ES2209984T3 - Procedimiento y composiciones para la deteccion de episodios patologicos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de detección in vitro de la presencia de una patología neurodegenerativa o de un tumor sólido en un paciente, que comprende: (i) la preparación, a partir de una muestra de células sanguíneas de un paciente, de ácidos nucleicos que comprenden unos ARN o unos ADNc derivados de los mismos, y (ii) la hibridación de los ácidos nucleicos preparados con por lo menos un banco de ácidos nucleicos que comprende unos ácidos nucleicos específicos de formas de empalme ¿splicing¿ de genes característicos de una célula sanguínea aislada de un organismo que presenta una patología neurodegenerativa o un tumor sólido, indicando el perfil de hibridación la presencia de células sanguíneas características de la patología en la muestra.

Description

Procedimientos y composiciones para la detección de episodios patológicos.

La presente invención se refiere a unas nuevas composiciones y métodos para la detección de episodios patológicos. Se refiere más particularmente a unas composiciones y métodos de detección de episodios patológicos a distancia. La invención se refiere asimismo a unas herramientas, unos equipos y unas composiciones para la utilización de dichos métodos, así como sus utilizaciones en el campo de la salud humana o animal, o en investigación experimental, por ejemplo.

Con el envejecimiento de la población en los países desarrollados, aparecen unas nuevas necesidades en materia de diagnóstico. Las enfermedades tales como los cánceres, las enfermedades neurodegenerativas serían mejor abordadas para el beneficio de los pacientes y de la sociedad si se dispone de diagnósticos predictivos de la aparición y de la evolución de la patología.

La experiencia muestra que cuanto más se presenta un diagnóstico precoz, mayores son las oportunidades de controlar la evolución probable de las enfermedades. Este es el caso, muy claramente de los cánceres. Las campañas de detección precoz de los cánceres de pecho mediante la mamografía sistemática han permitido mejorar la esperanza de supervivencia en dichos cánceres. Asimismo, se puede calcular que una consideración precoz de los pacientes que desarrollan una enfermedad de Alzheimer permitiría retrasar significativamente su evolución.

Dichas enfermedades, tales como los cánceres y las enfermedades neurodegenerativas, han tenido una incidencia que aumenta marcadamente con la edad de la población. Es probable que dichas enfermedades tarden unos años antes de instalarse y poder ser detectadas. Se destaca por ejemplo que se requiere la acumulación de alteraciones sucesivas a nivel del genoma humano para desembocar en la iniciación de cánceres. Asimismo unos estudios genéticos realizados en unas poblaciones seleccionadas que presentan una fuerte incidencia de la enfermedad de Alzheimer, asociadas a unos experimentos genéticos en los animales, subrayan asimismo el carácter multifactorial de la iniciación de dicha patología.

Dichas patologías ligadas al envejecimiento presentan unas características comunes, tales como:

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unas alteraciones celulares que se desarrollan después de los desequilibrios del entorno de los tejidos implicados junto a unas agresiones físicas, químicas o biológicas;

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la contribución de las células del sistema inmunitario.

Si las alteraciones de los tejidos implicados sólo se identifican preferentemente a raíz de las biopsias, podría ocurrir que unas alteraciones de las células inmunitarias, reflejo de un desarrollo patológico en curso, se pudieran detectar a distancia de los núcleos de desarrollo de dichas patologías, debido a que la mayor parte de las células del sistema inmunitario evolucionan entre los tejidos y el compartimiento sanguíneo o los ganglios linfáticos.

Las células linfocitárias y los macrófagos son los principales mediadores de la respuesta inmunitaria celular. Los linfocitos y los macrófagos están presentes en los tejidos así como en la sangre. Son dichas células que entran primero en contacto con los tejidos extraños al organismo. Dichas células macrófagas degradan los tejidos y la sustancias implicadas. Los péptidos que derivan de las proteínas degradadas se fijan a continuación mediante unas moléculas del sistema mayor de histocompatibilidad de clase II que las llevan a la superficie del macrófago donde dichos complejos son reconocidos por los linfocitos T. Existen otros casos de sistemas de presentación de los péptidos y de activación de las respuestas inmunitarias y se han descrito principalmente en el caso del desarrollo de cánceres.

Actualmente los diagnósticos de dicho tipo de enfermedades se realizan por lo tanto cuando la enfermedad se ha instalado. Por lo que se refiere a los cánceres, por ejemplo, el diagnóstico se presenta a partir de una imagen médica y de un diagnóstico morfológico de los tejidos obtenidos a partir de biopsias. Para una patología como la enfermedad de Alzheimer es un conjunto de observaciones médicas lo que permite obtener el diagnóstico.

Existe por lo tanto una necesidad real de disponer de herramientas y de métodos que permitan descifrar de forma precoz, simple y fiable la aparición de patologías, principalmente de patologías ligadas a una desregulación de los mecanismos de regulación de las vías de señalización celular, en particular, unas patologías caracterizadas por una hiper-proliferación celular (cáncer, degeneración nerviosa, estenosis, etc...)

La introducción de unas técnicas derivadas de la biología molecular, asociadas a la bioinformática, ha permitido concebir unas librerías (o bancos) de fragmentos de ADN que caracterizan un estado patológico determinado, que permiten determinar a partir de una muestra muy pequeña de un tejido cualquiera, la presencia o ausencia de referencias patológicas.

La presente invención describe actualmente un nuevo enfoque para la detección de patologías in vitro. Más particularmente, la presente invención describe unos nuevos métodos y composiciones para la detección de episodios patológicos, principalmente unas firmas genéticas patológicas. La invención describe además unos métodos y composiciones utilizables para la detección a distancia de episodios patológicos, es decir sobre unos materiales biológicos diferentes de los tejidos patológicos. Las composiciones y métodos de la invención ofrecen actualmente a los clínicos, a los biólogos e industriales unas nuevas soluciones para el diagnóstico in vitro, fundados sobre unos métodos directos, rápidos, sensibles y económicos, y automatizables.

Más particularmente, la presente invención se apoya principalmente en la evidencia de que resulta posible determinar, a partir de unas muestras biológicas que comprenden unas células circulantes, la presencia o el riesgo de desarrollo de una patología. Más particularmente, la invención se apoya en la puesta de manifiesto de que es posible detectar en una muestra biológica que comprende unas células sanguíneas, la existencia de una patología, comprendiendo unos estadios muy precoces de iniciación o de desarrollo, a los que sería ineficaz cualquier otro diagnóstico existente.

El primero objeto de la invención reside más particularmente en un procedimiento de detección in vitro de la presencia de una patología en un sujeto según la invención.

Más particularmente, el procedimiento de la invención comprende la determinación de la presencia, en una muestra, de células sanguíneas que presentan unas alteraciones de la expresión genética características de la presencia de la patología.

De este modo, la presente invención se apoya por una parte en la utilización de las células sanguíneas para la realización de un ensayo a distancia de la presencia de un suceso patológico, y, por otra parte, en la utilización de tecnologías genómicas que permiten detectar unas alteraciones en la expresión (en particular de la transcripción) del genoma en dichas células.

Según una variante particular, la presente invención comprende por lo tanto preferentemente la determinación de la presencia, en una muestra biológica, de las células sanguíneas que presentan unas alteraciones transcripcionales y/o post-transcripcionales de la expresión genética, características de la presencia de una patología.

La invención reside en la demostración de que resulta posible detectar una patología en curso de formación a partir de unas firmas genómicas identificadas en las células sanguíneas, los núcleos embrionarios patológicos que pueden existir en los tejidos nerviosos como el cerebro o la médula ósea (lugar de dichas enfermedades neurodegenerativas) o en cualquier otro tejido por ejemplo en el origen de un cáncer (pecho, pulmón, prostat, hígado, tejido óseo, etc...).

La invención demuestra de una forma inesperada que existe a nivel de las células sanguíneas (preferentemente de las células nucleadas, tales como los linfócitos, macrófagos, monocitos, células dentríticas, etc...) unas alteraciones transcripcionales y post-transcripcionales de la expresión genética después de unas interacción (es) directa (s) o indirecta (s) con las células a lo largo de la iniciación patológica.

Más particularmente, la invención demuestra de una forma inesperada que existe a nivel de las células sanguíneas (preferentemente de las células nucleadas, tales como los linfócitos, macrófagos, monocitos, células dentríticas, etc...) unas alteraciones transcripcionales cualitativas de los genes a continuación de una (s) interacción (es) directa (s) o indirecta (s) con las células a lo largo de la iniciación patológica.

