JP4902964B2 - 薬物の代謝阻害剤とその使用 - Google Patents

Description

本発明は、薬物の代謝を阻害して薬物の吸収率を向上させる物質およびその使用に関する。

薬物（医薬品）の多くは、小腸におけるシトクロームP450 3A（CYP3A）などの酵素による代謝を受けることが知られている。この小腸において代謝を受けることが、薬物の小腸における吸収率を低下させ、低いバイオアベイラビリティーと大きな個体間変動の原因に挙げられている。
一方、薬物の吸収を改善させるための方法として、薬物の小腸通過を該薬物の吸収が起こるに十分な時間遅らせるために有効な量の脂質を含む組成物を投与すること、該脂質として、オレイン酸などの脂肪酸を用いることが知られている（特許文献１）。
また、鼻粘膜など経粘膜での薬物の吸収促進剤として、多価不飽和脂肪酸を薬物に含有させることも知られている（特許文献２、特許文献３）。
しかしながら、ＤＨＡなどの多価不飽和脂肪酸が小腸における薬物の代謝を阻害する作用を有することは知られていない。

特表平１１−５０５２５８号公報 特開２０００−１２８８０５号公報 特開２００１−２４０５５８号公報

本発明は、小腸における薬物の代謝を阻害して、薬物の吸収率を向上させ高いバイオアベイラビリティーを得るための手段を提供することを課題とする。

本発明者は、ＤＨＡなどの多価不飽和脂肪酸が小腸における薬物の代謝をコントロール（抑制）できることを見出し、その多価不飽和脂肪酸の代謝抑制機能が、結果として小腸における薬物の吸収率を向上させ、高いバイオアベイラビリティーに寄与することを見出して本発明に至った。また、本発明者は、ＤＨＡなどの多価不飽和脂肪酸が経口投与されても小腸まで分解されることなく到達することを思いがけず見出し、その代謝抑制機能を経口投与用の医薬品に応用できることを見出した。
さらに、本発明者は、ＤＨＡなどの多価不飽和脂肪酸によると薬物代謝が一定時間抑制されるが、一定時間経過後はその抑制能がなくなることを発見し、よって、多価不飽和脂肪酸を有効成分と共に用いた医薬品では、その有効時間をコントロールできることも見出した。さらにまた、多価不飽和脂肪酸によると薬物代謝が一定時間抑制されるので、医薬品の吸収部位への到達時間と代謝抑制時間とを合致させることによって、有効なバイオアベイラビリティーを達成することができる。このような不飽和多価脂肪酸による一定時間の代謝抑制機能は経口投与用の医薬品において特に顕著な有用性を発揮できる。
従来、グレープフルーツジュースがシトクロームP450 3A（CYP3A）の代謝を阻害することで経口投与薬の吸収性を向上させることはよく知られている。しかし、グレープフルーツジュースによるCYP3A代謝阻害は、CYP3Aの酵素活性の完全な失活によるものであって、本来、CYP3Aにより代謝すべきものまですべて吸収させることになってしまうし、代謝阻害が強くなりすぎるという危険性を伴うのに対して、本発明のＤＨＡなどの多価不飽和脂肪酸による代謝阻害能は、上記のように一定時間有効であるので、このような危険性はない。

すなわち、本発明は、次に関するものである。
（１）多価不飽和脂肪酸からなる薬物の代謝阻害剤。
（２）多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）からなる上記（１）記載の代謝阻害剤。
（３）薬物が経口投与用である上記（１）又は（２）に記載の代謝阻害剤。
（４）小腸におけるシトクロームP450 3A（CYP3A）による代謝を阻害する上記（１）〜（３）のいずれかに記載の代謝阻害剤。
（５）薬物の有効成分がシクロスポリン又はサキナビルである上記（１）〜（４）のいずれかに記載の代謝阻害剤。
（６）薬物の有効成分と代謝阻害剤としての多価不飽和脂肪酸とを含有することを特徴とする医薬品組成物。
（７）多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）からなる上記（６）記載の医薬組成物。
（８）医薬品組成物が経口投与用である上記（６）又は（７）記載の組成物。
（９）シクロスポリンあるいはサキナビルと代謝阻害剤としての多価不飽和脂肪酸とを含有する医薬組成物。
（１０）多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である上記（９）記載の医薬組成物。
（１１）薬物の代謝阻害剤としての多価不飽和脂肪酸の使用。
（１２）薬物の代謝阻害剤としてのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の使用。

