ES2208637T3

ES2208637T3 - Nueva proteasa fungica.

Info

Publication number: ES2208637T3
Application number: ES93810243T
Authority: ES
Inventors: Frank Dr. Buxton; Albert Dr. Hinnen; Jacob Prof. Dr. Visser
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1992-04-15
Filing date: 1993-04-06
Publication date: 2004-06-16
Anticipated expiration: 2013-04-06
Also published as: EP0574347A2; MX9302202A; CY2507B1; AU663173B2; JPH0646863A; NO931368D0; JP3424840B2; EP0574347B1; NZ247397A; FI931634L; HU219809B; DK0574347T3; NO931368L; JP2003235591A; DE69333249T2; FI931634A0; EP0574347A3; IL105383A0; FI112667B; ATE252156T1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION CONCIERNE A NUEVA SECUENCIA DE DNA CODIFICADA PARA UNA SERINA PROTEASA ASPERGILLUS DE TIPO SUBTILISINA, UNA SERINA PROTEASA ASPERGILLUS DE TIPO SUBTILISINA POR SI MISMA Y UN METODO PARA SU PREPARACION. LA INVENCION ADEMAS CONCIERNE A NUEVA CADENA MUTANTE DEFECTUOSA DE ASPERGILLUS EN UNA SERINA PROTEASA DE TIPO SUBTILISINA, LA CUAL SE USA PARA LA EXPRESION DE PROTEINA HETEROLOGA, Y UN METODO PARA LA PREPARACION DE TAL CADENA MUTANTE.

Description

Nueva proteasa fúngica.

La presente invención se refiere a una nueva secuencia de ADN que codifica para una proteasa de serina de Aspergillus niger y a un método para su preparación. La invención además se refiere a una nueva cepa de Aspergillus niger defectuosa en un gen pepC y/o pepD, que es útil para la expresión de una proteína heteróloga, y a un método para la preparación de tal cepa.

Antecedentes de la invención

Las especies de Aspergillus y, en particular, Aspergillus niger, se usan en la producción industrial de enzimas usados en la industria del procesamiento de alimentos. A. niger tiene ventajas como hospedador para la producción de proteínas recombinantes por su gran capacidad de secreción de proteínas y porque se dispone de sistemas para su manipulación genética molecular. Sin embargo, se ha demostrado que la presencia de proteasas en el líquido de cultivo es perjudicial para la expresión de proteínas heterólogas en A. niger; de hecho, los Aspergilli se han usado comercialmente para producir proteasas. Se han descrito varias proteasas extracelulares de Aspergillus en la bibliografía [Barthomeuf et al., Biotech. Tech. 2: 29-34 (1988); Barthomeuf et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 37: 1333-1336 (1989); Bosmann, H.B., Biochim. Biophys. Acta 293: 476-489 (1973); Ichishima, E., Biochim. Biophys. Acta 258: 274-288 (1972); Chopra, S. y Mehta, P., Folia Microbiol. 30: 117-125 (1985); Krishnan y Vijayalakshimi, J. Chromatogr. 329: 165-170 (1985)]. El gen pepA que codifica aspergilopepsina A de Aspergillus awamori se ha clonado recientemente [Berka et al., Gene 86:153-162 (1990)]. El producto del gen pepA es responsable de la parte principal de proteasas ácidas secretadas de A. niger y cepas en las que el gen pepA se ha delecionado han permitido incrementar la expresión de proteínas heterólogas en A. niger var. awamori [Dunn-Coleman et al., Biotechnology 9: 976-981 (1991)]. Recientemente también se han clonado otros genes de proteasas de Aspergilli y éstos incluyen una proteasa de serina alcalina de A. oryzae [Tatsumi et al., Mol. Gen. Genet. 219: 33-38 (1989)], una proteasa de serina alcalina de A. fumigatus [Jaton-Ogay et al., FEMS Microbiol. Letts 92: 163-168 (1992)], una proteasa ácida tipo no pepsina de A. niger var. macrosporus [Inoue et al., J. Biol. Chem. 266: 19484-89 (1991)], y una metaloproteasa denominada proteasa neutra II de A. oryzae [Tatsumi et al., Mol. Gen. Genet. 228:97-103 (1991)].

Se pueden usar genes de proteasas aislados y mutados de A. niger para experimentos de rotura génica, es decir, la preparación de cepas mutantes en las que se destruye el correspondiente gen natural. Por ejemplo, el gen pepA de Aspergillus awamori se ha destruido por rotura génica con el fin de preparar cepas deficientes en aspergilopepsina A (Berka et al., op. cit.).

Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, los Aspergilli producen un gran número de proteasas diferentes y, por lo tanto, existe una necesidad continua de cepas de Aspergillus deficientes en otras proteasas para la producción industrial de proteínas. Para este propósito, también existe la necesidad de otros genes de proteasas que pueden usarse para la preparación de cepas deficientes en proteasas por mutagénesis in vitro, por ejemplo, rotura génica. Además, también existe la necesidad de proteínas proteasas recombinantes que se pueden aplicar industrialmente para el procesamiento de proteínas.

Otro constituyente principal de las actividades de proteasas secretadas en A. niger son proteasas de serina [Sakka et al., J. Ferment. Technol. 63: 479-483 (1985)]. Las proteasas de serina de los hongos se han caracterizado a fondo en el moho T. album y la levadura Saccharomyces cerevisiae. Probablemente, T. album secreta tres proteasas de serina relacionadas, siendo la mejor caracterizada la proteinasa K [Jany et al., FEBS 199: 139-144 (1986)], mientras que la proteína homóloga en levadura se localiza en la vacuola [Wolf y Ehmann, Eur. J. Biochem. 98: 375-384 (1979)]. Los genes para todas estas proteínas de T. album y S. cerevisiae se han clonado y caracterizado [Gunkel y Gassen, Eur. J. Biochem. 179: 185-194 (1989), Samal et al., Gene 85: 329-333 (1989), Samal et al., Molec. Microbiol 4:1789-1792(1990), y Moehle et al., Molec. Cell. Biol. 7: 4390-99 (1987)]. También se han clonado y caracterizado proteasas de serina alcalinas en A. oryzae, en A. fumigatus y en Achremonium chrysogenum [Tatsumi et al., Mol. Gen. Genet. 219: 33-38 (1989); Jaton-Ogay et al., FEMS Microbiol. Letts. 92: 163-168 (1992); Isogai et al., Agric. Biol. Chem. 55: 471-477 (1991)].

Ahora se ha descubierto que Aspergillus también produce proteasas de serina homólogas a la familia de proteasas subtilisina. La presente invención se centra en este tipo de proteasa.

Objeto de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar una molécula de ADN que codifica una proteasa de serina de Aspergillus niger seleccionada entre el grupo compuesto por las proteasas de serina que tienen la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 y 7, respectivamente.

Otro objeto es proporcionar una proteasa de serina de Aspergillus niger recombinante del tipo subtilisina y con este propósito también una cepa de Aspergillus niger transformada para su producción.

Otro objeto es proporcionar una cepa de Aspergillus defectuosa en el gen pepC y/o el gen pepD, pudiendo usarse dicha cepa para una producción más eficaz de proteínas heterólogas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una proteasa de serina de Aspergillus del tipo subtilisina. Tal proteasa se denomina en la presente invención "subtilisina de Aspergillus". Se entiende que una "subtilisina de Aspergillus" de la presente invención (a) deriva de Aspergillus sp., (b) presenta actividad proteasa debido a un resto de serina catalítico en el sitio activo y (c) tiene suficiente homología de secuencia de aminoácidos con las proteasas de serina conocidas, agrupándose dentro de la subfamilia de la subtilisina. Sin embargo, dentro del significado de la expresión subtilisina de Aspergillus como se usa en la presente invención, también se incluyen fragmentos de tal enzima que retienen la actividad proteasa de serina, sin embargo, los enzimas de longitud completa son realizaciones preferidas. También se entenderá que forman parte de la presente invención las proteínas de fusión que contienen una "subtilisina de Aspergillus" de la invención unida a aminoácidos adicionales, péptidos o proteínas.

En un significado preferido, "subtilisina de Aspergillus" describe una proteasa o fragmento activo de Aspergillus niger, más preferiblemente una proteasa o fragmento activo que tiene la secuencia de aminoácidos o parte de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1 y 6, respectivamente.

La presente invención también se refiere a una secuencia de ADN aislada que codifica una proteasa de serina de Aspergillus niger seleccionada entre el grupo que tiene secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 2 y 7, respectivamente, y un vector híbrido para la clonación y multiplicación de tal secuencia de ADN. La invención además se refiere a un vector híbrido de expresión para la producción de una proteasa de serina de Aspergillus niger que comprende tal secuencia de ADN unida funcionalmente con regiones reguladoras adecuadas para la expresión de un gen de proteasa de serina de Aspergillus niger en una célula hospedadora adecuada. La invención también se refiere a células hospedadoras transformadas capaces de expresar Aspergillus niger, por ejemplo, una cepa de Aspergillus niger capaz de sobreexpresar Aspergillus niger debido a un número de copias incrementado del gen tras la transformación.

La invención también se refiere a una cepa de Aspergillus niger deficiente en un gen pepC y/o pepD y a un método para su producción por medio de una secuencia de ADN que codifica Aspergillus niger que ya no es capaz de expresar la proteína funcional debido a mutagénesis, por ejemplo, rotura génica.

Además, la presente invención se refiere a métodos para la preparación de una secuencia de ADN, vector híbrido, vector de expresión, así como a métodos para la expresión de una cepa de Aspergillus niger deficiente en un gen pepC y/o pepD y de una cepa hospedadora con un vector híbrido de expresión.

Descripción detallada de la invención ADN que codifica la subtilisina de Aspergillus, vectores híbridos para clonación y expresión

La presente invención se refiere a una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN seleccionada entre el grupo que codifica proteasas de serina de Aspergillus niger que tienen las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 2 y 7, respectivamente. La secuencia de ADN puede contener uno o más intrones, como los que tienen las moléculas de ADN aislables a partir de una biblioteca de ADN genómico, por ejemplo, como el gen pepC mostrado en la SEC ID Nº 1 o el gen pepD mostrado en la SEC ID Nº 6. Sin embargo, la invención también se refiere a una variante sin intrones de la secuencia de ADN, por ejemplo, tal como la que se puede aislar por clonación de ADNc o después de la mutagénesis, por ejemplo, aplicando tecnología de PCR. Tales genes sin intrones son útiles, en particular, para la expresión en hospedadores que no son Aspergillus, preferiblemente en procariotas o en levaduras.

La invención se refiere preferiblemente a una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica el PEPC de A. niger que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1 o un fragmento de ésta que retiene la actividad proteasa de serina. Una secuencia de ADN de la invención es preferiblemente la región que codifica para la proteasa PEPC madura mostrada en la secuencia de nucleótidos con SEC ID Nº 1. Sin embargo, la invención también se refiere a secuencias de ADN degenerado que codifican PEPC o un fragmento de ésta, es decir, secuencias en las que se han reemplazado nucleótidos sin cambiar la secuencia de aminoácidos codificada. Tales secuencias de ADN son útiles, por ejemplo, debido a las diferencias en el uso de codones preferido en diferentes hospedadores o debido a la presencia de nuevos sitios de reconocimiento de los enzimas de restricción

Otra realización preferida de la invención es una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la PEPD de A. niger que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 6 o un fragmento de ésta que retiene la actividad proteasa de serina. De esta manera, otra secuencia de ADN preferida de la invención también es la región que codifica la proteasa PEPD madura mostrada en la secuencia de nucleótidos con SEC ID Nº 6. Sin embargo, la invención también se refiere a las secuencias de ADN degenerado que codifican PEPC o un fragmento de ésta, es decir, secuencias en las que se han reemplazado nucleótidos sin cambiar la secuencia de aminoácidos codificada.

La invención también se refiere a un vector híbrido que comprende como inserción una secuencia de ADN que codifica un Aspergillus niger de la invención. Tal vector híbrido de la invención es útil para la propagación y multiplicación de una secuencia de ADN de la invención. Tal vector de expresión comprende un "cassette de expresión" en el que una secuencia de ADN que codifica un Aspergillus niger está unida funcionalmente a regiones reguladoras adecuadas para el control de la expresión de tal secuencia de ADN en una célula hospedadora deseada.

Un vector híbrido de la invención, incluyendo un vector de expresión, puede obtenerse a partir de cualquier vector útil en la técnica de ingeniería genética, tal como virus, fagos, cósmidos, plásmidos o ADN cromosómico, tales como los derivados de SV40, virus del herpes, virus del papiloma, retrovirus, baculovirus, fago \lambda, por ejemplo NM 989 o EMBL4, o fago M13, por ejemplo M13mp8, plásmidos bacterianos, por ejemplo pBR322, pUC18, o plásmidos de levaduras, por ejemplo plásmido 2\mu de levadura, o un virus, fago o plásmido defectuoso en presencia de un virus, fago o plásmido auxiliar que permita la replicación de dicho virus, fago o plásmido defectuoso, por ejemplo el vector M13(+)KS en presencia de, por ejemplo, el fago auxiliar M14K07, o también ADN cromosómico, derivado por ejemplo de hongos filamentosos tales como Aspergillus sp., por ejemplo, A. niger, por ejemplo los proporcionados por el documento EP 184 438. Los vectores preferidos son de S. cerevisiae o de hongos filamentosos, mas preferiblemente de Aspergillus sp., incluso más preferiblemente de A. niger.

Un vector híbrido de la invención, incluyendo un vector de expresión, proporciona la replicación de un ADN deseado en un hospedador adecuado, bien como un elemento extracromosómico o por integración en el cromosoma del hospedador. Se dispone de varios sistemas de vectores posibles para integración y expresión del ADN clonado de la invención. En principio, son adecuados todo los vectores que se replican y se mantienen de forma estable en el hospedador elegido. De ese modo, el vector se selecciona dependiendo de las células hospedadores previstas para la transformación. En general, tales células hospedadoras pueden ser microorganismos procarióticos o eucarióticos tales como bacterias, hongos tales como levaduras, preferiblemente S. cerevisiae, o como hongos filamentosos, preferiblemente Aspergillus sp., más preferiblemente A. niger, células de origen eucariota superior tales como células de vertebrados, por ejemplo células de mamífero. Las células hospedadoras adecuadas se discutirán más adelante en la presente invención con detalle. Un vector híbrido de la invención, incluyendo un vector de expresión, que se mantiene como un elemento extracromosómico comprende un origen de replicación (ori) y una secuencia de replicación autónoma (ARS), secuencias de marcadores seleccionables y, opcionalmente, sitios de restricción adicionales. Un vector que está destinado a la integración en un cromosoma del hospedador no necesita comprender un ori o una ARS, ya que se replica en la célula en conexión con el cromosoma.

Un origen de replicación o una secuencia de replicación autónoma (un elemento de ADN que confiere capacidades de replicación autónoma a los elementos extracromosómicos) se proporciona mediante la construcción de un vector que incluye un origen exógeno tal como el derivado del virus de simio (SV40) u otra fuente vírica, o mediante los mecanismos cromosómicos de la célula hospedadora.

Un vector híbrido de la invención, incluyendo un vector de expresión, también puede contener marcadores selectivos dependiendo del hospedador al que vaya a transformar, en el que se selecciona y se clona. Puede usarse cualquier gen marcador que facilite la selección de los transformantes por el fenotipo de expresión del marcador. Son marcadores adecuados particularmente los que expresan resistencia a antibióticos, por ejemplo, contra tetraciclina o ampicilina o, en el caso de mutantes de hongos auxotróficos, genes que complementan las lesiones del hospedador. Los genes correspondientes confieren, por ejemplo, resistencia al antibiótico cicloheximida, o proporcionan prototrofia en una levadura auxotrófica, preferiblemente S. cerevisiae, mutante, por ejemplo el gen ura3, leu2, his3 o trp1. También es posible emplear como marcadores genes estructurales que están asociados a un segmento de replicación autónomo siempre que el hospedador que se vaya a transformar sea auxotrófico para el producto expresado por el marcador.

Son de particular importancia en el contexto de los vectores híbridos, en particular de los vectores de expresión, para A. niger, genes marcadores que complementan lesiones del hospedador A. niger, tales como el gen argB que codifica la ornitina carbamoil transferasa derivada, por ejemplo, de A. niger o de A. nidulans (documento EP 184 438), o de fragmentos de ADN de A. nidulans homólogos con el gen pyr4 de N. crassa. Otros genes marcadores adecuados se describen más adelante en relación con la descripción de los hospedadores transformados de la invención.

Un vector híbrido de la invención adecuado para la multiplicación de ADN que codifica subtilisina de Aspergillus en E. coli es, por ejemplo, el plásmido pTZPEPC o pTZPEPD descrito más adelante en los ejemplos adjuntos.

El término "cassette de expresión" en el contexto de un vector de expresión de la presente invención significa una secuencia de ADN capaz de expresar la subtilisina de Aspergillus y comprende un promotor unido de forma operativa con una región que codifica la subtilisina de Aspergillus y, opcionalmente, uno o más elementos reguladores adicionales de grupo compuesto por una secuencia señal, un terminador de la transcripción, un potenciador de la transcripción, un sitio de unión a ribosomas, una secuencia para el procesamiento eficaz del ARN, una secuencia que codifica un procesamiento de proteína eficaz, y una secuencia que codifica la correcta localización de la proteína. En un casete de expresión de acuerdo con la presente invención, una región que codifica la subtilisina de Aspergillus puede combinarse con elementos reguladores homólogos, es decir, como los que se unen de forma natural, o con elementos reguladores heterólogos, es decir, derivados de otros genes.

Pueden emplearse una amplia diversidad de secuencias promotoras, dependiendo de la naturaleza de la célula hospedadora. Los promotores que son potentes y al mismo tiempo bien regulados son los más útiles.

