de alergias no se han utilizado compuestos antigénicos que pueden prepararse a partir de hongos queratinófilos y de levaduras.
En el contexto del presente invento, el término "soluble" o la expresión "no soluble" se refiere a la solubilidad en una disolución acuosa. La expresión "preparación antigénica" se refiere a toda composición de materia que es capaz de inducir una respuesta antigénica o inmunogénica. La expresión "que modula la respuesta inmunitaria" se refiere a la capacidad de las preparaciones antigénicas del presente invento para estimular o potenciar la respuesta inmunitaria, por ejemplo como se demuestra por la capacidad de esas preparaciones para estimular la proliferación de linfocitos en cultivos celulares (puede encontrarse una revisión detallada en Strube y col. (1989), Vet. Med. Rev., 60, págs. 3-15, Büttner M. (1993), Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis., 16, n.º1, págs. 1-10).
En la actualidad se ha encontrado de manera inesperada, que las preparaciones antigénicas que pueden prepararse a partir de hongos queratinófilos o levaduras, pueden utilizarse para la profilaxis y tratamiento de alergias, así como para modular la respuesta inmunitaria, particularmente en mamíferos.
En la actualidad se han desarrollado procedimientos para preparar material antigénico a partir de hongos queratinófilos así como de levaduras. Las preparaciones antigénicas que se pueden preparar conforme a estos procedimientos comprenden polisacáridos y/o glicopéptidos. Las preparaciones antigénicas pueden usarse como composiciones farmacéuticas además de como vacunas para el tratamiento de animales y seres humanos, especialmente para el tratamiento de alergias y para modular la respuesta inmunitaria. Se entenderá que las composiciones farmacéuticas de este invento pueden tener una utilidad tanto inmunológica como farmacológica.
El material antigénico de este invento también puede prepararse a partir de material derivado de hongos queratinófilos o levaduras, por ejemplo, a partir de paredes celulares de hongos o levaduras.
Para la elaboración de las preparaciones antigénicas del presente invento, se han desarrollado tres procedimientos diferentes. Según estos procedimientos, tres fracciones antigénicas diferentes (ASMP, ANMP o AEMP), en lo sucesivo denominadas comúnmente "fracciones", pueden prepararse a partir de hongos queratinófilos así como de levaduras. Las preparaciones antigénicas que comprenden más de una fracción se denominarán de ahora en adelante "preparación de un complejo" o de manera abreviada "Complejo".
Procedimiento 1
La fracción que puede prepararse conforme a este procedimiento, está formada por un material antigénico soluble que comprende polisacáridos y/o glicopéptidos (ASMP) (del inglés, " Antigenic Soluble Material comprising polysaccharide and/or glycopeptides"). De manera breve este procedimiento, que se ilustra con detalle en el Ejemplo 1, comprende las siguientes etapas:
Se cultivan hongos queratinófilos o levaduras en placas de Agar, por ejemplo, de la manera descrita en el documento EP 0564620. Uno de los medios preferidos es por ejemplo el agar extracto de malta procedente de Oxoid. También pueden utilizarse otros medios que aseguren el crecimiento de hongos queratinófilos o levaduras. La biomasa fúngica resultante se despega del cultivo y se trata con una disolución acuosa de un álcali. Las disoluciones acuosas alcalinas preferidas son NaOH o KOH en las concentraciones preferidas de 0,1-5% (p/v). El tratamiento alcalino preferiblemente se lleva a cabo preferiblemente a 20-150ºC durante un máximo de 30 h. Después del tratamiento en condiciones alcalinas acuosas, las fases sólida y líquida de la preparación se separan, por ejemplo, por centrifugación, filtración o sedimentación. Preferiblemente la separación se realiza por centrifugación que asegura una buena separación de los restos celulares fúngicos, por ejemplo, a fuerzas de aproximadamente 3.500 g. El tratamiento en condiciones alcalinas acuosas, así como la etapa de separación, pueden repetirse varias veces.
Después del tratamiento alcalino, el sobrenadante resultante se trata en condiciones ácidas acuosas, p. ej., con un ácido orgánico 0,2-1,5 M o con un ácido mineral 0,05-1 M. Por ejemplo puede usarse HCl o ácido acético, preferiblemente a valores de pH entre pH 2,5 y pH 4,5. Preferiblemente el tratamiento en condiciones ácidas acuosas se realiza durante de 2 a 4 horas a temperaturas de 4 a 8ºC, después de lo cual tiene lugar la separación de las capas sólida y líquida. El tratamiento en condiciones ácidas acuosas, así como la etapa de separación, pueden repetirse varias veces, preferiblemente en las condiciones anteriormente indicadas. A continuación, el sobrenadante resultante de la etapa de separación se somete a una etapa de precipitación. Preferiblemente la precipitación se realiza añadiendo al sobrenadante un disolvente orgánico adecuado, p. ej., un alcohol, tal como un alcanol inferior, por ejemplo metanol o etanol. Una relación de un volumen de sobrenadante por 2-5 volúmenes de alcohol dará como resultado una buena precipitación del material antigénico. También pueden utilizarse otros procedimientos de precipitación no alcohólica, conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, la precipitación con sulfato amónico u otra sal puede asimismo producir la precipitación del material antigénico. La fase sólida se somete luego a una nueva etapa de separación, preferiblemente en condiciones como las anteriormente descritas. La fase sólida resultante se recupera y si se desea se disuelve en una disolución acuosa, preferiblemente en agua destilada, de la que típicamente se utilizan de 25 a 100 ml. Por último, la preparación ASMP puede liofilizarse y almacenarse durante períodos de tiempo prolongados en condiciones secas.
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Procedimiento 2
La fracción que puede prepararse conforme a este procedimiento está formada por un material antigénico no soluble que comprende polisacáridos y/o glicopéptidos (ANMP) (del inglés, " Antigenic Nonsoluble Material comprising polysaccharide and/or glycopeptides").
De manera breve este procedimiento, que está ilustrado con detalle en el Ejemplo 2, comprende las siguientes etapas:
Los hongos queratinófilos o levaduras se cultivan en placas de Agar, por ejemplo, de la manera descrita en el documento EP 0564620. Uno de los medios preferidos es por ejemplo el agar extracto de malta procedente de Oxoid. También pueden utilizarse otros medios que aseguran el crecimiento de hongos queratinófilos o levaduras. La biomasa fúngica resultante se despega del cultivo y se trata con una disolución acuosa de un álcali. Las disoluciones alcalinas acuosas preferidas son NaOH o KOH en las concentraciones preferidas de 0,1-5% (p/v). El tratamiento alcalino preferiblemente se lleva a cabo a 20-150ºC durante un máximo de 30 h. Después del tratamiento en condiciones alcalinas acuosas, las fases sólida y líquida de la preparación se separan, por ejemplo, por centrifugación, filtración o sedimentación. Preferiblemente la separación se realiza por centrifugación, que asegura una buena separación de los restos celulares fúngicos, por ejemplo, a fuerzas de aproximadamente 3.500 g. El tratamiento en condiciones alcalinas acuosas puede repetirse varias veces, así como la etapa de separación. Después del tratamiento alcalino, la fase sólida se trata con ácidos minerales u orgánicos. Preferiblemente ácido acético 0,2-1,5 M o HCl 0,05-1 M se añaden a la fase sólida durante de 0,5 a 3 horas, a temperaturas de 70 a 100ºC. Después del tratamiento ácido, la fase sólida se lava con una disolución acuosa, preferiblemente agua destilada. Para mayor ventaja, el lavado se repite aproximadamente cinco veces. Por último, la fase sólida se suspende en agua destilada.
Procedimiento 3
La fracción que puede prepararse conforme a este procedimiento está formada por un material antigénico exógeno que comprende polisacáridos y/o glicopéptidos (AEMP) (del inglés, " Antigenic Exogenous Material comprising polysaccharide and/or glycopeptides"). De manera breve este procedimiento, que está ilustrado con detalle en el Ejemplo 3, comprende las siguientes etapas:
Los hongos queratinófilos o levaduras se cultivan en una disolución acuosa o se cultivan en un medio líquido durante un máximo de 240 horas (el volumen de la disolución o cultivo se define aquí como volumen primario PV). Puede utilizarse agua destilada (véase el ejemplo 3.I.) así como los medios descritos en el documento EP 0564620. Después de la incubación o cultivo, las células fúngicas se separan, por ejemplo, por centrifugación, filtración o sedimentación, preferiblemente por centrifugación en las condiciones anteriormente descritas. El sobrenadante resultante se liofiliza luego y posteriormente se disuelve en agua. Preferiblemente, el volumen de agua es igual a de 0,1 a 0,2 volúmenes del volumen primario (PV). La disolución resultante se somete luego a una etapa de precipitación. Preferiblemente, la precipitación se realiza añadiendo al sobrenadante un disolvente orgánico adecuado, p. ej., un alcohol, tal como un alcanol inferior, por ejemplo, metanol o etanol. Una relación de un volumen de sobrenadante por 2-5 volúmenes de alcohol producirá una buena precipitación del material antigénico. También pueden utilizarse otros procedimientos de precipitación no alcohólica conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, la precipitación con sulfato amónico u otra sal puede producir también la precipitación del material antigénico. El precipitado resultante se recupera y si se desea se disuelve en un disolvente acuoso, preferiblemente en agua destilada. Preferiblemente, de 0,5 a 50 mg del precipitado se disuelven en 1 ml de disolvente acuoso. Por último, la disolución de AEMP puede liofilizarse y almacenarse durante períodos de tiempo prolongados en condiciones secas, preferiblemente a de 2 a 10ºC.