Más particularmente, en una forma de realización de la invención, el banco utilizado comprende además unos ácidos nucleicos específicos de genes cuyo nivel de expresión se modifica en una célula sanguínea que procede de un organismo que presenta una situación patológica.

La invención se basa principalmente en un método original, el análisis cualitativo de las diferencias ligadas a la presencia de inserciones o de delecciones (epissages alternativos) en unas regiones esenciales para la función de los productos de los genes. Dichas inserciones y deleciones se regulan principalmente y son características de los estados fisiológicos y fisiopatológicos (principalmente proliferativos y diferenciados) de las células del organismo. Dicho nivel de regulación se efectúa a lo largo de la iniciación, del mantenimiento y del desarrollo de un gran número de patologías. En un modo preferido, la invención reside por lo tanto asimismo en la aplicación de una tecnología genómica destinada a analizar sistemáticamente dichas desregulaciones en la puesta a punto de diagnósticos predictivos. La invención permite de este modo identificar los genes desregulados en unas células circulantes en el momento de los episodios patológicos, y de utilizar dichos episodios genéticos cualitativos en unos ensayos diagnósticos, predictivos o de detección de episodios patológicos, que contribuyen al control total de dichos desgastes de salud.

Con la perspectiva de identificar unos marcadores de expresión génica específicamente presentes en las células sanguíneas de un organismo que presenta una patología, por ejemplo en un estadio muy precoz para poder ser diagnosticado mediante exámenes clínicos o ensayos diagnósticos clásicos, la presente invención propone ventajosamente identificar unas alteraciones post-transcricpionales. En efecto dichas alteraciones son principalmente consecuencia de la modificación de la regulación de una etapa clave de la expresión génica: el empalme "splicing". Las variaciones de empalme "splicing" modifican de forma cualitativa los ARN incluyendo o excluyendo de los mismos unos exones o intrones cuya presencia o ausencia ligada a una situación fisiopatológica determinada pueden proporcionar la base para el diagnóstico. Dicho diagnóstico se puede basar en la utilización de PCR o de hibridaciones que permiten detectar específicamente la secuencia empalmada de forma diferencial entre las dos situaciones. A menudo las variaciones de empalme "splicing", mediante la utilización de exón (es) alternativo(s) o mediante la retención de intrón (es) en un ARN mensajero afectan a la secuencia de la proteína correspondiente. Dichas diferencias en el encadenamiento de los aminoácidos permiten prever un diagnóstico basado en la utilización de anticuerpos que reconocen específicamente la secuencia proteica alternativa.

Tal como se indica a continuación, el procedimiento de la invención reside principalmente en la utilización de células circulantes como material biológico. Más particularmente, se trata de células sanguíneas, y preferentemente de células nucleadas. Se puede citar principalmente los linfocitos, los macrófagos, los monócitos, las células dentríticas, etc..- Dichas células se pueden extraer del paciente mediante cualquier técnica conocida por la persona experta en la técnica, citaferesis, gradientes de Ficoll, preparación de células mononucleadas de la sangre periférica, etc... Para la utilización de la presente invención, las diferentes poblaciones de células sanguíneas se pueden separar las unas de las otras, para utilizar únicamente un tipo particular, que presenta una firma genómica específica. Sin embargo, el ensayo de la invención se puede llevar a cabo asimismo sobre una muestra biológica que comprende unas células sanguíneas no separadas. Por otra parte, las células circulantes pueden asimismo ser (o comprender) unas células tumorales, desenganchadas del tejido patológico, por ejemplo en el caso del proceso de la metástasis. Los ácidos nucleicos se pueden preparar a partir de la muestra según cualquier técnica conocida por la persona experta en la técnica (lísis celular, extracción, aislamiento de ARN, etc..) Además, dichos ácidos nucleicos se tratan preferentemente con anterioridad a la etapa de hibridación, por ejemplo para preparar ADNc, para amplificar dichos ácidos nucleicos, para marcarlos, etc... A este respecto, el marcaje puede ser por ejemplo radioactivo, enzimático, fluorescente, colorimétrico, o de cualquier otra naturaleza. Típicamente, el procedimiento de la invención comprende la extracción de una muestra biológica sanguínea, el tratamiento de las células sanguíneas para liberar los ácidos nucleicos, la amplificación de los ácidos nucleicos (y, en el caso de que sea necesario, su transcripción inversa), el marcaje de los ácidos nucleicos y su hibridación sobre el o los bancos.

El procedimiento de la invención se puede utilizar para detectar la presencia de una patología (o de un suceso patológico), es decir la existencia de mecanismos celulares característicos de una situación de iniciación o de desarrollo de una patología, incluso si los síntomas clínicos no resultan todavía aparentes. El procedimiento de la invención puede en relación con ello permitir asimismo la detección in vitro del estadio de evolución de una patología en un paciente. De este modo, las firmas genéticas de las células evolucionan en función del estadio de progreso de la patología, y es posible detectar, gracias a unos bancos específicos, la evolución de una patología. Por otra parte, el procedimiento de la invención puede asimismo detectar in vitro la localización de una patología en un paciente, es decir por ejemplo el origen tisular de un núcleo patológico.

Tal como se indica a continuación, el procedimiento de la invención se puede utilizar para detectar diferentes tipos de patologías, principalmente unas patologías asociadas a unas desregulaciones de las vías de señalización celulares. Se puede tratar de patologías ligadas al envejecimiento, como por ejemplo las enfermedades neurodegenerativas, o cualquier otra patología que implica principalmente una proliferación celular anómala (cáncer, estenosis, etc..)

Según un modo particular, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define a continuación para la detección in vitro de la presencia, del estadio de evolución y/o de la localización de una patología neurodegenerativa.

Según otro modo particular, la invención se refiere a un procedimiento tal como se define a continuación para la detección in vitro de la presencia, del estadio de evolución y/o de la localización de una patología cancerosa. Se puede tratar de cánceres variados, como por ejemplo tumores sólidos (hepáticos, pulmonar, de cabeza y cuello, melanoma, hígado, vesícula, pecho, etc..).

La invención describe asimismo un procedimiento de detección in vitro de células sanguíneas características de un estado patológico, que comprende la extracción de una muestra de células sanguíneas en un paciente y la determinación de la presencia, en dicha muestra, de células sanguíneas que presentan un perfil genético característico de una patología.

Tal como se describe a continuación, la invención reside en parte en la constitución y la utilización de bancos de ácidos nucleicos característicos de un estado patológico, En una primera forma de realización, se trata de bancos (o de preparaciones) de ácidos nucleicos, que comprenden unos ácidos nucleicos específicos de unos genes cuyo nivel de expresión se modifica en una célula sanguínea procedente de un organismo en una situación patológica.

Según otra forma de realización, se trata de bancos (o de preparaciones) de ácidos nucleicos, que comprenden unos ácidos nucleicos específicos de formas de empalme "splicing" de genes, característicos de una célula sanguínea procedente de un organismo en una situación patológica.

Las preparaciones y los bancos de la invención pueden colocarse sobre unos soportes, afinados y mezclados, tal como se describirá en mayor detalle a continuación en el texto.

La invención describe además unos métodos para la preparación de dichos bancos. En particular, dichos métodos comprenden (i) la obtención de una primera preparación de ácidos nucleicos a partir de una célula sanguínea aislada de un organismo que presenta una patología neurodegenerativa o un tumor sólido, (ii) la obtención de una preparación de ácidos nucleicos de referencia a partir de una célula sanguínea aislada de un organismo que no presenta dicha patología, (iii) una etapa de hibridación entre dicha primera preparación y la preparación de referencia, y (iv) la recuperación, a partir de los híbridos formados, de clones de ácidos nucleicos específicos de formas de empalme "splicing" de genes característicos de la célula sanguínea que proceden del organismo en situación de patología.

La invención describe asimismo unos procedimientos de preparación de bancos de ácidos nucleicos característicos de un estadio de evolución de una patología, que comprende (i) la obtención de una primera preparación de unos ácidos nucleicos a partir de una célula sanguínea aislada de un organismo que presenta una patología neurodegenerativa o un tumor sólido en un estadio de evolución determinado, (ii) la obtención de una preparación de ácidos nucleicos de referencia a partir de una célula sanguínea aislada de un organismo que presenta dicha patología en un estadio de evolución diferente, (iii) una etapa de hibridación entre dicha primera preparación y la preparación de referencia, y (iv) la recuperación, a partir de los híbridos formados, de clones de ácidos nucleicos específicos de formas de empalme "splicing" de genes característicos de la célula sanguínea que proceden del organismo en el estadio de evolución determinado de la patología.

