ES2209184T3

ES2209184T3 - Composiciones que contienen bergamotina para aumentar la biodisponibilidad oral de agentes farmaceuticos.

Info

Publication number: ES2209184T3
Application number: ES98939311T
Authority: ES
Inventors: Kan He; Paul Hollenberg; Thomas F. Woolf
Original assignee: Warner Lambert Co LLC
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1997-08-19
Filing date: 1998-08-11
Publication date: 2004-06-16
Anticipated expiration: 2018-08-11
Also published as: ZA987436B; KR20010023034A; BR9812131A; AU8777098A; DE69819519D1; EP1007034A1; NZ502668A; US6509371B1; ATE253357T1; DK1007034T3; DE69819519T2; KR100510809B1; AU747051B2; WO1999008676A1; CA2291233C; EP1007034B1; CA2291233A1; PT1007034E; JP2001515035A

Abstract

Una composición farmacéutica oral o un supositorio que comprende Bergamotina en su forma aislada y un compuesto que tiene una biodisponibilidad oral menor que 50% mezclados con al menos un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptables.

Description

Composiciones que contienen Bergamotina para aumentar la biodisponibilidad oral de agentes farmacéuticos.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica o un supositorio que comprende Bergamotina (BG) y un compuesto que tiene biodisponibilidad oral baja. La presente invención se refiere al uso de BG para aumentar la biodisponibilidad de los compuestos mediante la coadministración del compuesto con BG.

Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de BG para inhibir el metabolismo enzimático intestinal de compuestos que tienen baja biodisponibilidad. Específicamente, la inhibición del citocromo intestinal P450 3A4 mediante BG disminuye el metabolismo intestinal de los compuestos y aumenta su biodisponibilidad oral. Adicionalmente, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que incluyen BG en combinación con un compuesto que tiene baja biodisponibilidad y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La biodisponibilidad oral se define como la fracción de fármaco inalterada que alcanza la circulación sistémica después de la administración por vía oral. La potenciación de la biodisponibilidad de los agentes farmacéuticos ha atraído mucha atención hacia el desarrollo de fármacos y la farmacología clínica. Ya que el P450 3A4 es el enzima P450 principal expresado en los intestinos e implicado en el metabolismo de un amplio espectro de fármacos usados clínicamente, se considera que es uno de los determinantes principales de la biodisponibilidad oral de estos fármacos. Algunos fármacos costosos, tales como la ciclosporina, FK506, taxol, indinavir, saquinavir, etc., se ha encontrado que son metabolizados ampliamente por P450 3A4. Se ha encontrado que la coadministración de algunos de estos fármacos con inhibidores de P450 3A4 aumenta su biodisponibilidad.

Se ha demostrado que la coadministración oral de zumo de pomelo aumenta significativamente la biodisponibilidad oral de varios fármacos clínicamente usados incluyendo dihidropiridinas (Bailey D.G., Spence J.D., Munoz C., and Arnold J.M.O. Interaction of citrus juices with felodipine and nifedipine., Lancett, 1991;337:268-269 and Bailey D.G., Arnold J.M.O., Bend J.R., Tran L.T., and Spence J.D. Grapefruit juice-felodipine interaction:reproducibility and characterization with the extended release drug formulation. Br.J.Clin. Pharmacol, 1995;40:135-140), ciclosporina A (Ducharme M.P., Warbasse L.H. Characterización with the extended release drug formulation, Br.J.Clin. Pharmacol, 1995;40:135-140, ciclosporina A (Ducharme M.P., Warbasse L.H and Edwards D.J. Disposition of intravenous and oral cyclosporine after administration with grapefruit juice. Clin. Pharmacol. Ther., 1995;57:485-491), midazolam (Kuferschmidt H.H., Ha H.R., Ziegler W.H., Meier P.J., and Krahenbuhl S. Interaction between grapefruit juice and midazolam in humans, Clin. Pharmacol. Ther., 1995;58:20-28), triazolam (Hukkinen S.K., Varhe A., Olkkola K.T., and Neuvonen P.J. Plasma concentrations of triazolam are increased by concomitant ingestion of grapefruit juice, Clin Pharmacol. Ther.,1995;58:127-131), terfenadina (Benton R.E., Hoig P.K., Zamaani K., Cantinela L.R., and Woosley R.L. Grapefruit juice alters terfenadine pharmacokinetics, resulting in prolongation of repolarization on the electrocardiogram. Clin. Pharmacol. Ther., 1996;59:383-388), y etinil-estradiol (Weber A., Jager R., Borner A., Klinger G., Vollanth R., Mathey K., and Balogh A. Can grapefruit juice influence ethinylestradiol bioavailability? Contraception, 1996;53:41-47. Ya que todos estos fármacos son metabolizados principalmente por el citocromo P450 3A4, el enzima P450 intestinal y hepático predominante (Shimada T., andamazaki H., Mimura M., Inui Y., and Guengerich F.P. Interindividual variation in human liver cytochrome P-450 enzymes involved in the oxidation of drugs, carcinogens and chemicals:studies with liver microsomes of 30 Japanese and 30 Caucasians. J. Pharmacol. Exp. Ther.,1994;270:414-422 and Watkins P.B., Wrighton S.A., Schuetz E.G., Molowa D.T., and Guzelian P.S. Identification of glucocorticoid-inducible cytochrome P-450 in the intestinal mucosa of rats and man. J. Clin. Invest., 1987;80:1029-1036), sugiere que el efecto del zumo de pomelo puede ser debido a la inhibición de la actividad de P450 3A4. Más recientemente, se ha demostrado que el zumo de pomelo disminuye drásticamente la inmunoreactividad del contenido de P450 3A4 en los enterocitos de los intestinos humanos sin ningún cambio en el contenido del mRNA de P450 3A4 (Lown K.S., Bailey D.G., Fontana R.J., Janardan S.K., Adair C.H., Fortlage L.A., Brown M.B., Guo W., and Watkins P.B. Grapefurit juice increases felodipine oral bioavailability in humans by decreasing intestinal CYP 3A protein expression. J. Clin. Invest., 1997;99:1-9). Estos resultados sugieren que la degradación de la proteína P450 3A4 se puede acelerar mediante la ingestión de zumo de pomelo (Lown, Supra., 1997). Debido a que la inactivación suicida de P450 3A de rata podría acelerar la degradación de la apoP450 (Correia M.A, Davoll S.H., Wrighton S.A., and Thomas P.E. Degradation of rat liver cytochrome P450 3A after their inactivation by 3,5-dicarbethoxy-2,6-dimethyl-4-ethyl-1,4-dihydropyridina: characterization of the proteolytic system. Arch. Biochem. Biophys., 1992;297:228-238), se ha sugerido que el mecanismo en el que se basa la inactivación de P450 3A4 está implicado en los efectos del zumo de pomelo.