Son ejemplos de promotores los promotores procarióticos \lambdaP_{L}, \lambdaP_{R}, y los promotores lac, trp o tac de E. coli. Los promotores adecuados para la expresión en levadura, preferiblemente S. cerevisiae son TRP1-, ADHI-, ADHII-, PHO3-, PHO5-, GAL10- o promotores glicolíticos tales como los promotores de los genes de la enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), kexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa, o el promotor híbrido de PH05-GAPDH (solicitud de patente europea Nº EP-A-213-593). Otros ejemplos de promotores eucarióticos son los promotores derivados de virus eucarióticos, por ejemplo, SV40, virus del sarcoma de Rous, adenovirus 2, virus del papiloma bovino, papovavirus, promotores derivado de citomegalovirus o promotores derivados de células de mamífero, por ejemplo, del gen de la actina, colágeno, miosina o \beta-globina. Los promotores eucarióticos pueden combinarse con secuencias potenciadoras tales como las secuencias activadoras secuencia arriba (UAS) de levadura, preferiblemente de S. cerevisiae o potenciadores virales o celulares tales como los potenciadores de citomegalovirus IE, el potenciador de SV40, el potenciador de genes de inmunoglobulinas u otros.

Los potenciadores son secuencias de ADN estimuladoras de la transcripción, por ejemplo, derivadas de virus tales como el virus de simio, virus del polioma, el virus del papiloma bovino o el virus del sarcoma de Moloney, o de origen genómico. Una secuencia potenciadora también puede derivar del ADN ribosómico extracromosómico de Physarum polycephalum (PCT/EP 8500278). Son también potenciadores adecuados, por ejemplo, sitios de activación secuencia arriba derivados del gen de la fosfatasa ácida PH05 de levadura.

Las secuencias señal pueden ser, por ejemplo, una presecuencia o líder secretor que dirige la secreción del polipéptido, o similar. Una secuencia señal es, por ejemplo, una señal o péptido líder de subtilisina de Aspergillus, por ejemplo, la secuencia señal mostrada en la SEC ID Nº 1. Por la bibliografía se conocen más secuencias señal, por ejemplo, las recopiladas en von Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14, 4683 (1986).

Las secuencias necesarias para la iniciación y terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm frecuentemente están disponibles en las regiones 5' y 3' no codificantes, respectivamente, de los ADNc virales o eucarióticos, por ejemplo, del hospedador de expresión.

Una realización de la invención es un vector de expresión que comprende una región codificante sin intrones compuesta por los dos exones de la región codificante mostrada en la SEC ID Nº 1 o por los cuatro exones de la región codificante mostrada en la SEC ID Nº 6 para la expresión de la subtilisina de Aspergillus en procariotas, por ejemplo, en E. coli, o preferiblemente en levaduras, más preferiblemente en S. cerevisiae bajo el control del promotor GAL10, por ejemplo como en el plásmido pFBY138.

La invención se refiere preferiblemente a un vector de expresión adecuado para la expresión de una secuencia de ADN que codifica una subtilisina de Aspergillus en una cepa de Aspergillus.

Un tipo de vector de expresión de acuerdo con la invención comprende una secuencia de ADN que codifica una subtilisina de Aspergillus, preferiblemente de A. niger, bajo el control de un promotor que naturalmente está unido con dicha secuencia de ADN, es decir, su promotor homólogo. Es más preferido un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica PEPC de la SEC ID Nº 1, más preferiblemente la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº 1, bajo el control de la región promotora mostrada en la SEC ID Nº 1 o un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica PEPD de la SEC ID Nº 6, más preferiblemente la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº 6, bajo el control de la región promotora mostrada en la SEC ID Nº 6. Sin embargo, la región que codifica para PEPC mostrada en la SEC ID Nº 1 también puede expresarse bajo el control del promotor de PEPD mostrado en la SEC ID Nº 6 y viceversa.

Preferiblemente la subtilisina de Aspergillus se secreta al medio. Esto puede conseguirse usando una secuencia señal que está unida funcionalmente al gen estructural, preferiblemente la secuencia señal unida de forma natural al gen estructural de la subtilisina de Aspergillus, por ejemplo, como en el plásmido pTZPEPC que comprende la secuencia señal de PEPC y la región codificante mostrada en la SEC ID Nº 1 o como en el plásmido pTZPEPD que comprende la secuencia señal de PEPD y la región codificante mostrada en SEC ID Nº 6.

Si tal vector de expresión se usa para la expresión de la subtilisina de Aspergillus en una cepa hospedadora de la especie de la que procede el gen de la subtilisina de Aspergillus, la subtilisina de Aspergillus se sobreexpresa, ya que ambos genes de subtilisina de Aspergillus, el recombinante y el original, son activos bajo las mismas condiciones de expresión.

Otro tipo de vector de expresión de la invención comprende una secuencia de ADN que codifica la subtilisina de Aspergillus bajo el control de un promotor funcional en Aspergillus, que no está unido de forma natural a dicha secuencia de ADN. Un promotor adecuado para la expresión de la subtilisina de Aspergillus en Aspergillus sp, en particular en A. niger es, por ejemplo, un promotor del gen pectina liasa de un Aspergillus sp., preferiblemente el promotor de los genes PLI (véase el documento EP-A-0 278 355), PLA, PLB, PLC, PLE o PLF (véase el documento EP-A-0 353 188) de A. niger, un promotor del gen poligalacturonasa de Aspergillus sp., preferiblemente el promotor del gen PGI o PGII de A. niger (véase la solicitud de patente europea, EP-A-421919), un promotor del gen de la piruvato quinasa de Aspergillus sp., preferiblemente el promotor del gen pki de A. niger (solicitud de patente europea EP-A-439997), o también un promotor de un gen de subtilisina de Aspergillus de la presente invención, preferiblemente un promotor de un gen de subtilisina de Aspergillus mostrado en SEC ID Nº 1 ó 6. La secreción de subtilisina de Aspergillus también puede conseguirse en este caso usando una secuencia señal que está unida funcionalmente al gen estructural, por ejemplo, la secuencia señal unida naturalmente al gen estructural de subtilisina de Aspergillus, por ejemplo, en el caso de la secuencia señal de PEPC mostrada en SEC ID Nº 1. Sin embargo, también puede usarse una secuencia señal heteróloga para la subtilisina de Aspergillus, por ejemplo una secuencia señal del gen de la pectina liasa de un Aspergillus sp., preferiblemente la secuencia señal del gen PLI (véase el documento EP-A-0 278 355 ), PLA, PLB, PLC, PLE o PLF (véase el documento EP-A-0 353 188) de A. niger, o una secuencia señal del gen de la poligalacturonasa de un Aspergillus sp., preferiblemente la secuencias señal de gen PGI o PGII de A. niger (véase la solicitud de patente europea EP-A-421919).

En una realización preferida de la invención, por ejemplo, en el plásmido pPKIPEPCA, el promotor de la piruvato quinasa de A. niger está unido funcionalmente a la región codificante mostrada en la SEC ID Nº 1, que codifica la subtilisina de Aspergillus unida a su secuencia señal homóloga.

En otra realización preferida de la invención, por ejemplo, en el plásmido pPKIPEPDA, el promotor de la piruvato quinasa de A. niger está unido funcionalmente a la región codificante mostrada en la SEC ID Nº 6 que codifica la subtilisina de Aspergillus unida a su secuencia señal homóloga.

Proceso de preparación de un gen de subtilisina de Aspergillus

La invención también se refiere a un proceso para la preparación de una molécula de ADN de la invención, es decir, la que codifica una subtilisina de Aspergillus de la invención, preferiblemente la codifica una forma preferida de un Aspergillus niger de la invención, o para la preparación de un vector híbrido que comprende tal molécula de ADN, comprendiendo dicho proceso el cultivo de un hospedador transformado con dicha molécula de ADN o vector híbrido de la invención. En una realización alternativa de la invención, puede prepararse una molécula de ADN de la invención por síntesis química por condensación de nucleótidos.

El cultivo de los hospedadores se realiza en un medio nutriente convencional que puede complementarse o privarse de compuestos químicos que permitan la selección negativa o positiva de los transformantes, es decir, los hospedadores que contienen la molécula de ADN deseada junto con un marcador de selección, de los que no se han transformado, es decir, los hospedadores que carecen de la molécula de ADN deseada.

Puede usarse cualquier hospedador transformable útil en la técnica, por ejemplo, bacterias tales como E. coli, hongos tales como Saccharomyces cerevisiae o Kluyveromyces lactis, células eucariotas superiores tales como células de insectos o células de mamíferos, por ejemplo, células CHO, o en particular hongos filamentosos, tales como Aspergillus, por ejemplo, A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori y especialmente A. niger. La transformación de los hospedadores se lleva a cabo por métodos convencionales.

Puede obtenerse una secuencia de ADN que codifica la subtilisina de Aspergillus a partir del genoma de una cepa de Aspergillus capaz de expresar subtilisina de Aspergillus, o puede prepararse, por ejemplo, cultivando un hospedador transformado con una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica una subtilisina de Aspergillus y, cuando se requiera, aislar la secuencia de ADN deseada a partir del cultivo.

En particular, tal ADN puede prepararse por un método que comprende una etapa seleccionada entre:

a) aislar ADN genómico de células de Aspergillus adecuadas, y seleccionar el ADN deseado, por ejemplo, usando una sonda de ADN o usando un sistema de expresión y selección adecuado para la expresión del polipéptido deseado,

b) aislar ARNm a partir de células de Aspergillus adecuadas, seleccionar el ARNm deseado, por ejemplo, por hibridación con una sonda de ADN o por expresión en un sistema de expresión y selección adecuado para la expresión del polipéptido deseado, preparar ADNc monocatenario complementario de este ARNm, y después ADNc bicatenario a partir del mismo,

c) aislar ADNc a partir de una biblioteca de ADNc y seleccionar el ADNc deseado, por ejemplo, usando una sonda de ADN o usando un sistema de expresión y de selección adecuado para la expresión del polipéptido deseado,

d) sintetizar ADN bicatenario in vitro por tecnología de PCR del ADN total de Aspergillus usando oligonucleótidos cebadores diseñados a partir del gen que codifica pepC de A. niger o pepD de A. niger u otra proteasa de serina conocida del tipo de la subtilisina, o

e) incorporar un ADN bicatenario obtenido de acuerdo con las etapas a), b), c) o d) en un vector apropiado, transformar un hospedador adecuado, multiplicar el hospedador y aislar el ADN.

Puede aislarse y seleccionarse ADN genómico para el ADN deseado (etapa a). El ADN genómico se aisla a partir de una cepa de Aspergillus capaz de expresar una subtilisina de Aspergillus. Se prepara una biblioteca de ADN genómico a partir de dicho ADN por digestión con enzimas de restricción apropiados e incorporación en vectores apropiados siguiendo procedimientos establecidos. La biblioteca de ADN genómico se selecciona con una sonda de ADN como se describe más adelante, o se expresa en un sistema de expresión adecuado y los polipéptidos obtenidos se seleccionan de manera convencional.

Puede prepararse una biblioteca genómica, por ejemplo, por digestión parcial del ADN genómico de una cepa de A. niger, por ejemplo NW756 o N400 con, por ejemplo, Sau3AI o MboI, y clonación de los fragmentos de ADN de alto peso molecular en un vector hospedador apropiado, por ejemplo, el plásmido pUN121 de E. coli o un vector lambda, por ejemplo, EMBL4.

Otras cepas de hongos que producen una subtilisina de Aspergillus deseada, por ejemplo, A. japonicus, A. oryzae, A. nidulans o A. niger pueden servir como fuente para la biblioteca genómica y pueden usarse otros vectores adecuados, por ejemplo, los mencionados anteriormente, como receptor para los fragmentos.

Para una selección eficaz en la biblioteca genómica de las secuencias de ADN que codifican la subtilisina de Aspergillus es necesaria una sonda de ADN que hibride. Ésta puede ser una sonda de ADN sintética si se conoce la secuencia de aminoácidos o parte de ésta de una subtilisina de Aspergillus deseada, u otro gen de subtilisina, por ejemplo, de levaduras, o una parte del mismo que hibride con un gen de subtilisina de Aspergillus.

El ARN mensajero poliadenilado (etapa b) se aisla a partir de las células adecuadas por métodos conocidos. Los métodos de aislamiento implican, por ejemplo, homogeneizar en presencia de un detergente y un inhibidor de ribonucleasas, por ejemplo, heparina, isotiocianato de guanidinio o mercaptoetanol, extraer el ARNm con mezclas de cloroformo y fenol adecuadas, opcionalmente en presencia de soluciones de sales y tampón, detergentes y/o agentes quelantes de cationes, y precipitar el ARNm de la fase acuosa con sales que queda con etanol, isopropanol o similares. El ARNm aislado puede purificarse adicionalmente por centrifugación en un gradiente de cloruro de cesio seguido de precipitación con etanol y/o métodos cromatográficos, por ejemplo, cromatografía de afinidad, por ejemplo una cromatografía en oligo(dT) celulosa o en oligo(U) sefarosa. Preferiblemente, tal ARNm total purificado se fracciona de acuerdo con el tamaño por centrifugación en gradiente, por ejemplo, en un gradiente lineal de sacarosa, o por cromatografía en columnas de fraccionamiento por tamaño adecuadas, por ejemplo, en geles de agarosa.

El ARNm deseado se selecciona por selección del ARNm directamente con una sonda de ADN, o por traducción en células adecuadas o en sistemas sin y selección de los polipéptidos obtenidos.

La selección de ARNm deseado se consigue preferiblemente usando una sonda de hibridación de ADN como se describe más adelante, evitando de ese modo la etapa adicional de traducción. Las sondas de ADN adecuadas son ADN de secuencia de nucleótidos conocida, por ejemplo ADN sintéticos, ADNc derivados de ARNm que codifican los polipéptidos deseados, o fragmentos de ADN genómico que comprenden, por ejemplo, secuencias de ADN contiguas que se aislan a partir de una fuente natural o a partir de microorganismos modificados por ingeniería genética.

El ARNm fraccionado puede traducirse en células, por ejemplo en oocitos de rana, o en sistemas sin células, por ejemplo, en lisado de reticulocitos o en extractos de germen de trigo. Los polipéptidos obtenidos se seleccionan con respecto a la actividad enzimática o la reacción con anticuerpos producidos contra el polipéptido nativo, por ejemplo, en un inmunoensayo, por ejemplo un radioinmunoensayo inmunoensayo enzimático o inmunoensayo con marcadores fluorescentes. Tales inmunoensayos y la preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales son bien conocidos en la técnica y se aplican de acuerdo con esto.

La preparación de un ADN complementario (ADNc) monocatenario a partir de molde de ARNm seleccionado es bien conocida en la técnica, así como la preparación de un ADN bicatenario a partir de un ADN monocatenario. El molde de ARNm se incuba con una mezcla de desoxinucleósido trifosfatos, opcionalmente desoxinucleósido trifosfatos marcados radiactivamente (para ser capaces de seleccionar el resultado de la reacción), una secuencia cebadora tal como un resto de oligo-dT que hibrida con la cola de poli(A) del ARNm y un enzima adecuado como una transcriptasa inversa, por ejemplo, del virus de la mieloblastosis de aves (AMV). Tras la degradación del ARNm molde, por ejemplo, por hidrólisis alcalina, el ADNc se incuba con una mezcla de desoxinucleósido trifosfatos y un enzima apropiado para dar un ADN bicatenario. Son enzimas adecuados, por ejemplo, una transcriptasa inversa, el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli o la ADN polimerasa de T4. Normalmente, una estructura de horquilla formada espontáneamente por el ADNc monocatenario actúa como cebador para la síntesis de la segunda cadena. Esta estructura en horquilla se elimina por digestión con la nucleasa S1. Como alternativa, primero se extiende el extremo 3' del ADN monocatenario con las colas homopoliméricas de desoxinucleótidos antes de la hidrólisis de ARNm molde y de la posterior síntesis de la segunda cadena de ADNc.

En la alternativa, el ADNc bicatenario se aísla a partir de una biblioteca de ADNc y se selecciona para el ADNc deseado (etapa c). La biblioteca de ADNc se construye aislando el ARNm de células adecuadas, y preparando ADNc monocatenario y bicatenario a partir de éste, como se ha descrito anteriormente. Este ADNc se digiere con las endonucleasas de restricción adecuadas y se incorpora en el fago \lambda, por ejemplo, \lambda charon 4A o \lambda gt11 siguiendo procedimientos establecidos. La biblioteca de ADNc replicada en membranas de nitrocelulosa se selecciona usando una sonda de ADN como se ha descrito anteriormente, o se expresa en un sistema de expresión apropiado y los polipéptidos obtenidos se seleccionan por reacción con un anticuerpo específico para los compuestos deseados.

Otro método para la preparación de ADN bicatenario es por tecnología de PCR (etapa d). Este método puede usarse, en particular, para la preparación de una gran cantidad de ADN bicatenario a partir de una pequeña cantidad de ADN o de ARN con secuencias al menos parcialmente conocidas. Sin embargo, también puede usarse como material de partida una inserción de ADN de secuencia desconocida que está flanqueada por secuencias conocidas de un vector. En la tecnología de PCR, se usan moléculas de ADN, por ejemplo oligonucleótidos, como cebadores para la síntesis enzimática de ADN dependiente de molde. Pueden prepararse grandes cantidades ya que puede repetirse secuencialmente la desnaturalización del ADN bicatenario, la hibridación con los cebadores y la síntesis enzimática. El número de moléculas de ADN sintetizadas aumenta exponencialmente ya que se dobla en cada ciclo. La tecnología de PCR pertenece al estado de la técnica y puede aplicarse de forma convencional en la presente invención. Puede diseñarse un oligonucleótido cebador para hibridar con el ADN que codificaría secuencias de proteínas proteasas de serina conservadas del tipo de la subtilisina basándose en la comparación entre proteasas de serina conocidas del tipo de la subtilisina. La tecnología de PCR es bien conocida en la técnica y pueden aplicarse técnicas de PCR convencionales a la presente invención, por ejemplo, las descritas en: M.A. Innis et al. (eds.), PCR protocols. A guide to methods and applications. Academic Press, San Diego (1990).

