ES2210035T3

ES2210035T3 - Composiciones farmaceuticas destinadas a una administracion por via oral.

Info

Publication number: ES2210035T3
Application number: ES00993686T
Authority: ES
Inventors: Charles Guinez; Rene Laversanne; Jo Lle Amedee
Original assignee: Capsulis SA
Current assignee: Capsulis SA
Priority date: 2000-01-03
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2020-12-27
Also published as: WO2001049264A2; FR2803202A1; US6770292B2; DE60006000T2; ATE251894T1; EP1244427B1; JP2004506600A; WO2001049264A3; FR2803202B1; DE60006000D1; CA2396379A1; EP1244427A2; AU2859801A; US20030072797A1; AU780548B2

Abstract

Utilización de vesículas multilaminares que presentan una estructura interna de cristal-líquido laminar formada, desde el centro hasta la periferia de las indicadas vesículas, por un apilamiento de bicapas concéntricas a base de agentes anfífilos que alternan con capas de agua, solución acuosa o de solución de un líquido polar y en el seno de las cuales se encuentra incorporado al menos un principio activo, para la fabricación de una composición farmacéutica destinada para una administración por vía oral.

Description

Composiciones farmacéuticas destinadas a una administración por vía oral.

La presente invención se refiere a nuevas composiciones farmacéuticas destinadas a una administración por vía oral.

Hoy en día numerosos medicamentos necesitan una administración parenteral, bien sea por inyección intramuscular, subcutánea o intravenosa, o mediante incorporación en una perfusión. En general, una vía de administración de este tipo se hace necesaria por:

\bullet: Una fragilidad de la molécula activa respecto a condiciones físico-químicas y biológicas del tracto gastrointestinal (pH, enzimas...),

\bullet: Una no permeabilidad de la barrera gastro-intestinal a la molécula activa,

\bullet: Una toxicidad o un poder de irritación demasiado fuerte de la molécula activa respecto a las mucosas gastro-intestinales.

Entre las moléculas que entran en la categoría de las moléculas de administración parenteral obligatoria, se pueden citar, por ejemplo:

\bullet: Los péptidos y polipéptidos, en particular las hormonas, que se descomponen por los medios gastro-intestina- les,

\bullet: La heparina que no pasa la barrera,

\bullet: Numerosos citostáticos conocidos por su toxicidad y la no permeabilidad de la barrera gastro-intestinal a su respecto.

Por otra parte, otros tejidos mucosos, que podrían ser emplazamientos privilegiados de administración de medicamentos no se utilizan como tales, debido a su baja permeabilidad a las moléculas activas consideradas. Ello obliga a veces a utilizar bien sea una administración sistémica, o un fuerte sobredosificado del principio activo. En los dos casos, la dosis administrada es claramente superior a la dosis necesaria, lo cual produce numerosos inconvenientes, en materia de coste, como en materia de seguridad del medicamento.

Además, la aceptación del tratamiento por el paciente así como la comodidad de este último son parámetros cada vez más tenidos en cuenta en el desarrollo de nuevos medicamentos. A este respecto, una administración no invasiva, por vía oral, representa un progreso claro en este sentido.

Varios enfoques han sido desarrollados para facilitar la administración por vía oral de los medicamentos.

El más clásico, destinado a proteger el principio activo de la acidez y de la acción enzimática encontradas en el estómago consiste en revestir la molécula activa en un comprimido cuya película exterior es resistente a dicho medio. Generalmente, el indicado revestimiento se disuelve una vez puesto en condiciones de pH neutro como las encontradas en el intestino, permitiendo así la liberación de la materia activa. Este enfoque es eficaz para moléculas bien sea que actúan directamente en el intestino, o que no presentan dificultades al paso a la circulación general a través de la mucosa intestinal. La misma por consiguiente no es eficaz para favorecer el transporte trans-membranar necesario para ciertas moléculas como la heparina. La misma tampoco se aplica a moléculas sensibles a las enzimas presentes en el intestino (proteasas en particular que destruyen las proteínas).

