ES2208895T3 - Telomerasa purificada. - Google Patents

Abstract

La invención suministra telomerasa humana purificada y procedimientos para su purificación. Los procedimientos comprenden la utilización de varios pasos secuenciales, que incluyen el so de una primera matriz que se unen a las moléculas que soportan cargas negativas, una matriz que se une a las moléculas que soportan cargas positivas, una segunda matriz que se une a las moléculas que soportan cargas negativas, un paso de purificación por afinidad y una matriz que separa las moléculas de acuerdo con su tamaño.

Description

Telomerasa purificada.

Antecedentes de la invención

La población norteamericana está envejeciendo. El segmento de crecimiento más rápido de la población es de personas arriba de 85 años de edad, quienes para el año 2040 se espera que representen más de 30 millones. Esta oleada demográfica está produciendo necesidades significativas para medicamentos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la edad y fomenta el interés en aumento del proceso de envejecimiento y las enfermedades asociadas con el mismo, incluyendo el cáncer.

Los organismos envejecen, en parte, debido a que sus células tienen una capacidad limitada para continuar dividiéndose. Cuando llegan a ese límite, las células empiezan a envejecer. La senescencia de las células continuó en los extremos de los cromosomas de una célula, los telómeros. Con cada división celular, los telómeros pierden algo de ADN y se hacen más cortos. En algún punto esta reducción se vuelve crítica. Las células perciben esto y detienen la reproducción de cromosomas para evitar mayor pérdida. En consecuencia, la célula ya no tiene capacidad para dividirse.

No todas las células se vuelven senescentes. Los organismos unicelulares y ciertas células de mamífero no tienen límite fijo para la división celular. Los investigadores han descubierto que muchas de estas células contienen una enzima de ribonucleoproteína llamada telomerasa. La telomerasa substituye el ADN que por lo general se pierde de los telómeros durante la división celular. (E.H. Blackburn, (1992) Annu. Rev. Biochem. 61:113-29). Por lo tanto, los telómeros nunca se reducen más allá de la longitud crítica y las células nunca llegan al envejecimiento.

Es de especial interés que los investigadores encontraron que las células de muchos cánceres humanos tienen telomerasa. (C.B. Harley, Mutation Research 1991 256:271-282). Esto ayuda a explicar porqué las células cancerosas continúan dividiéndose sin llegar a envejecer. También sugiere una arma poderosa en la batalla contra el cáncer: Si se puede inhibir la actividad de la telomerasa en las células cancerígenas, se puede esperar que éstas células envejezcan y dejen de dividirse.

El desarrollo de métodos para regular la actividad de la telomerasa requiere fuentes de telomerasa purificada y, en particular, telomerasa humana purificada. La telomerasa purificada sería útil para desarrollar y probar ensayos para medir la actividad de la telomerasa, por ejemplo, para evaluar el ensayo y para usar como un estándar en el ensayo. Los ensayos para la telomerasa son útiles para caracterizar las células cancerosas o células precancerosas, debido a que la mayoría de estas células expresan telomerasa. La telomerasa purificada sería más útil que las preparaciones de telomerasa cruda para identificar y probar los reguladores, inhibidores o activadores de la actividad de telomerasa en ensayos in vitro. Además, la telomerasa purificada facilitaría un análisis bioquímico completo del mecanismo de la enzima, que puede proporcionar comprensión para desarrollar reguladores con base al mecanismo. La telomerasa purificada también sería útil en la preparación de anticuerpos contra telomerasa. Esos anticuerpos en determinado momento serían una ayuda especial como reactivos para purificar la telomerasa humana y como ayuda para el diagnóstico y prognosis del cáncer. La telomerasa purificada también ayudará a proporcionar información de la secuencia en aminoácidos útil para clonar los diversos componentes de la ribonucleoproteína.

Aunque existe la necesidad de telomerasa purificada, la purificación de la enzima humana implica retos técnicos. La telomerasa es una ribonucleoproteína rara que se expresa en las células humanas sólo en muy poca cantidad. Se estima que las células humanas que se sabe expresan los niveles más altos de actividad de telomerasa sólo pueden tener casi cien moléculas de la enzima por célula. El hecho es que la telomerasa es una estructura multicomponente, compleja que además dificulta su purificación. Además, las células humanas poseen comparativamente niveles muy altos de ribonucleoproteínas de no telomerasa. Estas otras ribonucleoproteínas pueden tener propiedades de purificación cromatográficas similares a la ribonucleoproteína de la telomerasa, lo que dificulta la purificación de la telomerasa de las células humanas. De ese modo, es necesaria la telomerasa purificada y en particular, la telomerasa humana purificada.

Sumario de la invención

La telomerasa humana se purifica a arriba de 60,000 veces pureza en preparaciones de células citoplásmicas crudas. Dos polipéptidos que purifican conjuntamente con fracciones que contienen actividad de telomerasa están presentes en las fracciones purificadas en cantidades aproximadas estequiométricas con el componente de ARN de la telomerasa humana aislado. Un polipéptido tiene secuencias de aminoácidos equivalentes a nucleolina. El otro péptido tiene secuencias de aminoácidos equivalente al homólogo del factor 2 de elongación.

En un aspecto, esta invención proporciona métodos para purificar telomerasa. Los pasos incluidos en el método dependen del nivel de purificación que se desea. Un método para purificar telomerasa a partir de una composición impura que contiene biomoléculas orgánicas, por ejemplo, un extracto nuclear de 293 células, para por lo menos 60,000 veces en comparación con extracto crudo (aproximadamente 4% de pureza relativa) comprende:

(1) poner en contacto la telomerasa con una primera matriz que une moléculas de carga negativa, por ejemplo, POROS® 50 HQ, separando la telomerasa de otras biomoléculas orgánicas que no se unen con la matriz y reuniendo la telomerasa;

(2) poner en contacto la telomerasa con una matriz que une moléculas de carga positiva, por ejemplo, POROS® Heparin 20 HE-1, separando la telomerasa de otras biomoléculas orgánicas que no se unen con la matriz y reuniendo la telomerasa;

(3) poner en contacto la telomerasa con una segunda primera matriz que une moléculas de carga negativa, por ejemplo, SOURCE 15Q®, separando la telomerasa de otras biomoléculas orgánicas que no se unen con la matriz y reuniendo la telomerasa;

(4) poner en contacto la telomerasa con un agente de afinidad que tiene afinidad específica con la telomerasa, por ejemplo un oligonucleótido que tiene la secuencia 5'-cgttcctctt cctgcggcct-3' (Oligo 14ab) (ID SEC NO:7), separando la telomerasa de otras biomoléculas orgánicas que no se unen con el agente de afinidad y reuniendo la telomerasa; y

(5) separando la telomerasa de otras biomoléculas orgánicas de acuerdo al tamaño molecular, la forma o la densidad flotante, por ejemplo separar las moléculas de acuerdo al tamaño en una columna de clasificación de tamaños de TosoHaas TSK-Gel*G5000PW_{XL} y reunir la telomerasa.

La telomerasa puede separarse en por lo menos 500,000 veces pureza agregando un segundo paso de afinidad usando anticuerpos antinucleolina o anticuerpos anti-TMG. La telomerasa puede purificarse a pureza substancial (por ejemplo, por lo menos 1,000,000 veces separándola más por electroforesis con gel.

El protocolo de purificación también puede incluir el paso de poner en contacto la telomerasa con una matriz de selectividad intermedia, separar la telomerasa de otras biomoléculas orgánicas que no se unen con la matriz de selectividad intermedia y reunir la telomerasa, de preferencia antes del paso de afinidad.

La telomerasa puede separarse a diferentes niveles de pureza por medio de alteración, cambio de secuencias, o eliminación de cualquiera de los pasos en el protocolo de purificación. Sin embargo, cualquier protocolo incluirá el contacto de la telomerasa con un agente de afinidad. Poner en contacto la telomerasa con una matriz que une moléculas con carga negativa o carga positiva es el siguiente paso o pasos preferido(s) a incluir en el protocolo.

La invención también proporciona una preparación de la proteína telomerasa de mamífero y, de manera más particular, telomerasa con aumento de por lo menos 2000 veces, por lo menos 3000 veces, por lo menos 20,000 veces, por lo menos 60,000 veces, por lo menos 100,000 veces, por lo menos 500,000 veces o por lo menos 1,000,000 veces pureza relativa en comparación con los extractos celulares crudos de 293 células. La telomerasa es de mamífero, y aún más específicamente humana. La invención también proporciona telomerasa hecha por los pasos de purificación anteriores.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 describe un protocolo de cuatro pasos para purificar la telomerasa.

La Fig. 2 describe un protocolo de cinco pasos para purificar la telomerasa.

La Fig. 3 describe un primer protocolo de seis pasos para purificar la telomerasa.

La Fig. 4 describe un segundo protocolo de seis pasos para purificar la telomerasa.

La Fig. 5 muestra los resultados de un ensayo de elongación de iniciador a partir de un extracto CHAPS S-100 de 293 células (líneas 1-5) y a partir de acumulación activa de cromatografía de intercambio aniónico POROS® 50 HQ (líneas 1-5) en el procedimiento de purificación de cuatro pasos.

La Fig. 6 muestra los resultados de un ensayo de elongación de iniciador a partir de una preparación de telomerasa de la acumulación activa de cromatografía de intercambio aniónico POROS® 50 HQ (líneas 1-4) y la acumulación activa de cromatografía de intercambio aniónico POROS® Heparina 20 HE-1 (líneas 5-8) en el procedimiento de purificación de cuatro pasos.

La Fig. 7 muestra los resultados de un ensayo de elongación de iniciador a partir de una preparación de telomerasa a partir de acumulación activa de separación de afinidad de Oligo 5 (líneas 1-4), la acumulación activa de cromatografía POROS® Heparina 20 HE-1 ajustada a la concentración salina usada para separación de afinidad (líneas 5-7), y acumulación activa POROS® Heparina 20 HE-1 (líneas 8 y 9) en el procedimiento de purificación de cuatro pasos.

La Fig. 8 muestra los resultados de un ensayo de elongación de iniciador a partir de preparaciones de telomerasa a partir de acumulación activa de cromatografía POROS® Heparina 20 HE-1 (líneas 1-3) y acumulación activa de cromatografía Spermidine POROS® (líneas 4-6) en el procedimiento de purificación de cinco pasos, y a partir de acumulación activa Superose® en el primer ensayo de seis pasos.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Salvo definición en contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente tienen el significado conocido comúnmente por una persona experta en la técnica a quien pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan conocimiento de una definición general de muchos de los términos usados en esta invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (Diccionario de Microbiología y Biología Molecular) (2ª Edición, 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (El Diccionario de Cambridge de Ciencias y Tecnología) (Walker De., 1988); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (El Diccionario de Biología de Harper Collins) (1991). Como se usan en el presente, los siguientes términos tienen los significados adscritos a los mismos a menos que se especifique de otro modo.

"Polinucleótido" denomina un polímero compuesto de unidades de nucleótidos (ribonucleótidos, desoxiribonucleótidos, variantes estructurales relacionados que ocurren naturalmente y análogos sintéticos que no ocurren naturalmente de los mismos) enlazados por medio de uniones de fosfodiester, variantes estructurales relacionados que ocurren naturalmente y análogos sintéticos que no ocurren naturalmente de los mismos. De ese modo, el término incluye polímeros de nucleótidos en donde los nucleótidos y los enlaces entre ellos incluyen análogos sintéticos que no ocurren naturalmente de los mismos, como por ejemplo y sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de chiral metilo, ribonucleótidos de 2-O-metilo, ácidos péptido nucleicos ("PNAs"), y similares. Los polinucleótidos pueden sintetizarse, por ejemplo, usando un sintetizador automatizado de ADN. "Acido nucleico" denomina típicamente a polinucleótidos grandes. "Oligonucleótido" denomina típicamente a polinucleótidos cortos, que generalmente no son mayores de aproximadamente 50 nucleótidos. Se comprende que cuando se representa una secuencia de nucleótidos mediante una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), esto también incluye una secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C) en donde "U" substituye a "T".

En el presente se usa una anotación convencional para describir secuencias de polinucleótidos; el extremo izquierdo de una secuencia de polinucleótidos de banda única es el extremo 5'; la dirección izquierda de una secuencia de polinucleótidos de doble banda se denomina como dirección 5'. La dirección de adición de 5' a 3' de nucleótidos para transcripciones de RNA naciente se denomina como la dirección de transcripciones. La banda de ADN que tiene la misma secuencia que un mARN se denomina como la "banda de codificación"; las secuencias en la banda de ADN que tienen la misma secuencia de un mRNA transcrito a partir del ADN y que se localizan en el extremo 5' a 50 de la transcripción de ARN se denominan como "secuencias ascendentes"; las secuencias en la banda de ADN que tienen la misma secuencia del ARN y que son extremo 3' al 30 de la transcripción de ARN de codificación se denominan como "secuencias descendentes".

"Polinucleótidos recombinantes" denomina a un polinucleótido que tiene secuencias que no se juntan naturalmente. Un polinucleótido recombinante amplificado o reunido puede incluirse en un vector adecuado, y el vector puede usarse para transformar una célula huésped adecuada. Una célula huésped que comprende el polinucleótido recombinante se denomina como "célula huésped recombinante". El gen entonces se expresa en la célula huésped recombinante para producir, por ejemplo, un "polipéptido recombinante". Un polinucleótido recombinante también puede proporcionar un servicio de función no codificante (por ejemplo, origen de autorreproducción, sitio de unión de ribosomas, etc.). Los huéspedes unicelulares apropiados incluyen cualquiera de aquéllos que se usan rutinariamente para expresar ácidos nucleicos de mamífero o eucarióticos, incluyendo, por ejemplo, procariotas, como E. coli; y eucariotas, incluyendo por ejemplo, hongos, como levadura; y células de mamífero, incluyendo células de insectos (por ejemplo, Sf9) y células animales como CHO, R1.1, B-W, L-M, células de Riñón de Mono Verde Africano (por ejemplo, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 y BMT 10) y células humanas de cultivo.

"Secuencia de control de expresión" denomina a una secuencia de nucleótidos en un polinucleótido que regula la expresión (transcripción y/o traslación) de una secuencia nucleótida enlazada operativamente al mismo. "Enlazada operativamente" denomina una relación funcional entre dos partes en donde la actividad de una parte (por ejemplo, la habilidad para regular la transcripción) da como resultado una acción de la otra parte (por ejemplo, transcripción de la secuencia). Las secuencias de control de expresión pueden incluir, por ejemplo y sin limitación, secuencias de promotores (por ejemplo, inducible o constitutivo), intensificadores, terminadores de transcripción, un codón de arranque (es decir, ATG), señales de unión para introns, y codones de paro.

"Vector de expresión" denomina un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende las secuencias de control de expresión enlazadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que va a expresarse. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de actuación cis para expresión; otros elementos para expresión pueden suministrarse por la célula huésped o sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los que se conocen en la técnica, como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, simples o contenidos en liposomas) y viruses que incorporan el polinucleótido recombinante.

"Codificación" denomina la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, como un gen, un ADNc, o un ARNm, para servir como plantillas para síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen ya sea una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas que resulten de los mismos. De ese modo, un gen codifica una proteína si la transcripción y traslación de ARNm producidas por un gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la banda de codificación, la secuencia de nucleótidos que es idéntica a la secuencia ARNm y que por lo general se proporciona en listados de secuencia, como la banda no codificante, usada como molde para la transcripción, de un gen o ADNc puede decirse que codifican la proteína u otro producto de ese gen o ADNc. Salvo especificación en contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas de una y otra y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y ARN pueden incluir introns.

"Variante alélica" denomina cualesquiera de dos o más formas polimórficas de un gen que ocupa el mismo punto genético. Las variaciones alélicas surgen naturalmente a través de mutación, y pueden resultar en polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. También puede denominarse "variantes alélicas" a ADNc derivados transcripciones de mARN de variantes alélicas genéticas, así como las proteínas codificadas por ellas.

"Hibridiza específicamente a" o "hibridación específica" o "hibridiza selectivamente a", denomina la unión, duplicación o hibridación de una molécula de ácido nucleico de preferencia para una secuencia de nucleótidos en particular bajo condiciones severas cuando esa secuencia está presente en ADN o ARN de mezcla compleja (por ejemplo, celular total).

El término "condiciones severas" denomina las condiciones bajo las cuales una sonda mezclará de preferencia su secuencia secundaria blanco, y a una extensión menor a, o en lo absoluto a, otras secuencias. "Hibridación severa" y "condiciones de lavado de hibridación severa" en el contexto de experimentos de hibridación de ácidos nucleicos como hibridaciones del sur y del norte dependen de la secuencia, y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijsen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with Nucleic Acid Probes (Técnicas de Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular -- Hibridación con Sondas de Acido Nucleico) parte I capítulo 2 "Generalidades de los principios de hibridación y la estrategia de ensayos de sonda de ácido nucleico", Elsevier, New York. Por lo general, las condiciones de hibridación altamente severa y de lavado se seleccionan a aproximadamente 5ºC inferiores al punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una resistencia iónica y pH definidos. El Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica y pH definidos) en la que 50% de la secuencia blanco se mezcla para una sonda con perfecta coincidencia. Se seleccionan condiciones muy severas para que igualen el Tm para una sonda en particular.

Un ejemplo de condiciones de hibridación severas para hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en una mancha sur o norte es 50% de formalina con 1 mg de heparina a 42ºC, llevándose a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente severas es 0.15 M CaCl a 72ºC durante casi 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado severas es un lavado de 0.2X SSC a 65ºC durante 15 minutos (ver Sambrook et al. para una descripción de tampón SSC). A menudo, un lavado severo es precedido por un lavado poco severo para remover la señal de sonda anterior. Un ejemplo de lavado de severidad media para un duplexo de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1X SSC a 45ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de poca severidad para duplexo de por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6x SSC a 40ºC durante 15 minutos. En general, una relación de señal para ruido de 2x (o superior) que la observada para una sonda sin relación en el ensayo de hibridación particular indica detección de una hibridación específica.