Para identificar los componentes principales del zumo de pomelo responsables del aumento de la biodisponibilidad de algunos fármacos, flavonoides, tales como naringenina, naringina, quercetina, y kaemferol, han sido elegidos como posibles candidatos debido a que han demostrado que inhiben competitivamente la actividad de P450 3A4 in vitro (Miniscalco A., Lundahl J., Regardh C.G., Edgar B., and Eriksson U.G. Inhibition of dihydropyridine metabolism in rat and human liver microsomes by flavonoids found in grapefruit juice. J.Pharmacol. Exp. Ther., 1992;261;1195-1199 and Ghosal A., Satoh H., Thomas P.E., Bush E., and Moore D. Inhibition and kinetics of cytochrome P450 3A4 activity in microsomes from rat, human and cDNA- expressed human cytochrome P450. Drug. Metab. Dispos., 1996;24:940-947). Sin embargo, la administración oral de estos flavonoides no produjo los efectos del zumo de pomelo (Bailey D.G., Arnold J.M.O., Munoz C., and Spence J. Grapefruit juice-felodipine interaction: mechanism, predictability, and effect of naringin. Clin. Pharmacol.Ther., 1993;53;637-642 and Rashid J., McKinstry C., Renwick A.G., Dirnhuber M., Waller D.G., and George C.F. Quercetin, an in vitro inhibitor of CYP3A, does not contribute to the interaction between nifedipino and grapefruit juice. Br. J. Clin. Pharmac., 1993;36;460-463). Recientemente, la purificación por HPLC del extracto de cloruro de metileno del zumo de pomelo a conducido a la identificación de 6',7'-dihidroxibergamotina como un componente del zumo de pomelo que causa la inhibición de la 6\beta-hidroxilasa-testosterona en los microsomas del hígado de ratas inducidas con dexametasona (Edwards D.J., Bellevue F.H., III, and Woster P.M. Identification of 6',7'-dihydroxybergamottin, a cytochrome P450 inhibitor, in grapefruit juice. Drug. Metab. Dispos., 1996;24:1287-1290).

En esta invención se ha encontrado sorprendentemente e inesperadamente que BG es el compuesto principal del zumo de pomelo responsable del mecanismo en el que se basa la inhibición del citocromo humano P450 3A4. Por tanto, la coadministración de un compuesto que tiene baja biodisponibilidad oral en combinación con BG se puede usar para aumentar la biodisponibilidad oral del compuesto.

Sumario de la invención

Por consiguiente, una primera realización de la presente invención proporciona una composición farmacéutica o un supositorio que comprende bergamotina en su forma aislada y un compuesto que tiene una biodisponibilidad oral menor que 50% en mezcla con al menos un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptables.

Una realización adicional añadida de la presente invención, es el uso de bergamotina en su forma aislada para la preparación de una composición farmacéutica oral o un supositorio para inhibir el metabolismo intestinal enzimático de un compuesto que tiene una biodisponibilidad oral menor que 50% y para aumentar la biodisponibilidad de dicho compuesto.

Otra realización de la presente invención es el uso de bergamotina en su forma aislada para la preparación de una composición farmacéutica oral o un supositorio para inhibir el metabolismo intestinal del citocromo P4503 A4.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes que se refieren a las figuras adjuntas 1 a 8, de las que se da a continuación resúmenes reducidos.

La figura 1 muestra los perfiles de HPLC en fase inversa del extracto de zumo de pomelo. El eluido se monitorizó por detección UV a 310 nm, Panel A. Los cromatogramas iónicos reconstruidos para BG [M + H]^{+} de m/z 339, Panel B; BG monohidroxilada, [M + H]^{+} de m/z 355, Panel C; BG bis-hidroxilada [M + H]^{+} de m/z 373, Panel D.

La figura 2 es un espectro MS/MS de iones producto de BG, [M + H]^{+} de m/z 339.

La figura 3 son espectros MS/MS de iones producto de metabolitos de BG-monohidroxilada, [M + H]^{+} de m/z 355, Panel A, 12,9 min (abundancia relativa 39%), Panel B, 17,7 min (6%); Panel C, 18,1 min (11%); Panel D, 19,6 min (7%); Panel E, 24,1 min (37%). Los sitios de oxidación indicados están basados en el comportamiento de disociación inducida por colisión del ión precursor de m/z 355; es decir, el ión producto de m/z 203 corresponde al resto intacto de 5-hidroxipsoraleno y por tanto, se indicada la oxidación de la cadena de isopreno. Los sitios de oxidación específicos no se pueden determinar a partir de los datos MS/MS.

La figura 4 son espectros MS/MS de iones producto de BG bis-hidroxilada, [M + H]^{+} de m/z 373, Panel A; 12,9 min; Panel B 15,9 min. %). Los sitios de oxidación indicados están basados en el comportamiento de disociación inducida por colisión; es decir, el ión de m/z 203 (Panel A) corresponde al resto intacto de 5-hidroxipsoraleno y por tanto, está indicada la oxidación de la cadena de isopreno. La pérdida de formaldehído (Panel B) para dar un ión de m/z 343 se interpretó como indicadora de oxidación alifática. Los sitios de oxidación específicos no se pueden determinar a partir de los datos de MS/MS.

La figura 5 son espectros diferenciales con monóxido de carbono reducido (panel superior) y espectros UV-visible (panel inferior) de la mezcla de reacción de P450 3A4 reconstituida, incubada con BG en presencia de NADPH (- -), con BG en ausencia de NADPH (-\bullet-) y sin BG en presencia de NADPH (- - -), respectivamente. P450 3A4 (0,5 nmol/ml) se incubó con BG 50 \muM en un sistema reconstituido a 37ºC durante 15 minutos como se describe en Métodos y Materiales. Se diluyeron alícuotas de 0,25 ó 0,2 ml de las mezclas de incubación en 1,75 ó 0,8 ml de tampón Hepes 50 mM (pH 7,5) que contenía glicerol al 20% y EDTA 0,5 mM y los espectros diferenciales de P450 con monóxido de carbono reducido y los espectros UV-visible se tomaron respectivamente como se describe en Materiales y Métodos.

La figura 6 son perfiles de HPLC del sistema de P450 3A4 reconstituido después de la incubación con BG 50 \muM en presencia (---) o ausencia de NADPH (- - - -). El eluido se monitorizó a 214 nm y 405 nm (de forma intercalada). Los picos A, B, Y C representan la P450-NADPH-reductasa, citocromo b_{5} y P450 3A4, respectivamente.

La figura 7 muestra la inhibición dependiente del tiempo y la concentración de la actividad de la 6\beta-hidroxilación de testosterona de P450 3A4 por BG en un sistema reconstituido. Los detalles experimentales se describieron en Materiales y Métodos. La concentración de BG en las muestras de preincubación fue 0 \muM (\Box), 5 \muM (\lozenge), 10 \muM (o), 25 \muM (\Delta), 50 \muM (\triangledown), y 100 \muM (X), respectivamente.

La figura 8 muestra la inhibición de BG de las actividades de P450 1A2 (), 2A6 (\lozenge), 2C9 (\Box), 2D6 (\Delta), 2E1 (X), y 3A4 (o), en microsomas de hígado humano por BG. Las actividades de los enzimas P450 se determinaron usando los métodos descritos en Materiales y Métodos. Los resultados se expusieron como media de los tres experimentos.

Descripción detallada de la invención

El término "baja biodisponibilidad oral" se refiere a un compuesto que tiene una biodisponibilidad oral menor que 50%. Preferiblemente menor que 30%.

Bergamottin, también conocida como 5-geranoxipsoraleno, bergamotina o bergaptina, se conoce químicamente como (E)-4-[3,7-dimetil-2,6-octadienil)oxi]-7H-furol[3,2-g][1]benzopiran-7-ona y tiene la siguiente estructura química:

1

La siguiente tabla 1 proporciona una lista de abreviaturas y sus definiciones, usadas en la presente invención.