本発明によって、薬物の小腸における代謝を抑制でき、小腸における薬物の吸収率を向上させ高いバイオアベイラビリティーを得ることができた。さらに、本発明によると、小腸における吸収率が低い薬物でも医薬品として使える可能性が生じるので、医薬品開発上のメリットは大きい。

以下には、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。
本発明の代謝阻害剤は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、リノレン酸、γ−リノレン酸、アラキドン酸、レチオニック酸などの多価不飽和脂肪酸であるが、ＤＨＡが最も好ましい。

本発明で用いられる薬物の有効成分としては、一般的に小腸におけるシトクロームP450 3A（CYP3A）などによる代謝を受け易く吸収し難いもの、あるいは有効成分が微量でシトクロームP450 3A（CYP3A）で完全に代謝されて薬効を発揮できないものであれば、何でもよい。例えば、シクロスポリンA（CyA）などのシクロスポリン、抗エイズ薬として知られているサキナビルなどが挙げられる。

本発明の製剤の形態としては、例えば、粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセル、等の固形剤、溶液、懸濁液、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、これらの製剤は常套手段により調製することができる。

以下の実施例１〜５では、有効成分としてシクロスポリンA（CyA）を選び、CyAの小腸における吸収率がＤＨＡによって亢進されるか否かを検討した。
実施例で用いた試薬等は、以下のとおりである。

＜試薬＞
シクロスポリンＡ（CyA）：ノバルディスファーマ株式会社
コーン油（Wako）
cis−4,7,10,13,16,19−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）：SigmaD−2534
ポリエチレングリコール２００：Wako
麻酔薬エンフルラン：ダイナポット
シクロスポリン測定キットTDXFLX^TM：Abｂott
Ｐ−糖タンパク質阻害剤PSC833：ノバルディスファーマ株式会社
テストステロン：Wako208−08341
６β−水酸化テストステロン：SigmaH−2898
１７α−メチルテストステロン：SigmaM−7252
ヒト肝臓ミクロソーム：Gentest452161
アルブミン：Bovine SigmaA−4503

＜小腸におけるシクロスポリン吸収率に対するＤＨＡの影響＞
ラットにCyAを投与し、血中シクロスポリン濃度に対するＤＨＡの影響を調べた。
（試薬調製）
経口投与の場合、CyAはコーン油に溶解する。ＤＨＡはコーン油に添加した（最終濃度 ５，１０，２０wt/vol％）。
静脈内投与の場合、CyAをエタノールで溶解した後、ポリエチレングリコール２００に溶解した（エタノールの最終濃度１０vol/vol％）。

（手術）
２２０〜２５０ｇのWister系雄性ラット（日本医科学動物）を24時間絶食させ、エンフルラン麻酔下（導入５％、維持２％）で左後肢大腿動脈および大腿静脈にカニューレを施した。覚醒後、CyAを投与し、Bolmanケージにラットを固定した。

（投与方法）
経口投与の場合、CyAをコーン油に溶解して経口ゾンデで投与した。投与量は、５mg/mLのCyA溶液を、ラット１kg当たり５mg投与した。ＤＨＡを添加する場合、最終濃度５，１０，２０wt/vol％でコーン油に添加した。
静脈投与の場合、投与３時間前に１ml/kgのコーン油(DHAを含む場合あり)を経口投与し、CyAの１０vol/vol％エタノール溶液の静脈内投与を行なった。ＤＨＡを添加する場合、コーン油に最終濃度５，１０，２０wt/vol％で添加した。