Tal como se describirá con detalle más adelante, la etapa de recuperación de los clones puede comprender o bien la recuperación de los clones de ácidos nucleicos no hibridados, o bien la recuperación, a partir de unos híbridos formados, de clones de ácidos nucleicos específicos de formas de empalme "splicing" de genes.

La invención se refiere asimismo a cualquier equipo utilizable para la utilización de un procedimiento tal como describe a continuación que comprende un banco de ácidos nucleicos que comprenden unos ácidos nucleicos específicos de alteraciones de expresión genética características de células sanguíneas de un organismo en situación patológica.

Identificación de marcadores específicos de las modificaciones transcripcionales y post-transcripcionales

Tal como se indica a continuación, la invención describe unos procedimientos de preparación de unos bancos de ácidos nucleicos característicos de un estadio de evolución de una patología, que comprenden (i) la obtención de una primera preparación de ácidos nucleicos a partir de una célula sanguínea aislada de un organismo que presenta una patología en un estadio de evolución determinado, (ii) la obtención de una preparación de ácidos nucleicos de referencia a partir de una célula sanguínea aislada de un organismo que presenta dicha patología a un estadio de evolución diferente, (iii) una etapa de hibridación entre dicha primera preparación y la preparación de referencia, y (iv) la recuperación de los ácidos nucleicos característicos de la célula sanguínea que proceden del organismo en el estadio de evolución determinado de la patología.

Los métodos de la invención comprenden más particularmente la constitución de clones y de bancos de ácidos nucleicos a partir de ARN(s) extraídos de diferentes patologías, en diferentes estadios de su progresión, y obtenidos tanto a partir de tejidos patológicos como a partir de las células sanguíneas cuya expresión genética ha sido afectada por dichos tejidos. La obtención de dichos clones y de dichos bancos se lleva a cabo ventajosamente mediante unas técnicas de análisis diferenciales de la expresión genética. Las firmas diferenciales obtenidas son por lo tanto específicas de diferencias entre un tejido enfermo y un tejido sano por una parte y de células sanguíneas del paciente y de células sanguíneas de un control sano por otra parte. Dichas firmas pueden por lo tanto expresarse preferentemente o bien en las muestras patológicas o bien en las muestras controles.

Las poblaciones de ácidos nucleicos que sirven para la obtención de clones o para la constitución de bancos son por ejemplo unos ARN (totales o mensajeros) de las células extraídas de una situación patológica y unos ARN (totales o mensajeros) que corresponden a una situación control, o unos ácidos nucleicos derivados de dichos ARN totales o mensajeros (mediante transcripción inversa, amplificación, clonaje en los vectores, etc..). Dichos ácidos nucleicos se pueden preparar según las técnicas conocidas por la persona experta en la técnica. Brevemente, dichas técnicas comprenden generalmente una lísis de las células, tejido o muestra, y el aislamiento de los ARNs mediante unas técnicas de extracción. Se puede tratar en particular de un tratamiento mediante unos agentes caotrópicos tales como el tiocianato de guanidio (que destruye las células y protege los ARN) seguido de una extracción de los ARN mediante unos solventes (fenol, cloroformo por ejemplo). Tales métodos son bien conocidos por la persona experta en la técnica (ver Maniatis et al., Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162 (1987) 156), y pueden practicarse cómodamente utilizando unos equipos disponibles en el mercado tales como por ejemplo el conjunto US73750 (Amersham) para los ARNs totales. No es necesario que los ARNs utilizados sean perfectamente puros, y principalmente no resulta molesto que algunas trazas de ADN genómico o de otros componentes celulares (proteína, etc..) subsistan en las preparaciones, mientras que no afecten significativamente la estabilidad de los ARNs. Además, de forma facultativa, resulta posible utilizar no unas preparaciones de ARN totales pero si unas preparaciones de ARN mensajeros. Dichos ARN se pueden aislar, o bien directamente a partir de la muestra biológica o bien a partir de los ARN totales mediante las secuencias poliT, según los métodos clásicos. La obtención de ARN mensajeros puede por ello realizarse mediante unos equipos comerciales tales como por ejemplo el equipo US72700 (Amersham). Los ARN pueden asimismo obtenerse directamente a partir de unos bancos o de otras muestras preparadas con antelación y/o accesibles en unas colecciones, conservadas en unas condiciones adecuadas.

La hibridación se puede llevar a cabo en diferentes condiciones, que pueden ser ajustadas por la persona experta en la técnica. Preferentemente, se utiliza para la hibridación un exceso de la población de ácidos nucleicos derivados de la situación de la desregulación en relación con la población de ácidos nucleicos derivados de la situación control.

A partir del producto de la reacción de hibridación, se pueden utilizar dos tipos principales de enfoques para aislar los clones característicos de desregulaciones (patológicas) según la invención. La primera, puramente cuantitativa, permite generar una preparación de ácidos nucleicos reagrupando el conjunto (o una parte significativa) de clones resultantes de una diferencia de nivel de expresión entre las dos situaciones. De tales clones (y bancos) se obtienen según las técnicas conocidas de hibridación sustractiva, consistente esencialmente en eliminar los híbridos formados en la etapa de hibridación, para conservar solo los clones no hibridados, característicos de la situación de desregulación en relación con la situación de control seleccionada.

En una forma de realización preferida, se utilizan sin embargo un procedimiento cualitativo, que permite generar una preparación de ácidos nucleicos reagrupando el conjunto (o una parte importante) de los clones resultantes de alteraciones genéticas funcionales características de la situación de desregulación en relación con la situación control seleccionada. Más particularmente, tal banco cualitativo no comprende el conjunto de clones cuya expresión se modifica, sino por ejemplo los clones correspondientes a unas empalmes "splicing" o a unas deleciones diferenciales entre las dos situaciones. Teniendo en cuenta que los empalmes "Splicing" alternativos en las vías de regulación y de transformación celulares, de tales preparaciones (y bancos) implican ventajosamente unos clones que presentan un valor funcional importante, y por lo tanto susceptibles de reflejar unas modificaciones genéticas implicadas en la situación de desregulación. Tales clones permiten por lo tanto constituir unos bancos más predictivos y generar unos marcadores genéticos más representativos.

La constitución de tales bancos cualitativos se puede llevar a cabo por aislamiento, a partir de unos híbridos formados en la etapa de hibridación, de las regiones de ácidos nucleicos que corresponden a unos empalmes "splicing" diferenciales o a unos delecciones. Según los métodos empleados, dichas regiones corresponden o bien a las regiones no apareadas, o bien a las regiones apareadas.

Dichos dos enfoques se describen con mayor detalle a continuación.

Producción y utilización de bancos diferenciales cuantitativos

En una primera forma de realización , se utiliza por lo tanto en la presente invención un banco diferencial cuantitativo, es decir un banco que comprende unos clones de ácidos nucleicos correspondientes a unos genes cuyo nivel de expresión se modifica en unas células en situación patológica en relación con una situación control. Tales bancos pueden derivarse por ejemplo de análisis diferenciales cuantitativos, y reagrupar las secuencias cuya expresión está incrementada o disminuida cuando se producen fenómenos de desregulación celular. Las metodologías para establecer dicho tipo de bancos son conocidas por la persona experta en la técnica y se pueden reagrupar en las categorías siguientes:

Sustracción electrónica a partir de secuenciación a flujo elevado

Dicho procedimiento se basa en la secuenciación aleatoria de un determinado número de cDNAs. Se puede utilizar a continuación un motor de búsqueda informática para llevar a cabo una sustracción entre dos situaciones analizadas.

Serial Analysis of Gene Expresión (SAGE)

Dicho procedimiento se basa en el reconocimiento de una firma asociada a cada cDNA utilizando unos enzimas de restricción y unos oligonucleótidos adaptadores. Dicha etiqueta corresponde a una parte de la secuencia del cDNA (longitud de 10 nucleótidos con el fin de identificar de forma no ambigua el cDNA correspondiente). Dichas etiquetas se ensamblan a continuación para secuenciarse y posteriormente ser analizadas (Velculescu et coll., Science, 1995, 270 : 484-487). Dicho enfoque representa por lo tanto un acortamiento en relación con la secuenciación sistemática.