Los géneros de hongos preferidos a partir de los cuales se pueden preparar las fracciones anteriormente definidas son los géneros Trichophyton, Microsporum o Candida.
Las especies preferidas son:
- Trychophyton equinum, - Trichophyton mentagrophytes, - Trichophyton sarkisovii, - Trichophyton verrucosum, - Microsporum canis,
- Microsporum gypseum, o
- Candida albicans.
Las cepas preferidas de las especies anteriormente mencionadas son:
- Trychophyton equinum DSM n.º 7276,
- Trichophyton mentagrophytes DSM n.º 7279,
- Trichophyton sarkisovii DSM n.º 7278,
- Trichophyton verrucosum DSM n.º 7277,
- Microsporum canis DSM n.º 7281,
- Microsporum canis var. obesum DSM n.º 7280
- Microsporum canis var. distortum DSM n.º 7275,
- Microsporum gypseum DSM n.º 7274, o
- Candida albicans DSM n.º 9656.
Todas las cepas anteriormente mencionadas han sido depositadas por el solicitante en la DSM ("Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Alemania) bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest sobre el Depósito de microorganismos. Todas las cepas excepto Candida albicans DSM No. 9656 han sido previamente descritas en la solicitud de Patente de USSR n.º 5006861, presentada el 21.10.1991, y en las correspondientes solicitudes, es decir, en la solicitud de Patente publicada, documento EP 0564620, presentada el 17.10.1992.
Dependiendo de la especie a partir de la cual las fracciones pueden obtenerse, las fracciones se mencionan de la siguiente manera.
Las fracciones derivadas de:
(i) Trichophyton equinum, se mencionan como ASMP-TE, ANMP-TE o AEMP-TE.
(ii) Trichophyton mentagrophytes, se mencionan como ASMP-TM, ANMP-TM o AEMP-TM.
(iii) Trichophyton sarkisovii, se mencionan como ASMP-TS, ANMP-TS o AEMP-TS.
(iv) Trichophyton verrucosum, se mencionan como ASMP-TV, ANMP-TV o AEMP-TV.
(v) Microsporum canis, se mencionan como ASMP-MC, ANMP-MC o AEMP-MC.
(vi) Microsporum gypseum, se mencionan como ASMP-MG, ANMP-MG o AEMP-MG, o
(vii) Candida albicans, se mencionan como ASMP-CA, ANMP-CA o AEMP-CA.
Cuando se proporciona información concerniente a la cepa específica, la abreviatura de la especie va seguida de los dígitos del depósito específico en la DSM, por ejemplo, AEMP-CA9656 se refiere a la fracción de AEMP que se puede preparar a partir de la cepa DSM n.º 9656 de Candida albicans.
Las Fracciones que se pueden preparar según se ha definido en uno cualquiera de los procedimientos anteriormente descritos (de 1 a 3) comprenden al menos un único antígeno que puede prepararse a partir de al menos uno de los hongos anteriormente mencionados. Las preparaciones antigénicas del presente invento comprenden al menos una de las fracciones anteriormente definidas o de sus combinaciones.
Las preparaciones antigénicas (ASMP y AEMP) según se describen en los Ejemplos 1 y 3:
1) comprenden monosacáridos, aminoácidos y nucleótidos, que están unidos en gran proporción en forma de estructuras poliméricas y en una pequeña proporción son monómeros libres.
2) están constituidas principalmente por unidades de monosacáridos: manosa, galactosa, glucosa y xilosa, y por otras unidades de monosacáridos en cantidades relativas diferentes.
3) contienen una mezcla de estructuras poliméricas formadas por una cantidad importante de estos monosacáridos. Una parte importante de estas estructuras poliméricas presentan pesos moleculares mayores que 20.000 kDa.
4) contienen pequeñas cantidades de aminoácidos libres o unidos.
5) contienen pequeñas cantidades de moléculas de DNA que se observa que son sensibles a la digestión con DNasa I.
La espectroscopía de NMR de las preparaciones antigénicas ASMP y AEMP dio como resultado espectrogramas de NMR que se presentan en las Figuras de 1 a 4.
Los desplazamientos químicos y las multiplicidades de las señales (resumidas en la Tabla 12) coinciden con los datos informados en la literatura referentes a carbohidratos y aminoácidos.
Para las fracciones de AEMP y ASMP, p. ej., MG 7274, TM 7279 y CA 9656, las señales correspondientes a carbohidratos cubren un intervalo de 3,2 - 5,5 ppm, y las señales correspondientes a aminoácidos cubren una región de 0,75 - 3,45 (en ausencia de protones \alpha).
ASMP también muestra señales típicas correspondientes a acetato-CH_{3} de 1,92 ppm.
Las fracciones de AEMP muestran también señales típicas correspondientes a disacáridos y aminoácidos. P. ej., el espectro de TM 7279 muestra señales correspondientes a aminoácidos aromáticos tales como Fenilalanina, Tirosina y Triptófano en la región de 7,15-7,9 ppm.
Respecto a las fracciones individuales de ASMP o AEMP, se prefieren las concentraciones de 0,1 a 50 mg/ml. Respecto a las fracciones individuales de ANMP, se prefieren las concentraciones del 0,1 al 5% (v/v).
Las realizaciones preferidas de las preparaciones antigénicas del presente invento comprenden por ejemplo las siguientes combinaciones de las Fracciones (Complejos):
El Complejo 1 comprende ASMP-TM, ASMP-MG y ASMP-CA. Preferiblemente la concentración de cada fracción es de 0,1 a 50 mg/ml. Una realización sumamente preferida según el Complejo 1 es una combinación de ASMP-TM7279, ASMP-MG7274 y ASMP-CA9656.
El Complejo 1.1 comprende ASMP-MG y ASMP-CA. Preferiblemente la concentración de cada fracción es de 0,1 a 50 mg/ml. Una realización sumamente preferida según el Complejo 1.1 es una combinación de ASMP-MG7274 y ASMP-CA9656.
El Complejo 2 comprende ANMP-TM, ANMP-MG y ANMP-CA. Preferiblemente la concentración de cada fracción es del 0,1 al 5% (v/v). Una realización sumamente preferida según el Complejo 2 es una combinación de ANMP-TM7279, ANMP-MG7274 y ANMP-CA9656.
El Complejo 3 comprende AEMP-TM, AEMP-MG y AEMP-CA. Preferiblemente la concentración de cada fracción es de 0,1 a 50 mg/ml. Una realización sumamente preferida según el Complejo 3 es una combinación de AEMP-TM7279, AEMP-MG7274 y AEMP-CA9656.
El Complejo 4 comprende ANMP y AEMP. Se prefieren las siguientes combinaciones de fracciones: (1) ANMP-CA y AEMP-TM o (2) ANMP-MG, ANMP-TM y AEMP-TM. Preferiblemente la concentración de ANMP es del 0,1 al 5% (v/v) y la de AEMP es de 0,1 a 50 mg/ml. Las realizaciones sumamente preferidas según el Complejo 4 son las siguientes combinaciones:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 4.1 \+ ANMP-CA9656 y \+ 4.2 \+
ANMP-MG7274 y\cr  \+ AEMP-TM7279; \+
\+ ANMP-TM7279 y\cr  \+ \+ \+
AEMP-TM7279;\cr}
El Complejo 5 comprende ANMP y ASMP. Una combinación preferida es ANMP-MG, ANMP-TM y ASMP-CA. Preferiblemente la concentración de las fracciones individuales de ANMP es del 0,1 al 5% (v/v), y la de las fracciones individuales de ASMP es de 0,1 a 50 mg/ml. La combinación de ANMP-MG7274, ANMP-TM7279 y ASMP-CA9656 es sumamente preferida.
Otros complejos antigénicos preferidos conforme al presente invento comprenden por ejemplo: ASMP y AEMP, o ASMP, AEMP y ANMP, en concentraciones para ASMP y AEMP de 0,1-50 mg/ml, y para ANMP en concentraciones del 0,1 al 5% (v/v).
Las preparaciones antigénicas del presente invento pueden aplicarse junto con vehículos fisiológicamente adecuados que no producen efectos secundarios fisiológicos adversos, e incluyen tampones, disoluciones o adyuvantes, por ejemplo disoluciones de sales, disoluciones de lactato o la disolución de Ringer. Los vehículos preferidos son por ejemplo: Vehículo A: disolución acuosa que comprende NaCl al 0,85% (p/v); Vehículo B: disolución acuosa que comprende Glucosa al 5% (p/v), extracto de carne "lab-lemco" (Oxoid) al 0,3% (p/v), y extracto de levadura (Oxoid) al 0,1% (p/v); Vehículo C: Medio RPMI 1640 (adquirido procedente de Serva, número de catálogo 12-702).