Derivadas de esta tecnología, las microcápsulas revestidas de polímeros permiten, además de la protección del principio activo, su liberación controlada o retardada en el intestino, y por consiguiente una mejor farmacocinética que permite por ejemplo reducir los efectos secundarios del producto. La patente europea EP 0 709 087 a nombre de Flamel describe una invención de esta clase. El diámetro de las partículas (del orden de algunas centenas o algunos millares de micrómetros) puede modificarse, así como el espesor del revestimiento, permitiendo variaciones en los perfiles cinéticos de liberación.

Numerosos ensayos han puesto en práctica diferentes tecnologías basadas en microvesículas o en microesferas o nanoesferas de polímeros con el fin de proteger el principio activo pero también facilitar su paso a través de la membrana gastro-intestinal, a la circulación. Se pueden citar los liposomas (véase M. Ueno et al., Chem. Pharm. Bull., 30 p. 2245-2247, 1982) utilizados para facilitar el paso de la heparina, o las nanoesferas de polialquil cianoacrilatos) utilizadas para la administración oral de insulina (C. Damgé et al., J Pharma. Sc., 86 p. 1403-1409, 1997). Basados en otra tecnología, adyuvantes como los derivados acetilados de aminoácidos (A. Leone-Bay et al., J. Controlled release, 50 p. 41-49, 1998) o hidrogeles (J. M. Dunn & A. S. Hollister, Current Therap. Res. 56 p. 738-745, 1995) han sido utilizados para facilitar la administración oral de heparina.

Entre las vesículas, objetos esféricos formados por disposiciones moleculares de moléculas anfífilas, las vesículas multilaminares han sido objeto de importantes investigaciones y han dado lugar a varias aplicaciones. A título de ejemplos, se citarán las solicitudes internacionales WO 93/19735; WO 95/18601; WO 97/00623; WO 98/02144; WO 99/16468. Tales vesículas designadas por vesículas multilaminares con estructura de cebolla en los documentos citados anteriormente se distinguen de los liposomas por:

\bullet: su modo de preparación que parte de una fase laminar de cristal-líquido, es decir de una fase en equilibrio termodinámico, que presenta un orden de larga distancia,

\bullet: su estructura interna cristal-líquido laminar. Esta estructura está formada por un apilamiento de bicapas concéntricas de anfífilos que alternan con capas de agua o de solución acuosa o de solución de un líquido polar (glicerol por ejemplo), del centro hasta la periferia de estas vesículas. Antes de su dispersión en un medio de utilización, estas vesículas se encuentran en un estado de equilibrio termodinámico. La estructura especifica de estas vesículas puede ser fácilmente evidenciada por microscopía óptica, en particular por microscopía óptica con luz polarizada,

\bullet: la naturaleza variada de moléculas anfífilas que pueden ser utilizadas, solas o en mezcla, para constituirlas,

\bullet: los medios en los cuales se pueden dispersarlas, que pueden ser también bien hidrófilos como lipófilos en función de la formulación.

El tamaño de estas vesículas multilaminares es aproximado al micrómetro, típicamente de 0,1 \mum a 20 \mum de diámetro. Su utilización para la administración de un medicamento por vía oral no ha sido nunca ilustrada ni demostrada.

Los inventores de la presente invención han descubierto ahora que la administración por vía oral de las vesículas multilaminares cuya estructura especifica se ha definido anteriormente, incorporando una molécula conocida por no poder ser administrada por esta vía, o por el hecho de su fragilidad, o por el hecho de su incapacidad en franquear la barrera gastro-intestinal se hacía posible cuando la misma se incorporaba en estas vesículas multilaminares. Una incorporación de este tipo favorece el paso de la molécula a través de la pared gastro-intestinal y permite encontrarla de nuevo en la circulación sanguínea. Este descubrimiento ha sido realizado a partir de los ensayos realizados sobre moléculas de naturalezas y características muy diferentes, tales como la heparina por una parte y la calcitonina, por otra parte.

