ES2207497T3 - 1,4-dihidroindeno(1,2-c)pirazoles sustituidos como inhibidores de tirosina quinasa. - Google Patents

1,4-dihidroindeno(1,2-c)pirazoles sustituidos como inhibidores de tirosina quinasa.

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ES2207497T3 ES00919742T ES00919742T ES2207497T3 ES 2207497 T3 ES2207497 T3 ES 2207497T3 ES 00919742 T ES00919742 T ES 00919742T ES 00919742 T ES00919742 T ES 00919742T ES 2207497 T3 ES2207497 T3 ES 2207497T3
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Abstract

Compuestos de **fórmula** donde el término metileno sustituido significa metileno sustituido con uno o más de hidroxi o un grupo alquilo C1- 4, donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido adicionalmente con un grupo de fórmula NRrRs, en la que Rr y Rs representan independientemente H o un grupo alquilo C1- 6; donde grupo amino opcionalmente sustituido significa un grupo de fórmula NRkRl en la que Rk y Rl representan independientemente hidrógeno, un grupo alquilo C1-12, un grupo alcoxi C1-12, un grupo cicloalquilo C3-12, un grupo fenilo, un grupo fenilalquilo C1-6, un grupo heteroarilo, o un grupo heteroarilalquilo C1-6, donde cada uno de dichos grupos está opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: un grupo alquilo C1-6, un grupo alcoxi C1-6, hidroxi, halo, o Rk y Rl junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos representan un anillo saturado heterocíclico de cinco, seis o siete miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado entre O,S, o N y está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C1-6.

Description

1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazoles sustituidos como inhibidores de tirosina quinasa.
La invención se refiere a la ciertos 3-aril pirazoles con fusión del anillo 4,5(3,4)-bicíclico que son inhibidores de proteína quinasas particularmente tirosina quinasas y serina/treonina quinasa, de los cuales algunos son compuestos nuevos, a composiciones farmacéuticas que contienen estos pirazoles y a un proceso para preparar estos pirazoles.
Antecedentes de la invención
Existen al menos 400 enzimas identificadas como proteína quinasas. Estas enzimas catalizan la fosforilación de sustratos proteicos diana. La fosforilación es normalmente una reacción de transferencia de un grupo fosfato de ATP al sustrato proteico. La estructura específica en el sustrato diana a la cual se transfiere el fosfato es un resto tirosina, serina o treonina. Como estos restos aminoácidos son las estructuras diana para la transferencia de fosforilación, normalmente se hace referencia a estas enzimas proteína quinasas como tirosina quinasas o serina/treonina quinasas.
Las reacciones de fosforilación, y las reacciones que contrarrestan la fosfatasa en los restos tirosina, serina y treonina están implicadas en incontables procesos celulares que están detrás de respuestas a diversas señales intracelulares (mediadas típicamente a través de receptores celulares), regulación de funciones celulares, y activación o desactivación de procesos celulares. A menudo una cascada de proteína quinasas participan en la transducción de señales intracelulares y son necesarias para la realización de estos procesos celulares. Dado su ubicuidad en estos procesos, las proteína quinasas pueden encontrarse como parte integral de la membrana de plasma o como enzimas cicloplásmicas o localizarse en el núcleo, a menudo como componentes de complejos de enzimas. En muchos casos, estas proteína quinasas son un elemento esencial de los complejos proteicos de enzimas y estructurales que determinan dónde y cuando ocurre un proceso celular en una célula.
Proteínas tirosina quinasas
Las proteínas tirosina quinasas (PTK) son enzimas que catalizan la fosforilación de restos tirosina específicos en las proteínas celulares. Esta modificación post-translacional de estos sustratos de proteínas, que a menudo son también enzimas, actúa como un interruptor molecular que regula la proliferación celular, la activación o la diferenciación (véase por ejemplo, Schlessinger and Ulrich, 1992, Neuron 9:383-391). Se ha observado una actividad anormal o excesiva de las PTK en muchas enfermedades incluyendo trastornos proliferativos benignos y malignos así como enfermedades producidas por la activación inapropiada del sistema inmune (por ejemplo, trastornos autoinmunes), rechazo de aloinjertos, y enfermedad de rechazo de injertos del hospedador. Además las PTK receptoras específicas de células endoteliales tales como KDR y Tie-2 median el proceso angiogénico, y de esta forma están implicadas en apoyar la progresión de cánceres y otras enfermedades que implican una vascularización inapropiada (por ejemplo, retinopatía diabética, neovascularización coroidal debida a degeneración macular relacionada con la edad, psoriasis, artritis, hemangiomas infantiles).
Las proteínas quinasas puede ser de tipo receptora (con dominios extracelular, transmembrana e intracelular) o del tipo no receptora (siendo completamente intracelular).
Receptor tirosina quinasa (RTK)
Los RTK comprenden una gran familia de receptores de transmembrana con diversas actividades biológicas. En la actualidad, se han identificado al menos diecinueve (19) subfamilias de RTK distintas. La familiar del receptor tirosina quinasa (RTK) incluye receptores que son cruciales para el crecimiento y diferenciación de una diversidad de tipos de células (Yarden and Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57:433-478, 1988; Ullrich and Schlessinger, Cell 61:243-254, 1990). La función intrínseca de los RTK se activa con la unión del ligando, lo que produce la fosforilación del receptor y múltiples sustratos celulares, y posteriormente en una diversidad de respuestas celulares (Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61:203-212). De esta forma, la transducción de señal mediada por el receptor de tirosina quinasa se inicia por la interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando), seguido típicamente de dimerización del receptor, estimulación de la actividad proteína tirosina quinasa intrínseca y trans-fosforilación del receptor. Por eso, se forman posiciones de unión para las moléculas de transducción de señal intracelular y conduce a la formación de complejos con un espectro de moléculas de señalización citoplasmática que facilita la respuesta celular apropiada. (por ejemplo, división celular, diferenciación, efectos metabólicos, cambios en el microentorno extracelular) (véase Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron 9:1-20).
Las proteínas con dominios SH2 (homología src -2) o unión fosfotirosina (PTB) unen receptores de tirosina quinasa y sus sustratos con una afinidad alta para propagar señales en las células. Ambos dominios reconocen la fosfotirosina (Fantl et al., 1992, Cell, 69:413-123; Songyang et al, 1994, Mol- Cell. Biol. 14:2777-2785; Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778; Koch et al., 1991, Science 252:668-678; Shoelson, Curr. Opin. Chem. Biol. (1997), 1(2), 227-234; y Cowburn, Curr. Opin. Struct. Bio. (1997), 7(6), 835-838). Se han identificado varias proteínas de sustrato intracelular que se asocian con los receptores tirosina quinasa (TRK). Pueden dividirse en dos grupos principales: (1) sustratos que tienen un dominio catalítico; y (2) sustratos que carecen de tal dominio pero sirven como adaptadores y se asocian con moléculas activas catalíticamente (Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778). La especificidad de las interacciones entre receptores y proteínas y dominios SH2 o PTB de sus sustratos se determinan con los restos aminoácidos que rodean inmediatamente al resto tirosina fosforilado. Por ejemplo, las diferencias en las afinidades de unión entre dominios SH2 y las secuencias de aminoácidos que rodean los restos fosfotirosina en los receptores particulares se correlacionan con las diferencias observadas en sus perfiles de fosforilación de sustrato (Songyang et al, 1993, Cell 72:767-778). Las observaciones sugieren que la función de cada receptor tirosina quinasa se determina no sólo por su patrón de expresión y disponibilidad de ligando sino también por el conjunto de líneas de transducción de señales que se activan por un receptor particular así como el tiempo y duración de estos estímulos. De esta forma, la fosforilación proporciona una etapa reguladora importante que determina la selectividad de las líneas de señalización reclutadas por receptores de factores de crecimiento específicos, así como receptores de factores de diferenciación.
Se ha sugerido que varios receptores tirosina quinasas y factores de crecimiento que se unen a ellas juegan un papel en la angiogénesis, aunque algunas pueden provocar angiogénesis indirectamente (Mustonen and Alitalo, J. Cell. Bio. 129:895-898, 1995). Un ejemplo de tal receptor tirosina quinasa, conocido como "quinasa 1 de hígado fetal" (KLJ-1), es miembro de la subclase Tipo III de RTK. Un nombre alternativo para la FLK-1 humana es "receptor de quinasa que contiene dominio" (KDR) (Terman et al., Oncogene 6:1677-83, 1991). Otro nombre alternativo para FLK-1/KDR es "receptor 2 del factor de crecimiento de la célula vascular endotelial") ("VEGFR-2") ya que une VEGF con alta afinidad. La versión con murina de FLK-1/VEGFR-2 se ha llamado también NYK (Oelrichs et al., Oncogene 8(1):11-15, 1993). Se ha aislado el ADN que codifica la FLK-1 en ratones, ratas y seres humanos, y se han publicado el nucleótido y las secuencias de aminoácidos codificadas (Matthews et al., Porc. Natl. Acad. Sci. USA; 88:9026-30, 1991; Terman et al., 1991, supra; Terman et al., Biochem. Biophys, Res. Comm. 187:1579-86, 1992; Sarzani et al., supra; y Millauer et al., supra, sugieren que la VEGF y FLK-1/KDR/VEGFR-2 son un par ligando-receptor que juegan un papel importante en la proliferación de células endoteliales vasculares, y en la formación y ramificación de vasos sanguíneos, designados como vasculogénesis y angiogénesis respectivamente.
Otro RTK de subclase de Tipo III designado "tirosina quinasa-1 similar a fms" (Flt-1) está relacionada con FLK-1/KDR (DeVries et al. Science 255;989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5:519-524, 1990). Una designación alternativa para Flt-1 es "receptor 1 del factor de crecimiento célula vascular endotelial" (VEGFR-1). Hasta la fecha, se han encontrado miembros de las subfamilias FLK-1/KDR/VEGFE-2- y Flt-1/VEGFR1 expresadas principalmente en células endoteliales. Estos miembros de subclases se estimulan específicamente por miembros de la familia de ligandos de factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) (Kalgsburn and D'Amore, Cyotkine & Growth Factor Reviews 7:259-270, 1996). En factor de crecimiento celular vascular endotelial se une a Flt-1 con mayor afinidad que a FLK-1/KDR y es mitogénico hacia células vasculares endoteliales (Terman et al., 1992m supra; Mustonen et al. supra; DeVries et al., supra). Se cree que Flt-1 es esencial para la organización endotelial durante el desarrollo vascular. La expresión de Flt-1 se asocia con el desarrollo vascular inicial en embriones de ratón, y con la neovascularización durante la cura de heridas (Mustonen and Alitalo, supra). La expresión de Flt-1 en órganos de adultos tal como en los glomérulos de los riñones sugiere una función adicional para este receptor que no está relacionada con el crecimiento celular (Mustonen and Alitalo, supra).
Como se ha afirmado previamente, hay pruebas recientes que sugieren que el VGF juega un papel en la estimulación de la angiogénesis normal y en la patológica (Jakeman et al., Endocrinology 133:848-859, 1993; Koch et al., Breast Cancer Research and Treatment 36:139-155, 1995; Ferrara et al, Endocrine Reviews 18(1); 4-25, 1997; Ferrara et al., Regulation of Angiogenesis (ed. L.D. Goldberg and E.M. Rosen), 209-232, 1997). Además, la VEGF se ha implicado en el control y mejora de la permeabilidad vascular (Connolly et al., J. Biol. Chem. 264:20017-20024, 1989; Brown et al., Regulation of Angiogenesis (ed. L.D. Goldberg and E.M. Rosen), 233-269, 1997).
Se ha informado de diferentes formas de VEGF que surgen de la concatenación alternativa de ARNm, incluyendo las cuatro especies descrita por Ferrara et al. (J. Cell. Biochem. 47:211-218, 1991). Ferrar et al. supra han identificado principalmente especies asociadas a células y secretadas, y se conoce que la proteína existe en forma de dímeros unidos con enlaces disulfuro.
Recientemente se han identificado varios homólogos de VEGF relacionados. Sin embargo, sus funciones tanto en los procesos patológicos como en los fisiológicos no se han dilucidado. Además, los miembros de la familia VEGF están a menudo coexpresados con VEGF en varios tejidos y son, en general, capaces de formar heterodímeros con VEGF. Esta propiedad altera probablemente la especificidad del receptor y los efectos biológicos de los heterodímeros y complica adicionalmente la aclaración de sus funciones específicas como se ilustra a continuación (Korpelainen and Alitalo, Curr. Opin. Cell. Biol., 159-164, 1998 y referencias citadas en ese documento).
El factor de crecimiento de la placenta (PIGF) tiene una secuencia de aminoácidos que muestra una homología significativa con la de la secuencia de VEGF (Park et al., J. Biol. Chem. 269:25646-54, 1994; Maglione et al. Oncogene 8:925-31, 1993). Como con VEGF, surgen distintas especies de PIGF de la concatenación alternativa de ARNm, y la proteína existe en forma dimérica (Park et al., supra). El PIGF-1 y PIGF-2 se unen con Flt-1 con alta afinidad, y el PIGF-2 además se une con neuropilia-1 (Migdal et al., J. Biol. Chem. 273 (35): 22272-22278), pero no se use con FLK1/KDR (Park et al, supra). Se ha informado que el PIGF potencia la permeabilidad vascular y el efecto mitogénico del VEGF en las células endoteliales cuando el VEGF está presente a bajas concentraciones (pretendidamente debido a la formación del heterodímero) (Park et al., supra).
El VEGF-B se produce como dos isoformas (restos 167 y 185) que también parecen unirse al Flt-1/VEGFR-1. Puede tener un papel en la regulación de la degradación de la matriz extracelular, adhesión celular, y migración a través de la modulación de la expresión y actividad del activador plasminógeno tipo uroquinasa y del inhibidor 1 del activador plasminógeno (Pepper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998), 95(20): 11709-11714).
El VEGF-C se clonó originalmente como un ligando para VEGFR-3/Flt-4 que se expresa principalmente en células linfáticas endoteliales. En su forma totalmente procesada, el VEGF-C puede unirse también a KDR/VEGFR-2 y estimular la proliferación y migración de células endoteliales in vitro y angiogénesis in vivo (Lymboussaki et al, Am. J. Pathol. (1998), 153(2): 195-403; Witzenbilcher et al, Am. J. Pathol. (1998), 153(2), 381-394). La sobreexpresión transgénica de VEGF-C causa la proliferación y la extensión solamente de los vasos linfáticos, mientras que los vasos sanguíneos permanecen inafectados. Al contrario que VEGF, la expresión de VEGF-C no está inducida por la hipoxia (Ristimake et al., J. Biol. Chem. (1998), 273(14), 8413-8418).
El VEGF-D, descubierto más recientemente, es muy similar estructuralmente al VEGF-C. Se ha informado que el VEGF-D se une y activa al menos dos VEGFR, VEGFR-3/Flt-4 y KFR/VEGFR-2. Se clonó originalmente como un mitógeno inducible con c-fos para fibroblastos y se expresa principalmente en las células mesenquimales del pulmón y de la piel (Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. UISA (1998), 95(2), 548-553 y las referencias en ese documento).
Se ha reivindicado que el VEGF-C y VEGF-D inducen aumentos en la permeabilidad vascular in vivo en una análisis Miles cuando se inyecta en el tejido cutáneo (documentos PCT/US97/14696; WO98/07832, Witzenbilcher et al., supra). El papel fisiológico y significado de estos ligandos en la modulación de la hiperpermeabilidad vascular y la respuesta endotelial en los tejidos donde se expresan es incierto.
Basándose en los descubrimientos recientes de otros homólogos de VEGF y VEGFR y los precedentes de ligandos y heterodimerización de receptores, las acciones de tales homólogos de VEGF pueden implicar la formación de heterodímeros de ligandos VEFG y/o heterodimerización de receptores, o la unión a un VEGFR no descubierto todavía (Witzenbilcher et al., supra). Además, informes recientes sugieren que la neuropilina-1 (Migdal et al, supra) o VEGFR-3/Flt-4 (Witzenbilcher et al., supra), u otros receptores distintos de KDR/VEGFR-2 pueden ser responsables de la inducción de permeabilidad vascular (Stacker, S.A., Vitali, A., Domagala, T., Nice, E., y Wilks, A.F., "Angiogenesis and Cancer", Conference, Amer. Assoc. Cancer. Res., Enero. 1998, Orlando, FL; Williams Diabetologia 40:S118-120 (1997)). Hasta ahora, no se ha descrito evidencia directa del papel esencial de KDR en la hiperpermeabilidad vascular mediada por VEGF.
Las tirosina quinasas no receptoras
Las tirosina quinasas no receptoras representan una colección de enzimas celulares que carecen de secuencias extracelulares y transmembrana. En la actualidad, se han identificado más de 24 tirosina quinasas no receptoras individuales, comprendiendo once (11) subfamilias (Src, Frk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, y LIMK). En la actualidad, la subfamilia Src de tirosina quinasas no receptoras se compone del mayor número de PTK e incluyen Src, Tes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr, e Yrk. La subfamilia Src de enzimas se ha relacionado con la oncogénesis. En Bolen, 1993, Oncogene 8:2025-2031 se dar una discusión más detallada de tirosina quinasas no receptoras.
Se ha encontrado que muchas de las tirosina quinasas no receptoras, RTK o tirosina quinasa no receptora, están implicadas en las líneas de señalización celular implicadas en varias condiciones patógenas, incluyendo cáncer, psoriasis, y otros desórdenes hiperproliferativos de respuestas hiper-inmune.
Desarrollo de compuestos para modular los PTK
En vista de la supuesta importancia de PTK para controlar, regular, y modular la proliferación celular, las enfermedades y trastornos asociados con la proliferación celular anormal, se han hecho muchos intentos para identificar "inhibidores" de tirosina quinasa receptoras y no receptoras usando una diversidad de enfoques, incluyendo el uso de ligandos mutantes (Patente de Estados Unidos No. 4.966.849), receptores solubles y anticuerpos (Solicitud No. WO 94/10202; Kendall & Thomas, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10705-09; Kim et al., 1993, Nature 362:841-844), ligandos de ARN (Jellinek, et al., Biochemistry 33:10450-56; Takano et al, 1993 Mol. Bio. Cell 4:358A; Kinsella, et al., 1992, Exp. Cell. Res. 199:56-62; Wright, et al., 1992 J. Cellular Phys. 152:448-57) e inhibidores de tirosina quinasa (documentos WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; Patente de Estados Unidos No. 5.330.990; Mariani, et al., 1994, Proc. Am. Assoc. Cancer. Res. 35:2268).