Abreviatura	Definición
NADPH	Dinucleótido de nicotinamida y adenina
GSH	Glutatione
LC/UV	Cromatografía líquida/espectroscopía Ultravioleta
LC/MS	Cromatografía líquida/espectroscopía de masas
HPLC	Cromatografía líquida de alta resolución
ESI	Ionización por electropulverización
CID	Disolución inducida por colisión
MgCl_{2}	Cloruro de magnesio
EDTA	Ácido etilendiaminotetraácético
CO	Monóxido de carbono
BG	Bergamotina
IC_{50}	Concentración para inhibición media
K_{inactivación}	Constante de velocidad máxima de inactivación
K_{I}	Constante requerida para la inactivación media máxima
P450	Citocromo P450

Se ha identificado la bergamotina como un compuesto principal en el zumo de pomelo responsable del mecanismo de inactivación de P450 3A4. Se identificaron también en el zumo de pomelo varios derivados de BG monooxigenados o dihidroxilados. El contenido de dihidroxibergamotinas, una de las cuales se aisló previamente y se identificó para la inhibición de la 6\beta-hidroxilasa de la testosterona en los microsomas del hígado de rata (Edwards, Supra, 1996), se determinó que representaba menos que 20% del contenido de BG en el zumo de pomelo. La mayoría de los derivados de BG en el zumo de pomelo contienen el grupo furanocumarina intacto, el cual se presume que es el responsable de la inactivación de los P450. La bergamotina y sus derivados mono- o di-hidroxilados no se observaron en el zumo de naranja, lo cual es consecuente con las publicaciones de que el zumo de naranja no causa tales efectos inhibitorios sobre el metabolismo intestinal del fármaco (Bailey, Supra., 1991). El contenido de BG y sus derivados puede variar significativamente entre las diferentes preparaciones de zumo de pomelo, lo que podría explicar la discrepancia publicada en relación con el efecto del zumo de pomelo (Vanakoski J., Mattila M.J., and Seppala T. Grapefruit juice does not enhance the effects of midazolam and triazolam in man. Eur. J. Clin. Pharmacol., 1996;50:501-508).

La inactivación de la actividad de P450 3A4 era dependiente del tiempo y la concentración y también requería el metabolismo de BG. Estos resultados sugieren que BG es un inactivador de P450 3A4, en el que se basa el mecanismo (Walsh C.T. Suicide substrates, mechanism-based enzyme inactivation: recent developments. Ann. Rev. Biochem., 1984;53:493-535). Se han publicado previamente varias otras furanocumarinas que causan el mecanismo en el que se basa la inactivación de los P450, por ejemplo, corandrina (Cai Y., Baer-Dubowska W., Ashwood-Smith M.J., Ceska O., Tachibana S., and DiGiovanni J. Mechanism-based inactivation of hepatic ethoxyresorufin O-dealkylation activity by naturally occurring coumarins. Chem. Res. Toxicol., 1996;9:729-736) y 8-metoxipsoraleno (Labbe G., Descariote V., Beaune P., Letteron P., Larrey D., and Pessayre D. Suicide inactivation of cytochrome P-450 by methoxsalen, evidence for the covalent binding of a reactive intermediate to the protein moiety. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1989;250:1034-1042 and Mays D.C., Hilliard J.B., Wong D.D., Chambers M.A., Park S.S., Gelboin H.V., and Gerber N. Bioactivation of 8-methoxypsoralen and irreversible inactivation of cytochrome P-450 in mouse liver microsomes: modification by monoclonal antibodies, inhibition of drug metabolism and distribution of covalent adducts. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1990;254:720-731). Se sugirió que el anillo de furano era el grupo responsable de la inactivación de P450 1A basándose en los estudios de una serie de cumarinas de origen natural (Cai, Supra, 1996). Se ha demostrado también que algunos otros compuestos que contienen furano causan la inactivación de P450. Un ejemplo es la furanopiridina L-754.394, un inhibidor de la proteasa del HIV se demostró que causa un mecanismo en el que se basa la inactivación P450 3A4 mediante la formación de un epóxido químicamente reactivo en el anillo de furano (Chiba M., Nishine J.A., and Lin J.H. Potent and selective inactivation of human liver microsomal cytochrome P-450 isoforms by L-754,394, an investigational HIV protease inhibitor. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1995;275:1527-1534; Sahali-Sahly Y., Balani S.K., Lin J.H., and Baillie T.A. In vitro studies on the metabolic activation of the furanopyridine L-754,394, a highly potent and selective mechanism-based inhibitor of cytochrome P450 3A4. Chem. Res. Toxicol., 1996;9:1007-1012). Se presume que la inactivación de P450 3A4 basada en un mecanismo mediado por BG sigue un mecanismo similar en el que el anillo de furano es activado a un intermedio reactivo que modifica covalentemente un resto crítico en el sitio activo del enzima. La inactivación parece que tiene lugar en el sitio activo debido a que no se inhibe por la adición de 2 ó 3 \dagger mM GSH al sistema de incubación. El valor de K_{inactivación} para la inactivación de P450 3A4 mediada por BG de 0,3 min^{-1} indica que BG es uno de los más potentes inactivadores de P450 3A4. Los valores de K_{inactivación} para otros dos potentes inactivadores son 0,4 min^{-1} para gestodeno (Guengerich F.P. Mechanism-based inactivation of human liver microsomal cytochrome P-450 IIIA4 by gestodene. Chem. Res. Toxicol., 1990;3:363-371) y 1,62 min^{-1} para L-754.394 (Chiba M., Supra, 1995;275:1527-1543). Adicionalmente, se encontró que BG era más potente que 6',7'-dihidroxibergamotina cuya K_{inactivación} se determinó que era 0,16 min^{-1} para la inactivación de P450 3A4 en el sistema reconstituido. BG también parece ser un inhibidor competitivo de P450 3A4. Esto es consecuente con la observación de que BG se metaboliza principalmente a varios metabolitos hidroxilados por P450 3A4. Sin embargo, la inhibición competitiva puede ser sobreestimada porque P450 3A4 puede sufrir algún mecanismo en el que se basa la inactivación por BG durante la determinación de la actividad de la 6\beta-hidroxilación de la testosterona.

Ya que la actividad de P450 3A4 se ha publicado que es estimulada por la \alpha-naftoflavona (Ueng Y.F., Kuwabara T., Chun Y.J., and Guengerich F.P. Cooperativity in oxidations catalyzed by cytochrome P450 3A4. Biochemistry, 1997;36:370-381), se investigó la posibilidad de que la \alpha-naftoflavona pudiera tener un efecto sinergístico sobre la generación del metabolito reactivo de BG que podría llevar después a aumentar la inactivación. Los resultados de esta invención indican que la \alpha-naftoflavona no tiene efecto sobre la inactivación de P450 3A4 mediada por BG. Sin embargo, no está claro si la \alpha-naftoflavona estimula la hidroxilación de BG catalizada por el citocromo P450 3A4.