Nucleic Acid Arrays

Dicho método radica en la colocación de ácidos nucleicos (oligonucleótidos, fragmentos PCR, cDNAs) sobre unos soportes sólidos (membranas, placas de cristal, bio-microchips) a mayor o menor densidad. Unas sondas procedentes de ARN mensajero de muestras sanas o patológicas se utilizan a continuación para la hibridación con el fin de identificar los mensajeros que o bien se expresan o bien están reprimidos.

Differential Display

Dicha técnica utiliza un molde oligo -dT y unos moldes aleatorios para realizar unas reacciones de PCR sobre unas poblaciones de ADNc. Los productos de PCR se comparan a continuación sobre unos geles muy resolutivos. Los fragmentos expresados de forma diferencial se aíslan a continuación y se confirma su presencia mediante Northern-blots antes de la secuenciación.

Se han desarrollado diversas variantes de dicha tecnología (Prashar y Weissman, PNAS, 1996, 93:659-663). Dichas variantes difieren por sus moldes y por la elección de los enzimas de restricción y de los adaptadores utilizados, Como la tecnología SAGE, se dirigen a las extremidades 3' de los cDNAs. Diversos equipos están asimismo disponibles en el mercado con el fin de hacer más asequible dicho enfoque.

Clonaje por sustracción

Dicha técnica se basa en la eliminación de cDNAs comunes en dos muestras que se desean comparar. De este modo, se proponen diferentes conjuntos de sustracción en los que el cDNA "tester" se híbrida con un exceso de cDNA "driver" (Clontech). El producto final está constituido por un conjunto de fragmentos amplificados mediante PCR derivados de unos cDNAs expresados de forma diferencial, que se pueden clonar en un vector adecuado para su análisis posterior. La tecnología RDA (Representational Difference Analysis) se basa asimismo en un principio de sustracción (Lisitsyn et coll., Science, 1993, 259, 946-951).

La utilización de dichas técnicas de análisis diferenciales permiten por lo tanto generar unos clones y unos bancos cuantitativos, es decir reagrupando el conjunto de las secuencias cuya expresión está aumentada o disminuida cuando se producen unos fenómenos de desregulación (es) celular (es) implicados en las patológicas.

Producción y utilización de bancos cualitativos diferenciales

En otra forma de realización, se utiliza ventajosamente en la presente invención un banco diferencial cualitativo, es decir un banco comprendiendo unos clones de ácidos nucleicos en los que por lo menos una parte de la secuencia corresponde a la secuencia de genesempalmados diferencialmente entre unas células correspondientes a una situación patológica y a una situación control. Dicho tipo de banco reagrupa por lo tanto las secuencias empalmadas de forma diferencial en el momento del proceso de desregulación patológica.

La utilización de dicho tipo de banco resulta particularmente ventajosa. En efecto, las diferentes vías de señalización que están alteradas en gran número de patologías, como los cánceres y las enfermedades neurodegenerativas por ejemplo, implican unos genes y por lo tanto unos ARNm cuya expresión está regulada mediante empalme "Splicing" alternativo. Además, un número creciente de ejemplos proporcionados por la literatura muestran que unas formas de ARN específicamente observadas en patología son el resultado de una alteración del empalme "splicing".

En relación con la originalidad de la invención, se debe subrayar asimismo que el estado de activación de los diferentes tipos celulares que participan en la respuesta inmunitaria está regulado por unas cascadas de señalización cuyos actores son regulados mediante empalme "splicing".

De este modo, la demencia Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson son por lo tanto unos ejemplos de enfermedades que presentan un impacto real económico y que presentan un componente neurodegenerativo. Incluso si la descripción de los síntomas clínicos y la identificación de algunos genes de susceptibilidad han permitido llevar a cabo unos pasos significativos en el conocimiento de dichas enfermedades, las bases moleculares que sostienen el desarrollo de dichas enfermedades son todavía muy oscuras. La elucidación de las cascadas de señalización, desreguladas en dichos estados patológicos, conducirá de una forma indudable al descubrimiento de dianas adecuadas para la intervención diagnóstica y terapéutica. Laa literatura subraya la importancia de las alteraciones de los procesos de empalme "splicing" de los ARN.

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La amiotrofia espinal es una de las enfermedades genéticas más frecuentes. Dos genes SMN1 y SMN2 codifican para unas proteínas idénticas, la pérdida de dos alelos SMN1 y una alteración del empalme "splicing" del gen SMN2 participan en el desarrollo de la enfermedad (Lorson et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96 : 6307-6311).

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En unas biopsias de pacientes afectados de la enfermedad de Alzheimer, se han detectado unas alteraciones específicas del empalme "splicing" del gen de presinilina PS1 (Isoe-Wada et aoll., Eur. J. Neurol., 1999 : 163-167).

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El transportador de glutamato presenta una importancia mayor en unas enfermedades neurodegenerativas tales como la esclerosis Amiotrófica lateral o la epilepsia, por ejemplo. Unas alteraciones del empalme "splicing" de dicho transportador afectan su funcionalidad (Meyer et coll, Neurosci. Lett, 1998, 241 : 68-70).

Hoy en día se conocen numerosos ejemplos de inactivación de la actividad anti-oncogen resultante de empalme "splicing" alternativo de los mensajeros correspondientes:

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En los carcinomas pulmonares de células pequeñas, el gen de la proteína p130 que pertenece a la familia RB (proteína del retinoblastoma) está mutado a nivel de un lugar consenso para el empalme "splicing". La consecuencia de dicha mutación es la eliminación del exón 2 que tiene como resultado una ausencia de síntesis de la proteína debido a la presencia del codón "stop" precoz. Dicha observación ha sido la primera a subrayar la importancia de los miembros de la familia RB en la tumorigénesis.

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En los cánceres de la cabeza y del cuello, uno de los mecanismos de p53 implica una mutación en un lugar consenso de empalme "splicing".

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En otros tipos de cánceres de pulmón, el gen de la proteína p16/INK A, proteína que es un inhibidor de las quinasas ciclinas dependientes CDK4 y CDK6 está mutada a nivel de un lugar donante de empalme "splicing". El resultado de dicha mutación es la producción de una proteína truncada con una semi vida corta. Entonces la proteína p16 se asocia normalmente a CDK4 y CDK6, impidiendo su asociación con las ciclinas de tipo D y la fosforilación en particular RB, lo que tiene como consecuencia la acumulación de las formas hipofosforiladas, activas, de RB. En ausencia de p16, RB está inactiva por fosforilación. Se debe destacar que el locus p16 es en efecto particularmente complejo y que en lugar de la expresión de p16, permite la de p19 por empalme "splicing" alternativo. La proteína p19 que no presenta ningún aminoácido en común con la proteína p16, se puede asociar al proto-oncogen MDM2 y bloquear el ciclo celular en presencia de p53, ejerciendo de este modo una función "supresor del tumor".

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WT1, anti-oncogen que codifica para un supresor transcripcional cuyas alteraciones son el origen de los tumores de Wilms, se transcribe en diversos ARN mensajeros engendrados mediante empalme "splicing" alternativo. En los cánceres de pecho, las proporciones relativas de las diferentes variantes se modifican en relación con el tejido sano, proporcionando unas herramientas diagnósticas y unas pistas para comprender la importancia de los diferentes dominios funcionales de WT1 en la progresión tumoral.

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Dicho mismo fenómeno de modificación de las relaciones entre diferentes formas de ARN mensajeros y de isoformas proteicas se encuentra en la neurofibrina NF1 en los neurofribromas.

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Dicha noción de modulación de los fenómenos de empalme "splicing" que firma la progresión tumoral se refuerza asimismo por el ejemplo de HDM2. Se han detectado en efecto cinco empalmes "splicing" alternativos de HDM2 en los carcinomas ováricos y los pancreáticos y, lo que es particularmente interesante, su expresión aumenta según el estadio de progresión tumoral.

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La LTBP, componente de la matriz extracelular de diversos tejidos que intervienen en la secreción y el almacenamiento del TGF-\beta se produce asimismo bajo diferentes isoformas. Una de ellas, probablemente menos sensible a la proteolisis, parece modular la actividad biológica del TGF-\beta y podría estar implicada en diferentes estados fisiopatológicos hepáticos.