Una ventaja de la invención es que estas vesículas multilaminares se preparan a partir de constituyentes biocompatibles conocidos por su inocuidad.

Otra ventaja de la invención es que el procedimiento de preparación de las vesículas es de realización sencilla y solo recurre a aparatos corrientes utilizados en química.

Por otro lado, el hecho de que el procedimiento recurra a una fase laminar inicial en equilibrio termodinámico le proporciona una excelente reproductividad así como una gran estabilidad de las vesículas obtenidas.

Así, según una de sus características esenciales, la invención se refiere a la utilización de vesículas, multilaminares que presentan una estructura interna de cristal-líquido laminar formada, desde el centro hasta la periferia de las mencionadas vesículas por un apilamiento de bicapas concéntricas a base de agentes anfífilos que se alternan con capas de agua, de solución acuosa o de solución de un líquido polar y en el seno de las cuales se encuentra incorporado al menos un principio activo, para la fabricación de una composición farmacéutica destinada para una administración por vía oral.

Por el término "incorporado" cuya utilización nos parece preferible a la del término "encapsulado", se entiende que el o los principios activos forman parte integrante de la entidad constituida por la vesícula. En efecto, se pueden encontrar moléculas de principio activo en cualquier capa comprendida entre el centro y la periferia de la indicada vesícula.

La expresión "administración por vía oral" se utiliza en su sentido habitual y significa que el producto se introduce en el organismo por la boca, en oposición, por ejemplo, a un modo de administración por vía parenteral.

Resulta, en el transcurso de los ensayos realizados por los inventores, que la incorporación de un principio activo en el seno de las vesículas, presentaba diferentes ventajas ya expuestas en lo que antecede. Las vesículas actúan, en particular, como verdaderos vectores del principio activo, permitiendo facilitar su paso a través de la barrera gastro-intestinal y/o protegerlo de la degradación, en particular de la degradación por los enzimas presentes en el medio gastro-intestinal.

Las vesículas utilizadas tienen generalmente diámetros comprendidos entre 0,1 y 25 \mum, de preferencia entre 0,2 y 15 \mum.

Más precisamente, las vesículas utilizadas según la invención están preferentemente constituidas por varías capas de agentes anfífilos que alternan con capas de fase acuosa o polar. El espesor de cada una de estas capas es un espesor molecular, típicamente del orden de 5 a 10 manómetros. Para un apilamiento de una decena a algunos cientos de capas se obtiene por consiguiente un diámetro comprendido entre 0,1 \mum y algunas decenas de micrómetros. Es lo que se ha observado experimentalmente, siendo las vesículas observables en microscopía óptica (con luz polarizada con el fin de tener un mejor contraste en relación a su birrefringencia), o como puntos no resueltos para las más pequeñas de ellas, o como esferas birrefringentes para las más gruesas. El perfil de tamaños puede estudiarse con la ayuda de un granulómetro láser (utilizando la difusión estática de un haz láser, analizado bajo varios ángulos). Se obtiene en general un perfil gausiano centrado en un valor que varía entre 0,1 y 25 \mum que muestra una baja heterogeneidad de tamaño para una formulación dada, en condiciones operativas de preparación dadas.

Las vesículas en las cuales se encuentra incorporado el agente activo tienen, como se ha expuesto anteriormente, una estructura multilaminar denominada de cebolla y están constituidas, desde su centro hasta su periferia, por una sucesión de capas laminares separadas por un medio líquido. Estas vesículas pueden ser obtenidas por un procedimiento que comprende la preparación de una fase laminar cristal-líquido y su transformación por aplicación de un cizallamiento. Un procedimiento de este tipo se describe en particular en la patente WO 93/19735 procedente de la patente francesa FR 2 689 418 o WO 95/18601 introducidos aquí a título de referencia.