Se exploró preliminarmente en el presente estudio el mecanismo de inactivación de P450 3A4 mediado por BG. La formación del aducto Heme está bien documentada que es el mecanismo para la inactivación de P450 por olefinas terminales y acetilenos (Ortiz de Montellano P.R. and Correia M.A, Inhibition of cytochrome P450. In Cytochrome P450-Structure, Mechanism and Biochemistry (Ortiz de Montellano P.R., Ed. pp 305-366, Plenum Press, New York). Recientemente, el aducto heme formado en un sistema recontituido se identificó y caracterizó por espectroscopía visible, HPLC y espectroscopía de masas (He K., Falick A.M., Chen B., Nilsson F., and Correia M.A. Identification of the heme adduct and an active site peptide modified during mechanism-based inactivation of rat liver cytochrome P450 2B1 by secobarbital. Chem. Res. Toxicol., 9:614-622 and He K., He Y.A., Szklarz G.D., Halpert J.R., and Correia M.A. Secobarbital-mediated inactivation of cytochrome P450 2B1 and its active site mutants: partitioning between heme and protein alkylation and epoxidation. J. Bol. Chem., 1996;271:25864-25872). El espectro visible de la muestra de P450 3A4 inactivada por BG no mostró ningún signo de formación del aducto heme. El único pico de absorción observado en el espectro diferencial frente al testigo de NADPH en el intervalo de 400 a 500 nm fue a aproximadamente 423 a 425 nm, lo que se presume que es debido a P450 reducido por NADPH. El espectro de absorción mostró también que el contenido de heme no disminuía significativamente para P450 3A4 inactivado por BG incluso aunque la muestra perdiera 90% de la actividad de la 6\beta-hidroxilación de la testosterona. Este resultado parece excluir el otro mecanismo alternativo implicado en el mecanismo en que se basan varios inactivadores en el que causan la fragmentación del grupo heme lo que lleva a la unión covalente del fragmento heme a la apoproteína (Ortiz de Montellano, Supra., 1995 and Yao K, Falick A.M., Patel N., and Correia M.A. Cumene hydroperoxide-inactivation of cytochrome P450 2B1: identification of an active site heme-modified peptide. J. Biol. Chem., 1993;268:59-65). Sin embargo, el espectro diferencial con CO reducido de P450 3A4 disminuyó en aproximadamente 40% después del tratamiento con BG en un sistema reconstituido. Debido a que no hay ninguna evidencia de la destrucción de heme o de la formación del aducto heme, es posible que la BG unida pueda estar posicionada cerca del resto heme mediante unión covalente a un sitio activo de residuo de aminoácido, de tal manera que interfiere con la interacción de CO con el grupo Heme ferroso. Los estudios de la inactivación de P450 por otra furanocumarina, 8-metoxipsoraleno, sugieren que la unión covalente del 8-metoxipsoraleno al sitio activo de apoP450 podría explicar la pérdida del espectro con CO reducido de P450 (Labbe, Supra, 1989 and Mays, Supra, 1990). El análisis por HPLC de P450 3A4 inactivado por BG proporciona una evidencia indirecta que sugiere que BG podría modificar la apoP450. La pérdida parcial de la apoproteína parece ser una característica común del enzima P450 inactivado por la modificación de la proteína cuando la mezcla de incubación de P450 se analiza por HPLC en fase inversa (Roberts E.S., Hopkins N.E., Alworth D.A., and Hollenberg P.F. Mechanism-based inactivation of cytochrome P450 2B1 by 2-ethynylnaphthalene: Identification of an active site peptide. Chem. Res. Toxicol., 1993;6:470-479 and He K., Supra, 1996). Se podría esperar que algunos sitios activos hidrófobos de residuos de aminoácidos del P450 inactivado están expuestos de modo que se unen estrechamente al medio de fase inversa como resultado de los cambios de conformación inducidos por la unión covalente. La modificación covalente de apoP450 también se ha publicado previamente que es un mecanismo para la inactivación de P450 por algunas otras furanocumarinas (Labbe, Supra., 1989; Cai, Supra., 1996; Mays, Supra., 1990). Por tanto, la inactivación de P450 3A4 mediada por BG parece que se debe principalmente a la modificación de la apoproteína, como se ha observado con 2-etinilnaftaleno y 9-etinilfenantreno para el mecanismo en que se basa la inactivación de P450 2B1 y 2B4 (Roberts E.S., Hopkins N.E., Zaluzec E.J., Gage D.A., Alworth W.L., and Hollenberg P.F. Identification of active-site peptides from 3H-labeled 2-ethynylnaphalene-inactivated P450 2B1 and 2B4 using amino acid sequencing and mass spectrometry. Biochemistry, 1994;33:766-3771 and Roberts E.S., Hopkins N.E., Zaluzec E.J., Gage D.A., Alworth W.L., and Hollenberg P.F. Mechanism-based inactivation of cytochrome P450 2B1 by 9-ethynylphenanthrene. Arch. Biochem. Biophys., 1995;323:295-302).

Aunque la inhibición o la inactivación de P450 3A4 por BG y sus derivados es importante para entender el efecto del zumo de pomelo sobre la biodisponibilidad de varios fármacos usados clínicamente que se sabe que son metabolizados en gran extensión por el P450 3A4 intestinal, también se determinó en esta invención si BG inhibe también las actividades de otros P450 humanos. Se demostró que BG inhibía las actividades de varios P450 humanos incluyendo 1A2, 2A6, 2C9, 2C19, 2D6, y 2E1. debido a que el efecto del zumo de pomelo parece manifestarse principalmente a nivel de los intestinos, la contribución de cada enzima P450 al efecto puede ser dependiente de su nivel de expresión en los intestinos. P450 3A4 es el enzima P450 intestinal más abundante, mientras que los otros P450, tales como 1A, 2A, 2C, 2D y 2E, son pobremente expresados en los intestinos (Watkins, Supra, 1987 and Peters W.H.M. and Kremers P.G. Cytochrome P450 in the intestinal mucosa of man. Biochem. Pharmacol, 1989; 38:1535-1538). Se sospecha que BG y sus derivados pueden ser pobremente absorbidos o ampliamente metabolizados en el tubo digestivo de modo que tienen poca ocasión de inactivar o inhibir los P450 del hígado.

Ciertos fármacos usados clínicamente son ampliamente metabolizados por P450 3A4 y por tanto tienen una biodisponibilidad oral relativamente baja (Bertz R.J. and Granneman R., Clin. Pharmacokinet., 1997;32:210-258). La tabla 2 muestra la fracción metabolizada y la biodisponibilidad oral de diferentes fármacos usados clínicamente. Por tanto, la pobre absorción de estos fármacos se debe al metabolismo de primer paso de P450 3A4 en el tubo digestivo. Se ha demostrado que la biodisponibilidad oral de algunos de estos fármacos aumenta significativamente por la coadministración con zumo de pomelo. Se ha descubierto en esta invención que la biodisponibilidad oral de estos fármacos se puede mejorar por la formulación o coadministración con BG, la furanocumarina principal del zumo de pomelo.

Ya que el nivel de expresión del P450 3A4 intestinal varía significativamente entre los individuos, se ha considerado como uno de los factores principales que contribuyen a la variabilidad entre individuos del metabolismo del fármaco y de los efectos del fármaco. Se ha descubierto además que tal variabilidad se puede reducir por la inactivación de P450 3A4 intestinal mediante la coadministración de BG.