Más recientemente, se ha intentado identificar pequeñas moléculas que actúan como inhibidores de tirosina quinasa. Por ejemplo, se han descrito compuestos de arilo bis monocíclico, bicíclico o heterocíclico (documento PCT WO 92/2062) y derivados de vinileno-azaindol (documento PCT WO 94/14808) como inhibidores de tirosina quinasa. Se han descrito compuestos de estirilo (Patente de Estados Unidos No. 5.217.999), compuestos de estirilo sustituido piridilo (Patente de Estados Unidos No. 5.302.606) ciertos derivados de quinazolina (Solicitud de Patente Europea No. 0 566 266 A1; Expert Opin. Ther. Pat. (1998), 8(4):475-478), selenoindoles y selenuros (documento PCT WO 94/03427), compuestos tricíclicos polihidroxílicos (documento PCT WO 91/15495) como compuestos para usar como inhibidores de tirosina quinasa para usar en el tratamiento del cáncer. Se han descrito Anilinocinolinas (documento PCT WO 97/34876) y compuestos derivados de quinazolina (documento PCT WO97/22596; y PCT WO97/42187) como inhibidores de angiogénesis y permeabilidad vascular.
Además, se han hecho intentos para identificar pequeñas moléculas que actúan como inhibidores de serina/treonina quinasa. En particular, se han descrito compuestos de bis(indolilmaleimida) como inhibidores de isoformas de serina/treonina PKC particulares cuya disfunción se asocia con una permeabilidad vascular alterada en enfermedades relacionadas con VEGF (documentos PCT WO97/40830; PCT WO97/40831).
Por tanto, es deseable la identificación de pequeñas cantidades eficaces que inhiben específicamente la transducción de señal modulando la actividad de tirosina y serina/treonina quinasa receptora y no receptora para regular y modular una proliferación, diferenciación o metabolismo celular anormal o inapropiada. En particular, sería beneficiosa la identificación de métodos y compuestos que inhiben específicamente la función de una tirosina quinasa que es esencial para procesos angiogénicos o para la formación de hiperpermeabilidad vascular que conduce a edemas, ascitis, efusiones, exudados, y extravasación macromolecular y deposición de la matriz, así como a trastornos asociados.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona compuestos de fórmula I
1
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la que
L_{1} representa un grupo de fórmula (E)_{S}(CH_{2})_{q} en la que E representa NR_{24}, O o S, s es 0 ó 1 y q es un entero de 0 a 6, con la condición de que cuando s es 1 q sea al menos 1, donde la cadena alquileno está opcionalmente sustituida con uno o más de los siguientes: un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno o más grupos hidroxi, halo o amino opcionalmente sustituido, un grupo C_{1-6} alcoxi opcionalmente sustituido con uno o más grupos hidroxi, halo, o amino opcionalmente sustituido; hidroxi; halo; o amino opcionalmente sustituido;
A representa CONH, NHCO, SO_{2}NH, NHSO_{2}, o NR_{25};
L_{2} representa un grupo de fórmula (CH_{2})_{r}, en la que r es un entero de 0 a 6, donde la cadena alquileno está opcionalmente sustituida con un o más de los siguientes: un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno o más grupos hidroxi, halo o amino opcionalmente sustituido; un grupo alcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno o más grupos hidroxi, halo, o amino opcionalmente sustituido; hidroxi; halo; o amino opcionalmente sustituido;
R_{2} representa un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: halo, hidroxi, alcoxi C_{1-6} o amino opcionalmente sustituido; un grupo alcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: halo, hidroxi, alcoxi C_{1-6} o amino opcionalmente sustituido; o R_{2} es halo, hidroxi, ciano, nitro, carbamoílo, un grupo alcanoílo C_{1-6}, un grupo (alcoxi C_{1-6})carbonilo o un amino opcionalmente sustituido;
n representa 0, 1, 2 ó 3.
X representa a) metileno sustituido, b) carbonilo, c) oxígeno, d) un grupo de fórmula -C=NOR_{7}, donde R_{7} representa H o un grupo alquilo C_{1-4}, e) un grupo de fórmula NR_{8} en la que R_{8} representa H, un grupo alquilo C_{1-4} opcionalmente sustituido o fenilo opcionalmente sustituido, f) un grupo de fórmula (CH_{2})_{n} en la que n es 1, 2 ó 3, o g) un grupo de fórmula S(O)_{p} en la que p es 0, 1 ó 2;
R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} representan independientemente a) H, b) halo, c) un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: hidroxi, un grupo alcoxi C_{1-6}, halo o un grupo amino opcionalmente sustituido, d) un grupo alcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: hidroxi; un grupo alcoxi C_{1-6}; halo; o un grupo amino opcionalmente sustituido, con la condición de que estos grupos no estén unidos al carbono que está unido al oxígeno del grupo alcoxi; e) fenoxi opcionalmente sustituido, f) hidroxi, g) un grupo de fórmula COR_{a} en el que R_{a} representa hidroxi, un grupo alcoxi C_{1-6} o R_{a} representa un grupo amino opcionalmente sustituido, h) un grupo amino opcionalmente sustituido, i) un grupo alcanoílo C_{1-6}, j) nitro, k) fenilalquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, l) fenilalcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituido, m) ciano; u o) un grupo alquenilo C_{2-4} o un grupo alquinilo C_{2-4}, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: un grupo alquilo C_{1-6}, un grupo alcoxi C_{1-6} o halo;
y
1) cuando A es SO_{2}NH o NHSO_{2}
R_{1} representa a) fenilo opcionalmente sustituido, b) heteroarilo opcionalmente sustituido, c) un anillo heterocíclico saturado de cinco, seis o siete miembros que contiene un átomo de nitrógeno que opcionalmente contiene un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S o N y está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C_{1-6}, pudiéndose unir dicho anillo saturado a través de un carbono o de un heteroátomo, d) un grupo amino opcionalmente sustituido, o e) un grupo alcoxi C_{1-6};
2) cuando A representa CONH o NHCO
R_{1} representa a) fenilo sustituido con nitro o uno o más grupos alcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituidos con uno o más de los siguientes: halo, hidroxi, alcoxi C_{1-6} o amino opcionalmente sustituido, b) un heteroarilo opcionalmente sustituido, o c) un anillo heterocíclico saturado de cinco, seis o siete miembros que contiene un átomo de nitrógeno, que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S o N y está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C_{1-6} en el que dicho anillo saturado está unido a través de un átomo de carbono o d) un grupo alcoxi C_{1-6}.
3) cuando A representa un grupo NR_{25} y q es al menos 1 entonces
R_{1} representa a) fenilo opcionalmente sustituido, b) heteroarilo opcionalmente sustituido o c) un grupo amino opcionalmente sustituido; y
4) cuando A representa un grupo R_{25} y q es 0 y s es 0, entonces R_{1} representa heteroarilo opcionalmente sustituido;
R_{24}y R_{25} representan independientemente H; un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: hidroxi, un grupo alcoxi C_{1-6}, halo o un grupo amino opcionalmente sustituido; un grupo alcanoílo C_{1-6} o un grupo alquilsulfonilo C_{1-6}; con la condición de que no haya dos heteroátomos unidos al mismo átomo de carbono hibridado sp3.
Los especialistas en la técnica apreciarán que cuando n es distinto de 0 ó 1 los grupos R_{2} pueden ser iguales o diferentes.
El término grupo amino opcionalmente sustituido significa un grupo de fórmula NR_{k}R_{l} en el que R_{k} y R_{l} representan independientemente hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-12},un grupo alcoxi C_{1-12}, un grupo cicloalquilo C_{3-12}, un grupo fenilo, un grupo fenilalquilo C_{1-6}, un grupo heteroarilo, o un grupo heteroarilalquilo C_{1-6}, donde cada uno de dichos grupos está opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: un grupo alquilo C_{1-6}, un grupo alcoxi C_{1-6}, hidroxi, halo, o R_{k} y R_{l} junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos representan un anillo heterocíclico saturado de cinco, seis o siete miembros y que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, o N y que está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C_{1-6}.
El término opcionalmente sustituido como se usa en este documento en referencia a fenilo y heteroarilo significa sustituido con uno o más de los siguientes a) halo b) un grupo alquilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: hidroxi, halo, un grupo amino opcionalmente sustituido o un anillo saturado heterocíclico de cinco, seis o siete miembros que contiene un átomo de nitrógeno que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado entre O, S, o N y está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C_{1-6} en el que dicho anillo saturado está unido a través de un átomo de carbono, c) un grupo alcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: hidroxi, un grupo alcoxi C_{1-6} halo, o un grupo amino opcionalmente sustituido con la condición de que estos grupos no estén unidos al carbono que está unido al oxígeno del grupo alcoxi, o un anillo heterocíclico saturado de cinco, seis o siete miembros que contiene un átomo de nitrógeno y que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S o N y que está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C_{1-6}, donde dicho anillo saturado está unido a través de un átomo de carbono, d) un fenoxi opcionalmente sustituido, e) hidroxi, f) un grupo de fórmula COR_{a} en el que R_{a} representa hidroxi, un grupo alcoxi C_{1-6} o R_{a} representa un grupo de fórmula NR_{b}R_{c} en la que R_{b} y R_{c} representan independientemente hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-12}, un grupo cicloalquilo C_{3-12} o un fenilo, donde el grupo alquilo, el grupo cicloalquilo y el fenilo están opcionalmente sustituidos con uno o más de los siguientes: hidroxi, halo, un grupo cicloalquilo C_{3-12} o un grupo amino de fórmula NR_{h}R_{j} en la que R_{h} y R_{j} representan independientemente hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6} o donde R_{h} y R_{j} junto con el átomo de nitrógeno al que están acoplados representan un anillo saturado heterocíclico de cinco, seis o siete miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S o N y que está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C_{1-6}, g) un grupo de fórmula NR_{d}R_{e} en la que R_{d} y R_{e} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-12}, un grupo cicloalquilo C_{3-12}, o fenilo o un grupo de fórmula COR_{f} en la que R_{f} representa hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-12}, un grupo cicloalquilo C_{3-12}, un grupo fenilalquilo C_{1-6}, o fenilo, donde en cada caso el grupo alquilo, cicloalquilo, y fenilo están opcionalmente sustituidos con uno o más de los siguientes: halo, hidroxi, nitro o un grupo amino de fórmula NR_{h}R_{j}, en la que R_{h} y R_{j} son como se han definido anteriormente, h) un grupo de fórmula O(CH_{2})_{m}R_{g} en la que m es 2, 3, 4 o 5 y R_{g} representa hidroxi o un grupo de fórmula NR_{d}R_{e} en la que R_{d} y R_{e} son como se han definido anteriormente; o R_{g} representa un grupo de fórmula COR_{a} en la que R_{a} es como se ha definido anteriormente, y m es 1, 2, 3, 4, o 5, i) nitro, j) fenilalquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, k) fenilalcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituido, l) ciano, m) un grupo alqueniloxi C_{3-6}, n) un grupo piridiloxi o piridiltio, donde el anillo de piridina está opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: trifluorometilo o nitro, o) hidroxiamidino, p) aminoetilo, q) formamidometilo, r) un grupo alquiltio C_{1-6}, s) fenilo o t) un grupo alquenilo C_{2-4} o un grupo alquinilo C_{2-4}, estando cada uno de ellos opcionalmente sustituido con fenilo que está opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: un grupo alquilo C_{1-6}, un grupo alcoxi C_{1-6} o halo.
El término heteroarilo significa un heterociclilo aromático opcionalmente sustituido mono o bicíclico, donde el heterociclilo contiene 1, 2, 3, ó 4 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, azufre, u oxígeno. El grupo heteroarilo puede acoplarse a través de un átomo de carbono o un heteroátomo. Los grupos heteroarilo adecuados incluyen imidazolilo, furilo, pirrolilo, tienilo, oxazolilo, tiazolilo, isoxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, piridinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, quinilo, isoquinilo, indazolilo, benzoxazolilo, benzofurilo, benzotiazolilo, indolizinilo, imidazopiridinilo, o benzo(b)tienilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido como se ha descrito anteriormente.
Cuando el grupo amino opcionalmente sustituido representa un anillo heterocíclico saturado, el anillo preferiblemente es morfolino, perhidrotiazin-4-ilo, pireridino, pirrolidin-1-ilo, piperazin-1-ilo, 4-metilpiperazin-4-ilo, tiamorfolinilo, perhidro-1,3-diazepin-1-ilo, o perhidroazepinilo.
El término metileno sustituido significa metileno sustituido con uno o más de los siguientes: hidroxi o un grupo alquilo C_{1-4} en el que el grupo alquilo está sustituido adicionalmente con un grupo de fórmula NR_{r}R_{s} en el que R_{r} y R_{s} representan independientemente H o un grupo alquilo C_{1-6}.
Debe apreciarse que cualquier grupo mencionado en este documento que contiene una cadena de tres o más átomos significa un grupo en el que la cadena puede ser lineal o ramificada. Por ejemplo, un grupo alquilo puede comprender propilo, que incluye n-propilo e isopropilo, y butilo, que incluye n-butilo, sec-butilo, y terc-butilo. El término grupo cicloalquilo C_{3-12} incluye grupos unidos, por ejemplo adamantilo. El término "halo" como se usa en este documento significa flúor, cloro, bromo y yodo.
Preferiblemente x es CH_{2} o S.
En un primer grupo de compuestos preferidos de formula I, X es CH_{2} y A es NR_{25}.
En un segundo grupo de compuestos preferidos de fórmula I, X es S y A es NR_{25}.
En un tercer grupo de compuestos preferidos de fórmula I, X es CH_{2} y A es HNSO_{2}.
En un cuarto grupo de compuestos preferidos de fórmula I, X es CH_{2} y A es SO_{2}NH.
En un quinto grupo de compuestos preferidos de fórmula I, X es CH_{2} y A es CONH.
En un sexto grupo de compuestos preferidos de fórmula I, X es CH_{2} y A es HNCO.
En los compuestos más preferido de fórmula I, X es CH_{2}, A es NR_{25}, L_{1} es (CH_{2})_{q} donde q es un entero de 1 a 6 y la cadena alquileno está opcionalmente sustituida con uno o más de los siguientes: un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno o más hidroxi, halo o amino opcionalmente sustituido; un grupo alcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno o más hidroxi, halo o amino opcionalmente sustituido; hidroxi; halo; o amino opcionalmente sustituido; L_{2} es un enlace y R_{1} es un piridilo opcionalmente sustituido.
Los compuestos de fórmula I pueden existir como sales con ácidos farmacéuticamente aceptables. La presente invención también incluye dichas sales. Ejemplos de tales sales incluyen clorhidratos, bromhidratos, sulfatos, metanosulfatos, nitratos, maleatos, acetatos, citratos, fumaratos, tartratos [por ejemplo (+)-tartratos, (-)-tartratos o mezclas de los mismos incluyendo mezclas racémicas], succinatos, benzoatos y sales con aminoácidos tales como ácido glutámico. Estas sales pueden prepararse por métodos conocidos por los especialistas en la técnica.
Ciertos compuestos de fórmula I que tienen sustituyentes ácidos pueden existir como sales con bases farmacéuticamente aceptables. La presente invención incluye dichas sales. Ejemplos de tales sales incluyen sales de sodio, sales de potasio, sales de lisina y sales de arginina. Estas sales pueden prepararse por métodos conocidos por los especialistas en la técnica.
Ciertos compuestos de fórmula I pueden existir en más de una forma cristalina y la presente invención incluye cada forma cristalina y mezclas de las mismas.
Ciertos compuestos de fórmula I pueden existir también en forma de solvatos, por ejemplo hidratos, y la presente invención incluye cada solvato y mezclas de los mismos.
Ciertos compuestos de fórmula I pueden contener más de un centro quiral, y existen en distintas formas activas ópticamente. Cuando los compuestos de fórmula I contienen un centro quiral, el compuesto existe en dos formas enantioméricas y la presente invención incluye ambos enantiómeros y las mezclas enantioméricas. Los enantiómeros pueden resolverse por métodos conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo formando sales diastereoisoméricas que pueden separarse, por ejemplo, por cristalización; formación de derivados diastereoisoméricos o complejos que pueden separarse, por ejemplo, por cristalización, cromatografía de gas-líquido o de líquido; reacción selectiva de un enantiómero con un reactivo específico de enantiómero, por ejemplo esterificación enzimática; o cromatografía de gas-líquido o de líquido en un entorno quiral, por ejemplo en un soporte quiral, por ejemplo sílice con un ligando quiral unido o en presencia de un disolvente quiral. Debe apreciarse que cuando el enantiómero deseado se transforma en otra entidad química mediante uno de los procedimientos de separación descrito anteriormente, se necesita una etapa adicional para liberar la forma enantiomérica deseada. Alternativamente, pueden sintetizarse enantiómeros específicos mediante síntesis asimétrica usando reactivos, sustratos, catalizadores, o disolventes activos ópticamente convirtiendo un enantiómero en otro mediante transformación asimétrica.
Cuando un compuesto de fórmula I contiene más de un centro quiral puede existir en formas diastereoisoméricas. Los pares diastereoisoméricos pueden separarse por métodos conocidos por los especialistas, por ejemplo cromatografía o cristalización y los enantiómeros individuales dentro de cada par pueden separarse como se ha indicado anteriormente. La presente invención incluye cada diastereómero de compuestos de fórmula I y mezclas de los mismos.
Ciertos compuestos de fórmula I pueden existir en distintas formas tautoméricas o como distintos isómeros geométricos, y la presente invención incluye cada tautómero y/o isómero geométrico de compuestos de fórmula I y mezclas de los mismos.
Ciertos compuestos de fórmula I pueden existir en distintas formas conformacionales estables que pueden ser separables. La asimetría torsional debida a una rotación restringida sobre un enlace simple asimétrico, por ejemplo debido al impedimento estérico o deformación del anillo, puede permitir separar los distintos componentes. La presente invención incluye cada isómero conformacional de los compuestos de fórmula I y las mezclas de los mismos.
Ciertos compuestos de fórmula I pueden existir en forma bipolar y la presente invención incluye cada forma bipolar de compuestos de fórmula I y las mezclas de las mismas.