Las respuestas inmunitarias celulares y humorales es encuentran bajo control transcripcional. La literatura proporciona numerosos ejemplos de isoformas nativas producidas mediante empalme "splicing" alternativo implicadas en dichas respuestas inmunitarias.

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los receptores "basureros" de los macrófagos son unas glicoproteínas membranosas esenciales para las respuestas fisiológicas y patológicas de dichas células sanguíneas y sus funciones se regulan mediante unas isoformas generadas por empalme "splicing" (Gough et coll. J. Lipid Res; 1998; 39 : 531-543).

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La activación de los linfocitos T requiere la presencia funcional de diversos receptores y proteínas reguladoras. Boriello y coll. (J. Immunol. 1995; 155 : 5490-5497) han descrito la presencia de isoformas del co-factor de activacion B7, después del empalme "splicing" alternativo de dicho gen, subrayando de este modo la gran plasticidad de la respuesta inmunitaria aportado por dichas variantes de empalme "splicing".

Tröster et al. (J. Exp. Med. 180 (1994) 2059) aporta por otra parte la identificación de una forma de empalme "splicing" del gen La/SS-B, sin por ello establecer su correlación con una patología.

Para tener en cuenta dichos fenómenos y dicha complejidad, y aislar de este modo unas firmas específicas de un estado patológico y presentes en las células sanguíneas, el procedimiento de la invención utiliza ventajosamente, como marcadores genéticos, unos episodios de empalme "splicing" característicos de las situaciones de desregulación.

Con dicho fin, la presente invención utiliza por ejemplo unos bancos de ácidos nucleicos cualitativos diferenciales producidos según la metodología "DATAS" descrita en la solicitud de patente internacional no publicada nº PCT/FR 99/00547. En particular, tales bancos se pueden preparar por hibridación entre la población de ácidos nucleicos derivada de unas células aisladas de la circulación sanguínea a partir de la situación patológica y la población de ácidos nucleicos derivados de las células circulantes de la situación de control, y aislamiento, a partir de los híbridos formados, de los ácidos nuclecios correspondientes a los empalmes "splicing" diferenciales.

En dicho enfoque, la hibridación se realiza preferentemente en fase líquida. Además, se puede llevar a cabo en cualquier dispositivo adecuado, tal como por ejemplo unos tubos (Eppendorf, por ejemplo), unas placas, o cualquier otro soporte adaptado y normalmente utilizada en Biología Molecular. La hibridación se realiza ventajosamente en unos volúmenes comprendidos entre 10 y 1000 \mul, por ejemplo entre 10 y 500 \mul. Se entiende que el dispositivo utilizado y los volúmenes utilizados se pueden adaptar fácilmente por la persona experta en la técnica, las cantidades de ácidos nucleicos utilizados para la hibridación son asimismo conocidas por la persona experta en la técnica. En general, es suficiente utilizar unos microgramos de ácidos nucleicos, por ejemplo del orden de 0,1 a 100 \mug. Por otra parte, es posible utilizar los ácidos nucleicos en una relación driver/tester variando de 50 a 0,02 aproximadamente, preferentemente de 40 a 0,1. De forma más particularmente ventajosa, se prefiere que dicha relación sea próxima o superior a 1, ventajosamente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10. Se entiende que dicha relación se puede adaptar por la persona experta en la técnica según las condiciones del procedimiento (cantidades de ácidos nucleicos disponibles, situaciones fisiológicas, objetivo buscado, etc..). Los otros parámetros de hibridación (tiempo, temperatura, fuerza iónica) son asimismo adaptables por la persona experta en la técnica. De forma general después de la desnaturalización de los "tester" y "driver" (por calentamiento por ejemplo), la hibridación se lleva a cabo durante aproximadamente durante 2 a 24 horas, a una temperatura de aproximadamente 37ºC (eventualmente sometida a unos saltos de temperatura), y en unas condiciones estándar de fuerza iónica (pudiendo variar de 0,1 M a 5 M NaCl, por ejemplo). Se conoce que la fuerza iónica es uno de los factores determinante de la astringencia de una hibridación, principalmente en el caso de hibridación sobre un soporte sólido.

Según una forma de realización particular de la invención, la hibridación se realiza en una emulsión fenólica, por ejemplo según la técnica PERT (Phenol Emulsion DNA Reassociation Technique) descrita por Kohne D.E et al. (Biochemistry, Vol. 16, Nº 24, pp 5329-5341, 1977). Ventajosamente, la hibridación se realiza en una emulsión fenólica mantenida mediante unos termociclos (saltos de temperatura de 37ºC aproximadamente a 60/65ºC aproximadamente) y no por agitación, según la técnica descrita por Miller y Riblet (NAR 23 (1995) 2339).

Se puede utilizar en el marco de la presente invención, cualquier otra técnica de hibridación en fase líquida, preferentemente en emulsión. Por otra parte, la hibridación puede asimismo llevarse a cabo con una de las parejas inmovilizada sobre un soporte. Ventajosamente, es el driver que se inmoviliza. Esto se puede llevar a cabo principalmente gracias a unos moldes biotinilada o por cualquier otra técnica de inmovilización conocida por la persona experta en la técnica.

A partir de unas poblaciones de ácidos nucleicos generadas por hibridación, los marcadores genéticos de la invención (los clones característicos de las alteraciones genómicas cualitativas) se pueden identificar mediante cualquier técnica conocida por la persona experta en la técnica. En el caso de los heterodúplex ARN/ADN, dichas regiones se presentan esencialmente en forma de regiones de ARN no apareadas (bucles de ARN), y se pueden identificar y clonar por separación de los heterodúplex y de los ácidos nucleicos de hebra simple (exceso de ácido nucleico que no ha reaccionado), digestión selectiva de los ARN de doble hebra (dominios implicados en los heterodúplex), y después por separación de los ARN de hebra simple resultante y de los ADN de doble hebra. En el caso de los heterotriplex, dichas regiones de empalme "splicing" diferenciales se presentan esencialmente en forma de regiones de ADN de doble hebra y se pueden identificar y clonar por tratamiento en presencia de enzimas adecuados tales como un enzima que permite digerir los ARN, y después un enzima que permite digerir los ADN de hebra simple. Los ácidos nucleicos obtenidos de este modo se encuentran directamente en forma de ADN doble-hebra y se pueden clonar en cualquier vector adecuado.

Se entiende que se indican otras variantes y condiciones precisas para el aislamiento de los ácidos nucleicos, las hibridaciones y la obtención de clones cualitativos en la solictud nº PCT/ FR 99/00547 no publicada todavía.

Dichas metodologías permiten generar unos clones y unos bancos de ácidos nucleicos correspondientes a unos marcadores genéticos cualitativos que permiten distinguir las células sanguíneas de una situación sana de las de una situación patológica. Tal como se indica en la sección experimental, dichas preparaciones de ácidos nucleicos representan unos marcadores particularmente útiles para diagnosticar a partir de una extracción sanguínea unas enfermedades neurodegenerativas y unos cánceres.

Diversidad de los bancos

Las técnicas descritas a continuación permiten por lo tanto generar unos conjuntos de clones de ácidos nucleicos característicos de las diferencias entre las situaciones sana y patológica. Cada técnica de preparación genera numerosos clones, que constituyen unos bancos. Dichos bancos se pueden utilizar tal cual, dispuestos sobre unos soportes o modificados por adición o supresión de clones, reagrupación de diferentes bancos, adición de clones control, etc..

Los bancos de la invención pueden comprender por ejemplo de 10 a 50.000 clones, más generalmente de 10 a 10.000 clones, más preferentemente de 50 a 5.000 clones. Los clones se disponen generalmente, de forma ordenada, sobre uno o diversos soportes, de forma que se facilita el análisis de los resultados de la hibridación. EL soporte puede ser de vidrio, nylon, plástico, fibra, etc..., de forma general cualquier soporte sólido se adapta para la extensión de los ácidos nucleicos. La colocación de los bancos sobre los soportes se pueden llevar a cabo por unas técnicas convencionales conocidos por la persona experta en la técnica, que se describen por ejemplo en la solicitud internacional PCT/FR99/00547.