Los siguientes son ejemplos de fármacos usados clínicamente que tienen pobre biodisponibilidad: Ciclosporina y Tacrolimo son potentes agentes inmunodepresivos usados en los trasplantes y en el tratamiento de trastornos autoinmunes seleccionados. La Rapamicina está bajo desarrollo clínico para uso en trasplantes y en el tratamiento de trastornos autoinmunes. Todos estos agentes han demostrado que son metabolizados ampliamente por P450 3A4. La Ciclosporina, Tacrolimo, y Rapamicina se absorben pobremente, variando la biodisponibilidad oral entre 15% a 30%, 15% a 20%, y 10% a 20%, respectivamente. Saquinavir, un inhibidor de la proteasa del HIV, se absorbe muy pobremente con una biodisponibilidad oral de 1% a 9%. Se ha demostrado que P450 3A4 es el enzima fundamental responsable del metabolismo de Saquinavir. Otros inhibidores de la proteasa del HIV, tales como Indinavir y Ritonavir, son metabolizados también principalmente por P450 3A4 y tienen una biodisponibilidad oral relativamente baja. Varias dihidropiridinas usadas como bloqueantes de los canales de calcio, tales como Felodipino, Isradipina, Nifedipino, Nimodipino y Nisoldipino, son metabolizadas principalmente por P450 3A4. Su pobre biodisponibilidad oral (5%-20%) se ha demostrado que es debida principalmente al metabolismo de primer paso. Se ha demostrado que la biodisponibilidad oral de algunas de las dihidropiridinas aumenta por la coadministración con zumo de pomelo. La Atorvastatina, un agente hipolipidémico e hipocolesterolémico, se metaboliza principalmente por P450 3A4. La biodisponibilidad oral es sólo de 14% a 30%. Todos estos agentes se pueden combinar con BG y administrar a un paciente para aumentar su biodisponibilidad oral. Adicionalmente, otros agentes listados en la tabla 2 se pueden combinar también con BG para aumentar su biodisponibilidad oral.

TABLA 2 Fármacos usados clínicamente que tienen pobre biodisponibilidad oral que son metabolizados principalmente por P450 3A4

Fármaco	Fracción metabolizada (%)	Biodisponibilidad oral (%)
Ciclosporina	>90	30-15
Tacrolimo (FK 506)	>90	20-15
Sirolimús (rapamicina)	>90	20-10
Indinavir	Alta	\sim30
Ritonavir	>90	60-80
Saquinavir	>90	1-9
Felodipino	>90	15-25
Isradipina	>90	15-25
Nicardipino	>90	20-30
Nisoldipino	>90	\sim5
Nimodipino	>90	15-10
Nitrendipino	>90	16-6
Nifedipino	>90	40-60
Verapamil	>90	20-30
Etopósido	\sim50	35-70
Tamoxifeno	>90
Vinblastina	\sim50	Pobre
Vincristina	\sim50	Pobre
Taxol
Atorvastatina		14-30
Fluvastatina	\sim90	50-9
Lovastatina	>90	<5
Pravastatina	>50	25-10
Simvastatina	\sim60	<5
Terfenadina	>90	\sim1
Loratadina	>90	Baja
Astemizol	>90	Baja
Anfeltanil	>90	Muy baja
Carbamazepina	>90	>70
Azitromicina	30-35	35-45
Claritromicina	>70	50-55
Eritromicina	>90	30-65
Itraconazol	>90	44-55
Rifabutina	>90	20-12
Lidocaina	>90	25-45
Cisaprida	>90	35-40
Sertralina	>90
Pimozida	>90	<50
Triazolam	>90	45-70
Midazolam	>90	40-50
Testosterona	>90	Pobre
Medroxiprogesterona	>90	<20
Ergotamina	>90	<1

Identificación de BG y sus derivados en el zumo de pomelo

Se separaron varios componentes del extracto de acetato de etilo del zumo de pomelo por HPLC bajo las condiciones descritas en Métodos y Materiales (figura 1). El análisis estructural de los picos del componente por LC-MS/MS reveló que el pico con un tiempo de retención de 26 minutos era BG (figura 1). El espectro de iones producto y el tiempo de retención de HPLC fueron idénticos al del estándar auténtico (figura 2). El ión fragmento predominante de m/z 203 corresponde al resto 5-hidroxipsoraleno que subsiguientemente se fragmenta para dar iones de m/z 174, 159, y 147 por pérdida de CO, CO_{2}, C_{2}H_{2}O_{2}, respectivamente. El ión fragmento de m/z 137 corresponde a la cadena lateral restante. Como se muestra en la figura 1, hay al menos cinco productos BG monooxigenados presentes en el zumo de pomelo. Sus estructuras propuestas se muestran en la figura 3. Hay al menos dos productos principales de BG dihidroxilado en el zumo de pomelo. El componente que eluye a los 13 minutos tiene un espectro de iones producto y un tiempo de retención en HPLC idéntico a la 6',7'dihidroxivergamotina (véase figura 4). El ión molecular protonado de m/z 340 del componente que eluye a los 24 minutos sufrió una fragmentación por disociación (CID) inducida por colisión para dar un iones producto principal de m/z 168 que sugeriría que este componente no es un derivado de BG. La propia BG parece ser la furanocumarina predominante en el extracto de zumo de pomelo con acetato de etilo por determinación por LC/UV. Adicionalmente, se encontró que BG se une a la columna C18 tan estrechamente que no es posible eluir desde la columna con metanol al 60%, condición previamente usada para identificar la 6',7'-dihidroxibergamotina en el zumo de pomelo (Edwards, Supra, 1996).

El análisis por LC/UV de los extractos de acetato de etilo del zumo de naranja indicó que no hay BG detectable en el zumo de naranja.

Inactivación de P450 3A4

La incubación de P450 3A4 con BG en el sistema reconstituido dio como resultado una pérdida de 90% de la actividad de 6\beta-hidroxilación de la testosterona (tabla 3). Aproximadamente 60% de la actividad de P450 se inhibió también en ausencia de NADPH en el sistema reconstituido (Tabla 2). Sin embargo, incluso cuando las muestras se diluyeron 20 veces para la determinación de la actividad de 6\beta-hidroxilación de la testosterona, todavía contenían BG 2,5 \muM. A esta concentración se encontró que BG inhibía la actividad de P450 3A4 en aproximadamente 55% en experimentos separados. Además, los contenidos de P450 medidos por el espectro con CO reducido disminuyeron en aproximadamente 40% después de 15 minutos de incubación de P450 3A4 con BG en presencia de NADPH (Tabla 3). No hubo formación de un pico a 420 nm u otra absorción en lugar de la de 450 nm en el intervalo de 400 a 500 nm para el espectro diferencial de P450 reducido por CO (figura 5). La absorción máxima del espectro absoluto fue a 425 nm para P450 3A4 inactivado por BG. Se corrió aproximadamente 2 nm a una longitud de onda mas larga en comparación con P450 3A4 en presencia de NADPH sin BG. No hubo ninguna indicación de destrucción del grupo heme; sin embargo, hubo una pequeña mejora de la absorción máxima por P450 3A4 inactivado por BG (figura 5). El contenido de P450 también disminuyó en una magnitud similar cuando se usó como referencia la muestra de -NADPH/+BG. Este método se considera que reduce la interferencia en la determinación de P450 por CO generado endógenamente durante la incubación (Correia M.A., Decker C., Sugiyama K., Underwood M., Bornheim L., Wrighton S.A., Rettie A.E., and Trager W.F. Degradation of rat hepatic cytochrome P450 heme by 3,5-dicarbethoxy-2,6-dimethyl-4-ethyl-1,4-dihydropyridine to irreversibly bound protein adducts. Arch. Biochem. Biophys., 1987;258:436-451).

