ES2208312T3 - Procedimiento y dispositivo para la deteccion de variaciones de propiedades opticas de una muestra en un proceso de analisis. - Google Patents
Procedimiento y dispositivo para la deteccion de variaciones de propiedades opticas de una muestra en un proceso de analisis.Info
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Abstract
Procedimiento para la detección de una variación de las propiedades ópticas de una muestra a ser analizada, consistiendo este procedimiento en ejecutar, en el transcurso de un período de tiempo relativamente corto, del orden del milisegundo hasta la decena de milisegundos, una secuencia de operaciones que comprende, al menos, las etapas siguientes: - una primera exposición de la muestra a un primer impulso luminoso incidente (IL1) cuyas ondas luminosas están comprendidas en una primera gama de frecuencia, siendo emitido este impulso (IL1) por una primera fuente luminosa optoelectrónica (SL1), - una primera medida de tipo turbidimétrico, por un detector opto electrónico (DO), situado sensiblemente en el eje de dicho primer impulso incidente (IL1) de intensidad luminosa transmitida por dicho primer impulso, después de su paso a través de dicha muestra, - el almacenamiento del resultado de esta primera medida en una memoria (MEM), - una segunda exposición de la muestra a un segundo impulsoluminoso incidente (IL2), que presenta sensiblemente la misma incidencia que el primero, cuyas ondas luminosas están comprendidas en una segunda gama de frecuencia, siendo emitido este impulso (IL2) por una segunda fuente luminosa optoelectrónica (SL2), - una segunda medida de tipo turbidimétrico de la intensidad transmitida de dicho segundo impulso por el citado detector (DO) después de su paso a través de dicha muestra, - el almacenamiento de los resultados de esta segunda medida en dicha memoria (MEM).
Description
Procedimiento y dispositivo para la detección de
variaciones de propiedades ópticas de una muestra en un proceso de
análisis.
La presente invención se refiere a un
procedimiento y a un dispositivo para la detección de variaciones
de propiedades ópticas de una muestra, tales como, por ejemplo, una
variación colorimétrica obtenida en el transcurso de un proceso de
análisis químico y/o biológico.
La invención se aplica, principalmente, a la
detección de la presencia o de la ausencia de microorganismos tales
como bacterias o levaduras en una muestra de un material
biológico.
La invención es más particularmente conveniente,
pero no de manera exclusiva, a una detección de este tipo en un
proceso de análisis biológico tal como se ha descrito en la
solicitud WO 96/29427 que comprende una fase de separación "sobre
gel" que consiste en:
- -
- la introducción de una muestra en un tubo de centrifugado, por encima de un sistema gelificado previamente introducido en el tubo, estando concebido este sistema de manera que se separen los microorganismos presentes en la muestra en función de su tamaño y que comprende un medio de cultivo propicio para el desarrollo de los microorganismos y un reactivo apto para inducir una variación de medida óptica detectable;
- -
- el centrifugado del contenido del tubo con el fin de provocar la migración de los microorganismos presentes en la muestra hasta el sistema gelificado y promover en el mismo su desarrollo;
- -
- la detección de la presencia o de la ausencia de los microorganismos en dicho sistema mediante una detección de dicha variación de medida óptica.
Hasta aquí, esta detección se efectuaba a simple
vista y comprendía por lo tanto todos los inconvenientes de este
tipo de detección.
La invención se aplica igualmente a otros campos,
entre los cuales se encuentra principalmente la hemostasis. La
invención puede ser utilizada también en un procedimiento para
medir el tiempo de coagulación de la sangre tal como se ha descrito
en la solicitud US 4 918 984 depositada a nombre de la Sociedad
Serbio, que comprende una medida densitométrica relacionada con una
determinación del tiempo de coagulación de una muestra de plasma
sanguíneo. En este ejemplo, estas dos medida se obtienen por medio
de un dispositivo que comprende, a uno y otro lado de un recipiente
transparente, la muestra, por una parte, un dispositivo de
iluminación y, por otra parte, un fotodetector delante del cual se
coloca un filtro óptico pasa banda, estando conectado este
fotodetector con un circuito electrónico de tratamiento.
Ulteriormente, con vistas a mejorar este
dispositivo, se ha previsto, además:
- -
- por una parte, un
dispositivo de filtración, que comprende varios filtros luminosos
móviles, que pueden ser colocados sucesivamente en la trayectoria
del haz luminoso emitido por la lámpara de incandescencia
(dispositivo
\hbox{de iluminación)}, y
- -
- por otra parte, un circuito de muestreo apto para tomar muestras de la señal de medida proporcionada por el fotodetector, en sincronismo con el desplazamiento de los filtros y para asociar con cada muestra un identificativo correspondiente al filtro utilizado durante el muestreo.