Se conocen en la técnica diversos métodos para la incorporación de ADNc bicatenario o ADN genómico en un vector apropiado (etapa e). Por ejemplo, pueden añadirse extensiones de homopolímero complementarias al ADN bicatenario y al vector de ADN por incubación en presencia de los correspondientes desoxinucleósido trifosfatos y un enzima tal como la desoxinucleotidil transferasa terminal. El vector y el ADN bicatenario después se unen por apareamiento de bases entre las colas homopoliméricas complementarias y finalmente se ligan por enzimas específicos de unión tales como ligasas. Otras posibilidad son la adición de enlazadores sintéticos a los extremos del ADN bicatenario, o la incorporación del ADN bicatenario en el vector para la unión de extremos romos o en bisel. Los vectores apropiados se discutirán con detalle más adelante.

Los procedimientos de transformación para transformar células hospedadores apropiadas con el vector híbrido obtenido y la selección y multiplicación de células hospedadores transformadas son bien conocidos en la técnica. Más adelante se proporcionan ejemplos de tales métodos.

El aislamiento del ADN deseado, mutantes y fragmentos de éstos de acuerdo con la invención se consigue por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, extracción con fenol y/o cloroformo. Opcionalmente, el ADN puede manipularse adicionalmente, por ejemplo, por tratamiento con agentes mutagénicos para obtener mutantes, o por digestión con enzimas de restricción para obtener fragmentos, modificación de uno o ambos extremos terminales para facilitar la incorporación en el vector, eliminación de secuencias de intervención y similares.

La secuencia de nucleótidos de un ADN de acuerdo con la invención puede determinarse por métodos conocidos per se, por ejemplo, por el método de Maxam y Gilbert usando ADN de extremos marcados o por el método didesoxi de determinación de la cadena de Sanger.

Las secuencias del gen de la subtilisina de Aspergillus de la presente invención también pueden prepararse por una síntesis in vitro de acuerdo con métodos convencionales. La síntesis in vitro es aplicable especialmente a la preparación de fragmentos más pequeños de un gen de subtilisina de Aspergillus que codifica para los fragmentos de subtilisina de Aspergillus con actividad proteasa de serina. La síntesis in vitro también es particularmente aplicable a la síntesis de ADN que codifica un promotor o un péptido señal. La síntesis in vitro se aplica preferiblemente al gen de la subtilisina de Aspergillus derivado de A. niger o a fragmentos de éste, más preferiblemente al gen de pepC mostrado en la SEC ID Nº 1 o a su promotor o secuencia señal, o al gen pepD mostrado en la SEC. ID: Nº 6 o a su promotor o secuencia señal.

S. A. Narang (Tetrahedron 39, 3, 1983) ha presentado a modo de resumen los métodos adecuados para la síntesis de ADN. Las técnicas de síntesis conocidas permiten la preparación de polinucleótidos hasta una longitud de 120 bases, con buen rendimiento, alta pureza y en relativamente poco tiempo. Los nucleótidos convenientemente protegidos se unen entre sí por el método del fosfodiéster (K.L. Agarwal et al., Angew. Chemie 84, 489, 1972), el método más eficaz del fosfotriéster (C. B. Reese, Tetrahedron 34, 3143, 1972), el método del fosfito triéster (R.L. Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 98, 3655, 1976) o el método de fosforamidita (S.L. Beaucage y M.H. Carruthers, Tetrahedron 22, 1859, 1981). La simplificación de la síntesis de los oligonucleótidos y polinucleótidos ha sido posible por el método en fase sólida, en el que las cadenas de nucleótidos se unen a un polímero adecuado. El verdadero ADN bicatenario se construye enzimáticamente a partir de oligonucleótidos solapantes que se preparan químicamente a partir de ambas cadenas de ADN, que se ponen juntos en el orden correcto por apareamiento de bases y después se unen químicamente por el enzima ADN ligasa. Otra posibilidad comprende incubar oligonucleótidos únicos solapantes procedentes de las dos cadenas de ADN en presencia de los cuatro desoxinucleósido trifosfatos requeridos con una ADN polimerasa, por ejemplo la ADN polimerasa I, el fragmento Klenow de la polimerasa I o la ADN polimerasa de T4, o con la transcriptasa inversa de AMV (virus de la mieloblastosis de aves). De ese modo, los dos oligonucleótidos se ponen juntos en el orden correcto por apareamiento de bases y se complementan con los nucleótidos requeridos por el enzima para dar una doble cadena de ADN completa (S.A. Narang et al., Anal. Biochem. 121, 356, 1982).

En la realización de la presente invención puede usarse un gen de subtilisina de otras especies, por ejemplo, levaduras, o un fragmento de éste como sonda para identificar un ARNm de subtilisina de Aspergillus sp., por ejemplo, de A. niger, en una fracción de ARN o un ADN de subtilisina en una biblioteca genómica o de ADNc. A partir de la secuencia primaria del gen de A. niger y en comparación con otras proteasas, puede deducirse la región codificante de la proteasa y puede confirmarse la relación del gen con la familia de genes de subtilisina. El gen obtenido puede usarse para la preparación de la proteasa recombinante como se indica con detalle más adelante.

Las sondas de ADN sintético se sintetizan de acuerdo con métodos conocidos como se detalla más adelante, preferiblemente condensación por etapas usando el método de fosfotriéster en fase sólida, fosfito triéster o fosforamidita, por ejemplo, la condensación de unidades de acoplamiento dinucleotídicas por el método del fosfotriéster. Estos métodos se adaptan para la síntesis de mezclas de los oligonucleótidos deseados usando mezclas de dos, tres o cuatro nucleótidos dA, dC, dG y/o dT en forma protegida o las correspondientes unidades de acoplamiento dinucleotídicas en la etapa de condensación apropiada como describe por Y. Ike et al., (Nucleic Acids Research 11, 477, 1983).

Para la hibridación, las sondas de ADN se marcan, por ejemplo, marcado radiactivamente por la reacción de la quinasa. La hibridación del ARNm fraccionado por tamaño con las sondas de ADN que contienen un marcador se realiza de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo, en tampón y soluciones salinas con la adición de, por ejemplo, quelantes de calcio, compuestos que regulan la viscosidad, proteínas, ADN no homólogos y similares, a temperaturas que favorecen la hibridación selectiva, por ejemplo entre 0ºC y 80ºC, por ejemplo entre 25ºC y 50ºC o alrededor de 65ºC, preferiblemente alrededor de 20ºC por debajo de la temperatura de fusión del ADN híbrido bicatenario.

Hospedadores transformados y preparación de los mismos

Además, la invención se refiere a células hospedadoras transformadas con un híbrido o vector de expresión de la invención, preferiblemente que codifica las formas preferidas de la subtilisina de Aspergillus de la invención.

Son ejemplos de hospedadores adecuados, particularmente para la multiplicación de las moléculas de ADN recombinante, microorganismos que están desprovistos o son pobres en enzimas de restricción o enzimas de modificación, tales como bacterias, en particular cepas de Escherichia coli, por ejemplo, las cepas E. coli X1776, E. coli Y1090, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221, E. coli DH5\alpha, o preferiblemente E. coli DH5\alphaF', JM109, MH1 o HB101, o la cepa de E. coli K12. También son hospedadores adecuados otras células procarióticas, por ejemplo, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus y otros, y levaduras, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae tales como S. cerevisiae GRF 18. Otros células hospedadoras adecuadas son células de organismos superiores, en particular líneas celulares animales o humanas establecidas continuas, por ejemplo, fibroblastos de pulmón embrionario humano L132, las células de melanoma maligno humano de Bowes, células HeLa, células COS-7 de riñón de mono verde africano transformadas con el virus SV40 o células de ovario de hámster chino (CHO):

Son ejemplos de células adecuadas para la expresión de un gen de subtilisina de Aspergillus de la invención las células mencionadas anteriormente transformadas con un vector de expresión apropiado y adicionalmente células de insecto adecuadas transformadas con un vector de expresión de Baculovirus apropiado y, en particular, hongos filamentosos, por ejemplo Penicillium, Cephalosporium o preferiblemente Aspergillus sp., por ejemplo, A. carbonarius, A. awamori, A. nidulans, A. oryzae o más preferiblemente A. niger, transformados con un vector de expresión apropiado.

La invención se refiere también a un método para la preparación de tales transformantes que comprende el tratamiento de una célula hospedadora adecuada en condiciones de transformación con una molécula de ADN o un vector híbrido de la invención, opcionalmente junto con un gen marcador de selección y opcionalmente la selección de los transformantes. El gen de subtilisina de Aspergillus también puede integrarse en el genoma del hospedador tras la transformación, en particular si se usan células eucarióticas como hospedadores, por ejemplo Aspergillus sp.

La transformación de microorganismos se realiza de acuerdo con métodos convencionales como los descritos en la bibliografía, por ejemplo para S. cerevisiae (A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978), para B. subtilis (Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81, 741, 1961), para E. coli (M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159, 1970) y para Aspergillus [F. Buxton et al., Gene 37:207-14 (1985), D.J. Balance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112: 284-9 (1983)].

Por consiguiente, el procedimiento de transformación de células de E. coli incluye, por ejemplo, pretratamiento de las células con Ca^{2+} para permitir la captación de ADN, e incubación con el vector híbrido. La selección posterior de las células transformadas puede lograrse, por ejemplo, transfiriendo las células a un medio de crecimiento selectivo que permita la separación de las células transformadas de las células parentales dependiendo de la naturaleza de la secuencia marcadora del vector de ADN. Preferiblemente se usa un medio de crecimiento que no permita el crecimiento de las células que no contiene el vector híbrido.

La transformación de hongos tales como levaduras o Aspergillus sp. comprende, por ejemplo, etapas de eliminación enzimática de la pared celular mediante glicosidasas, tratamiento de los esferoplastos obtenidos con el vector híbrido en presencia de polietilenglicol y de iones de Ca^{2+}, y regeneración de la pared celular incluyendo los esferoplastos en agar. Preferiblemente, la regeneración en agar se prepara de forma que permita la regeneración y la selección de las células transformadas al mismo tiempo, como se ha descrito anteriormente.

La transformación de células de origen eucariótico superior, tales como líneas celulares de mamíferos, preferiblemente se consigue por transfección. La transfección se realiza por técnicas convencionales tales como la precipitación con fosfato cálcico, microinyección, fusión de protoplastos, electroporación, es decir, introducción del ADN por un pulso eléctrico corto que incremente de forma transitoria la permeabilidad de la membrana celular, o en presencia de compuestos auxiliares tales como dietilaminoetildextrano, dimetilsulfóxido, glicerol o polietilenglicol, y similares. Tras el procedimiento de transfección, se identifican las células transfectadas y se seleccionan, por ejemplo, por cultivo en un medio selectivo elegido dependiendo de la naturaleza del marcador de selección, por ejemplo, medios de cultivo convencionales tales como medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo, medio RPMI 1640 y similares, que contienen, por ejemplo, el correspondiente antibiótico.

Las células hospedadoras transformadas se cultivan por métodos conocidos en la técnica en un medio líquido que contiene fuentes de carbono asimilables, por ejemplo, carbohidratos tales como glucosa o lactosa, nitrógeno, por ejemplo, aminoácidos, péptidos, proteínas o sus productos de degradación tales como peptonas, sales de amonio o similares, y sales inorgánicas, por ejemplo, sulfatos, fosfatos y/o carbonatos de sodio, potasio, magnesio y calcio. El medio contiene además, por ejemplo, substancias que promueven el crecimiento, tales como oligoelementos, por ejemplo, hierro, zinc, manganeso y similares.

El medio preferiblemente se elige para ejercer una presión selectiva y prevenir el crecimiento de células que no han sido transformadas o que han perdido el vector híbrido. De esta manera, por ejemplo, se añade un antibiótico al medio si el vector híbrido contiene un gen de resistencia a antibióticos como marcador. Si, por ejemplo, se usa una célula hospedadora que es auxotrófica para un aminoácido esencial mientras que el vector híbrido contiene un gen que codifica para un enzima que complementa el defecto de hospedador, se usa un medio mínimo deficiente en dicho aminoácido para cultivar las células transformadas.

Las células de origen eucariótico superior, tales como células de mamífero, se desarrollan en condiciones de cultivo tisular usando medios disponibles en el mercado, por ejemplo medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo, medio RPMI 1640 y similares como se ha mencionado anteriormente, complementados opcionalmente con substancias que promueven el crecimiento y/o sueros de mamífero. Las técnicas para el cultivo celular en condiciones de cultivo tisular son bien conocidas en la técnica e incluyen cultivos homogéneos en suspensión, por ejemplo, en un reactor de agitación por aspas o reactor de agitación continua, o cultivos de células inmovilizadas o atrapadas, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas, microperlas de agarosa, partículas de vidrio poroso, cartuchos de cerámica y otros microsoportes.

El cultivo se realiza por procesos que son conocidos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, valor de pH del medio y tiempo de fermentación, se eligen para obtener un título máximo del polipéptido o derivado de la invención. De esta manera, una cepa de E. coli o de levadura se cultiva preferiblemente en condiciones aerobias en cultivo sumergido con agitación o removiendo a una temperatura de aproximadamente 20ºC a 40ºC, preferiblemente a aproximadamente 30ºC, y a un valor de pH de 4 a 8, preferiblemente de aproximadamente pH 7, durante aproximadamente 4 a 30 horas, preferiblemente hasta que se consiguen rendimientos máximos del polipéptido o derivado de la invención.

Para permitir la selección de las células transformadas de las células no transformadas, las moléculas de ADN de la invención llevan un marcador de selección o, como alternativa, las células se cotransforman con un segundo vector que contiene tal marcador. Como ocurre en otros sistemas, dicho marcador de selección es un gen estructural expresable, cuyo polipéptido expresado (un enzima) proporciona resistencia contra compuestos tóxicos para el organismo receptor o que completa el sistema enzimático de un mutante carente de tal polipéptido esencial. Tales genes marcadores adecuados para la selección de células fúngicas filamentosas transformadas son, por ejemplo, los genes conocidos qa-2, pyrG, pyr4, trpC, amdS o argB.

Como se describe en el documento EP-A-0 278 355, se aisló un gen marcador, denominado pyrA, de la biblioteca genómica de A. niger, que está relacionado y tiene una función similar a pyrG de A. nidulans y pyr4 de N. crassa, que concretamente produce el enzima orotidina 5'-fosfato descarboxilasa. Este enzima cataliza la descarboxilación de la orotidina 5'-fosfato a ácido uridílico (uridina 5'-fosfato) y también del ácido fluoro-orótico a la fluorouridina tóxica. Sin embargo, puede usarse el ADN de cualquier otro gen pyr que codifique la orotidina 5'-fosfato descarboxilasa. A partir de un clon positivo denominado BJ5183/pCG59D7 (DSM3968) de E. coli se aisló el plásmido pCG59D7 que comprende el gen pyrA, y se usó para la cotransformación de un mutante pyrA^{-} de A. niger. Tal mutante pyrA- es defectuoso en el gen de la orotidina 5'-fosfato descarboxilasa y, por lo tanto, es incapaz de producir el correspondiente enzima. Tal mutante se prepara tratado las conidiosporas de A. niger N756 bajo irradiación UV mutante y se seleccionan las colonias que sobreviven en presencia de ácido fluoro orótico y uridina. Las colonias que sobreviven en presencia de ácido fluoro orótico y en ausencia de uridina se eliminan. Los restantes mutantes que requieren uridina, según su capacidad para ser transformados, pertenecen a dos grupos de complementación pyrA y pyrB, representados por los mutantes An8 y An10 de A. niger, respectivamente. Se tratan en forma de protoplastos en condiciones de transformación con el plásmido pCG59D7 (DSM 3968) que contiene pyrA. Se descubrió que sólo se transformaban las colonias de A. niger An8 (DSM 3917) y que contenían el gen pyrA, como se demostró por la capacidad de hibridación de su ADN digerido con el ADN de pUN 121.

Proceso para la preparación de subtilisina de Aspergillus

La invención también se refiere a un proceso para la preparación de una subtilisina de Aspergillus de la invención, preferiblemente sus formas preferidas, que comprende cultivar un hospedador transformado con un vector de expresión de la invención en condiciones adecuadas para la expresión del gen de la subtilisina de Aspergillus. Cuando se requiere, se aisla el polipéptido de forma convencional. Dependiendo de la construcción del vector de expresión, la subtilisina de Aspergillus se produce o, si está presente una secuencia señal, se produce y se secreta.

El hecho de que un hospedador seleccionado sea adecuado o no para la expresión depende principalmente de las secuencias reguladoras elegidas para la construcción del vector de expresión, en particular del promotor.

Por ejemplo, si se usa un promotor derivado de un gen de Aspergillus, preferiblemente A. niger, para la expresión de un gen de subtilisina de Aspergillus de la invención, es un hospedador adecuado una cepa de Aspergillus, preferiblemente de A. niger. Sin embargo, si se usa un promotor que no deriva de un gen de Aspergillus para la construcción de un vector de expresión de la invención, otros hospedadores son adecuados para la expresión, por ejemplo, bacterias tales como E. coli, o levaduras tales como S. cerevisiae. También son hospedadores y promotores adecuados para la preparación de polipéptidos de acuerdo con la invención los adecuados para la transformación proporcionados anteriormente.

En particular, la invención se refiere a un proceso en el que un hospedador Aspergillus transformado expresa el gen exógeno de subtilisina de Aspergillus en condiciones en las que los genes endógenos de subtilisina de Aspergillus están activos y, por lo tanto, expresa más subtilisina de Aspergillus que la cantidad natural debido al incremento de la dosis génica. Para este propósito, el hospedador Aspergillus, en particular A. niger, se transforma con un vector de expresión que comprende un gen de subtilisina de Aspergillus bajo el control de sus secuencias de control de la expresión homólogas, es decir unidas de forma natural, en particular el promotor y la secuencia señal.

En particular, la invención también se refiere a un proceso en el que un hospedador Aspergillus transformado expresa el gen exógeno de subtilisina de Aspergillus a mayor nivel o en diferentes condiciones que el gen endógeno, ya que está unido a un promotor diferente.