Los bancos utilizados pueden comprender a la vez unos clones de ácidos nucleicos correspondientes a unos genes cuyo nivel de expresión está modificado (marcadores genéticos cuantitativos) y unos clones de ácidos nucleicos de los que por lo menos una parte de la secuencia corresponde a unos exones o a unos intrones empalmados de forma diferencial entre una situación sana y una situación patológica (marcadores genéticos cualitativos). De este modo, los marcadores genéticos se pueden generar según unos enfoques diferentes, y después se mezclan para obtener una respuesta tanto predictiva como posible.

Es asimismo posible reunir en un mismo banco, sobre un mismo soporte, unos marcadores de la expresión genética expresados específicamente en las células presentes en la circulación sanguínea cuando se presentan unas patologías diferentes. La hibridación de tal banco permite por lo tanto una continuación del desarrollo de diversas patologías a partir de una misma extracción sanguínea.

Un objeto de la presente invención reside por lo tanto asimismo en una preparación de ácidos nucleicos comprendiendo unos marcadores genéticos cualitativos y cuantitativos de desregulación (es) celular (es) presentes en las células de la circulación sanguínea y sintomáticos de patologías. Un objeto particular reside en un banco que comprende unos marcadores genéticos característicos de diferentes situaciones de desregulación. La invención tiene asimismo por objeto cualquier soporte sólido sobre el que por lo menos se han dispuesto dos bancos de ácidos nucleicos característicos de dos situaciones de desregulación. A este respecto, la invención se refiere a un procedimiento de preparación de un microchip de ADN utilizable para el diagnóstico de patologías, comprendiendo el depósito, sobre un soporte sólido, de una o diversas preparaciones de ácidos nucleicos características de situación (es) de desregulación.

Por otra parte, según una forma de realización preferida, se utilizan unos bancos de ácidos nucleicos afinados por selección de clones a medida que se utiliza, en función de su implicación eficaz en diferentes patologías o diferentes estadios de una misma patología. Los bancos iniciales pueden en efecto comprender por ejemplo el conjunto de los clones característicos de los episodios genéticos de una situación de desregulación consecutiva al establecimiento de una patología. Después, la utilización del procedimiento de diagnóstico de la invención permite observar que algunos de los clones hibridan con unas sondas derivadas de los estadios precisos e intermediarios del desarrollo de la patología. Dichos clones se pueden identificar por lo tanto como reveladores de estadios precoces y pueden proporcionar una herramienta de diagnóstico muy potente capaz de anticipar cualquier criterio de exámen clínico, cualquier otra herramienta de diagnóstico.

De forma más específica, la presente invención describe en este momento la identificación y la caracterización de tales clones, utilizables como marcadores genéticos de la presencia y de la evolución de patologías.

Una de las mayores aplicaciones de la identificación y del clonaje de dichos marcadores genéticos se refiere a la evaluación del potencial de hibridación de los ARN extraídos de las células sanguíneas de un individuo determinado. Dicha evaluación se puede llevar a cabo hibridando una sonda que representa los ARN mensajeros de las células de dicho individuo con uno o diversos bancos de firmas características de situación (es) patológica(s), tal como las descritas a continuación. Dicha aplicación se describe en mayor detalle a continuación.

Métodos de análisis y de diagnóstico de las firmas de patologías

La invención permite determinar la presencia de firmas específicas de diferentes estadios de patologías por hibridación de una muestra de ácidos nucleicos de las células presentes en la circulación sanguínea con los marcadores genéticos definidos anteriormente, el perfil de hibridación observado indicando las desregulaciones fisiopatológicas del organismo del que se ha obtenido la muestra sanguínea. A dicho efecto, los marcadores genéticos utilizados se reagrupan preferentemente en forma de bancos, con de fin de proporcionar una respuesta tanto predictiva como posible. Una de las ventajas de la presente invención reside asimismo en el número importante de marcadores utilizados, que transforma la información generada en tan predictiva. El carácter predictivo de la información se consolida además a través de la naturaleza de los marcadores utilizados y preparados.

Un objeto particular de la invención reside en un método de análisis del estado de las células sanguíneas, que comprenden por lo menos una etapa de hibridación entre a) una muestra de ácidos nucleicos de las células sanguíneas y b) un banco de ácidos nucleicos que corresponden a unos episodios genéticos característicos de situación (es) de desregulación (es) de las vía(s) de señalización celulares, el perfil de hibridación que indican las desregulaciones fisiopatológicas del organismo.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se pondrán de manifiesto con la lectura de la sección experimental siguiente, que se debe considerar como ilustrativa y no limitativa.

Sección experimental Ejemplo de enfermedades neurodegenerativas: ALS

Los modelos animales dan acceso a unas muestras biológicas que permiten analizar las diferentes etapas del desarrollo de una patología y comparar dichas etapas con unos controles sanos.

La esclerosis amiotrófica lateral (SAL/ALS) es una enfermedad neurodegenerativa, asociada a diferentes tipos de inclusiones tales como los cuerpos de Lewis y caracterizada por una apoptosis de las motoneuronas espinales y corticales cuyo desenlace fatal se asocia a veces a una demencia frontal. Unas formas esporádicas, sin ninguna mutación descrita, coexisten con unas formas familiares (FALS) asociadas a unas mutaciones en el gen de SOD1 codificante para el superóxido dismutasa. Unos ratones transgénicos que expresan el gen humano SOD1 que presenta una de las mutaciones que prevalece en las FALS (mutación G93A) están disponibles en el Jackson Laboratory, con la condición de solicitud de una licencia de utilización a la NorthWestern University. La aparición de los síntomas de ALS ligados a la mutación G93A en SOD1 no es la consecuencia de una reducción de la actividad de la superóxido dismutasa sino en una ganancia en la función que aumenta la capacidad del enzima para generar unos radicales libres. Dicho modelo reproduce en 120 días el desenlace fatal de la enfermedad con unos síntomas comparables a los de la enfermedad humana. Dicho modelo permite tener acceso a unas muestras cerebrales, espinales y de sangre periférica.

Identificación de formas de empalme "splicing" específico del modelo de ALS

La empresa ExonHit Therapeutics desarrolla un enfoque original de cribado diferencial cualitativo basado en la tecnología DATAS (Differential Analysis of Transcripts Alternatively Spliced).Dicha tecnología representa el objeto de una solicitud de patente en Europa y en Estados Unidos. Las secuencias identificadas mediante DATAS pueden derivar de unos exones alternativos o de retención de intrones en una de las dos situaciones fisiopatológicas comparadas. Los datos obtenidos caracterizan por lo tanto unas modificaciones de la expresión de secuencias de ARN que afectan unos dominios funcionales de las proteínas. El análisis cualitativo diferencial se lleva a cabo en unas muestras de animales transgénicos y de los controles singénicos de 60 y 100 días de edad. Los 60 días corresponden a un estadio que precede en poco los primeros síntomas, pero que ya se ha caracterizado a nivel cerebral mediante los cambios de la fisiología celular, principalmente una alteración del metabolismo mitocondrial. A los 100 días, el 50% de las motoneuronas corticales y espinales están muertas y se ha iniciado un proceso activo de apoptosis neuronal paralelamente a una activación astrocitária.

El análisis cualitativo diferencial por lo tanto se ha llevado a cabo:

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a partir de ARN extraídos de unas muestras de cerebro y de médula espinal sin aislamiento previo de las neuronas con el fin de tomar en cuenta un máximo de episodios de empalmes "splicing" alternativos ligados al desarrollo de la patología.

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a partir de sangre total periférica o de fracciones celulares sanguíneas.

Las secuencias identificadas por DATAS corresponden a unos intrones y/o a unos exones de las que las expresiones diferenciales por empalme "splicing" entre las situaciones patológicas y la situación sana se validan por PCR.

La comparación de dichas consecuencias con los bancos de datos permite clasificar las informaciones obtenidas y proponer una selección razonada de las dos secuencias cuyo estudio se persigue.

Caracterización posterior de las secuencias obtenidas

Las secuencias validadas por PCR se pueden investigar en unos modelos complementarios que implican unos procesos de neurodegeneración. De este modo, los ARN que proceden de un modelo de isquemia cerebral o de los ARN de un modelo animal de enfermedad de priones se pueden estudiar útilmente con el fin de validar la expresión selectiva de marcadores de ALS o más generalmente de marcadores de enfermedades neurodegenerativas.

La expresión de las formas de empalmes "splicing" identificadas se investigará en unas muestras humanas representativas de diferentes patologías de componentes neurodegenerativos:

- extracciones sanguíneas de pacientes afectados de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, el Parkinson etc...