Los compuestos de la invención son útiles como inhibidores de serina/treonina y tirosina quinasas. En particular, los compuestos de esta invención son útiles como inhibidores de tirosina quinasas que son importantes en las enfermedades hiperproliferativas, especialmente en el proceso de angiogénesis. Como estos compuestos son antiangiogénicos, son sustancias importantes para inhibir la progresión de estados patológicos en los que la angiogénesis es un componente importante.
A continuación se proporcionan definiciones preferidas de los sustituyentes.
R_{1} representa preferiblemente fenilo opcionalmente sustituido, tienilo opcionalmente sustituido, piridilo opcionalmente sustituido, furilo opcionalmente sustituido o pirrolilo opcionalmente sustituido.
Más preferiblemente R_{1} representa 2-tienilo, 3-tienilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-piridilo, 3-piridilo, o 4-piridilo cada uno de los cuales es fenilo opcionalmente sustituido, y opcionalmente mono-, di-, y trisustituido, en el que los sustituyentes se seleccionan entre alcoxi opcionalmente sustituido (particularmente metoxi, 3-morfolinopropoxi, 2-morfolinoetoxi, 3-carboxipropoxi, carboximetoxi, 2-carboxietoxi, 2-carbamoiletoxi, carboilmetoxi, 3-carbamoilpropoxi, 2-piperidinoetoxi, 2-(piperazin-1-il)etoxi, 2-(pirrolidin-1-il)etoxi, 2-dimetilaminoetoxi, 2-(perhidro-tiazin-3-il)etoxi, 3-piperidinopropoxi, 3-(piperazin-1-il)propoxi, 3-(pirrolidin-1-il)-propoxi, 3-dimetilaminopropoxi, 3-(perhidrotiazin-4-il)propoxi, alquilo inferior (particularmente metilo), halo (particularmente flúor y cloro), arilo (particularmente fenilo), hidroxi, ariloxi (particularmente fenoxi), arilalcoxi (particularmente benciloxi), alquilamino di-inferior (particularmente dimetilamino), alquilo polihalo-inferior, alcoxi polihalo-inferior (particularmente difluorometoxi), nitro, ciano, alquiltio inferior (particularmente metiltio), carboxi, alcoxicarbonilo inferior (particularmente metoxicarbonilo), amado (particularmente acetamido y benzamido) y carbamoílo opcionalmente sustituido (particularmente carbamoílo, N-metilcarbamoílo, N-fenilcarbamoílo) y un grupo piridiloxi o piridiltio en el que en anillo piridina está opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: trifluorometilo o nitro.
Más preferiblemente R_{1} representa 4-piridilo, 2-formamidometil-4-piridilo, 2aminometil-4-piridilo, 2-(hidroxi-
amidino)-4-piridilo, 2-carbamoil-4-piridilo, 4-piridil-N-óxido, 2-cloro-4-piridilo, 2-ciano-4-piridilo, 5-metil-2-furilo, 5-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)fur-2-ilo, fenilo, 4-metoxifenilo, 3-metoxifenilo, 2-metoxifenilo, 3,4-dimetoxifenilo, 3,4,5-trimetoxifenilo, 4,(3-morfolinopropoxi)fenilo, 4-(2-morfolinoetoxi)fenilo, 4-(3-carboxipropoxi)fenilo, 4-carboximetoxifenilo, 4-(3-carbamoilpropoxi)fenilo, 4-carbamoilmetoxifenilo, 3-(3-morfolino-propoxi)fenilo, 3-(2-morfolinoetoxi)fenilo, 3-(3-carboxipropoxi)fenilo, 4-carboximetoxifenilo, 4-(3-carbamoilpropoxi)fenilo, 4-carbamoilmetoxifenilo, 3-(3-morfolino-propoxi)fenilo, 3,(2-morfolinoetoxi)fenilo, 3-(3-carboxipropoxi)fenilo, 4-carboximetoxifenilo, 3-(3-carbamoilpropoxi)fenilo, 3-carbamoilmetoxifenilo, 2-hidroxifenilo, 3-hidroxifenilo, 4-hidroxifenilo, 3-hidroxi-4-metoxifenilo, 4-hidroxi-3-metoxifenilo, 4-difluorometoxifenilo, 3-nitrofenilo, 4-nitrofenilo, 3,5-di-terc-butil-4-hidroxifenilo, 4-metilfenilo, 4-fluorofenilo, 2-clorofenilo, 3-clorofenilo, 4-clorofenilo, 2,4-diclorofenilo, 2-cloro-5-nitrofenilo, 4-fluoro-2-clorofenilo, 4-metiltiofenilo, 4-bifenilo, 3-fenoxifenilo, 4-fenoxifenilo, 4-benciloxifenilo, 4-dimetilaminofenilo, 4-dietilaminofenilo, 4-metoxicarbonilfenilo, 4-carbamoilfenilo, 4-cianofenilo, 4-N-metilcarbamoil-fenilo, 4-N-fenilcarbamoilfenilo, 4-acetamidofenilo, 4-benzamidofenilo, 4-carboxifenilo, 4-[N-(2-dietilaminoetil)carbamoil]fenilo, 4-(prop-1-eniloxi)fenilo, 4-(2-hidroxietoxi)fenilo, 3-(N-(2-dietilaminoetil)-carbamoilmetoxi)fenilo, 3-[3-(N-2-dietilaminoetil)carbamoilpropoxi]fenilo, N-(2-dietilaminoetil)carbamoilmetoxi)fenilo, 4-[3-(N-(2-dietilaminoetil)-carbamoil)propoxi]enilo, 2-furilo, 5-[3,5-bis(trifluorometil)fenil]-2-furilo, 3-bromo-2-tienilo, 5-metoxi-2-furilo, 5-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)-2-furilo, 3-N-(2-morfolinoetil)carbamoilmetoxi)fenilo, 3-[3-(N-(2-morfolinoetil)carbamoil)propoxifenil], 4-(N-(2-morfolinoetil)-carbamoilmetoxi)fenilo, 4-(morfolinoacetamido)fenilo y 4-[3-(N-2-morfolinoetil)carbamoil)propoxi]fenilo.
Preferiblemente R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} representan independientemente hidrógeno, halo (particularmente flúor), alcoxi inferior opcionalmente sustituido (particularmente metoxi, 3-morfolinopropoxi, 2-morfolinoetoxi, 3-carboxipropoxi, carboximetoxi, 2-carboxietoxi, 2-carbamoiletoxi, 3-carbamoilpropoxi, 2-piperidinoetoxi, 2-(piperazin-1-il)etoxi, 2-(pirrolidin-1-il)etoxi, 2-dimetilaminoetoxi, 2-(perhidrotiazin-1-il)etoxi, 3-piperidinopropoxi, 3-(piperazin-1-il)propoxi, 3-(pirrolidin-1-il)propoxi, 3-dimetilaminopropoxi, 3-(perhidrotiazin-4-il)propoxi, carbamoilmetoxi, hidroxipropiloxi, hidroxietoxi, (3-morfolino)propoxi y 2-morfolino)etoxi), amido (particularmente acetamido y benzamido), carbamoílo opcionalmente sustituido (particularmente carbamoílo, N-metil-carbamoílo y N-fenilcarbamoílo), carboxi, nitro y amino.
Más preferiblemente R_{3}, R_{4}, R_{5}, y R_{6} representan los siguientes: 6,7-dimetoxi, 6,7,8-trimetoxi, 6-fluoro, 6-acetamido, 7-metoxi, 6-carbamoílo, 6-(N-metil-carbamoílo), 6-(N-fenilcarbamoílo), (3-morfolino)propoxi y (2-morfolino)-etoxi.
El término inferior como se usa en este documento significa un grupo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
Compuestos específicos de la presente invención incluyen:
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol)-N-(4-piridil)bencilamina
N-[4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)fenil]bencenosulfonamida
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(2-metoxietil)benzamida
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(4-nitrofenil)benzamida
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-imidazol-1-ilacetanilida
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-[2-(imidazol-1-il)etil]anilina
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(2-morfolinoetil)-bencenosulfonamida
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(2-metoxietil)-bencenosulfonamida
N-[2-(N,N-dietilamino)etil]-4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)bencilamina
N-[2-(N,N-dietilamino)etil]-4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)bencenosulfonamida
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(2-morfolinoetil)bencilamina
N-(4-etoxifenil)-4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)bencilamina
(S)-4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(pirrolidin-2-ilmetil)benzamida
4-(1H-[1]benzotieno[3,2-c]pirazol-3-il)-N-[3-(imidazol-1-il)propil]bencilamina
4-(1H-[1]benzotieno[3,2-c]pirazol-3-il)-N-[2-morfolinoetil)bencilamina
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyendo enantiómeros individuales y mezclas de enantiómeros.
La presente invención incluye además el uso de estos compuestos en composiciones farmacéuticas con una cantidad farmacéuticamente eficaz de los compuestos descritos anteriormente y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse a individuos para reducir la velocidad o interrumpir el proceso de angiogénesis en enfermedades relacionadas con la angiogénesis, o para tratar edema, efusiones, exudados, o ascitis y otras enfermedades asociadas con la hiperpermeabilidad vascular.
Descripción detallada de la invención
Los compuestos de esta invención tienen propiedades antiangiogénicas. Estas propiedades antiangiogénicas se deben al menos en parte a la inhibición de la proteína tirosina quinasa que es esencial para los procesos angiogénicos. Por esta razón, estos compuestos pueden usarse como agentes activos contra enfermedades tales como artritis, ateroesclerosis, psoriasis, hemangiomas, angiogénesis miocárdica, colaterales coronarios y cerebrales, angiogénesis en extremidades isquémicas, cicatrización de heridas, enfermedades relacionadas con la úlcera péptica producida por Helicobacter, fracturas, fiebre causada por arañazos de gato, rubeosis, glaucoma neovascular, y retinopatías tales como las asociadas con la retinopatía diabética o degeneración macular relacionada con la edad. Además, algunos de estos compuestos puede usarse como agentes activos contra tumores sólidos, ascitis malignas, cánceres hematopoyéticos, y trastornos hiperproliferativos, tales como hiperplasia tiroidea, (especialmente enfermedad de Grave) y quistes tales como hipervascularidad de estroma de ovario característico del síndrome ovárico poliquístico (síndrome de Stein-Leventhal)) ya que tales enfermedades requieren una proliferación de células de los vasos sanguíneos para el crecimiento y/o la metástasis.
Además, algunos de estos compuestos pueden usarse como agentes activos contra quemaduras, enfermedad crónica de pulmón, apoplejía, pólipos, anafilaxis, inflamación crónica y alérgica, síndrome de hiperestimulación ovárico, edema cerebral asociado con tumor cerebral, edema pulmonar o cerebral inducido por la altitud, trauma o hipoxia, edema ocular y macular, ascitis, y otras enfermedades en las que la hiperpermeabilidad vascular, efusiones, exudados, extravasación proteica, o edema son manifestaciones de la enfermedad. Los compuestos serán útiles también en el tratamiento de trastornos en los que la extravasación conduce a la deposición de fibrina y matriz extracelular, provocando la proliferación del estroma (por ejemplo fibrosis, cirrosis, y síndrome de túnel carpiano).
Las VEGF son únicas en el sentido de que son los únicos factores de crecimiento angiogénico conocidos que contribuyen a la hiperpermeabilidad vascular y a la formación de edema. De hecho, la hiperpermeabilidad vascular y el edema que se asocian con la expresión o administración de muchos otros factores de crecimiento parecen estar mediadas por la producción de VEGF. Las citoquinas estimuladoras estimulan la producción de VEGF. La hipoxia produce un aumento notable de VEGF en varios tejidos, de ahí que las situaciones que implican infartos, oclusión, isquemia, anemia o impedimento circulatorio implican típicamente respuestas mediadas por VEGF/VPF. La hiperpermeabilidad vascular, edema asociado, intercambio transendotelial alterado y la extravasación molecular, que está acompañada a menudo de diapédesis, puede producir una deposición de matriz excesiva, proliferación anormal del estroma, fibrosis, etc. Por tanto, la hiperpermeabilidad mediada por VEGF puede contribuir significativamente a trastornos con estas características etiológicas.
Se prevé que los trastornos enumerados anteriormente estén mediados en gran medida por la actividad de la proteína tirosina quinasa que implica las KDR/VEGFR-2 y/o las Flt-1/VEGFR-1 tirosina quinasas. Inhibiendo la actividad de estas tirosina quinasas, se inhibe la progresión de los trastornos enumerados debido a que el componente angiogénico o de hiperpermeabilidad vascular del estado patológico se ve severamente restringido. La acción de los compuestos de esta invención, por su selectividad por tirosina quinasas específicas, produce una minimización de efectos secundarios que ocurrirían si se usaran tirosina quinasas menos selectivas.
Los compuestos de esta invención tienen actividad inhibidora de proteína quinasas. Estos es, estos compuestos modulan la transducción de señal mediante proteína quinasas. Los compuestos de esta invención inhiben proteína quinasas de las clases de tirosina y de serina/treonina quinasas. En particular, estos compuestos inhiben selectivamente la actividad de las tirosina quinasas KDR/FLK-1/VEGFR-2. Ciertos compuestos de esta invención inhiben también la actividad de tirosina quinasas adicionales tales como Flt-1/VEGFR-1, quinasas de la subfamilia Src tales como Lck, Src, fyb, yes, etc. Adicionalmente, algunos compuestos de la invención inhiben significativamente las serina/treonina quinasas tales como CDK que tienen un papel esencial en la progresión del ciclo celular. La potencia y especificidad de los compuestos genéricos de esta invención hacia una proteína quinasa particular pueden alterarse y optimizarse mediante variaciones en la naturaleza, cantidad y disposición de sustituyentes (i.e., R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6}) y de las restricciones conformacionales. Además, los metabolitos de ciertos compuestos también poseen una actividad inhibidora de proteína quinasas significativa.
Cuando se administran los compuestos de esta invención a individuos que necesitan tales compuestos, inhiben la hiperpermeabilidad vascular y la formación de edema en estos individuos. Se cree que los compuestos actúan inhibiendo la actividad de la KDR tirosina quinasa que está implicada en el proceso de hiperpermeabilidad vascular y de formación de edema. También se puede hacer referencia a la KDR tirosina quinasa como FLK-1 tirosina quinasa, NYK tirosina quinasa, o VEGFR-2 tirosina quinasa. La KDR tirosina quinasa se activa cuando el factor de crecimiento de célula endotelial vascular (VEGF) u otro ligando activante (tal como VEGF-C, VEGF-D o proteína HIV Tat) se une a un receptor de KDR tirosina quinasa que yace en la superficie de las células endoteliales vasculares. Después de la activación de la KDR tirosina quinasa, ocurre una hiperpermeabilidad de los vasos sanguíneos y el líquido se mueve del flujo sanguíneo a través de los vasos en los espacios intersticiales, formando por lo tanto un área de edema. A menudo la diapédesis acompaña a esta respuesta. De forma similar, la hiperpermeabilidad vascular excesiva puede interrumpir el intercambio molecular normal a través del endotelio en tejidos y órganos críticos (por ejemplo pulmón y riñón), causando por lo tanto extravasación macromolecular y deposición. Después de esta respuesta aguda a la estimulación de KDR que se cree que facilita el proceso angiogénico posterior, la estimulación prolongada de KDR tirosina quinasa produce la proliferación y quimiotaxia de células endoteliales vasculares y formación de nuevos vasos. Inhibiendo la actividad de la KDR tirosina quinasa, bloqueando la producción del ligando activador, bloqueando la unión del ligando al receptor de KDR tirosina quinasa, evitando la dimerización del receptor y la transfosforilización, inhibiendo la actividad enzimática de la KDR tirosina quinasa (inhibiendo la función de fosforilización de la enzima) o mediante algún otro mecanismo se interrumpe la señalización (D. Mukhopedhyay et al., Cancer Res. 58:1278-1284 (1998) y las referencias contenidas en ese documento), y puede inhibirse y minimizarse la hiperpermeabilidad, así como la extravasación asociada, la formación de edema posterior y la deposición de matriz, y las respuestas angiogénicas.
Un grupo de compuestos preferidos de esta invención tiene la propiedad de inhibir la actividad de la KDR tirosina quinasa sin inhibir significativamente la actividad de la Flt-1 tirosina quinasa (también se hace referencia a la Flt-1 tirosina quinasa como VEGFR-1 tirosina quinasa). La KDR tirosina quinasa y la Flt-1 tirosina quinasa se activan mediante la unión de VEGF a los receptores de KDR tirosina quinasa y a los receptores de Flt-1 tirosina quinasa, respectivamente. Como la actividad Flt-1 tirosina quinasa puede mediar eventos importantes en el mantenimiento endotelial y en la función vascular, una inhibición de esta enzima puede llevar a efectos tóxicos o adversos. Como mínimo, tal inhibición es innecesaria para bloquear las respuestas angiogénicas, para la inducción de hiperpermeabilidad vascular y para la formación de edema, así que es un desperdicio y no tiene valor para el individuo. Ciertos compuestos preferidos de la invención son únicos porque inhiben la actividad de un receptor-VEGF tirosina quinasa (KDR) que se activa activando ligandos pero no inhibe otros receptores de tirosina quinasas, tales como Flt-1, que también se activan mediante ciertos ligandos de activación. Los compuestos preferidos de esta invención son, por lo tanto, selectivos en su actividad inhibidora de tirosina quinasa.
Los compuestos de la presente invención son también útiles en el tratamiento de úlceras - úlceras bacterianas, producidas por hongos y de Mooren, y colitis ulcerativa.
Los compuestos de la presente invención son también útiles en el tratamiento de enfermedades en los que ocurre una angiogénesis no deseada, edema o deposición de estroma en infecciones víricas tales como Herpes simple, Herpes Zoster, SIDA, sarcoma de Kaposi, infecciones causadas por protozoos, y toxoplasmosis, seguidas de trauma, radiación, apoplejía, endometriosis, síndrome de hiperestimulación ovárica, lupus sistémico, sarcoidosis, sinovitis, enfermedad de Crohn, anemia de célula falciforme, enfermedad de Lyme, pénfigo, enfermedad de Paget, síndrome de hiperviscosidad, enfermedad de Osler-Weber-Rendu, inflamación crónica, enfermedad oclusiva pulmonar crónica, asma, artritis reumatoide y osteoartritis.
Los compuestos de la presente invención son también útiles en el tratamiento de trastornos oculares tales como edema ocular y macular, enfermedad neovascular ocular, escleritis, ceratotomía radial, uveítis, vitritis, miopía, cataratas, desprendimiento de retina crónico, complicaciones post-láser, conjuntivitis, enfermedad de Stargardt y enfermedad de Eales además de retinopatía y degeneración macular.