Las condiciones para una expresión máxima del gen o genes exógenos dependen del sistema de expresión seleccionado. Por ejemplo, si se usa un promotor del gen de una pectina liasa (PL) o de una poligalacturonasa (PG) de A. niger, la expresión del gen de subtilisina de Aspergillus unido a éste es inducible en una célula de A. niger por adición al medio de cultivo de pectina o de productos de la degradación de la pectina. Sin embargo, en presencia de una cantidad suficiente de glucosa, el promotor no es inducible si se usa como hospedador una cepa de A. niger, por ejemplo An8 (DSM 3917). Esto significa que un gen de subtilisina de Aspergillus bajo el control de un promotor de PL o PG de A. niger se "reprime por catabolito" en A. niger. Sin embargo, si se usa otra cepa de Aspergillus, preferiblemente A. oryzae o mas preferiblemente A. nidulans, un gen de la subtilisina de Aspergillus bajo el control de un promotor PL o PG de A. niger se expresa constitutivamente, es decir, también en ausencia de pectina y/o en presencia de glucosa. Por lo tanto, puede ser ventajoso expresar un gen de subtilisina de Aspergillus bajo el control de un promotor de PL o PG de A. niger en un hospedador Aspergillus distinto de A. niger, preferiblemente A. oryzae o más preferiblemente A. nidulans, ya que, por ejemplo, puede añadirse glucosa en vez de pectina al medio nutriente como fuente de energía y de carbono durante la expresión del gen.

Si se usa un promotor de una piruvato quinasa de Aspergillus, preferiblemente de A. niger para la expresión de un gen de subtilisina de Aspergillus, el gen se expresa si se usa un medio mínimo con glucosa como fuente de carbono y de energía.

Ahora es posible sobreexpresar subtilisina de Aspergillus, por lo que pueden aplicarse varios métodos. Puede prepararse una única subtilisina de Aspergillus purificada por un método en el que un hospedador adecuado que no es capaz de expresar ninguna subtilisina de Aspergillus, que expresa subtilisina de Aspergillus en baja cantidad o que no expresa subtilisina de Aspergillus en las condiciones de inducción usadas para la expresión del gen exógeno de subtilisina de Aspergillus, se transforma con un vector híbrido que comprende un gen estructural que codifica para una subtilisina de Aspergillus, preferiblemente de A. niger, más preferiblemente la PEPC mostrada en la SEC ID Nº 1, o un fragmento de una actividad proteasa de serina de subtilisina de Aspergillus, y que dicho gen estructural se exprese. Si se usa un hospedador que no es capaz de expresar ninguna subtilisina de Aspergillus, se puede obtener la respectiva subtilisina de Aspergillus única en forma pura, lo que significa que no está contaminada con ninguna otra subtilisina de Aspergillus.

Un hospedador incapaz de expresar ninguna subtilisina de Aspergillus es un microorganismos que no tiene el gen correspondiente o una cepa de Aspergillus en la que se ha suprimido la expresión de los genes endógenos de subtilisina de Aspergillus en un medio de crecimiento acondicionado de manera apropiada, mientras que el promotor de subtilisina de Aspergillus exógena operativamente unido con el gen estructural de subtilisina de Aspergillus deseado, por ejemplo, un promotor derivado de A. niger, es activo en estas condiciones o donde el gen de subtilisina de Aspergillus está unido a otro promotor.

Otros promotores y cepas adecuadas para la expresión de subtilisina de Aspergillus se proporcionan a continuación en la descripción de los vectores de expresión de la invención.

Subtilisina de Aspergillus y su uso

La proteasa de serina pura de Aspergillus del tipo subtilisina per se también se denomina "subtilisina de Aspergillus". Se entiende que tal proteasa (a) deriva de Aspergillus sp., (b) muestra actividad proteasa debido a un resto catalítico de serina en el sitio activo y (c) tiene suficiente homología de secuencia de aminoácidos con proteasas de serina conocidas que se agrupan en la familia de la subtilisina. Dentro de la expresión subtilisina de Aspergillus también se encuentran fragmentos de dicho enzima que retienen la actividad proteasa de serina.

La invención se refiere preferiblemente a una subtilisina de Aspergillus pura de Aspergillus niger, preferiblemente la proteasa de serina PEPC que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la secuencia de secuencias presentada bajo la SEC ID Nº 1 o la proteasa de serina PEPD que tiene la secuencia de aminoácidos presentada bajo la SEC ID Nº 6, y fragmentos y mutantes de las mismas que retienen la actividad proteasa de serina.

La invención se refiere además a composiciones enzimáticas que comprenden una o más de una subtilisina de Aspergillus y/o un derivado de la misma con actividad proteasa de serina y/o sus sales biológicamente aceptables, opcionalmente en una combinación predeterminada con uno o más enzimas adecuados que tiene otra actividad aparte de la de subtilisina de Aspergillus.

Cepa de Aspergillus deficiente en subtilisina de Aspergillus

La invención también se refiere a una cepa de Aspergillus mutada. Se prefiere una cepa de A. niger deficiente en el gen pepC mostrado en la SEC ID Nº 1 o en el gen pepD mostrado en la SEC ID Nº 6. También se prefiere una cepa de A. niger deficiente en ambos genes pepC y pepD.

En una realización preferida de la invención, puede prepararse por rotura génica una cepa de Aspergillus mutada de la invención que tenga un gen de subtilisina de Aspergillus defectuoso, es decir, una secuencia de ADN que corresponde con el gen endógeno de Aspergillus que se desea destruir muta in vitro a un gen defectuoso y transforma a células hospedadoras de Aspergillus. Debido a un suceso de recombinación homóloga en la célula, el gen endógeno intacto se reemplaza por el exógeno defectuoso. Normalmente, el gen endógeno se destruye por inserción de un gen marcador dentro de la región codificante. Esto lleva a un gen defectuoso que puede controlarse fácilmente y usarse para la selección de transformantes con el correspondiente gen endógeno interrumpido. Sin embargo, también pueden usarse otros métodos de mutagénesis para la preparación de una cepa de Aspergillus mutada, preferiblemente una cepa mutada de A. niger, en la cual está mutado un gen pepC y/o un gen pepD de forma que no se pueden expresar pepC y/o pepD funcionales.

En una realización más preferida de la invención se transforma una cepa de A. niger con un vector híbrido que comprende un mutante defectuoso del gen pepC mostrado en la SEC ID Nº 1, por ejemplo un gen pepC interrumpido que tiene un marcador de selección insertado, por ejemplo, como el comprendido en el plásmido pPEPCPYRA descrito en los ejemplos adjuntos, y se seleccionan los transformantes.

En otra realización más preferida de la invención, se transforma una cepa de A. niger con un vector híbrido que comprende un mutante defectuoso del gen pepD mostrado en la SEC ID Nº 6, por ejemplo, un gen pepD interrumpido que tiene un gen marcador de selección insertado, por ejemplo, como el comprendido en el plásmido pPEPDPYRA descrito en los ejemplos adjuntos, y se seleccionan los transformantes.

En una tercera realización más preferida de la invención se transforma una cepa de A. niger con un mutante defectuoso del gen pepC mostrado en la SEC ID Nº 1, por ejemplo, un gen pepC interrumpido que tiene un gen marcador de selección insertado, por ejemplo, como el comprendido en el plásmido pPEPCPYRA descrito en los ejemplos adjuntos, y con un mutante defectuoso del gen pepD mostrado en la SEC ID Nº 6, por ejemplo, un gen pepD interrumpido que tiene un gen marcador de selección insertado, por ejemplo, como el comprendido en el plásmido pPEPDPYRA descrito en los ejemplos adjuntos, y se seleccionan transformantes defectuosos tanto en pepC como en pepC.

Una cepa mutada de Aspergillus niger que tiene un gen defectuoso pepC y/o pepD es útil para la expresión de una producción aumentada de proteínas heterólogas u homólogas intra o extracelularmente.

La expresión de proteínas heterólogas u homólogas en Aspergillus sp. puede conseguirse de acuerdo con métodos convencionales. Normalmente, se construye un vector de expresión que comprende un gen homólogo o heterólogo unido de forma operativa con un promotor homólogo o heterólogo funcional en Aspergillus y, opcionalmente, con otras secuencias de control de la expresión funcionales en Aspergillus, por ejemplo, las definidas anteriormente. Cuando se requiere, el polipéptido se aisla de una manera convencional. Dependiendo de la construcción del vector de expresión, los productos se producen en la célula hospedadora o, si está presente una secuencia señal, se producen en la célula y se secretan.

En este contexto, los genes estructurales son, por ejemplo, genes estructurales que se originan a partir de virus, células procarióticas o células eucarióticas y que pueden derivar de ADN genómico o de ADNc preparado a través de la ruta del ARNm o pueden sintetizarse químicamente, codificando una amplia diversidad de polipéptidos útiles, incluyendo polipéptidos glicosilados, en particular de eucariotas superiores, especialmente mamíferos, tales como de origen animal o especialmente humano, tales como enzimas que pueden usarse, por ejemplo, para la producción de nutrientes y para realizar reacciones enzimáticas en química, o polipéptidos, que son útiles y valiosos para el tratamiento de enfermedades humanas y animales o para la prevención de las mismas, por ejemplo, hormonas, polipéptidos con propiedades inmunomoduladoras, antivirales y antitumorales, anticuerpos, antígenos virales, vacunas, factores de coagulación, productos alimentarios y similares.

Son ejemplos de tales genes estructurales, por ejemplo, los que codifican la poligalacturonasa de Aspergillus, por ejemplo, PGI o PGII, o la pectina liasa de Aspergillus, por ejemplo, PLI, PLA, PLB, PLC, PLE y PLF, u hormonas tales como secretina, timosina, relaxina, calcitonina, hormona luteinizante, hormona paratiroidea, adrenocorticotropina, hormona estimuladora de melanocito, \beta-lipotropina, urogastrona o insulina, factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento epidérmico, el factor de crecimiento similar a insulina (IGF), por ejemplo, IGF-I e IGF-II, factor de crecimiento de mastocitos, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de células nerviosas derivadas de glia, o factor de crecimiento transformante (TGF), tal como TGF\beta, hormonas de crecimiento tales como la hormona de crecimiento humana o bovina, interleuquinas, tales como la interleuquina-1 o -2, factor de inhibición de la migración de macrófagos humano (MIF), interferones, tales como el interferón-\alpha humano, por ejemplo interferón-\alphaA, \alphaB, \alphaD o \alphaF, interferón-\beta, interferón-\gamma o un interferón híbrido, por ejemplo un interferón híbrido \alphaA-\alphaD o un \alphaB-\alphaD, especialmente el interferón híbrido BDBB, inhibidores de proteinasas tales como \alpha_{1}-antitripsina, SLPI y similares, antígenos del virus de la hepatitis, tales como el antígeno de superficie o del núcleo del virus de la hepatitis B o el antígeno del virus de la hepatitis A, o el antígeno de la hepatitis no A no B, activadores del plasminógeno tales como el activador de plasminógeno tisular o uroquinasa, factor de necrosis tumoral, somatostatina, renina, \beta-endorfina, inmunoglobulinas tales como las cadenas ligeras y/o pesadas de las inmunoglobulinas D, E o G, o inmunoglobulinas híbridas humano-ratón, factores que unen inmunoglobulinas, tales como el factor que une inmunoglobulina E, calcitonina, péptido humano relacionado con la calcitonina, factores de coagulación sanguínea, tales como el factor IX o VIIIc, eritropoyetina, eglina, tales como la eglina C, hirudina, desulfatohirudinas, tales como las variantes de desulfatohirudinas HV1, HV2 o PA, superóxido dismutasa humana, timidina quinasa viral, \beta-lactamasa y glucosa isomerasa. Son genes preferidos los que codifican para un interferón-\alpha o interferón híbrido humano, particularmente el interferón híbrido BDBB, el activador del plasminógeno de tejido humano (t-PA), el antígenos de la superficie del virus de la hepatitis B (HBVsAg), factor de crecimiento similar a la insulina I y II, eglina C y desulfatohirudina, por ejemplo, la variante HV1.

Las realizaciones más preferidas son las descritas en los ejemplos adjuntos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención, sin embargo, de ninguna forma pretenden limitarla.

Las abreviaturas tienen los siguientes significados:

BSA	albúmina de suero bovino
DTT	1,4-ditiotreitol
EDTA	ácido etilendiamina tetra acético, sal disódica
IPTG	isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
kpb	kilopares de bases
PEG	polietilenglicol
SDS	dodecil sulfato sódico
Tris	tris (hidroximetil) aminometano
X-gal	5-bromo-4-cloro-3 indoil-\beta-galactósido

Tampones, medios, reactivos

SM: NaCl 100 mM, MgSO_{4} 8,1 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,5, gelatina al 0,01%

LB: tripticasa peptona (BBL) al 1%, extracto de levadura (BBL) al 0,5%, NaCl al 1% y Tris-HCl 0,5 mM pH 7,5

LM: tripticasa peptona (BBL) al 1%, extracto de levadura (BBL) al 0,5%, NaCl 10 mM y MgCl_{2} 10 mM

SSC: NaCl 0,15 M, citrato tri-sódico 0,015 M

PSB: Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM

TE: Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM pH 8,0

medio mínimo: 1 litro contiene 1,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g de KCl, 0,5 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,9 mg de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,2 mg de MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 0,06 mg de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,06 mg de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,29 g de CaCl_{2}\cdot62 H_{2}O, 0,2 mg de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, fuentes de carbono y nitrógeno según se especifica en el texto o 6 g de NaNO_{3} y 10 g de glucosa por litro si estas fuentes no se mencionan explícitamente, ajustado a pH 6,0 con NaOH.

medio completo: medio mínimo con 6 g de NaNO_{3} y 10 g de glucosa por litro más 2 g de tripticasa peptona (BBL), 1 g de casaminoácidos (Difco), 1 g de extracto de levadura (BBL), 0,5 g de sal sódica de ácido ribonucleico de levadura (ICN, Cleveland, USA), 2 ml de solución de vitamina por litro, ajustado a pH 6,0 con NaOH.

solución de vitaminas: 10 mg de tiamina, 100 mg de riboflavina, 10 mg de ácido pantoténico, 2 mg de biotina, 10 mg de ácido p-aminobenzoico, 100 mg de nicotinamida, 50 mg de piridoxina-HCl por 100 ml.

TBE: 1 litro contiene 4 ml de solución de EDTA 0,5 M pH 8,0, 10,8 g de Tris y 5,5 g de H_{3}BO_{3}

Fenol: Fenol tratado como se describe en Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory 1982 (p438)

Tampón de muestra: glicerol al 10% (v/v), EDTA 100 mM, pH 8,0 y azul de bromofenol al 0,01%.

ARNasa A: ARNasa A tratada como se describe en Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory 1982 (p451)

Se usan las siguientes cepas y vectores:

A. niger N400: tipo silvestre

A. niger An8: mutante auxotrófico para uridina de la cepa de A. niger N756 altamente productora del complejo pectinasa, descrita en el documento EP-A-0 278 355, depositada como DSM 3917.

E. coli LE392: F^{-}, hsdR514 (r_{k}^{-}, m_{k}^{+}), supE44, supF58, lacY1, o (lac1ZY)6, galK2, galT22, metB1, trpR55, \lambda^{-} .

E. coli DH5\alphaF': F^{-}, endA1, hsdR17, (r_{k}^{-}, m_{k}^{+}), supE44, thi-1, recA1, gyrA, relA1)80\diameterlacZ M15, \Delta(lac ZYA-argF)U169, \lambda^{-}.

EMBL4: EMBL4 es un vector lambda de substitución con una capacidad de clonación de 9-23 kpb (Frischauf et al., J. Mol. Biol. 170:827-842, 1983). Contiene una región de clonación múltiple entre los brazos de lambda y la región no esencial de relleno. Esto permite realizar digestiones múltiples con enzimas de restricción de forma que el religamiento del relleno en los brazos del vector se reduzca cuando se inserta el ADN extraño de interés. El vector también hace uso del fenotipo Spi para proporcionar una selección directa del recombinante (Zissler et al., en: A.D. Hershey (ed.) The Bacteriophage lambda, Cold Spring Harbour Laboratory, 1971).

Ejemplo 1 Construcción de una biblioteca genómica de Aspergillus niger

Ejemplo 1.1

Aislamiento de ADN de alto peso molecular a partir de A. niger N400

Se inoculan conidiosporas de la cepa N400 de Aspergillus niger en 200 ml de medio mínimo a una densidad final de esporas de 10^{6} esporas/ml y se agitan en 11 Erlenmeyers durante 24 h a 28ºC a 300 rpm. El micelio se recoge por filtración a través de Myracloth en un embudo Buchner, se lava con solución salina estéril fría, se congela en nitrógeno líquido y se conserva a -60ºC o se usa directamente. El método usado para el aislamiento de ADN para preparar la biblioteca genómica se basa en el procedimiento descrito por Yelton et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474 (1984)].

Para la construcción de la biblioteca, se trituran 10 g de micelio en nitrógeno líquido en porciones de 1 g en un microdesmembrador de Braun. El micelio triturado se transfiere a 11 Erlenmeyers estériles que contienen 200 ml de tampón de extracción (EDTA 50 mM pH 8,5, SDS al 0,2%) y 200 \mul de dietilpirocarbonato. La mezcla se atempera lentamente a temperatura ambiente y luego se calienta a 68ºC durante 20 min con agitación ocasional. La suspensión se enfría a temperatura ambiente y se centrifuga durante 15 min a 12.000 x g. Se añade al sobrenadante 1/16 de volumen de una solución de acetato potásico pH 4,2 y se deja la mezcla en hielo durante 1 h. El precipitado se retira por centrifugación (20 min; 16.000 x g; 4ºC). Los ácidos nucleicos se precipitan del sobrenadante por una incubación con 0,6 volúmenes de isopropanol en hielo durante 15 min. El ácido nucleico precipitado se recoge por centrifugación (10 min; 6.000 x g; 4ºC), se lava con etanol al 70% y se seca brevemente. El sedimento se resuspende en 10 ml de TE que contiene 20 \mug/ml de ARNasa A (Boehringer, Mannheim) y se incuba durante 15 min a 37ºC. El ADN se trata con nucleasa sin pronasa (concentración final de 1 mg/ml) (Kochlight, Coinbrook) durante 1 hora a 37ºC.