Ejemplo de cáncer: cáncer de las vías respiratorias y digestivas superiores

La transmisión de transgenes ha representado el objeto de diversas aplicaciones experimentales en el marco de la cancerología experimental. De este modo se utilizan los alelos dominantes de determinados genes cancerígenos para obtener unos ratones transgénicos, en el caso de modelo experimental para el estudio del cáncer.

Los cánceres constituyen un grupo heterogéneo de enfermedades caracterizadas cada uno por un conjunto complejo de alteraciones genéticas que tienen como consecuencia una proliferación celular anárquica y la diseminación de las metástasis. Si la identificación de las alteraciones genéticas que provocan la aparición y la progresión de los cánceres se presenta hoy en día esencial para diagnosticar y seguir la evolución tumoral, es la perspectiva de elaborar unos nuevos diagnósticos más precoces sobre la base de dichos conocimientos lo que hace evidente la importancia de la apuesta por dichas investigaciones por parte de la industria farmacéutica. Son numerosos los genes cuyas alteraciones pueden conferir a una célula unas propiedades cancerosas. Juegan unos papeles esenciales no solamente durante el desarrollo sino también a lo largo de la vida celular. Intervienen de este modo para asegurar unas funciones tan esenciales como la proliferación, la diferenciación, la reparación del ADN o la supervivencia celular. Aquellos cuyas alteraciones conducen a la producción de proteínas que activan de forma anómala el ciclo celular se denominan oncogenes. Se encuentran por ejemplo en dicha categoría los genes celulares myc y ras. Los anti-oncogenes tienen por le contrario como función normal frenar el ciclo celular. La inhibición de su actividad pone a la célula bajo la única dependencia de los genes con efecto proliferativo y favorece por lo tanto la progresión tumoral. Se encuentran en dicha categoría los genes RB (retinoblastoma) y P53. Junto a los oncogenes y los anti-oncogenes, los genes que modulan la muerte celular programada o apoptósis se muestran como unos actores importantes de la canerogénesis. Parecido a un proceso de diferenciación celular fisiológica, la muerte celular programada se controla genéticamente. El hecho de que una célula pierda la capacidad de iniciar dicha diferenciación terminal que permite su eliminación, la sitúa en efecto en una situación de supervivencia normal y puede favorecer el surgimiento de un clon celular transformado. Es lo que se observa en los linfomas foliculares humanos en los que el gen bcl-2 se encuentra sobreexpresado debido a la translocación ocurrida en los cromosomas 14 y 18. Dicha sobreexpresión de un gen con actividad anti-apoptótica favorece la supervivencia anómalamente larga de poblaciones celulares en cuyo núcleo pueden por lo tanto acumularse otras mutaciones transformantes. La muerte celular programada o apoptósis se reconoce en la actualidad como un mecanismo esencial para la eliminación de células transformadas en indeseables ya sea unas células infectadas con un virus como en el caso de células que han acumulado unas mutaciones que las hacen no funcionales o anormalmente proliferantes. El nivel de complejidad que rige la homeostasis celular deriva no solamente del número importante de actores implicados sino de los papeles variados que cada uno de ellos puede desempañar alternativamente en función del tipo celular o de las condiciones. El anti-oncogen p53 o el proto-oncogen cMyc pueden por ejemplo desempeñar un papel tan importante como el control de la apoptosis.

Tal complejidad hace necesaria la utilización de enfoques bastante globales para analizar las modulaciones de expresión de los conjuntos de genes y suficientemente específicas para, identificar lo más rápidamente posible las alteraciones más adecuadas en relación con el diagnóstico, del seguimiento de la progresión tumoral o de la identificación de nuevas dianas de acciones terapéuticas.

Utilizando diferentes sistemas de direccionamiento (regiones promotoras) es posible obtener de una forma preferencial la expresión del transgen en un tejido particular. Se puede asimismo disponer de modelos de tumores que se desarrollan en un ambiente tisular específico. Dichos diferentes modelos de tumores marcados dejan entrever la posibilidad de detectar unas firmas específicas a nivel de las células circulantes en función de la localización del tumor.

Modelo de tumor apuntado sobre el hígado

Existe en los ratones un modelo de histocompatibilidad (HCC) ligado a la expresión restringida en el hígado de unas secuencias precoces del virus SV40, codificante para los antígenos gran T y pequeña t (Dubois, N., Bennoun, M., Allemand, I., Molina, T., Grimber, G., Daudet-Monsac, M., Abelanet, R., and Briand, P., (1991) Time course development of differentiated hepatocarcinoma and lung metastasis in transgenic mice. J. Hepatol., 13, 227-239). El transgen se encuentra bajo el control del promotor del gen humano de la antitrombina III lo que conlleva una expresión precoz y constante de los antígenos
virales.

De este hecho, la proliferación hepatocelular sufre una perturbación en dos tiempos. El índice de proliferación de los hepatocitos transgénicos es proporcionalmente superior a la normal durante el desarrollo hepático (desde el nacimiento hasta la 5ª semana), después disminuye sensiblemente sin por ello alcanzar el índice más bajo característico del estado quiescente de un hígado normal. Dichos ratones transgéncios desarrollan de forma sistemática unos HCC diferenciados que conducen a la muerte de todos los animales antes de 7 meses. A pesar de una desregulación precoz de la proliferación de los hepatocitos, la hepatomegalia sólo aparece tardíamente. El análisis de las etapas preneoplásicas que preceden la aparición de los HCC ha permitido poner de manifiesto un mecanismo compensatorio por apoptósis, ahora una masa hepática normal en dicho modelo (Allemand et al., 1995). Resulta interesante indicar que dicha apoptósis se para en el momento en que el hígado normal entra en un estado quiescente. Más allá de este punto, parece que la hemostasis hepática ya no está controlada. Un estudio sistemático de la sensibilidad a la apoptósis ha revelado que los hepatocitos derivados de dicho modelo transgénico habían adquirido un carácter resistente a la muerte celular dependiente del sistema C95/Fas (Rouquet N, Allemand I, Molina T, Bennoun M, Briand P and Joulin V. (1995) Fas-dependent apoptosis is impaired by SV40 T-antigen in transgenic liver. Oncogene, 11, 1061-1067).

Rouquet N, Allemand I, Grimber G, Molina T, Briand P and Joulin V. (1996) Protection of hepatocytes from Fas-mediated apoptosis by a non-transforming SV40 T-antigen mutant. Cell Death and Diff., 3, 91-96) por un mecanismo independiente de un empalme "splicing" alternativo del receptor CD95/Fas. Sin embargo, sólo un análisis global de las modificaciones de los empalmes "splicing" puede dar evidencia de una alteración de dicho proceso para el conjunto de las parejas moleculares que intervienen en la vía de señalización del receptor CD95/Fas .

Dicho modelo transgénico representa una herramienta ideal para identificar 1) las modificaciones de la expresión génica que acompaña la transición preneoplasia hacia la neoplasia, ya sean unos genes indispensables para la transformación (oncogenes) o unos genes que se oponen a la progresión tumoral (genes apoptóticos) 2) unas firmas circulantes del desarrollo del cáncer ligadas al escape a partir del tumor de las células tumorales 3) de episodios de alteración de la expresión génica en las células de la sangre características del desarrollo del cáncer.

Identificación de las firmas específicas

El enfoque diferencial cualitativo se ha llevado a cabo a partir de los ARN extraídos del hígado y de las células de la sangre de ratones normales y de ratones que desarrollan unos hepatocarcinomas (HCC) ligados a la expresión del antígeno T del SV40 bajo el control del promotor de la antiTrombina III. Los animales control y los animales que expresan el transgen se seleccionan a diferentes edades permitiendo tener acceso a los estadios muy precoces, preneoplásicos y neoplásicos caracterizados principalmente en dicho modelo mediante una activación de la apoptosis necesaria en la hemostasis hepática.

Utilización de las secuencias identificadas

Las modulaciones de la expresión de dichas secuencias se podrían investigar a continuación en unas biopsias de tumores humanos con el fin de ampliar el campo de aplicación, en terapia humana y en diagnóstico.