Los compuestos de la presente invención son también útiles en el tratamiento de trastornos cardiovasculares tales como ateroesclerosis, restenosis, oclusión vascular y enfermedad obstructiva de la carótida.
Los compuestos de la presente invención son también útiles en el tratamiento de indicaciones relacionadas con el cáncer tales como tumores sólidos, sarcomas (especialmente sarcoma de Ewing y osteosarcoma), retinoblastoma, rabdomiosarcomas, neuroblastoma, malignidades hematopoyéticas, incluyendo leucemia y linfoma, efusiones pleurales o pericárdicas inducidas por tumores, y ascitis malignos.
Los compuestos de la presente invención son también útiles en el tratamiento de trastornos diabéticos tales como glaucoma, retinopatía diabética y microangiopatía.
Se prevé que los trastornos enumerados anteriormente son mediados en gran medida por la actividad de la tirosina quinasa que implica los receptores VEGF (por ejemplo KDR y Flt-1). Inhibiendo la actividad de estos receptores de tirosina quinasas, se inhibe el progreso de los trastornos enumerados anteriormente ya que se restringe severamente el componente angiogénico del estado patológico. La acción de los compuestos de esta invención, por su selectividad por tirosina quinasas específicas, produce una minimización de efectos secundarios que ocurrirían si se usaran inhibidores de tirosina quinasas menos selectivos.
En otro aspecto, la invención proporciona compuestos de fórmula I como se ha definido anteriormente (incluyendo las condiciones) para uso como medicamentos, particularmente como inhibidores de la actividad de proteína quinasa, por ejemplo la actividad tirosina quinasa, la actividad de serina quinasa y la actividad de treonina quinasa. En todavía otro aspecto la presente invención proporciona el uso de compuestos de fórmula I como se ha definido anteriormente (incluyendo las condiciones) en la fabricación de un medicamento para usar en la inhibición de la actividad de proteína quinasas.
En esta invención, son aplicables las siguientes definiciones:
"Sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a aquellas sales que retienen la eficacia biológica y propiedades de las bases libres y que se obtienen por reacción con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido sulfónico, ácido carboxílico, ácido fosfórico orgánico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico, ácido láctico, ácido tartárico y similares.
"Alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifático saturado, incluyendo grupos lineales y ramificados que tienen de 1 a 4 carbonos.
"Alcoxi" se refiere a un grupo "O-alquilo" donde alquilo se define como se ha descrito anteriormente.
Formulaciones farmacéuticas
Los compuestos de esta invención pueden administrarse a un paciente humano por sí solos o en composiciones farmacéuticas en las que están mezclados con vehículos o excipientes a dosis para tratar o mejorar la hiperpermeabilidad vascular, edema y trastornos asociados. También pueden administrarse al paciente mezclas de estos compuestos como una mezcla simple o en composiciones farmacéuticas adecuadamente formuladas. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad de compuesto o compuestos suficiente para producir la prevención o atenuación de una neovascularización inapropiada, progresión de trastornos hiperproliferativos, edema, hiperpermeabilidad asociada con VEFD y/o hipotensión relacionada con VEGF. Pueden encontrarse técnicas para la formulación y administración de los compuestos de aplicación instantánea en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
Vías de administración
Las vías de administración pueden, por ejemplo, incluir administración oral, gotas oculares, rectal, transmucosa, tópica, o intestinal; administración parenteral incluyendo intramuscular, subcutánea, inyecciones intramedulares, así como inyección intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular.
Alternativamente, el medicamento se puede administrar de una forma local en vez de sistémica, por ejemplo, mediante inyección del compuesto directamente en un lugar edematoso, normalmente en una formulación de liberación de depósito o sostenida.
Además, el medicamento puede administrarse con un sistema de entrega dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico de célula endotelial.
Composición/formulación
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse de una manera conocida, por ejemplo, mediante procesos de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales.
Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la presente invención puede formularse de esta manera de una forma convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración seleccionada.
Para la inyección, los agentes de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en soluciones tampón fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución Ringer, o solución salina fisiológica. Para la administración transmucosa, se usan en la formulación penetrantes apropiados a la barrera a traspasar. Tales penetrantes son conocidos en la técnica.
Para la administración oral, los compuestos pueden formularse fácilmente combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales vehículos permiten que los compuestos de la invención se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones, y similares, para la administración oral a un paciente. Las preparaciones farmacéuticas para administración oral pueden obtenerse combinando el compuesto activo con un excipiente sólido, moliendo opcionalmente la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Algunos excipientes adecuados, en particular, son agentes de carga tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes, tales como pirrolidona de polivinilo reticulada, agar, o ácido algínico, o una sal del mismo tal como alginato sódico.
Los centros de pastillas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este propósito se pueden usar soluciones de azúcar concentrado, que pueden contener opcionalmente goma arábica, talco, pirrolidona de polivinilo, gel carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones lacadas, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Pueden añadirse tintes o pigmentos a los comprimidos o a los recubrimientos de pastillas para su identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.
Las composiciones farmacéuticas que pueden usarse oralmente incluyen cápsulas ajustadas hechas de gelatina, así como cápsulas suaves selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas ajustadas pueden contener los ingredientes activos en mezcla con agentes de relleno tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio, y opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas suaves, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para tal administración.
Para la administración por inhalación, los compuestos para usar de acuerdo con la presente invención se entregan convenientemente en forma de presentación de spray aerosol en paquetes presurizados o nebulizadores, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. EN el caso del aerosol presurizado la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula que suministra una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de por ejemplo gelatina para usar en un inhalador o insuflador que contienen una mezcla de polvos del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Los compuestos pueden formularse para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o contenedores multi-dosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o agentes de dispersión.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de compuesto activo en forma soluble en agua. Adicionalmente, pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como suspensiones de inyección oleosa apropiadas. Los disolventes lipófilos adecuados o vehículos incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de inyecciones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas.
Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril sin pirógenos, antes de usar.
Los compuestos pueden formularse también en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, conteniendo bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos pueden formularse también como una preparación depósito. Tales formulaciones de actuación a largo plazo pueden administrarse por implantación (por ejemplo de forma subcutánea o intramuscularmente o mediante inyección intramuscular). De esta forma, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o en resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo como una sal poco soluble.
Un ejemplo de vehículo farmacéutico para los compuestos hidrófobos de la invención en un sistema codisolvente que comprende alcohol bencílico, un sobrenadante no polar, un polímero orgánico mezclable en agua, y una fase acuosa. El sistema codisolvente puede ser el sistema codisolvente VPD. VPD es una solución de 3% p/v de alcohol bencílico, 8% p/v de polisorbato 80 de sobrenadante no polar y 65% p/v de polietilenglicol 300, completado en volumen con etanol puro. El sistema de codisolvente VPD (VPD:5W) consiste en VPD diluido 1:1 con un 5% de dextrosa en solución acuosa. Este sistema codisolvente disuelve bien compuestos hidrófobos, y genera poca toxicidad con la administración sistémica. Naturalmente, las proporciones de un sistema codisolvente pueden variar considerablemente sin destruir sus características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes del codisolvente puede cambiarse; por ejemplo, pueden usarse otros sobrenadantes no polares de baja toxicidad en lugar el polisorbato 80; puede cambiarse la proporción de polietilenglicol; otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar al polietilenglicol, por ejemplo, pirrolidona de polivinilo; y puede sustituirse la dextrosa por otros azúcares o polisacáridos.
Alternativamente, pueden emplearse otros sistemas de entrega para compuestos farmacéuticos hidrófobos. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos conocidos de vehículos o excipientes de entrega para medicamentos hidrófobos. Pueden emplearse también ciertos disolventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido, aunque normalmente a costa de mayor toxicidad. Adicionalmente, los compuestos pueden administrarse usando un sistema de liberación sostenida, tale como matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrófobos que contienen al agente terapéutico. Se han establecido diversos materiales de liberación sostenida y son conocidos por los especialistas en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza, liberar los compuestos desde unas pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, pueden emplease estrategias adicionales para la estabilización de la proteína.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender también vehículos o excipientes sólidos o de fase de gel adecuados. Ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen sin limitación o carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros tales como polietilenglicoles.
Muchos de los compuestos de molécula orgánica de la invención pueden proporcionarse como sales con contraiones farmacéuticamente aceptables. Pueden formarse sales farmacéuticamente aceptables con muchos ácidos, incluyendo sin limitación a ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros disolventes protónicos que en las correspondientes formas de base libre.
Dosificación eficaz
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para usar en la presente invención incluyen composiciones que contienen el ingrediente activo en una cantidad eficaz para conseguir su propósito propuesto. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad eficaz para prevenir el desarrollo de o para aliviar los síntomas existentes del sujeto en tratamiento. La determinación de las cantidades eficaces está dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica.
Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos celulares. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos celulares o animales para conseguir un intervalo de concentración circulante que incluye el IC_{50} como se determina en análisis celulares (i.e. la concentración del compuesto de prueba que consigue la mitad de la inhibición máxima de una actividad de una proteína quinasa dada). En algunos casos es apropiado determinar el IC_{50} en presencia de un 3 a 5% de albúmina de sérica ya que dicha determinación se aproxima a los efectos de unión de la proteína del plasma en el compuesto. Tal información puede usarse más específicamente para calcular dosificaciones útiles en seres humanos. Además, los compuestos más preferidos para la administración sistémica inhiben eficazmente la señalización de la proteína quinasa en células intactas a niveles que se pueden conseguir fácilmente en el plasma.
Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de compuesto que produce una mejora de los síntomas en un paciente. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos puede calcularse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para calcular la dosis máxima tolerada (MTF) y la ED_{50} (dosis eficaz para el 50% de respuesta máxima). La relación de dosificación entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación entre MTD y ED_{50}. Se prefieren Los compuestos que muestran altos índices terapéuticos. Los datos obtenidos de estos análisis de cultivos celulares y estudios con animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificaciones para seres humanos. La dosificación de tales compuestos reside preferiblemente en un intervalo de concentraciones circulantes que incluye el ED_{50} con poca o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada la vía de administración utilizada. La formulación exacta, vía de administración y dosificación puede seleccionarse por el médico concreto en vista del estado del paciente (Véase por ejemplo Fingl et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch1. p1). En el tratamiento de crisis, puede ser necesaria la administración de un bolo agudo o de una infusión cercana al MTD para obtener una respuesta rápida.
La cantidad de dosificación y el intervalo puede ajustarse individualmente para proporcionar niveles de plasma del resto activo que son suficientes para mantener los efectos moduladores de quinasa, o la concentración mínima eficaz (MEC). El MEC es distinto para cada compuesto pero puede estimarse con datos in vitro; por ejemplo, la concentración necesaria para conseguir un 50-90% de inhibición de proteína quinasas usando los análisis descritos en este documento. Las dosificaciones necesarias para conseguir la MEC dependerá de las características individuales y de la vía de administración. Sin embargo, pueden usarse análisis HPLC o análisis biológicos para calcular las concentraciones en plasma.
Los intervalos de dosificación pueden calcularse también usando el valor MEC. Los compuestos deben administrarse siguiendo un régimen que mantiene los niveles en plasma por encima del MEC en un 10-90% del tiempo, preferiblemente entre un 30-90% y más preferiblemente entre 50-90% hasta que se consigue la mejora deseada de los síntomas. En casos de administración local o toma selectiva, la concentración local eficaz del medicamento puede no estar relacionada con la concentración en plasma.
La cantidad de composición administrada dependerá, por supuesto, del sujeto a tratar, del peso del sujeto, la gravedad de la aflicción, la vía de administración y del juicio del médico que lo prescribe.
Empaquetado
Si se desea, las composiciones pueden presentarse en un envase o en un dispositivo dispensador que puede contener una o más unidades de dosificación que contienen el ingrediente activo. El envase puede contener por ejemplo papel de aluminio o plástico para envoltorios, tal como un paquete de blister. El envase o dispositivo dispensador puede acompañarse de instrucciones para la administración. También pueden prepararse las composiciones que comprenden un compuesto de la invención formuladas con un vehículo farmacéuticamente aceptable, colocarse en un recipiente adecuado, y etiquetarse para el tratamiento de una enfermedad indicada.
En algunas formulaciones puede ser beneficioso usar los compuestos de la presente invención en forma de partículas de tamaño muy pequeño, por ejemplo como las obtenidas moliendo por energía líquida.
Si se desea, en las composiciones de la presente invención el compuesto activo puede asociarse con otros ingredientes activos farmacológicamente aceptables. Por ejemplo, los compuestos de esta invención pueden administrarse en combinación con uno o más agentes farmacéuticos adicionales que inhiben o previenen la producción de VEGF, atenúan las respuestas intracelulares al VEGF, bloquean la transducción de la señal intracelular, inhiben la hiperpermeabilidad vascular, reducen la inflamación, o inhiben o previenen la formación de edema o la neovascularización. Los compuestos de la invención pueden administrarse antes de, posterior a, o simultáneamente con el agente farmacéutico adicional, sea cual sea la vía de administración apropiada. Los agentes farmacéuticos adicionales incluyen sin limitación a esteroideos anti-edémicos, NSAID, inhibidores de ras, agentes anti-TNF, agentes anti-IL1, antihistamínicos, antagonistas PAF, inhibidores de COX-1, inhibidores de COX-2, inhibidores de NO sintasa, inhibidores de PKC e inhibidores de PI3 quinasa. Los compuestos de la invención y los agentes farmacéuticos adicionales actúan aditivamente o sinérgicamente. De esta forma, la administración de tal combinación de sustancias que inhiben la hiperpermeabilidad vascular y/o inhiben la formación de edema puede proporcionar un mayor alivio de los efectos perjudiciales de un trastorno hiperproliferativo, angiogénesis, hiperpermeabilidad vascular o un edema que la administración de cada sustancia por separado. En el tratamiento de trastornos malignos se anticipan las combinaciones con quimioterapias antiproliferativas o citotóxicas.
La presente invención también comprende el uso de un compuesto de fórmula I como un medicamento.
Las familias Src y Syk de quinasas tienen un papel pivotal en la regulación de la función inmune. La familia Src incluye actualmente Fyn, Fgr, Fes, Lyn, Src, Yes, Hck, y Blk. La familia Syk se cree actualmente que sólo incluye Zap y Syk. La familia Janus de quinasas está implicada en la transducción del factor de crecimiento y en las señales de citoquina proinflamatoria a través de varios receptores. Aunque BTK y ITK, miembros de la familia Tec de quinasas, tienen un papel menos comprendido en la inmunobiología, su modulación con un inhibidor puede probarse terapéuticamente beneficiosa. Las quinasas RIP, IRAK-1, IRAK-2, NIK, IKK-1, y IKK-2 están implicadas en los caminos de transducción de señal para las citoquinas proinflamatorias claves TNF y IL-1. En virtud de sus capacidad para inhibir una o más de estas quinasas, los compuestos de fórmula I funcionan como agentes inmunomoduladores útiles para el mantenimiento de aloinjertos y el tratamiento de trastornos autoinmunes. Mediante la capacidad para regular la activación de las células T o la potenciación de un proceso inflamatorio, estos compuestos podrían usarse también para tratar tales enfermedades autoinmunes. Los transplantes debidos al fenómeno de rechazo, de hospedador frente a injerto de órganos sólidos o de injerto frente a hospedador de médula ósea, están limitados por la toxicidad de los agentes inmunosupresores disponibles actualmente y se beneficiarían de un medicamento beneficioso con un mejor índice terapéutico. Los experimentos dirigidos a gentes han demostrado el papel esencial de Src en la biología de osteoclastos, las células responsables de la resorción del hueso. Los compuestos de fórmula I, mediante su capacidad para regular Src, pueden ser útiles también en el tratamiento de osteoporosis, osteopetrosis, enfemedad de Paget, hipercalcemia inducida por tumor y en el tratamiento de metástasis óseas.
Se ha demostrado que varias proteínas quinasas son protooncógenas. La ruptura de cromosoma (en el punto de ruptura de la ltk quinasa en el cromosoma 5), translocación como en el caso del gen Abl con BCR (cromosoma Philadelphia), truncación en casos tales como c-Kit o EGFR, o mutación (por ejemplo, Met) resultan en la creación de proteínas no reguladas transformándolos de productos protooncógenos en oncógenos. En otros tumores, la oncogéneis está conducida por las interacciones entre un ligando autocrino o paracrino y un receptor de factor de crecimiento. Los miembros de la familia src quinasas están típicamente implicados en la transducción de la señal corriente abajo potenciando por lo tanto la oncogénesis y ellos mismos pueden hacerse oncógenos por sobreexpresión o mutación. puede interrumpirse el proceso patológico inhibiendo la actividad proteína quinasa de estas proteínas. La restenosis vascular puede implicar un proceso de proliferación celular endotelial y del músculo liso provocado por FGF y/o PDGF. La inhibición de la actividad FGFr o PDGFr quinasa puede ser una estrategia eficaz para inhibir este fenómeno. De esta forma, los compuestos de fórmula I que inhiben la actividad quinasa dec-kit, c-met, c-fms, miembros de la familia src, EGFr, erbB2, erbB4, BCR-Abl, PDGFr, FGFr y otros receptores o tirosina quinasas citosólicas normales o anormales pueden ser valiosos en el tratamiento de trastornos proliferativos benignos y neoplásticos.
En muchos trastornos patológicos (por ejemplo tumores sólidos primarios, y metástasis, sarcoma de Kaposi, artritis reumatoide, ceguera debido a neovascularización ocular inapropiada, psoriasis y ateroesclerosis) la progresión de la enfermedad depende de una angiogénesis persistente. Los factores de crecimiento polipéptidos producidos a menudo por el tejido de la enfermedad o las células inflamatorias asociadas, y sus correspondientes receptores de tirosina quinasas específicos de células endoteliales (por ejemplo KDR/VEGFR-2, Flt- 1/VEGFR-1, Tie-2/Tek y Tie) son esenciales para la estimulación del crecimiento de células endoteliales, migración, organización, diferenciación y establecimiento de la nueva vasculatura funcional requerida.