Según la patente francesa FR-2 689 418, esta transformación puede realizarse durante una etapa de cizallamiento homogéneo de la fase cristal-líquido, lo cual conduce a vesículas, también denominadas microcápsulas, de tamaño controlado. Sin embargo, jugando con la formulación de la fase laminar cristal-líquido, en particular con la naturaleza de los agentes tensioáctivos que entran en su composición, la transformación de esta fase cristal-líquido en vesículas puede obtenerse por simple solicitación mecánica, en particular en el mezclado de los constituyentes.

Tales vesículas presentan, entre otras, la ventaja de poder ser preparadas por un procedimiento de preparación particularmente sencillo que permite utilizar una gran variedad de agentes tensioactivos.

Otra ventaja, relacionada también esencialmente con el procedimiento utilizado para preparar las vesículas denominadas de estructura de cebolla utilizadas según la invención, reside en el hecho de que se incorporan los agentes activos y los aditivos previamente a la formación de las vesículas, lo cual permite un excelente rendimiento de encapsulación, de ahí una mejor eficacia y una economía muy importante para moléculas costosas.

Tales estructuras se obtienen ventajosamente mediante la incorporación de al menos un agente activo en una fase laminar cristal-líquido que comprende al menos un agente tensioáctivo y luego transformación de esta fase cristal-líquido laminar en una fase densa de vesículas multilaminares de pequeño tamaño.

Es importante observar que esta transformación no modifica la simetría del cristal-líquido de la fase inicial, y que caracteriza las vesículas multilaminares. Esta simetría de cristal-líquido se traduce por observaciones macroscópicas, tales como la birrefringencia en microscopía óptica, o la presencia de pico de difracción en análisis por rayos X. Es preciso no obstante apreciar que tales observaciones pueden resultar difíciles bien sea por el bajo contraste unido al tamaño muy pequeño de las vesículas, en microscopía óptica o por la dilución y por consiguiente la debilidad de la señal en difracción de rayos X.

Así, las vesículas utilizadas según la invención pueden ser obtenidas según un procedimiento según el cual se prepara una fase de cristal-líquido laminar que incorpora al menos un agente activo y se provoca la redisposición de la indicada fase cristal-líquido en vesículas multilaminares mediante aplicación de un cizallamiento o de una solicitación mecánica resultante de por ejemplo de la mezcla de constituyentes de la indicada fase de cristal-líquido laminar.

Este cizallamiento podrá ser un cizallamiento homogéneo, lo cual presenta la ventaja de conducir a vesículas de tamaño perfectamente homogéneo. Sin embargo, una simple agitación mecánica podrá mostrarse suficiente para conducir a la formación de vesículas multilaminares de la invención.

Las moléculas anfífilas utilizadas para la preparación de las vesículas se elegirán, sin que ello sea una obligación, entre las moléculas que son objeto de una descripción en la farmacopea, o ya utilizadas en medicamentos destinados para una administración por vía oral. Se pueden citar sin que ello sea exhaustivo, ni que los productos hallan sido obligatoriamente utilizados anteriormente en farmacia, el grupo constituido por:

\vardiamondsuit: glicerolípidos, en particular fosfolípidos, hidrogenados o no,

\vardiamondsuit: ácidos grasos de C_{6} a C_{30}, saturados o mono- o poliinsaturados, lineales o ramificados, etoxilados o no, en forma de ácido o de sal de un metal alcalino, alcalinotérreo o de una amina,

\vardiamondsuit: ésteres, etoxilados o no, sacarosa o sorbitol, o manitol, o glicerol o poliglicerol conteniendo de 2 a 20 unidades de glicerol o glicol de los ácidos grasos indicados anteriormente,