Teóricamente, esta solución es susceptible de
permitir el seguimiento en el tiempo real de las variaciones del
haz detectado para cada una de las zonas de longitudes de onda de
los filtros.
En realidad, no permite obtener resultados
satisfactorios principalmente debido a que el período de
desplazamiento de los filtros permanece relativamente importante
(sin que pueda considerarse su reducción) y que conduce a un
muestreo con una periodicidad del orden de 2 segundos. Es evidente
que, teniendo en cuenta esta periodicidad y el desfasado temporal
de las señales detectadas, las comparaciones efectuadas entre estas
señales son dudosas y, de cualquier forma, el error sobre la
localización del viraje sigue siendo relativamente importante.
Además, debido a la parte electromecánica que hace intervenir, esta
solución es relativamente costosa y necesita un mantenimiento
relativamente pesado.
Así pues, la invención tiene igualmente por
objeto resolver estos problemas de lentitud, de mantenimiento y de
mecánica pesada.
Por otra parte, la patente US A 5 489 977 propone
un procedimiento que consiste en ejecutar, en el transcurso de un
período de tiempo relativamente corto, dos exposiciones sucesivas
de la muestra bajo la misma incidencia pero con impulsos luminosos
comprendidos en dos gamas de frecuencia diferentes, la medida y el
análisis de las intensidades del rayo luminoso transmitido después
de su paso a través de la muestra.
Sin embargo, las informaciones recogidas no
permiten determinar de una forma satisfactoriamente precisa y sin
riesgo de falseo negativo, un viraje de la muestra.
Lo mismo ocurre en la estación de medida descrita
en la patente EP-A-0 635 570, que
detecta la densidad de la radiación luminosa procedente de dos
fuentes de luz distintas.
Así pues, la invención tiene además por objeto
suprimir estos inconvenientes.
La invención propone, por lo tanto, un
procedimiento de detección de tipo estático y sin mantenimiento,
que consiste en ejecutar, en el transcurso de un período de tiempo
relativamente corto, del orden del milisegundo hasta la decena de
milisegundos, una secuencia de operación, que comprende las etapas
siguientes:
- -
- una primera exposición de la muestra a un primer impulso luminoso incidente, cuyas ondas luminosas están comprendidas en una primera gama de frecuencia, siendo emitido este impulso por una primera fuente luminosa optoelectrónica,
- -
- una primera medida de tipo turbidimétrico por un primer detector optoelectrónico situado sensiblemente en el eje de dicho impulso incidente de la intensidad luminosa transmitida de dicho impulso, tras su paso a través de dicha muestra,
- -
- el almacenamiento del resultado de esta primera medida en una memoria,
- -
- una segunda exposición de la muestra a un segundo impulso luminoso incidente, que presenta sensiblemente la misma incidencia que el primero, cuyas ondas luminosas están comprendidas en una segunda gama de frecuencia, siendo emitido este impulso por una segunda fuente luminosa optoelectrónica,
- -
- una segunda medida de tipo turbidimétrico por dicho primer detector de la intensidad luminosa de dicho segundo impulso tras su paso a través de dicha muestra,
- -
- el almacenamiento, en dicha memoria, del resultado de esta segunda medida.
Según la invención, este procedimiento se
caracteriza porque comprende, además, en dicho período de
tiempo
- -
- una tercera exposición de la muestra a un tercer impulso luminoso (IL_{3}) orientado perpendicularmente a los otros dos impulsos,
- -
- una tercera medida de tipo nefelométrico de la intensidad luminosa de la radiación emitida por la muestra en respuesta a este tercer impulso, por medio de dicho detector (DO),
- -
- el almacenamiento en memoria de los resultados de esta tercera medida en dicha memoria, y
- -
- efectuándose un análisis de los resultados, almacenados en dicha memoria, durante o después de dicho período de tiempo.
Ventajosamente, la duración de dichos impulsos
luminosos podrá ir desde una décima de milisegundo hasta algunos
milisegundos.
Ventajosamente, dicho detector será del tipo
espectrofotométrico con el fin de poder efectuar una medida de
fluorescencia de la muestra.
Esta medida de fluorescencia podrá estar
conjugada, además, con un análisis de tipo nefelométrico, que tiene
en cuenta las propiedades de difusión óptica de la muestra.
De este modo, en el caso de la detección de la
presencia de bacterias, será posible realizar una tabla de variedad
que permita explotar las variaciones de propiedad óptica de la
muestra medidas por los detectores y deducir una indicación sobre la
importancia de las poblaciones de bacterias, entendiéndose que:
- -
- un número poco elevado de bacterias se traduce en una fluorescencia,
- -
- un aumento de las bacterias engendra una disminución de la fluorescencia, permaneciendo transparente la muestra,
- -
- un número elevado de bacterias engendra un estado no transparente, no fluorescente detectable por la medida nefelométrica.