"Polipéptido" denomina un polímero compuesto de residuos de aminoácidos, variantes estructurales relacionados que ocurren naturalmente, y análogos sintéticos que no ocurren naturalmente de los mismos enlazados por medio de uniones de péptidos, variantes estructurales relacionados que ocurren naturalmente, y análogos sintéticos que no ocurren naturalmente de los mismos. Los polipéptidos sintéticos pueden sintetizarse, por ejemplo, usando un sintetizador automatizado de polipéptidos. El término "proteína" denomina típicamente a polipéptidos grandes. El término "péptido" denomina típicamente a polipéptidos cortos.

En el presente se usa la anotación convencional para representar las secuencias de polipéptidos; el extremo izquierdo de una secuencia de polipéptidos es el aminotérmino; el extremo derecho de una secuencia de polipéptidos es el carboxilo-término.

"Anticuerpo" denomina un polipéptido substancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina, o fragmentos del mismo, que unen y reconocen específicamente un analito (antígeno). Los genes de inmunoglobulina comprenden genes de regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como los miriagenes de regiones variables de inmunoglobulina. Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con varias peptidasas. Esto incluye, por ejemplo, fragmentos Fab' y F(ab)'_{2}. El término "anticuerpo", según se utiliza en el presente, también comprende fragmentos de anticuerpos producidos ya sea por la modificación de anticuerpos completos o los sintetizados de novo usando metodologías de DNA recombinante.

Un anticuerpo "se une específicamente a" o "es inmunoreactivo específicamente con" una proteína cuando el anticuerpo funciona en una reacción aglutinante que determina la presencia de la proteína en la presencia de una población heterogénea de proteínas y otros biológicos. De ese modo, bajo condiciones designadas de inmunoensayos, los anticuerpos especificados se unen de preferencia a una proteína en particular y no se unen en una cantidad importante a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a una proteína bajo esas condiciones requiere un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una proteína en particular. Puede usarse una variedad de formatos de inmunoensayos para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivos con una proteína en particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA de fase sólida se usan como rutina para seleccionar los anticuerpos monoclonales inmunoreactivos con una proteína. Ver Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual (Anticuerpos, Manual de Laboratorio), Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción de los formatos y condiciones de inmunoensayos que pueden usarse para determinar la inmunoreactividad específica.

"Inmunoensayo" denomina un ensayo que utiliza un anticuerpo para unir específicamente un analito. El inmunoensayo se caracteriza por el uso de propiedades específicas de unión de un anticuerpo en particular para separar, señalar como blanco y/o calificar el analito.

"Complementario" denomina la compatibilidad topológica o correspondencia mutua de superficies de interacción de dos polinucleótidos. De ese modo, las dos moléculas pueden describirse como complementarias, y además, las características de superficie de contacto se complementan entre sí. Un primer polinucleótido es complementario a un segundo polinucleótido si la secuencia de nucleótidos del primer polinucleótido es idéntica a la secuencia de nucleótidos del co-ingrediente aglutinante de polinucleótidos del segundo polinucleótido. De ese modo, el polinucleótido cuya secuencia es 5'-TATAC-3', es complementario al polinucleótido cuya secuencia es 5'-GTATA-3'.

"Substitución conservadora" denomina una substitución en un polipéptido de un aminoácido por un aminoácido con funcionalidad similar. Cada uno de los siguientes seis grupos contiene aminoácidos que son substituciones conservadoras unos de otros:

1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2) Acido aspártico (D), ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina(Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofan (W).

"Puro substancialmente" significa que una especie objetivo es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar, más abundante que cualquier otra especie biomolecular orgánica individual en la composición), y una fracción substancialmente purificada es una composición en donde la especie objetivo comprende por lo0menos aproximadamente 50% (sobre una base molar) de todas las especies biomoleculares orgánicas presentes. Por lo general, una composición substancialmente pura significa que aproximadamente 80% a 90% o más de la especie biomolecular orgánica presente en la composición es la especie purificada de interés. La especie objetivo se purifica para obtener homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composición por métodos de detección convencionales) si la composición comprende esencialmente una sola especie biomolecular orgánica. "biomolécula orgánica" denomina una molécula orgánica de origen biológico, por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos o lípidos. Para el propósito de esta definición, no se consideran especie biomolecular orgánica las especies solventes, moléculas pequeñas (<500 Daltons), estabilizadores (por ejemplo, BSA), y especies de iones elementales.

"Que ocurre naturalmente" cuando se aplica a un objeto, denomina el hecho de que el objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo los viruses) que puede separarse de una fuente de la naturaleza y que no se modificó intencionalmente por el hombre en el laboratorio, ocurre naturalmente.

"Telomerasa" o "complejo de ribonucleoproteína de telomerasa" denomina una enzima de ribonucleoproteína de origen eucariótica identificable por su habilidad para polimerizar una secuencia de ADN de un telómero eucariótico. La telomerasa además se caracteriza por un componente de ARN que tiene secuencias complementarias con por lo menos parte de la repetición telomérica de la especie origen y por uno o más componentes de proteína. Tal como se usa en el presente, "telomerasa animal", "telomerasa de mamífero" y "telomerasa humana" denominan las telomerasas que se pueden encontrar naturalmente en diversas células multicelulares animales, de mamífero y humanas, respectivamente, o que tienen componentes polipéptidos con las mismas secuencias de aminoácido, y componentes de ARN con las mismas secuencias de nucleótidos. La telomerasa humana contiene el componente de ARN, "hTR". (Patente de Estados Unidos, 5,583,016, Villeponteau et al.). El término "telomerasa" comprende todas las formas alélicas de la telomerasa, incluyendo las formas de tipo silvestre y mutantes.

"Componente de proteína de telomerasa" denomina un componente de proteína de la enzima medular de telomerasa.

"Enzima medular de telomerasa" denomina la reunión conjunta de los componentes de la telomerasa, tanto los componentes de ARN como de proteína, suficiente para la actividad de telomerasa in vitro.

"Proteína asociada con telomerasa" denomina una proteína que se une a la enzima medular de la telomerasa pero que no necesariamente es para la actividad de la telomerasa in vitro.

"Factor de actividad de la telomerasa" denomina una proteína que, cuando se incluye con la enzima medular de la telomerasa, aumenta la actividad de la telomerasa in vitro.

"Proteína relacionada con la telomerasa" denomina, en conjunto, los componentes de la proteína de telomerasa, proteínas asociadas con telomerasa y factores de actividad de telomerasa.

"Actividad de telomerasa" denomina la síntesis de ADN telomérico por la telomerasa. Un método de ensayo para detectar la actividad de telomerasa es el ensayo TRAP. Ver Harley et al., Solicitud Internacional WO 95/13381. Este ensayo mide la cantidad de nucleótidos radioactivos incorporados en los productos de elongación, polinucleótidos, formados por adición de nucleótidos a un substrato o iniciador de telomerasa. La radioactividad incorporada puede medirse como una función de la intensidad de una banda en una pantalla de PhosphorImager™ expuesta a un gel en donde los productos radioactivos son separados. Un experimento de prueba y un experimento de control pueden compararse visualmente usando las pantallas PhosphorImager™. Vea también el estuche de ensayo de telomerasa TRAP-eze™ (Oncor); y Morin, Cell (Célula) 59:521-529 (1989).

La "actividad específica" de la telomerasa es la cantidad de actividad de telomerasa según la cantidad de proteína en un volumen unitario.

"Telomerasa purificada" denomina las preparaciones de telomerasa que tienen por lo menos 2000 veces pureza relativa aumentada. Como se usa en el presente, una preparación de telomerasa tiene 2000 veces pureza relativa aumentada si la actividad específica de la telomerasa en la preparación es por lo menos 2000 veces superior a la actividad específica de la telomerasa de extractos citoplásmicos crudos de 293 células con capacidad de suspensión, que a continuación se describen en el presente, y según la medición por medio del ensayo de elongación de iniciador descrito en el presente a continuación en el Ejemplo I.A. Se calcula que en una preparación de telomerasa que tiene aproximadamente 100,000 veces pureza relativa aumentada, aproximadamente 6% de las proteínas son telomerasa, mientras que en la preparación de telomerasa que tiene aproximadamente 1,000,000 veces pureza relativa aumentada, aproximadamente 60% de las moléculas son telomerasa.

II. Métodos para purificar telomerasa

Esta invención proporciona telomerasa purificada y los métodos para prepararla. En particular, esta invención está dirigida a la telomerasa de mamífero o humana purificada y la telomerasa recombinante. Esta invención proporciona telomerasa purificada separada de cualquier célula que exprese telomerasa, por ejemplo, extractos celulares crudos normales, células cancerosas, células inmortalizadas, tejidos humanos y animales, tumores o de células que expresan telomerasa de manera recombinante.

A. Ensayos para actividad de telomerasa

En los métodos para purificar telomerasa a menudo es útil determinar la presencia o cantidad de telomerasa o de actividad de telomerasa en una preparación. Para esto se dispone de varios ensayos. Como se dijo anteriormente, con el fin de determinar la pureza relativa, el método más preferido para medir la actividad específica de la telomerasa es el ensayo de elongación de iniciador. Este ensayo se describe en el Ejemplo I.A., a continuación. En forma breve, este ensayo mide la cantidad de nucleótidos radioactivos incorporados en polinucleótidos sintetizados en una secuencia de iniciador. La cantidad incorporada se mide como una función de la intensidad de una banda en una pantalla de phosphoimager expuesta a un gel en donde los productos radioactivos se separan. Un experimento de prueba y un experimento de control pueden compararse visualmente en pantallas de phosphoimager. Este ensayo tiene como fundamento un ensayo descrito por G.B. Morin, (1989) Cell (Célula) 59:521-529.

Otro ensayo para actividad de telomerasa es el ensayo de mancha con puntos es útil para selección rutinaria debido a que tiene mayor rendimiento y cientos de ensayos pueden llevarse a cabo en un solo día realizándose una gran porción de la mano de obra automáticamente. Los resultados puede obtenerse la tarde del segundo día. El ensayo de mancha con puntos es más efectivo para comparar la actividad de las muestras a casi el mismo nivel de pureza y menos efectivo en diferentes etapas de pureza. Por lo tanto, no es un ensayo preferido para determinar la pureza relativa. Un protocolo para el ensayo de mancha con puntos se proporciona en el Ejemplo I.B.

Otros ensayos incluyen detectar la presencia del componente de ARN de la telomerasa. Se conoce la secuencia del componente de ARN de la telomerasa para diversas especies. Se separó un polinucleótido que comprende la secuencia para el componente de ARN de telomerasa humana ("hTR").El ADN genómico humano hTR fue clonado, secuenciado y colocado en depósito. Un clon lambda denominado "28-1" contiene un inserto \sim 15 kb que contiene secuencias de genes de componente ARN de telomerasa humana. El clon 28-1 fue depositado en la Colección de Cultivos de Tipo Americano de acuerdo con el Tratado de Budapest y se le asignó el registro de adquisición número ATCC 75925. El plásmido pGRN33 contiene un inserto \sim 2.5 kb HindIII-SacI que contiene secuencias del clon lambda 28-1 que contienen la secuencia de hTR. El plásmido pGRN33 se depositó en la Colección de Cultivos de Tipo Americano conforme al Tratado de Budapest y se le asignó el registro de adquisición número ATCC 75926. Un fragmento hTR del fragmento \sim 2.4 kb SauIIIA1-HindIII del clon 28-1 también contiene la secuencia de hTR. La secuencia del fragmento PstI se proporciona a continuación en SQ ID NO:1. Los nucleótidos de hTR se indican antes de la secuencia indicada por los asteriscos y numerados 1 a 451. La región de la plantilla se subraya.

1

Para la secuencia del componente de ARN de telomerasa de humanos, ratones, levadura, ciliados, ver Feng et al. (1995) Science (Ciencia) 269:1236-41; Villeponteau et al., patente de Estados Unidos no. 5,583,016; WO96/01835 (Villeponteau et al.), WO 96/01604 (Andrews et al.), Blasco et al. (1995) Science 269:1267-1270; Romero and Blackburn

2

(1991) Cell (Célula) 67:343-353; Lingner et al. (1994) Genes and Devel. (Genes y Desarrollo) 8:1984-1988; y Singer and Gottschling (1994) Science (Ciencia) 266:404-409.

PCR ("RT-PCR") de transcripción inversa es un ensayo útil para determinar la cantidad de ARN de telomerasa debido a que es muy sensible. Se proporciona un protocolo para un ensayo RT-PCR en el Ejemplo I.C. Ver también, solicitud de patente de Estados Unidos 08/770,565, presentado el 20 de diciembre de 1996. Pueden usarse otros métodos para detección específica de ARN, por ejemplo, Análisis Northern. En el Ejemplo I.D. se proporciona un protocolo para Northern. La limitación principal para usar cualquiera de los ensayos de hTR para detectar telomerasa es que la presencia de hTR no significa que hay presencia de telomerasa activa. Por ejemplo, células somáticas normales y algunas fracciones de telomerasa parcialmente purificada tienen cantidades significativas de hTR pero no actividad de telomerasa detectable.

Otro ensayo muy sensible para la actividad de telomerasa es el ensayo TRAP, descrito en Harley et al., publicación Internacional WO 95/13381; Harley et al. solicitud Internacional PCT/US96/09669, presentada el 7 de junio de 1996 y Kim et al. (1994) Science 266:2011-2015.

B. Protocolos de purificación 1. Consideraciones generales

Esta invención proporciona métodos para preparar telomerasa purificada a partir de una composición impura, es decir, una composición que contiene telomerasa y otras biomoléculas orgánicas contaminantes. Empezando con una composición de telomerasa impura, un método que produce telomerasa que es superior a 60,000 veces pura incluye los siguientes pasos:

(1) proporcionar una preparación impura que contiene telomerasa, por ejemplo, un extracto nuclear;

(2) separar telomerasa de otras biomoléculas orgánicas con una primera matriz que une moléculas que tienen carga negativa, por ejemplo, 50 HQ POROS®;

(3) purificar adicionalmente la telomerasa con una matriz que une moléculas que tienen carga positiva, por ejemplo, Heparina 20 HE-1 POROS®;

(4) purificar adicionalmente la telomerasa con una segunda matriz que une moléculas que tienen carga negativa, por ejemplo, SOURCE 15Q®;

(5) purificar adicionalmente la telomerasa con un agente de afinidad que tiene afinidad específica para la telomerasa, por ejemplo el oligonucleótido 14ab, que tiene la secuencia 5'-cgttcctctt-3' (ID SEC NO:7); y

(6) purificar adicionalmente la telomerasa de otras biomoléculas orgánicas de acuerdo al tamaño molecular, la forma o la densidad flotante, por ejemplo separar las moléculas de acuerdo al tamaño en una columna de clasificación de tamaño TosoHaas TSK-Gel*G5000PW_{XL}.

Pueden incluirse pasos adicionales optativos en los métodos de purificación para producir preparaciones de telomerasa con pureza relativamente superior. La telomerasa puede purificarse adicionalmente con una resina de selectividad intermedia (de preferencia una matriz que contenga espermidina) antes de la purificación por afinidad. Ver la Fig. 2.

Los pasos de purificación específica usados y su secuencia se realizan a discreción del practicante. Sin embargo, se proporciona el siguiente lineamiento. En general, se prefiere empezar con los pasos que tienen mayor capacidad y relativamente menor selectividad, después con los pasos que tienen capacidad y/o selectividad intermedia, después con los pasos que tienen poca capacidad y alta selectividad. Las matrices que unen moléculas con cargas positivas o negativas tienen alta capacidad y son útiles como pasos iniciales debido a que la telomerasa está presente en pocas cantidades en las células y los métodos de purificación empezarán típicamente con grandes cantidades de extracto celular crudo. Entre estas resinas, se prefiere primero la purificación con resinas de intercambio aniónico, después la purificación con resinas que unen moléculas que portan cargas positivas. El orden puede invertirse.

Los pasos con selectividad y capacidad intermedia se prefieren después de los pasos con gran capacidad. Estos incluyen las matrices de selectividad intermedia y separación con base a tamaño molecular, forma o densidad flotante. Aunque se prefiere primero la purificación con resinas de selectividad intermedia, los pasos de purificación intermedia no deben limitarse a ningún orden en particular. En el procedimiento de purificación de cuatro pasos que se describe anteriormente, no se incluyen los pasos intermedios.

Las matrices de afinidad específica tienen relativamente poca capacidad, pero gran selectividad, y se prefieren posteriormente en el proceso de purificación cuando la telomerasa está presente con pocos materiales contaminantes. Este paso puede ser un paso único de purificación y es más útil cuando la pureza relativa aumentada de la telomerasa es de por lo menos 40 veces.

2. Fuente de telomerasa

La purificación de la telomerasa empieza con una composición de fuente impura, como un extracto nuclear o extracto celular crudo, de preferencia rica en actividad de telomerasa. Los organismos unicelulares sin límites de número de divisiones de célula, como Tetrahymena o levadura, elaboran telomerasa y son buenas fuentes para extracto celular en la preparación de telomerasa a partir de esos organismos. Sin embargo, en organismos multicelulares, especialmente de mamífero, no todas las células elaboran telomerasa. Por lo tanto, deben identificarse las fuentes a partir de los tipos de células disponibles. En mamíferos, células y tejido de gérmenes, células y tejido cancerosos y líneas celulares inmortalizadas son todos fuentes de actividad de telomerasa. En los roedores y posiblemente en otros mamíferos no primates, algunos tejidos somáticos normales, por ejemplo, hígado de ratón, son fuentes de actividad de telomerasa.

Las líneas celulares inmortalizadas son en particular una fuente útil de preparaciones de telomerasa cruda porque pueden crearse en cultivos y recolectarse en grandes cantidades, por lo mismo proporcionan extracto celular para preparaciones de telomerasa a gran escala. En particular, en la preparación de telomerasa humana purificada, se prefieren 293 células. Las 293 células tienen como origen el riñón embriónico humano transformado con fragmentos de ADN de adenovirus tipo 5 (Graham et al., 1977 J. Gen. Virol. 36; 59-77). La línea celular, que crece en cultivos de una sola capa, se adaptó para crecer en suspensión Stillman and Gluzman, (1985) Mol. and Cell Bio. 5:2051-2060). Pueden obtenerse en la Colección de Cultivos de Tipo Americano (ATCC) (Registro de Adquisición No. ATCC CRL 1573).