Como resultado de la actividad del "factor de permeabilidad vascular" de VEGF en la mediación de la hiperpermeabilidad vascular, la estimulación VEGF de una VEGFR quinasa se cree que juega también un papel importante en la formación de ascitis tumorales, edema cerebral y pulmonar, efusiones pleurales y miocárdicas, reacciones de hipersensibilidad de tipo retrasado, edema en el tejido y disfunción orgánica después de trauma, quemaduras, isquemia, complicaciones diabéticas, endometriosis, síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos (ARDS), hipotensión relacionada con bypass post-cardiopulmonar e hiperpermeabilidad, y edema ocular que conduce a glaucoma o ceguera por neovascularización inapropiada. Además de VEGF, los recientemente identificados VEGF-C y VEGF-D y la proteína Hiv-Tat puede causar también una respuesta de hiperpermeabilidad vascular a través de la estimulación de una VEGFR quinasa.
La Tie-2 se expresa también en una población selecta de células de tallo hematopoyéticas es las cuales puede tener un papel en su reclutación, adhesión, regulación y diferenciación (Blood 89, 4317-1326 (1997)), esta población de expresión de Tie-2 puede servir como progenitores circulantes angiogénicos endoteliales. Ciertos agentes de acuerdo con la fórmula I capaces de bloquear la actividad quinasa de quinasas específicas de células endoteliales podrían por lo tanto inhibir la progresión de la enfermedad que implican estas situaciones.
Los compuestos de fórmula I o una sal de los mismos o las composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de los mismos pueden usarse en el tratamiento de trastornos proliferativos benignos y neoplásticos y trastornos del sistema inmune. Tales enfermedades incluyen trastornos autoinmunes tales como artritis reumatoide, tiroiditis, diabetes de tipo I, esclerosis múltiple, sarcoidosis, enfermedad inflamatoria intestinal, miastenia gravis y lupus sistémico eritomatoso; psoriasis, rechazo de órgano transplantado (por ejemplo rechazo de riñón, enfermedad de injerto frente a hospedador), enfermedades proliferativas benignas y neoplásicas, cánceres en seres humanos, tales como cáncer de pulmón, pecho, estómago, vejiga, colon, páncreas, ovario, próstata y rectal y células hematopoyéticas (leucemia y linfoma), y enfermedades que implican una vascularización inapropiada como por ejemplo retinopatía diabética, neovascularización coroidal por degeneración macular relacionada con la edad, y hemangiomas infantiles en seres humanos. Además, tales inhibidores puede ser útiles en el tratamiento de trastornos que implican edemas, ascitis, efusiones y exudados mediados por VEGF, por ejemplo edema macular, edema cerebral, y síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos (ARDS).
Los compuestos de la presente invención pueden ser útiles también en la profilaxis de las enfermedades anteriores.
Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula I o una sal del mismo en la fabricación de un medicamento para tratar la hiperpermeabilidad vascular, trastornos dependientes de la angiogénesis, trastornos proliferativos yo trastorno del sistema inmune en mamíferos, particularmente seres humanos.
La presente invención también proporciona un método para tratar hiperpermeabilidad vascular, neovasculariazción inapropiada, trastornos proliferativos y/o trastornos del sistema inmune que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I a un mamífero, particularmente un ser humano, en necesidad del mismo.
La potencia in vitro de los compuestos en la inhibición de estas proteína quinasas puede calcularse por los procedimientos descritos a continuación.
La potencia de los compuestos puede determinarse con la cantidad de inhibición de la fosforilación de un sustrato exógeno (por ejemplo, un péptido sintético (Z. Songyang et al., Nature. 373:536-539) mediante un compuesto de prueba relativo al control.
Producción de KDR tirosina quinasa usando un sistema de baculovirus
La secuencia de codificación del dominio intra-celular de KDR humana (aa789-1354) se generó con PCR usando ADNc aislado de células HUVEC. También se introdujo una secuencia poly-His6 en el extremo N de la proteína. Este fragmento se clonó en un vector de transfección pVL1393 en la posición Xba1 y Not 1. Se generó un baculovirus recombinante (BV) a través de co-transfección usando el reactivo de Transfección BaculoGold (PharMingen). El BV recombinante se purificó en placas y se verificó con un análisis Western. Para la producción de proteína, se desarrollaron células SF-9 en medio SF-900-II a 2 x 106/ml, y se infectaron a 0,5 unidades de formación de placas por célula (MOI). Las células se recogieron 48 horas después de la infección.
Purificación de KDR
Las células SF-9 que expresan (His)_{6}KDR(aa789-1354) se lisan añadiendo 50 ml de solución tampón Triton X-100 de lisis (20 mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10% glicerol, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 10 \muh/ml aprotinina, 1 \mug/ml leupeptina) a la célula de 1 l de cultivo celular. El lisado se centrifugó a 19.000 rpm en un rotor Sorval SS-34 durante 30 minutos a 4ºC. EL lisado celular se aplicó a una columna Sepharose quelante de 5 ml de NiCl_{2}, equilibrada con HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,3 M. El KDR se eluyó usando la misma solución tampón que contenía imidazol 0,25 M. Las fracciones de la columna se analizaron usando SDS-PAGE y un análisis ELISA (a continuación) que mide la actividad quinasa. El KDR purificado se intercambió en una solución tampón HEPES 25 mM, pH 7,7, NaCl 25 mM, DTT 5mM y se almacenó a -80ºC.
Producción y purificación de Tie-2 quinasa humana
La secuencia de codificación del dominio intra-celular de KDR humana (aa775-1124) se generó con PCR usando ADNc aislado de placenta humana. Se introdujo una secuencia poly-His6 en el extremo N y esta construcción se clonó en un vector de transfección pVL1939 en la posición Xba1 y Not 1. Se generó un baculovirus recombinante (BV) a través de co-transfección usando el reactivo de Transfección BaculoGold (PharMingen). El BV recombinante se purificó en placas y se verificó con un análisis Western. Para la producción de proteína, se desarrollaron células SF-9 de insectos en medio SF-900-II a 2 x 106/ml, y se infectaron a MOI de 0,5. La purificación de la quinasa marcada His usada en la selección fue análoga a la descrita para KDR.
Producción y purificación de Flt-1 tirosina quinasa humana
Se usó un vector de transfección pVL1393 (PharMingen, Los Ángeles, CA). Se colocó una secuencia de nucleótidos que codificaba poly-His6 5' en la región de nucleótidos que codifican todo el dominio intracelular de la quinasa de la Flt-1 humana (aminoácidos 786-1338). La secuencia de nucleótidos que codifican el dominio quinasa se generó con PCR usando bibliotecas de ADNc aislado de células HUVEC. Los restos histidina permitieron una purificación por afinidad de la proteína de una manera análoga a la de KDR y AP70. Se infectaron células SF-9 de insectos con una multiplicidad de 0,5 y se recogieron 48 horas después de la infección.
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Fuente de la EGFR tirosina quinasa
La EGFR se adquirió en Sigma (Cat No. E-3641); 500 unidades/50 \mul) y el ligando EGF se adquirió en Oncogene Research Products/Calbiochem (Cat. No. PF011-100).
Expresión de ZAP70
Se usó un vector de transfección pVL1393 (PharMingen, Los Ángeles, CA). Se colocó una secuencia de nucleótidos que codificaba los aminoácidos M(H)6 LVPR_{9}S se colocó 5' en la región que codifica todo el ZAP70 (aminoácidos 1-619). La secuencia de nucleótidos que codifican el dominio ZAP70 se generó con PCR usando bibliotecas de ADNc aislado de células T Jurkat inmortalizadas. Los restos histidina permitieron una purificación por afinidad de la proteína (vide infra). El puente LVPR_{9}S constituye una secuencia de reconocimiento para la escisión proteolítica con trombina, permitiendo retirar la marca de afinidad de la enzima. Se infectaron células SF-9 de insectos con una multiplicidad de infección de 0,5 y se recogieron 48 horas después de la infección.
Extracción y purificación de ZAP70
Las células se lisan en una solución tampón que consistía en Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 137 mM, 10% glicerol, 1% Triton X-100, PMSF 1 mM, 10 \mug/ml aprotinina, 1 \mug/ml leupeptina y ortovanadato sódico 1 mM). El lisado se aplicó a una columna Sepharose quelante HiTrap (Pharmacia) equilibrada con HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,3 M. La proteína de fusión se eluyó con imidazol 0,25 M. La enzima se almacenó en una solución tampón que contenía HEPES 25 mM, pH 7,7, NaCl 50 mM, pH 7,5 NaCl 50 mM y DTT 5 mM.
Fuente de Lck
El Lck o las formas truncadas de Lck pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo de Upstate Biotechnology Inc. (Saranac Lake, N.Y.) y Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), o purificarse de fuentes naturales o recombinantes usando métodos convencionales.
Fuente de Cdc2
La enzima humana recombinante y la solución tampón de ensayo pueden obtenerse comercialmente (New England Biolabs, Beverly, MA. USA), o purificarse de fuentes naturales o recombinantes usando métodos convencionales.
Análisis de Cdc2
El protocolo usando fue el proporcionado con los reactivos comprados con modificaciones menores. En resumen, la reacción se realizó en una solución tampón que consistía en Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EFTA 1 mM, DTT 2 mM, Brij 0,15%, DMSO 5% y MgCl_{2} 10 mM (solución tampón comercial) suplementada con concentraciones finales de ATM 300 \muM fresco (31 \muCi/ml) y 30 \mug/ml de histona tipo III. Se ensayó un volumen de reacción de 80 \mul, conteniendo unidades de enzima, durante 20 minutos a 25 grados C en presencia o ausencia de un inhibidor. La reacción se terminó añadiendo 120 \mul de ácido acético al 10%. El sustrato se separó de la marca no incorporada mediante inspección visual en papel de fosfocelulosa, seguido de 3 lavados de 5 minutos cada uno con ácido fosfórico 75 mM. Las cuentas se midieron con un contador beta en presencia de un líquido de escintilación.
Ciertos compuestos de esta invención inhiben significativamente cdc2 a concentraciones por debajo de 50 \muM.
Fuente de la PKC quinasa
La subunidad catalítica de PKC puede obtenerse comercialmente (Calbiochem)
Análisis de PKC quinasa
Se empleó un análisis radioactivo de quinasa siguiendo un procedimiento publicado (Yasuda, I. Kirshimoto, A., Tanaka, S., Tominaga, M., Sakurai, A., Nishizuka, Y. Biochemical and Biophysucak Research Communication 3:166, 1220-1227 (1990)). En resumen, todas las reacciones se realizaron en una solución tampón quinasa consistente en Tris-HCl 50 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 2 mM, EGTA 1 mM, ATP 100 \muM, péptido 8 \muM, DMSO al 5% y ^{33}P ATP (8 Ci/mM). El compuesto y la enzima se mezclaron en el recipiente de la reacción y la reacción se inició añadiendo la mezcla de ATP y sustrato. Después de la terminación de la reacción por adición de 10 \mul de solución tampón de parada (ATP 5 mM en ácido fosfórico 75 mM), se reconoció una porción de la mezcla en filtros de fosfocelulosa. Las muestras reconocidas se lavaron 3 veces en ácido fosfórico 75 mM a temperatura ambiente durante 5 a 15 minutos. La incorporación de radiomarcas se cuantificó por conteo de escintilación líquida.
Fuente de la enzima Erk2
La enzima recombinante murina y la solución tampón de ensayo pueden obtenerse comercialmente (New England Biolabs, Beverly, Ma. USA) o purificarse de fuentes naturales o recombinantes usando métodos convencionales.
Análisis de enzima Erk2
En resumen, la reacción se realizó en una solución tampón consistente en Tris-HCl 50 mM pH 7,5, EGTA 1 mM, DTT 2 mM, Brij al 0,01%, DMSO al 5% y MgCl_{2} 10 mM (solución tampón comercial) suplementada con aTM 100 \muM (31 \muCi/ml) y 30 \muM de proteína de mielina básica en las condiciones recomendadas por el suministrador. Los volúmenes y métodos del análisis incorporaron radioactividad como se ha descrito para el análisis PKC. (vide supra).
Análisis inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para PTK
Se usaron análisis inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para detectar y medir la presencia de actividad tirosina quinasa. Los análisis ELISA se realizaron de acuerdo con protocolos conocidos que se describen por ejemplo, en Voller, et al., 1980, "Enzyme-Linked Imunosorbent Assay", en Manual of Clinical Immunology, 2d ed, editado por Rose y Friedman, páginas 359-371 Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C.
El protocolo descrito se adaptó para calcular la actividad con respecto a un PTK específico. Por ejemplo, se proporcionan a continuación protocolos preferidos para realizar los experimentos ELISA. La adaptación de estos protocolos para determinar la actividad de un compuesto para otros miembros de la familia de receptores PTK, así como tirosina quinasas no receptoras, entran dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica. Para el propósito de determinar la selectividad de inhibidor, se usó un sustrato PTK universal (por ejemplo, un copolímero aleatorio de poli(Glu_{4}Tyr), con un peso molecular de 20.000-50.000) junto con ATP (típicamente 5 \muM) a concentraciones aproximadamente dos veces mayores que la Km aparente en el ensayo.
Se usó el siguiente procedimiento para analizar en efecto inhibitorio de compuestos de esta invención en la actividad de la KDR, Flt-1, Tie-2, EGFR y ZAP70 tirosina quinasa.
Tampones y soluciones
PGT: Poly(Glu, Tyr) 4:1
Almacenar el polvo a -20ºC. Disolver el polvo en solución tampón salina de fosfato (PBS) para dar una solución de 50 mg/ml. Almacenar porciones de 1 ml a -20ºC. Al hacer las placas, diluir a 250 \mug/ml en Gibco PBS.
Solución tampón de reacción: Hepes 100 mM, MgCl_{2} 20 mM, MnCl_{2} 4 mM, DTT 5mM, BSA al 0,02%, NaVO_{4} 200 \muM, pH 7,10
ATP: Almacenar porciones de 100 mM a -20ºC. Diluir a 20 \muM en agua
solución tampón de lavado: pbs con tween 20 al 0,1%
Solución tampón de dilución de anticuerpos: Albúmina de suero bovino al 0,1% (BSA) en PBS.
Sustrato TMB: mezclar el sustrato TMB y soluciones de Peróxido 9:1 justo antes de usar o usar Sustrato K-Blue de Neogen.
Solución de parada: Ácido fosfórico 1M.
Procedimiento
1. Preparación de placa
Diluir el stock PGT (50 mg/ml, congelado) en PBS a 250 \mug/ml. Añadir 125 \mul por pozo de placas ELISA Corning modificadas de fondo liso y de alta afinidad (Corning No. 25805-96). Añadir 125 \mul de PBS a los pocillos vacíos. Cubrir con cinta de sellar e incubar durante una noche a 37ºC. Lavar 1 x con 250 \mul de solución salina de lavado y secar durante aproximadamente 2 horas en un incubador seco a 37ºC. Almacenar las placas recubiertas en una bolsa cerrada herméticamente a 4ºC hasta su uso.
2. Reacción de la tirosina quinasa
Preparar soluciones de inhibidor a una concentración 4x en DMSO al 20% en agua.
Preparar la solución tampón de reacción.
Preparar la solución de enzima de tal forma que las unidades deseadas estén en 50 \mul, por ejemplo para KDR preparar a 1 ng/\mul para un total de 50 ng por pocillo en las reacciones. Almacenar en hielo.
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Añadir 50 \mul de la solución de enzima por pocillo (típicamente 5-50 ng enzima/pocillo dependiendo de la actividad específica de la quinasa)
Añadir 25 \mul 4x inhibidor
Añadir 25 \mul 4X ATP para el análisis de inhibidor
Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente
Interrumpir la reacción añadiendo 50 \mul de HCl 0,5 N por pocillo
Lavar la placa
** Concentración Final para la Reacción: ATP 5 \muM, DMSO al 5%.
3. Unión de anticuerpos
Diluir una porción de 1 mg/ml de anticuerpo PY20-HRP (Pierce) (un anticuerpo de fosfotirosina) a 50 ng/ml en BSA al 0,1% en PBS mediante una dilución en 2 etapas (100x, después 200x). Añadir 100 \mul de Ab por pocillo. Incubar 1 hora a temperatura ambiente. Incubar 1 hora a 4ºC. Lavar la placa cuatro veces.
4. Reacción de color
Preparar el sustrato TMB y añadir 100 \mul por pocillo
Controlar OD a 650 nm hasta que se alcance 0,6
Interrumpir con ácido fosfórico 1 M. Agitar en el lector de placas.
Leer inmediatamente la OD 450 nm.
Los tiempos de incubación óptimos y las condiciones de reacción enzimática pueden variar ligeramente con las preparaciones de enzimas y se determinan empíricamente para cada lote.
Para Lck, la solución tampón utilizada fue MOPSO 100 mM, pH 6,5 MnCl_{2} 4 mM, MgCl_{2} 20 mM, DTT 5 mM, BSA al 0,2%, NaVO_{4} 200 mM, bajo condiciones de ensayo análogas.
Los compuestos de fórmula I pueden tener utilidad terapéutica en el tratamiento de enfermedades que implican proteína tirosina quinasas identificadas, incluyendo las que no se han mencionado en este documento, y las proteína tirosina quinasas no identificadas que se inhiben con compuestos de fórmula I. Todos los compuestos ejemplificados en este documento inhiben significativamente la KDR quinasa a concentraciones de 50 micromoles o menos. Algunos compuestos de esta invención también inhiben significativamente otras PTK tales como lck a concentraciones de 50 micromoles o menos.
Modelos in vitro para la activación de células T
Después de la activación con mitógenos o antígenos, las células T son inducidas a secretar IL-2, un factor de crecimiento que apoya su fase proliferativa posterior. Por lo tanto, se puede medir la producción de IL-2 con células T primarias o la proliferación celular de células T primarias o líneas de células T apropiadas como un sustituto para la activación de células T. Ambos análisis están descritos en la literatura y sus parámetros están bien documentados (en Current Protocols in Immunology, Vol 2, 7.10.1-7.11.2).