Las preparaciones antigénicas del presente invento pueden aplicarse per se o en forma de disoluciones para inyección, cremas, sprays, aerosoles, comprimidos y otras formas de aplicación conocidas por el experto en la técnica. Las preparaciones antigénicas del presente invento pueden también proporcionar vacunas altamente efectivas.
Las preparaciones antigénicas del presente invento son capaces de estimular la proliferación de células del sistema inmunitario y por ello son capaces de modular la respuesta inmunitaria. Las preparaciones antigénicas del presente invento son además capaces de inhibir la proliferación de queratinocitos humanos.
Las preparaciones antigénicas del presente invento pueden conferir un alto grado de resistencia frente a reacciones alérgicas, en particular de tejidos epiteliales, y más en particular de la piel. Tienen interés en cuanto a la prevención y cura de alergias, y utilizadas por los autores del invento, no han presentado efectos secundarios adversos según se demuestra in vivo en animales de laboratorio (es decir, en cobayas y ratones blancos) y en caballos (es decir, en caballos de razas híbridas y en caballos islandeses).
En particular, la dermatitis alérgica aguda y las lesiones cutáneas alérgicas agudas pueden curarse de manera efectiva y sin efectos secundarios mediante la administración de la preparación antigénica del presente invento, es decir, mediante vacunación. Después de la inyección o inyecciones intramusculares de las preparaciones antigénicas del presente invento, los síntomas de inflamación alérgica de la piel, prurito y la sensibilidad de la piel de los individuos afectados de dermatitis alérgica pueden suprimirse. La recuperación completa de todos los síntomas alérgicos se ha alcanzado en el plazo de 2 a 8 semanas después de la última inyección, y la sensibilidad de la piel frente a los irritantes, inducida por el alérgeno, quedó suprimida. Además, en el plazo de 1 a 6 semanas después de la última inyección, el prurito puede desaparecer.
En una realización preferida, las preparaciones antigénicas del presente invento proporcionan protección y cura para el denominado Eccema de Verano de caballos, en especial de caballos islandeses. Después de 1 a 3 inyecciones intramusculares o intradérmicas de las preparaciones antigénicas del presente invento, los caballos afectados de Eccema de Verano pueden curarse del Eccema de Verano o quedar protegidos frente a él, siendo preferidos los complejos 1 y 1.1.
En una realización preferida más, las preparaciones antigénicas del presente invento proporcionan protección y cura frente a la alopecia en mamíferos. Después de 1 a 3 inyecciones intramusculares o intradérmicas de las preparaciones antigénicas del presente invento, los mamíferos afectados de alopecia pueden curarse de la alopecia o quedar protegidos frente a ella, siendo preferidos los Complejos 1 ó 1.1.
En otra realización preferida, las preparaciones antigénicas del presente invento mejoran el estado del pelo y el cambio de pelaje estacional de mamíferos. Después de 1 a 3 inyecciones intramusculares o intradérmicas, el estado del pelaje puede mejorarse de manera significativa y en los individuos afectados de un cambio de pelaje incompleto puede producirse el cambio completo al pelaje estacional normal, siendo preferidos los Complejos 1 ó 1.1.
En otra realización preferida, las preparaciones antigénicas del presente invento proporcionan la protección y cura frente a eccemas. Después de 1 a 3 inyecciones intradérmicas o intramusculares del tratamiento, o después del tratamiento tópico, con las preparaciones antigénicas del presente invento, los mamíferos, es decir, seres humanos, afectados de eccema, pueden curarse del eccema o quedar protegidos frente a él, siendo preferidas las fracciones ASMP-MG, ASMP-CA y ASMP-TM, es decir, ASMP-MG7274, ASMP-CA9656 y ASMP-TM7279, o los complejos 1 y 1.1.
En una realización preferida más, las preparaciones antigénicas del presente invento proporcionan protección y cura frente a neurodermatitis. Después del tratamiento tópico con las preparaciones antigénicas del presente invento, los mamíferos, es decir, seres humanos, afectados de neurodermatitis pueden curarse de la neurodermatitis o quedar protegidos frente a ella, siendo preferidas las fracciones ASMP-MG, ASMP-CA y ASMP-TM, es decir, ASMP-MG7274, ASMP-CA9656 y ASMP-TM7279, o los complejos 1 y 1.1.
Las preparaciones antigénicas del presente invento pueden utilizarse para tratar diversos estados como los descritos en "Klinische Immunologie", Peter, H.H. (redactor), publicado en 1991 por Urban & Schwarzenberg, Munich, Alemania, por ejemplo:
1. enfermedades alérgicas de las vías respiratorias
1.1
rinitis y conjuntivitis alérgicas
1.1.1.
rinoconjuntivitis estacional
1.1.2.
rinitis crónica
1.2.
asma bronquial
1.3.
estado asmático
1.4.
asma infantil
1.4.1.
enfermedad pulmonar obstructiva posterior a una bronquiolitis infecciosa
1.4.2.
asma bronquial episódico benigno o crónico benigno
1.4.3.
asma bronquial crónico fuerte
2. aspergilosis broncopulmonar alérgica
3. alergias alimentarias
3.1.
alergia alimentaria mediada por IgE
3.1.1.
alergia alimentaria infantil mediada por IgE
3.1.2.
alergia alimentaria mediada por IgE de estados juveniles y adultos
3.2.
alergias alimentarias mediada por IgG y por células T
3.3.
intolerancia a la leche de vaca
3.4.
síndrome de Heiner
3.5.
gastroenteropatía eosinófila
3.6.
enfermedad celíaca
4. Alergia a picaduras/aguijones de insectos
5. urticaria en todas sus formas
5.1.
urticaria por contacto
5.2.
urticaria concomitante con reacciones alérgicas
5.3.
urticaria concomitante con la intolerancia a aditivos e inhibidores de la síntesis de prostaglandinas (seudoalergia)
5.4.
urticaria física
5.4.1.
dermatografía (urticaria provocada)
5.4.2.
urticaria colinérgica y adrenérgica
5.4.3.
urticaria inducida por frío
5.4.4.
urticaria inducida por la luz
5.4.5.
urticaria inducida por presión
5.4.6.
otras formas raras de urticaria física
5.5.
vasculitis urticarial
5.6.
mastocitosis y urticaria pigmentosa
5.7.
urticaria concomitante con enfermedades infecciosas
5.8.
urticaria concomitante con inmunotiroiditis
5.9.
urticaria y amiloidosis
6. angiodema
6.1.
edema angioneurótico hereditario (HANE)
6.2.
edema angioneurótico adquirido
7. dermatitis atópica, eccema atópico
8. alergias relacionadas con fármacos
TABLA 1 Propiedades y características de Candida albicans DSM n.º 9656
1
El presente invento trata además sobre la cepa de Candida albicans DSM n.º 9656, que se obtuvo mediante selección directa basada en la estabilización de las características morfológicas del cultivo y en la atenuación de la cepa epidémica No. 008, que se había aislado procedente de un hombre en 1990.
Las propiedades biológicas de la cepa DSM n.º 9656 de Candida albicans se encuentran descritas en la Tabla 1.
La cepa DSM n.º 9656 de Candida albicans difiere también de la cepa epidémica en su estabilidad de población, en sus características morfológicas cuando se somete a pases a través de medios nutritivos durante períodos de tiempo prolongados, y en su menor virulencia. Siguiendo las enseñanzas para la elaboración de las preparaciones antigénicas del presente invento, a partir de esta cepa pueden elaborarse preparaciones antigénicas sumamente efectivas e inocuas, según el presente invento.
El experto en la técnica apreciará enseguida que el presente invento está perfectamente adaptado para llevar a cabo los objetivos y alcanzar los fines y ventajas mencionados así como los inherentes al mismo. Los compuestos, procedimientos y técnicas aquí descritas en el momento presente son representativos de las realizaciones preferidas, tienen como finalidad servir de ejemplos, y no de limitaciones en el alcance.
Habiendo ya descrito el presente invento de manera general, el mismo se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos que se aportan a modo de ilustración, y que no tiene la intención de limitar el presente invento.