Merced a estas disposiciones, las diferentes
medidas que son prácticamente simultáneas, (período de medida muy
corto) se efectúa en las mismas condiciones y, por lo tanto, son
muy seguras. Además, la interpretación de los resultados de medida
es mucho menos aleatoria y ya no hay que tener falsos negativos.
Un modo de ejecución de un dispositivo para la
realización del procedimiento según la invención, se describirá a
continuación, a título de ejemplo no limitativo, con referencia a
los dibujos adjuntos, en los que:
la figura 1 es una representación esquemática que
ilustra el principio de un dispositivo de detección de las
variaciones de propiedades ópticas de una muestra en presencia de
un reactivo;
la figura 2 es una representación esquemática del
detector espectrofotométrico utilizado en el dispositivo de la
figura 1;
la figura 3 es un diagrama, que ilustra el
principio de una detección simplificada de la fluorescencia de la
muestra;
la figura 4 es un diagrama temporal de una
secuencia de medida utilizada en un período de medida por el
dispositivo de la figura 1;
la figura 5 es una tabla de variedad utilizada
para explotar los resultados de las medidas efectuadas por el
dispositivo;
la figura 6 es una representación esquemática de
un aparato de análisis automático que utiliza un dispositivo de
detección según la invención para efectuar análisis bioquímicos en
hemóstasis.
Las figura 7 y 8 son curvas representativas de
los valores detectados por un aparato de lectura según la invención
en el caso de tubos SCREEN GEL® Uri (figura 7) y de tubos SCREEN
GEL® mycobact (figura 8).
En el ejemplo ilustrado en las figuras 1 a 4, la
muestra 1, que se desea analizar, está contenida en un recipiente
transparente 2, por ejemplo un tubo de ensayo, de eje perpendicular
al eje de un montaje óptico, que comprende un sistema de emisión de
un haz luminoso incidente que comprende, por una parte, al menos
dos fuentes luminosas SL_{1}, SL_{2} conectadas con una cabeza
de emisión 3, situada en las proximidades del tubo 2, por
intermedio de dos guías ópticas respectivas 4, 5 constituidas,
respectivamente, por un filtro óptico y, por otra parte, una tercera
fuente luminosa SL_{3} conectada por medio de una guía óptica 6
con una cabeza de emisión 7 de eje perpendicular al eje de la cabeza
3. Al menos una segunda fuente luminosa SL_{4} suplementaria,
representada en trazos discontinuos, podrá estar conectada con la
cabeza de emisión 3, por intermedio de una guía que onda
correspondiente.
Las fuentes luminosas SL_{1}, SL_{2},
SL_{4} están constituidas por diodos electroluminiscentes, cuya
radiación luminosa es filtrada por los filtros F_{1}, F_{2},
F_{4}, respectivamente rojo (entre 600 nm y 700 nm) para la
fuente SL_{1} y verde (entre 550nm y 650 nm) para la fuente
SL_{2}. Igualmente, la fuente SL_{3} comprende un diodo D_{3}
y un filtro rojo F_{3}.
Los diodos D_{1} hasta D_{4} están pilotados
por un microprocesador MP con el fin de emitir impulsos luminosos
sucesivos, por ejemplo 2 ms, en el transcurso de un período de
medida por ejemplo de 10 ms.
El dispositivo comprende, por otra parte, al
menos un circuito de detección DO, en este caso dos circuitos
DO_{1} y DO_{2} conectados con una cabeza de recepción 3' a
través de dos filtros respectivos, dispuestos en el eje de la
cabeza de emisión 3, en el lado del tubo 2 situado en la parte
opuesta a la de dicha cabeza 3.
Los detectores DO_{1}, DO_{2}, cada uno de
los cuales comprende un fotodiodo asociado con un filtro, están
pilotados con el microprocesador con el fin de tomar muestras de
medida durante el período de emisión de los diodos D_{1} hasta
D_{4} y atribuirles un identificativo.
Las señales de medida producidas por los
detectores DO_{1}, DO_{2} son numerizadas por intermedio de un
convertidor analógico/numérico A/N, antes de ser aplicada al
microprocesador MP.
Evidentemente, el microprocesador MP está
asociado con periféricos tales como, por ejemplo, una consola de
teclado/pantalla CE, un terminal de entrada/salida TES por ejemplo
de tipo RS232, y una unidad de memoria MEM.
En el ejemplo representado en la figura 2, el
detector DO, que puede substituir a los detectores DO_{1},
DO_{2}, es de tipo espectrofotométrico. Este está compuesto por un
objetivo OF, que permite proyectar hasta el infinito el haz
luminoso producido por la cabeza 3 o que se obtiene por difusión de
la luz producida por la cabeza 7 sobre un elemento dispersivo ED tal
como un prisma o una red por intermedio de un filtro F'_{4}.