（採血）
CyA投与後、経時的にヘパリン採血を行なった。経口投与の場合、投与後１，２，３，４，６，９，１２，２４時間後に、静脈内投与の場合、投与後０．１６７，０．５，１，２，４，８，１２，２４時間後に、採血を行なった。

（血中CyA滴定法）
血液中のCyA量をシクロスポリン測定キットTDXFLX^TM（Abbott社）で行なった。

（結果）
コーン油（基材）に溶解したCyAを経口投与したラット（個体数６〜７）の血中CyA濃度（平均値：mean）を表１と図１に示した。なお、表1には、標準偏差（ＳＤ）も併記した。CyAを経口投与したラットの血中CyA濃度は、既報の文献（Biochemical Pharmacology 63(4)： 777-783 (2002) Yokogawa K, Shimada T, Higashi Y, Itoh Y, Masue T, Ishizaki J, Asahi M, Miyamoto K., Modulation of mdr1a and CYP3A gene expression in the intestine and liver as possible cause of changes in the cyclosporin A disposition kinetics by dexamethasone）と同等の結果を示した。基材にＤＨＡを添加した群では投与2時間目からＤＨＡの添加量に応じて血中CyA濃度が上昇し、１０および２０wt/vol％のＤＨＡを添加した群では有意に上昇した。
また、図1から明らかなように、ＤＨＡ添加による血中CyA濃度の上昇は、一過性である。
CyAを静脈内投与したラット（個体数３〜４）の血中CyA濃度は、前記の既報の文献と同等の結果を示した。ＤＨＡを予め経口投与した場合にも影響は認められなかった（表２及び図２）。
この結果から、CyAの経口投与の場合には、ＤＨＡの添加で血中CyA濃度が有意に増加したのに対して、静脈内投与の場合は、ＤＨＡを添加しても影響がないことが分かった。

＜ＤＨＡを予め投与した場合の影響＞
この実施例では、ＤＨＡを予め投与したときのCyA血中濃度に対する影響を調べた。
ラットにCyAを経口投与する３時間前に２０wt/vol％ＤＨＡを投与した以外は、実施例１と同様の試験を行なった。
結果を図３に示す。ＤＨＡを予め投与した場合と、投与しない場合（コントロール）でCyA血中濃度に殆ど差異がない。
この結果から、予めＤＨＡを投与したときには、CyAの経口投与においても、ＤＨＡ同時投与のような影響が現れないことが分かった。このことは、ＤＨＡの影響がグレープフルーツジュースのような持続性のものではなく、危険性が少ないことを示す。

＜動態パラメータに対するＤＨＡの影響＞
実施例１と同様の方法でラットにCyAを投与し、投与後の薬物動態パラメータを測定した。
経口投与の場合、ＤＨＡ添加によりAUC（薬物血中濃度−時間曲線下面積：area under the blood concentration time curve）の値は添加用量に応じて高くなり、１０および２０重量％のＤＨＡを添加した群では有意であった。全身クリアランスCltot/F、分布容積Vdss/Fの値はＤＨＡの添加用量に応じて低くなり、１０および２０重量％のＤＨＡを添加した群では有意であった。半減期T1/2に違いはなかった（図４）。なお、AUCは、直線台形法によるものでソフトウエアWin Nonlin(Pharsight Corp)を用いて処理した。
静脈投与の場合には、予めＤＨＡを経口投与した場合にもAUC、Cltot/F、Vdss/FおよびT1/2に有意差はなかった（図５）。
この結果から、CyAの経口投与の場合には、ＤＨＡの添加で薬物動態パラメータに有利な影響が現れるのに対して、静脈投与の場合には、ＤＨＡを添加しても影響がないことが分かった。

実施例１と３の結果から、ＤＨＡは小腸におけるCyAの吸収過程に影響し、肝臓におけるCYP3A4の代謝に影響がないことが示唆された。そこで、次に、このことを検討するためにヒト及びラットの肝臓ミクロソームを用いたCyAのCYP3A4による代謝に対してＤＨＡが影響するかどうかの確認、Ｐ−糖タンパク質を発現しているＣａｃｏ−２細胞を用いたCyAの透過性にＤＨＡが影響するかの確認を行なった。