Ejemplos
En todos los ejemplos la centrifugación se realizó con fuerzas entre de 3.000 g a 3.500 g durante aproximadamente 30-50 min. Los medios se adquirieron procedentes de Oxoid (Unipath GmbH, Am Lippeglacis 6-8, 46483 Wesel, Alemania) o Serva (Serva Feinbiochemica GmbH & Co. KG, Carl-Benz-Str. 7, 69115 Heidelberg, Alemania). A menos que se indique lo contrario, los hongos se cultivaron según se describe en el catálogo de Oxoid "5. aktualisierte deutsche Ausgabe" o en el documento EP 0564 620. Las cepas de hongos utilizadas para la elaboración de las preparaciones antigénicas del presente invento se obtuvieron mediante selección y atenuación de las cepas de hongos según se describe en N.V. Mazkevitch, 1981, "Spontannaja ismentchivost i kariologia nesovershennich gibov", publicado por Isdatelstwo Nauka, Moscú; e Ivanova, L.G., 1992, "Sistematika, morphologitcheskaja charakteristika, biologitcheskii svojstva vosbuditelej dermatophitosov, obshih dlja givotnih i tcheloveka", Moscú, Biblioteca de la Universidad de Moscú. Las técnicas de cultivo básicas para los cultivos de células de mamíferos pueden encontrarse con facilidad en Doyle, Griffiths, y Newell (Redactores), Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons (1995). En los ensayos con queratinocitos se utilizaron células HaCaT (Boukamp y col., (1988), J. Cell Biol., 106, págs. 761-771 y Ryle y col., (1989), Differentiation, 40, págs. 42-54), y también pueden utilizarse queratinocitos aislados u otras líneas celulares de queratinocitos. Los linfocitos de caballo se aislaron y cultivaron según se describe en Friemel, H., "Immunologische Arbeitsmethoden", publicado por VEB Gustav Fischer Verlag, Jena, 1984; o Paul, E., "Fundamental Immunology", publicado por Raven Press, Nueva York, 1984. Los radioensayos se realizaron esencialmente como se describe en Boehncke y col., 1994, Scand. J. Immunol. 39, págs. 327-332 y en las referencias citadas en el mismo. NaOH, KOH, HCl y ácido acético se prepararon en forma de disoluciones acuosas. A menos que se indique lo contrario, el término soluble se refiere a la solubilidad en disoluciones acuosas. Los vehículos fisiológicamente aceptables, utilizados en los experimentos que se describen a continuación, son en los ejemplos: Vehículo A: disolución acuosa que comprende NaCl al 0,85% (p/v); vehículo B: disolución acuosa que comprende glucosa al 5% (p/v), extracto de carne "lab-lemco" (Oxoid) al 0,3% (p/v), y extracto de levadura (Oxoid) al 0,1% (p/v); Vehículo C: Medio RPMI 1640 (Serva).
Ejemplo 1
El material antigénico soluble que comprende polisacáridos y/o glicopéptidos (ASMP) se preparó a partir de:
Trichophyton mentagrophytes (ASMP-TM), Microsporum gypseum (ASMP-MG) o Candida albicans (ASMP-CA, conforme a los siguientes procedimientos:
Los hongos se cultivaron en placas de Agar según se describe en el documento EP 0564620. La biomasa fúngica se despegó de la placa y se utilizó en la producción de:
I. ASMP-TM
(i) La biomasa de Trichophyton mentagrophytes se trató con NaOH al 4,5% (p/v), a aproximadamente 140ºC, durante 1 hora, seguido de centrifugación durante 45 minutos. Al sobrenadante se añadió una disolución 4 M de ácido acético hasta que se alcanzó un pH final de 3,5. Después de 2 horas, el sedimento se separó por centrifugación y 3 volúmenes de etanol se añadieron a 1 volumen de sobrenadante. El sedimento resultante de la precipitación alcohólica se sedimentó por centrifugación y se disolvió en agua destilada. Por último, las preparaciones individuales de ASMP se liofilizaron.
(ii) La biomasa de Trichophyton mentagrophytes se trató con KOH al 0,2% (p/v), a aproximadamente 140ºC, durante 1 hora, seguido de centrifugación. Al sobrenadante se trató con una disolución 1 M de HCl hasta alcanzar un pH final de 3,5, durante 4 horas, a 4-10ºC. El sedimento se separó luego por centrifugación y 2 volúmenes de etanol se añadieron a 1 volumen de sobrenadante. El sedimento resultante de la precipitación alcohólica se sedimentó por centrifugación y se disolvió en agua destilada. Por último, las preparaciones individuales de ASMP se liofilizaron.
II. ASMP-MG
(i) La biomasa de Microsporum gypseum se trató con NaOH al 0,2% (p/v), a aproximadamente 140ºC, durante 2 horas, seguido de centrifugación. El sedimento se trató de nuevo con NaOH al 0,2% (p/v), a aproximadamente 140ºC, durante 2 horas, seguido de centrifugación, y el procedimiento se repitió por tercera vez. El último sobrenadante se trató luego con una disolución 8 M de ácido acético a un pH final de 3,5 , durante 3 horas, a 18-20ºC. El sedimento se separó luego por centrifugación, y 3 volúmenes de etanol se añadieron a 1 volumen de sobrenadante. El sedimento resultante de la precipitación alcohólica se sedimentó por centrifugación y se disolvió en agua destilada. Por último, las preparaciones individuales de ASMP se liofilizaron.
(ii) La biomasa de Microsporum gypseum se trató también con KOH al 3% (p/v), a aproximadamente 75ºC, durante 6 horas, seguido de centrifugación. El sedimento se trató de nuevo con NaOH al 3% (p/v), a aproximadamente 75ºC, durante 6 horas, seguido de centrifugación. El último sobrenadante se trató después con una disolución 0,5 M de HCl a un pH final de 3,5, durante 4 horas, a 4-10ºC. El sedimento se separó luego por centrifugación, y 3 volúmenes de metanol se añadieron a 1 volumen de sobrenadante. El sedimento resultante de la precipitación alcohólica se sedimentó por centrifugación y se disolvió en agua destilada. Por último, las preparaciones individuales de ASMP se liofilizaron.
III. ASMP-CA
(i) La biomasa de Candida albicans se trató con NaOH al 3,0% (p/v), a aproximadamente 75ºC, durante 6 horas, seguido de centrifugación. El sedimento se trató de nuevo con NaOH al 3,0% (p/v), a aproximadamente 75ºC, durante 6 horas, seguido de centrifugación. El último sobrenadante se trató después con una disolución 12 M de ácido acético a un pH final de 3,5, durante 2 horas, a 4-10ºC. El sedimento se separó luego por centrifugación, y 2 volúmenes de metanol se añadieron a 1 volumen de sobrenadante. El sedimento resultante de la precipitación alcohólica se sedimentó por centrifugación y se disolvió en agua destilada. Por último, las preparaciones individuales de ASMP se liofilizaron.
(ii) La biomasa de Candida albicans se trató con NaOH al 4,5% (p/v), a aproximadamente 35ºC, durante 3 horas, seguido de centrifugación. El sedimento se trató de nuevo con NaOH al 4,5% (p/v), a aproximadamente 35ºC, durante 3 horas, seguido de centrifugación, y el procedimiento se repitió por tercera vez. El último sobrenadante se trató luego con una disolución 0,25 M de HCl a un pH final de 3,5, durante 4 horas, a 18-20ºC. El sedimento se separó luego por centrifugación, y 2 volúmenes de etanol se añadieron a 1 volumen de sobrenadante. El sedimento resultante de la precipitación alcohólica se sedimentó por centrifugación y se disolvió en agua destilada. Por último, las preparaciones individuales de ASMP se liofilizaron.
Ejemplo 2
El material antigénico no soluble que comprende polisacáridos y/o glicopéptidos (ANMP) se preparó a partir de:
Trichophyton mentagrophytes (ANMP-TM), Microsporum gypseum (ANMP-MG) o Candida albicans (ANMP-CA, conforme a los siguientes procedimientos:
Los hongos se cultivaron en placas de Agar según se describe en el documento EP 0564620. La biomasa fúngica se despegó de la placa y se utilizó en la producción de:
I. ANMP-TM
(i) La biomasa de Trichophyton mentagrophytes se trató con NaOH al 0,2% (p/v), a aproximadamente 35ºC, durante 2 h, seguido de centrifugación. El sedimento se trató con ácido acético 0,3 M, durante aproximadamente 3 horas, a aproximadamente 60ºC, y se lavó cinco veces con agua destilada. Cada etapa de lavado fue seguida de una centrifugación. El último sedimento se resuspendió en una disolución acuosa de NaCl al 0,85% (p/v) (Vehículo A) hasta alcanzar una concentración final de 0,5% (v/v) de ANMP-TM. La preparación de ANMP-TM se almacenó en forma de suspensión a 2- 10ºC.
(ii) La biomasa de Trichophyton mentagrophytes se trató con KOH al 0,2% (p/v), a aproximadamente 35ºC, durante 24 h, seguido de centrifugación. El sedimento se trató con HCl 0,1 M, durante aproximadamente 30 minutos, a 70ºC, y se lavó cinco veces con agua destilada. Cada etapa de lavado fue seguida de una centrifugación. El último sedimento se resuspendió en RPMI 1640 (Vehículo C) hasta alcanzar una concentración final de 1,5% (v/v) de ANMP-TM. La preparación de ANMP-TM se almacenó en forma de suspensión a 2-10ºC.