Dichos ADNc se utilizan para seguir la evolución tumoral en dicho modelo transgénico y en una serie de modelos de HCC murinos producidos por transgénesis (Bennoun M, Grimber G, Couton D, Seye A, Molina T , Briand P and Joulin V. (1998) The amino terminal region of SV40 large T antigen is sufficient to induce hepatic tumours in mice. Oncogene, 17, en prensa). De este modo, utilizando los ADNc específicos detectados en los diferentes estadios muy precoces en las células sanguíneas, antes de la aparición de los tumores, se puede predecir en una población mixta de ratones sanos y de ratones transgénicos, las que van a desarrollar un cáncer.

Se pueden utilizar unas sondas nucleotídicas o unos moldes de PCR derivados de dichos ADNc específicos de los tumores para investigar la expresión, en unas biopsias de tumores humanos, las formas de empalmes "splincing" identificados y/o los ARN cuya cantidad se ha alterado en dicho modelo.

Asimismo, se pueden utilizar igualmente las sondas identificadas en la sangre de los animales con unos diferentes estadios del desarrollo tumoral con el fin de detectar unas firmas comunes en unas extracciones de sangre de pacientes afectados de cánceres.

En una estrategia que utiliza unos bancos de ADNc obtenidos según los procedimientos de la invención descritos anteriormente, se puede asimismo utilizar ,una sonda total preparada a partir de las extracciones sanguíneas de pacientes afectados de cáncer, para la búsqueda de firmas comunes en los diferentes bancos obtenidos de los modelos murinos en los diferentes estadios del desarrollo tumoral de una parte y a partir de las biopsias de diferentes tipos tumorales humanos por otra parte. Dichas hibridaciones se llevan a cabo según las técnicas conocidas por la persona experta en la técnica (ver principalmente las condiciones de hibridación descritas en la solicitud PCT/FR99/00547).

Búsqueda del diagnóstico predictivo en el hombre

La metodología descrita en el presente capítulo se puede utilizar indiferentemente utilizando las técnicas de análisis cuantitativo y cualitativo descritas a continuación. La invención da preferencia sin embargo a la utilización y la búsqueda de marcadores ligados a las alteraciones cualitativas de la expresión de los genes debido a las ventajas descritas anteriormente.

La invención describe la identificación y la constitución de bancos de firmas característicos de la evolución de una patología a partir de unas biopsias. De este modo es posible establecer unos bancos de secuencias de ADNc representativos de la evolución y de la localización de dichas patologías. Es por lo tanto posible buscar, a partir de una muestra sanguínea, la presencia de firmas ADNc idénticas a las que están presentes en los bancos. La presencia de firmas comunes subraya por lo tanto la presencia de ácidos nucleicos que presentan las mismas alteraciones que las presentes en las biopsias de las patologías sospechosas, muy probablemente derivadas de las células obtenidas de tejidos patológicos.

La utilización de dicha búsqueda se basa principalmente en la confección de sondas a partir de células sanguíneas y la hibridación de dichas sondas con unos filtros que agrupan diferentes marcadores específicos de tal o tal patología.

La invención describe la posibilidad de identificar unas alteraciones de la expresión de los genes a partir de células sanguíneas y ello a partir de modelos experimentales que mimetizan toda o parte de una patología humana (ejemplo modelo de ratón ALS o modelo de tumor hepático).

La utilización de sondas nucleicas derivadas de células sanguíneas de pacientes afectados o no de la patología diana (enfermedad neurodegenerativa, cáncer, etc..) permite investigar la existencia de firmas comunes con los bancos predictivos experimentales creados a partir de los modelos patológicos experimentales. La aparición de firmas comunes constituye un diagnóstico de un riesgo de desarrollo de tal patología en el individuo sometido al diagnóstico.

La invención permite igualmente proceder de la forma siguiente:

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Unas extracciones sanguíneas de pacientes afectados o no de una patología diana se mezclan con el fin de obtener un stock de ARN representativo de los estados patológico y sano.

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Dichos ARNs se someten a unos análisis diferenciales según las técnicas descritas en la invención y se constituyen unos bancos de ADNc característicos de los estados patológicos y sanos.

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Dichos bancos de ADNc se validan a continuación por hibridación con la ayuda de sondas preparadas a partir de muestras individuales de sangre de pacientes o de personas sanas.

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Los bancos validados de este modo se analizan a continuación mediante la utilización de sondas preparadas a partir de extracciones de sangre de una gran población de pacientes que van a la consulta del médico para unos exámenes de rutina. Dichos bancos constituyen una herramienta de diagnóstico cercano a la invención. De este modo un paciente que se somete a una mamografía para descarte de un cáncer de pecho, se le puede extraer una pequeña muestra de sangre. Una sonda nucleica preparada a partir de tal muestra permite a continuación investigar muy precozmente unas firmas probables de la evolución de un cáncer incluso en ausencia de imagen en la radiografía.

La invención se puede utilizar en forma de Bio microchip. El Bio microchip utiliza las propiedades de la reacción de hibridación para la que las dos hebras de ADN denominadas complementarias se ligan la una con la otra de forma muy específica. La invención se puede utilizar investigando específicamente uno o diversos marcadores ADN de la patología utilizando una técnica de amplificación del ADN con la ayuda de moldes oligonucleótidicos espcíficos del ADN a investigar.

Claims (14)

1. Procedimiento de detección in vitro de la presencia de una patología neurodegenerativa o de un tumor sólido en un paciente, que comprende (i) la preparación, a partir de una muestra de células sanguíneas de un paciente, de ácidos nucleicos que comprenden unos ARN o unos ADNc derivados de los mismos, y (ii) la hibridación de los ácidos nucleicos preparados con por lo menos un banco de ácidos nucleicos que comprende unos ácidos nucleicos específicos de formas de empalme "splicing" de genes característicos de una célula sanguínea aislada de un organismo que presenta una patología neurodegenerativa o un tumor sólido, indicando el perfil de hibridación la presencia de células sanguíneas características de la patología en la muestra.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el banco comprende además unos ácidos nucleicos específicos de genes cuyo nivel de expresión está modificado en una célula sanguínea aislada de un organismo que presenta una patología neurodegenerativa o un tumor sólido.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el o los bancos se disponen sobre un soporte.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los ácidos nucleicos preparados a partir de la muestra son unos ARN totales o mensajeros, eventualmente amplificados, o unos ADNc derivados de los mismos.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque los ácidos nucleicos están marcados.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células sanguíneas son unas células nucleadas.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque las células sanguíneas nucleadas comprenden unos linfocitos, unos macrófagos, unos monocitos y/o unas células dentríticas.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la detección in vitro de la presencia de la esclerosis amiotrófica lateral (ALS) en un paciente.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la detección in vitro de la presencia de un tumor sólido seleccionado de entre los tumores de hígado, pulmón, cabeza y cuello, melanoma, vesícula, pecho y próstata en un paciente.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la detección in vitro del estado de evolución y/o de la localización de una patología neurodegenerativa.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la detección in vitro del estado de evolución y/o de la localización de un tumor sólido.

12. Procedimiento para la preparación de un banco de ácidos nucleicos característicos de un estado patológico, caracterizado porque comprende (i) la obtención de una primera preparación de ácidos nucleicos a partir de una célula sanguínea aislada de un organismo que presenta una patología neurodegenerativa o un tumor sólido, (ii) la obtención de una preparación de ácidos nucleicos de referencia a partir de una célula sanguínea aislada de un organismo que no presenta dicha patología, (iii) una etapa de hibridación entre dicha primera preparación y la preparación de referencia, y (iv) la recuperación, a partir de los híbridos formados, de clones de ácidos nucleicos específicos de formas de empalme "splicing" de genes característicos de la célula sanguínea que proceden del organismo en situación de patología.

13. Procedimiento para la preparación de un banco de ácidos nucleicos característicos de un estado de evolución de una patología, caracterizado porque comprende (i) la obtención de una primera preparación de ácidos nucleicos a partir de una célula sanguínea aislada de un organismo que presenta una patología neurodegenerativa o un tumor sólido en un estadio de evolución determinado, (ii) la obtención de una preparación de ácidos nucleicos de referencia a partir de una célula sanguínea aislada de un organismo que presenta dicha patología en un estadio de evolución diferente, (iii) una etapa de hibridación entre dicha primera preparación y la preparación de referencia, y (iv) la recuperación, a partir de los híbridos formados, de clones de ácidos nucleicos específicos de formas de empalme "splicing" de genes característicos de la célula sanguínea que proceden del organismo en el estadio de evolución determinado de la patología.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque el banco se deposita sobre un soporte.