Se disuelven 8,5 g de CsCl en 9 ml de la solución del ADN obtenida, se añaden 0,2 ml de bromuro de etidio a 10 mg/ml y esta solución se centrífuga en un rotor Beckman SW41 durante 60 h a 33.000 rpm o en un rotor Beckman 50 Ti durante 40 h a 45.000 rpm. La banda de ADN se recoge y se elimina el bromuro de etidio por extracción múltiple con isopropanol equilibrado con una solución saturada de NaCl en agua. Se añaden 5 volúmenes de TE y se trata la solución de ADN de forma secuencial con fenol saturado con TE, fenol/cloroformo/alcohol isoamílico 25:24:1 y cloroformo/alcohol isoamílico 24:1. El ADN se precipita por adición de 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M pH 5,2, 2,5 volúmenes de etanol y una incubación durante toda la noche a -20ºC. El precipitado se recoge por centrifugación (1 h; 30.000 x g; 4ºC), se lava con etanol al 70%, se seca y se disuelve en 400 \mul de TE.

Ejemplo 1.2

Digestión parcial del ADN de A. niger N400 con MboI y aislamiento de los fragmentos

Para probar la concentración de MboI que proporciona la mayor cantidad de fragmentos de ADN entre 13,6 y 23 kpb, se digieren porciones de 1 \mug de ADN de A. niger N400 en el tampón apropiado recomendado por el proveedor con cantidades decrecientes de MboI (0,5-0,001 U) durante 1 h a 37ºC en un volumen de 10 \mul. La reacción se detiene por la adición de 1 \mul de EDTA 0,25 M, y las muestras se cargan en un gel de agarosa al 0,6% en tampón TBE, que contiene 1 \mug/ml de bromuro de etidio. La concentración requerida de MboI para dar un alto rendimiento de los fragmentos de 13,6-23 kpb deseados es de aproximadamente 0,02 U/\mug de ADN. Por consiguiente, se digieren 200 \mug de ADN en un volumen total de 2 ml. Después de 1 h a 37ºC, se añade EDTA a una concentración final de 25 mM, el enzima se inactiva por calor a 65ºC durante 10 min y el ADN se precipita, se lava, se seca y se disuelve en 400 \mul de TE. El ADN fragmentado se separa en un gel preparativo de agarosa al 0,4% a 4ºC y 40 V (3 V/cm). Los fragmentos del tamaño correcto se recortan del gel y el ADN se electroeluye del gel en un tubo de diálisis estéril en 2 ml de TBE de 2 a 3 horas a 100 V. La corriente se invierte durante 30 s, y el tampón que contiene el ADN se recoge. Después se concentran los fragmentos por precipitación con etanol y se disuelven en 100 \mul de TE.

Ejemplo 1.3

Preparación de ADN del vector

La biblioteca genómica de la cepa N400 de A. niger se construye en el vector lambda EMBL4. El vector, que tiene una capacidad de clonación de 9 a 23 kpb, se describe por Frischauf et al., [J. Mol. Biol. 170: 827-842 (1983)] y Karn et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5172-76 (1980)] y puede adquirirse de Promega Biotecnology Inc. Para evitar que se clonen en un fago dos inserciones originarias de partes diferentes del genoma, se usa para la clonación un fragmento de longitud mínima 13,6 kpb.

Se digieren completamente 10 \mug de ADN de lambda EMBL4 con 50 unidades de BamHI en el tampón recomendado por el proveedor en un volumen de 100 \mul durante 2 h a 37ºC. El enzima se inactiva a 65ºC durante 10 min. Se eleva la concentración de NaCl hasta 150 mM y se añaden 50 unidades de Sa1I y la incubación se continúa a 37ºC durante otras 2 horas. Tras la adición de EDTA a 25 mM e inactivación del enzima calentando a 67ºC durante 10 min. La solución se extrae con volúmenes iguales de fenol (TE saturado), fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1), y cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Para eliminar los pequeños fragmentos polienlazadores de BamHI/Sa1I, el ADN se precipita con 0,6 volúmenes de isopropanol después de la adición de 0,1 vol de acetato sódico 3 M pH 5,2. Después de 15 min en hielo y 15 min de centrifugación a 12.000 x g a 4ºC, el precipitado se lava extensamente con etanol al 70%, se seca y se disuelve en 40 \mul de TE.

Ejemplo 1.4

Ligamiento y empaquetamiento in vitro de los fragmentos de ADN genómico de A. niger N400

Es esencial que los sitios cos del vector preparado de acuerdo con el ejemplo 2.3 estén hibridados antes de la reacción de ligamiento. El vector se calienta a 65ºC durante 10 min en Tris-HCl 100 mM pH 7,5 y MgCl_{2} 10 mM y después se hibrida durante 1 hora a 42ºC. A partir de los ligamientos de ensayo, se ha descubierto que una relación de aproximadamente 1:1 (en peso) proporciona la mayoría de los recombinantes. El ligamiento tuvo lugar en Tris HCl 50 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM y ATP 1 mM, usando 9,5 \mug de vector y 10 \mug de fragmentos de ADN en un volumen total de 100 \mul. Se añade ADN ligasa (BRL) a una concentración de 0,5 U/\mug de ADN y la mezcla de ligamiento se incuba durante toda la noche a 14ºC. Para comprobar el ligamiento se corre una muestra del ADN ligado en un gel de agarosa. También se ligan como control 0,5 \mug del vector sin adición de fragmentos en un volumen de 5 \mul.

La mezcla de ligamiento se concentra por precipitación con etanol y se disuelve en 20 \mul de TE antes del empaquetamiento in vitro. El empaquetamiento in vitro se realiza con extractos de Promega Packagene según las indicaciones del fabricante usando porciones de 10 \mul para empaquetar 1 \mug de ADN. Como control se empaqueta por separado 1 \mug de fago lambda de control cI857 Sam7 de alto peso molecular, suministrado con los extractos. Tras el empaquetamiento se añaden 500 \mul de tampón solución del fago (PSB) y 5 \mul de cloroformo. La reserva de fagos recombinantes puede almacenarse a 4ºC.

Ejemplo 1.5

Titulación y amplificación de la biblioteca genómica de la cepa N400 de A. niger

Las células de E. coli NM539 se cultivan en medio LB que contiene maltosa al 0,2%, MgSO_{4} 10 mM y CaCl_{2} 1 mM hasta una densidad óptica (600 nm) de 1,0. Se añaden alícuotas de 0,2 ml de este cultivo a 0,1 ml de una dilución apropiada del fago en PSB. Tras la adsorción de los fagos durante 20 min a 37ºC, se añaden 3 ml de agar-superior LB al 0,6% a 45ºC, la mezcla se pone en placas de agar LB y éstas se incuban toda la noche a 37ºC. El número de unidades formadoras de placas (pfu) por ml de suspensión de fago es de 12 x 10^{5} y 4,2 x 10^{5} pfu/ml para dos reservas de fagos preparadas de acuerdo con el ejemplo 1.4. Después de restar el fondo calculado a partir de los ligamientos control sin fragmentos (17% y 40% respectivamente) el número absoluto de recombinantes es de 6 x 10^{5}. El contenido de ADN en los recombinantes es equivalente a más de 200 de los genomas de Aspergillus niger.

Para amplificar la biblioteca, se usan alícuotas de 80 \mul de ambas reservas de fagos para infectar células de E. coli NM539 que se ponen en agarosa-superior LB sobre placas de agar LB y después se incuban toda la noche a 37ºC. Los fagos se eluyen a partir de la agarosa por agitación suave de las placas con 5 ml de PSB por placa durante 1 h a temperatura ambiente. Se recoge el PSB, se centrifuga (10 min a 6.000 xg) para eliminar las bacterias y se añade cloroformo (concentración final al 0,5%). Después se mezclan ambas reservas de fagos que se amplifican aproximadamente al mismo nivel (40 \mul de reserva), se titulan (8 x 10^{9} pfu/ml) y se almacenan a 4ºC.

Ejemplo 2 Preparación de una sonda PRB de levadura

Ejemplo 2.1

Preparación de la sonda de levadura

El plásmido pGP202 (depositado como DSM 7018) contiene un fragmento de ADN de levadura de 3,2 kb, que codifica el gen PRB de levadura que puede escindirse convenientemente con HindIII y SauI. Este plásmido se digiere con HindIII y SauI y los fragmentos se separan en un gel de agarosa al 0,8%. El fragmento de 3,2 kb se recorta y se electroeluye el ADN. Se realiza una traducción con muesca de 100 ng de este fragmento con ^{32}P-dATP como nucleótido marcado y se usa inmediatamente para pruebas de Southern o de levantamiento de placas.

Ejemplo 2.2

Southern del ADN de A. niger

Se digieren alícuotas de 2 \mug de ADN de A. niger preparado como se describe anteriormente con BamHI o HindIII y se separan en un gel de agarosa al 0,8%. Tras fotografiar los geles teñidos con bromuro de etidio, el ADN se transfiere a filtros de nitrocelulosa mediante transferencia por capilaridad [Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98:503-517(1975)] y se hibrida como se describe en el ejemplo 3 con la sonda PRB de levadura marcada. Las tiras separadas de nitrocelulosa que contienen los dos productos de digestión se someten a una diversidad de regímenes de lavado para determinar las condiciones que proporcionan la proporción entre señal y ruido más fuerte. Descubrimos que un lavado preliminar en SSC x 6 a 47ºC seguido de dos lavados con SSC x 2 a temperatura ambiente proporcionan los mejores resultados.

Ejemplo 3 Selección de la biblioteca de A. niger N400 con la sonda PRB de levadura

Parte de la biblioteca genómica de la cepa N400 de Aspergillus niger descrita anteriormente (ejemplo 1) se diluye en SM y se ponen en placas porciones de 0,1 ml cada una que contienen aproximadamente 2000 pfu. Las células hospedadoras se preparan por inoculación de 50 ml de medio LB complementado con maltosa al 0,2% con 0,5 ml de un cultivo de toda la noche de E. coli NM539 en medio LB, agitando durante 4 h a 250 rpm y a 37ºC, seguido de la adición de 0,5 ml de MgSO_{4} 1 M y de 0,5 ml de CaCl_{2} 0,5 M. Se mezclan alícuotas de 0,2 ml de estas células, cada una con una porción de 0,1 ml de la suspensión del fago, y se incuban a temperatura ambiente durante media hora. Después se añaden 3 ml de agarosa al 0,7% en medio LM a 47ºC, la mezcla se remueve brevemente e inmediatamente se pone en placas de agar LM. Las placas se incuban toda la noche a 37ºC y se enfrían durante 2 h a 4ºC.

A partir de cada placa se hacen dos réplicas de acuerdo con el método de hibridación de placas de Benton y Davis [Benton, W.D. y Davis, R.W., Science 196: 180-182 (1977)]. El primer filtro (BA85 de Schleicher y Schuell) se sitúa sobre la placa durante 1 min, la segunda réplica durante 2 min y la posición de las réplicas se marca usando tinta china. Después de quitar los filtros, se sitúan en una placa que contiene 100 ml de una solución desnaturalizante (NaCl 1M, NaOH 0,5 M) durante 0,5 min, y después durante 1 min en 100 ml de solución neutralizadora (Tris-HCl 0,5 M pH 7,5, NaCl 1,5 M). Los filtros se transfieren a una placa que contiene SSC x 3, se frotan suavemente con una mano enguantada para eliminar los restos de bacterias y se enjuaga con SSC x 3. Los filtros se transfieren, se secan durante 10 min a temperatura ambiente y se meten en un horno a 80ºC durante 2 h en papel 3MM de Whatman.

Los filtros mantenidos en el horno se empapan en SSC x 3, se lavan en esta solución durante 1 h a temperatura ambiente y después se transfieren a una placa que contiene 250 ml de mezcla de prehibridación precalentada (65ºC) (SSC x 6, Denhardt x 10 (BSA, fracción V de Boehringer al 0,2%; Ficoll 400 al 0,2%, Pharmacia; polivinilpirrolidona-10 al 0,2%, Sigma), SDS al 0,1% y 0,1 mg/ml de ADN de esperma de arenque cortado y recién purificado). Después de 1 h de prehibridación a 65ºC en un baño de agua con agitación, los filtros se lavan una vez durante media hora en 250 ml de mezcla de hibridación precalentada (65ºC), que es la misma que la mezcla de prehibridación excepto por la falta de ADN de esperma de arenque. Después se transfieren los filtros a una placa que contiene 150 ml de mezcla de hibridación precalentada (65ºC) a la que se ha añadido recientemente la sonda marcada.

Después de la hibridación durante 14 h a 65ºC, los filtros se lavan una vez en 250 ml de mezcla de hibridación precalentada (47ºC) durante media hora a 47ºC, seguido del lavado a temperatura ambiente con dos cambios de 250 ml de SSC x 2, cada uno durante 45 min. Los filtros se secan y se exponen a una película Kodak XAR5 durante uno a tres día a -70ºC, usando una pantalla intensificadora.

De esta forma, se obtienen 3 señales positivas de las seis placas analizadas. Las placas positivas se perforan con una pipeta Pasteur estéril situando las placas cuidadosamente en el autorradiograma usando las marcas de tinta. Los pedazos de agar que contienen las placas positivas se añaden a 1 ml de SM y se añaden 2,5 \mul de cloroformo. Se permite que los fagos difundan fuera del agar durante una hora a temperatura ambiente, con agitación vorticial ocasional y, después se incuban toda la noche a 4ºC. El agar y los restos celulares se eliminan por centrifugación durante 5 min, se añaden 2,5 \mul de cloroformo y las reservas de fagos se almacenan a 4ºC.

Los clones positivos se denominan \lambda1, \lambda2 y \lambda4. Como los fagos se disponen en placas a alta densidad, las placas positivas se purifican dos veces sembrándolas a una baja densidad y repitiendo el procedimiento completo de réplica de las placas, hibridación y picado de las placas positivas.

Ejemplo 4 Caracterización de los clones \lambda

Ejemplo 4.1

Aislamiento del ADN \lambda

Para aislar el ADN de los clones recombinantes, primero se amplifican los fagos. Para este fin, se desarrollaron las células hospedadores de E. coli LE392 hasta una densidad óptica (600 nm) de 1,0 en medio LB complementado con MgSO_{4} 10 mM y maltosa al 0,2%. Después, se disponen por separado en placas 50 \mul de las reservas de los fagos purificados como se ha descrito anteriormente. Después de una incubación durante toda la noche a 37ºC, los fagos se eluyen de las placas no confluentes extendiendo 5 ml de SM sobre las placas e incubando durante dos horas con agitación suave. Se recogen los fagos eluidos y se añade 0,1 ml de cloroformo. La mezcla se remueve brevemente y se eliminan los restos celulares por centrifugación. Se recuperan los sobrenadantes, se añade cloroformo al 0,3% y el lisado resultante de la placa se almacena a 4ºC.

Para obtener placas casi confluente como material de partida para el aislamiento de ADN del fago, se disponen en placas porciones de 10 ml de los lisados de las placas con células hospedadoras E. coli LE392. Tras toda la noche de incubación a 37ºC, se raspa la capa superior de agarosa de tres placas casi confluentes. Estas capas se mezclan, se añaden 20 ml de SM y 0,4 ml de cloroformo y la mezcla resultante se agita a 37ºC durante 30 min. Los restos celulares y la agarosa se eliminan por centrifugación, se recupera el sobrenadante y su volumen se ajusta a 18 ml con SM. Se añade un volumen igual de NaCl 2 M, PEG6000 al 20% (BDH, Poole, GB) en SM y las soluciones se mezclan y se ponen en hielo. Después de 75 min, los fagos se sedimentan por centrifugación durante 20 min a 1200 x g a 4ºC. Se decantan los sobrenadantes y el líquido remanente se elimina con un papel Kleenex. El sedimento se resuspende en 3 ml de SM y posteriormente se extrae con 3 ml de cloroformo. La fase acuosa se trata con ARNasa A (67 \mug/ml) y ADNasa I (33 \mug/ml) durante 20 min a 37ºC. Después, esta mezcla se extrae añadiendo 2 ml de fenol, removiendo, añadiendo 1 ml de cloroformo, removiendo otra vez y separando las dos fases por centrifugación. La fase acuosa se extrae dos veces más, con 3 ml de fenol/cloroformo (1:1) y 3 ml de cloroformo, respectivamente. Después, se precipita el ADN de la fase acuosa por la adición secuencial de 0,3 ml de tampón acetato sódico 3 M (pH 5,2) y 6 ml de etanol. Esta mezcla se deja a 4ºC durante 16 horas y después se recupera el ADN por centrifugación (10 min, 12000 x g, 4ºC). El sedimento se disuelve en 0,4 ml de tampón TE, se añade ARNasa A a 200 \mug/ml, y se incuba a 37ºC durante 1 h. El ADN se precipita por la adición de 38 \mul de tampón acetato sódico 3 M (pH 5,2) y 0,8 ml de etanol a 4ºC durante 1 h. El ADN se recupera por centrifugación y posteriormente se disuelve en 100 \mul de TE.

Ejemplo 4.2

Análisis de restricción de los clones pepC de A. niger N400

Se establece por análisis de restricción que los tres fagos contienen inserciones derivadas de la misma región del genoma de A. niger y se construye un mapa de restricción parcial de \lambda1.

Se digieren 2 \mug de ADN del fago con 20 unidades de EcoRI en un volumen de 20 \mul durante 1 h a 37ºC en el tampón recomendado por el proveedor (BRL) y después se calientan a 65ºC durante 10 min. Las muestras se procesan en un gel de agarosa al 0,7% y se fotografían. El ADN se transfiere a membranas de nitrocelulosa y se hibrida con la sonda PRB de levadura marcada. Está claro a partir de estos productos de digestión que los tres fagos son idénticos conteniendo un fragmento EcoRI de 12 kb y de 2,7 kb. También está claro que el fragmento de 12 kb es el único fragmento que hibrida con la sonda PRB y, por lo tanto, contiene la mayoría si no todos los genes correspondientes a A. niger. \lambda1 se elige para más análisis.

\lambda1 también se digiere con una diversidad de enzimas de restricción y se somete de nuevo a un análisis de Southern. La banda más pequeña que parece contener todas las bandas que hibridan con la sonda PRB es un fragmento EcoRI BamHI de 3,2 kpb. Por lo tanto, éste se subclona en un plásmido.