En resumen, las células T puede activarse mediante co-cultivo con células estimulantes alogénicas, un proceso designado como reacción de un sentido de linfocitos mezclados. Las células respondedoras y las células mononucleares de sangre periférica se purifican mediante gradiente Ficoll-Hypaque (Pharmacia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células estimulantes se inactivan mitóticamente mediante tratamiento con mitomicina C (Sigma) o irradiación gamma. Las células respondedoras y estimulantes se co-cultivan en una relación de dos a uno en presencia o ausencia del compuesto de prueba . Normalmente se mezcla 10^{5} respondedoras con 5 x 10^{4} estimulantes y se colocan en una placa (volumen 200 \mul) de microtitulación con fondo U (Costar Scientific). Las células se cultivan en un RPMI 1640 suplementado con suero bovino inactivado por calor (Hyclone Laboratories), o en suero humano AB de donantes masculinos, 2 mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M y DMSO al 5%. Los cultivos se impulsan con 0,5 \muCi de timidina ^{3}H (Amersham) un día antes de la recogida (normalmente el día tres). Los cultivos se recogen (recogedor Betaplate, Wallac) y se evalúa la toma de isótopos mediante escintilación líquida (Betaplate, Wallac).
El mismo sistema de cultivo puede usarse para evaluar la activación de células T midiendo la producción de IL-2. De ocho a veinticuatro horas después del inicio del cultivo, los sobrenadantes se retiran y se mide la concentración de IL-2 mediante ELIDA (Sistemas R y D) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Modelos in vivo de activación de células T
La eficacia in vivo de los compuestos puede probarse en modelos de animales conocidos para medir directamente la activación de células T o para los que se ha probado que las células T son efectores. Las células T pueden activarse in vivo la porción constante del receptor de la célula T con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Ab). En este modelo, se administra a ratones BALB/c 10 \mug de Ab anti-CD3 de forma intraperitoneal dos horas antes de la extracción de sangre.
Los animales que van a recibir un medicamento de prueba se pre-tratan con una dosis única del compuesto una hora antes de la administración del Ab anti-CD3. Se miden mediante ELISA los niveles en suero de las citoquinas proinflamatorias interferon-\gamma (IFN-\gamma) y el factor \alpha de necrosis tumoral (TNF-\alpha), indicadores de la activación de células T. Un modelo similar emplea el cebado de células T in vivo con un antígeno específico tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) seguido de un proceso in vivo de drenar las células en los nodos linfáticos con el mismo antígeno. Como se ha descrito previamente, se usa la medida de la producción de citoquina para evaluar el estado de activación de los cultivos de células. En resumen, los ratones C57BL/6 se inmunizan subcutáneamente con 100 \mug de KLH emulsionada en adyuvante completo de Freund (CFA) en el día cero. Los animales se pretratan con el compuesto un día antes de la inmunización y posteriormente en el día uno, dos, y tres después de la inmunización. Los nodos linfáticos de drenaje se recogen en el día 4 y se cultivan sus células a 6 x 10^{6} por ml en medio de cultivo en tejido (RPMI 1640 suplementado con suero bovino inactivado por calor (Hyclone Laboratories), 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5}M y DMSO al 0,5%) durante 24 horas y 48 horas. Los sobrenadantes del cultivo se hacen análisis mediante ELISA de factor de crecimiento de células T autocrinas Interleuquina-2 (IL-2) y/o niveles de IFN-\gamma.
Los compuestos de plomo también pueden probarse en modelos animales de enfermedades humanas. Estos se ejemplifican con la encefalomielitis auto-inmune experimental (EAE) y la artritis inducida por colágeno (CIA). Los modelos EAE que imitan aspectos de la esclerosis múltiple en humanos se han descrito en ratas y ratones (FASEB J. revisado, 5:2560-566, 1991; modelo de murina: Lab. Invest. 4(3): 278, 1981; modelo en roedores: J. Immunol 146(4):1163-8, 1191). En resumen, las ratas o ratones se inmunizan con una emulsión de proteína básica de mielina (MBP) o derivados péptidos neurogénicos de la misma, y CFA. Pueden inducirse una enfermedad aguda con la adición de toxinas bacterianas tales como bordetella pertussis. La enfermedad remitente se induce por transferencia adoptiva de células T de animales inmunizados con MBP/péptido.
La CIA puede inducirse en ratones DBA/1 por inmunización con colágeno tipo II (J. Immunol:142(7):2239-2243). Los ratones desarrollarán signos de artritis tan pronto como 10 días después de la prueba de antígenos y pueden evaluarse hasta 90 días después de la inmunización. En los modelos de EAE y CIA, puede administrarse un compuesto profilácticamente o en el momento de la activación de la enfermedad. Los medicamentos eficaces deberían reducir la gravedad y/o la incidencia.
Ciertos compuestos de esta invención que inhiben uno o más receptores angiogénicos PTK, y/o una proteína quinasa tal como lck implicada en mediar respuestas inflamatorias pueden reducir la gravedad y la incidencia de la artritis en estos modelos.
Los compuestos pueden probarse también en modelos de injertos en ratones, de piel (revisado en Ann. Rev. Immunol., 10:333-58, 1992; Transplantation: 57(12): 1701-17D6, 1994) o corazón (Am. J. Anat.: 113:273, 1963). En resumen, se transplantan injertos de piel de espesor total de ratones C57BL/6 a ratones BALB/c. Los injertos se examinan diariamente, empezando el día seis, buscando evidencias de rechazo. En el modelo de transplante cardiaco neonatal, los corazones neonatales se transplantan de forma ectópica de ratones C57BL/6 a la pinna de la oreja de ratones adultos CBA/J. Los corazones empiezan a latir de cuatro a siete días después del transplante y el rechazo puede evaluarse visualmente usando un microscopio de disección para comprobar el cese del latido.
Análisis celulares de receptores PTK
Se usó el siguiente análisis celular para calcular el nivel de actividad y el efecto de los distintos compuestos de la presente invención en KDR/VEGFR2. Pueden diseñarse análisis celulares de receptor PTK empleando un estímulo de un ligando específico en la misma línea que otras tirosina quinasas usando métodos bien conocidos en la
técnica.
Fosforilación de KDR inducida por VEGF en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) medida por transferencia de Western
1. Se adquirieron células HUVEC (de varios donantes) en Clonetics (San Diego, CA) y se cultivaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Sólo se utilizaron los primeros pasos (3-8) para este análisis. Las células se cultivaron en placas de 100 mm (Falcon para cultivos de tejido; Becton Dickinson; Plymouth, England) usando medio EBM completo (Clonetics).
2. Para evaluar la actividad inhibidora de un compuesto, las células se trataron con tripsina y se plantaron a 0,5-1,0 x 10^{5} células/pocillo en cada pocillo de placas cluster de 6 pocillos (Costar; Cambridge, MA).
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3. 3-4 días después de plantar, las placas eran confluentes al 90-100%. El medio se retiró de todos los pocillos, las células se aclararon con 5-10 ml de PBS y se incubaron 18-24 horas con 5 ml de medio base EBM sin añadir ningún suplemento (i.e. inanición sérica).
4. Se añadieron diluciones seriales en 1 ml de medio EBM (concentraciones finales de 25 \muM, 5 \muM, o 1 \muM) a células y se incubaron durante una hora a 37ºC. Después se añadió VEGF_{165} humano recombinante (R&D Systems) a todos los pocillos en 2 ml de medio EBM a una concentración final de 50 ng/ml y se incubó a 37ºC durante 10 minutos. Las células de control no tratadas o tratadas con VEGF se usaron solamente para evaluar los antecedentes de fosforilación y la inducción de fosforilación de la VEGF.
Después, todos los pocillos se aclararon con 5-10 ml de PBS frío que contenía Ortovanadato Sódico 1 mM (Sigma) y las células se lisaron y se rasparon en 200 \mul de solución tampón RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 7, NaCl 150 mM, NP-40 al 15%, desoxicolato sódico al 0,25%, EDTA 1 mM) que contenía inhibidores de proteasa (PMSF 1mM, aprotinina 1 \mug/ml, pepstatina 1 \mug/ml, leupeptina 1 \mug/ml, vanadato sódico 1 mM, fluoruro sódico 1 mM, y 1 \mug/ml de Dnase (todos los productos químicos de Sigma Chemical Company, St Louis, M). El lisado se centrifugó a 14.000 rpm durante 30 minutos, para eliminar los núcleos.
Después, se precipitaron cantidades iguales de proteínas por adición de Etanol frío (-20ºC) (2 volúmenes) durante un mínimo de 1 hora o un máximo de una noche. Los gránulos se reconstituyeron en solución tampón de muestra Laemli que contenía \beta-mercaptoetanol al 5% (BioRad; Hercules, CA) y se hirvió durante 5 minutos. Las proteínas se resolvieron por electroforesis de gel de poliacrilamida (6%, 1,5 mm Novex, San Diego, CA) y se traspasaron a una membrana de nitrocelulosa usando el sistema Novex. Después de bloquear con albúmina de suero bovino (3%), las proteínas se sondaron durante una noche con anticuerpo policlonal anti-KDR (C20, Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA) o con un anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) a 4ºC. Después de lavar e incubar durante 1 hora con F(ab)_{2} conjugado con HRP de IgG cabra anti-conejo o cabra-anti-ratón, las bandas se visualizaron usando el sistema de quimioluminiscencia de emisión (ECL) (Amersham Life Sciences, Arlington Height, IL).
Ciertos ejemplos de la presente invención inhiben significativamente la fosforilación celular de KDR tirosina quinasa inducida con VEGF a concentraciones de menos de 50 \muM.
Modelo in vivo de edema uterino
Este ensayo mide la capacidad de los compuestos para inhibir el aumento agudo de peso uterino en ratones que ocurre en las primeras horas después de una estimulación con estrógenos. Se sabe que el rápido aumento del peso uterino se debe a un edema causado por la mayor permeabilidad de la vasculatura uterina. Cullinan-Bove y Koss (Endocrinology (1993), 133:829-837) demostraron una relación temporal cercana del edema uterina estimulado con estrógenos con la mayor expresión de ARNm VEGF en el útero. Estos resultados se han confirmado con el uso de anticuerpos monoclonales neutralizantes con VEGF que redujo significativamente el aumento agudo en el peso uterino después de la estimulación con estrógenos (documento WO 97/42187). Por tanto, este sistema puede servir como un modelo para la inhibición in vivo de las señales VEGF y la hiperpermeabilidad asociada y el edema.
Materiales
Todas las hormonas se compraron en Sigma (St. Louis, NO) o Cal Biochem (La Jolla, CA) en forma de polvos liofilizados y se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Componentes del vehículo
(DMSO, Cremaphor EL) se compró en Sigma (St. Louis, MO).
Los ratones (Balb/c, de 8-12 semanas) se compraron en Taconic (Germantown, NY) y se alojaron en una instalación para animales sin patógenos de acuerdo con las Animal Care and Use Comitee Guidelines institucionales.
Método
Día 1: Los ratones BALB/C se inyectaron de forma intaperitoneal 12,5 unidades de gonadotropina sérica de yegua gestante (PMSG)
Día 3: Los ratones recibieron 15 unidades de gonadotropina goriónica humana (hCG) i.p.
Día 4: Los ratones se dividieron de forma aleatoria en grupos de 5-10. Los compuestos de prueba se administraron por vía i.p, i.v. o p.o. dependiendo de la solubilidad y del vehículo a dosis en el intervalo de 1-100 mg/kg. El grupo de control de vehículo recibió solo vehículo y otros dos grupos no se trataron.
Treinta minutos después, el grupo experimental, el del vehículo y 1 de los grupos no tratados se inyectaron con 17 \beta-estradiol (500 \mug/kg). Después de 2-3 horas, los animales se sacrificaron mediante inhalación de CO_{2}. Siguiendo una incisión central, se aisló cada útero y se retiró cortando juntos por debajo de la cérvix y en las uniones del útero y los oviductos. Se retiró la grasa y el tejido conectivo con cuidado de no dañar la integridad del útero antes de pesarlo. Se compararon los pesos medios de los grupos tratados con los grupos no tratados o tratados sólo con el vehículo. La significancia se determinó mediante la prueba t de Student. El grupo de control no estimulado se usó para controlar la respuesta al estradiol.
Los resultados demuestran que ciertos compuestos de la presente invención inhiben la formación de edema cuando se administran sistémicamente mediante diversas vías.
Ciertos compuestos de esta invención que son inhibidores de receptores de tirosina quinasas angiogénicos puede mostrarse también activos en un modelo de implante Matrigel de neovascularización. El modelo de neovascularización Matrigel implica la formación de nuevos vasos sanguíneos dentro de una "canica" transparente de matriz extracelular implantada subcutáneamente que se induce por presencia de un factor proangiogénico que produce células tumorales (para ejemplos véase: Passaniti, A., et al, Lab. Investig. (1992), 67(4), 519-528; Anat. Rec. (1997), 249(1), 63-73 ; Int. J. Cancer (1995), 63(5), 694-701; Vasc. Biol (1995), 15(11), 1857-6). El modelo se ensaya preferiblemente en 3-4 días y el final incluye evaluación macroscópica visual de neovascularización, determinación microscópica de densidad de los microvasos, y cuantificación de hemoglobina (método Drabkin) después de retirar el implante frente a controles de animales no tratados con inhibidores. El modelo puede emplear alternativamente bFGF o HGF como estímulo.
Ciertos compuestos de esta invención que inhiben uno o más proteína quinasas oncogénicas, protooncogénicas, o dependientes de proliferación, o receptores PTK angiogénicos inhiben también el crecimiento de tumores de xenoinjertos de murina primaria, de ratas o de humanos en ratones, o inhiben la metástasis en modelos de murina.
Ejemplificaciones I. Síntesis
Los compuestos de fórmula I pueden prepararse como se describe a continuación. En la siguiente
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Los compuestos de fórmula I en los que A representa CONH pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto de fórmula TL_{1} COR_{t} en la que R_{t} es un grupo saliente por ejemplo halo o alcoxi con una amina de fórmula H_{2}N-L_{2}-R_{1} a una temperatura en el intervalo de 0-250ºC opcionalmente en presencia de un disolvente.
Los compuestos de fórmula I en los que A representa CH_{2}NH pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto de fórmula I en la que A representa CONH con un agente reductor, por ejemplo hidruro de aluminio litio a una temperatura en el intervalo de 0-250ºC opcionalmente en presencia de un disolvente.
Alternativamente, los compuestos de fórmula I en los que L_{1}A representa CH_{2}NH pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto de fórmula TL_{1} CHO con una amina de fórmula H_{2}N-L_{2}-R_{1} en presencia de un agente reductor, por ejemplo triacetoxiborohidruro sódico, a una temperatura en el intervalo de 0-250ºC opcionalmente en presencia de un disolvente.
Alternativamente, el grupo L_{1}-A-L_{2}-R_{1} puede estar presente en el anillo fenilo y el sistema del anillo puede construirse como se describe a continuación en donde
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Hay dos enfoques generales a la síntesis de sistemas de anillos de los compuestos de fórmula I que se han establecido en las Patente de Estados Unidos 3.843.665 y en la Patente de Estados Unidos 3.843.666.
En la Patente de Estados Unidos 3.843.665, la ciclación del anillo pirazol se efectúa calentando compuestos de fórmula II con una sulfonilhidrazida aromática de fórmula III en un disolvente inerte y una cantidad catalítica de un ácido. La reacción se realiza durante un periodo de 5 a 30 horas, preferiblemente a una temperatura de 75ºC a 100ºC y da compuestos de fórmula I en los que R_{1} es hidrógeno.
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en donde:
p es 0, 1, 2; W es un alquilo inferior; y R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y X son como se han definido anteriormente. Los compuestos de fórmula II se preparan tratando una compuestos funcionalizado apropiadamente de fórmula IV con un aldehído de fórmula V en presencia de un catalizador ácido o básico (Braun, R.A.; Mosher, W.A. J. Amer. Chem. Soc. 1958, 80, 2749).
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Un segundo método para preparar los sistemas de anillos de los compuestos de fórmula I se establece en la Patente de Estados Unidos 3.843.666 donde los compuestos con fórmula general VI se calientan a 75ºC - 175ºC con una cantidad catalítica de un ácido carboxílico orgánico o un ácido sulfónico orgánico en un disolvente inerte tal como un hidrocarburo aromático durante un periodo de 6 a 24 horas.
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en donde R, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y X son como se han definido anteriormente.
Los compuestos de fórmula VI se preparan tratando compuestos de fórmula general VII con hidrazina en un disolvente inerte. La reacción se realiza de 15º a 20ºC durante un periodo de hasta 24 horas.
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Alternativamente, los compuestos de fórmula I pueden prepararse directamente haciendo reaccionar un compuesto de fórmula VII con hidrazina sin aislar el compuesto de fórmula VI, por ejemplo calentando un compuesto de fórmula VII con hidrazina en un disolvente inerte, por ejemplo metanol, en presencia de un catalizador ácido, por ejemplo ácido acético, a una temperatura en el intervalo de 60ºC al punto de ebullición del disolvente inerte empleado.
Los compuestos de fórmula I pueden prepararse también haciendo reaccionar un compuesto de fórmula XVI
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donde R, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y X son como se han definido anteriormente con hidrazina en un disolvente inerte, por ejemplo metanol, a una temperatura en el intervalo de 15ºC al punto de ebullición del disolvente inerte empleado.
Los compuestos que tienen fórmula general VII se preparan tratando un compuesto de fórmula VIII con un aldehído de fórmula V en condiciones básicas. La reacción se realiza en un disolvente inerte a una temperatura entre 5ºC y 10ºC durante un periodo de 3 a 6 horas,
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donde:
Y es cualquier grupo saliente convencional, tal como cloro, bromo, yodo, tosilato o mesilato y R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6} y X son como se han definido previamente.
Los compuestos de fórmula VII pueden prepararse también haciendo reaccionar un compuesto de fórmula II con un agente de epoxidación, por ejemplo peróxido de hidrógeno, en un disolvente inerte, por ejemplo metanol diclorometano, agua o mezclas de los mismos, a una temperatura en el intervalo de 0º a 100ºC opcionalmente en presencia de una base, por ejemplo hidróxido sódico.
La ciclación de VI puede efectuarse también tratando con un ácido mineral tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, o ácido fosfórico. La reacción se realiza en un alcanol inferior a una temperatura entre 15ºC a 20ºC durante un periodo de 12 a 48 horas. El producto de la reacción, IX, puede aromatizarse después en I calentando a una temperatura de 50ºC a 150ºC con un ácido carboxílico orgánico o un ácido sulfónico orgánico en un éter de cadena lineal o un éter cíclico durante un periodo de 8 a 30 horas.
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El compuesto IX puede diacetilarse por tratamiento con un anhídrido ácido de fórmula (R_{x}CO)_{2}O (estructura X) en el cual R_{x} es un grupo alquilo C_{1}-_{4} en un disolvente inerte tal como un hidrocarburo aromático a una temperatura entre 35ºC a 200ºC durante un periodo de 5 a 8 horas para dar un compuesto de fórmula XI.