El extracto nuclear crudo puede prepararse separando el núcleo del citoplasma mediante un giro de baja velocidad. En el Ejemplo VI, Sección A, se proporciona una descripción más detallada.

El extracto celular crudo puede prepararse de forma normal. Por lo general las células pueden homogeneizarse a aproximadamente 4ºC en tampones a pH fisiológico. En el Ejemplo II se proporciona un protocolo más detallado. Las 293 células crecen como cultivos de suspensión en botellas giratorias de 8 litros en MEM de Joklik, 5% de suero de becerro recién nacido, 2 g/l de NaHCO_{3}, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina a 37º. Los cultivos se conservan en 0.6 x 10^{6} células/ml y se duplican cada 24 horas. También se puede contratar un especialista en cultivos de células para cultivar grandes lotes de células. Los contratistas incluyen a Analytical Biological Systems (Wilmington, DE), Cellex (Minneapolis, MN) y Berlex (South San Francisco, CA).

Otros tipos de células, en particular aquéllas que crecen rápidamente en cultivos de suspensión (lo que facilita cultivos a gran escala), también son útiles para purificar telomerasa humana. Los candidatos incluyen líneas de células de linaje celular B o T, como líneas Namalwa (linfoma de Burkitt), Daudi (linfoma de Burkitt), Jurkat (leucemia aguda de células T) y HUT 78 (linfoma cutáneo de células T). Además, las células HeLa (carcinoma cervical) tienen actividad de telomerasa. Los extractos celulares HeLa pueden obtenerse del Centro de Cultivos de Células por Computadora (Mons, Bélgica).

Los extractos nucleares de 293 células son una fuente preferida de telomerasa. El extracto celular crudo de las células de mamífero usadas en los métodos de esta invención, pueden ser extracto celular o extracto citoplásmico entero.

La cantidad de preparación impura necesaria para purificar la telomerasa depende, en parte, de la abundancia de telomerasa en la célula, la cantidad de telomerasa que se pierde en cada paso y el último grado de purificación y cantidad deseados. El ejemplo III describe el uso de 128 litros de cultivo de suspensión de 293 células en un procedimiento que purificó telomerasa más de 3000 veces.

Conforme la purificación avanza, la telomerasa se vuelve más pura y más diluida. En este estado, la telomerasa puede perderse debido a la adhesión de la telomerasa a tubos, líneas, puntas, etc. Esta pérdida puede minimizarse por medio de adición de detergente. En particular, la adición de hasta aproximadamente 0.1% de Nonidet P-40 y aproximadamente 1% de Tween®-20 (detergentes no iónicos) no inhibe la actividad de la telomerasa, y puede agregarse a todos los tampones de cromatografía.

3. Matrices que unen moléculas con carga negativa

Un método preferido para purificar telomerasa a partir de un extracto celular crudo comprende poner en contacto la telomerasa con la primera y segunda matrices que unen moléculas que tienen cargas negativas, separando la telomerasa de otras biomoléculas orgánicas que no se unen a la matriz y reunir la telomerasa. Las matrices que unen moléculas con una carga negativa son útiles para purificar la telomerasa debido al pH entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9, la telomerasa compleja parece tener por lo menos cargas negativas locales. En una forma de realización preferida de la invención, la matriz es una resina de intercambio aniónico empacada en una columna. Las resinas de intercambio aniónico unen moléculas con carga negativa. Un beneficio de usar intercambio aniónico en esta etapa cruda de la preparación es la alta capacidad aglutinante de estas resinas.

Para separar la telomerasa humana, las resinas de intercambio aniónico que se caracterizan por grupos funcionales de aminos terciarios o cuaternarios son los que proporcionan mejores resultados. 50 HQ de POROS® (PerSeptive Biosystems, Cambridge, Massachusetts) y SOURCE 15Q (Pharmacia, Uppsala, Suecia) son resinas de intercambio aniónico preferidas. También son útiles Super Q-650M (TosoHaas, Montgomeryville, Pennsylvania), DEAE Sepharose® CL-6B (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y Mono Q® (Pharmacia, Uppsala, Suecia). En fracciones de lavado a partir de la resina de intercambio aniónico, se prefiere la elución con paso de sal. También puede usarse elución de gradientes lineales salinos para lavar la telomerasa usando de preferencia volúmenes de gradiente de menos que los volúmenes de la columna.

4. Matrices que unen moléculas con carga positiva

Un método preferido para purificar telomerasa que comprende, como segundo paso entre dos pasos de purificación con intercambio aniónico, poner en contacto la telomerasa con una matriz que une moléculas que tienen cargas positivas, separando telomerasa a partir de otras biomoléculas orgánicas que no se unen a la columna y reunir la telomerasa. En una forma de realización preferida, la matriz comprende heparina. En particular, la Heparina 20 HE-1 POROS® (PerSeptive Biosystems, Cambridge, Massachusetts) es útil como una matriz en este etapa. Otras matrices útiles que unen moléculas con cargas positivas incluyen SP Sepharose® CL-6B y Resource™ (Pharmacia, Uppsala, Suecia).

5. Pasos de purificación intermedia

Después de la purificación con matrices de alta capacidad y antes de la purificación de matriz de afinidad, la telomerasa puede purificarse adicionalmente a través de uno o más pasos de purificación intermedia.

En un paso de purificación intermedia, la telomerasa se pone en contacto con hidroxilapatita, la telomerasa se separa de otras biomoléculas orgánicas que no se unen a la hidroxilapatita y de reúne la telomerasa. La hidroxilapatita es una forma cristalina de hidroxilofosfato de calcio que tiene la capacidad para unir proteínas de acuerdo a su carácter básico o acídico. Su base de separación de proteínas difiere de la de las resinas de intercambio iónico. Las fracciones pueden lavarse con tampones o composición diferente.

Un paso preferido de purificación intermedia comprende poner en contacto la telomerasa con una matriz de selectividad intermedia; separar la telomerasa de otras biomoléculas orgánicas que no se unen a la matriz de selectividad intermedia y reunir la telomerasa. Este paso puede ser el cuarto paso de la purificación de los esquemas de purificación de cinco o seis señalados en las Figuras 2 y 3. El propósito principal de este paso es purificar adicionalmente la preparación de telomerasa antes de que entre en contacto con un agente de afinidad. Las clases de matrices comprendidas en este paso tienen por lo general pocas capacidades de unión pero pueden ser más selectivas que las resinas de intercambio iónico, por lo mismo proporcionan mayor purificación. Estas unen la telomerasa por medio de interacciones que son más complejas que la carga, independientes, y no son tan específicas como por ejemplo, los anticuerpos. Las características aglutinantes pueden incluir, por ejemplo, combinaciones de atracción electrostática, atracción hidrofóbica/hidrofílica, afinidad por componentes particulares, como ácidos nucleicos o aminoácidos particulares en la proteína, afinidad por grupos químicos funcionales en las moléculas, y la variedad de compuestos conocidos y usados en la purificación de proteínas para separación semiespecífica de moléculas. En particular, y sin limitación, esta invención contempla el uso de las siguientes matrices de selectividad intermedia.

En este paso se prefieren las matrices que comprenden una poliamina, como espermidina o espermina. Estas moléculas contienen cadenas primarias y secundarias de hidrocarbono de aminas amidst. En la unión de la telomerasa pueden comprenderse tanto la carga como las interacciones hidrofóbicas.

En este paso las matrices que comprenden polinucleótidos son útiles. En el caso de la telomerasa humana, el ácido poliguanílico retiene la actividad de telomerasa. Sin desear ser unidas por teoría, se cree que estas matrices son útiles debido a que la telomerasa es una enzima que sintetiza el ADN y contiene una mitad de ARN. Por lo tanto, se presume que tiene influencia que une específicamente polinucleótidos.

Las matrices que comprenden iones metálico divalentes también son útiles en este paso. Los metales pueden ser quelados en soportes sólidos a través de moléculas como ácido iminodiacético o ácido nitrilotriacético. El níquel es el metal más preferido y el cobre y zinc también son útiles en la purificación de telomerasa humana. Sin desear limitarlos por teoría, se asume que los metales interactúan selectivamente con residuos aminoácidos específicos en las proteínas. En esas interacciones es normal que se incluyan residuos de histidina. Dependiendo del metal inmovilizado, sólo las proteínas con suficientes densidades locales de histidinas serán retenidas por la columna. Algunas interacciones entre los metales y las proteínas pueden ser tan fuertes que la proteína no puede recuperarse. De ese modo, cada metal debe ser probado empíricamente para detectar su utilidad en la purificación de una determinada proteína. Tanto la unión como la liberación de la telomerasa deben ser eficientes.

Las matrices que comprenden substancias proteináceas con carga positiva también son útiles en este paso del método de purificación. Tal como se usa en el presente, las substancias proteináceas comprenden aminoácidos, poliaminoácidos, péptidos y proteínas. Dos materias con carga positiva, la poli-L-lisina y la histona, retienen selectivamente telomerasa humana.

Las matrices que comprenden ácido aminofenilo-borónico también retienen telomerasa humana. Aunque no se desea estar limitado por la teoría, la afinidad de la proteínas por ácido borónico es complicada pero esencialmente comprende interacción entre grupos de dioles sobre proteínas con ácido inmovilizado.

En una forma de realización de la invención, la telomerasa se pone en contacto secuencialmente con por lo menos 2, por lo menos 3 o por lo menos 4 matrices de selectividad intermedia. Como no es posible que las proteínas actúen como telomerasa en las matrices que tienen características diferentes, el uso de más de una matriz mejora el nivel de purificación de este paso. Las secuencias que producen altos rendimientos y purificaciones pueden determinarse empíricamente, y las matrices que tienen mayor capacidad se prefieren inicialmente en la secuencia. Algunas combinaciones de dos matrices en la serie no se prefieren debido a sus modos similares de separación, por ejemplo, una columna de metal divalente seguida por otro, espermina seguida por espemidina, poli-L-lisina seguida por histona.

Otro paso de purificación intermedia en un método para purificar telomerasa comprende separar la telomerasa de otras biomoléculas orgánicas de acuerdo con el tamaño molecular, la forma o la densidad flotante y reunir la telomerasa. Este puede ser el quinto paso en el procedimiento de seis pasos señalado en la Figura 3. Una forma de realización preferida de este paso comprende fraccionar la preparación de telomerasa por cromatografía de filtración de geles. La clasificación de tamaño de matrices de gel que separan proteínas en el margen de tamaño de 200 kD a 2000 kD son más útiles en la purificación de telomerasa humana. Las matrices preferidas son HW65 (TosoHaas, Montgomeryville, Pennsylvania), Superose® 6 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y en particular, TSK-Gel*G5000PW_{XL}. Otra forma de realización de este paso comprende centrifugación gradiente de la telomerasa en gradientes de composiciones diferentes que producen separación de las moléculas en la preparación. Los gradientes preferidos están compuestos de Cs_{2}SO_{4} o de glicerol. Otra forma de realización de este paso comprende el uso de electroforesis de geles, que separa las moléculas en base a su carga, tamaño y forma. Las composiciones de geles pueden variar mucho en esta forma de realización. Un gel preferido, es un gel nativo compuesto de agarosa, poliacrilamida o ambos, que corre bajo condiciones fisiológicas de resistencia de tampón y pH, que tienden a preservar el complejo nativo y la actividad de la telomerasa humana.

6. Matriz de afinidad

Después de los pasos de purificación de alta capacidad y después de los pasos opcionales de purificación intermedia, la telomerasa se purifica adicionalmente poniendo en contacto la telomerasa con un agente de afinidad que tiene afinidad específica con la telomerasa, separando la telomerasa de otras biomoléculas orgánicas que no se unen al agente de afinidad, y reuniendo la telomerasa del agente de afinidad. Los agentes de afinidad en este paso del método de purificación son órdenes de magnitud más específica para unir telomerasa sobre otras biomoléculas orgánicas, que los agentes en otros pasos del método. Los agentes de afinidad que tienen afinidad específica por la telomerasa comprenden, por ejemplo, oligonucleótidos que son complementarios al componente de ARN de telomerasa, oligonucleótidos (ARN o ADN) que tienen una secuencia de iniciador reconocida por la telomerasa, anticuerpos que reconocen epítopos de telomerasa o proteínas asociadas de telomerasa, y compuestos que inhiben la telomerasa. Un agente de afinidad preferido es Oligo 14ab, un oligonucleótido cuya secuencia se proporciona en la Tabla 2. El anticuerpo antinucleolina y el anticuerpo antiTMG también son útiles.

Los oligonucleótidos comprenden una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia del componente de ARN de telomerasa (por ejemplo, una "secuencia antisensación") son agentes de afinidad útiles. En una forma de realización, el oligonucleótido se une a una etiqueta recuperabble, por ejemplo, biotina. Los "ácidos péptido nucleicos", polímeros que tienen un sostén de amidas y bases unidas, también son útiles como agentes de afinidad. La etiqueta puede estar en uno o en ambos extremos. Después de poner en contacto la telomerasa con el agente de afinidad etiquetado, el agente de afinidad se pone en contacto con un agente aglutinante que se une a la etiqueta recuperable, por ejemplo, estreptavidina o agente derivativo. De preferencia, el agente aglutinante se une a una matriz. Entonces, las moléculas que no se unieron al agente de afinidad recuperable y por lo tanto, no se unieron al agente aglutinante, son separadas o retiradas de la mezcla. Liberando la telomerasa del agente de afinidad, la telomerasa se purifica.

El uso de etiquetas recuperables es muy conocido en la técnica. La etiqueta recuperable y el agente aglutinante pueden ser cualquier clase de ligante y ligante co-ingrediente. En una forma de realización preferida, la etiqueta recuperable es biotina y el agente aglutinante es NeutrAvidin ImmunoPure® (Pierce, Rockford, IL, número de catálogo 53157). En una forma de realización, la etiqueta recuperable es un antígeno y el agente aglutinante es un anticuerpo que une el antígeno.

Un procedimiento general experimental para probar enfoques de afinidad de ácidos nucleicos es como sigue: (i) los oligonucléotidos con etiqueta de biotina se mezclan bajo diversas condiciones con telomerasa parcialmente purificada; (ii) perlas con NeutrAvidin unido son agregadas a la mezcla; (iii) las perlas se separan de la mezcla (la telomerasa que se pegó al oligonucleótido también se pegó a las perlas, así que la actividad se reduce desde la mezcla); (iv) las perlas se lavan para remover material unido (la telomerasa se desprende de las perlas y la actividad se recupera).

Los oligonucleótidos complementarios a una secuencia del componente de ARN de telomerasa humana se probaron para detectar su capacidad como agentes de afinidad. Los oligonucleótidos útiles en los métodos de la invención se proporcionan en la Tabla 1. Cada uno de los oligos antisentido se probó en paralelo con un oligo no específico de control. La reducción hace referencia a la retención de telomerasa por el oligo; la recuperación hace referencia a la liberación subsecuente de telomerasa del oligo.

El Oligo 14ab es el oligo preferido para purificación por afinidad. El Oligo 14ab hibridiza una región de hTR que es accesible en la holoenzima.

El Oligo 5 también es un buen oligonucleótido para purificación por afinidad. Aunque no desea la unión por teoría, el Oligo 5 es un fuerte iniciador sin elaboración, así que puede no actuar como un ligante antisentido; puede actuar como un ligante iniciador. Al usar Oligo 5 y lavar con concentraciones salinas variantes, la actividad de la telomerasa se recupera en un conjunto de fracciones que contienen niveles bajos de proteína detectable (10 \mug/ml), haciendo de ésta una preparación muy rica en telomerasa. La producción de la actividad de telomerasa fue 19%. (Ver el Ejemplo III).

TABLA 1 Oligonucleótidos complementarios (antisentido) para ARN de telomerasa humana

Nombre de Oligo	Tamaño (nt)	Descripción	Desempeño
anti-P	31	hTR antisentido directo, cubre el	Buena reducción, inhibe la actividad
		molde
P3	22	hTR antisentido más un término	Buena reducción, recuperación de
		de iniciador	telomerasa
Oligo 5	30	hTR antisentido	Buena reducción, recuperación de
			telomerasa
Oligo 13	30	hTR antisentido	Poca reducción.
Oligo 14	30	hTR antisentido	Buena reducción.
Oligo 14ab	20	hTR antisentido para región	Buena reducción, recuperación de
		accesible	telomerasa

\newpage

TABLA 2 Secuencias de Oligonucleótidos

anti-P (ID SEC NO:2):

5' BIOTIN - gcctacgcc ttctcagtta gggttagaca - a - 3' BIOTINA

P3 (ID SEC NO:3):

5' BIOTIN - cgcccttctc agttagggtt ag – 3'

Oligo 5 (ID SEC NO:4):

5' BIOTIN - gccgagtcct gggtgcacgt cccatagct c – 3'

Oligo 13 (ID SEC NO:5):

5' BIOTIN - gaacgggcca gcagctgaca ttttttgttt – 3'

Oligo 14 (ID SEC NO:6):

5' BIOTIN - gctcagaat gaacggtgga aggcggcagg – 3'

Oligo 14ab (ID SEC NO:7):

5' BIOTIN - cgttcctctt cctgcggcct - 3'

En otra forma de realización de este paso, el agente de afinidad es un oligonucleótido con una secuencia de iniciador reconocida por la telomerasa. El oligonucleótido se pone en contacto con la telomerasa y nucleótidos de dideoxi bajo condiciones para una reacción de elongación de iniciador. Esto da como resultado la terminación de la cadena de síntesis de ADN por telomerasa. Bajo estas condiciones, la telomerasa puede bloquear el iniciador terminado de la cadena. El iniciador y la telomerasa unida al mismo es separado. El oligonucleótido incluye de preferencia secuencias que se sabe son iniciadores eficientes en el ensayo de elongación de iniciador. Esto incluye la secuencia sintetizada por telomerasa así como iniciadores de secuencia no teloméricos como M2/TS. Por ejemplo, la telomerasa sintetiza secuencias de ADN de telomerasa (TTAGGG)_{n} en el extremo 3' de iniciadores de una sola banda de ADN (y ARN). De ese modo, un oligonucleótido para separar telomerasa humana puede tener la secuencia (TTAGGG)_{3} (ID SEC NO:8). Las secuencias sintetizadas por otras telomerasas se identifican, por ejemplo, en E.H. Blackburn, (1991) TIBS 16:378-381.