Ejemplo 5 Clonación de PEPC en un plásmido y su secuenciación y caracterización

Ejemplo 5.1

Construcción de pTZPEPC

El ADN de \lambda1 se incuba con los enzimas de restricción BamHI y EcoRI, esencialmente como se ha descrito anteriormente. Después de la extracción con cloroformo, el ADN se precipita, se sedimenta por centrifugación, se disuelve en tampón de muestra y se somete a electroforesis en un gel de agarosa al 0,6% en tampón TBE x 1. Se recupera la porción del gel que contiene el fragmento BamHI-EcoRI de 3,2 kpb y se electroeluye el ADN. Después, éste se extrae precipitando con 100 \mul de cloroformo y etanol y redisolviendo en 40 ml de tampón TE. La concentración de ADN se estima por electroforesis en gel de agarosa seguido de la visualización de la banda con luz ultravioleta.

El vector pTZ18R se prepara por digestión con BamHI y EcoRI en las condiciones recomendadas por el proveedor (BRL). El ADN se extrae con fenol, fenol/cloroformo (1:1) y cloroformo y el ADN se precipita con etanol.

Se ligan juntos 100 ng de cada uno de los fragmentos anteriores en un volumen de reacción de 25 \mul, que contiene el tampón recomendado por BRL más ATP (1 mM) y 1,5 U de ADN ligasa de T4 (BRL). La mezcla de reacción se incuba durante 16 h a 16ºC y después se usa para transformar E. coli DH5\alphaF'. Las células se disponen en placas de agar LB que contienen 25 \mug/ml de ampicilina, Xgal al 0,005%, IPTG 0,05 mM y se incuban toda la noche a 37ºC.

Se usan varias colonias blancas individuales para preparar los cultivos de toda la noche en medio LB complementado con glucosa al 0,1% y 25 mg/ml de ampicilina. Estos cultivos se usan para aislar el plásmido, usando el método de miniprep de Holmes y Quigley [Holmes, D.S. y Quigley, M., Anal. Biochem. 114:193 (1981)]. Los plásmido se digieren con varios enzimas de restricción, de acuerdo con las recomendaciones del proveedor (BRL) y en presencia de ARNasa A (0,5 mg/ml), y los productos se analizan en un gel de agarosa. Se seleccionan los plásmidos que producen los fragmentos BamHI-EcoRI y HindIII del tamaño esperado y las células de E. coli que los portan se mantienen en glicerol a -20ºC. Este plásmido se llama pTZPEPC (depositado como DSM 7019).

Ejemplo 5.2

Secuencia de nucleótidos de pepC

El subclon pepC, un fragmento BamHI-EcoRI de 3,2 kpb en el vector pTZ18R, se secuencia completamente por el método de terminación de cadena didesoxi [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-67 (1977)] usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos y Sequenase (United States Biochemical Corp.).

La secuencia completa de nucleótidos está presente en el listado de secuencias. La fase de lectura abierta se identifica por comparación con otra subtilisina conocida de la familia de las proteasas de serina y se confirma por mapeo de transcripción.

Ejemplo 5.3

Mapeo del ARN de PEPC

El ARN total se prepara a partir de micelios liofilizados y triturados que crecen en medio mínimo con glucosa como fuente de carbono y amonio como fuente de nitrógeno por el método de Frederick y Kinsey [Curr. Genet. 18:53-58 (1990)]. El extremo 5' del ARN mensajero se identifica por hibridación del ARN total con oligo A, un oligonucleótido marcando en el extremo con 32-P (complementario a los nucleótidos 433 a 456 de la SEC ID Nº 1) y determinándose el tamaño del transcrito producido por transcriptasa inversa procesado en un gel de secuenciación por comparación con las reacciones de secuenciación producidas por la secuenciación didesoxi con el mismo oligonucleótido (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Los sitios precisos de ayuste del intrón se identifican por clonación y secuenciación de una copia parcial de ADNc del mensajero de pepC. La síntesis de la primera cadena se lleva a cabo por métodos convencionales (Maniatis et al., op. cit.) con la excepción de que el oligonucleótido de cebado es oligo C (complementario a los nucleótidos 923 a 944 de la SEC ID Nº 1). Este ADNc se somete a PCR usando oligos B (correspondientes a los nucleótidos 631 a 657 de la SEC ID Nº 1) y C, y se clona en pTZ18R. (Obsérvese que el oligo B tiene adicionalmente un sitio BamHI en su extremo 5' y el oligo C adicionalmente tiene un sitio EcoRI). Ambas cadenas de los dos clones independientes se secuencian completamente. La longitud total del ARNm producido por el gen pepC se determina por análisis de Northern usando el fragmento EcoRI-BamHI de 3,2 kb como sonda (Maniatis et al., op. cit.) y se determina que está entre 1,5 y 1,8 kb, lo que corresponde al tamaño esperado por la fase de lectura abierta y la posición del sitio de iniciación de la transcripción.

Ejemplo 6 Interrupción genómica de PEPC

Ejemplo 6.1

Construcción de pTZPEPCE

El plásmido pTZPEPC se digiere con BamHI, se trata con la polimerasa de T4 y se religa en presencia de un exceso diez molar de conectores de EcoRI desfosforilados (5' GGAATTCC). Después de la transformación en E. coli, se identifica por miniselección el plásmido correcto con sitios EcoRI flanqueando ambos lados del gen pepC.

Ejemplo 6.2

Construcción de pAXI

El plásmido pCG59D7 que puede obtenerse a partir de Escherichia coli BJ5138/pCG59D7 (DSM 3968) se digiere con XbaI y se purifica el fragmento que contiene un gen pyrA de A. niger completo. Éste se clona en el sitio XbaI de pTZ18R para crear el plásmido pAXI (depositado como DSM 7017).

Ejemplo 6.3

Construcción de pPEPCPYRA

El fragmento XbaI de 4 kb que contiene el gen pyrA se escinde de pAXI y se purifica a partir de las secuencias del vector.

Se cortan con BglII 2 \mug de pTZPEPCE de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y, después, se extrae con fenol, se precipita con etanol y se redisuelve en 20 \mul de agua. Este ADN después se trata con fosfatasa alcalina bacteriana para eliminar los grupos 5' fosfato, como recomienda el fabricante. El fragmento de 5 kb se purifica de un gel.

Los dos fragmentos anteriores se tratan con polimerasa de T4 de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se extraen con fenol y se precipitan con etanol. Los dos fragmentos se mezclan y se ligan. Después de la transformación de E. coli, las colonias que llevan los plásmidos correctos se identifican por digestión por restricción de preparaciones de miniplásmidos.

pPEPCPYRA consta del vector pTZ18R que contiene un fragmento EcoRI que lleva el gen PEPC, que tiene el fragmento central BglII, que codifica los dos sitios activos de histidina y serina, substituido por un fragmento de ADN XbaI que codifica la orotidina monofosfato descarboxilasa.

Ejemplo 6.4

Transformación de A. niger

Se digieren completamente 10 \mug del plásmido pPEPCPYRA con EcoRI. El grado de digestión se revisa procesando una alícuota en un gel y el resto del ADN se extrae con fenol, se precipita con etanol y se resuspende en 20 \mul de agua estéril.

Las esporas conidiales del A. niger An8 auxotrófico (DSM 3917) se cultivan durante 4 días a 28ºC en medio completo hasta la completa esporulación. Se usan 2 x 10^{8} conidiosporas para inocular 200 ml de medio mínimo complementado con 1 g/l de arginina y uridina.

Después de 20 horas de crecimiento a 28ºC a 180 rpm, el micelio se recoge por filtración a través de Miracloth, se lava dos veces con 10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM y se resuspende en 20 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM y 0,5 mg/ml de Novozym 234 (Novo Industries). La mezcla se incuba en un baño de agua con agitación (30ºC, 50 rpm) hasta que se liberan suficientes protoplastos (detectados microscópicamente después de 90 a 120 min). La suspensión de protoplastos se filtra a través de un lecho corto de lana de vidrio en un embudo para eliminar los restos de micelio. Los protoplastos se sedimentan por centrifugación suave (10 min, 2000 rpm) a temperatura ambiente y se lavan dos veces con 10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM. Finalmente, los protoplastos se resuspenden en 200 a 500 \mul de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM para dar una concentración de 1 x 10^{8} esferoplastos por ml.

Para la transformación, se incuba una alícuota de 200 \mul de la suspensión de protoplastos con 5 \mug del pPEPCPYRA digerido con EcoRI, 50 \mul de PCT (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl_{2} 50 mM, PEG 6000 al 25%). La mezcla de incubación se mantiene en hielo durante 20 min, se añaden otros 2 ml de PCT y la mezcla se incuba durantes 5 min más a temperatura ambiente. Se añaden 4 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM y se mezclan alícuotas de 1 ml de la solución final de transformación con medio mínimo de agar líquido (medio mínimo + 1 g/l de arginina + 10 g/l de Bacto-Agar (Difco)), estabilizado con KCl 0,8 M. Las mezclas se vierten inmediatamente sobre placas de agar del mismo medio y se incuban a 30ºC.

Tras 2 ó 3 días de crecimiento a 28ºC, aparecen los transformantes estables como crecimiento vigoroso y colonias que esporulan sobre un crecimiento de fondo de muchos cientos de transformantes pequeños, presumiblemente abortivos.

Ejemplo 6.5

Identificación de las roturas génicas

A partir de las colonias estables, se preparan suspensiones individuales de esporas y se cultivan en rayas en placas mínimas recientes más arginina. Se seleccionan colonias individuales y se cultivan otra vez en rayas para conseguir cultivos puros. Éstos se usan para inocular 200 ml de medio mínimo líquido complementado con 1 g/l de arginina. Después de 24 h de agitación a 180 rpm a 30ºC, el micelio se recoge en papel de filtro y la pasta se liofiliza. Después de secar, se prepara el ADN a partir de las pastas individuales moliendo las pastas con un mortero hasta conseguir un polvo fino. Se resuspenden 60 mg de este polvo en 3 ml de dodecilsulfato sódico al 1%, Tween 80 al 0,1% y acetato amónico 1 M por agitación vorticial. Esto se calienta a 65ºC durante 20 min con mezcla ocasional. Los restos celulares se separan de la solución de ADN por centrifugación a 15.000 rpm durante 5 min. El sobrenadante se extrae dos veces con fenol, dos con cloroformo y se precipita con etanol. El sedimento de ADN se redisuelve en 100 \mul de TE estéril.

Se digieren 20 \mul de cada ADN con BglII en presencia de 1 \mug de ARNasa A durante 1 h. Esto se separa en un gel de agarosa, se transfiere a una membrana de nitrocelulosa y se mete en un horno. Se purifica el fragmento EcoRI de pTZPEPC que contiene PEPC, se marca por traducción con muesca y se usa como sonda en los filtros. Las cepas que llevan una rotura del gen pepC se reconocen fácilmente por la falta del fragmento de hibridación BglII de 1,2 kb así como porque tienen alterada la movilidad de los otros dos fragmentos flanqueantes.

Una de estas cepas se pone en placas con medio que contiene uridina y ácido 5-fluoro-orótico. Los mutantes auxotróficos para pirimidina se identifican por el crecimiento más fuerte en este medio y se pican y purifican por cultivo en rayas para obtener colonias individuales.

Ejemplo 6.6

Producción de interferón en la cepa de A. niger pepC^{-}

Una de las cepas de A. niger An8 pepC^{-} aisladas en el ejemplo 6.5 se usa como hospedador para una transformación posterior con pyrA^{+}que contiene plásmidos y cassettes de expresión que contienen un gen heterólogo para interferón.

Se cultivan esporas conidiales del mutante de A. niger An8 pepC^{-} auxotrófico para la uridina durante 4 días a 28ºC en medio completo hasta que esporulan completamente. Se usan 2 x 10^{8} conidiosporas para inocular 200 ml de medio mínimo complementado con 1 g/l de arginina y uridina.

Después de 20 horas de cultivo a 28ºC y a 180 rpm, el micelio se recoge por filtración a través de Myracloth, se lava dos veces con 10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM y se resuspende en 20 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM, 0,5 mg/ml de Novozym 234 (Novo Industries). La mezcla se incuba en un baño de agua con agitación (30ºC, 50 rpm) hasta que se libera una cantidad suficiente de protoplastos (detectada microscópicamente después de 90 a 120 min). La suspensión de protoplastos se filtra a través de un lecho corto de lana de vidrio en un embudo para eliminar los restos de micelio. Los protoplastos se sedimentan por centrifugación suave (10 min, 2000 rpm) a temperatura ambiente y se lavan dos veces con 10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM. Finalmente, los protoplastos se resuspenden en 200-500 \mul de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM para dar una concentración de 1 x 10^{8}/ml.

Para la transformación, se incuba una alícuota de 200 \mul de la suspensión de protoplastos con 5 \mug de pCG59D7 (DSM 3968) y 50 \mug de ADN de pGIIss-IFN AM119 o pGII-IFN AM119 (ambos plásmidos se describen completamente en la solicitud EP 0 421 919), 50 \mul de PCT (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl_{2} 50 mM, PEG 6000 al 25%). La mezcla de incubación se mantiene en hielo durante 20 min, se añaden otros 2 ml de PCT y la mezcla se incuba durante 5 min más a temperatura ambiente. Se añaden 4 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM y se mezclan alícuotas de 1 ml de la solución de transformación final con medio agar mínimo licuado (medio mínimo + 1 g/l de arginina + 10 g/l de Bacto-Agar (Difco)), estabilizado con KCl 0,8 M. Las mezclas se vierten inmediatamente en placas de agar del mismo medio y se incuban a 30ºC.

Después de 2 ó 3 días de cultivo a 28ºC, aparecen los transformantes estables con crecimiento vigoroso y colonias que esporulan sobre un crecimiento de fondo de muchos cientos de transformantes pequeños, presumiblemente abortivos.

Los transformantes se pican y se analiza la expresión de interferón. La actividad del interferón se determina de acuerdo con el procedimiento de Armstrong (J.A. Armstrong, Appl. Microbiol. 21, 732 (1971)) usando células humanas CCL-23 y el virus de la estomatitis vesicular (VSV) como virus de exposición.

Se precultivan individualmente esporas conidiales de los transformantes en 50 ml de un medio de precultivo (3 g/l de Pectin Slow Set L (Unipectin, S.A. Redon, Francia), 2 g/l de NH_{4}Cl, 0,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l de NaCl, 0,5 g/l de Mg_{2}SO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,5 g/l de Ca_{2}SO_{4}\cdot2H_{2}O, pH 7.0, y arginina al 1%). El precultivo se incuba durante 72 horas a 250 rpm y a 28ºC. Se usa un 10% del precultivo para inocular 50 ml de medio de cultivo principal (20 g/l de harina de soja, 5 g/l de pectina Slow Set, y arginina al 1%). El cultivo se desarrolla durante 72 a 96 horas a 250 rpm y a 28ºC.

Se toman muestras a distintos tiempos (durante 20 horas), las células se sedimentan por centrifugación y se rompen por liofilización y se trituran en seco. Se ensaya la actividad del interferón en el sobrenadante y en los extractos celulares como se describe (supra). La mayor parte de la actividad del interferón se encuentra secretada en el medio en transformantes que llevan pGIIss-IFN AM119, mientras que en los transformantes que llevan pGII-IFN AM119 principalmente está en el extracto celular.

Ejemplo 7 Sobreexpresión de pepC en A. niger

Ejemplo 7.1

Sobreexpresión de copias múltiples

Se transforma A. niger An8 con 1 \mug de pAXI más 10 \mug de pTZPEPC para producir protótrofos para la uridina. Las colonias se purifican y se prepara el ADN como se ha descrito anteriormente. Las transferencias de Southern usando el fragmento EcoRI-BamHI de pTZPEPC demostraron que algunos transformantes tiene una única copia de pTZPEPC integrada en su genoma mientras que otros tienen hasta y por encima de 10 copias extra en su genoma. Estas cepas producían en correspondencia más actividad proteolítica y son mitóticamente estables.

Ejemplo 7.2

Sobreexpresión de pepC a partir de fusiones génicas

El plásmido pGW1100 (depositado como DSM 5747) se corta con BamHI y SacI. El fragmento de 1,2 kpb que incluye el promotor de la piruvato quinasa y el extremo 5' se purifica, se trata con la polimerasa de T4 y se clona en el único sitio BamHI de pTZPEPC en el extremo 5' del clon de pepC, que también se convierte en extremos romos con la polimerasa de T4 y se trata con fosfatasa alcalina.

Los plásmidos correctos se identifican por miniselección, se elige uno y se utiliza para transformar una cepa BW313 de E. coli dut^{-} ung^{-}. Esta cepa se superinfecta con M13K07 para producir un ADN monocatenario uracilo-substituido a partir del plásmido.

El oligonucleótido 1 (representado como la SEC ID Nº 3) consta de 37 nucleótidos. Los primeros 19 nucleótidos son complementarios a los primeros 19 nucleótidos de la fase de lectura abierta de pepC y los 18 últimos son complementarios a los 18 nucleótidos últimos anteriores al ATG del gen de la piruvato quinasa. Para la mutagénesis in vitro de este plásmido, se fosforilan 5 pM del oligonucleótido 1 en el extremo 5' con ATP 100 pM tratando el oligo con 10 U de polinucleótido quinasa de T4 en 50 \mul de tampón quinasa como recomienda el proveedor. La reacción se termina calentado a 65ºC durante 10 min.

Se mezcla una concentración 0,2 pM del ADN monocatenario que contiene uracilo con una concentración 0,5 pM del oligonucleótido 1 fosforilado en Tris-HCl 20 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, NaCl 25 mM en un volumen final de 10 \mul. La mezcla se incuba a 65ºC durante 5 min, se enfría lentamente a temperatura ambiente durante 60 min y se pone en hielo durante 15 min. Después se añaden a la mezcla 2 \mul de dNTP 500 \muM, 1,5 \mul de ATP 10 mM, 1 ml de ADN polimerasa de T7 (12 U/\mul, Pharmacia) y 1 \mul de ADN ligasa de T4 (1,2 U/\mul, BRL) y esta mezcla de polimerización se incuba durante 15 min a 37ºC. La reacción se termina calentando a 65ºC durante 5 min y se usan alícuotas para transformar E. coli DH5\alphaF'.