\vardiamondsuit: mono-, di- o triglicéridos o mezclas de glicéridos de los ácidos grasos indicados anteriormente,

\vardiamondsuit: alcoholes grasos de C_{6} a C_{30}, saturados o mono- o poliinsaturados, lineales o ramificados, etoxilados o no,

\vardiamondsuit: colesterol y sus derivados, en particular los ésteres de colesterol cargados o neutros como el sulfato de colesterol,

\vardiamondsuit: otros derivados de estructura esterol, en particular los de origen vegetal teles como el sitoesterol o el sigmaesterol,

\vardiamondsuit: éteres, etoxilados o no, de sacarosa, o de sorbitol, o de manitol, o de glicerol o de poliglicerol conteniendo de 2 a 20 unidades de glicerol o de glicol y alcoholes grasos indicados anteriormente,

\vardiamondsuit: aceites vegetales polietoxilados, hidrogenados o no hidrogenados,

\vardiamondsuit: polímeros secuenciados de polioxietileno y de polioxipropileno (poloxámeros),

\vardiamondsuit: hidroxiéstearato de polietilenglicol,

\vardiamondsuit: los esfingolípidos, y derivados de la esfingosina,

\vardiamondsuit: los polialquilglucósidos,

\vardiamondsuit: las ceramidas,

\vardiamondsuit: copolímeros de polietilenglicol y de alquilglicol, por ejemplo, los copolímeros de la familia de los ELFACOS de AKZO NOBEL,

\vardiamondsuit: copolímeros di- o tribloque de éteres de polietilenglicol y de polialquilenglicol, por ejemplo los copolímeros de la familia de los ARLACELL de ICI.

Estos anfífilos o agentes tensioáctivos pueden ser utilizados solos o en mezcla. Entre estos anfífilos, algunos pueden por sí solos formar una base de cristal-líquido laminar por mezclado con un disolvente polar. Otros son utilizados únicamente en mezcla, en una proporción más pequeña, para aportar propiedades de rigidez o de estanqueidad a la fase de cristal-líquido laminar.

La formulación utiliza ventajosamente en una mezcla de moléculas tensioáctivas. Se utilizan generalmente al menos dos agentes tensioáctivos diferentes con balances de hidrófilo-lipófilo diferentes, lo cual permite regular en continuo las propiedades de las bicapas y así controlar la aparición de la inestabilidad que rige la formación de las vesículas multilaminares.

Así, se elegirá ventajosamente entre los agentes tensioáctivos indicados anteriormente, dos agentes tensioáctivos que presenten propiedades relativamente diferentes, en particular un balance hidrófilo-lipófilo (HLB) diferente. El primer agente tensioáctivo presentará ventajosamente un balance hidrófilo-lipófilo comprendido entre 1 y 6, de preferencia entre 1 y 4, mientras que el segundo agente tensioáctivo tendrá un balance hidrófilo-lipófilo comprendido entre 3 y 15, de preferencia comprendido entre 5 y 15.

Otra ventaja de las vesículas utilizadas según la invención es que se pueden añadir a la formulación polímeros naturales o artificiales tales como los polisacáridos (alginatos, citosan, etc.) con el fin de reforzar la solidez de la vesícula, y permitirle resistir mejor a las tensiones físico-químicas del medio de administración (pH, efecto mecánico, presión osmótica ...). Estos polímeros pueden también ser incorporados a la vesícula, como depositados alrededor en forma de un revestimiento. En este caso, la vesícula o la partícula formada por vesículas revestidas en la matriz polímera tiene un diámetro más grueso que las vesículas solas. Estos polímeros pueden eventualmente reticularse para reforzar también su solidez.

Las vesículas utilizadas según la invención tienen ventajosamente un diámetro comprendido entre 0,1 y 25 \mum, de preferencia entre 0,2 y 15 \mum.