La luz, dispersada por el elemento ED, es
detectada, entonces, por una barreta de elementos fotosensibles EP,
por ejemplo una barreta de tipo CCD, pilotada por el
microprocesador MP.
Merced a esta disposición, es posible obtener el
espectro de la luz transmitida a través de la muestra o difundida
por la misma y determinar, además, la fluorescencia de la muestra
(que presenta un pico, cuya longitud de onda está desfasada con
relación a la de la luz incidente).
En la figura 2 se ha representado un diagrama de
intensidad luminosa en función de la longitud de onda, que hace
aparecer un desfasado de aproximadamente 50 nm entre un haz de luz
incidente, procedente de la cabeza 3, y transmitido a través de la
muestra (pico P_{1}) y la luz emitida por fluorescencia (pico
P_{2}).
La invención no se limita a un detector
espectrofotométrico de este tipo para medir la fluorescencia.
En efecto, es posible efectuar un gran número de
medidas si se utilizan combinaciones apropiadas de filtros
asociados con las fuentes luminosas SL_{1} hasta SL_{4} y con
dos detectores DO_{1}, DO_{2}.
De este modo, para efectuar una medida de
fluorescencia, será posible asociar con una de las fuentes
SL_{1}, SL_{2}, SL_{4}, por ejemplo, con la fuente SL_{4} un
filtro paso bajo F_{4} que acentúe la luz verde pero que no deje
pasar la luz azul, y tener previsto un detector, por ejemplo el
detector DO_{2} equipado con un filtro de tipo paso alto que deja
pasar la luz azul engendrada por la fluorescencia.
El diagrama ilustrado en la figura 3 (intensidad
luminosa I función de la longitud de onda nm) muestra,
esquemáticamente:
- -
- la respuesta R_{1} del diodo electroluminiscente de la fuente SL_{4} a un impulso eléctrico,
- -
- la curva de filtro paso bajo PB asociada con el diodo electroluminiscente,
- -
- la luz transmitida al detector DO_{2} después de su paso a través de la muestra, estando desfasada la frecuencia de esta luz hacia el azul debido a la fluorescencia (curva R_{2}),
- -
- la curva de filtro paso alto PH asociada con el detector DO_{2}, que deja pasar la luz azul engendrada por fluorescencia.
El detector DO_{1} podrá consistir entonces en
un simple fotodiodo, que sirva para efectuar las medidas
turbidimétricas y nefelométricas.
Como se ha mencionado precedentemente, el
microprocesador MP acciona una sucesión de secuencias de medida,
cada una de las cuales comprende, en el interior de un período de
medida muy corto T, por ejemplo del orden de 10 ms, tres impulsos
luminosos de baja duración d, del orden de 2 ms, siendo engendrado
el primer impulso IL_{1} por la fuente SL_{1}, un segundo
impulso IL_{2} es engendrado por la fuente SL_{2}, mientras que
el tercer impulso luminoso IL_{3} es engendrado por la fuente
SL_{3} (figura 4).
En el transcurso de estos tres impulsos
luminosos, bajo el accionamiento del microprocesador MP, el
detector DO toma tres muestras de medida respectivas, a saber:
- -
- una primera muestra E_{1}, a partir de la cual se determinan:
- -
- la intensidad IT_{1} de luz roja transmitida, procedente de la fuente SL_{1} (longitud de onda 590 nm),
- -
- la intensidad IF_{1} de luz emitida por fluorescencia, cuya longitud de onda se encuentra desfasada con relación a la luz incidente, por ejemplo con un valor de 50 nm,
- -
- una segunda muestra E_{2} a partir de la cual se determinan:
- -
- la intensidad luminosa transmitida IT procedente de la fuente SL_{2} para una longitud de onda de 540 nm y, eventualmente,
- -
- la intensidad de luz emitida por fluorescencia,
- -
- una tercera muestra E_{3} que permite determinar la intensidad luminosa difundida como consecuencia de la iluminación por la fuente SL_{3} (medida nefelométrica).
Estas diferentes medidas permiten determinar, de
una manera relativamente precisa y sin riesgo de falsos negativos,
las variaciones de propiedades ópticas de la muestra, por ejemplo,
bajo el efecto de las secreciones enzimáticas de las bacterias sobre
un substrato cromógeno, entendiéndose que:
- -
- cuando el número de bacterias es pequeño, se obtiene una señal fluorescente importante;
- -
- cuando el número de bacterias se eleva, la fluorescencia disminuye, mientras que la muestra permanece transparente;
- -
- en presencia de un número importante de bacterias, la muestra se vuelve opaca y difunde la radiación luminosa incidente; esta señal nefelométrica se vuelve preponderante;
- -
- las intensidades citadas de las luces emitidas por las dos fuentes SL_{1}, SL_{2} varían de manera inversa entre sí, en función del color de la muestra y, por lo tanto, de la importancia de la población bacteriana.