Análisis por HPLC de P450 3A4 inactivado por BG

Como se muestra en la figura 6, la cantidad de apoP450 3A4 disminuyó selectivamente hasta aproximadamente 50% cuando la muestra que contenía P450 3A4 inactivado por BG se analizó por HPLC de fase inversa sobre una columna Poros. Se recuperaron de la columna cerca de 100% de la reductasa y la proteína del citocromo b5 cuando se comparó con testigos de -NADPH. Se recuperó aproximadamente 90% de heme de la muestra que contenía P450 3A4 inactivado por BG, lo que estaba de acuerdo con los resultados obtenidos de los análisis espectrales. No se pudo detectar ningún pico heme modificado usando estas condiciones de HPLC.

Inactivación de P450, dependiente del tiempo y la concentración, por BG

Como se muestra en la figura 7, la inactivación de P450 3A4 mediada por BG en un sistema reconstituido era dependiente del tiempo y la concentración así como requería el metabolismo de BG. La inactivación presentó cinéticas de pseudo primer orden con respecto al tiempo. Se uso el análisis de regresión lineal de los datos de la figura 7 para determinar las constantes de velocidad inicial de inactivación (K_{obs}). Los trazados dobles recíprocos de los valores de K_{obs} y las concentraciones de BG dieron una constante de velocidad máxima (K_{inactivación}) para la inactivación de 0,3 min^{-1} y una concentración de inactivador requerida para la inactivación máxima media (Ki) de 7,7 \muM (Walsh, Supra, 1984). Se observó también una inhibición dependiente de la concentración para la muestra sin preincubación. Esto era consecuente con el resultado de la muestra de -NADPH/+BG en la tabla 3.

Efecto de la \alpha-naftoflavona sobre la inactivación mediada por BG

Se ha publicado que la \alpha-naftoflavona estimula el metabolismo de varios sustratos por P450 3A4 (Ueng, Supra, 1997). Por tanto, se decidió asegurarse si incrementaría la formación del metabolito reactivo de BG, y subsiguientemente potenciaría la inactivación de P450 3A4. La \alpha-naftoflavona no cambia la potencia de la inactivación de P450 3A4 mediada por BG. La actividad de 6\beta-hidroxilación de la testosterona de 3A4 se inactivó en aproximadamente 55% con BG 2 \muM cuando la \alpha-naftoflavona se incubó simultáneamente en la mezcla de reacción a las concentraciones finales que variaban entre 6 y 50 \muM. No se usaron concentraciones más altas de \alpha-naftoflavona debido a la limitación de la solubilidad.

Inhibición de los enzimas P450 microsomales de hígado humano por BG

Como se muestra en la figura 8, las actividades de P450 1A2, 2A6, 2C9, 2D6, 2E1, y 3A4 en los microsomas de hígado humano fueron inhibidas por BG. Los IC_{50} fueron aproximadamente X, X, 2,4, 3,0, 3,9, y 4,6 \muM para P450 1A2, 2A6, 2C9, 2D6, 2E1, y 3A4, respectivamente. Aproximadamente 71% y 100% de la actividad de P450 2C19 fue inhibida por BG 2 y 20 \muM, respectivamente.

TABLA 3 Inactivación de P450 3A4 mediada por Bergamotina (BG) en un sistemaª reconstituido

	P450 (nmol/ml)	6\beta-hidroxilación de testosterona
		(nmol/min/nmol)
BG-/NADPH+	0,44	7,9
BG+/NADPH-	0,47	2,9
BG+/NADPH+	0,27	0,8
ªP450 3A4 (0,5 nmol/ml) se incubó con BG 50 \muM en un sistema reconstituido a 37ºC durante 15 minutos como
se describe en Métodos y Materiales. Una alícuota (0,05 ml) de mezcla de incubación se diluyó en 0,95 ml de
tampón Hepes 50 mM (pH 7,5) para la determinación de la actividad de 6\beta-hidroxilación de la testosterona.

Los compuestos de la presente invención se pueden preparar y administrar en una amplia variedad de formas farmacéuticas orales.

Para preparar las composiciones farmacéuticas a partir de los compuestos de la presente invención, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser o sólidos o líquidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, sellos, supositorios, y gránulos dispersables. Un vehículo sólido puede ser una o más sustancias que pueden actuar también como diluyentes, agentes aromatizantes, aglutinantes, conservantes, agentes desintegrantes del comprimido, o un material encapsulante.

En forma de polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que está mezclado con el componente activo finamente dividido.

En forma de comprimidos, el componente activo se mezcla con el vehículo que tiene las propiedades aglutinantes necesarias en las proporciones adecuadas y se compacta en la forma y el tamaño deseados.

Los polvos y los comprimidos contienen preferiblemente de cinco o diez a aproximadamente setenta por ciento del compuesto activo. Los vehículos adecuados son carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, una cera de bajo punto de fusión, mantequilla de coco, y similares. El término "preparación" se pretende que incluya la formulación del compuesto activo con el material de encapsulado como un vehículo que proporciona una cápsula en la cual el componente activo con o sin otros vehículos, esta rodeado por un vehículo, que está, por tanto, en asociación con él. Similarmente, están incluidos los sellos y los comprimidos para chupar. Los comprimidos, polvos, cápsulas, píldoras, sellos, y comprimidos para chupar se pueden usar como formas farmacéuticas sólidas adecuadas para la administración oral.

Para preparar los supositorios se funde primero una cera de bajo punto de fusión, tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos o mantequilla de coco, y el componente activo de dispersa homogéneamente en ella, con agitación. La mezcla homogénea fundida se vierte después en moldes de tamaño conveniente, se deja que se enfríe, y por tanto que solidifique.

Las preparaciones de forma líquida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones, por ejemplo agua o soluciones de propilenglicol en agua.

Las soluciones acuosas adecuadas para uso oral se pueden preparar disolviendo el componente activo en agua y añadiendo agentes colorantes, aromatizantes, estabilizantes y espesantes adecuados como se desee.

Las suspensiones acuosas adecuadas para uso oral se pueden preparar dispersando el componente activo finamente dividido en agua con un material viscoso, tal como gomas naturales o sintéticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y otros agentes de suspensión bien conocidos.

También están incluidas preparaciones en forma sólida que están pensadas para convertirse, justo antes del uso, en preparaciones en forma líquida para la administración oral. Tales formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones, y emulsiones. Estas preparaciones pueden contener, además del componente activo, agentes colorantes, aromatizantes, estabilizantes, tampones, edulcorantes artificiales o naturales, dispersantes, espesantes, solubilizantes, y similares.

La preparación farmacéutica está preferiblemente en una forma farmacéutica unitaria. En tal forma la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma farmacéutica unitaria puede ser una preparación envasada, conteniendo el envase cantidades discretas de la preparación, tales como comprimidos envasados, cápsulas, y polvos en viales o ampollas. También, la forma farmacéutica unitaria pueden ser las propias cápsulas, comprimidos, sellos, o comprimidos para chupar, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estas formas envasadas.

La cantidad de componente activo en una preparación de dosis unitaria se puede variar o ajustar de 0,1 mg a 100 mg, preferiblemente de 0,5 mg a 20 mg según la aplicación particular y la potencia del componente activo. La composición, si se desea, puede contener también otros agentes terapéuticos compatibles.