II. ANMP-MG
(i) La biomasa de Microsporum gypseum se trató con NaOH al 3% (p/v), a aproximadamente 75ºC, durante 6 horas, seguido de centrifugación. El sedimento se trató de nuevo con NaOH al 3% (p/v), a aproximadamente 75ºC, durante 6 horas, seguido de centrifugación. El sedimento resultante se trató con ácido acético 0,7 M, durante aproximadamente 4 horas, a 60ºC, y se lavó cinco veces con agua destilada. Cada etapa de lavado fue seguida de centrifugación. El sedimento final se resuspendió en una disolución acuosa que contenía glucosa al 5% (p/v), extracto de levadura al 0,1% (p/v), procedente de Oxoid, y extracto de carne "lab-lemco" al 0,3% (p/v), procedente de Oxoid, (Vehículo B), hasta alcanzar una concentración final de 2,5% (v/v) de ANMP-MG. La preparación de ANMP-MG se almacenó en forma de suspensión a 2-10ºC.
(ii) La biomasa de Microsporum gypseum se trató con KOH al 3% (p/v), a aproximadamente 35ºC, durante 3 h, seguido de centrifugación. El sedimento se trató de nuevo con KOH al 3% (p/v), a aproximadamente 35ºC, durante 3 horas, seguido de centrifugación, y el procedimiento se repitió por tercera vez. El sedimento resultante se trató con HCl 0,5 M, durante 30 minutos, a 80ºC, y se lavó cinco veces con agua destilada. Cada etapa de lavado fue seguida de centrifugación. El último sedimento se resuspendió en RPMI 1640 (Vehículo C) hasta alcanzar una concentración final de 2,0% (v/v) de ANMP-MG. La preparación de ANMP-MG se almacenó en forma de suspensión a 2-10ºC.
III. ANMP-CA
(i) La biomasa de Candida albicans se trató con NaOH al 4,5% (p/v), a aproximadamente 140ºC, durante 2 horas, seguido de centrifugación. El sedimento se trató de nuevo con NaOH al 4,5% (p/v), a aproximadamente 140ºC, durante 2 horas, seguido de centrifugación, y el procedimiento se repitió una tercera vez. El sedimento resultante se trató con ácido acético 1 M, durante 1 hora, a 60ºC, y se lavó cinco veces con agua destilada. Cada etapa de lavado fue seguida de centrifugación. El último sedimento se resuspendió en una disolución acuosa que contenía NaCl al 0,85% (p/v) (Vehículo A) hasta alcanzar una concentración final de 1,5% (v/v) de ANMP- CA. La preparación de ANMP-CA se almacenó en forma de suspensión a 2-10ºC.
(ii) La biomasa de Candida albicans se trató con KOH al 4,5% (p/v), a aproximadamente 140ºC, durante 2 horas, seguido de centrifugación. El sedimento se trató de nuevo con NaOH al 4,5% (p/v), a aproximadamente 140ºC, durante 2 horas, y el sedimento resultante se trató con HCl 0,1 M, durante 30 minutos, a 100ºC, y se lavó cinco veces con agua destilada. Cada etapa de lavado fue seguida de centrifugación. El último sedimento se resuspendió en RPMI 1640 (Vehículo C) hasta alcanzar una concentración final de 2,5% (v/v) de ANMP-CA. La preparación de ANMP-CA se almacenó en forma de suspensión a 2-10ºC.
Ejemplo 3
El material antigénico exógeno que comprende polisacáridos y/o glicopéptidos (AEMP) se preparó a partir de cultivos líquidos de: Trichophyton mentagrophytes (AEMP-TM), Microsporum gypseum (AEMP-MG) o Candida albicans (AEMP-CA). Los cultivos líquidos se cultivaron en condiciones esencialmente como las descritas en el documento EP 0564620. Las preparaciones individuales de las AEMP se obtuvieron conforme a los siguientes procedimientos.
I. AEMP-TM
Trichophyton mentagrophytes se incubó durante 240 h a 26ºC en 1.000 ml de agua destilada. A continuación, el cultivo, que contenía aproximadamente 1,2 x 10^{8} células por ml, se centrifugó. El sobrenadante se liofilizó y se disolvió en 100 ml de agua destilada, se añadieron 3 volúmenes de metanol y el precipitado se disolvió en disolución acuosa. El sobrenadante se liofilizó obteniéndose AEMP-TM.
II. AEMP-MG
Microsporum gypseum se cultivó durante 50 h a 28ºC en 200 ml de Vehículo C (medio RPMI 1640, procedente de Serva). El cultivo, que contenía aproximadamente 3 x 10^{7} células por ml, se centrifugó. El sobrenadante se liofilizó y se disolvió en 20 ml de agua destilada, se añadieron 2 volúmenes de metanol y el precipitado se disolvió en disolución acuosa. El sobrenadante se liofilizó obteniéndose AEMP-MG.
III. AEMP-CA
Candida albicans se cultivó durante 30 h en 800 ml de Vehículo B (extracto de carne "lab-lemco" al 1% (p/v) procedente de Oxoid, extracto de levadura al 0,1% (p/v) procedente de Oxoid, y dextrosa al 5% (p/v)), a 37ºC. El cultivo, que contenía aproximadamente 10^{8} células por ml, se centrifugó. El sobrenadante se liofilizó y se disolvió en una pequeña cantidad de agua destilada, se añadieron 2 volúmenes de metanol y el precipitado se disolvió en disolución acuosa. El sobrenadante se liofilizó obteniéndose AEMP-CA.
Ejemplo 4
Se determinó la influencia de las diferentes preparaciones antigénicas sobre el crecimiento de cultivos celulares de queratinocitos (cultivos de células HaCaT).
I. Las fracciones antigénicas ASMP-TM, ANMP-TM y AEMP-TM preparadas a partir de Trichophyton mentagrophytes DSM n.º 7279, ASMP-MG, ANMP-MG y AEMP-MG preparadas a partir de Microsporum gypseum DSM n.º 7274, y ASMP-CA, ANMP-CA y AEMP-CA preparadas a partir de Candida albicans DSM n.º9656, se utilizaron en concentraciones diferentes. Las fracciones de ANMP, preparadas conforme al Ejemplo 2, se encontraban liofilizadas y se resuspendieron en PBS (del inglés, " Phosphate Buffered Saline") (disolución salina tamponada con fosfato, con una concentración de fosfato de 6,7 mM, a un pH fisiológico de aproximadamente 7,2; adquirido procedente de Serva, n.º de catálogo 17-516).
Para el cultivo, se utilizaron placas para cultivo de tejidos de 12 pocillos (de fondo plano, 9,6 cm^{2} de área superficial). En cada uno de los pocillos se añadieron 0,15 ml de una suspensión celular de queratinocitos (células HaCaT), de aproximadamente 1 millón de células por ml de medio nutritivo (RPMI 1640 complementado con suero de ternera fetal al 10% (p/v)), 2 ml de medio nutritivo, y 0,02-0,1 ml de la fracción antigénica disuelta en PBS. En los pocillos de control no se añadió material de las fracciones antigénicas. El cultivo se realizó en incubadora, con CO_{2} al 5% (v/v), a una temperatura de 37ºC, durante aproximadamente 48 horas, hasta que una monocapa de células confluentes se hubo formado en los pocillos de control.
La inhibición del crecimiento celular se determinó comparando el tamaño del área de las extensiones de células tratadas con las fracciones antigénicas, con el de los controles no tratados con fracciones antigénicas (control = 100%). Los resultados se muestran en las Tablas 2 y 3.
La inhibición del crecimiento celular se observó a una concentración de ASMP-MG de 0,1 mg/ml, a una concentración de ASMP-TM de 0,3 mg/ml, y a una concentración de ASMP-CA de 1 mg/ml. En el caso de los ANMP (MG, TM y CA) la inhibición se observó a una concentración de 1 mg/ml. En el caso del AEMP-MG, la inhibición del crecimiento celular se observó a una concentración de 0,3 mg/ml, y en el caso de AEMP-TM y AEMP-CA se observó a una concentración de 1 mg/ml.
Ejemplo 5
Se determinó la influencia de las diferentes fracciones antigénicas sobre la proliferación celular de linfocitos de caballo.
Se utilizaron las fracciones antigénicas ASMP y AEMP de las cepas fúngicas de T. mentagrophytes DSM n.º 7279, M. gypseum DSM n.º 7274, y Candida albicans DSM n.º 9656. Se preparó una suspensión de aproximadamente 40.000 linfocitos (procedentes de caballos islandeses) por ml de medio nutritivo. El medio nutritivo RPMI 1640 se complementó con suero de ternera fetal al 10% (p/v). El cultivo de los linfocitos se realizó en placas para cultivo de tejidos de 96 pocillos, con fondo en U (Falcon n.º 3077). En cada pocillo se distribuyeron 200 \mul de suspensión celular y se añadieron 20 \mul de fracción antigénica disuelta en PBS. Se prepararon controles sin adición de material de la fracción antigénica.
Las placas de cultivo de tejidos se incubaron a 37ºC con CO_{2} al 5% (v/v) durante 72 horas. A continuación el medio nutritivo se cambió y se añadió una disolución que contenía ^{3}H-Timidina (1 \mul por pocillo). Se llevó a cabo una segunda etapa de cultivo durante 12 horas, y el cultivo se lavó con PBS. La proliferación celular se determinó mediante técnicas de radioensayo, según se describe en Boehncke y col., 1994, Scand. J. Immunol. 39, págs. 327-332. La medida de la proliferación celular se realizó comparando los cultivos de ensayo con los controles no expuestos al material de la fracción antigénica. Los valores de los controles se definieron como el 100%. Los resultados se muestran en la Tabla 4. Las fracciones antigénicas individuales tuvieron un efecto inhibidor o estimulador sobre la proliferación de linfocitos.