En las composiciones utilizadas según la invención, las vesículas son ventajosamente dispersadas en el seno de un medio farmaceúticamente aceptable, generalmente constituido por agua o por un tampón, siendo este medio idéntico o diferente del que se encuentra entre las laminillas de las vesículas.

Las vesículas según la invención pueden también ser dispersadas en un medio hidrófobo, por ejemplo un aceite, aceptable para el uso farmacéutico, por ejemplo un aceite vegetal o mineral, un éster de ácido graso sintético, o el escualano o escualeno. Esto puede tener la ventaja de evitar o limitar la presencia de agua en el caso de un agente activo que fuese por ejemplo hidrolizable. Esta dispersión en aceite puede por sí misma ser emulsionada en un medio acuoso, con el fin de obtener una formulación más agradable de tragar. Debido a la presencia de la fase intermedia aceitosa, el medio continuo exterior, por ejemplo acuoso, se separa del medio interno de las vesículas, asegurando así una protección suplementaria al agente activo incorporado en las vesículas.

Según otro de sus aspectos, la invención se refiere igualmente al procedimiento de preparación de vesículas y de composiciones utilizadas según la invención.

El método de preparación consiste en una primera fase en preparar mediante mezclado una fase laminar de cristal-líquido que incorpora los diferentes constituyentes. Esta se obtiene por simple mezclado de los ingredientes, en un orden determinado por el experimentador por las miscibilidades de cada uno de los constituyentes. Puede ser necesario calentar algunos constituyentes pastosos o sólidos con el fin de facilitar su incorporación. En este caso se adiciona la molécula activa de preferencia al final de la mezcla con el fin de evitarla que experimente una temperatura demasiado elevada, si la misma es sensible a la temperatura. Se puede también preparar una mezcla de todos los constituyentes salvo el de la molécula activa o su solución acuosa en forma de una mezcla "stock" que se utilizará según las necesidades para preparar la fase laminar. La solución acuosa puede contener diferentes constituyentes destinados para asegurar su compatibilidad biológica y en particular mezclas tampones pero igualmente varias moléculas activas sinérgicas. La fase laminar así preparada se somete seguidamente a un cizallamiento moderado (de 0 a 1000 s^{-1}) durante un tiempo limitado (de 0 a 60 minutos).

En la mayoría de los casos, este cizallamiento se obtiene directamente por la acción del dispositivo que ha servido para el mezclado.

En una tercera etapa, la fase laminar cizallada se dispersa en un medio final, en general agua o un tampón, idéntico a/o diferente del que ha servido en la preparación de la fase laminar. Este medio de dispersión puede también ser un medio no acuoso o polar (glicerol, polietilen glicol, alquilen glicol...), o hidrófobo (aceites...). Esta dispersión se realiza generalmente a temperatura ambiente (20-25ºC) mediante adicción lenta del medio en la fase laminar bajo agitación constante.

Un conservante y eventualmente otros aditivos destinados para completar la formulación galénica pueden ser añadidos al producto.

Los ejemplos que siguen ilustran muy claramente el interés de la invención evidenciando el paso a la circulación sanguínea de la heparina previamente incorporada en vesículas según la invención (ejemplo 1) mientras que este producto, en simple solución, no franquea la barrera gastro-intestinal y la calcitonina igualmente incorporada en vesículas según la invención mientras que el mismo producto no incorporado en vesículas es inestable en el medio gastro-intestinal (ver ejemplo 2).

Estos ejemplos se ilustran por las figuras 1 a 4 en lo que respecta a la heparina, las figuras 1 a 3 proporcionan los resultados de ensayos realizados en la rata y la figura 4, los resultados de ensayos realizados en el perro y por la figura 5 en el caso de la calcitonina (ensayos sobre la rata).

En los ejemplos que siguen, las proporciones dadas para los constituyentes de las diferentes formulaciones se indican, salvo mención contraria, en porcentaje en peso.