En el uso terapéutico, los compuestos utilizados en el método farmacéutico de esta invención se administran a una dosis inicial de BG de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 mg por kilogramo, al día. Se prefiere un intervalo de dosis diario de BG de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 0,1 mg por kilogramo. La dosis terapéutica apropiada de los compuestos de la presente invención que se puede combinar con BG es conocida por los expertos en la técnica. Las dosis, sin embargo, se pueden variar dependiendo de los requerimientos del paciente, la severidad del estado a ser tratado, y el compuesto a ser empleado. La determinación de la dosis apropiada para una situación particular está dentro de la experiencia de la técnica. Generalmente, el tratamiento se inicia con pequeñas dosis que son menores que la dosis óptima del compuesto. A partir de ahí, se aumenta la dosis con pequeños incrementos hasta que se alcanza el efecto óptimo según las circunstancias. Según convenga, la dosis diaria total se puede dividir y administrar en porciones durante el día, si se desea.

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran los métodos preferidos en esta invención para preparar los compuestos de la invención.

Materiales y métodos Productos químicos

NADPH, L-\alpha-dilauroil- y L-\alpha-dioleil-sn-glicero-3-fosfocolinas, fosfatidilserina, catalasa, GSH, hidrocloruro del ácido \delta-aminolevulínico, testosterona, 6\beta- y 11\beta-hidroxitestosterona, clorzoxazona, cumarina, tolbutamida, se adquirieron de Sigma Chemical Company (St Louis, MO). 7-hidroxicumarina (umbeliferona) se obtuvo de Aldrich (Milwaukee, WI), 4-hidroximetiltolbutamida, 6-hidroxiclorzoxazona, 4'-hidroximefenitoina, bufurolol racémico, y 1'-hidroxibufurolol se obtuvieron de Gentest Corp. (Woburn, MA). Isopropil-\beta-D-tiogalactosidasa se adquirió de Calbiochem Corp. (La Jolla, CA). (S)-mefenitoina fue un regalo del Dr. W.F. Trager (University of Washington, Seattle, WA). La Bergamotina se adquirió de Indofine Chemical Company, Inc (Somerville, NJ):

Ejemplo 1 Identificación por LC-MS/MS de BG y sus derivados en el zumo de pomelo

Se prepararon zumo de pomelo y zumo de naranja exprimiendo a mano mitades de pomelos o naranjas de Florida, respectivamente. Se extrajo el zumo con acetato de etilo, y los extractos secos se disolvieron en el tampón para HPLC para el subsiguiente análisis. La identificación por LC/MS de los componentes se realizó usando un espectrómetro de masas Quattro II triple quadrupole (Micromass, Manchester, UK). La introducción de la muestra y la ionización fue por ionización por electropulverización (ESI) en el modo de ión positivo (voltaje en cono de 30 v). Los datos de barrido se obtuvieron bajo el control del sistema de datos Micromass Masslynx NT (Version 2,22). Los componentes del zumo de pomelo se separaron por HPLC con una columna C18 (Zorbax XDB 5 \mum, 2,1 x 150) eluida con ácido acético 100 mM (A) y acetonitrilo (B) con un gradiente de 30% de B durante 5 minutos y después de 30% a 70% de B durante 25 minutos a un caudal de 200 \mul/minuto. Las determinaciones de los pesos moleculares se realizaron por espectros de masas de captura a lo largo de un intervalo de masas de 100 a 500 amu a una velocidad de barrido de 1,0 segundos/serie de diez. Las determinaciones de la estructura molecular se realizaron por captura de barridos MS/MS de iones producto a una velocidad de 1,0 segundos/serie de diez. La activación de colisión se logró usando argón a una presión celular del gas indicada de 0,2666 x 10^{-3}Pa (2,0 x 10^{-3} torr) y una energía de colisión de 20 eV.

Ejemplo 2 Expresión de P450 3A4 y purificación del enzima expresado

Un cDNA de P450 3A4 de longitud completa (excepto por la deleción de los codones 3-12 en el extremo 5' terminal) introducido por ingeniería genética en el vector pCW se obtuvo del Dr. R. W. Estabrook (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX). El vector que contenía P450 3A4 se transformó dentro de las células MV1304. El crecimiento de la E. coli. transformada se llevó a cabo en un cultivo Terrific modificado, y se indujo la expresión de P450 A4 por la adición de isopropil-\beta-D-tiogalactosida 1 mM. Se añadió ácido \delta-aminolevulínico (0,5 mM) para aumentar la síntesis de heme. Se preparó la fracción de la membrana a partir de células bacterianas por tratamiento con ultrasonidos después de tratamiento con lisozima y subsiguientemente se aisló del homogenato de células bacterianas por centrifugación diferencial. P450 3A4 se purificó hasta homogeneidad por cromatografía en una columna DE52 de las membranas solubilizadas en detergente como se ha descrito previamente (Gillam E.M., Baba T., Kim B.R., Ohmori S., and Guengerich F.P. Expression of modified human cytochrome P450 3A4 in Escherichia coli and purification and reconstitution of the enzyme. Arch. Biochem. Biophys., 1993;305:123-131).

Ejemplo 3 Aislamiento de la P450-citocromo-NADPH-reductasa y del citocromo b5

La P450-citocromo-NADPH-reductasa y el citocromo b5 se purificaron por los métodos descritos previamente a partir de microsomas del hígado de ratas Long-Evans tratadas con fenobarbital (Waxman D.J. and Walsh C. Phenobarbital-induced rat liver cytochrome P450. J. Biol. Chem., 1982;257:10446-10457; Omura T. and Sato R. The carbon-monooxide binding pigment of liver microsomes. J. Biol. Chem., 1964;239;2370-2378).

Ejemplo 4 Inactivación de P450 3A4 mediada por BG en un sistema reconstituido

Se reconstituyó P450 3A4 (0,5 nmol) con 20 \mug de una mezcla (1:1:1) de L-\alpha-dilauroil- y L-\alpha-dioleil-sn-glicero-3-fosfocolinas y fosfatidilserina, 200 \mug de ácido cólico, 1 nmol de NADPH-reductasa, 0,5 nmol de citocromo b5, 500 U de catalasa, 2 \mumol de GSH, MgCl_{2} 30 mM, EDTA 0,5 mM, y glicerol al 20% en un volumen final de 1 ml de tampón Hepes 50 mM (pH 7,5). Las reacciones con diferentes concentraciones de BG se iniciaron por adición de NADPH 1 mM, y se terminaron sobre hielo. Las incubaciones se realizaron a 37ºC durante los periodos de tiempo indicados. Al final de la incubación, 0,2 ml de la mezcla de incubación se diluyeron en 0,8 ml de tampón Hepes 50 mM (pH 7,5) que contenía glicerol al 20% y EDTA 0,5 mM. Se registraron los espectros entre 330 y 700 nm frente al tampón diluyente como referencia sobre un espectrofotómetro DW2-OLIS en el modo de haz partido. Se usó una alícuota de 0,25 ml para la determinación del contenido de P450 por el método de Omura y Sato (Omura and Sato, Supra, 1964). Se recogieron alícuotas adicionales para la determinación de la actividad de 6\beta-hidroxilación de testosterona y el análisis por HPLC.

Ejemplo 5 Determinación de la actividad de 6\beta-hidroxilación de la testosterona

Se diluyó una alícuota (0,05 ml) de la mezcla de incubación en 0,95 ml de tampón Hepes 50 mM (pH 7,5) que contenía testosterona 200 \muM, 500 U de catalasa, 2 \mumol de GSH, MgCl_{2}30 mM, EDTA 0,5 mM, y glicerol al 20% en un volumen final de 1 ml de tampón Hepes 50 mM (pH 7,5), y se incubó durante 10 minutos a 37ºC. Se determinó la 6\beta-hidroxitestosterona por HPLC en una columna C18 (Microsorb-MV, 5 \mum, 4,6 x 15 cm, Rainin, Woburn) eluida isocráticamente con una fase móvil de metanol al 65% a un caudal de 1 ml/min, y el eluido se monitorizó por detección UV a 254 nm.