Ejemplo 6
Este ejemplo ilustra las preparaciones de los complejos típicos. Los complejos (del 1 al 5) descritos en este ejemplo, se han preparado a partir de Trichophyton mentagrophytes DSM n.º 7279, Microsporum gypseum DSM n.º 7274 o Candida albicans n.º 9656.
I. El Complejo 1 comprende ASMP-TM, ASMP-MG y ASMP-CA en un vehículo adecuado, en el ejemplo
Concentración [mg/ml]
Complejo 1 A B C
ASMP-TM7279 5 10 30
ASMP-MG7274 5 10 30
ASMP-CA9656 5 10 30
en el vehículo en el vehículo en el vehículo
A o B o C A o B o C A o B o C
El Complejo 1.1 comprende ASMP-MG y ASMP-CA en un vehículo adecuado, en el ejemplo
Concentración [mg/ml]
Complejo 1 A B C
ASMP-MG7274 5 10 30
ASMP-CA9656 5 10 30
en el vehículo en el vehículo en el vehículo
A o B o C A o B o C A o B o C
II. El Complejo 2 comprende ANMP-TM, ANMP-MG y ANMP-CA en un vehículo adecuado, en el ejemplo
Concentración [% (v/v)]
Complejo 2 A B C D
ANMP-TM7279 0,5 1,0 1,5 2,5
ANMP-MG7274 0,5 1,0 1,5 2,5
ANMP-CA9656 0,5 1,0 1,5 2,5
suspensión suspensión suspensión suspensión
en el en el en el en el
vehículo vehículo vehículo vehículo
A o B o C A o B o C A o B o C A o B o C
III. El complejo 3 comprende AEMP-TM, AEMP-MG y AEMP-CA en un vehículo adecuado, en el ejemplo
Concentración [mg/ml]
Complejo 3 A B C
AEMP-TM7279 5 10 30
AEMP-MG7274 5 10 30
AEMP-CA9656 5 10 30
en el vehículo en el vehículo en el vehículo
A o B o C A o B o C A o B o C
IV. El complejo 4 comprende ANMP y AEMP en un vehículo adecuado, en el ejemplo
(i) Complejo
4.1 ANMP-CA9656 al 2,5% (v/v)
AEMP-TM7279 7,1 mg/ml
en el vehículo A o B o C
(ii)
Concentración
Complejo 4.2 A B
ANMP-MG7274 2,5% (v/v) 3,0% (v/v)
ANMP-TM7279 2,5% (v/v) 3,0% (v/v)
AEMP-TM7279 10,5 mg/ml 18,5 mg/ml
en el vehículo en el vehículo
A o B o C A o B o C
V. El Complejo 5 comprende ASMP y ANMP en un vehículo adecuado, en el ejemplo
Concentraclón
Complejo 5 A B
ANMP-MG7274 1,75% (v/v) 3,0% (v/v)
ANMP-TM7279 1,75% (v/v) 3,0% (v/v)
ASMP-CA9656 15,6 mg/ml 15,6 mg/ml
en el vehículo en el vehículo
A o B o C A o B o C
Ejemplo 7
La inocuidad de las diferentes preparaciones antigénicas se ensayó en experimentos de vacunación en sistemas de modelos animales (ratones blancos, cobayas y caballos).
Las fracciones antigénicas se prepararon según se describe en los Ejemplos de 1 a 3 y 6, a partir de Trichophyton mentagrophytes DSM n.º 7279, Microsporum gypseum DSM n.º 7274 o Candida albicans DSM n.º 9656.
Las siguientes observaciones clínicas concernientes al estado de los animales vacunados se hicieron diariamente hasta cinco días después de cada vacunación:
1. Estado general
- apetito
- influencia sobre la locomoción
2. Reacción local
- edema e inflamación en el sitio de la inyección
- cambios de temperatura en el sitio de la inyección
- aparición de dolor en el sitio de la inyección
- necesidad de tratar el sitio de la inyección con medicamentos
I. Las preparaciones antigénicas se inyectaron una o dos veces con un intervalo de 10 días, por vía intrabdominal en ratones blancos y por vía intrabdominal y subcutánea en cobayas. Las preparaciones antigénicas, sus concentraciones y los resultados se muestran en las Tablas 5 y 6 (A y B). La inyección subcutánea o intrabdominal de los antígenos fúngicos en forma de preparaciones individuales o de complejos, en su mayoría no presentaron efectos adversos sobre el estado general de los animales y no se observó reacción local en el sitio de la inyección.
II. Las preparaciones de complejos de los antígenos fúngicos según se describen en el Ejemplo 6 (Complejos 4.1, 4.2 y 5) se inyectaron cada una de ellas una sola vez por vía intramuscular en el mismo caballo y en diferentes sitios (en los lados izquierdo y derecho del cuello y en uno de los músculos pectorales. Se vacunaron tres caballos diferentes: (i) una yegua preñada, (ii) un potro, edad: 7-8 meses, y (iii) un garañón, edad: 6 años. Las preparaciones antigénicas, sus concentraciones y los resultados se muestran en la Tabla 7.
La inyección intramuscular de los antígenos fúngicos en forma de preparación de un complejo no tuvo influencia alguna sobre el estado general de los caballos y no se observó reacción local en el sitio de la inyección. Estos estudios demuestran la excelente inocuidad de las preparaciones antigénicas del presente invento.
Ejemplo 8
La influencia de las diferentes preparaciones antigénicas sobre el estado de la piel y el pelaje se estudió en ratones blancos.
Las preparaciones antigénicas se prepararon según se describe en los Ejemplos de 1 a 3 y 6, a partir de Trichophyton mentagrophytes DSM n.º 7279, Microsporum gypseum DSM n.º 7274 o Candida albicans DSM n.º 9656.
Las preparaciones antigénicas se inyectaron dos veces con un intervalo de 10 días, por vía intrabdominal en ratones blancos. La observación del estado de la piel y el pelaje continuó durante cinco días. Las preparaciones antigénicas, sus concentraciones y los resultados se muestran en la Tabla 8. Las inyecciones de las preparaciones antigénicas mejoraron el estado de la piel y el pelaje de ratones blancos, en comparación con los de un animal de control afectado de dermatitis.
Ejemplo 9
La eficacia de tres preparaciones antigénicas diferentes se estudió mediante la vacunación de caballos islandeses afectados por Eccema de Verano, en un ensayo clínico controlado por placebo.
Las preparaciones antigénicas se prepararon según se describe en los Ejemplos de 1 a 3 y 6, a partir de T. mentagrophytes DSM n.º 7279, M. gypseum DSM n.º 7274 y C. albicans DSM n.º 9656. Un volumen de 1 ml de Vehículo A que contenía las preparaciones antigénicas individuales se inyectó tres veces por vía intramuscular. El intervalo entre cada una de las inyecciones fue de cinco días. Las inyecciones se administraron de manera alternada en el lado derecho e izquierdo del músculo pectoral. Las preparaciones antigénicas, sus concentraciones y los resultados se muestran en las Tablas 9 y 10.
La administración de una preparación antigénica que comprende ASMP-MG7274, ASMP-TM7279 y ASMP-CA9656 dio como resultado la completa curación de todos los caballos vacunados (3) cuatro semanas después de la tercera inyección. Los caballos del grupo de control (inyección del vehículo A sin antígenos) no mostraron signos de recuperación.
Ejemplo 10
La inocuidad de tres preparaciones antigénicas diferentes se estudió mediante la vacunación de caballos islandeses afectados por Eccema de Verano, en un ensayo clínico controlado por placebo.
Las preparaciones antigénicas se prepararon según se describe en los Ejemplos de 1 a 3 y 6, a partir de T. mentagrophytes DSM n.º 7279, M. gypseum DSM n.º 7274 y C. albicans DSM n.º 9656. Un volumen de 1 ml de Vehículo A que contenía las preparaciones antigénicas individuales se inyectó tres veces por vía intramuscular. El intervalo entre cada una de las inyecciones fue de cinco días. Las inyecciones se administraron de manera alternada en los lados derecho e izquierdo de los músculos pectorales. Los animales se mantuvieron en observación en cuanto a la aparición de efectos secundarios durante un espacio de tiempo de tres días después de cada una de las inyecciones. Las preparaciones antigénicas, sus concentraciones y los resultados se muestran en la Tabla 11. No se observaron efectos secundarios generales tales como fiebre o pérdida de apetito. Solamente una de las preparaciones antigénicas indujo hinchazón en el lado de la inyección. Este efecto secundario menor se observó en sólo uno de los caballos. No se observaron signos de dolor.
Ejemplo 11
La eficacia antialérgica de las fracciones individuales ASMP-TM7279, ASMP-MG7274 y ASMP-CA9656, así como la del complejo 1 que comprende ASMP-TM7279, ASMP-MG7274 y ASMP-CA9656, se ha estudiado en un modelo de animales de laboratorio.