La figura 5 muestra un ejemplo de tabla de verdad
simplificada que tiene en cuenta tres estados lógicos de los
valores medidos, a saber: el estado -1, que comprende a valores
medidos inferiores a un valor de umbral menor que S-, un estado 0,
que corresponde a valores medidos comprendidos entre el umbral
inferior S- y un umbral superior S+, y el estado +1, que corresponde
a valores medidos mayores que el umbral superior S+.
Es evidente que si se elige convenientemente los
umbrales S+ y S-, la detección del viraje de la muestra se obtendrá
mediante la detección de paso simultáneo a 0 de los valores de los
parámetros LB, LV, N y F.
Ventajosamente, un dispositivo similar al que
acaba de describirse, podrá equipar un aparato de análisis
hemostático automático del tipo que se ha descrito ya en la
solicitud de patente FR Nº 98 07484, depositada el 10 de Junio de
1998, a nombre de la solicitante, y cuya representación esquemática
se ha indicado en la figura 6.
Este aparato hace intervenir una pluralidad de
cubetas C transparentes, destinadas a contener, respectivamente,
una muestra líquida a ser analizada. Estas cubetas C están fijadas
sobre una banda soporte B, que se desplaza sucesivamente a través
de un puesto de incisión 23 de la banda B, un puesto de pipetado
24, un puesto de detección 25, equipado con un dispositivo del tipo
del que se ha representado en la figura 1, y un puesto 26 de
recuperación de la banda B dotada con sus cubetas C usadas.
El puesto de pipetado 24 está servorizado por una
pipeta vertical 30, móvil en altura. Esta pipeta 30 está fijada por
una de sus extremidades a un brazo 31 montado de manera giratoria
alrededor de un eje vertical 32 con el fin de poder ser conducido
por rotación, sucesivamente hasta el área de pipetado 24, hasta un
área de enjuagado 33 y hasta dos áreas de toma 34, 35.
Las áreas de toma 34, 35 están situadas en el
trayecto de los recipientes R_{1}, R_{2} portados por dos
carruseles respectivos CR_{1}, CR_{2} móviles en rotación
alrededor de dos ejes verticales 37, 38, accionados por dos
servomotores, estando destinado uno de los carruseles CR_{1} a
contener los recipientes R_{1} de muestras, mientras que el otro
CR_{2} contiene recipientes R_{2} aceptados a los reactivos
utilizados en el amito de los análisis que se quieren efectuar.
El procesador P acciona secuencias de pipetado
que comprenden, sucesivamente:
- -
- un enjuagado previo de la pipeta 30,
- -
- la toma de una dosis de muestra contenida en uno de los recipientes R_{1} del carrusel CR_{1},
- -
- la inyección de esta dosis en una cubeta C, situada en el puesto de pipetado 24,
- -
- el enjuagado de la pipeta 30,
- -
- la toma de una dosis de reactivo contenido en uno de los recipientes R_{2} del carrusel CR_{2},
- -
- la inyección de esta dosis de reactivo en la cubeta C,
- -
- el inicio de al menos una secuencia de medidas, tal como se ha descrito anteriormente, con vistas a efectuar la detección de un viraje y/o una evaluación cuantitativa de uno o varios constituyentes de la muestra.
Un estudio preliminar de factibilidad ha
permitido mostrar que el dispositivo según la invención
proporcionaba excelentes resultados para la detección rápida de las
bacterias urinarias para eliminar una infección urinaria y la
detección de las micobacterias en las tomas biológicas.
Los ensayos efectuados en el transcurso de este
estudio se han referido a muestras contenidas en dos tipos
diferentes de tubos, que contienen un mismo substrato y concebidos
para asegurar una concentración de los microorganismos de la
muestra a ser ensayada en una zona de revelado, con dimensiones
reducida, constituidos por un capilar, a saber:
- -
- tubos de tipo SCREEN GEL® mycobact que comprenden un capilar en el que se concentran las micobacterias tras agitación, por sedimentación con el gel,
- -
- tubos de tipo SCREEN GEL® Uri, que comprenden un capilar que contiene una fase gel de revelado en la que los microorganismos penetran por centrifugado.
- 1)
- Para el tubo SCREEN GEL® mycobact, la influencia del gel sobre la lectura efectuada por el dispositivo según la invención ha sido estudiada merced a una serie de ensayos en sistema purificado que utiliza tubos que contienen 0,5 ml de un medio de cultivo con gel.
La fluorescencia ha sido estudiada por medio de
un aparato de preserie según la invención, utilizado como aparato
de referencia y acoplado con un mismo procesador programado con el
fin de poder visualizar sobre una pantalla las curvas de
resultado.
Estos ensayos han mostrado que, la lectura de
cambio de color era más fácil y más precoz en presencia de gel.