La forma de realización anterior se probó usando oligonucleótidos de biotinilatados como iniciadores, que fueron recuperados después con perlas de NeutrAvidin. Los controles fueron oligos no iniciadores, como (CCCTAA) _{3} (ID SEC NO:9). Los oligonucleótidos preferidos para purificación de afinidad en esta forma de realización son M2/TS y (TTAGGG)_{3} (ID SEC NO:8). La secuencia de oligonucleótidos útiles se proporciona en la Tabla 3.

TABLA 3

Nombre de Oligo	Tamaño (nt)	Descripción	Desempeño
(TTAGGG)_{3}	18	Iniciador telomérico	Buena reducción, recuperación de telomerasa
(ID SEC NO:8)
M2/TS	18	Iniciador no telomérico	Buena reducción, recuperación de telomerasa
Biotin-SS- (TTAGGG)_{3}	18	Iniciador telomérico divisible	Reducción ligera, poca recuperación
(ID SEC NO:8)

Secuencias de Oligonucleótidos

M2/TS (ID SEC NO:10):

5'- BIOTIN - aatccgtcga gcagagtt - 3'

Con los diversos oligos iniciadores usados, la eficiencia de la reducción se correlacionó con la resistencia del iniciador en un ensayo de elongación de iniciador de telomerasa. El iniciador M2/TS mostró la mejor capacidad para reducir y retener la actividad. Algo de la actividad de telomerasa se eluyó con DTT a partir de una reducción de iniciador de biotinil-SS-(TTAGGG)_{3} (ID SEC NO:8) (el DTT rompe el enlace de disulfuro en el iniciador, liberándolo de las perlas). La producción fue sólo de 1-5\textdollar, pero la pureza fue más bien alta (la concentración de proteína inferior para detección por ensayo de proteínas estándar).

En otra forma de realización de este paso, el agente de afinidad es un anticuerpo que reconoce específicamente un epítopo de telomerasa. Los anticuerpos útiles como reactivos de afinidad incluyen los anticuerpos contra nucleolina y anticuerpos contra estructura de tapón de tri-metiloguanisina ("TMG") encontrada en varios ARNs nucleares pequeños. Una fuente de anticuerpos que puede reconocer telomerasa humana son los anticuerpos que reconocen la telomerasa de otros organismos. Esos anticuerpos pueden reaccionar cruzándose con la telomerasa por homología. Las secuencias primarias de 80 kD y 95 kD de subunidades de proteína de Telomerasa de tetrahimena se analizaron para regiones de antigenicidad y probabilidad de superficie. A partir de este análisis, se diseñaron dos péptidos para las de 80 kD y uno para las de 95 kD. Estos péptidos tienen las siguientes secuencias:

GP 80A:

CRKKTMFRYLS VTNKQKWDQT KKKRKEN (ID SEC NO:11) - proteína de 80 kD

GP 80B:

CHISEPKERV YKILGKKYPK TEEE (ID SEC NO:12) proteína de 80 kD

GP 95A:

DNNLCILALL RFLLSLERFN IL (ID SEC NO:13) - proteína de 95 kD

Estos péptidos se usaron para aumentar los anticuerpos. Cuando se eligen las secuencias de la proteína Tetrahimena para este propósito, es muy importante seleccionar la probabilidad de superficie porque es muy posible que los anticuerpos contra formas externas de telomerasa inmunoprecipiten la actividad de la telomerasa de otros organismos. En otra forma de realización, los anticuerpos son aumentados contra proteínas de fusión que contienen una porción de un componente de polipéptido de telomerasa y preparados en, por ejemplo, un sistema de E. coli. En otra forma de realización, los anticuerpos se identifican de entre anticuerpos que reconocen epítopos en enzimas que se encuentran funcionalmente relacionadas con la telomerasa, por ejemplo, enzimas de replicación de ADN y transcripciones inversas. En otra forma de realización, los anticuerpos son aumentados contra péptidos de la secuencia de proteínas de telomerasa humana.

En otra forma de realización de este paso, el agente de afinidad es un inhibidor de la actividad de la telomerasa que se une a la telomerasa. Los inhibidores de telomerasa y los métodos de ensayo para los mismos, se describen en Prowse et al., solicitud de patente de Estados Unidos 08/288,501, presentada el 10 de agosto de 1994. Cuando se adhieren a una etiqueta recuperable, estos compuestos proporcionan un gancho por el que separan la telomerasa.

Después de que se retiran las moléculas que no se unen al agente de afinidad, la telomerasa unida es liberada de las mismas. Cuando el agente de afinidad es un oligonucleótido, se intentan extremos de resistencia iónica (por ejemplo, sal elevada (aproximadamente 500 mM de NaCl) o baja (cero)), exposición a altas concentraciones de nucleótidos, y el uso de oligos divisibles (oligos de disulfuro que aparecen en la Tabla 3) como esfuerzos para liberar la enzima unida. Lavar una columna de Oligo 5 con soluciones salinas de resistencia iónica en aumento libera la telomerasa.

Cuando se hirvió la matriz de columna de afinidad de M2/TS con la telomerasa unida, y el material liberado fue analizado en un gel SDS impregnado en plata, aparecieron muy pocas bandas (menos de 10). Aunque en este experimento las proteínas de telomerasa estuvieron más bien debajo del límite de detección, este resultado indicó que muy pocas de las otras proteínas se unieron a la matriz de afinidad. De ese modo la especificidad de esta reducción de afinidad fue alta.

Agregar un segundo paso de afinidad aumenta significativamente la pureza de la telomerasa. Por ejemplo, si se sigue un paso de afinidad de un oligo 14ab por medio de purificación de afinidad con antinucleolina o antiTMG, la telomerasa se purifica a aproximadamente 500,000 veces.

7. Purificación con base a tamaño molecular, forma o densidad flotante

En un método preferido de la invención, el paso de purificación de afinidad es seguido por un paso que incluye separar la telomerasa de otras biomoléculas orgánicas de acuerdo al tamaño molecular, la forma o la densidad flotante. Las matrices que separan las moléculas de acuerdo al tamaño, como la cromatografía de exclusión de gel, son especialmente útiles en esta etapa. Una matriz preferida es la columna de clasificación de tamaño TosoHaas TSK-Gel*G5000PW_{XL}. La telomerasa en estas fracciones se purificó a más de 60,000 veces pureza relativa. Las fracciones que contienen actividad de telomerasa en esta etapa se separaron por SDS-PAGE. Estas contenían aproximadamente 50 bandas de proteínas visibles. La separación de las bandas de los resultados de gel dan como resultado una proteína substancialmente pura.

La telomerasa purificada es útil para producir anticuerpos contra la proteína. También es útil como control en ensayos para detectar la telomerasa en una muestra. La telomerasa recombinante, producida en células, es útil para inmortalizar esas células. La inmortalización es útil en la preparación de líneas celulares autoreplicantes.

III. Proteínas relacionadas con telomerasa

Después de purificar la telomerasa usando el protocolo presentado en la Fig. 4, las proteínas en fracciones que contienen actividad de telomerasa se examinaron por eletroforesis de gel. Se identificaron dos polipéptidos en las fracciones purificadas que se copurificaron con la actividad de telomerasa y que se encontraron en cantidades estequiométricas aproximadas con el componente de ARN de telomerasa. Una proteína, designada b120, tuvo una masa molecular aparente de 120 kD en SDS-PAGE. Otra proteína, designada y105, tuvo una masa molecular aparente de 105 kD en SDS-PAGE.

Las proteínas se caracterizaron adicionalmente. Las proteínas se fragmentaron con protasa y la secuencia de aminoácidos se determinaron por medio de espectrometría en masa con nano-eletrospray (nanoelectrorociado). Este método se describe en M. Wilm et al., (1996) "Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectometry" (Secuencia del femtomole de las proteínas de geles de poliacrilamida por medio de espectrometría en masa con nano- eletrospray (nanoelectrorociado)), Nature 379:466-469.

Las proteínas se caracterizaron adicionalmente. Las proteínas se fragmentaron con protasa, y la secuencia de aminoácidos de los fragmentos se determinó por medio de espetrometría en masa de nanoelectrospray (nanoelectrorociado). Este método se describe en M. Wilm et al., (1996) "Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-electrospray spectrometry" (Secuencia de proteínas de femtomole de geles de poliacrilamida por medio de espectrometría de nanoelectrospray), Nature 379:466-469. Las secuencias de los aminoácidos de péptidos derivados de b120 / y105 se compararon con secuencias de aminoácidos conocidos en la base de datos de secuencias Genbank.

Se identificó que los fragmentos de péptidos de b120 tienen secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias del homólogo de factor 2 de elongación ("HF2E"). Ver N. Nomura et al., "Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. I. The coding sequences of 40 new genes (KIAA0001-KIAA0040) deduced by analysis of randomly sampled cDNA clones from human ommature myeloid cell line KG-1" (Predicción de las secuencias de codificación de genes humanos no identificados. I. Las secuencias de codificación de 40 genes nuevos (KIAA0001-KIAA0040) deducidos por análisis de clones de ADNc de muestras aleatorias a partir de la célula myeloid ommature línea KG-1), (1994) DNA Res. (Japan) 1:27-35. Registro de adquisición GENBANK # D21163. HF2E es un ADNc separado aleatoriamente de una librería ADNc cuya secuencia es homóloga para el factor 2 de elongación. Su función no se identificó anteriormente. El factor 2 de elongación funciona en la traslocación de ARNm en el ribosoma. El polipéptido b120 se denomina en el presente como "homólogo de factor 2 de elongación".

Se identificó que los fragmentos de péptidos de y105 tienen secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias de nucleolina. La nucleolina es una proteína nucleolar residente que se entiende que funciona en conjunto de ribosomas. Ver, por ejemplo M. Srivastava et al. (1989) "Cloning and sequencing of the human nucleolin cDNA" (Clonización y secuencia del ADNc de nucleolina humana), FEBS Letters 250:99-105 y M. Srivastava et al. (1990) "Genomic organization and chromosomal localization of the human nucleolin gene" (Organización genómica y localización de cromosomática del gen de nucleolina humana), J. Biol. Chem., 265:14922-931. Registro de adquisición GENBANK nº M60858 J05584. El polipéptido y105 se denomina en el presente como "nucleolina".

IV. Usos de las proteínas relacionadas con telomerasa

La actividad de la telomerasa puede inmunoprecipitarse de las fracciones nucleares con anticuerpos de antinucleolina. Debido a que se une a la telomerasa, la nucleolina es una proteína asociada con la telomerasa. La nucleolina funciona in vivo como un factor de actividad de la telomerasa.

Por consiguiente, esta invención proporciona métodos para separar la telomerasa en donde la telomerasa se pone en contacto con la nucleolina y el complejo de telomerasa-nucleolina se separa de otras moléculas contaminantes. En una forma de realización, una matriz de afinidad que comprende nucleolina se pone en contacto con la telomerasa, y las moléculas contaminantes se lavan de la matriz. En otra forma de realización, la nucleolina primero se deriva con un par de ligantes, como GST/glutatione o biotin/estreptavidin y después se pone en contacto con la telomerasa para formar un complejo. El complejo se captura en una matriz de afinidad derivada con el coingrediente de aglutinante. En otra forma de realización, la telomerasa asociada con nucleolina (ya sea en estado natural o por contacto anterior con la telomerasa) se separa de una mezcla usando una matriz de afinidad que comprende anticuerpos de antinucleolina.

Al parecer la nucleolina funciona en el proceso del conjunto de telomerasa y la extensión con mediación de telomerasa de los telómeros de cromosomas in vivo. Esta invención proporciona métodos para elaborar telomerasa natural o recombinante que incluye expresar nucleolina recombinante en una célula que expresa componentes recombinantes de telomerasa.

Esta invención proporciona métodos para seleccionar compuestos para identificar agentes que alteran la asociación de las proteínas asociadas con telomerasa, como nucleolina o HF2E, con telomerasa. Los métodos comprenden por lo general poner un compuesto en contacto con la proteína asociada con telomerasa y/o con la telomerasa, y determinar si la asociación entre la proteína asociada con telomerasa y la telomerasa se altera por la presencia del compuesto. Una alteración indica que el agente altera la unión de la telomerasa con la proteína asociada. La unión de una proteína asociada con la telomerasa puede determinarse por medio de una variedad de medios, incluyendo los métodos descritos que determinan si la telomerasa puede co-separarse o co-detectarse con la proteína asociada. Estos métodos son útiles para identificar loa agentes que pueden modular el conjunto o la actividad de la telomerasa in vivo.

Se cree que la nucleolina y el HF2E funcionan como factores de actividad de la telomerasa in vivo. Esta invención proporciona métodos para seleccionar los compuestos para identificar los agentes que alteran la actividad o función de la telomerasa, como la nucleolina o el HF2E, en una célula que produce telomerasa, poniendo en contacto la célula con el agente, y determinando si la actividad o la función de la telomerasa se altera, por ejemplo, midiendo la actividad de la telomerasa o la longitud del telómero. En otro método, el compuesto se pone en contacto con el factor de actividad de la telomerasa y/o telomerasa in vitro, y la capacidad del factor de actividad de la telomerasa para alterar la actividad de la telomerasa se determina y compara con su capacidad para alterar esta actividad sin la presencia del compuesto.

Esta invención también proporciona los métodos para inhibir el conjunto de la telomerasa o la actividad de la telomerasa in vivo inhibiendo la actividad de un factor de actividad de telomerasa, como la nucleolina o HF2E. En una forma de realización, los métodos comprenden la inhibición del conjunto o actividad de telomerasa proporcionando la célula con una molécula antisensibilidad dirigida contra el ADN o ARN que codifica el factor de actividad de la telomerasa. En otra forma de realización, los métodos comprenden la expresión de versiones mutantes no funcionales de un factor de actividad de telomerasa que actúa como un señuelo contra la actividad natural de estas proteínas. Esos mutantes pueden ser, por ejemplo, fragmentos de la proteína nativa, mutantes que comprenden varias substituciones, adiciones, supresiones y equivalentes sin conservadores de aminoácidos.

Tanto la nucleolina como el HF2E son útiles para identificar otras proteínas relacionadas con la telomerasa que unen la nucleolina u HF2E, según se pueda llevar a cabo, por ejemplo, usando análisis de dos híbridos. Ver por ejemplo, Chien et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:9578. Este análisis identifica las interacciones de proteína-proteína in vivo a través de la reconstitución de un activador transcripcional, la proteína de transcripción levadura Gal4 de levadura. Ver Fields and Song (1989) Nature 340:245. El método tiene como base las propiedades de la proteína Gal4 de levadura, que comprende dominios separables responsables de la unión de ADN y activación transcripcional. Se construyen polinucleótidos, generalmente vectores de expresión, que codifican dos proteínas híbridas. Un polinucleótido comprende el dominio de unión de ADN Gal4 de levadura unido a la secuencia de polipéptidos de una proteína conocida (por ejemplo, nucleolina o HF2E). El otro polinucleótido comprende dominio de activación Gal4 unido a una secuencia de polipéptidos de una segunda proteína a probar (por ejemplo, ADNc de un librería). Las construcciones se introducen en una célula huésped de levadura. En la expresión, la unión intermolecular entre las mitades unidas de las dos proteínas fusionadas puede reconstituir dominio aglutinante de ADN Gal4 con dominio de activación Gal4. Esto conduce hacia la activación transcripcional de un gen reportador (por ejemplo, lacZ, HIS3) enlazado operativamente a un sitio de unión de Gal4. Se usaron variaciones de sistemas de dos híbridos para estudiar la actividad in vivo de una enzima proteolítica. Ver Dasmahapatra et al. (1992) Proc. Natl. Acad: Sci. (USA) 89:4159. Alternativamente, se puede usar un sistema de selección interactiva de E.coli/BCCP puede usarse para identificar secuencias de proteínas recíprocas (es decir, secuencias de proteínas que heterodimerizan o forman heteromultímeros de orden superior). Ver Germino et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:933; Guarente (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:1639. Una vez que se identificaron los ADNs que codifican los polipéptidos recíprocos, pueden usarse para seleccionar un banco de compuestos (por ejemplo, librerías de moléculas pequeñas) para identificar los agentes que inhiben la interacción aglutinante.

V. Polinucleótidos que codifican proteínas relacionadas con telomerasa

Esta invención también proporciona polinucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos que codifican proteínas relacionadas con telomerasa, incluyendo componentes de proteínas de telomerasa, proteínas asociadas con telomerasa y factores de actividad de telomerasa. Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas relacionadas con telomerasa son inherentes de la secuencia de aminoácidos de estos polipéptidos y el código genético. Estas secuencias de nucleótidos pueden usarse en la preparación de polinucleótidos recombinantes usados para expresar proteínas relacionadas con telomerasa en varios sistemas de expresión.

En una forma de realización, el polinucleótido comprende la secuencia de ADNc o ADN genómico que codifica un componente de proteína de telomerasa. Esos polinucleótidos se obtienen, por ejemplo, de la siguiente manera. Las secuencias completas o parciales de aminoácidos del componente de proteína de telomerasa se usan para crear conjuntos degenerados de sondas o iniciadores de polinucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos. Como bien sabe el experto en la técnica, es preferible seleccionar las secuencias de aminoácidos que contienen aminoácidos codificados por tan pocos codones como sea posible (de preferencia codones únicos) para disminuir el número de posibles polinucleótidos que codifican la secuencia. Estas sondas o iniciadores se usan entonces para comprobar o amplificar secuencias de polinucleótidos de bibliotecas de ADNc o ADN genómico. Las secuencias de polinucleótidos que ocurren naturalmente que codifican proteínas asociadas con telomerasa se identifican al realizar la secuencia de clones positivos o secuencias amplificadas.

En otro aspecto, esta invención proporciona sondas e iniciadores de polinucleótidos de por lo menos 7 nucleótidos que hibridizan específicamente una secuencia que ocurre naturalmente que codifica una proteína asociada con telomerasa o su complemento. Las sondas y los iniciadores son útiles para detectar polinucleótidos que codifican componentes de proteína de telomerasa. La detección del componente de proteína de telomerasa ARNm es útil para detectar cáncer en una célula debido a que la mayoría de las células cancerosas expresan la telomerasa.