Las fracciones individuales se han preparado conforme al ejemplo 1. El complejo 1 se preparó conforme a los ejemplos 1 y 6.
Los ratones CF-1 han sido sensibilizados siguiendo el modelo y las instrucciones del Mouse Ear Swelling Test (Gad SC, Dimm BK, Dobbs DW, Reilly C, Walsh RD: Development and Validation of an Alternative Dermal Sensitization Test: The Mouse Ear Swelling Test (MEST). Toxicology and Applied Pharmacology 84, 93-114, 1986. Este es un ensayo muy conocido, validado y aceptado por OECD para el estudio de sustancias alérgicas. Para demostrar la eficacia del complejo o de sus fracciones individuales debida a su potencia antialérgica en un animal de laboratorio, la hinchazón en la oreja causada por el alérgeno que debe ser evitada. Se llevó a cabo un estudio ciego controlado por placebo en ratones y con dos alérgenos diferentes:
El ensayo MEST se realizó con ratones CF-1, que son muy sensibles a los alérgenos. Ratones CF-1 de 6-10 semanas de edad, se prepararon afeitando la piel abdominal, inyectando 0,05 ml de Adyuvante de Freund y aplicando 100 \mul del alérgeno 1-cloro-2,4-dinitroclorobenceno (DNCB) en uno de los ensayos clínicos, y aplicando alérgeno de ácaros en otro ensayo clínico, por vía tópica en la piel abdominal afeitada, desde el día 0 al día 4. Siete días más tarde, 20 \mul del alérgeno se aplicaron por vía tópica en la oreja utilizada en el ensayo, y la disolución que se disipa se aplicó en la oreja utilizada como control. El grosor de la hinchazón de la oreja se midió 24 y 48 h después. El mismo procedimiento se llevó a cabo con el grupo de control, tratado con placebo en lugar de con el complejo y con las fracciones respectivas del complejo.
La administración de las fracciones individuales ASMP-TM7279, ASMP-MG7274 y ASMP-CA9656, así como la del complejo 1 que comprende ASMP-TM7279, ASMP-MG7274 y ASMP-CA9656, produjo una reducción del 90% en la hinchazón de la oreja después de la sensibilización con el alérgeno de ácaros, y una reducción del 87,5% de la hinchazón de la oreja después de la sensibilización con DNCB, 48 horas después de la reexposición al alérgeno para la provocación inmunológica, en comparación con los grupos de control.
Ejemplo 12
La eficacia antialérgica de la preparación de un complejo que comprende las preparaciones antigénicas ASMP-MG7274 y ASMP-CA9656, preparado según se describe en el Ejemplo 1, se demostró por medio de la vacunación de un caballo islandés afectado de Eccema de Verano.
Las inyecciones intradérmicas de un volumen de 0,4 ml de Vehículo A que contiene 0,2 mg de MG y 0,2 mg de CA, por tres veces, con un intervalo de cinco días entre cada una de las inyecciones, produjo la curación del caballo vacunado tres semanas después de la última inyección, según se evidencia por el descenso significativo de los síntomas clínicos. No se observaron efectos secundarios.
Ejemplo 13
La eficacia de una preparación antigénica preparada según se describe en el Ejemplo 1 (ASMP) a partir de Microsporum gypseum DSM n.º 7274, se demostró por medio de la vacunación de un hombre de 41 años que padecía de un eccema con inflamación, prurito y erosiones en la piel entre los dedos cuarto y quinto del pie.
Un volumen de 0,1 ml del Vehículo A que contenían 0,4 mg de ASMP-MG7274 se inyectó por vía intradérmica, solamente una vez. La piel volvió a la normalidad 4-5 días después del tratamiento.
El prurito ya había desaparecido 24 horas después de la inyección. No se observaron efectos secundarios importantes.
Ejemplo 14
La eficacia de una preparación antigénica elaborada según se describe en el Ejemplo 1 (ASMP) a partir de Candida albicans DSM n.º 9656, se demostró en el tratamiento de la neurodermatitis.
ASMP-CA9656 se mezcló con una crema, usando "Kamill Hand und Nagelcreme" adquirida procedente de Procter & Gamble, para obtener una concentración final de 60 mg ASMP-CA9656/ml de crema. La preparación se aplicó por vía tópica a una niña de 3 años que padecía de neurodermatitis con costras amarillas en la piel cercana a ambas orejas. La crema se aplicó por vía tópica en la parte afectada de la piel una vez al día, durante 30 días. Después de este tratamiento, la piel volvió a la normalidad. No se observaron efectos secundarios.
Ejemplo 15
La eficacia de una preparación antigénica elaborada según se describe en el Ejemplo 1 (ASMP) a partir de Microsporum gypseum DSM n.º 7274, se demostró en el tratamiento de eccema.
ASMP-MG7274 se mezcló con una crema, usando "Kamill Hand und Nagelcreme" adquirida procedente de Procter & Gamble, para obtener una concentración final de 60 mg ASMP-MG7274/ml de crema. Un hombre de 30 años que padecía de un eccema con inflamación, erosiones y prurito en el dedo anular se trató mediante aplicación tópica en las partes afectadas de la piel, una vez al día durante 30 días. Esto dio como resultado la curación completa después del tratamiento. El prurito había desaparecido a los pocos días de iniciarse el tratamiento. No se observaron efectos secundarios.
Ejemplo 16
La eficacia de las preparaciones antigénicas, elaboradas según se describe en el Ejemplo 1 (ASMP) a partir de Microsporum gypseum DSM n.º 7274, Trichophyton mentagrophytes DSM n.º 7279, y Candida albicans DSM n.º 9656, se ensayaron por medio de la vacunación de un caballo de 5 años de edad que no había cambiado el pelaje de invierno hasta junio. Un volumen de 1 ml del Vehículo A que contenían 15 mg de cada una de las preparaciones antigénicas ASMP-MG7274, ASMP-TM7279 y ASMP-CA9656 (concentración final de 45 mg de ASMP/ml) se inyectó tres veces con un intervalo de cinco días, por vía intramuscular, lo que produjo el cambio completo al pelaje estacional normal en un plazo de 15 días. No se observaron efectos secundarios.
Ejemplo 17
La eficacia de preparaciones antigénicas de complejos, elaboradas según se describe en el Ejemplo 1 (ASMP) a partir de Microsporum gypseum DSM n.º 7274, Trichophyton mentagrophytes DSM n.º 7279, y Candida albicans DSM n.º 9656, se demuestra en el tratamiento de la alopecia.
Dos caballos de 7 años de edad, que padecían de alopecia, uno de ellos en 3-5 localizaciones diferentes y el otro en 7-10 localizaciones diferentes, todas ellas repartidas por el cuerpo, se trataron con una vacuna que contenía 10 mg de cada una de las preparaciones antigénicas ASMP-MG7274, ASMP-TM7279 y ASMP-CA9656 en 1 ml del Vehículo A (concentración final de 30 mg/ml). La vacuna se inyectó tres veces con un intervalo de cinco días, por vía intramuscular, lo que produjo la restitución completa del pelaje de ambos caballos 10 días después de la última aplicación. No se observaron efectos secundarios.
Ejemplo 18
La eficacia una preparación antigénica de un complejo, elaborada según se describe en el Ejemplo 1 (ASMP) a partir de Microsporum gypseum DSM n.º 7274, Trichophyton mentagrophytes DSM n.º 7279, y Candida albicans DSM n.º 9656, se demuestra en el tratamiento de la alopecia en caballos.
Un caballo de 10 años de edad, que padecía de alopecia en 10-12 localizaciones diferentes repartidas por el cuerpo, se trató con una vacuna que contenía 15 mg de cada una de las preparaciones antigénicas ASMP-MG7274, ASMP-TM7279 y ASMP-CA9656 en 1 ml del vehículo A (concentración final de 45 mg/ml). La vacuna se inyectó tres veces con un intervalo de cinco días, por vía intramuscular, lo que produjo la restitución completa del pelaje 15 días después de la última aplicación. No se observaron efectos secundarios.
Ejemplo 19
La eficacia una preparación antigénica de un complejo, elaborada según se describe en el Ejemplo 1 (ASMP) a partir de Microsporum gypseum DSM n.º 7274, Trichophyton mentagrophytes DSM n.º 7279, y Candida albicans DSM n.º 9656, se demuestra en el tratamiento de la alopecia en perros.
Un perro hembra de 3 años de edad, que padecía de alopecia en 2-3 localizaciones diferentes repartidas por el cuerpo, se trató con una vacuna que contenía 10 mg de cada una de las preparaciones antigénicas ASMP-MG7274, ASMP-TM7279 y ASMP-CA9656 en 1 ml del vehículo A (concentración final de 30 mg/ml). La vacuna se inyectó tres veces con un intervalo de cinco días, por vía intramuscular, lo que produjo la restitución completa del pelaje 15 días después de la última aplicación. No se observaron efectos secundarios.