Ejemplo 6 Análisis por HPLC de P450 3A4 inactivado por BG

Después de 10 minutos de incubación de P450 3A4 con BG 50 \muM en el sistema reconstituido como se ha descrito antes, se analizaron directamente 200 \mul de la mezcla de reacción en una columna Poros como se ha descrito previamente (Roberts E.S., Hopkins N.E., Alworth D.A., and Hollenberg P.F. Mechanism-based inactivation of cytochrome P450 2B1 by 2-ethynylnaphthalene: Identification of an active-site peptide. Chem. Res. Toxicol., 1993;6;470-479). La elución se monitorizó por detección UV a 14, 310, y 405 nm simultáneamente.

Ejemplo 7 Inhibición de las actividades de los enzimas P450 microsomales del hígado humano por BG

Se obtuvieron tejidos de hígado humano del University of Chicago Distribution Center of LTPADS (Liver Transplant Procurement and Distribution Service, University of Minnesota, Minneapolis, MN), Human Biologics Inc. (Phoenix, AZ) y el International Institute for the Advancement of Science (Exton, PA). Se prepararon los microsomas del hígado por centrifugación diferencial. Se usaron N3-desmetilación de la cafeina (Tassaneeyakul W., Mohammed Z., Birkett D.J., McManus M.E., Veronese M.E., Turkey R.H., Quattrochi L.C., González F.J., and Miners J.O. Caffeine as a probe for human cytochromes P450: Validation using cDNA-expression, immunoinhibition and microsomal kinetic anf inhibitor techniques. Pharmacogenetics, 1992;2:173-183), 7-hidroxilación de la cumarina (Fentern J:H, and Fry J.R. Metabolism of coumarin by rat, gerbil, and human liver microsomes. Xenobiotica, 1992;22:357-367), hidroxilación de la tolbutamida (Miners J.O., Smith K.J., Robson R.A., McManus M.E., Veronese M.E., and Birkett D.J. Tolbutamide hydroxylation by human liver microsomes: Kinetic characterization and relationship to other cytochrome P450 dependent xenobiotic oxidations. Biochem. Pharmacol., 1988;37:1137-1144), 1'-hidroxilación de bufurolol racémico (Kronbach T., Mathys D., Gut J., Catin T., and Meyer U.A. High-performance liquid chromatographic assays for bufurolol 1'-hydroxylase, debrisoquine 4-hydroxylase, and dextromethorphan o-deethylase in microsomes and purified cytochrome P450 isozymes of human liver. Anal. Biochem., 1987;162:24-32), 6-hidroxilación de la clorzoxazona (Peter R., Bocker R., Beaune P.H., Iwasaki M., Guengerich F.P., and Yang C.S. Hydroxylation of chlorzoxazone as a specific probe for human liver cytochrome P450 IIEI. Chem. Res. Toxicol., 1990;3:566-573), y 6\beta-hidroxilación de la testosterona (Sonderfan A.J., Arlotto M.P., Dutton D.R., McMillen S.K., and Parkinson A. Regulation of testosterone hydroxylation by rat liver microsomal cytochrome P450. Arch. Biochem. Biophys., 1987;255:27-41,4) para determinar las actividades de P450 1A2, 2A6, 2C9, 2D6, 2E1, y 3A4, respectivamente. Los microsomas de hígado humano reunidos (N =6, 0,1-1 mg proteína/ml) se incubaron con BG (1, 10, y 100 \muM) en presencia de los correspondientes sustratos de prueba, cafeína 100 \muM, cumarina 4 \muM, tolbutamida 100 \muM, bufurolol 10 \muM, clorzoxazona 40 \muM, y testosterona 50 \muM en un volumen final de 0,5 ml de tampón fosfato 0,1 mM (pH 7,4) a 37ºC durante los periodos de tiempo apropiados, respectivamente. Las reacciones se iniciaron por las adiciones de NADPH 1 mM y se terminaron en hielo. Se uso la 4'-hidroxilación de (S)-mefenitoina para la determinación de la actividad de P450 2C19 (Meier U.T., Kronbach T., and Meyer U.A. Assay of mephenytoin metabolism in human liver microsomes by high-performance liquid chromatography. Anal Biochem., 1985;151:286-291). Se incubó (S)-mefenitoina (50 \muM) con microsomas de hígado humano reunidos en un volumen final de 0,125 ml en presencia de BG 0,2, 2, y 20 \muM, respectivamente. Se determinó la concentración de 4'-hidroximefenitoina usando LC-MS/MS. Los testigos experimentales estaban constituidos por la incubación completa de los componentes sin la adición de BG.

Claims

1. Una composición farmacéutica oral o un supositorio que comprende Bergamotina en su forma aislada y un compuesto que tiene una biodisponibilidad oral menor que 50% mezclados con al menos un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptables.

2. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la baja biodisponibilidad es menor que 30%.

3. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el compuesto se selecciona entre Ciclosporina, Tacrolimús (FK506), Sirolimús (rapamicina), Indinavir, Saquinavir, Felodipino, Isradipino, Nicardipino, Nisoldipino, Nimodipino, Nitrendipino, Nifedipino, Verapamil, Etopósido, Tamoxifeno, Vinblastina, Vincristina, Atorvastatina, Fluvastina, Lovastatina, Pravastatina, Simvastatina, Terfenadina, Loratadina, Astemizol, Alfentanil, Carbamazepina, Azitromicina, Itraconazol, Rifabutina, Lidocaina, Cisaprida, Sertralina, Pimozida, Triazolam, Midazolam, Testosterona, Medroxiprogesterona y Ergotamina.

4. El uso de la bergamotina en su forma aislada, para la preparación de una composición farmacéutica o un supositorio, para inhibir el metabolismo enzimático intestinal de un compuesto que tiene una biodisponibilidad oral menor que 50% y para aumentar la biodisponibilidad de dicho compuesto.

5. El uso de la Bergamotina en su forma aislada, para la preparación de una composición farmacéutica oral o un supositorio para inhibir el metabolismo intestinal del citocromo P4503 A4.

6. El uso según la reivindicación 4, en el que la biodisponibilidad oral del compuesto es menor que 30%.

7. El uso según las reivindicaciones 4 ó 6, en el que el compuesto que tiene baja biodisponibilidad oral se selecciona entre Ciclosporina, Tacrolimús (FK506), Sirolimús (rapamicina), Indinavir, Saquinavir, Felodipino, Isradipino, Nicardipino, Nisoldipino, Nimodipino, Nitrendipino, Nifedipino, Verapamil, Etopósido, Tamoxifeno, Vinblastina, Vincristina, Taxol, Atorvastatina, Fluvastatina, Lovastatina, Pravastatina, Simvastatina, Terfenadina, Loratadina, Astemizol, Alfentanil, Carbamazepina, Azitromicina, Eritromicina, Itraconazol, Rifabutina, Lidocaina, Cisaprida, Sertralina, Pimozida, Triazolam, Midazolam, Testosterona, Medroxiprogesterona y Ergotamina.

8. El uso según las reivindicaciones 4 a 6, en el que la dosis inicial de Bergamotina es de 0,01 a 1 mg por kilogramo, al día.