Los plásmidos correctos se identifican digiriendo preparaciones de miniplásmidos. Se eligen 3 y el fragmento EcoRI se secuencia completamente usando oligonucleótidos sintéticos. Un plásmido que contiene una fusión perfecta del promotor de la piruvato quinasa con la fase de lectura abierta de pepC, que se denomina pPKIPEPCA, se usa con pAXI para cotransformar A. niger An8 en prototrófico para uridina.

La presencia de la fusión pki-pepC se confirma obteniendo el ADN de transformantes individuales purificados y usándolo en análisis de Southern usando sondas de pki y pepC. Se demuestra que las cepas con una o más copias de esta fusión génica integrada en su genoma producen más actividad proteolítica cuando las células se desarrollan rápidamente en glucosa como fuente de C.

Ejemplo 8 Expresión de pepC en otros organismos Expresión en levadura

El plásmido pPKIPEPCA se somete a mutagénesis in vitro con los dos oligonucleótidos sintéticos mostrados en la lista de secuencias como SEC ID Nº 4 y 5. El primero introduce un sitio EcoRI justo antes del ATG de pepC y el otro crea un bucle con el intrón completo. Esto crea un plásmido pPKIPEPCB cuya secuencia se confirma por secuenciación completa.

El fragmento EcoRI-BamHI de 2,8 kb que empieza justo antes del ATG de pepC y acaba después del terminador de pepC se purifica y liga junto con el fragmento BamHI-EcoRI de 520 pb de pFBY129 (depositado como DSM 7016), que contiene el promotor GAL10 de levadura, en el sitio SnaBI del vector pFBY25 de dos micras basado en levadura (depositado como DMS 7020). El plásmido correcto se identifica por los productos de la digestión de restricción.

Este plásmido, pFBY138, se utiliza para transformar levaduras y se ha demostrado que produce la proteína pepC cuando se induce la fusión génica con galactosa.

Ejemplo 9 Aislamiento de una sonda de ADN para la selección de proteasas de serina similares a la subtilisina de A. niger

Ejemplo 9.1

Diseño de cebadores de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) degenerados

La reacción en cadena de la polimerasa (Saiki et al., Science 230:1350-1354 (1985)) se usa para aislar sondas para esta selección. Las dos regiones que contienen los restos de los sitios activos para histidina y serina, respectivamente, están bien conservadas entre las diferentes proteasas de la clase de la subtilisina. Se obtiene una secuencia de aminoácidos consenso para cada una de estas regiones y se deducen las secuencias de ADN capaces de codificar estas dos secuencias de aminoácidos. Para reducir el nivel de degeneración, se diseñan dos cebadores para cada una de las regiones conservadas. PCRoligo 1 y PCRoligo 2 (mostrados en las SEC ID Nº 8 y 9, respectivamente) corresponden a la región del sitio activo His, y PCRoligo 3 y PCRoligo 4 (mostrados en las SEC ID Nº 10 y 11, respectivamente) corresponden a la región del sitio activo Ser. Para facilitar la subclonación posterior de los productos de PCR, los PCRoligos 1 y 2 contienen un sitio de restricción BamHI y los PCRoligos 3 y 4 también un sitio EcoRI próximo a sus extremos 5'.

Ejemplo 9.2

Amplificación del ADN genómico de A. niger

Se aísla el ADN genómico de A. niger como se describe en el ejemplo 1. Se realizan cuatro reacciones de amplificación usando una combinación por parejas de los cuatro oligos para PCR descritos anteriormente. La mezcla de reacción para la reacción en cadena de la polimerasa contiene 100 ng de ADN genómico total de A. niger, 100 pmol de cada cebador, Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 1 mg/ml de gelatina, (pH 8,3) y 5 unidades de ADN polimerasa Taq en un total de 50 \mul. El ADN se desnaturaliza a 94ºC durante 30 segundo y después se hibridan los cebadores a 42ºC durante 40 segundos y la etapa de extensión se realiza a 72ºC durante 60 segundos. Después se repiten estas tres etapas 40 veces.

Ejemplo 9.3

Aislamiento y caracterización de los productos de PCR

Los productos de las reacciones de amplificación se separan en un gel de agarosa al 1% y los fragmentos de ADN se aislan del gel por electroelución como se ha descrito anteriormente. Los fragmentos aislados (200 a 300 ng) se extraen con fenol y luego con cloroformo y se precipitan con etanol. Tras la centrifugación, los sedimentos de ADN se secan y luego se disuelven en 10 \mul de tampón TE. Posteriormente este ADN se digiere con 10 unidades de los enzimas de restricción BamHI y EcoRI en un volumen de 20 \mul durante 1 h a 37ºC en el tampón recomendado por el proveedor (BRL). Tras la extracción con fenol y cloroformo y la precipitación con etanol, el ADN digerido se sedimenta, se seca y se redisuelve en 10 \mul de tampón TE. La concentración de ADN se estima por electroforesis en gel de agarosa seguido de la visualización de las bandas de ADN bajo luz UV.

El vector pTZ18R se prepara por digestión con BamHI y EcoRI en las condiciones recomendadas por el proveedor (BRL) y luego se extrae y se precipita con etanol como se ha descrito anteriormente.

Se ligan 100 ng de los fragmentos de PCR aislados junto con 100 ng del vector pTZ18R preparado descrito anteriormente en un volumen de 20 \mul con 1 unidad de ADN ligasa de T4. Las condiciones del tampón usado son las sugeridas por el proveedor (BRL). Tras la incubación de la mezcla de reacción a 16ºC durante 16 h, ésta se usa para transformar la cepa DH5\alphaF' de E. coli. Las células se disponen en placas de agar LB que contienen 25 \mug/ml de ampicilina, Xgal al 0,005%, IPTG 0,05 mM y se incuban durante toda la noche a 37ºC.

Se usan varias colonias blancas individuales para preparar cultivos de una noche en 5 ml de medio LB complementado con glucosa al 0,1% y 25 \mug/ml de ampicilina. Estos cultivos se usan para aislar el ADN del plásmido, usando el método de miniprep de Holmes y Quigley (Holmes, D.S. y Quigley, M. Anal. Biochem. 114: 193 (1981)). Los plásmidos se digieren con los enzimas de restricción BamHI y EcoRI de acuerdo con las recomendaciones del proveedor (BRL). Los plásmidos que contienen fragmentos se analizan adicionalmente.

Los insertos de los plásmidos seleccionados se secuencian por el método de terminación de cadena didesoxi (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-67 (1977)) usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos y Sequenase (United States Biochemical Corp.).

Ejemplo 9.4

Análisis por ordenador de las secuencias de los productos de PCR

Las secuencias de nucleótidos de los insertos anteriores se comparan con todas la secuencias de ADN en las bases de datos combinadas de GenBank y EMBL. Una de ellas, que muestra una fuerte homología con las secuencias de ADN que codifican proteasas del tipo de la subtilisina, se elige como sonda, y se denomina sonda-PCR, para la posterior selección de la biblioteca genómica de A. niger. La secuencia de este fragmento (sin los cebadores de PCR) es la que está entre los nucleótidos 1474 y 2020 en la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 6.

Ejemplo 10 Selección de la biblioteca de A. niger N400 con la sonda-PCR

Se preparan filtros para hibridación en placa de la biblioteca genómica de la cepa N400 de Aspergillus niger como se ha descrito anteriormente (ejemplo 1) y se prehibridan de acuerdo con el ejemplo 3.

Tras la hibridación durante 14 a 16 h a 65ºC, los filtros se lavan una vez con 250 ml de SSC x 2, SDS al 0,1% durante media hora a temperatura ambiente seguido de lavado a temperatura ambiente con dos cambios de 250 ml de SSC x 0,2 y SDS al 0,1%, de 20 min cada uno, y finalmente dos veces en 250 ml de SSC x 0,2 y SDS al 0,1% a 65ºC, durando cada lavado 20 min. Los filtros se secan y se exponen a una película Kodak XAR5 durante uno a tres día a -70ºC usando una pantalla intensificadora.

De esta forma, se obtienen 5 señales positivas a partir de las seis placas analizadas. Las placas positivas se pinchan con una pipeta Pasteur estéril poniendo cuidadosamente las placas en el autorradiograma usando las marcas de tinta. Los pedazos de agar que contienen las placas positivas se añaden a 1 ml de SM y se añaden 2,5 \mul de cloroformo. Se permite que los fagos difundan fuera del agar durante una hora a temperatura ambiente, con agitación vorticial ocasional y, después se incuban toda la noche a 4ºC. El agar y los restos celulares se eliminan por centrifugación durante 5 min, se añaden 2,5 \mul de cloroformo y las reservas de fagos se almacenan a 4ºC.

Los clones positivos se denominan \lambdaa, \lambdab, \lambdac, \lambdad y \lambdae. Como los fagos se disponen en placas a alta densidad, las placas positivas se purifican dos veces sembrándolas a una baja densidad y repitiendo el procedimiento completo de réplica de las placas, hibridación y picado de las placas positivas.

Ejemplo 11 Caracterización de los clones \lambda

Ejemplo 11.1

Aislamiento del ADN de \lambda y análisis de restricción de los clones de pepD de A. niger N400

El ADN de lambda se aisla como se describe en el ejemplo 4.1.

Se establece por análisis de restricción que los cinco fagos de \lambdaa a \lambdae contienen insertos derivados de la misma región del genoma de A. niger y se construye un mapa de restricción parcial de esta región genómica.

Se digieren 2 \mug de ADN del fago con 20 unidades de EcoRI o BamHI en un volumen de 20 \mul durante 1 h a 37ºC en el tampón recomendado por el proveedor (BRL) y después se calientan a 65ºC durante 10 min. Las muestras se procesan en un gel de agarosa al 0,7% y se fotografían. El ADN se transfiere a membranas de nitrocelulosa y se hibrida con la sonda-PCR marcada.

Está claro a partir de estos productos de digestión que los 5 fagos contienen una región solapante de aproximadamente 5,5 kb que hibrida con la sonda-PCR y, por lo tanto, contiene la mayoría si no todo el gen correspondiente a A. niger. Un fragmento BamHI de 6,0 kpb de longitud contiene esta región y se elige para un análisis más profundo.

Ejemplo 12 Clonación de PEPD en un plásmido y su secuenciación de caracterización

Ejemplo 12.1

Construcción de pTZPEPD

El fragmento BamHI de 6,0 kb se incuba con el enzima de restricción HindIII. Tras la extracción con cloroformo, se precipita el ADN, se sedimenta por centrifugación, se disuelve en tampón de muestra y se somete a electroforesis en un gel de agarosa al 0,6% en tampón TBE x 1. Se recupera una porción del gel que contiene el fragmento BamHI-HindIII de 3,0 kpb y el ADN se electroeluye. Entonces, éste se extrae con 100 \mul de cloroformo, se precipita con etanol y se redisuelve en 40 ml de tampón TE. La concentración de ADN se estima por electroforesis en gel de agarosa seguido de la visualización de la banda bajo luz UV.

El vector pTZ18R se prepara por digestión con BamHI y HindIII, en las condiciones recomendadas por el proveedor (BRL). El ADN se extrae con fenol, fenol/cloroformo (1:1) y cloroformo, y el ADN se precipita con etanol.

Se ligan juntos 100 ng de cada uno de los fragmentos anteriores en un volumen de reacción de 25 \mul, que contiene el tampón recomendado por BRL más ATP (1mM) y 1,5 U de ADN ligasa de T4 (BRL). La mezcla de reacción se incuba durante 16 h a 16ºC y después se usa para transformar E. coli DH5\alphaF'. Las células se disponen en placas de agar LB que contiene 25 \mug/ml de ampicilina, Xgal al 0,005%, IPTG 0,05 mM y se incuban durante toda la noche a 37ºC.

Se usan varias colonias blancas individuales para preparar cultivos de una noche en medio LB complementado con glucosa al 0,1% y 25 mg/ml de ampicilina. Estos cultivos se usan para aislar el plásmido, usando el método miniprep de Holmes y Quigley [Holmes, D.S. y Quigley, M., Anal. Biochem. 114:193 (1981)]. Los plásmidos se digieren con varios enzimas de restricción de acuerdo con las recomendaciones del proveedor (BRL) y en presencia de ARNasa A (0,5 mg/ml), y los productos se analizan en un gel de agarosa. Los plásmidos que dan lugar a fragmentos BamHI-HindIII del tamaño esperado se seleccionan y las células E. coli que los llevan se almacenan en glicerol a -20ºC. Este plásmido se denomina pTZPEPD (depositado como DSM 7409).

Ejemplo 12.2

Secuencia de nucleótidos de pepD

El subclon de pepD, un fragmento BamHI-HindIII de 3,0 kpb en el vector pTZ18R, se secuencia completamente por el método de terminación de la cadena didesoxi [Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-67 (1977)] usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos y Sequenase (United States Biochemical Corp.).

La secuencia de nucleótidos completa se presenta en el lista de secuencias como SEC ID Nº 6. La fase de lectura abierta se identifica por comparación con otras proteasas de serina conocidas de la familia de la subtilisina y esto se confirma por mapeo de restricción.

Ejemplo 5.3

Mapeo del ARN de PEPD

El ARN total se prepara a partir de micelios liofilizados y molidos que se desarrollan en medio mínimo con glucosa como fuente de carbono y amonio como fuente de nitrógeno por el método de Frederick y Kinsey [Curr. Genet. 18:53-58 (1990)]. El extremo 5' del ARN mensajero se identifica por hibridación del ARN total con oligo A, un oligonucleótido marcando en el extremo con 32-P (complementario a los nucleótidos 851 a 876 de la SEC ID Nº 6) y determinando el tamaño del transcrito producido por transcriptasa inversa procesado en un gel de secuenciación por comparación con las reacciones de secuenciación producidas por la secuenciación didesoxi con el mismo oligonucleótido (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Los sitios precisos de ayuste de los intrones se identifican por clonación y secuenciación de una copia parcial de ADNc del mensajero de pepD. La síntesis de la primera cadena se realiza por métodos convencionales (Maniatis et al., op. cit.) con la excepción de que el oligonucleótido de cebado es oligo C (complementario a los nucleótidos 1914 a 1941 de la SEC ID Nº 6). Este ADNc se somete a PCR usando los oligos B (correspondientes a los nucleótidos 1102 a 1129 de la SEC ID Nº 6) y C, y se clona en pTZ18R. Obsérvese que en el oligoB los nucleótidos 1107 a 1009 (GGT) se reemplazan por ATC creando así un nuevo sitio BamHI. De forma similar, en el oligoC los nucleótidos 1932 (A) y 1935 (A) se reemplazaron por G y T, respectivamente, creando así un nuevo sitio HindIII. Ambas cadenas de los dos clones independientes se secuencian completamente. La longitud total del ARNm producido por el gen pepD se determina por análisis Northern usando el fragmento EcoRI-HindIII de 3,0 kb como sonda (Maniatis et al., op. cit.) y se determina que está entre 1,4 y 1,7 kb, lo que corresponde con el tamaño esperado por la fase de lectura abierta y la posición del sitio de iniciación de la transcripción.

Ejemplo 13 Rotura genómica de PEPD

Ejemplo 13.1

Construcción de pPEPCPYRA

El fragmento XbaI de 4 kb que contiene el gen pyrA se escinde de pAXI (DSM 7017) y se purifica a partir de las secuencias del vector.

Se cortan 2 \mug de pTZPEPD con NheI y NcoI de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y después se extraen con fenol, se precipitan con etanol y se redisuelven en 20 \mul de agua. Después, este ADN se trata con fosfatasa alcalina bacteriana para eliminar los grupos 5' fosfato como recomienda el fabricante. Se purifica a partir del gel el fragmento de 5,3 kb carente del fragmento NheI-NcoI de 0,6 kpb que contiene los sitios activos His y Ser.

Los dos fragmentos anteriores se tratan con polimerasa de T4 de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se extraen con fenol y se precipitan con etanol. Se mezclan los dos fragmentos y se ligan. Tras la transformación de E. coli, las colonias que llevan los plásmidos correctos se identifican por digestión de restricción de preparaciones de miniplásmidos.

pPEPDPYRA consta del vector pTZ18R que contiene un fragmento BamHI-HindIII que lleva el gen pepD, que tiene el fragmento central NheI-NcoI, que codifica los sitios activos His y Ser, reemplazado por un fragmento XbaI de ADN que codifica la orotidina-monofosfato-descarboxilasa.

Ejemplo 13.4

Transformación de A. niger

Se digieren completamente 10 \mug de plásmido pPEPDPYRA por EcoRI. El grado de digestión se revisa procesando una alícuota en un gel y el resto del ADN se extrae con fenol, se precipita con etanol y se resuspende en 20 \mul de agua estéril.

Se cultivan esporas conidiales de A. niger An8 auxotrófico (DSM 3917) durante 4 días a 28ºC en medio completo hasta la completa esporulación. Se usan 2 x 10^{8} conidiosporas para inocular 200 ml de medio mínimo complementado con 1 g/l de arginina y uridina.

Después de 20 horas de crecimiento a 28ºC a 180 rpm, el micelio se recoge por filtración a través de Miracloth, se lava dos veces con 10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM y se resuspende en 20 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM, 0,5 mg/ml de Novozym 234 (Novo Industries). La mezcla se incuba en un baño de agua con agitación (30ºC, 50 rpm) hasta que se liberan suficientes protoplastos (detectados microscópicamente después de 90 a 120 min). La suspensión de protoplastos se filtra a través de un lecho corto de lana de vidrio en un embudo para eliminar los restos de micelio. Los protoplastos se sedimentan por centrifugación suave (10 min, 2000 rpm) a temperatura ambiente y se lavan dos veces con 10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM. Finalmente, los protoplastos se resuspenden en 200 a 500 \mul de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM para dar una concentración de 1 x 10^{8} esferoplastos por ml.

Para la transformación se incuba una alícuota de 200 \mul de la suspensión de protoplastos con 5 \mug del pPEPDPYRA digerido con EcoRI, 50 \mul PCT (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl_{2} 50 mM, PEG 6000 al 25%). La mezcla de incubación se mantiene en hielo durante 20 min, se añaden otros 2 ml de PCT y la mezcla se incuba durante 5 min más a temperatura ambiente. Se añaden 4 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM y se mezclan alícuotas de 1 ml de la solución de transformación final con medio mínimo de agar líquido (medio mínimo + 1 g/l de arginina + 10 g/l de Bacto-Agar (Difco)), estabilizado con KCl 0,8 M. Las mezclas se vierten inmediatamente sobre placas de agar del mismo medio y se incuban a 30ºC.