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El compuesto XI puede aromatizarse en el compuesto XII calentando a una temperatura de 35ºC a 200ºC con un ácido mineral o un ácido orgánico en un disolvente inerte durante un periodo de 3 a 8 horas. Finalmente, el compuesto XII puede transformarse en I calentando a una temperatura de 50ºC a 150 ºC en un disolvente inerte tal como agua o un alcohol inferior en presencia de un metal alcalino o un hidróxido de un metal alcalino durante el periodo de 8 a 30 horas.
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Los compuestos de formular general II pueden ciclarse en compuestos de fórmula XIII por reacción con hidrazina en un disolvente inerte, por ejemplo metanol a una temperatura en el intervalo de 35-150ºC.
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Los compuestos de fórmula I pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto de fórmula XIII con un agente deshidrogenador, por ejemplo azufre, oxígeno, paladio, dióxido de manganeso o dióxido de plomo opcionalmente en presencia de un disolvente inerte, por ejemplo un hidrocarburo, a una temperatura en el intervalo de 15 a 250ºC.
Pueden encontrarse ejemplos específicos de las transformaciones anteriores en las Patentes de Estados Unidos No. 3.843.665 y 3.843.666.
El carbonilo de unión pueden transformarse en un grupo metileno mediante un reducción Wolf-Kishner de la hidrazona correspondiente (Mosher, W.A. Tawfik, E.-Z., Lipp, D.W. J. Org. Chem. 1971, 36, 3890).
Pueden encontrarse métodos de funcionalización del carbonilo de unión y ejemplos específicos en la Solicitud de Patente Japonesa JP 60 130521 A2, y Patente de Estados Unidos de B. Loev 3.004.983 (1960).
Los compuestos de fórmula I pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto de fórmula XIV:
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con una base fuerte, por ejemplo n-butillitio a una temperatura en el intervalo de -78ºC a 25ºC seguido de reacción con un compuesto de fórmula R_{2}COG (estructura XV) en el cual R_{2} es como se ha definido previamente y G representa un grupo alcoxi C_{1-6}.
Los compuestos de fórmula IV, VIII, XIV, XV y XVI están disponibles en el mercado o pueden prepararse por métodos conocidos por los especialistas en la técnica.
Los compuestos de fórmula I en los que X representa SO, o SO_{2} pueden prepararse oxidando un compuesto de fórmula I en la que X representa S por métodos conocidos por los especialistas en la técnica por ejemplo usando un número apropiado de equivalentes molares de ácido 3-cloroperbenzoico.
Los compuestos de fórmula I en lo que X representa un grupo de fórmula -C=NOR_{7} pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto de fórmula I en el que X representa carbonilo, con un compuesto de fórmula H_{2}NOR_{7} por métodos conocidos por los especialistas en la técnica.
Los compuestos de fórmula I en los que R_{1} = 4-piridilo pueden funcionalizarse adicionalmente en la posición 2 del anillo piridina por métodos conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, mediante recolocaciones mediadas por piridina-N-óxido.
Ciertos sustituyentes en compuestos de fórmula I pueden interconvertirse por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo pueden hacerse reaccionar sustituyentes alcoxi con un reactivo de escisión de éter adecuado por ejemplo ácido bromhídrico, tribromuro de bromo o clorhidrato de piridina para dar un compuesto de fórmula I con un sustituyente hidroxi. Alternativamente, pueden prepararse compuestos de fórmula I con un sustituyente alcoxi alquilando compuestos de fórmula I que tienen un sustituyente hidroxi. Los sustituyentes de ácido carboxílico pueden transformarse en sustituyentes éster carboxílico o amida. Los sustituyentes nitro pueden reducirse a aminas y las aminas pueden acilarse por métodos conocidos por los especialistas en la técnica.
Esta invención se ilustra por medio de los Ejemplos que se proporcionan a continuación que dan sólo como ejemplo. El producto final de cada uno de estos Ejemplos se caracteriza por uno o más de los siguientes procedimientos: cromatografía líquida de alto rendimiento; análisis elemental, espectroscopia con resonancia magnética nuclear, espectroscopia con infrarrojos y espectroscopia de masa de alta resolución. Se usan las siguientes abreviaciones
IMS = alcohol metilado industrial
LCMS = cromatografía líquida/espectroscopia de masa
Ejemplo 1
a) Una mezcla de indan-1-on (3,3 g), 4-formilbenzoato de metilo (5,0 g) piperidina (0,6 ml) y ácido acético glacial (0,5 ml) se calentó en un baño de vapor durante 3 horas. La masa sólida obtenida se hirvió en alcoholes metilados industriales y después se filtró en caliente. El residuo sólido obtenido se lavó con alcoholes metilados industriales y se secó para dar 4-(1-oxoindan-2-ilidenometil)benzoato de metilo, p.f. 194-198ºC.
b) El producto de a) (1,5 g) se suspendió en metanol (10 ml) y diclorometano (15 ml) y se agitó a 0-5ºC mientras se añadía una solución de hidróxido sódico 2M (2,7 ml) seguido de peróxido de hidrógeno al 30% (100 vol. 1,1 ml). La mezcla se agitó a 0,5ºC durante 5 minutos y después a temperatura ambiente durante 24 horas. Se añadió diclorometano (100 ml) a la mezcla que se lavó después con salmuera (2 x 50 ml), se secó, se filtró y se evaporó para dar 4-(1-oxoespiro[indan-2,'-oxiran]-3'-il)benzoato de metilo p.f. 160-163ºC. La fase acuosa se acidificó con ácido clorhídrico 5M y se extrajo con diclorometano para dar ácido 4-(1-oxoespiro[indan-2,2'-oxiran]-3'-il)benzoico. p.f. 220ºC con descomposición.
c) Se calentaron a reflujo el ácido 4-(1-oxoespiro[indan-2,2'-oxiran]-3'-il)benzoico de la parte b) (780 mg), metanol (50 ml), hidrato de hidrazina (0, 18 ml) y ácido acético glacial (6 gotas) durante 24 hora. La mezcla se enfrió en hielo y se filtró para dar ácido 4-(1-4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)benzoico, p.f.> 320ºC
d) Se agitaron a temperatura ambiente una mezcla del producto de c) (5,3 g) y diclorometano (250 ml) y después se añadió cloruro de oxalilo (5 ml) y N,N-dimetilformamida seca (6 gotas), la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos y después se calentó a reflujo durante 90 minutos. El disolvente se retiró al vacío a presión reducida para dar un cloruro ácido bruto que se usó directamente en el siguiente experimento.
e) El cloruro ácido de d) (3,73) g se agitó a temperatura ambiente en diclorometano (150 ml), y después se añadió trietilamina (3 ml) y después 4-aminopiridina (0,9 g). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Se añadieron agua (150 ml) y una solución de hidróxido sódico 5M (50 ml) y se agitó la mezcla durante 90 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se filtró y el residuo se lavó con diclorometano y agua. El filtrado y los lavados se combinaron, se separaron, y la capa de diclorometano se secó y se evaporó para dar un sólido que se combinó con el sólido original obtenido de la filtración y se separó por cromatografía en columna de gel de sílice usando diclorometano/alcohol etílico (10:1) para dar N-(4-piridil)-4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-benzamida.
f) Se añadió hidruro de aluminio litio (830 mg) en porciones a una solución agitada del producto de e) (1,9 g) en tetrahidrofurano seco (50 ml) a temperatura ambiente. La mezcla se calentó a reflujo durante 1 hora. La mezcla se enfrió a 0-5 ºC y se añadió a acetato de etilo (60 ml) y después se añadió agua (70 ml). La mezcla se agitó durante 10 minutos y se filtró para dar un sólido A. La capa acuosa se separó y se extrajo con más acetato de etilo (100 ml). El sólido A se agitó con etanol y se filtró. Los extractos de acetato de etilo y el filtrado de etanol se combinaron y se evaporaron. El residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna ultra-rápida usando diclorometano / etanol (10:1) para dar 4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol)-N-(4-piridil)bencilamina, p.f. 270-274ºC.
Ejemplo 2
a) Una mezcla de indan-1-ona (20,0 g), 4-nitrobenzaldehído (27,0 g), ácido acético glacial (3,0 g) y piperidina (3,06 g) se calentó a 95ºC en una atmósfera de nitrógeno durante 3,5 horas. La mezcla se enfrió a 20ºC y se filtró para dar un sólido que recristalizó en alcohol metilado industrial para dar 2-(4-nitrobencilideno)indan-1-ona.
b) El producto de a) (28,0 g) se agitó con diclorometano (100 ml) y metanol (100 ml) a 20ºC y después se añadió una solución de hidróxido sódico 2M (50 ml) seguido de peróxido de hidrógeno (20 ml, 100 volúmenes). La mezcla se agitó a 20ºC durante 24 horas. Se añadió más peróxido de hidrógeno (10 ml, 100 volúmenes) y la mezcla se agitó durante 24 horas más. Se añadió más peróxido de hidrógeno (10 ml, 100 volúmenes) y la mezcla se agitó durante 64 horas. La mezcla de reacción se neutralizó con ácido acético glacial y el sólido formado se recogió por filtración y se secó para dar 3'-(4-nitrofenil)-1-oxoespiro[indan-2,2'-oxirano].
c) El producto de b) (10,0 g) se disolvió en etanol (180 ml) y se añadió hidrato de hidrazina (1,78 g) a la solución obtenida, seguido de ácido acético glacial (30 gotas). La mezcla se hirvió a reflujo durante 5 horas y después se enfrió a 20ºC y se mantuvo a esta temperatura durante 18 horas. El sólido se recogió por filtración y recristalizó en acetona para dar 3-(4-nitrofenil)1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol, p.f. 267-270ºC.
d) El producto de c) (3,0 g) se suspendió en alcohol metilado industrial (200 ml) y se añadió paladio en carbón al 5% (250 mg) seguido de formato de amonio (2,05 g). La mezcla se agitó y se calentó a 70ºC durante 3 horas y después se enfrió a temperatura ambiente y después se filtró. El filtrado se concentró a presión reducida y se trituró con diclorometano para dar 4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)anilina, p.f. 253-254ºC.
e) El producto de d) (1,0 g) se disolvió en diclorometano (30 ml) y se añadió trietilamina (0,62 ml). La mezcla se enfrió a 0ºC y se añadió cloruro de benceno sulfonilo (0,79 g) con agitación. La mezcla se calentó a 20ºC y se agitó a esta temperatura durante 2 horas. Se añadió más trietilamina (0,2 ml) y más cloruro de benceno sulfonilo (0,79 g) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Se añadió éter (80 ml) seguido de agua (40 ml). El sólido que precipitó se recogió por filtración, se lavó con una solución de bicarbonato sódico y éter y después se secó al vacío a 60ºC. El material se recristalizó en acetona para dar un sólido que se purificó por cromatografía en columna de sílice usando diclorometano para dar un sólido que se identificó como 4'-(1-fenilsulfonil(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)N-fenilsulfonilanilina.
f) El producto e) (0,56 g) se suspendió en metanol (40 ml) y se añadió una solución de hidróxido sódico 2M. Se obtuvo una solución transparente que se agitó a 20ºC durante 20 minutos. La mezcla se vertió en ácido clorhídrico 2M (75 ml) y el sólido obtenido se recogió por filtración para dar un sólido que se agitó con bicarbonato sódico saturado (25 ml) y acetato de etilo (25 ml) durante 30 minutos y después se filtró para dar N-[4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)fenil]bencenosulfonamida, p.f. 286-288ºC.
Ejemplo 3
Una mezcla de cloruro ácido del Ejemplo 1 d) (100 mg) diclorometano (5 ml), 2-metoxietanol (26 \mul) y trietilamina (84 \mul) se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. La mezcla se agitó con una solución de bicarbonato sódico (saturada, 5 ml) y se filtró. El filtrado se evaporó para dar un sólido que se purificó por cromatografía en columna ultra-rápida usando diclorometano/alcohol metilado industrial (25:2) como fase móvil para dar 4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(2-metoxietil)benzamida en forma de sólido incoloro.
Ejemplo 4
Una mezcla de cloruro ácido del Ejemplo 1 d) (100 mg), diclorometanol (5 ml), 4-nitroanilina (41 mg) y trietilamina (64 \mul) se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. La mezcla se agitó con una solución de bicarbonato sódico saturado (5 ml) durante 10 minutos y después se filtró. El sólido se lavó con diclorometano, después con alcohol para dar 4-(1,2-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(4-nitrofenil)benzamida en forma de sólido incoloro.
Ejemplo 5
a) La anilina del Ejemplo 2 d) (6g) se disolvió en diclorometano (200 ml) y después se añadió trietilamina (7,4 ml). La mezcla se enfrió a 0ºC y después se añadió cloruro de cloroacetilo (4,2 ml) con agitación y la mezcla se calentó a 20ºC. La mezcla se filtró y el sólido obtenido se lavó con agua y después con éter y se secó para dar un intermedio que se había cloroacetilado en el nitrógeno 1 del pirazol y en el grupo NH_{2} de la anilina de partida.
b) El producto de a) (1,4), imidazol (0,95 g) y tetrahidrofurano (40 ml) se hirvieron a reflujo a 90ºC en una atmósfera de nitrógeno durante 6 horas. La mezcla se filtró y el filtrado se evaporó a presión reducida para dar un residuo que se dividió entre acetato de etilo y ácido clorhídrico 2M. El sólido obtenido se recogió por filtración y se secó para dar diclorhidrato de 4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)imidazol-1-ilacetanilida, p.f. 264-266ºC.
Ejemplo 6
El producto del Ejemplo 5 (0,27 g) se suspendió en tetrahidrofurano (30 ml) en una atmósfera de nitrógeno con agitación y se añadió hidruro de aluminio litio (87 mg). La mezcla se agitó a 20ºC durante 18 horas. La mezcla se inactivó con una solución saturada de sulfato sódico (40 ml) y después se extrajo con acetato de etilo (2 x 30 ml) para dar un sólido que se disolvió en etanol (3 ml) al cual se le añadió ácido clorhídrico concentrado (10 gotas). El etanol se retiró para dar un sólido amarillo que se trituró con éter para dar diclorhidrato de 4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(2-imidazol-1-il)etil]anilina, p.f. 205-209ºC.
Ejemplo 7
a) Una mezcla de cloruro de 4-cianobenceno sulfonilo (5,15 g) en acetona (70 ml) se agitó a temperatura ambiente y después se añadió gota a gota una solución de 2-morfolinoetilamina (6,7 ml) en acetona (15 ml) con agitación. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y después se retiró la acetona por evaporación y el residuo se eluyó a través de una capa de sílice usando acetato de etilo para dar 4-ciano-N-2-morfolinoetilbencenosulfonamida.
b) El producto de a) (0,65 g) y tolueno seco (30 ml) se agitaron a 0-5ºC y se añadió hidruro de diisobutilaluminio (4,4 ml de una solución 1,0M en ciclohexano) a 0-5ºC. Después de la adición, la solución se calentó a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se llevó a ebullición a reflujo durante 30 minutos e hirvió durante 3 horas. La mezcla se enfrió y se añadió a ácido clorhídrico 5M (10 ml) a 10-15ºC. Después, la mezcla se calentó a 90ºC durante 10 minutos y después se enfrió y se separó la capa de tolueno. La capa acuosa se lavó con acetato de etilo y después se neutralizó a pH 7-8 usando una solución de hidróxido sódico 5M. Esta mezcla se extrajo con acetato de etilo, se secó, se filtró y se evaporó para dar una goma que se secó al vacío a 40ºC para dar un sólido que se identificó como 4-formil-N-(2-morfolinoetil)bencenosulfonamida, p.f. 114-116ºC
c) El producto de c) (200 mg), 2-bromoindanona (142 mg) y metanol seco (3 ml) se agitaron a 0ºC, y a esta mezcla se le añadió una solución de metóxido sódico (44 mg) en metanol (0,5 ml). La mezcla se agitó a 0ºC durante 2 horas para dar un sólido que se recogió por filtración, se lavó con metanol y se secó al vacío para dar el epóxido.
d) El producto de c) (3,7 g), hidrato de hidrazina (1 ml), ácido acético glacial (10 gotas) y etanol (100 ml) se hirvieron a reflujo durante 26 horas y el etanol se secó sobre tamices moleculares en un extractor Soxhlet. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía en columna ultra-rápida para dar 4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(2-morfolinoetil)bencenosulfonamida, p.f. 218-220ºC
Ejemplo 8
Este Ejemplo se preparó de forma similar al Ejemplo 7 excepto que se usó 2-metoxietilamina en lugar de 2-morfolinoetilamina y el producto obtenido fue 4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(2-metoxietil)bencenosulfonamida.