En otro aspecto, esta invención proporciona métodos para detectar un polinucleótido que codifica un componente de proteína de telomerasa en una muestra, que comprende los pasos (a) poner en contacto la muestra con la sonda o iniciador de polinucléotidos que comprende una secuencia de por lo menos 7 nucleótidos que hibridiza específicamente una secuencia de nucleótidos seleccionada de una secuencia de nucleótidos del componente de proteína de telomerasa y (b) detectar si el polinucleótido hibridizó específicamente el polinucleótido del componente de proteína de telomerasa. La hibridación específica proporciona una detección del componente de proteína de telomerasa en la muestra.

En otro aspecto esta invención proporciona los métodos para inhibir la expresión de telomerasa en una célula que comprende proporcionar a la célula un polinucleótido inhibidor que se une específicamente a un polinucleótido del componente de proteína de telomerasa, por ejemplo, ARNm. El polinucleótido inhibidor puede ser una molécula antisentido, un ribozima, una molécula de sentido o un señuelo que codifica un análogo de telomerasa de señuelo inactivo.

Los polinucleótidos recombinantes que incluyen secuencias de control de expresión enlazadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifican un componente de proteína de telomerasa son útiles para preparar grandes cantidades de telomerasa recombinante. En una forma de realización, el método comprende proporcionar a la célula un aparato de expresión para expresión recombinante de las proteínas relacionadas de telomerasa y el componente de ARN de telomerasa. Alternativamente, una célula que ya expresa uno o más componentes de la ribonucleoproteína puede complementarse con un aparato de expresión para expresar los demás componentes.

VI. Métodos para generar una respuesta de inmunización contra la telomerasa

La telomerasa purificada, las proteínas asociadas con telomerasa o los péptidos naturales o sintéticos derivados de las mismas, también son útiles para inducir una respuesta inmunológica en los animales. Por consiguiente, esta invención proporciona vacunas de polinucleótidos y polipéptidos que provoquen una respuesta de inmunización humoral o con mediación de células contra la telomerasa, las proteínas asociadas con telomerasa o las células que la expresan. Esta invención también proporciona métodos para producir anticuerpos que reconocen la telomerasa o las proteínas asociadas con telomerasa tanto policlonales como uniclonales. Los anticuerpos que específicamente reconocen la telomerasa o las proteínas asociadas con telomerasa son agentes de afinidad útiles en métodos para separar esas proteínas o como controles en los inmunoensayos para las mismas. Los métodos comprenden la inmunización de un animal con telomerasa purificada, una proteína asociada con telomerasa o un fragmento de cualquiera de las anteriores.

Los anticuerpos que reconocen específicamente la telomerasa o una proteína asociada con la telomerasa también son útiles para detectar la presencia de estas proteínas en una muestra, tal como una célula o tejido. Debido a que la telomerasa está presente en la mayoría de los cánceres, la identificación de la telomerasa ayuda en el diagnóstico de cáncer o estados previos al cáncer. Detectar la presencia de la telomerasa con anticuerpos es barato y ofrece rapidez y facilidad. La telomerasa purificada o los fragmentos inmunogénicos de la misma también son útiles en las vacunas para inmunizar a una persona.

Una vacuna de polipéptidos o polinucleótidos para generar una respuesta de inmunización contra la telomerasa comprende un análogo inmunogénico de polipéptido de telomerasa o un polinucleótidos codificador del análogo. En una forma de realización, el análogo inmunogénico tiene un motivo aglutinante Clase I de MHC o Clase II de MHC. El uso de fragmentos de proteínas autónomas como inmunogénicos se conocido en la técnica y se describe para iniciación de Linfocitos T Citotóxicos en la publicación Internacional WO 94/03205. Las vacunas que comprenden estos materiales son útiles al tratar enfermedades asociadas con la sobre expresión de telomerasa, como el cáncer.

I. Protocolo para ensayos de telomerasa A. Ensayo de elongación de iniciador a) Ensayo

El ensayo de elongación de iniciador descrito en este ejemplo es la norma para determinar la actividad específica, con los propósitos de determinar la pureza relativa de la preparación de una telomerasa.

La reacción de telomerasa de 40 \mul debe tener una concentración final de:

1.

Tampón de Telomerasa 1X (véase abajo).

2.

2 mM de MgCl_{2}.

3.

2 mM de dATP, 2 mM de dTTP, 8 \muM de dGTP.

4.

1 \muM ó 0.25 \mug/reacción de óligo - iniciador M2/TS.

5.

20 \muCi/reacción de (a^{32}P-dGTP (0.624 \muM dGTP, actividad específica 800 Ci/milimoles; NEN).

\newpage

1.

Para arrancar la reacción deben combinarse 20 \mul de la mezcla de reacción 2X con un volumen igual (20 \mul) de extracto de enzima.

(Para el control de RNasa agregar un 1 \mul de RNasa A a 5 mg/ml a la mezcla de tampón justamente antes de agregar el extracto).

(Concentración final de RNasa es de 125 \mug/ml).

2.

Incubar a 30ºC durante 90 minutos (volumen total = 40 \mul).

3.

Para detener la reacción agregar 50 \mul de solución de parada TE (10 mM de Tris con pH de 7.5 y 20 mM de EDTA) que contiene 100 \mug/ml de RNasa A (Existencia = 10 mg/ml; dilución a 100X).

(Concentración final es de 55 \mug/ml).

4.

Incubar a 37ºC durante 15 minutos (volumen total = 90 \mul).

5.

Para eliminar las proteínas agregar 50 ml de 10 mM de Tris, pH de 7.5, 0.5% de SDS, y 300 \mug/ml de proteinasa K. (Concentración final de PK es de 107 \mug/ml y 0.18% de SDS; reponer con material fresco cada vez).

Para 1 ml:	10 \mul de Tris 1.0 M
	25 \mul de SDS al 20%
	30 \mul de PK (10 mg/ml)
	0.935 ml de agua Depc

6.

Incubar a 37ºC durante 15 minutos (volumen total = 14 \mul)

7.

Extraer con un volumen igual (140 \mul) de PCIA (fenol:cloroformo:isoamil-alcohol (25:24:1)). Transferir la fase acuosa a tubo fresco.

8.

Precipitar ADN agregando \mul de NH_{4}OAC, 2.5 M (bueno para precipitar pequeños óligos) que contienen 100 \mug/ml de tARN (10 mg/ml de existencias; dilución 100X, 30 \mug de portador/ tubo) y 2 a 3 volúmenes (500 \mul) de etanol absoluto frío.

9.

Dejar reposar a -20ºC durante 30 minutos o durante la noche.

10.

Girar en microcentrífuga durante 15 minutos a temperatura ambiente.

11.

Desechar supernatante y secar al pellet o gránulo en un aparato al vacío con velocidad "speed-vac" o secar al aire durante la noche. Opcional: enjuagar el gránulo con 50 \mul de etanol frío.

12.

Resuspender el gránulo en 3 \mul de colorante de carga en secuencia (99.9% de formamida, 0.05% de cianol de xileno, y 0.05% de azul de bromofenil).

13.

Hervir durante un minuto y enfriar sobre hielo.

14.

Cargar muestras en un gel secuenciador de 8% de acrilamida/7 M de urea y correr a 1500 V (50 W), (hasta que el BPB es de 2/3 a 3/4 del camino descendente).

15.

Transferir el gel a papel filtro Whatman y secar a 80ºC durante 35 minutos, y enfriar durante 15 minutos antes de retirar el gel del secador.

16.

Exponer el gel a la pantalla del Phosphor-Imager (Molecular Dynamics). Las exposiciones típicas son entre 6 y 24 horas.

a) Soluciones con ensayos de telomerasa humana 1. Tampón de Telomerasa 10X

Componente amt/10 ml	(Existencias)	(10X)	(1X)	Para 10 ml de 10X
1. Tris.Cl pH 7.5	1 M	500 mM	50 mM	5 ml
2. Espermidina \cdot 3HCl	1 M	10 mM	1 mM	100 \mul
3. BME*	14.3 M	50 mM	5 mM	35 \mul
4. MgCl_{2}	1 M	10 mM	1 mM	100 \mul
5. K-OAc	5 M	500 mM	50 mM	1 ml
6. EGTA	0.5 M	10 mM	1 mM	200 \mul
				DEPC 3.565 ml

\text{*} Alternativamente, hacer (-)BME, alicuota 1 ml. Agregar 3.5 \mul de BME para dar 10X antes del uso.

2. Detener la solución

Componente	(Existencia)	(Final)	amt/10 ml
1. Tris.Cl pH 7.5	1 M	10 mM	100 \mul
2. EDTA	200 mM	20 mM	1 ml

3. dNTP fríos

Utilizar por ejemplo Pharmacia (Uppsala, Suecia), 100 mM de existencias.

Combinar 10 \mul de dATP y 10 \mul de dTTP en un tubo y almacenar a -20ºC o -70ºC.

No utilizar el mismo tubo más de 3x toda vez que los dNTP son inestables con las operaciones repetitivas de congelación/ descongelación. Cuando se hace una solución, utilizar 10 mM de Tris.Cl, pH de 7.5 (no utilizar agua puesto que el pH ácido destruirá el nucleótido).

4. Oli-Iniciador

Preparar la secuencia en sintetizador o comprar comercialmente (por ejemplo, Operon).

Gel (10% de acrilamida/ 7M de Urea), purificar el óligo crudo y concentrar utilizando la columna de C-18. Secar en un aparato "speed-vac", y resuspender el gránulo en 10 mM de Tris.Cl con pH de 7.5. Usualmente se obtiene un rendimiento de 30% a 45%. Se pierde alrededor de la mitad del óligo durante la purificación del gel y se pierde 5% a 30% de la columna. De preferencia purificar 300 a 600 \mug y resuspender el gránulo final en 40 \mul de tampón. Determinar la concentración leyendo la absorción a 280 nm. Suponer para un óligo que 1 DO = 30 \mug/ml.

A. Ensayo de mancha de puntos para actividad de telomerasa (Dot Blot)

1.

Combinar componentes de la mezcla del ensayo:

	Volumen	Existencias	Concentración Final (en 40 \mul)
	4.0 \mul		HTB 10X	1X
	0.4 \mul		100 mM de dATP	1 mM
	0.4 \mul		100 mM de dGTP	1 mM
	0.4 \mul		100 mM de dTTP	1 mM
	1.0 \mul		0.25 \mug/ml de Oligo MS/TS	1 \muM
	13.8 \mul		Agua depc
V_{1}=	20.0 \mul

2.

Agregar 20 \mul de extracto de prueba, mezclar e incubar a 30ºC durante 90 minutos.

3.

Agregar 160 \mul de 0.5 M de NaOH, 12.5 mM de EDTA (Concentración Final = 0.4 M, 10 mM), mezclar y dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos.

4.

Transferir las muestras al aparato Silent Monitor, Biodyne® B (0.45 \muM), caja de 96 cavidades, luego colocar la caja en el tubo principal al vacío para filtrar la muestra.

5.

Apagar el vacío y agregar 200 \mul de 0.4 M de NaOH a las cavidades, y aplicar vacío hasta que quede altamente seco el filtro.

6.

Pelar el filtro de membrana, enjuagar en SSC 2X (para neutralizar el NaOH), y colocar en 50 ml de mezcla de prehibridización precalentado (SSC 6X, Denhardt's 1X, 20 mM de NaPhos, pH de 7.2, 0.4% de SDS, agua depc) durante 1 hora a 65ºC.

7.

Hacer ribo-sonda utilizando el estuche de transcripción para ARN de Estratagena (templete de ADN de pBLRep4 digerido con HindIII, polimerasa de ARN T3). Para detener la reacción, agregar 1 \mul de DNasa libre de RNasa e incubar a 37ºC durante 15 minutos, extracto de PCIA (volumen igual), agregar 1/10 volúmenes de 3 M de NaOAc y 2.5 volúmenes de etanol para precipitar la sonda de ARN.

Centrifugar por 10 minutos y disolver ARN en 100 \mul de TE en agua depc (dietilpirocarbonato).

8.

Hibridizar la mancha (blot) agregando 50 \mul de la sonda por filtro e incubar durante la noche a 65ºC.

9.

Al día siguiente, calentar la solución de lavado (SSC 1X, 0.1% de SDS) a 65ºC y transferir el filtro a la solución de lavado. Enjuagar rápidamente, transferir el filtro a solución fresca, desechar el lavado hasta dentro del desperdicio radiactivo y repetir. Lavar cuatro veces más durante 15 minutos cada vez a 65ºC.

10.

Retirar el filtro de la solución de lavado y drenar el líquido en exceso. Sellar en bolsa y exponer a la pantalla de PI durante 1 hora. Rastrear la pantalla y cuantificar, utilizando la rejilla.

C. Ensayo RT-PCR a. Preparación de ARN

1.

El ARN se extrae de la fracción de columna: 300 \mul/reacción.

2.

Preparar 1 ml de SDS al 10%, 100 mM de solución EDTA en forma fresca antes de utilizar: 200 \mul de existencias, 500 mM de EDTA, 800 \mul de existencias, SDS al 10% hasta de 1 ml.

3.

En cada reacción, agregar 30 \mul de SDS anterior, tampón de EDTA y 5 \mul de existencias. Proteinasa K (10 \mug/\mul) a cada reacción, de manera que la concentración final será: SDS al 1%, 10 mM de EDTA, 50 \mug de proteinasa K.

4.

Incubar a 37ºC durante 10 minutos.

5.

Extracto de fenol:cloroformo, dos veces (tenga cuidado en no tomar el material de la interfase blanco).

6.

Al supernatante final se agregan 30 \mul de acetato de sodio 3 M, y se precipitan los ácidos nucleicos durante la adición de 900 \mul de etanol al 100% y con incubación a -70ºC o hielo seco durante 30 minutos.

7.

Para girar hacia abajo el precipitado, microcentrifugar a plena velocidad durante 15 minutos, extraer todo el líquido, y utilizar 200 \mul de etanol al 85% para enjuagar el gránulo, y luego utilizar el aparado "speed-vac" para secar el gránulo.

8.

Resuspender el gránulo en 30 \mul de agua Depc. Tomar 1 \mul de resuspensión en 100 \mul de agua Depc, y leer DO_{260 nm}. Utilizar DO260 = 40 \mug/ml para calcular la concentración de ARN.

b. Síntesis de ADNc de la primera banda

1.

Tomar 0.1 a 1 \mug de ARN hecho y formar cada una de las fracciones de telomerasa; se mezcla con 40 a 80 ng de hexámero aleatorio, hasta de 10 \mul.

Escoger el hexámero aleatorio, por ejemplo de Pharmacia pd(N)6, total 50 DO de unidades de polvo por frasco. Utilizar 90 unidades de DO/mil = 2.97 mg/ml, que es 1 unidad DO = 33 \mug.

2.

Desnaturalizar a 95ºC durante 10 minutos, enfriar en hielo y girar hacia abajo el vapor por encima del tubo de Eppendorf.

3.

Preparar la mezcla de reacción:

	1 Rx	13 Rx
5x, primer puesto, tampón sys. (BRL):	4 \mul	52 \mul
DTT 0.1 M (BRL):	2 \mul	26 \mul
10 mM de dNTP (BRL):	1 \mul	13 \mul
RNAguard® (Pharmacia):	1 \mul	13 \mul
Agua Depc:	1 \mul	13 \mul
TOTAL:	9 \mul	117 \mul

Agregar 9 \mul/cada reacción, y hacer incubación en un baño de agua de 42ºC.

4.

Después de incubar durante 1 a 2 minutos, se agrega 1 \mul de Superscript II RTasa (BRL) a la mezcla y se incuba durante 60 minutos a 42ºC.

5.

Detener la reacción calentando el tubo durante 10 minutos a 95-98ºC. Enfriar en hielo y girar hacia abajo el vapor.

b. Amplificación en PCR de ADNc con conjunto de iniciador específico

1.

Tampón de reacción de PCR:

	1 Rx	13 Rx
Iniciador 1:	1.00 \mul	13.00 \mul
Iniciador 2:	1.00 \mul	13.00 \mul
2.5 mM de dNTP:	2.50 \mul	32.50 \mul
5 \mu/\mul de polimerasa Taq (BM):	0.40 \mul	5.20 \mul
5 mg/ml del gene T4, proteína 32 (BM):	0.04 \mul	0.52 \mul
10x de tampón de TCR (BM):	2.00 \mul	26.00 \mul
10 \muCi/\mul de a-32P ATPd:	0.50 \mul	6.50 \mul
Agua de Depc:	10.56 \mul	137.28 \mul
TOTAL:	18.00 \mul	234.00 \mul

En 2 \mul de ADNc de la primera banda, agregar 18 \mul del tampón de reacción de PCR anterior. Luego se agrega una gota de aceite mineral a cada tubo de PCR.

2.

Establecer la condición para la amplificación del PCR para el clon hTR: 94ºC durante 34 segundos, 72ºC durante 45 segundos, 72ºC durante 1.5 minutos, 20 ciclos.

3.

Después del PCR, se mezclan 5 \mul del producto con un colorante de carga de secuenciado de 10x ADN y se carga el material sobre 6% de gel de poliacrilamida nativo (no hay necesidad de correr previamente el gel).

Correr a 250 voltios durante 90 minutos. Secar el gel y exposición de PI.

Será claro que uno puede substituir el material por equivalentes conocidos en los protocolos anteriores.

D. Detección de ARN de telomerasa por análisis Northern

1.

Parámetros del gel

20 cm de gel largo

1 mm de peine con 16 cavidades

5% de gel de Acrilamida/7 M de Urea en 1x TBE

Correr el gel O/N a 125 V durante unas 12 horas (el BPB y el XC habrán salido del gel). El U2 está cerca del fondo, y el hTR estará a aproximadamente 1/4 parte del camino hacia abajo hasta adentro del gel.

Se corre el hTR a aproximadamente 700 nt con respecto a los marcadores de ADN cuando se utilice gel al 5%. Aparece como un doblete.

Se resuspenden los gránulos de ARN (hechos de 50 a 100 \mul de una fracción de telomerasa) en 15 \mul de colorante

de secuenciado (formamida desionizada con colorante), se hierve por unos cuantos minutos y se enfría rápidamente antes de cargar:

Nota:

Si se utiliza 1 mm de un gel al 6%, espeso, y se corre durante la noche, el hTR corre a aproximadamente 1 kb.