＜代謝に対するＤＨＡの影響＞
（肝ミクロソーム代謝実験）
ヒト及びラットの肝臓ミクロソーム（Gentest社）によりテストステロン（１５，３０，１００，３００μM）を試験管内で３７℃、１０分間代謝させ、代謝物（6-β水酸化テストステロン）をHPLCで分離し溶出した。代謝反応時にＤＨＡ（１０，２０，３０μM）を添加した。
以下の式にSAAMII（Saam Institudeのソフトウエア）を用いて、Vmax、Km、Kiを求めた。
HPLC条件は次のとおりである。
A液 水：アセトニトリル：メタノール＝５８：２：４０
B液 水：アセトニトリル：メタノール＝２８：３２：４０
Ａ、B液を用いてグラジエント溶出を行なう。
内部標準：１７α−メチルテストステロン
カラム：Ｓｕｐｅｒ−ＯＤＳ（ＴＯＳＯＨ）
温度：４２℃
流速：１ｍＬ／min

結果は、表３のとおりである。
この結果から、肝臓によるテストステロン代謝に対するＤＨＡのKi（阻害定数）はいずれも小さく、阻害効果が高いことが分かった。

また、基質であるテストステロン濃度の逆数と代謝物である６β−水酸化テストステロンの精製速度の逆数をプロット（Line−Weaver Burk Plot）してその阻害形式を検討した。その結果、ＤＨＡはヒトミクロソームを用いたテストステロンの代謝に対して濃度に応じて、競合的に阻害した（図６）。

＜シクロスポリンの透過性に対するＤＨＡの影響＞
Ｐ−糖タンパク質を発現しているCaco−２細胞を用いて透過性の試験（Caco−２細胞を用いたトランスポートアッセイ）を行なった。
（細胞）
用いたCaco−２細胞は、久光製薬株式会社から入手したATCC由来細胞であり、一週間に一度以上継代培養を行なう。継代は、直径１００ｍｍの培養用ディッシュ（IWAKI 3020−100）に培養しているCaco−２細胞をPBS(−)で2回洗い、trypsin−EDTAで反応させディッシュからはがし回収した。遠心して細胞を濃縮した後、細胞数を数えた。最後に新しいディッシュ1枚あたり１０^６個の細胞を播種した。トランスポートアッセイ用にTranswell（costar3402、ポアサイズ３．０μｍ、直径１２ｍｍ）へCaco−２細胞を１well当たり６３０００個播種した。培養1週間後から２〜３日に一度培養液の交換を行い、培養三週間前後にトランスポートアッセイを行なった。

（Caco−２細胞を用いたトランスポートアッセイ）
３週間培養したCaco−２細胞を用いて［^３H］−CyAのトランスポートアッセイを行なった。トランスポート開始後３０、６０、９０および１２０分後にtranswellよりバッファーを一部採取して、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。
トランスポートアッセイ条件は次のとおりである。
Transwell（costar3402）：ポアサイズ３．０μｍ、直径１２ｍｍ
トランスポート用バッファー：Hanks balanced solt solution（ｐH7.4）
０．１％BSA存在下
CyA濃度：５０ｎM（３Ｃｉ／mmol）
PSC833濃度：１０μM
ＤＨＡ濃度：１００μM

Ｐ−糖タンパク質を発現しているCaco−２細胞を用いたCyAの透過性にＤＨＡが影響するかどうかを、陽性対照にＰ−糖タンパク質阻害剤であるPSC833を置いて検討した。その結果、apical側からbasal側への輸送およびbasal側からapical側への輸送は時間に応じて直線的に認められた。これらの輸送に対し、PSC833はbasal側からapical側への輸送について阻害した。なおPSC833がapical側からbasal側への輸送について阻害しなかった原因については不明である。そこでＤＨＡの評価は、basal側からapical側への輸送について行なった。その結果、ＤＨＡ１００μMはbasal側からapical側への輸送に対して影響しなった。（表4及び図７）