La fluorescencia F ha sido leída paralelamente al
cambio de color y se ha constatado que el aumento de fluorescencia
(\DeltaF) calculado con relación a la fluorescencia leída en el
momento del cambio de color, con relación a la fluorescencia de
partida (R = Ftx/Ft0) es mayor y más precoz en presencia de gel
(m\DeltaF > 3,8) que en ausencia de gel (m\DeltaF> 2,9),
independientemente del inoculum (10^{6} y 10^{4}
UFC/ml).
- 2)
- Para el tubo SCREEN GEL® Uri, la concentración de las bacterias está asegurada por centrifugado en la parte capilar del tubo que contiene la fase gel
La determinación de las ventanas de lectura de
los dos tipos de tubos ha resultado de un centenar de medidas de
fluorescencia, de nefelometría y de turbidimetría, efectuadas
partiendo del fondo del tubo hacia la parte superior del
capilar.
Para el tubo SCREEN GEL® Uri, las ventanas de
lectura están delimitadas por la turbidimetría: como puede verse en
la figura 7, el fondo del tubo está representado por el primer pico
de turbidimetría; la parte superior del capilar está representada
por la disminución de turbidimetría en presencia de desechos o por
la disminución de fluorescencia por la interfase gel muestra sin
desechos.
Para el tubo SCREEN GEL ® mycobact (figura 8), no
hay ventana de fin de lectura puesto que no hay interfase gel
muestra. Los valores de fluorescencia y de nefelometría leídos son,
por lo tanto, máximos independientemente de su localización.
En las figuras 7 y 8,
VB significa valores brutos,
T significa valores turbidimétricos,
VBT significa valores brutos de turbidimetría
leídos en la ventana de lectura,
F1 significa la ventana de inicio de lectura,
F2 significa la ventana de fin de lectura.
Se ha efectuado un estudio en sistema purificado
sobre la evolución de los parámetros del aparato de lectura en
presencia de microbacterias.
- 1)
- Se constata que la turbidimetria no evoluciona en función del crecimiento de las micobacterias, independientemente del inoculum y de la concentración en substrato.
- 2)
- El aumento de la nefelometría está relacionado, por su parte:
- -
- con la rapidez de crecimiento de la cepa: la variación de nefelometría es tardía independientemente de las cepas,
- -
- con el tamaño del inoculum: la variación de nefelometría es tanto más tardía cuanto más pequeño sea el inoculum. Existe un retardo de cuatro días para la cepa M. kansasii a 10^{6} UFC/ml y de 8 días para esta cepa 10^{4} UFC/ml. Lo mismo ocurre para la cepa M.tuberculosis (retardo de 6 y 9 días respectivamente),
- -
- con la concentración del substrato: la variación de N es tanto menor y más tardía cuanto más disminuya la concentración en substrato.
Para la cepa M.avium, aparece al cabo de 5
días para una concentración de substrato en 22,7 mg/l y al cabo de
11 días para una concentración de 11,35 ml/g.
Por lo tanto se ve que el aumento de
nefelometría, testigo de la multiplicación bacteriana, es tardía.
Este parámetro presenta, por lo tanto, poco interés en sistema
purificado.
- 3)
- En lo que se refiere a la fluorescencia, el aumento de fluorescencia \DeltaF depende:
- -
- de la velocidad de crecimiento de la cepa: siendo proporcional al crecimiento,
- -
- del inoculum: es tanto más precoz y más intenso cuanto más importante sea el inoculum,
- -
- de la concentración en substrato: es más precoz cuando la concentración en substrato disminuye para la cepa M.tuberculosis, de CMI pequeño (CMI 20 mg/l) y par a la cepa de M.kansasii, cuyo crecimiento está ralentizado por el substrato. La concentración óptima de substrato es de 11 mg/l,
- -
- de la estabilidad a 37ºC de los tubos testigo: el aumento de F(\DeltaF) de los tubos testigo de progresivo. El aumento de fluorescencia de los tubos de ensayo debe ser mayor que la de los tubos testigo incubados en las mismas condiciones para que el ensayo sea positivo. Para simplificar la lectura, preferimos calcular la relación fluorescencia F (ensayo) / fluorescencia (testigo), antes que calcular el aumento de fluorescencia con relación a to para los tubos de ensayo y para los tubos testigo.
El ensayo es positivo cuando la relación sea >
1,55. Este está limitado cuando la relación esté comprendida entre
1,4 y 1,55; en este caso, es necesario llevar a cabo ventajosamente
una incubación.
La determinación de la fluorescencia es sensible
(relación de 1,5 a 3,0) y precoz incluso más precoz que la
fluorescencia del tubo MGIT, sobre todo para las cepas de
crecimiento lento: M.xenopi y M.tuberculosis.