Si se utiliza una cantidad de 0.4 cm de un gel espeso al 5%, y si se corre a 1000 V (35-40 W), se corre el hTR a aproximadamente 450 nt. El hTR corre como una banda única utilizando este método, pero si no se purifican las fracciones, se ensucian las muestras y así la señal será pobre.

2. Manchado de EtBr

Se mancha el gel durante 20 a 30 minutos en 0.5 \mug/ml de EtBr en 1x TBE para ver perfil de snRNP.

3. Electromanchado

Aparato de Transferencia Genie

La trasferencia se efectúa sobre Hybond N+.

Transferencia: rTº en 1x TBE durante 0.7 horas, utilizando 0.95 A.

4. Fijación de ARN en la membrana

Entrelazamiento ultravioleta utilizando un entrelazador de Stratagena; autofijación (120 mj).

Entrelazar con el ARN en la membrana, con su cara hacia arriba.

5. Sonda

Utilizar, ya sea PCR (iniciadores de R3C y U3B) para hacer un fragmento radiactivo 154 nt, o bien etiquetar con I hexámero el fragmento de 154 nt de hTR utilizando Klenow. Sonda a 65ºC y el lavado final se hace en 0.1x SSC. Realizar la mancha utilizando el protocolo de Church (se indica abajo).

6. Análisis en el aparato de imágenes Phosphor-Imager

Exponer la mancha durante 5 horas en una placa creadora de imágenes con fósforo (por ejemplo Fuji). Puede acortarse el tiempo de exposición al utilizar extractos concentrados. Exposición de la película: 2 a 7 días, dependiente de la señal.

Protocolo de Church

Prehibridizar en 50 a 100 ml de solución de Church (500 mM de Na_{2}HPO_{4}, pH de 7.2, 1 m de MEDTA, 1% de BSA, y 7% de SDS). Prehibridizar durante unas cuantas horas a 65ºC.

Tratar la sonda con 0.1 \mug de ^{32}P-5' de óligo etiquetado en el extremo (rxn hacia delante) (actividad específica de la sonda debe ser de -10^{8} -10^{9} cpm/\mug). Sonda durante la noche a 65ºC.

Retirar la mancha de la bolsa a temperatura ambiente y enjuagar manualmente en 2x SSC (calentado a Tº de hibridización) dos veces, durante 1 minutos por lavado, 500 ml por lavado. Esto sirve para desprenderse rápidamente de la etiqueta caliente que podría pegarse no específicamente a la membrana.

Lavar la mancha 5x, en 2x SSC (rTº), 0.1% de SDS, 5 minutos por lavado, 500 ml por lavado a rTº.

(rTº = temperatura ambiente).

Lavar la mancha 1x, en 0.1x - 2x de SSC y 0.1% de SDS a temperatura de hibridización (500 ml) durante 30 minutos.

Colocar la mancha blanca en papel filtro, envolver con Saran o bolsa, y exponer a película O/N.

Notas:

1. Si se hace más de una mancha, iniciar el enjuague con la segunda mancha después de que la primera mancha haya quedado en el segundo lavado de 5 minutos.

2. Lavados para 1 mancha: 4 litros; 400 ml de 20x SSC y 3600 ml de ddH_{2}O. Retirar 1 litro y agregar 15 ml al 20% de SDS a 3 litros. (2x SSC = 300 mM de NaCl, y por lo tanto aproximadamente la mitad de aquella concentración de sal para la hibridización).

3. Solución de Church (100 ml): 1 g de BSA a 50 ml de NaPO_{4}, 1 M, pH de 7.2, 15 ml de H_{2}O, disolver, y luego agregar 0.2 ml de EDTA 0.5 M, y 35 ml de SDS al 20%.

II. Protocolos para un extracto de celulas crudas a partir de 293 células

Esta preparación prefiere un mínimo de 10^{7} células, ya sea células en suspensión o adherentes. Puede ser incrementada para lograr así una cantidad proporcionalmente mayor de células. Se ha logrado una preparación con una cantidad tan grande de 7.7 x 10^{10} células con una actividad excelente pero con un fondo levemente mayor. Además debe llevarse a cabo todo el procedimiento a 4ºC y sobre hielo.

Hay que cultivar las células a una fase de valor logarítmico mediano. Hay que proveer células adicionales adecuadas para el conteo: el cálculo de las cantidades de tampón depende del número de células y no tanto del volumen.

Se puede utilizar el detergente CHAPS o CHPSO. Estas formas muestran pocas diferencias para obtener extractos acitovs.

A. Tampones Tampón de lavado

Existencias	Final	20 mL	100mL
1 M de HEPES pH de 7.5	10nM	200\lambda	1 mL 150\lambda
1 M de MgCl_{2}	1.5 mM	30\lambda	1 mL
1 M de KCl	10mM	200\lambda	100\lambda
1 M de DTT	1mM	20\lambda	97.75 mL
H_{2}O Tipo DEPC		19.55 mL

Tampón de Lisis (0.5% de CHAPS/CHAPSO)

Existencias	Final	10 mL	50 mL	60 mL
1 M de Tris Cl, pH de 7.5	10 mM	100\lambda	500\mul	600 \mul
1 M de MgCl_{2}	1 mM	10\lambda	50\mul	60 \mul
0.5 M de EGTA	1 mM	20\lambda	100\mul	120 \mul
0.1 M dePMSF	0.1 mM		50\mul	60 \mul
BME	5 mM	10\lambda	15	18 \mul
10% de Detergente	0.5%	3\lambda	2500\mul	3000 \mul
10% de Glicerol	10%	500\lambda	5 mL	6000 \mul
H_{2}O Tipo DEPC		1 mL	41.785mL	50.14mL
		8.36 mL

B. Procedimiento

1.

Para las células adherentes hay que cultivar dos conjuntos de cajas de 15 cm y utilizar uno para el conteo. Una vez determinado el conteo de las células hay que enjuagar el otro conjunto dos veces con 20 mL de PBS frío. Agregar 10 mL de PBS y raspar las células para que entren en un tubo centrífugo de 15 mL.

Continuar con el paso 3.

2.

Para los cultivos de suspensión, cultivar el material a una densidad no mayor de 10^{6} células/ml (se prefiere alrededor de 7 X 10^{5}/mL). Después de establecer elconteo de las células, hay que convertir en "pellets" o sea gránulos las células en tubos centrífugos de 5 mL a 200 g/4ºC/5 minutos. Se resuspende en PBS frío equivalente al volumen original.

3.

Granular las células en un aparato centrífugo clínico a 200 g/4ºC/5 minutos. Se resuspende el material en forma completa en tampón de lavado a una concentración de 10^{6}células/100\lambda y se transfiere a los tubos microcentrífugos. Girar las células hacia abajo a 13 k rpm durante 1 minuto.

4.

Retirar el tampón de lavado y resuspender los gránulos en tampón de lisis con detergente a una concentración de 10^{6} células/18.5\lambda y transferir el material a un tubo ultrafugo adecuado (véase abajo). Deje el material sobre hielo durante 30 minutos. En caso de necesidad hay que convertir un Parafilme la parte superior del tubo.

Volumen	Tubo centrífugo de Beckmann	Rotor
<1 mL	micro-polialómero de pared gruesa	TLS 55
1.2 mL	micro-polialómero de pared delgada	TLS 55
2 a 5 mL	polialómero	SW 41

5.

Preparar los rotores ultrafugos de cubetas oscilantes adecuados y enfriar el ultracentrífugo adecuado a 4ºC. Para el rotor SW41, colocar el XL-80 Ultra a 28.5 k rpm para 100,000 g. Para el rotor TLS 55 colóquese el Ultra de cubierta de mesa a una velocidad de 39k rpm.

6.

Girar las células sometidas a lisis por un tiempo de 30 minutos.

7.

Recoleccionar la porción acuosa clara del supernatante (esta parte es el extracto). Divida el extracto en porciones alícuotas de 100\lambda y congélese en hielo seco. Almacenar a -80ºC.

III. Método a base de cuatro pasos para purificar la telomerasa

Se describe un método para hacer telomesara humana que se encuentra purificada en 3550 veces más que el material que se encuentra en los extractos de las células crudas. Este método comprende cuatro pasos en sucesión: 1) S-100 con detergente CHAPS a partir de 293 células; 2) una cromatografía del extracto S-100 sobre una matriz de POROS® 50 HQ; 3) cromatografía de las fracciones activas de POROS® 50 HQ sobre una matriz de POROS® 20 Heparina HE-1; y 4) cromatografía de las fracciones activas de POROS® 20 Heparina HE-1 sobre una matriz con afinidad para Oligo 5. Se proporcionan los protocolos para cada paso.

En el primer paso se recogieron 7.3 x 10^{10} 293 células a partir de 128 litros de cultivo en suspensión y se extrajo el CHAPS tal y como se describe en el Ejemplo II para rendir 883 ml del extracto CHAPS S-100.

En el segundo paso se sometió este extracto a cromatografía en una columna de PROSO® 50 HQ, y se combinaron las fracciones que contenían una actividad de telomerasa para un material reunido activo total de 72 ml. Este paso se llevó a cabo de la siguiente manera:

La resina POROS® 50 HQ (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA, número de catálogo 1-2559-05) se resuspendió en un volumen igual de tampón a (20 mM Hepes pH 7.9, 2 mM de MgCl_{2}, 1 mM de EGTA, 10% de glicerol, 0.1% de Nonidet P-40, 1 mM de Ditiotreitol, 0.2 mM de fenilmetilsulfonilfluoruro, 1 mM de Benzamidina, 1 mM de Metabisulfito de Sodio), equilibrado con 100 mM de NaCl (tampón A/100 mM de NaCl) y se empaquetó la pasa acuosa por gravedad en una columna de cromatografía de XK 26/20 (Pharmacia, Uppsala, Suecia, número de catálogo 18-1000-72).

Se operó la columna en un sistema GradiFrac® (Pharmacia, Uppsala, Suecia, número de catálogo 13-2192-01). Se equilibró la columna con 3 volúmenes de columna del tampón A/100 mM de NaCl, seguido por un lavado en alto contenido en sal, aplicando 3 volúmenes de columna de tampón A/2000 mM de NaCl. Finalmente se reequilibró la columna con 3 volúmenes de columna del tampón A/100 mM de NaCl. Se determinó la capacidad aglutinante de la columna cargando cantidades crecientes del extracto CHAPS hasta que se detectó una actividad de telomerasa en las fracciones del caudal. Se encontró que en la capacidad de la POROS® 50 HQ estaba en el intervalo de 20 miligramos de extracto de CHAPS por mililitro de resina.

Se cargaron 1.6 gramos de extracto CHAPS sobre una columna que contenía 80 ml de POROS® 50 HQ con una tasa de flujo de 20 ml/min. Luego se lavó la columna con 3 volúmenes del tampón A/100 mM de NaCl. Se realizó la primera elusión lavando la columna con un paso con cantidad mediana de sal, en una cantidad de 3 volúmenes de columna (tampón A/480 mM de NaCl). Se recuperó la actividad de telomerasa mediante un paso con alto contenido en sal (tampón A/1050 mM de NaCl). Se dializaron las fracciones procedentes de la elusión con alto contenido de sal separadamente en contra del tampón A, durante la noche. Se escanearon las fracciones para detectar la actividad de telomerasa mediante un ensayo de elongación de inciador. Se reunieron las fracciones activas. Este procedimiento se repitió varias veces para manejar así la totalidad de 6.8 gramos del extracto CHAPS S-100.

Para determinar la actividad específica relativa de la telomerasa para el extracto CHAPS S-100 y el material reunido activo POROS® 50 HQ, se determinaron para cada cual las concentraciones de proteínas (Reactivo para Ensayo de Proteínas Coomassie, Pierce Product #23200, Rockford, IL), y se compararon las preparaciones para establecer su actividad de telomerasa relativa mediante el ensayo de elongación de iniciador según se describe en el Ejemplo I (Figura 5). Se expuso el gel seco a una pantalla productora de imágenes con fósforo durante 4 a 16 horas. Se escaneó la pantalla y se ajustó la pantalla y se ajustó la escala de gris a fin de producir una imagen que apareciera en condición lineal con respecto a la titración del ensayo correspondiente. Esto ocurrió habitualmente entre 5 y 25 por el extremo inferior y entre 1000 y 2000 por el extremo superior.

Se midió la actividad de telomerasa en unidades arbitrarias y se derivó de una evaluación visual de la señal que resultaba de una titración de las fracciones en un margen de 10 a 20 veces mayor, en incremento de 2 veces en cada caso. Se determinaron las comparaciones relativas de la actividad entre las fracciones a partir del intervalo lineal de cada titración.

Los carriles 1 a 5 de la Figura 5 muestran productos de elongación de iniciador desde la actividad de telomerasa en 1.25 \mul a 20 \mul del extracto S-100 con CHAPS; los carriles 6 a 10 muestran el mismo resultado procedente de una tritración de material reunido activo POROS® 50 HQ. La cantidad de productos de telomerasa incrementa en proporción a la cantidad de la preparación ensayada en los carriles 3 a 5 y en los carriles 6 a 10, proporcionando un rango lineal para comparación entre las dos preparaciones. A partir del rango lineal para cada preparación, se estimó que una cantidad de 20 \mul del extracto CHAPS S-100 (carril 5) genera la misma cantidad de productos de elongación de iniciador de telomerasa como 2.5 \mul del material reunido activo POROS® 50 HQ (carril 7). Por consiguiente, puede decirse que estos volúmenes contienen cada cual una unidad arbitraria de actividad de telomerasa. Esta unidad arbitraria es únicamente importante para esta comparación en particular.

Utilizando las mediciones de volumen, concentración de proteínas, y volumen por unidad de actividad de telomerasa, se realizan cálculos sencillos que proporcionan el total de la unidades así como la cantidad total de proteína, a partir de lo cual se derivó la actividad específica relativa de la telomerasa para las dos preparaciones (Tabla 4). La actividad específica del material reunido activo POROS® 50 HQ (0.037 unidades/\mug) es de 5.8 veces mayor que aquella del extracto CHAPS S-100 (0.0065 unidades/\mug). Por consiguiente, tiene la telomerasa humana en el material reactivo activo POROS® 50 HQ una pureza relativa incrementada en 5.8 veces en comparación con aquella del extracto CHAPS S-100. El total de unidades de la actividad de telomerasa en el material reunido activo POROS® 50 HQ (28,800 unidades) representa el 65% de aquella del extracto CHAPS S-100 (44,150 unidades). Por consiguiente, tiene la cromatografía de POROS® 50 HQ un rendimiento de 65% para la actividad de telomerasa.

En el tercer paso, se sometieron 24 ml de un material reunido activo POROS® 50 HQ a cromatografía en una columna de POROS® Heparina 20 HE-1, y se combinaron las fracciones que tenían una actividad de telomerasa para lograr un material reunido activo total de 6 ml. La cromatografía se llevó a cabo del siguiente modo.

Se obtuvo el POROS® 20 HE-1 de la empresa PerSeptive (Cambridge, MA, número de catálogo 1-5229-06). El manejo de la resina, la empaquetadura y la equilibración de la columna se llevaron a cabo exactamente de la misma manera como se ha descrito para la resina anterior, salvo que se utilizó una columna de cromatografía de XK 16/20 (Pharmacia, Uppsala, Suecia, número de catálogo 18- 8773-01). Se determinó que la capacidad aglutinante estaba en el rango de 15 mg/ml de resina.

Se cargaron 146.4 miligramos de material reunido de POROS® 50 HQ sobre una columna de 25 ml de POROS® Heparina HE-1 con una tasa de flujo de 15 ml/min. Luego se lavó la columna con 3 volúmenes de tampón A/100 mM de NaCl. La primera elución fue realizada lavando la columna con un paso de sal mediana con 3 volúmenes de columna (tampón A/347 mM de NaCl). Se recuperó la actividad de telomerasa mediante un paso con alto contenido en sal (tampón A/1430 mM de NaCl). Se dializaron separadamente las fracciones procedentes de la elución con sal en cantidad elevada, en contra del tampón A, durante la noche. Se escanearon las fracciones para detectar la actividad de telomerasa mediante ensayos de elongación de iniciador. Se reunieron las fracciones activas.

La actividad específica relativa de la telomerasa para el material reunido activo POROS® 50 HQ y el material reunido activo de POROS® Heparina 20 HE-1 se determinó exactamente como se ha descrito arriba para el paso anterior. Las titraciones de las dos preparaciones en el ensayo de elongación del iniciador se muestran en la Figura 6; los valores medidos y calculados se muestran en la Tabla 4. Estos datos indican que la telomerasa humana en el material reunido activo de POROS® Heparina 20 HE- 1 se encuentra purificada en 6.8 veces mayor en comparación el nivel encontrado en el material reunido activo de POROS® 50 HQ. La purificación acumulativa después de este tercer paso es el producto de todos los pasos anteriores. Por consiguiente, tiene la telomerasa humana en el material reunido activo de POROS® Heparina 20 HE-1 una pureza relativa incrementada de 6.8 \times 5.8 = 39.4 veces en comparación con aquella encontrada en el extracto CHAPS S-100. El rendimiento de la cromatografía del POROS® Heparina 20 HE-1 es de 75% para la actividad de la telomerasa, y el rendimiento acumulativo después de este tercer paso es de 49%.

En el cuarto paso, se sometieron 0.14 ml del material reunido activo de POROS® Heparina 20 HE-1 a cromatografía en una matriz de afinidad con el empleo de Oligo 5 como la ligadura de afinidad. Se combinaron fracciones de la columna de afinidad que contenía la actividad de telomerasa para lograr un material reunido activo total de 0.4 ml. Se llevó a cabo la cromatografía de afinidad de la siguiente manera.

Cuentas de NeutrAvidin inmovilizado con UltraLink® (Pierce, Rockford, IL, número de catálogo 53151) se trataron previamente con un volumen igual de tampón A/100 mM de NaCl suplementado con 1 mg/ml de BSA, 0.2 mg/ml de ARNt y 0.2 mg/ml de ADN de testes (testículos) de salmón durante 1 hora a 4ºC. Luego se enjuagaron las cuentas con 5 volúmenes de tampón A/100 mM de NaCl.