以上の実施例４および５の結果から、ＤＨＡによるCyAのバイオアベイラビリティー向上は、Ｐ−糖タンパク質を介したものではなく小腸におけるCyP3A4を阻害した結果であることが示唆された。
以上から、薬物の吸収率を高めるためのＤＨＡを用いたdrug delivery system(DDS)の可能性が明らかになった。
ＤＨＡが生体に対して毒性を有さないことも考え合わせると、ＤＨＡの使用は臨床的に有効である。

＜多価不飽和脂肪酸の代謝に対する影響＞
ＤＨＡ以外も含む多価不飽和脂肪酸について、代謝阻害能を試験した。対照として、飽和脂肪酸、1価の不飽和脂肪酸についての試験も行なった。
実施例４と同様にしてラット肝ミクロソームを用いてテストステロンの代謝を行い、代謝物（6-β水酸化テストステロン）濃度を測定した。脂肪酸濃度５０μＭ、テストステロン濃度１５μＭ、温度３７℃で、１０分間代謝を行なった。
表５には、それぞれの脂肪酸を阻害剤として用いるときの、6-β水酸化テストステロン（6βＯＨＴ）濃度を、脂肪酸を添加しないときの6-β水酸化テストステロン（6βＯＨＴ）濃度に対する比で示した。
表５の結果から飽和脂肪酸では代謝阻害能がないのに対して、不飽和脂肪酸では代謝阻害能が見られ、不飽和脂肪酸でも、リノレン酸、γ−リノレン酸、アラキドン酸、レチオニック酸、ＤＨＡなどの多価不飽和脂肪酸になるとさらに代謝阻害能が高くなることが分かる。さらに、表５から多価不飽和脂肪酸ではＤＨＡが最も高い代謝阻害能を示すことが分かった。

＜小腸におけるサキナビル吸収率に対するＤＨＡの影響＞
以下の実施例では、CyAに代えてサキナビル（ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤）について試験した結果を示す。
実施例１と同様にして、ラットにサキナビルを投与し、血中サキナビル濃度に対するＤＨＡの影響を調べた。
図８には、サキナビルを５０mg/kg経口投与したラット（個体数４〜７）のサキナビル血中濃度を示した。ＤＨＡを添加した群では投与２時間目からＤＨＡの添加量に応じて血中サキナビル濃度が上昇し、１０％wt/vol%のＤＨＡを添加した群では有意に上昇した。図８から明らかなように、ＤＨＡ添加による血中サキナビル濃度の上昇は、一過性であった。
一方、図９には、サキナビルを１０mg/kg静脈内投与したラット（個体数５）のサキナビル血中濃度を示した。ＤＨＡを予め経口投与した場合にも影響は認められなかった。
この結果から、サキナビルについても、CyAと同様、経口投与の場合には、ＤＨＡ添加で血中濃度が有意に増加したのに対して、静脈内投与の場合には、ＤＨＡを添加しても影響がないことが分かった。

＜ＤＨＡを予め投与した場合の影響＞
この実施例では、ＤＨＡを予め投与したときのサキナビル血中濃度に対する影響を調べた。
３匹のラットにサキナビル（５０mg/kg）を経口投与する３時間前に１０wt/vol％ＤＨＡを投与した以外は、実施例１と同様の試験を行なった。
結果を図１０に示す。図１０には３匹のラットの平均値と標準偏差とを示した。ＤＨＡを予め投与した場合と、投与しない場合（コントロール）でサキナビル（ＳＱＶ）血中濃度に殆ど差異がない。
この結果から、予めＤＨＡを投与したときには、サキナビル経口投与によるときでも、ＤＨＡ同時投与のときのような影響が現れないことが分かった。このことは、実施例２と同様に、ＤＨＡの影響がグレープフルーツジュースのような持続性のものではなく、危険性が少ないことを示す。