Ejemplo 1 Vesículas que incorporan heparina 1.a Formulación y preparación de vesículas que incorporan heparina

La heparina utilizada en estos ejemplo es una heparina sin fraccionar, extraída de las mucosas intestinales de cerdo (SIGMA H-9399, 188 unidades USP/mg).

Formulación A
\code{1}	Alcohol laurico etoxilado (SEPPIC, Simulsol P4):	4,0%
\code{2}	Colesterol de lanolina (FLUKA):	3,0%
\code{3}	Agua desmineralizada estéril:	10,0%
\code{4}	Heparina al 25% en agua desmineralizada estéril	40,0%
\code{5}	Lecitina de soja (NATTERMANN Phospholipon 90)	43,0%

Modo operativo

Los constituyentes 1, 2 y 3 se introdujeron en un formador de píldoras estéril de 2 ml, en un orden indiferente, y luego se mezclaron a temperatura ambiente con la ayuda de una espátula previamente esterilizada al fuego. La solución total del constituyente 2 se comprobó mediante observación microscópica. Se introdujo seguidamente el constituyente 4 y se homogeneizó con la espátula y luego se añadió el constituyente 5.

El conjunto se homogeneizó con espátula, luego se dejó en reposo una noche a temperatura ambiente.

La preparación se dispersó seguidamente al 16,7% en agua desmineralizada estéril. El título en heparina de la dispersión de vesículas es por consiguiente del 1,67% (16,7 mg/ml).

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Formulación B
\code{1}	Alcohol laurico etoxilado (SEPPIC, Simulsol P4):	4,8%
\code{2}	Colesterol de lanolina (FLUKA):	3,6%
\code{3}	Lecitina de soja (NATTERMANN Phospholipon 90)	51,6%
\code{4}	Solución de heparina al 25% en PBS 1x	40,0%

Modo operativo

Los constituyentes 1, 2 y 3 se introdujeron en un formador de píldoras estéril de 2 ml, en un orden indistinto, luego se solubilizaron en diclorometano. El disolvente se evaporó seguidamente de forma total. Se añadió a temperatura ambiente el constituyente 4. El conjunto se homogeneizó con la ayuda de una aguja estéril, y luego se dispersó al 16,7% en PBS 1x estéril. El título en heparina de la dispersión de vesículas es por consiguiente del 1,67% (16,7 mg/ml).

Formulación C
\code{1}	Alcohol laurico etoxilado (SEPPIC, Simulsol P4):	4,8%
\code{2}	Colesterol de lanolina (FLUKA):	3,6%
\code{3}	Lecitina de soja (NATTERMANN Phospholipon 90)	51,6%
\code{4}	Solución de heparina al 50% en PBS 1x	40,0%

Modo operativo

Los constituyentes \code{1}, \code{2} y \code{3} se introdujeron en un formador de píldoras estéril de 2 ml, en un orden indistinto, luego se solubilizaron en diclorometano. El disolvente se evaporó seguidamente de forma total. Se añadió a temperatura ambiente el constituyente \code{4}. El conjunto se homogeneizó con la ayuda de una aguja estéril, se dejó en reposo una noche a 4ºC, y luego se dispersó a 16,7% en PBS 1x estéril. El título en heparina de la dispersión de vesículas es por consiguiente del 3,34% (33,4 mg/ml).

1.b Caracterización físico-químicas de las vesículas que incorporan heparina

Las vesículas se caracterizan por una parte por la medición del perfil granulométrico, y por otra parte por el rendimiento de encapsulación.

Perfil de tamaño

El perfil de tamaño se estudió por granulometría láser, utilizando un aparato Mastersizer S de Malvern.

Para la muestra A, el perfil de tamaño muestra un pico principal centrado alrededor de 0,34 \mum, y que se extiende de 50 nm a 20 \mum con un máximo secundario alrededor de 6 \mum. Aproximadamente un 60% (en volumen) de la muestra tiene un tamaño inferior a 10 \mum.