Se identificó el Oligo 5, un oligonucleótido de ADN con antisentido (National Biosciences, Inc., Plymouth, MN) que cubría los nucleótidos 407-436 de la telomerasa humana de ARN con las secuencias 5'-*gccgagtcct gggtgcacgt cccatagctc-3' (en que *G se encuentra biotinilado) (identificación de secuencia número 4). Se resuspendió el Oligo 5 en una concentración de 100 \muM para su uso en experimentos posteriores.

Se suplementaron 140 \mul de material de heparina reunido con una concentración de proteína de 9 mg/ml, aplicando 1.6 mM de Oligo 5, 2 mM de dTTP, 0.1 mM de ddATP, 2 mM de dGTP, 50 mM de Tris HCl con pH de 7.5, 1 mM de Spermidina (espermidina), 5 mM de \beta-mercaptoetanol, 1 mM de MgCl_{2}, 50 mM de Acetato de Potasio, 1 mM de EGTA y se incubó el material a 30ºC durante 1 hora. Se agregó la mezcla de reacción a 400 \mul de cuentas de NeutrAvidin pretratado y se mezcló a 4ºC durante 1 a 4 horas.

A continuación se vació la pasta acuosa en una pequeña columna desechable y se drenó el caudal. El caudal se retornó a través de la columna hasta por tres veces. Luego se lavó la columna con al menos 4 volúmenes de columna de tampón A/100 mM de NaCl y se eluyó con tampón A/500 mM de NaCl. Se probaron las fracciones para detectar la actividad de telomerasa mediante ensayos de elongación de iniciador.

La actividad específica relativa de la telomerasa para estas dos preparaciones se determinó exactamente de la manera descrita arriba para los pasos anteriores con una excepción. La telomerasa es liberada de las columnas de POROS® 50 HQ, POROS® Heparina HE-1, y de las columnas de afinidad de oligo 5 en los pasos de purificación 2, 3 y 4 incrementando la concentración de sal en el tampón de lavado. En vista de que las concentraciones de sal más allá de 100 mM inhiben la actividad de telomerasa (Figura 7, compárense los carriles 7 y 9) se dializaron los materiales reunidos activos de los pasos de purificación 2 y 3 para bajar la concentración de sal al nivel de la preparación cargada en la columna, para tales pasos. En el paso de purificación 4 (afinidad de oligo 5), no se desaló el material reunido de las fracciones activas. Para determinar una actividad relativa precisa, se ajustó la concentración de sal de la preparación cargada sobre la columna de afinidad (material reunido activo de POROS® Heparina 20 HE-1) para que fuera igual que aquella del material reunido activo de afinidad de Oligo 5.

Se muestran las titraciones de las dos preparaciones en el ensayo de elongación de iniciador en la Figura 7; los valores medidos y calculados se muestran en la Tabla 4. Estos datos indican que la telomerasa humana en el material reunido activo de Oligo 5 está purificada en 90 veces más en comparación con el grado obtenido en el material reunido activo de POROS® Heparina 20 HE-1. La purificación acumulativa después de este cuarto paso es de 90 \times 6.8 \times 5.8 = 3,550. Así, la telomerasa humana hecha con este método tiene una pureza relativa incrementada 3,500 veces en comparación con aquella obtenida en el extracto de CHAPS S-100. El rendimiento del paso de cromatografía de afinidad es de 29% para la actividad de telomerasa; el rendimiento acumulativo de la actividad de telomerasa para este método es de 14%.

IV. Método de cinco pasos para purificar la telomerasa

Se describe un método para hacer la telomerasa humana que tiene una pureza relativa 32,660 veces mayor en comparación con aquella que se encuentra en los extractos celulares crudos. Este método comprende cinco pasos en sucesión: 1) preparación del extracto de CHAPS detergente S-100 a partir de 293 células; 2) cromatografía del extracto S-100 en la matriz de POROS® 50 HQ; 3) cromatografía de las fracciones activas de POROS® 50 HQ sobre la matriz de POROS® Heparina 20 HE-1; 4) cromatografía de las fracciones activas de POROS® Heparina 20 HE-1 sobre la matriz de POROS® espermidina; y 5) cromatografía de las fracciones activas de POROS® espermidina, sobre la matriz de afinidad del oligonucléotido 5. Se proporcionan protocolos para la preparación de la matriz de espermidina y para la operación en la columna de espermidina. Se proporcionaron protocolos para todos los demás pasos en el método a base de 4 pasos según el Ejemplo III.

En el método de 5 pasos, los tres primeros pasos son iguales, en un método a base de 4 pasos. En el cuarto paso, se sometieron 0.7 ml del material reunido activo POROS® Heparina 20 HE-1 a una cromatografía en una columna recién preparada (es decir, no disponible en el mercado) de POROS® espermidina, y se combinaron las fracciones que contenían una actividad de telomerasa para lograr un material reunido activo total de 0.15 ml. La cromatografía se llevó a cabo de la siguiente manera.

Se preparó el material POROS®-Espermidina de la siguiente manera. Se colocó el POROS® 20 EP seco (PerSeptive 1-6129-03) en tampón acoplador (0.1 M de fosfato de sodio ajustado a un pH de 10.0 con KOH) para permitir que se hidrataran las cuentas. Las cuentas hidratadas fueron transferidas a una columna desechable y se enjuagaron con tampón acoplador para un volumen de 20 lechos. Se agregaron 2 volúmenes de lechos de un material que constaba de tetraclorhidrato de espermidina 0.2 M (Sigma) y fosfato de sodio 0.1 M. Se reajustó la solución del tampón acoplador de espermidina hasta un pH de 10. (20 ml de fosfato de sodio 0.1 M-espermidina 0.22 M + 1.5 ml de NaOH 1

\hbox{N =}

espermidina 0.2 M-fosfato de sodio 0.1 M, pH de 10.0). Se giraron las cuentas con la solución de espermidina durante la noche a temperatura ambiente. Se eliminó la solución de espermidina por lavado con un volumen de 20 lechos de tampón de acoplamiento. Los grupos reactivos remanentes de las cuentas de POROS® 20 EP se enfriaron bruscamente con un volumen de 2 lechos de etanolamina 0.1 M constituida en un tampón de acoplamiento. Se giró la mezcla durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se lavó con volúmenes equivalentes a 20 lechos de tampón acoplador. Se lavó la mezcla con un volumen de 10 lechos del tampón A/100 mM de NaCl y se empaquetó en las columnas para la cromatografía.

La columna de POROS®-Espermidina se equilibró a 4ºC con 10 volúmenes de columna (abreviado VC) del tampón A/100 mM de NaCl antes de la aplicación de la muestra. El material reunido activo de POROS® Heparina 20 HE-1 como muestra se dializó en el tampón A hasta por debajo de 100 mM de NaCl) que se aplicó a la columna y se cromatografió con una tasa de flujo de 0.6 VC (volúmenes de columna), por minuto. Luego se lavó la columna con la misma tasa de flujo aplicando 5 VC de tampón A/100 mM de NaCl. Las proteínas fueron eluidas con la misma tasa de flujo, en los siguientes pasos:

- 3 VC de tampón A, 100 mM de KCl, 90 mM de NaCl

- 3 VC de tampón A, 150 mM de KCl, 85 mM de NaCl

- 3 VC de tampón A, 200 mM de KCl, 80 mM de NaCl

- 3 VC de tampón A, 1000 mM de KCl

Se eluyeron las proteínas en cada paso, eluyéndose la telomerasa fundamentalmente de la columna de POROS®-Espermidina con el tampón A/150 mM de KCl y 85 mM de NaCl. Se determinó la actividad específica relativa de la telomerasa para estas dos preparaciones. Las titraciones de las dos preparaciones en el ensayo de elongación de iniciador se muestran en la Figura 8; los valores medidos y calculados se muestran en la Tabla 5. Esos datos indican que la telomerasa humana en el material reunido activo de POROS®-Espermidina se purifica en 9.2 veces más en comparación con el grado obtenido en el material reunido activo de POROS® Heparina 20 HE-1. La purificación acumulativa después de este cuarto paso es de 9.2 \times 6.8 \times5.8 = 363 veces más que el nivel obtenido en el extracto CHAPS S-100. El rendimiento de la cromatografía de POROS® espermidina es de 30% para la actividad de telomerasa, y el rendimiento acumulativo al cabo de estos cuatro pasos asciende a 14.6%.

La cromatografía de afinidad con Oligo 5 de las fracciones activas de POROS® espermidina purifica la telomerasa humana por un factor de 90 con un rendimiento de 29% (como ocurrió en el caso de las fracciones activas de POROS® Heparina 20 HE-1). Así, puede decirse que este método de 5 pasos produce una telomerasa humana que tiene una pureza relativa incrementada por 90 \times 363 = 32,660 veces mayor en comparación con el nivel alcanzado con los extractos de CHAPS S-100. El rendimiento de este método de 5 pasos es de 4.2%.

V. Método de seis pasos para purificar la telomerasa

Se describe un método para hacer telomerasa humana que se encuentra purificada en 65,320 veces mayor que el nivel alcanzado en los extractos de células crudas. Este método comprende seis pasos en sucesión: 1) la preparación del extracto CHAPS-detergente-S-100 a partir de 293 células; 2) la cromatografía del extracto de S-100 en la matriz de POROS® 50 HQ; 3) la cromatografía de las fracciones activas de POROS® 50 HQ sobre la matriz de POROS® Heparina 20 HE-1; 4) la cromatografía de las fracciones activas de POROS® Heparina 20 HE-1 sobre la matriz de POROS® Espermidina; 5) la cromatografía de las fracciones activas de POROS® Espermidina sobre la columna graduadora de Superose® 6; y 6) la cromatografía de las fracciones activas de la columna graduadora con Superose® 6 sobre la matriz de afinidad de Oligo 5. Se provee un protocolo para operar la columna de Superose® 6. Previamente se había provisto el conjunto de protocolos para todos los demás pasos.

En el método a base de 6 pasos, los cuatro primeros pasos son iguales, como en el método de 5 pasos. En el quinto paso se sometieron 0.02 ml de material procedente del material reunido activo de POROS® espermidina recogido en el Ejemplo IV a una cromatografía en una columna graduadora de Superose® 6 y se combinaron las fracciones que contenían una actividad de telomerasa para lograr un material reunido activo total de 0.16 ml. Se llevó a cabo la cromatografía con Superose® 6 de la siguiente manera.

La columna de 2.4 ml de Superose® 6, PACIENTES 3.2/30 procedente Pharmacia es pre-equilibrada con 2 volúmenes de columna del tampón A y 150 mM de NaCl con una tasa de flujo de 40 \mul/min. Para cada pasada con Superose® 6, se cargan 20 \mul de una fracción de POROS® espermidina activa sobre la columna, la cual es operada con una tasa de flujo de 20 \mul/min en el tampón A con 150 mM de NaCl. El grueso de las proteínas absorbente con DO_{280} va eluyéndose desde la columna entre 1.00 ml y 1.4 ml. El pico de la actividad de telomerasa es eluido entre 1.4 y 1.6 ml, sobre el extremo de arrastre del pico de las proteínas.

Se determinó la actividad específica relativa de la telomerasa para estas dos preparaciones. Se muestran en la Figura 8 las titraciones de las dos preparaciones en el ensayo de elongación de iniciador; los valores medidos y calculados se muestran en la Tabla 5. Estos datos indican que la telomerasa humana en el material reunido activo Superose® 6 se purifica con un incremento de 2 veces en comparación con el nivel alcanzado con el material reunido activo de POROS® espermidina. La purificación acumulativa después de este quinto paso es de 2 \times 9.2 \times 6.8 \times 5.8 = 725.7 veces la pureza relativa obtenida con el extracto de CHAPS S-100. El rendimiento de cromatografía con Superose® 6 es de 20% para la actividad de telomerasa y el rendimiento acumulativo al cabo de estos 5 pasos es de 2.9%.

La cromatografía de afinidad de Oligo 5 de las fracciones activas de Superose® 6 puede purificar la telomerasa humana en la misma medida que para las fracciones activas de POROS® Heparina 20 HE-1. Así, este método de 6 pasos produciría telomerasa humana que es purificada en 90 \times 725.7 = 65,320 veces mayor que el nivel obtenido en los extractos de CHAPS S-100. El rendimiento del método a base de 6 pasos es de 0.85%.

VI. Segundo método a base de seis pasos para purificar la telomerasa

Se ejecutó un método para hacer la telomerasa humana que tiene un grado de purificación de 60,000 veces mayor que los niveles obtenidos en los extractos con células crudas. Este método comprende seis pasos en sucesión: 1) la homogeneización en un aparato Dounce y la preparación del extracto nuclear a partir de 293 células; 2) la cromatografía del extracto nuclear en la matriz de POROS® 50 HQ; 3) la cromatografía de las fracciones activas de POROS® 50 HQ en la matriz de POROS® Heparina 20 HE-1; 4) la cromatografía de las fracciones activas de POROS® Heparina 20 HE-1 en la matriz de SOURCE 15Q®; 5) la cromatografía de las fracciones activas de la matriz SOURCE 15Q® en la matriz de afinidad de Oligo 14ab; y 6) la cromatografía de las fracciones activas de la matriz de afinidad 14ab en una columna clasificadora de TSK-Gel*G5000PW_{XL}. Se proveen los protocolos para todos los pasos.

A. Preparación del extracto nuclear 1. Células

Las 293 células están constituidas por una línea celular del riñón, embriónico humano transformado por adenovirus. Estas células crecen sin problema en cultivo de suspensión con una densidad óptima de cosecha de 0.5 X 10^{9} células por litro y con un tiempo de reduplicación de 24 horas. Se obtuvieron las células de Cellex en forma de gránulos celulares húmedos sobre hielo seco. Se crecen 293 cultivos en suspensión en frascos de tipo girador y se proporcionaron en lotes de 2 X 10^{11} células (procedentes de 400 litros de cultivo). Se cosechan las 293 células, se elabora el material dos veces en PBS (libre de Ca/Mg), se congeló en forma brusca como un gránulo celular húmedo, y se colocó sobre hielo seco. (Se pueden almacenar las células congeladas a -80ºC).

2. Extractos crudos

a. Se descongelan rápidamente los gránulos celulares, se mide el volumen de las células empaquetadas, y luego se suspenden las células en un volumen igual de un tampón H, frío como hielo. Se guardan las células sobre hielo y se interrumpen utilizando un homogeneizador de tipo dounce equipado con un majadero o triturador B con 10 carreras de ascenso y descenso.

b. El citoplasma y los núcleos se separan por un giro a baja velocidad: el material homogeneizado es centrifugado durante 10 minutos, a 4ºC con una velocidad de 2,500 r.p.m. (revoluciones por minuto) en un rotor Beckman JS4.2 (1780 Xg). El supernatante es decantado en botellas limpias y se guarda el gránulo sobre hielo para la preparación del extracto nuclear (véase abajo, el paso j).

Paso Alternativo b.

Si no hay tiempo suficiente para una preparación de un extracto nuclear, se puede almacenar el gránulo nuclear pero primero hay que suplementar el tampón con glicerol. Hay que medir el volumen del material homogeneizado procedente del paso a (para ser asignado a la variable y en la siguiente ecuación). Agregar glicerol frío como hielo, al 80%, al material homogeneizado para obtener una concentración final de 10%. Mezclar bien. El volumen del 80% de glicerol que debe agregarse, o sea x, se puede determinar por la ecuación: x = 0.1y/0.7. Se centrifuga exactamente como en el paso b. Se congelan en forma abrupta los gránulos nucleares y se almacenan a -80ºC. La adición de glicerol no cambia ninguno de los siguientes pasos de extracción.

c. Medir el volumen del supernatante (a que se asigna la variable y en la siguiente ecuación). Se agrega NaCl 5 M, frío como hielo, al supernatante para obtener una concentración final de 150 mM. Se mezcla bien. El volumen de 5 M de NaCl que debe agregarse, o sea x, se puede determinar por la ecuación: x = 0.15y/4.85.

d. Se centrifuga el supernatante durante 1 hora, a 4ºC y con 40K r.p.m. en un rotor Beckman 45Ti (100K Xg). Se decanta el supernatante cuidadosamente en un recipiente limpio.

e. Se mide el volumen del supernatante. Para cada litro de supernatante se agregan gradualmente 259.5 g de sulfato de amonio sólido (45% de concentración final). Se mezcla suavemente en el local frío durante unos 30 minutos.

f. Se recoge el precipitado centrifugando la mezcla durante 30 minutos a 4ºC con una velocidad de 10K r.p.m. en un rotor de tipo Sorvall GSA. Se decanta el supernatante y se drenan los gránulos muy bien.

g. Se resuspenden los gránulos en el tampón A que contiene 50 mM de NaCl. Se utiliza la quinta parte del volumen medido en el paso e (antes de agregar el sulfato de amonio) y se resuspende el gránulo utilizando un homogeneizador de tipo dounce, equipado con un majadero de tipo A.

h. Se dializa en el tampón A que contiene 50 mM de NaCl durante la noche con un solo cambio de tampón.

i. Se recoge el material dializado y se centrifuga durante 30 minutos a 4ºC con una velocidad de 15K r.p.m. en un rotor Sorvall SS-34. Se filtra el supernatante a través de una tela Mira. Este es el "extracto citoplásmico crudo". Se puede congelar en forma abrupta y almacenar a -80ºC o también se puede cargar directamente sobre la columna de TosoHaas super Q. El extracto citoplásmico crudo es típicamente de 230 ml con 25 mg/ml de proteína y basta una cantidad de 10 \mul para establecer la actividad de telomerasa en el ensayo convencional de la elongación del iniciador.

\newpage

j. A partir del paso b se mide el volumen del gránulo nuclear. Se resuspenden los núcleos en 0.5 volumen del Tampón C.

k. Se agrega lentamente y mientras se revuelve, otra cantidad de 0.5 volumen nuclear empaquetado del tampón C que contiene 1.2 M de NaCl.

l. Se homogeneiza en el aparato dounce (5 a 10 carreras) con el majadero A.

m. Se transfiere el material a un vaso de cristal sobre hielo y se agita al menos durante 30 minutos.

n. Se centrifuga durante 75 minutos a 4ºC a 18K r.p.m. en un rotor Sorvall SS-34.

o. Se transfiere el supernatante a bolsas de diálisis y se dializa durante la noche o 2 X 2 horas con el tampón "hipo" que contiene 100 mM de NaCl.

p. Se recoge el material dializado y se centrifuga durante 30 minutos a 4ºC a 15K r.p.m. en un rotor Sorvall SS-34. El supernatante clarificado es el "extracto nuclear crudo". Se congela en forma abrupta y se almacena a -80ºC. El extracto nuclear crudo es típicamente de 650 ml con 7 mg/ml de proteína y basta una cantidad de 10 \mul para establecer la actividad de telomerasa en el ensayo convencional.