Ejemplo 20
La eficacia una preparación antigénica de un complejo, elaborada según se describe en el Ejemplo 1 (ASMP) a partir de Microsporum gypseum DSM n.º 7274, Trichophyton mentagrophytes DSM n.º 7279, y Candida albicans DSM n.º 9656, se demuestra en el tratamiento de la alopecia en perros.
Dos perros macho, uno de 5 años y el otro de 8 años de edad, que padecían de alopecia en 2-4 localizaciones diferentes repartidas por el cuerpo, se trataron con una vacuna que contenía 15 mg de cada una de las preparaciones antigénicas ASMP-MG7274, ASMP-TM7279 y ASMP-CA9656 en 1 ml del vehículo A (concentración final de 45 mg/ml). La vacuna se inyectó tres veces con un intervalo de cinco días, por vía intramuscular, lo que produjo la restitución completa del pelaje 30 días después de la última aplicación. No se observaron efectos secundarios.
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Figuras de 1 a 4
Los experimentos de NMR de las fracciones ASMP y AEMP mostradas en las Figuras de 1 a 4 se realizaron conforme a lo siguiente:
Los espectros se han obtenido en D_{2}O, con un espectrofotómetro digital de NMR, 250 MHz, BRUKER (modelo DRX 400), con una frecuencia ^{1}H de 400,13 Mc. La anchura de barrido es 14,5 ppm y la temperatura ambiente es 300ºK. La referencia de los desplazamientos químicos se establece por medio de la distancia correspondiente al disolvente.
Los espectros unidimensionales estándar de ^{1}H se han obtenido utilizando el programa de pulsos apropiado de BRUKER.
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Claims (35)

1. Un procedimiento para preparar materiales antigénicos, solubles en disoluciones acuosas, que comprenden polisacáridos y/o glicopéptidos (ASMP), caracterizado porque células fúngicas, que pertenecen al grupo de hongos queratinófilos o levaduras, o sus materiales,
- se tratan en condiciones alcalinas acuosas,
- las fases sólida y líquida de la preparación se separan,
- después de la separación, el sobrenadante se trata con un ácido mineral u orgánico,
y
- después de la separación, el ASMP se precipita en el sobrenadante.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células fúngicas o sus materiales,
- se tratan con KOH o NaOH aproximadamente al 0,1-5% (p/v), a aproximadamente 20-150ºC, durante un máximo de 30 h,
- se centrifugan,
- después de la centrifugación el sobrenadante se trata con un ácido orgánico 0,2-1,5 M o con un ácido mineral 0,05-1 M,
- después de la centrifugación el sobrenadante se trata con un disolvente orgánico adecuado o con una sal adecuada, p. ej., con un alcohol tal como un alcanol inferior, o sulfato amónico, y
- el precipitado se recupera y si se desea se disuelve en una disolución acuosa.
3. Un procedimiento para preparar materiales antigénicos, no solubles en disoluciones acuosas, que comprenden polisacáridos y/o glicopéptidos (ANMP), caracterizado porque células fúngicas, que pertenecen al grupo de hongos queratinófilos o levaduras, o sus materiales,
- se tratan en condiciones alcalinas acuosas,
- las fases sólida y líquida de la preparación se separan, y
- después de la separación la fase sólida se trata con un ácido mineral u orgánico.
4. Un procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque dichas células fúngicas o sus materiales,
- se tratan con KOH o NaOH aproximadamente al 0,1-5% (p/v), a aproximadamente 20-150ºC, durante un máximo de 30 h,
- la fase sólida se trata con un ácido orgánico 0,2-1,5 M o con un ácido mineral 0,05-1 M, y
- se lava con una disolución acuosa.
5. Un procedimiento para preparar materiales antigénicos exógenos, que comprenden polisacáridos y/o glicopéptidos (AEMP), caracterizado porque células fúngicas, que pertenecen al grupo de hongos queratinófilos o levaduras, o sus materiales,
- se cultivan en un medio líquido,
- las fases sólida y líquida de la preparación se separan, y
- después de la separación, el AEMP se precipita en el sobrenadante.
6. Un procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque:
- el cultivo dura un máximo de 250 h,
- después de la separación, se añade un alcohol al sobrenadante, y
- el precipitado se recupera y si se desea se disuelve en una disolución acuosa.
7. Un procedimiento según la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque,
- después de la separación el sobrenadante se liofiliza,
- se disuelve en una disolución acuosa,
- después de la precipitación con aproximadamente 1-5 volúmenes de un alcohol, el precipitado se disuelve en una disolución acuosa,
- la disolución se liofiliza.
8. Un procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 7, caracterizado porque dicho hongo queratinófilo pertenece al menos a uno de los siguientes géneros de hongos Trichophyton y/o Microsporum, y/o dicha levadura pertenece al género Candida.
9. Un procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 7, caracterizado porque dicho hongo pertenece a una cualquiera de las siguientes especies de hongos:
- Trichophyton equinum,
- Trichophyton mentagrophytes,
- Trichophyton sarkisovii,
- Trichophyton verrucosum,
- Microsporum canis,
- Microsporum gypseum, o
- Candida albicans.
10. Un procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 7, caracterizado porque dicho hongo pertenece a una cualquiera de las siguientes cepas de hongos:
- Trichophyton equinum DSM n.º 7276,
- Trichophyton mentagrophytes DSM n.º 7279,
- Trichophyton sarkisovii DSM n.º 7278,
- Trichophyton verrucosum DSM n.º 7277,
- Microsporum canis DSM n.º 7281,
- Microsporum canis var. obesum DSM n.º 7280,
- Microsporum canis var. distortum DSM n.º 7275,
- Microsporum gypseum DSM n.º 7274, o
- Candida albicans DSM n.º 9656.
11. Un material que comprende polisacáridos y/o glicopéptidos, que presenta actividad antialérgica en mamíferos, derivando dicho material, o siendo dicho material derivable, a partir de hongos queratinófilos o levaduras, o a partir de sus materiales, mediante técnicas de aislamiento adecuadas según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10.
12. Un material (ASMP) que puede prepararse según se define en la reivindicación 1 ó 2, o en una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 10.
13. Un material (ANMP) que puede prepararse según se define en la reivindicación 3 ó 4, o en una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 10.
14. Un material (AEMP) que puede prepararse según se define en una cualquiera de las reivindicaciones de 5 a 7, o en una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 10.
15. Un material según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, caracterizado porque contiene ASMP procedente de la cepa T. mentagrophytes DSM n.º 7279, ASMP procedente de la cepa M. gypseum DSM n.º 7274, y ASMP procedente de la cepa C. albicans DSM n.º 9656.
16. Un material según la reivindicación 11 o la reivindicación 13, caracterizado porque contiene ANMP procedente de la cepa T. mentagrophytes DSM n.º 7279, ANMP procedente de la cepa M. gypseum DSM n.º 7274, y ANMP procedente de la cepa C. albicans DSM n.º 9656.
17. Un material según la reivindicación 11 o la reivindicación 14, caracterizado porque contiene AEMP procedente de la cepa T. mentagrophytes DSM n.º 7279, AEMP procedente de la cepa M. gypseum DSM n.º 7274, y AEMP procedente de la cepa C. albicans DSM n.º 9656.
18. Un material que comprende cualquier combinación de los materiales definidos en una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 17.
19. Un material según la reivindicación 18, caracterizado porque contiene ASMP y AEMP.
20. Un material según la reivindicación 18, caracterizado porque contiene ASMP y AEMP y ANMP.
21. Un material según la reivindicación 18, caracterizado porque contiene AEMP y ANMP.
22. Un material según la reivindicación 18, caracterizado porque contiene ASMP y ANMP.
23. Una vacuna que comprende un material según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 22.
24. Una vacuna que comprende un material según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 23, junto con un vehículo fisiológico adecuado.
25. Una disolución para inyección que comprende un material según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 24.
26. Un material reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 25, para uso farmacéutico.
27. El uso de un material según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 25, en la preparación de un producto farmacéutico para la profilaxis y/o tratamiento de alergias.
28. El uso de un material según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 25, en la preparación de un producto farmacéutico para modular la respuesta inmunitaria.
29. La Candida albicans depositada en la "Deutsch Sammlung für Mikroorganismen" (DSM), con el Número de Registro 9656.
30. Un material según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, caracterizado porque contiene ASMP procedente de la cepa M. gypseum DSM n.º 7274 y ASMP procedente de la cepa C. albicans DSM n.º 9656.
31. El uso de un material como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 25 ó 30, en la preparación de un producto farmacéutico para la profilaxis o tratamiento de eccema de verano.
32. El uso de un material como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 25 ó 30, en la preparación de un producto farmacéutico para la profilaxis o tratamiento de la alopecia.
33. El uso de un material como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 25 ó 30, en la preparación de un producto farmacéutico para la profilaxis o tratamiento de eccemas.
34. El uso de un material como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 25 ó 30, en la preparación de un producto farmacéutico para la profilaxis o tratamiento de neurodermatitis.
35. El uso de un material como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 25 ó 30, en la preparación de un producto farmacéutico para mejorar el pelaje en un mamífero.
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