＜動態パラメータに対するＤＨＡの影響（サキナビル）＞
実施例１と同様の方法でラットにサキナビルを投与し、投与後の薬物動態パラメータを測定し、結果を表６に示した。
経口投与の場合、ＤＨＡ添加によりAUCの値は添加用量に応じて高くなった。全身クリアランスCltot/F、分布容積Vdss/Fの値はＤＨＡの添加用量に応じて低くなり、半減期T1/2に違いはなかった。
静脈投与の場合には、予めＤＨＡを経口投与した場合にもAUC、Cltot/F、Vdss/FおよびT1/2に有意差はなかった。
この結果から、サキナビルの経口投与の場合には、ＤＨＡの添加で薬物動態パラメータに有利な影響が現れるのに対して、静脈投与の場合には、ＤＨＡを添加しても影響がないことが分かった。

実施例６と７の結果からCyAの場合と同様に、ＤＨＡは小腸におけるサキナビルの吸収過程に影響し、肝臓におけるサキナビルの代謝に影響がないことが示唆された。そこで、次に、このことを検討するためにラットの肝臓ミクロソームを用いたサキナビルのCYP3A4による代謝に対してＤＨＡが影響するかどうかの確認を行なった。

＜代謝に対するＤＨＡの影響（サキナビル）＞
実施例３と同様にラットの肝臓ミクロソーム（Gentest社）によりサキナビル（１．９５，６．３，１３μM/L）を試験管内で３７℃、１０分間代謝させ、代謝物をHPLCで分離し溶出した。代謝反応時にＤＨＡ（１０，５０，１００，２００，５００μM）を添加した。CYP3A4の代表的阻害剤として知られているケトコナゾル（Ketoconazol）を陽性対照として用いた。結果を図９に示した。図１１において縦軸はサキナビル代謝物の量であり、値が低いほど代謝が阻害されていることを示す。図１１からＤＨＡの添加によってサキナビルの代謝が濃度依存的に阻害されることが分かった。５００μM のDHAは、１μMのケトコナゾルとほぼ同じ阻害活性を示し、ＤＨＡは比較的強力なCYP3A4代謝阻害活性を示すことが分かった。

本発明のDHAによると、薬物の小腸における代謝を抑制でき、小腸における薬物の吸収率を向上させ高いバイオアベイラビリティーを得ることができた。

経口投与時の血中CyA濃度に対するＤＨＡの影響を示す。 静脈内投与時の血中CyA濃度に対するＤＨＡの影響を示す。 ＤＨＡを予め投与した場合の血中CyA濃度に対する影響を示す。 CyA経口投与後の薬物動態パラメータに対するＤＨＡの影響を示す。 CyA静脈内投与後の薬物動態パラメータに対するＤＨＡの影響を示す。 ヒト肝ミクロソームを用いたテストステロンのCYP3A4代謝に対するＤＨＡの影響を示す。 Caco−２細胞におけるCyAのbasal側からapical側へのトランスポートに対するPSC833およびＤＨＡの影響を示す。 経口投与時の血中サキナビル濃度に対するＤＨＡの影響を示す。 静脈内投与時の血中サキナビル濃度に対するＤＨＡの影響を示す。 ＤＨＡを予め投与したと場合の血中サキナビル濃度に対するＤＨＡの影響を示す。 ラット肝ミクロソームを用いたサキナビルのCYP3A4代謝に対するＤＨＡの影響を示す。

Claims (7)

1. ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）からなる薬物の代謝阻害剤。
2. 薬物が経口投与用である請求項１に記載の代謝阻害剤。
3. 小腸におけるシトクロームP450 3A（CYP3A）による代謝を阻害する請求項１または２に記載の代謝阻害剤。
4. 薬物の有効成分がシクロスポリン又はサキナビルである請求項１〜３のいずれかに記載の代謝阻害剤。
5. 薬物の有効成分と代謝阻害剤としてのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）とを含有することを特徴とする医薬品組成物。
6. 医薬品組成物が経口投与用である請求項５に記載の組成物。
7. シクロスポリンあるいはサキナビルと代謝阻害剤としてのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）とを含有する医薬組成物。