La determinación de la fluorescencia permite, por
lo tanto, una detección precoz y sensible de la actividad
respiratoria de las micobacterias. La lectura sobre el aparato
permite disminuir la concentración en substrato, que inhibe sobre
todo el crecimiento de las cepas de M. tuberculosis.
D) Un estudio en sistema de toma de muestras
sobrecargadas ha permitido determinar la evolución de los
parámetros del aparato de lectura en ausencia de micobacterias y en
presencia de micobacterias.
En ausencia de micobacterias, se han realizado
las constataciones siguientes:
- -
- la estabilidad del substrato a 45ºC y a 37ºC es similar el sistema de toma de muestras (n=3) y el sistema purificado,
- -
- la fluorescencia aumenta progresivamente y de la misma manera que el sistema purificado. La relación F de tubos testigo con tomas de muestra con relación a un tubo testigo con tampón es < 1,3,
- -
- la nefelometría refleja la presencia de desechos en las tomas de muestra.
- -
- En presencia de micobacterias, la relación de fluorescencia de las tomas de muestra sobrecargadas se ha determinado en tubos que contienen aproximadamente 11 mg/l de substrato y tomándose como referencia un tubo testigo con tampón, y el mismo umbral que en el caso precedente, Se constata que los plazos de detección medios son más cortos que con el tampón. Sin embargo, parece ser que la presencia de desechos en grandes cantidades retarda o marca la aparición del color rosa y de la fluorescencia, sobre todo para las cepas M.tuberculosis.
La determinación de la fluorescencia por el
aparato permite, por lo tanto, la detección de las micobacterias en
tomas de muestra sobrecargadas en plazos similares. Los otros
parámetros no presentan interés.
Como conclusión, el aparato según la invención es
utilizable para la lectura de tubos SCREEN GEL® mycobact:
- -
- cuando se utilizan los tubos sin centrifugado,
- -
- cuando se reduce la concentración de substrato, revelador de la fluorescencia. La concentración inicial seleccionada para visualizar correctamente un cambio de color inhibe, o retarda, el crecimiento de las cepas de M. tuberculosis, en particular.
Sin embargo, cuando se simplifica el modo de
detección,
- -
- no es necesario delimitar ventanas de lectura,
- -
- la fluorescencia es el único parámetro que presenta un interés como marcador de la actividad de las micobacterias,
- -
- el valor bruto de fluorescencia indicado es el valor máximo leído durante el trayecto recorrido por el capilar; este es independiente de su localización en el capilar,
- -
- la detección de la fluorescencia es suficiente, no existe extinción de F relacionada con la aparición del derivado incoloro no fluorescente puesto que la lectura cinética necesaria y a continuación semanal se detiene desde el momento en que aparece la generación del derivado rosa fluorescente,
- -
- la lectura se efectúa tomando como referencia un tubo testigo con tampón, incubado en las mismas condiciones que los tubos d a ser ensayados.
La interpretación de la relación de fluorescencia
de los tubos a ser ensayados sobre F del tubo testigo permite
paliar la evolución de fluorescencia durante los dos meses de
incubación a 37ºC y por lo tanto la inestabilidad del substrato a
esta temperatura,
- -
- la medida de fluorescencia sobre el aparato permite una determinación cuantitativa, y precoz, del cambio de color y hace que el resultado sea independiente del operador,
- -
- el reglaje del aparato está limitado a la fibra de fluorescencia; el calibrado a la utilización de controles positivos y el control a la utilización de los tubos SCREEN GEL® mycobact.