B. Primera cromatografía con intercambio de iones

1. El material del extracto nuclear se somete a la siguiente cromatografía con intercambio de iones. Una resina POROS® 50 HQ de la empresa PerSeptive Biosystems es resuspendida en un volumen igual del tampón hipo que contiene 100 mM de NaCl y se empaqueta la pasta acuosa por gravedad en una columna de cromatografía de XK 50/30 (Pharmacia).

2. La columna es operada en un sistema GradiFrac (Pharmacia) después de haber sido equilibrada con 3 volúmenes de columna de tampón hipo que contiene 100 mM de NaCl seguido por un lavado con alto contenido en sal con 3 volúmenes de columna de tampón hipo que contiene 2000 mM de NaCl. Luego es reequilibrada la columna con 3 volúmenes de columna del tampón hipo que contiene 100 mM de NaCl. La capacidad de la resina para la telomerasa está en el rango de 20 mg de extracto nuclear por mililitro de resina.

3. En una típica preparación que arranca con 2 X 10^{11} células (600 gramos de células), se cargan 650 a 700 ml de extracto nuclear crudo o aproximadamente 4.7 gramos de proteínas sobre una columna de 300 ml con una tasa de flujo de 20 ml/min. Luego se lava la columna con 3 volúmenes de columna de tampón hipo que contiene 100 mM de NaCl. Se lleva a cabo un paso de lavado con cantidad media de sal con 3 volúmenes de columnas de tampón hipo que contiene 404 mM de NaCl. Se recupera la actividad de telomerasa mediante una elución con alto contenido en sal con tampón hipo que contiene 1050 mM de NaCl. Son dializadas separadamente las fracciones de la elución con alto contenido en sal contra el tampón hipo que contiene 50 mM de NaCl durante la noche y se explora para determinar la actividad de telomerasa a través de un ensayo convencional antes de reunirse y someterse al siguiente paso de purificación.

C. Cromatografía con heparina

1. Una cantidad de 100 a 120 ml de fracciones activas combinadas procedentes del paso anterior, o sea aproximadamente 660 miligramos de proteínas se carga en una columna de 60 ml de POROS® Heparina 20 HE-1 procedente de PerSeptive Biosystems con una tasa de flujo de 8 ml/min. El manejo de la resina, la empaquetadura y la equilibración de la columna se realizan de la misma manera como se ha descrito para la resina anterior, salvo de que se utiliza una columna para cromatografía XK 26/20 (Pharmacia) y porque la capacidad aglutinante para esta columna está en el margen de 15 mg/ml de resina. Luego se lava la columna con 3 volúmenes de columna de tampón hipo que contiene 100 mM de NaCl. Se realiza un paso de lavado con nivel medio de sal con 3 volúmenes de columna de tampón hipo que contiene 290 mM de NaCl. La actividad de telomerasa es recuperada por una elución con alto contenido en sal aplicando un tampón hipo que contiene 1430 mM de NaCl. Se dializan separadamente las fracciones de la elución con alto contenido en sal contra el tampón hipo que contiene 250 mM de NaCl durante la noche y se explora para establecer la actividad de telomerasa mediante un ensayo convencional antes de reunirse y someterse al siguiente paso de purificación.

D. Segunda cromatografía con intercambio de aniones

1. Una cantidad de 20 a 40 ml de fracciones activas combinadas procedentes del paso anterior, o sea aproximadamente 240 miligramos de proteínas se diluyen en una proporción de 1 a 1 con tampón hipo antes de cargarse en una columna con 16 ml de Source 15Q de Pharmacia. La columna es habitualmente operada con su máxima capacidad aglutinadora con una tasa de flujo de 5 ml/min en un aparato FPLC (Pharmacia). Según el número de las fracciones reunidas del paso anterior se necesitan pasadas consecutivas. El manejo de la resina, la empaquetadura y la equilibración de la columna se llevan a cabo de la misma manera como se ha descrito para la resina anterior salvo que se utiliza una columna de cromatografía de HR 16/10 (Pharmacia) y porque la capacidad aglutinadora para esta columna está en el nivel de aproximadamente 10 mg/ml de resina. Luego se lava la columna con 3 volúmenes de columna de tampón hipo que contiene 100 mM de NaCl. Se lleva a cabo un paso de lavado con un nivel medio de sal con 3 volúmenes de columna de tampón hipo que contiene 307 mM de NaCl. Se recupera la actividad de telomerasa mediante una elución con alto contenido en sal aplicando un tampón hipo que contiene 1000 mM de NaCl. Se escanean las fracciones de la elución con alto contenido en sal para detectar la actividad de telomerasa mediante un ensayo convencional antes de reunirse y someterse a una cromatografía de afinidad.

Comenzando con el extracto nuclear de 2 X 10^{11} células, este programa de purificación parcial brinda 10 ml con 10 mg/ml de proteína y bastan 2 \mul para lograr la actividad de telomerasa en el ensayo convencional. La pureza relativa de telomerasa es de 100 veces más que el extracto crudo con un rendimiento de aproximadamente 30%. La concentración de telomerasa, a través de un análisis de ARN cuantitativo, es de 0.3 pmoles/ml. Este material es adecuado para lograr una cromatografía de afinidad.

Tampones

Tampón H -- 10 mM de HEPES-KOH, pH de 7.9; 2 mM de MgCl_{2}; 1 mM de EGTA; 10 mM de KCl.

Agregar justamente antes de usar: 1 mM de DTT; 1 mM de Metabisulfito de Sodio; 1 mM de Benzamidina y 0.2 mM de PMSF.

Tampón A -- 20 mM de HEPES-KOH; pH de 7.9; 1 mM de MgCl_{2}; 1 mM de EGTA; 10% de glicerol.

Agregar justamente antes de su uso: 1 mM de DTT; 1 mM de Metabisulfito de Sodio; 1 mM de Benzamidina; 0.2 mM de PMSF; y 5 \mug/ml de Leupeptina.

Tampón C -- 20 mM de HEPES-KOH; pH de 7.9; 1.5 mM de MgCl_{2}; 0.5 mM de EGTA; 20 mM de NaCl; 25% de glicerol.

Agregar justamente antes del uso: 1 mM de DTT; 1 mM de Metabisulfito de Sodio; 1 mM de Benzamidina; y 0.1 mM de PMSF.

Tampón Hipo -- 20 mM de HEPES-KOH; pH de 7.9; 2 mM de MgCl_{2}; 1 mM de EGTA; 10% de glicerol; 0.1% de NP-40.

Agregar justamente antes de su uso: 1 mM de DTT; 1 mM de Metabisulfito de Sodio; 1 mM de Benzamidina; y 0.2 mM de PMSF.

E. Cromatografía de afinidad

Se suplementaron 485 \mul de material reunido activo de Source 15Q con una concentración de proteína de aproximadamente 7 mg/ml con 100 \mug de dT oligonucleótido (30-mero), 125 \mug de ácido poliuridílico (Sigma, St. Luis, MO, número de catálogo P-9528) y 500 picomoles de oligonucleótido 14ab como ligadura (2'-O-metilo, biotinilado, enlazado con disulfuro, oligonucleótido de ARN, Universidad de Yale, New Haven, CT) en un volumen total de 500 \mul. El oligo 14ab tiene la secuencia 5'-cgttcctctt cctgcggcctt-3' (Oligo 14ab) (identificación de secuencia número 7) y cubre los nucleótidos 361-380 del ARN de telomerasa humana.

Después de incubar por 30 minutos a temperatura ambiente, se agrega la mezcla a 4-6 \times 10^{6} partículas de cuentas de MPG®-Estreptavidina (CPG, Lincoln Park, NJ, número de catálogo MSTR0510) material que se equilibró con el tampón A y 700 mM de NaCl y se dejaron sedimentar las cuentas por aproximadamente 10 minutos. Luego se sometieron las cuentas a una separación magnética, se desechó el supernatante y se lavaron las cuentas con 100 \mul de tampón A/700 mM de NaCl. Se resuspendieron las cuentas en un tampón de elución de 20 \mul (Tampón A suplementado con 500 mM de Tris HCl, pH de 8.3 y 100 mM de DTT) y se incubó el material a temperatura ambiente durante 20 minutos con resuspensión frecuente. Nuevamente se sometieron las cuentas a una separación magnética, se recogió el supernatante que contenía la actividad de telomerasa y se utilizó tal cual para la purificación subsiguiente.

F. Cromatografía con gel y aplicando clasificaciones de exclusión

Puede realizarse una actividad de trazado de telomerasa con el empleo de un cromatógrafo con exclusión de ciertos tamaños, en material purificado por afinidad. El material eluido (150 \mul, 2 fmoles de telomerasa/\mul) procedente de una cromatografía por afinidad de 14ab se aplica a una columna que contiene TSK-Gel*G5000PW_{XL} (30 cm \times 7.8 mm, TosoHaas), ya equilibrado este material en el tampón "B". Se eluye la columna en el mismo tampón como una tasa de flujo de 250 \mul/min. Los perfiles de la actividad de la telomerasa, así como las cantidades de hTR se determinan para las diferentes fracciones. La actividad enzimática al igual que el pico de las concentraciones de hTR se encuentran entre 7.0 ml y 7.4 ml de eluyente.

Tampón "B": 0.2 M de Trietilamina-CO_{2}; 1 mM de EGTA; 1 mM de DTT; 1 mM de MgCl_{2}; 1% de Glicerol.

G. Análisis de secuencias de aminoácidos

Las secuencias de aminoácidos de fragmentos de péptidos de b120 e y105 se determinan de la siguiente manera. Se prepararon geles de acrilamida utilizando los protocolos estándar y se mancharon con manchador de plata. En la reducción de gel, la acetamidación y la digestión tríptica fueron similares a los procedimientos publicados (Jeno et al., Analyt. Biochem. 224, 451-455 [1995]; Rosenfeld, et al., Analyt. Biochem. 203, 173-179 [1992]). Después de lavar con 100 mM de NH_{4}HCO_{3} y acetonitrilo, se hincharon las piezas de gel en el tampón de digestión que contenía 50 mM de NH_{4}HCO_{3}, 5 mM de CaCl_{2} y 12.5 ng\mul^{-1} de tripsina (Boehringer Mannheim, grado de secuenciado) a 4ºC. Al cabo de 45 minutos, se aspiró el supernatante y se reemplazó por 5 a 10 \mul del mismo tampón sin tripsina para mantener húmedas las piezas de gel durante la disociación enzimática (37ºC, durante la noche).

Se extrajeron péptidos mediante tres cambios de 5% de ácido fórmico y acetonitrilo y se secó en sentido descendente. Aproximadamente 10 nl de sorbente de POROS R2 (PerSeptive Biosystems) se colocaron en la punta de un aparato capilar con tracción ºC 100F-10 (CEI, Pangbourne). Nótese que no está empaquetada la resina y que no es necesaria la presencia de alguna frita u otro ensamblado de LC de tipo micro. Se utiliza un nuevo aparato capilar y una nueva porción de resina para cada análisis a fin de evitar contaminaciones cruzadas aún al nivel de los femtomoles. Se disolvió la mezcla de los péptidos secos en 10 \mul de 5% de ácido fórmico, se cargó el material en el aparato capilar pre-equilibrado, se lavó y se eluyó con 60% de metanol en 5% de ácido fórmico para introducirlo en el aparato capilar rociador. El volumen de elución es 10 veces mayor que el volumen de la resina lo cual resulta en una buena recuperación de péptidos.

Un nano-electrociado es llevado a cabo en un espectrómetro de masa API III (Perkin-Elmer Sciex, Ontario, Canadá) según se ha descrito (Wilm et al. Analyt. Chem. 68:1-8 [1996]; Mann et al., Analyt. Chem. 66, 4290-4399 [1994]). Para la selección de los iones precursores, se estableció el cuadrúpolo 1 en un nivel apto para transmitir una ventana de la masa de 2 Da. El tamaño del paso para los espectros de la masa en tándem fue de 0.2 Da, y la resolución se ajustó de tal manera que se pudiesen asignar las masas de los fragmentos a un nivel mejor que 1 Da.

Se buscó en el banco de genes para identificar los polipéptidos que contenían las secuencias de los aminoácidos de los fragmentos y105 y b120. La nucleolina (banco de genes M60858 J05584) contenía secuencias de y105 y el homólogo del factor de elongación 2 (banco de genes D21163) contenía secuencias de b120.

La presente invención proporciona métodos novedosos para purificar la telomerasa. En tanto que se han provisto ejemplos específicos, la descripción anterior solamente es ilustrativa y no contiene un elemento de restricción. Muchas variantes de la invención se sufrirían a los expertos en la materia una vez estudiado el presente texto. Debe determinarse el alcance de la invención, por lo tanto, no tanto con referencia a la descripción anterior, sino más bien basándose en las reivindicaciones adjuntas en combinación con su pleno grupo de equivalencias.

Todas las publicaciones y documentos de patente citados en esta solicitud se incorporan en este texto como material de referencia en su totalidad y para todos los fines y en la misma medida como si se hubiera transcrito así cada una de tales publicaciones o documentos de patentes, individuales.

(Tabla pasa a página siguiente)

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Claims (23)

1. Una preparación de proteína telomerasa de mamífero que se puede obtener por un proceso que comprende:

a) separar la proteína telomerasa de otras biomoléculas orgánicas;

b) combinar la proteína telomerasa separada con un oligonucleótido que tiene actividad de unión específica por la telomerasa, y

c) recuperar una fracción más enriquecida del oligonucleótido, produciendo de esta manera una preparación de proteína telomerasa de mamífero que tiene una pureza al menos 2000 veces mayor (en términos de actividad de telomerasa por peso de proteína) que un extracto bruto de células 293.

2. La preparación de la reivindicación 1, donde cuando la proteína telomerasa está asociada con un componente de ARN de telomerasa, la preparación tiene una actividad específica de al menos 1 unidad por 0,2 \mug de proteína en el ensayo de alargamiento de cebador de telómero en el que se separan extensiones de cebadores marcados con ^{32}P en un gel y se detectan usando una pantalla de phosphoimager.

3. La preparación de cualquier reivindicación anterior que contiene telomerasade mamífero a una concentración de 2 femtomoles/\mul.

4. La preparación de telomerasa de cualquier reivindicación anterior, donde la telomerasa tiene una pureza al menos \sim20.000 o \sim60.000 veces mayor que un extracto bruto de células 293.

5. La preparación de telomerasa de la reivindicación 4, que comprende una actividad de telomerasa que se separa en un intervalo de tamaños de 200-2.000 kDa cuando se fracciona por cromatografía de exclusión molecular.

6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el oligonucleótido se reconoce específicamente por la proteína telomerasa.

7. La composición de la reivindicación 1, donde el oligonucleótido es complementario al componente de ARN de telomerasa.

8. La composición de la reivindicación 7, enriquecida combinando una fracción que contiene proteína telomerasa con un oligonucleótido complementario al componente de ARN de telomerasa, y recuperando una fracción más enriquecida.

9. La composición de cualquier reivindicación anterior, donde la telomerasa es humana.

10. Un método para enriquecer la proteína telomerasa de mamífero de un extracto de células de mamífero, que comprende:

a) separar la telomerasa en el extracto de otras biomoléculas orgánicas,

b) poner en contacto la telomerasa separada con un oligonucleótido reconocido específicamente por la proteína telomerasa o que es complementario al componente de ARN de telomerasa (SEC. ID. Nº:1) y

c) recoger una fracción más enriquecida que contiene proteína que se une al oligonucleótido.

11. El método de la reivindicación 10, donde el oligonucleótido es complementario al componente de ARN de telomerasa.

12. El método de la reivindicación 10 ó 11, donde las etapas b) y c) enriquecen la proteína telomerasa en la preparación al menos 90 veces.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10-12, donde la unión al agente de afinidad proporciona un rendimiento de al menos un 29%.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10-13, que comprende añadir a la solución un oligonucleótido que es complementario al componente de ARN de telomerasa unido a un marcador recuperable (tal como biotina); y después separar el oligonucleótido usando una matriz con un agente de unión (tal como avidina) que captura el marcador.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10-14, que comprende combinar una fracción que contiene proteína telomerasa con una matriz de intercambio aniónico (tal como una resina de amina terciaria o cuaternaria) y recoger la proteína que se une.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10-15, que comprende combinar una fracción que contiene proteína telomerasa con una matriz de intercambio catiónico (tal como una matriz con heparina) y recoger la proteína que se une.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10-16, que comprende enriquecer sucesivamente fracciones que contienen proteína telomerasa en una pluralidad de matrices de intercambio iónico diferentes.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10-17, que comprende combinar una fracción que contiene proteína telomerasa con una matriz de selectividad intermedia, y recoger la proteína que se une; donde la matriz de selectividad intermedia es una matriz que tiene al menos uno de los siguientes substituyentes: hidroxiapatita, una poliamina (tal como espermina o espermidina), ácido poliguanílico, un ion metálico divalente (tal como Ni^{++}), un poliaminoácido cargado positivamente (tal como poli-L lisina), una proteína cargada positivamente (tal como histona) o ácido aminofenil-borónico.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10-18 que comprende además separar una fracción que contiene la proteína telomerasa por cromatografía de exclusión molecular capaz de separar moléculas dentro de un intervalo de \sim200 a 2.000 kDa.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10-19, por el que la telomerasa se enriquece en un extracto de células que expresan telomerasa de forma estable.

21. El método de la reivindicación 20, donde el extracto es un extracto de detergente o un extracto nuclear de células 293.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10-21, donde la proteína telomerasa es humana.

23. Uso de una preparación de telomerasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para seleccionar compuestos in vitro para identificar agentes que alteren la asociación de proteínas asociadas a telomerasa.