Ejemplo 9
a) una mezcla de indan-1-ona (3,3 g),4-formilbenzoato de metil (5,0 g), piperidina (0,6 ml) y ácido acético glacial (0,5 ml) se calentó en un baño de vapor durante 3 horas. La masa sólida obtenida se hirvió en alcoholes metilados industriales (200 ml) y después se filtró en caliente. El residuo sólido obtenido se lavó con alcoholes metilados industriales y se secó para dar 4-(1-oxoindan-2-ilidenometil)benzoato, p.f. 194-198ºC.
b) El producto de a) (1,5 g) se suspendió en metanol (10 ml) y diclorometano (15 ml) y se agitó a 0-5ºC mientras se añadía una solución de hidróxido sódico 2M (2,7 ml) seguida de peróxido de hidrógeno al 40% (100 volúmenes, 1,1 ml). La mezcla se agitó a 0-5ºC durante 5 minutos y después a temperatura ambiente durante 24 horas. Se añadió diclorometano (100 ml) a la mezcla que después se lavó con salmuera (2 x 50 ml), se secó, se filtró y se evaporó para dar 4-(1-oxoespiro[indan-2,2'-oxiran]-3'-il)benzoato, p.f. 160-163ºC. La fase acuosa se acidificó con ácido clorhídrico 5M y se extrajo con diclorometano para dar ácido 4-(1-oxoespiro[indan-2,2'-oxiran]-3'-il)benzoico, p.f. 220ºC con descomposición.
c) Una mezcla de 4-(1-oxoespiro[indan-2,2'-oxiran]-3'-il)benzoato de metilo (750 mg), metanol (30 ml) e hidrato de hidrazina (0,16 ml) se agitó a temperatura ambiente mientras se añadía ácido acético glacial (6 gotas). La mezcla se calentó a reflujo durante 24 horas y después se dejó reposar a temperatura ambiente durante 24 horas, después se enfrió a 0ºC y se filtró para dar 4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)benzoato de metilo.
d) El éster de c) (2,20 g) y N,N-dietiletilenodiamina (7 ml) se calentó a reflujo durante 4,5 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y después se añadió éter de petróleo, p.e. 40-60ºC (50 ml). La mezcla se filtró para dar la amida.
e) La amida (2,75 g) se suspendió en tetrahidrofurano (80 ml) y se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno mientras se añadía hidruro de aluminio litio (1,14 g). La mezcla se agitó durante 3,5 horas y después se añadieron más hidruro de aluminio litio (1,14 g) y más tetrahidrofurano (40 ml). Se añadió una tercera porción de hidruro de aluminio litio después de 22,5 horas y esta mezcla se agitó durante 24 horas. La mezcla se calentó a reflujo durante 2,5 horas y después se dejó reposar durante una noche a temperatura ambiente. La mezcla se agitó en una atmósfera de nitrógeno con refrigeración en un baño de hielo mientras se añadía acetato de etilo (100 ml), seguido de agua (100 ml). La capa orgánica se separó, se lavó, se secó y se evaporó para dar un aceite que se purificó por cromatografía ultra-rápida en columna usando acetato de etilo/etanol/trietilamina (7:2:1). Las fracciones apropiadas se combinaron y se evaporaron para dar una goma (0,85 g) que se disolvió en etanol (5 ml) con calentamiento y a la solución se le añadió ácido clorhídrico concentrado (0,6 ml). La mezcla se evaporó después a presión reducida y el sólido gomoso residual se hirvió con etanol (10 ml) después se enfrió en hielo y se filtró para dar triclorhidrato de N-[2-(N,N-dietilamino)etil]-4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)bencilamina, p.f. 225ºC.
Ejemplo 10
Este Ejemplo se preparó de forma similar al Ejemplo 7, excepto que se usó N,N-dietilaminoetilamina en lugar de 2-morfolinoetilamina. El producto obtenido fue diclorhidrato de N-[2-(N,N-dietilamino)etil]-4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)bencenosulfonamida, p.f. 192-196ºC.
Ejemplo 11
Este Ejemplo se preparó de forma similar al Ejemplo 9, excepto que se usó 2-morfolinoetilamina en lugar de N,N-dietiletilenodiamina. El producto obtenido fue diclorhidrato de 4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(2-morfolinoetil)bencilamina p.f. 266-269ºC (con descomposición).
Ejemplo 12
Este Ejemplo se preparó de forma similar al Ejemplo 1, excepto que se usó 4-etoxianilina en lugar de 2-metoxietilamina. El producto obtenido fue N-[(4-etoxifenil)-4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)bencilamina, p.f. 180ºC (con descomposición)
Ejemplo 13
Este Ejemplo se preparó de forma similar al Ejemplo 9 d), excepto que se usó (S-(+)-2-(aminoetil)pirrolidina en lugar de N,N-dietiletilenodiamina. El producto obtenido fue diclorhidrato de (S)-4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(pirrolidin-2-ilmetil)benzamida, p.f. 222-226ºC.
Ejemplo 14
a) Se añadió tiosalicilato de metilo (9,89 ml) a una solución de metóxido sódico (11,6 g) en etanol (100 ml) con agitación. Después de 15 minutos se añadió una solución de bromuro de 4'-bromofenacilo (20,0 g) en etanol (100 ml) y la mezcla se agitó y se calentó a reflujo durante 18 horas. La mezcla se enfrió y se acidificó con ácido clorhídrico al 10% (150 ml). El sólido se recogió y se usó directamente en el siguiente experimento.
b) El producto de a) (18,0 g) se agitó y se hirvió a reflujo en etanol (150 ml) en un matraz equipado con un extractor Soxhlet que contenía tamices moleculares de 4A. Se añadió una gota de ácido acético glacial seguido de hidrato de hidrazina (3,9 ml) y la mezcla se hirvió y se agitó a reflujo durante 64 horas. La mezcla se enfrió y el precipitado se recogió y se usó directamente en el siguiente experimento.
c) El producto de c) (4,0 g) se disolvió en tetrahidrofurano (200 ml) y se añadió gota a gota con agitación a 0ºC en una atmósfera de nitrógeno a una suspensión agitada de hidruro de potasio (1,53 g) en tetrahidrofurano (100 ml). Después de la adición, la mezcla se agitó durante 15 minutos y después se enfrió a -78ºC. Se añadió terc-butilo litio gota a gota (17,0 ml de una solución 1,5M en pentano) y después de agitar 45 minutos a esta temperatura se añadió dimetilformamida (4,7 ml). La temperatura se mantuvo a -78ºC durante 1 hora y después la mezcla de reacción se dejó calentar lentamente a temperatura ambiente. La mezcla se inactivó por la adición con precaución de ácido clorhídrico 1M (200 ml). La capa orgánica se separó, se lavó con agua, bicarbonato saturado, salmuera, y después se secó, se filtró, se evaporó para dar un sólido rojo ceroso que se purificó por cromatografía en columna en sílice usando acetato de etilo al 20% en éter de petróleo, p.e. 260-280ºC como fase móvil para dar 3-(4-formilfenil)-1H-[1]benzotieno[3,2-c]pirazol, p.f. 261-263ºC.
d) Una solución del producto c) (100 mg), 3-(1-imidazolil)propilamina (58 mg) en 1,2-dicloroetano que contenía ácido acético glacial (0,03 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió triacetoxiborohidruro sódico (84 mg) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Se añadió más triacetoxiborohidruro sódico (90 mg) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla se vertió en una solución agitada de bicarbonato sódico acuoso saturado (aproximadamente 20 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con diclorometano. La capa orgánica combinada y los extractos se lavaron con agua, se secaron y se evaporaron a presión reducida para dar un sólido que se disolvió en etanol (15 ml) y se añadieron 2 gotas de ácido clorhídrico concentrado. La solución se concentró a presión reducida para dar un sólido que se trituró con éter dietílico, se filtró y se secó para dar triclorhidrato de 4-(1H-[1]-benzotieno[3,2-c]pirazol-3-il)-N-[3-(imidazol-1-il)propil]bencilamina, p.f. 206-208ºC (con descomposición).
Ejemplo 15
Este Ejemplo se preparó de forma similar al Ejemplo 14 haciendo reaccionar 3-(4-formilfenil)-1H-[1]benzotieno[3,2-c]pirazol con 2-morfolinoetilamina para dar triclorhidrato de 4-(1H-[1]benzotieno[3,2-c]pirazol-3-il)-N-(2-morfolinoetil)bencilamina, p.f. 270-272ºC.
Ejemplo A
El uso de compuestos de la presente invención en la fabricación de composiciones farmacéuticas se ilustra por medio de la descripción proporcionada a continuación. En esta descripción el término "compuesto activo" denota cualquier compuesto de la invención pero particularmente cualquier compuesto que sea el producto final de uno de los Ejemplos anteriores.
a) Cápsulas
En la preparación de cápsulas, se mezclan y desagregan 10 partes en peso de compuesto activo y 240 partes en peso de lactosa. La mezcla se introduce en cápsulas de gelatina dura, conteniendo cada cápsula una dosis unitaria o parte de una dosis unitaria de compuesto activo.
b) Comprimidos
Los comprimidos se preparan con los siguientes ingredientes.
Partes en peso
Compuesto activo 10
Lactosa 190
Almidón de Maíz 22
Polivinilpirrolidona 10
Estearato de Magnesio 3
Se mezclan y desagregan el compuesto activo, la lactosa y parte del almidón y la mezcla resultante se granula con una solución de polivinilpirrolidona en etanol. El granulado seco se mezcla con el estearato de magnesio y el resto del almidón. Después, la mezcla se comprime en una máquina de comprimidos para dar comprimidos que contienen cada uno una dosis unitaria o parte de una dosis unitaria de compuesto activo.
c) Comprimidos entéricos recubiertos
Se preparan comprimidos por el método descrito anteriormente en (b). Los comprimidos se recubren entéricamente de una forma convencional usando una solución de ftalato de acetato de celulosa al 20% y ftalato dietílico al 3% en etanol:diclorometano (1:1).
d) Supositorios
En la preparación de supositorios, se incorporan 100 partes en peso de compuesto activo en 1300 partes en peso de base de supositorio de triglicérido y con la mezcla se forman supositorios que contienen cada uno una cantidad eficaz de ingrediente activo.
Equivalentes
Aunque esta invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencias a las realizaciones preferidas de la misma, los especialistas en la técnica deben apreciar que pueden realizarse distintos cambios en la forma y detalles sin apartarse del alcance de la invención definido por las reivindicaciones adjuntas. Los especialistas en la técnica reconocerán o serán capaces de encontrar usando sólo experimentos rutinarios, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descrita específicamente en este documento. Tales equivalentes están comprendidos dentro del alcance de las reivindicaciones.

Claims (28)

1. Compuestos de fórmula I
15
donde
el término metileno sustituido significa metileno sustituido con uno o más de hidroxi o un grupo alquilo C_{1-4}, donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido adicionalmente con un grupo de fórmula NR_{r}R_{s}, en la que R_{r} y R_{s} representan independientemente H o un grupo alquilo C_{1-6};
donde grupo amino opcionalmente sustituido significa un grupo de fórmula NR_{k}R_{l} en la que R_{k} y R_{l} representan independientemente hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-12}, un grupo alcoxi C_{1-12}, un grupo cicloalquilo C_{3-12}, un grupo fenilo, un grupo fenilalquilo C_{1-6}, un grupo heteroarilo, o un grupo heteroarilalquilo C_{1-6}, donde cada uno de dichos grupos está opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: un grupo alquilo C_{1-6}, un grupo alcoxi C_{1-6}, hidroxi, halo, o R_{k} y R_{l} junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos representan un anillo saturado heterocíclico de cinco, seis o siete miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, o N y está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C_{1-6}.
donde el término heteroarilo significa un heterociclilo aromático mono o bicíclico opcionalmente sustituido, donde el heterociclo contiene 1, 2, 3, o 4 heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, azufre, u oxígeno.
donde fenilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido significa fenilo y heteroarilo sustituido con uno o más de a) halo, b) un grupo alquilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido con uno o más de hidroxi, halo, un grupo amino opcionalmente sustituido o un anillo heterocíclico saturado de cinco, seis o siete miembros que contiene un átomo de nitrógeno y que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado entre O, S, o N y está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C_{1-6}, donde dicho anillo saturado está unido a través de un átomo de carbono, c) un grupo alcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno o más de hidroxi; un grupo alcoxi C_{1-6}; halo; o un grupo amino opcionalmente sustituido, con la condición de que estos grupos no estén unidos al carbono que está unido al oxígeno del grupo alcoxi, o un anillo saturado heterocíclico de cinco, seis o siete miembros que contiene un átomo de nitrógeno que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S o N y que está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C_{1-6}, donde dicho anillo saturado está unido a través de un átomo de carbono, d) fenoxi opcionalmente sustituido, e) hidroxi, f) un grupos de fórmula COR_{a} en la que R_{a} representa hidroxi, un grupo alcoxi C_{1-6} o R_{a} representa un grupo de fórmula NR_{b}R_{c} en la que R_{b} y R_{c} representan independientemente hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-12}, un grupo cicloalquilo C_{3-12}, o fenilo, donde el grupo alquilo, el grupo cicloalquilo y el fenilo están opcionalmente sustituidos con uno o más de hidroxi, halo, un grupo cicloalquilo C_{3-12}, o un grupo amino de fórmula NR_{h}R_{j} donde R_{h} y R_{j} representan independientemente hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6} o donde R_{h} y R_{j} junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos representan un anillo heterocíclico saturado de cinco, seis o siete miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S o N y que está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo C_{1-6}, g) un grupo de fórmula NR_{d}R_{e} en la que R_{d} y R_{e} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-12}, un grupo cicloalquilo C_{3-12}, o fenilo o un grupo de fórmula COR_{f} en la que R_{f} representa hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-12}, un grupo cicloalquilo C_{3-12}, un grupo fenilalquilo C_{1-6}, o fenilo, donde, en cada caso el grupo alquilo, el grupo cicloalquilo y el fenilo están opcionalmente sustituidos con uno o más de halo, hidroxi, nitro o un grupo amino de fórmula NR_{h}R_{j}, en la que R_{h} y R_{j} son como se han definido anteriormente, h) un grupo de fórmula O(CH_{2})_{m}R_{g} en la que m es 2, 3, 4 o 5 y R_{g} representa hidroxi o un grupo de fórmula NR_{d} R_{e} en la que R_{d} y R_{e} son como se han definido anteriormente; o R_{g} representa un grupo de fórmula COR_{a} en la que R_{a} es como se ha definido anteriormente, y m es 1, 2, 3, 4, o 5, i) nitro, j) fenilalquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, k) fenilalcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituido, l) ciano, m) un grupo alqueniloxi C_{3-6}, n) un grupo piridiloxi o piridiltio en el que el anillo de piridina está opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: trifluorometilo o nitro, o) hidroxiamidino, p) aminoetilo, q) formamidometilo, r) un grupo alquiltio C_{1-6}, s) fenilo, o t) un grupo alquenilo C_{2-4} o un grupo alquinilo C_{2-4}, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con fenilo que está opcionalmente sustituido con uno o más de los siguientes: un grupo alquilo C_{1-6}, un grupo alcoxi C_{1-6} o halo.
\newpage
2. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 1 en los que X es CH_{2} o S.
3. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 1 en los que X es CH_{2} y A es NR_{25}.
4. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 1 en los que X es S y A es NR_{25}.
5. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 1 en los que X es CH_{2} y A es HNSO_{2}.
6. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 1 en los que X es CH_{2} y A es SO_{2}NH.
7. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 1 en los que X es CH_{2} y A es CONH.
8. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 1 en los que X es CH_{2} y A es HNCO.
9. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 1 en los que X es CH_{2}, A es NR_{25}, L_{1} es (CH_{2})_{q} donde q es un entero de 1 a 6 y la cadena alquileno está opcionalmente sustituida con uno o más de los siguientes: un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno o más hidroxi, halo o amino opcionalmente sustituido; un grupo alcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituido con uno o más hidroxi, halo o amino opcionalmente sustituido; hidroxi; halo; o amino opcionalmente sustituido; L_{2} es un enlace y R_{1} es piridilo opcionalmente sustituido.
10. Un compuesto seleccionado entre:
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol)-N-(4-piridil)bencilamina
N-[4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)fenil]bencenosulfonamida
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(2-metoxietil)benzamida
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(4-nitrofenil)benzamida
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-imidazol-1-ilacetanilida
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-[2-(imidazol-1-il)etil]anilina
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(2-morfolinoetil)bencenosulfonamida
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(2-metoxietil)bencenosulfonamida
N-[2-(N,N-dietilamino)etil]-4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)bencilamina
N-[2-(N,N-dietilamino)etil]-4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)bencenosulfonamida
4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(2-morfolinoetil)bencilamina
N-(4-etoxifenil)-4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)bencilamina
(S)-4-(1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol-3-il)-N-(pirrolidin-2-ilmetil)benzamida
4-(1H-[1]benzotieno[3,2-c]pirazol-3-il)-N-[3-(imidazol-1-il)propil]bencilamina
4-(1H-[1]benzotieno[3,2-c]pirazol-3-il)-N-[2-morfolinoetil)bencilamina
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, incluyendo enantiómeros individuales y mezclas de enantiómeros.
11. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I como se ha definido en la reivindicación 1 junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. Un compuesto de fórmula I como se ha definido en la reivindicación 1 para uso como medicamento.
13. Un compuesto de fórmula I como se ha definido en la reivindicación 1 para uso como un medicamento para la inhibición de la actividad de la proteína quinasa.
14. Un compuesto de fórmula I como se ha definido en la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para inhibir la actividad de la proteína quinasa.
15. El uso de la reivindicación 14, donde la proteína quinasa en una tirosina quinasa.
16. El uso de la reivindicación 15, donde dicha tirosina quinasa es una tirosina quinasa receptora o una tirosina quinasa no receptora.
17. El uso de la reivindicación 16, donde dicha tirosina quinasa se selecciona entre el grupo compuesto por KDR, Flt-1, TIE-2, Lck, Src, fyn, y yes.
18. El uso de la reivindicación 14, donde la actividad de dicha tirosina quinasa afecta a la angiogénesis.
19. El uso de la reivindicación 18, donde la inhibición de dicha tirosina quinasa es anti-angiogénica.
20. El uso de la reivindicación 19, donde dicha inhibición de dicha tirosina quinasa inhibe la progresión de un estado patológico seleccionado entre el grupo compuesto por: cáncer, artritis, ateroesclerosis, psoriasis, hemangiomas, angiogénesis miocárdica, vascularización colaterales coronaria y cerebral, angiogénesis de extremidades isquémicas, enfermedades en la cornea, rubeosis, glaucoma neovascular, degeneración macular, cicatrización de heridas, úlceras pépticas relacionadas con Helicobacter, fracturas, retinopatía diabética, y fiebre provocada por arañazos de gato.
21. El uso de la reivindicación 15, donde la actividad de dicha tirosina quinasa afecta a la hiperpermeabilidad vascular o a la producción de edema.
22. El uso de la reivindicación 21, donde la inhibición de dicha tirosina quinasa es antiedematosa.
23. El uso de la reivindicación 22, donde la inhibición de dicha tirosina quinasa inhibe el progreso de un estado patológico seleccionado entre el grupo compuesto por: quemaduras, enfermedad crónica de pulmón, apoplejía, pólipos, psoriasis, inflamación alérgica, degeneración macular, retinopatía diabética, síndrome de hiperestimulación ovárico, edema cerebral asociado con tumor cerebral.
24. El uso de la reivindicación 15, donde la inhibición de dicha tirosina quinasa tiene un efecto anti-tumoral.
25. El uso de la reivindicación 15, donde la inhibición de dicha actividad de tirosina quinasa está asocia con efectos anti-fertilidad o abortivos.
26. El uso de la reivindicación 14, donde dicha proteína quinasa es una serina quinasa.
27. El uso de la reivindicación 14, donde dicha proteína quinasa es una treonina quinasa.
28. El uso de la reivindicación 15 en el que dicha tirosina quinasa es KDR.
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