Claims (12)
1. Procedimiento para la detección de una
variación de las propiedades ópticas de una muestra a ser
analizada, consistiendo este procedimiento en ejecutar, en el
transcurso de un período de tiempo relativamente corto, del orden
del milisegundo hasta la decena de milisegundos, una secuencia de
operaciones que comprende, al menos, las etapas siguientes:
- -
- una primera exposición de la muestra a un primer impulso luminoso incidente (IL_{1}) cuyas ondas luminosas están comprendidas en una primera gama de frecuencia, siendo emitido este impulso (IL_{1}) por una primera fuente luminosa optoelectrónica (SL_{1}),
- -
- una primera medida de tipo turbidimétrico, por un detector opto electrónico (DO), situado sensiblemente en el eje de dicho primer impulso incidente (IL_{1}) de intensidad luminosa transmitida por dicho primer impulso, después de su paso a través de dicha muestra,
- -
- el almacenamiento del resultado de esta primera medida en una memoria (MEM),
- -
- una segunda exposición de la muestra a un segundo impulso luminoso incidente (IL_{2}), que presenta sensiblemente la misma incidencia que el primero, cuyas ondas luminosas están comprendidas en una segunda gama de frecuencia, siendo emitido este impulso (IL_{2}) por una segunda fuente luminosa optoelectrónica (SL_{2}),
- -
- una segunda medida de tipo turbidimétrico de la intensidad transmitida de dicho segundo impulso por el citado detector (DO) después de su paso a través de dicha muestra,
- -
- el almacenamiento de los resultados de esta segunda medida en dicha memoria (MEM),
caracterizado porque comprende, además, en
dicho período de tiempo
- -
- una tercera exposición de la muestra a un tercer impulso luminoso (IL_{3}) orientado perpendicularmente a los otros dos impulsos,
- -
- una tercera medida de tipo nefelométrico de la intensidad luminosa de la radiación emitida por la muestra, como respuesta a este tercer impulso, por medio de dicho detector (DO),
- -
- el almacenamiento en memoria de los resultados de esta tercera medida en dicha memoria, y
- -
- efectuarse un análisis de los resultados almacenados en dicha memoria durante o después de dicho período de tiempo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende una sucesión de secuencias de
operación y un análisis comparativo de los resultados de esta
secuencia.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la duración de
dichos impulsos luminosos (IL_{1}, IL_{2}, IL_{3}) es del
orden de una décima de milisegundos hasta algunos milisegundos.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque
comprende, además en el transcurso de una de las dos primeras
medidas, una determinación de la fluorescencia de la muestra.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dichas
medidas se efectúan por medio de varios detectores, uno de los
cuales es utilizado específicamente para la determinación de la
fluorescencia.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque la medida de la fluorescencia se
obtiene por la conjugación del filtrado uno de dichos impulsos de
luz incidente por un filtro paso bajo, que acentúa la luz verde,
pero que no deja pasar la luz azul, y una filtración de la luz
transmitida, con respuesta a dicho impulso por medio de un filtro
paso alto, que deja pasar la luz azul engendrada por la
fluorescencia.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque las citadas medidas son de tipo
espectrofotométrico.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el
análisis de los resultados se efectúa merced a una tabla de verdad
previamente memorizada.
9. Dispositivo para la detección de una variación
de las propiedades ópticas de una muestra a ser analizada, que
comprende:
- -
- una fuente luminosa (SL_{1}), que emite en una primera gama de longitud de onda, un haz luminoso aplicado por intermedio de una primera guía óptica (4) con una primera cabeza de emisión (3), cuyo eje se encuentra sobre un recipiente transparente (2) que contiene una muestra 1 a ser analizada,
- -
- una segunda fuente luminosa SM2 que emite en una segunda gama de longitud de onda, un haz luminoso aplicado a dicha primera cabeza de emisión (3),
- -
- al menos un detector optoelectrónico (DP) colocado en el eje de la primera cabeza (3) en un emplazamiento situado al lado del recipiente situado en el lado puesto de dicha primera cabeza (3),
caracterizado porque comprende,
además:
- -
- una tercera fuente luminosa (SL_{3}), conectada por intermedio de una tercera guía óptica (6) con una segunda cabeza de emisión (7) cuyo eje se encuentra sobre el recipiente (2), perpendicularmente al eje de dicha primera cabeza (3), sirviendo esta tercera cabeza luminosa (SL_{3}) para efectuar una medida nefelométrica y que está pilotada por un microprocesador (MP),
- -
- pilotando dicho microprocesador MP las citadas fuentes luminosas (SL_{1}, SL_{2}, SL_{3}) y dicho detector (DO), con el fin de accionar una secuencia grande de medida, que comprende, en el interior de un período de medida muy corto, del orden de 1 milisegundo hasta 10 milisegundos, tres impulsos luminosos sucesivos de pequeña duración D, del orden de 2 milisegundos, engendrados respectivamente por las tres fuentes (SL_{1}, SL_{2}, SL_{3}), estando programado este microprocesador (MP) para efectuar un análisis de los resultados de las medidas efectuadas por el detector.
10. Dispositivo según la reivindicación 9,
caracterizado porque las fuentes luminosas (SL_{1},
SL_{2}, SL_{3}) comprenden, respectivamente, un diodo
electroluminiscente (D_{1}, D_{2}) y un filtro óptico (F_{1},
F_{2}, F_{3}).
11. Dispositivo según una de las reivindicaciones
9 y 10, caracterizado porque dicho detector (DO) es de tipo
espectrofotométrico.
12. Dispositivo según una de las reivindicaciones
9 a 11, caracterizado porque está integrado con el puesto de
medida de un aparato de análisis automático, que hace intervenir
una pluralidad de cubetas transparentes (C), cada una de las cuales
está destinada a contener una muestra líquida a ser analizada,
estando fijadas estas cubetas (C) sobre una banda soporte (P) que
se desplaza sucesivamente a través de un puesto de incisión (23) de
la banda (B) de un puesto de pipetado (24), de dicho puesto de
medida y de un puesto de recuperación de la banda (B), dotada con
sus cubetas usadas.
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