Ejemplo 13.5

Identificación de las roturas génicas

A partir de colonias estables, se preparan suspensiones individuales de esporas y se cultivan en rayas en placas mínimas recientes más arginina. Las colonias individuales se seleccionan y se cultivan en rayas otra vez para conseguir cultivos puros. Éstos se usan para inocular 200 ml de medio mínimo líquido complementado con 1 g/l de arginina. Después de 24 h a 30ºC agitando a 180 rpm, el micelio se recoge en papel de filtro y la pasta se liofiliza. Después de secar, se prepara el ADN a partir de pastas individuales moliendo las pastas con un mortero hasta conseguir un polvo fino. Se resuspenden 60 mg de este polvo en 3 ml de dodecilsulfato sódico al 1%, Tween 80 al 0,1% y acetato amónico 1 M por agitación vorticial. Esto se calienta a 65ºC durante 20 min mezclando ocasionalmente. Los restos celulares se separan de la solución de ADN por centrifugación a 15.000 rpm durante 5 min. El sobrenadante se extrae dos veces con fenol, dos con cloroformo y se precipita con etanol. El sedimento de ADN se redisuelve en 100 \mul de TE estéril.

Se digieren 20 \mul de cada ADN con NheI y NcoI en presencia de 1 \mug de ARNasa A durante 1 h. Esto se separa en un gel de agarosa, se transfiere a una membrana de nitrocelulosa y se mete en un horno. Se purifica el fragmento HindIII-BamHI de pTZPEPD que contiene PEPD, se marca mediante traducción con muesca y se usa como sonda en los filtros. Las cepas que llevan una rotura del gen pepD se reconocen fácilmente por la falta del fragmento de hibridación NheI-NhoI de 0,6 kb así como porque tienen alterada la movilidad de los otros dos fragmentos flanqueantes.

Una de estas cepas se pone en placas en medio que contiene uridina y ácido 5-fluoro orótico. Los mutantes auxotróficos para pirimidina se identifican por el crecimiento más fuerte en este medio y se pican y purifican por cultivo en rayas para obtener colonias individuales.

Ejemplo 13.6

Producción de interferón en la cepa de A. niger pepD^{-}

Una de las cepas de A. niger An8 pepD^{-} aisladas en el ejemplo 6.5 se usa como hospedador para una transformación posterior con plásmidos que contienen pyrA^{+}y cassettes de expresión que contienen un gen heterólogo para el interferón.

Se cultivan esporas conidiales del mutante de A. niger An8 pepD^{-} auxotrófico para la uridina durante 4 días a 28ºC en medio completo hasta que esporula completamente. Se usan 2 x 10^{8} conidiosporas para inocular 200 ml de medio mínimo complementado con 1g/l de arginina y uridina.

Tras 20 horas de crecimiento a 28ºC y a 180 rpm, el micelio se recoge por filtración a través de Myracloth, se lava dos veces con 10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM y se resuspende en 20 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM, 0,5 mg/ml de Novozym 234 (Novo Industries). La mezcla se incuba en un baño de agua con agitación (30ºC, 50 rpm) hasta que se libera una cantidad suficiente de protoplastos (detectada microscópicamente tras 90 a 120 min). La suspensión de protoplastos se filtra a través de un tapón de lana de vidrio en un embudo para eliminar los restos de micelio. Los protoplastos se sedimentan por centrifugación suave (10 min, 2000 rpm) a temperatura ambiente y se lavan dos veces con 10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM. Finalmente, los protoplastos se resuspenden en 200 a 500 \mul de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM para dar una concentración de 1 x 10^{8}/ml.

Tras 2 ó 3 días de crecimiento a 28ºC, aparecen los transformantes estables con crecimiento vigoroso y colonias que esporulan sobre un crecimiento de fondo de muchos cientos de transformantes pequeños, presumiblemente abortivos.

Las esporas conidiales de los transformantes se precultivan individualmente en 50 ml de un medio de precultivo (3 g/l de Pectin Slow Set L (Unipectin, S.A. Redon, Francia), 2 g/l de NH_{4}Cl, 0,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l de NaCl, 0,5 g/l de Mg_{2}SO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,5 g/l de Ca_{2}SO_{4}\cdot2H_{2}O, pH 7.0, y arginina al 1%). El precultivo se incuba durante 72 horas a 250 rpm y a 28ºC. Se usa un 10% del precultivo para inocular 50 ml de medio de cultivo principal (20 g/l de harina de soja, 5 g/l de pectina Slow Set, arginina al 1%). El cultivo se desarrolla durante 72 a 96 horas a 250 rpm y a 28ºC.

Se toman muestras a distintos tiempos (cada 20 horas), las células se sedimentan por centrifugación, se rompen por liofilización y se trituran en seco. Se prueba la actividad de interferón en el sobrenadante y en los extractos celulares como se describe (supra). La mayor parte de la actividad de interferón se encuentra secretada en el medio en transformantes que llevan pGIIss-IFN AM119, mientras que en los transformantes que llevan pGII-IFN AM119 principalmente está en el extracto celular.

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Ejemplo 14 Sobreexpresión de pepD en A. niger

Ejemplo 14.1

Sobreexpresión de copias múltiples

Se transforma A. niger An8 con 1 \mug de pAXI más 10 \mug de pTZPEPD para producir protótrofos para la uridina. Las colonias se purifican y se prepara el ADN como se ha descrito anteriormente. Las transferencias de Southern usando el fragmento HindIII de pTZPEPD demostraron que algunos transformantes tienen una única copia de pTZPEPD integrada en su genoma mientras que otros tienen hasta y por encima de 10 copias extra en su genoma. Estas cepas producen en correspondencia más actividad proteolítica y son mitóticamente estables.

Ejemplo 14.2

Sobreexpresión de pepD a partir de fusiones génicas

Se construye una fusión génica que consta de la región promotora de la piruvato quinasa de A. niger y de las regiones codificante y terminadora del gen pepD de A. niger. La fusión se construye por PCR recombinante (R. Higuchi: Recombinant PCR páginas 177-183 en Innis et al., (eds) PCR Protocols, Academic Press, Inc (1990). Se diseñan cuatro oligonucleótidos cebadores de los cuales se muestran los fusoligos 1, 2 y 3 en las SEC ID Nº 12, 13 y 14, respectivamente, mientras que el fusoligo 4 es complementario a la secuencia entre los nucleótidos 2858 y 2874 en la SEC ID 1. El fusoligo 1 hibrida con el promotor pki, 0,75 kpb secuencia arriba del codón de iniciación ATG. Los fusoligos 2 y 3 solapan parcialmente en cadenas complementarias, ambos contienen secuencias del promotor pki inmediatamente secuencia arriba del codón de iniciación de la traducción ATG, el propio codón ATG y también secuencias de la región codificante de pepD inmediatamente secuencia abajo del codón ATG. El fusoligo 4 hibrida con la región secuencia abajo del gen pepD, 0,65 kpb secuencia abajo del sitio de terminación de la traducción. Se llevan a cabo dos reacciones de PCR esencialmente como se ha descrito anteriormente. En la primera, un fragmento promotor pki de 0,75 kpb se amplifica usando los fusoligos 1 y 2 y pGW1100 (DSM 5747) como molde. En la segunda, un fragmento de 2,0 kb que contienen las regiones codificante y de terminación de pepD se amplifica usando los fusoligos 3 y 4 en pTZPEPD como molde. Los productos de amplificación se purifican a partir del gel de agarosa, se combinan, se desnaturalizan y rehibridan. Los dos fragmentos forman homo- y también heteroduplex durante la reacción de rehibridación ya que sus extremos se superponen debido a los fusoligos 2 y 3. Entonces, esta mezcla hibridada se reamplifica por PCR usando dos cebadores "exteriores" (fusoligo 1 y 4). El producto de esta reacción se aisla, se purifica y se subclona en un vector plasmídico.

Los plásmidos correctos se identifican por digestión de preparaciones de miniplásmidos. Se eligen 2 y el inserto se secuencia completamente usando oligonucleótidos sintéticos. Un plásmido que contiene una fusión perfecta del promotor de la piruvato quinasa con la fase de lectura abierta de pepD, que se denomina pPKIPEPDA, se usa con pAXI para cotransformar A. niger An8 en prototrófico para la uridina.

La presencia de la fusión pki-pepD se confirma obteniendo el ADN de transformantes individuales purificados y usándolo en análisis de Southern usando sondas de pki y pepD. Se demuestra que las cepas con una o más copias de esta fusión génica integrada en su genoma producen más actividad proteolítica cuando las células se desarrollan rápidamente en glucosa como fuente de C.

Ejemplo 15 Expresión de pepD en otros organismos Expresión en levaduras

El plásmido pTZPEPD se corta por EcoRI, se obtienen extremos romos con polimerasa de T4 y se religan, eliminando de este modo el sitio EcoRI de la región polienlazadora. Después, el plásmido resultante se somete a mutagénesis in vitro con los cuatro oligonucleótidos sintéticos oligolevadura 1, 2, 3 y 4 mostrados en la lista de secuencias como SEC ID Nº 15, 16, 17 y 18, respectivamente. El oligolevadura 1 introduce un sitio EcoRI justo secuencia arriba del ATG de pepD y los otros tres crean un bucle con cada uno de los 3 intrones completos. Esto crea el plásmido pTZPEPDa cuya secuencia se confirma por secuenciación completa.

El fragmento EcoRI-BamHI de 2,2 kb que empieza justo antes del ATG de pepD y acaba después de la región de terminación, se purifica y se liga junto con el fragmento BamHI-EcoRI de 520 pb de pFBY129 (DSM 7016) que contiene el promotor de levadura GAL10, en el sitio SnaBI del vector pFBY25 (DSM7020) de dos micrómetros basado en levadura. Se identifica un plásmido correcto por los productos de digestión de restricción. Este plásmido, pGAL10PEPD, se utiliza para transformar levaduras y muestra la producción de la proteína pepD cuando la expresión de la fusión génica se induce con galactosa.

Depósito de microorganismos

Los siguientes microorganismos se depositaron según el tratado de Budapest en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig:

Microorganismo/Plásmido	Fecha de Depósito	Nº. Depósito
E. coli DH5\alphaF'/pGW1100	18 de enero de 1990	DSM 5747
E. coli BJ5183/pCG59D7	2 de febrero de 1987	DSM 3968
A. niger An8	11 de diciembre de 1986	DSM 3917
E. coli DH5\alphaF'/pTZPEPC	30 de marzo de 1992	DSM 7019
E. coli DH5\alphaF'/pGP202	30 de marzo de 1992	DSM 7018
E. coli DH5\alphaF'/pFBY129	30 de marzo de 1992	DSM 7016
E. coli DH5\alphaF'/pAXI	30 de marzo de 1992	DSM 7017
E. coli DH5\alphaF'/pFBY25	30 de marzo de 1992	DSM 7020
E. coli DH5\alphaF'/pTZPEPD	19 de enero de 1993	DSM 7409

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

: NÚMERO DE SECUENCIAS: 18

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3220 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

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(A): ORGANISMO: Aspergillus niger

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CEPA: N400

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: pTZPEPC

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: región promotora

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..377

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido señal

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 378..435

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: péptido maduro

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: unión (436..756, 827..2056)

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteasa de tipo subtilisina"

\hskip6cm

/producto = "PEPC de Aspergillus niger"

\hskip6cm

/gen = "pepC"

\hskip6cm

/marcador = PEPC

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: intrón

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 757..826

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante incluyendo el codón de terminación

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: unión (388..756, 827..2059)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

100

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

4

400

\vskip1.000000\baselineskip

5

500

\vskip1.000000\baselineskip

6

600

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 416 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

7

700

8

800

9

901

900

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..19

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /función = "homólogo a pepC de A. niger"

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 20..37

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /función = "homólogo al gen pki de A. niger"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCCGAGGAT GCCCTTCATC TTGACGGATG ATTGATC

\hfill

37

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGAGGATG CCCTTCATCT TGAATTCGGA TGATTGATCT CTAC

\hfill

44

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCGATGTA ATCGACATCG GGGTGTCTGC GG

\hfill

32

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2993 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Aspergillus niger

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CEPA: N400

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: pTZPEPD

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: promotor

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..829

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: unión (830..1153, 1205..1649, 1697..1785, 1841..2233)

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /función= "proteasa de tipo subtilisina"

\hskip6cm

/producto= "PEPD de Aspergillus niger"

\hskip6cm

/gen = "pepD"

\hskip6cm

/marcador = PEPD

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: intrón

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1154..1204

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: intrón

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1650..1696

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: intrón

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1786..1840

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

11

110

\vskip1.000000\baselineskip

12

120

\vskip1.000000\baselineskip

13

130

131

14

\vskip1.000000\baselineskip

140

141

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 416 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

15

16

160

\vskip1.000000\baselineskip

17

170

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCTGGATCCC AYGGNACNCA YGTNGC

\hfill

26

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGGATCCC AYGGNACNCA YTGYGC

\hfill

26

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGAATTCG CCATNGANGT NCC

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGAATTCG CCATRCTNGT NCC

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAATGGATC CGCGACG

\hfill

17

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..12

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /función = "homólogo a pepD de A. niger"

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 10..27

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /función = "homólogo al gen pki de A. niger"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGAAAGCC ATCTTGACGG ATGATTG

\hfill

27

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..10

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /función = "homólogo al gen pki de A. niger"

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 8..27

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /función = "homólogo al gen pepD de A. niger"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTCAAGATG GCTTTCCTCA AACGCATTC

\hfill

29

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGGGCCAC GAATTCAACA TGGCTTTCCT C

\hfill

31

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGATCCGC AAACATAACC ATGTAGCCTA TGTGGAACAA G

\hfill

41

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCGATTAAC ATGAGTCTTG GTGGAGGCTA CTCCATGCG

\hfill

40

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): ANTI SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGCTGGAA ATGAGAATAG AGATGCAGCA CGGACTAGCC

\hfill

Claims

1. Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica para una proteasa de serina de Aspergillus niger seleccionada entre el grupo compuesto por las proteasas de serina que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID Nº. 2 y 7, respectivamente.

2. Una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de ADN seleccionada entre el grupo compuesto por la región codificante de pepC mostrada en la SEC ID Nº 1 y la región codificante de pepD mostrada en SEC ID Nº 6.

3. Un vector híbrido que comprende una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1.

4. Un vector híbrido de acuerdo con la reivindicación 3, en el que una secuencia de ADN que codifica una proteasa de serina de Aspergillus niger del tipo de subtilisina está unida funcionalmente a los elementos reguladores adecuados para la expresión de dicha secuencia de ADN en una célula hospedadora adecuada.

5. Un vector híbrido de acuerdo con la reivindicación 4, en el que una secuencia de ADN que codifica una proteasa de serina de Aspergillus niger del tipo de subtilisina está unida funcionalmente con elementos reguladores adecuados para la expresión de dicha secuencia de ADN en una cepa de Aspergillus.

6. Un vector híbrido de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende un promotor homólogo a la secuencia de ADN deseada que codifica una proteasa de serina del tipo de subtilisina de Aspergillus niger.

7. Un vector híbrido de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende un promotor heterólogo a la secuencia de ADN deseada que codifica una proteasa de serina del tipo de subtilisina de Aspergillus niger.

8. Un proceso para la preparación de una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende cultivar una célula hospedadora transformada con una molécula de ADN que codifica una proteasa de serina del tipo de subtilisina de Aspergillus niger y aislar dicha molécula de ADN a partir de la célula hospedadora.

9. Una cepa de Aspergillus niger que tiene un defecto en el gen pepC de la secuencia con SEC ID Nº 1 y/o en el gen pepD de la secuencia con SEC ID Nº 6.

10. Un proceso para la preparación de una cepa de Aspergillus niger que comprende la mutación del gen pepC cromosómico endógeno de Aspergillus niger de la secuencia con SEC ID Nº 1 y/o del gen pepD de Aspergillus niger de la secuencia con SEC ID Nº 6.

11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende la mutación in vitro de dicho gen, la transformación de un hospedador de Aspergillus niger que lleva un gen cromosómico endógeno correspondiente con el gen mutado in vitro, y el aislamiento de mutantes en los que el gen endógeno se substituye por el gen mutado in vitro.

12. Un proceso para la preparación de un polipéptido deseado que comprende transformar una cepa de Aspergillus niger de acuerdo con la reivindicación 9 con un vector de expresión que lleva un cassette de expresión adecuado para la expresión del polipéptido deseado, cultivar la cepa transformada de Aspergillus niger en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y aislar el polipéptido deseado.

13. Una proteasa de serina de Aspergillus niger seleccionada entre el grupo compuesto por PEPC mostrado en la SEC ID Nº 2 y PEPD mostrado en la SEC ID Nº 7.

14. Un proceso para la preparación de una proteasa de serina de Aspergillus niger del tipo de subtilisina, comprendiendo dicho proceso cultivar un hospedador adecuado que se transforma con un vector de expresión híbrido de acuerdo con la reivindicación 4.

15. Un hospedador transformado con un vector de expresión híbrido de acuerdo con la reivindicación 4.

16. Un hospedador transformado de acuerdo con la reivindicación 15, que es una cepa de Aspergillus niger.

17. Un hospedador transformado de acuerdo con la reivindicación 16, que es una cepa de Aspergillus niger transformada con un vector de expresión híbrido que comprende un promotor homólogo a la secuencia de ADN que codifica una proteasa de serina del tipo de subtilisina de Aspergillus niger.

18. Un hospedador transformado de acuerdo con la reivindiicación 16, que es una cepa de Aspergillus niger transformada con un vector de expresión híbrido que comprende un promotor heterólogo a la secuencia de ADN que codifica una proteasa de serina del tipo de subtilisina de Aspergillus niger.

\newpage

19. Un proceso para la preparación de un hospedador transformado de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende transformar un hospedador adecuado con un vector de expresión híbrido de acuerdo con la reivindicación 4.