Para la muestra B, el perfil de tamaño muestra un pico principal centrado alrededor de 0,32 \mum y que se extiende de 50 nm a 20 \mum, con un máximo secundario alrededor de 3,5 \mum. Aproximadamente un 60% (en volumen) de la muestra tiene un tamaño inferior a 10 \mum..

Para la muestra C, el perfil de tamaño muestra un solo pico centrado alrededor de 0,33 \mum y que se extiende de 50 nm a 3 \mum. Aproximadamente un 85% (en volumen) de la muestra tiene un tamaño inferior a 1 \mum.

El análisis por difusión láser se completó mediante una observación en microscopía óptica con luz polarizada, que permitió visualizar directamente las vesículas. La observación muestra para las muestras A y B, la presencia de una gran mayoría de objetos de tamaño próximo al micrómetro y algunos objetos más gruesos. Se observa también una tendencia a la agregación de los objetos entre sí, sin ninguna tendencia a la coalescencia.

Rendimiento de incorporación en las vesículas

El rendimiento de incorporación se determinó por separación de las vesículas de su medio de dispersión por centrifugación, luego análisis de la concentración en heparina en el sobrenadante. El título de heparina se realizó mediante un ensayo colorimétrico (SIGMA Héparine Accucolor^{TM} CRS106).

Se obtuvo un rendimiento de incorporación de 47 \pm 5% para la formulación A, lo cual significa que aproximadamente un 50% de la heparina introducida en la muestra se encuentra en el interior de las vesículas de esta formulación A. Para las formulaciones B y C, el rendimiento de incorporación medido de la misma forma es de 90 \pm 5%.

1.c Estudio de la administración en la rata de las vesículas que incorporan heparina Administración

El estudio se realizó sobre ratas Wistar.

Las vesículas que contienen heparina y una solución testigo negativo se administraron por vía oral, por cebado del animal no anestesiado utilizando una aguja de entubación.

Un testigo positivo (solución acuosa de heparina) se inyectó por vía subcutánea.

Los animales estuvieron en ayunas 24 h antes del tratamiento (dieta hídrica). La administración tuvo lugar en T_{0}, las extracciones tuvieron lugar en T_{0} (antes de la administración), y luego en distintos tiempos ulteriores como se ha indicado en las figuras anexas.

Las dosis administradas y protocolos se describen en la tabla siguiente, para cada formulación:

	Formulación A	Formulación B	Formulación C
Ratas	5 ratas macho de	2 ratas macho de 400 g	2 ratas macho 400 g
	400 g	y 2 ratas hembra de 200 g	y 2 ratas hembra 200 g
Concentración	16,7 mg/ml	16,7 mg/ml	33,4 mg/ml
de la dispersión
Dosis	2 ml/kg 33,4	1,2 ml/kg 20	Dosis I: 0,9 ml/kg	Dosis II: 3 ml/kg
administrada en	mg/kg 6280	mg/kg 3760	30 mg/kg 5640	100mg/kg
las vesículas	unidades USP/kg	unidades USP/kg	unidades USP/kg	18600 unidades
				USP/kg
Solución testigo	16,7 mg/ml
negativo
Dosis testigo	2 ml/kg
negativo vía oral	33,3 mg/kg
	6260 unidades USP/kg
Dosis testigo	2,4 mg/ml	5 mg/ml	5 mg/ml
positivo vía SC
Dosis testigo	1 ml/kg	0,4 ml/kg	0,4 ml/kg
positivo, vía SC	2,4 mg/kg	1,8 mg/kg	1,8 mg/kg
	450 unidades USP/kg	340 unidades USP/kg	340 unidades USP/kg

Extracción sanguínea

Las extracciones se realizaron por incisión caudal (formulación A) o por extracción retro-orbital (formulación B y C). Un volumen de 0,50 ml (formulación A) o 1 ml (formulaciones B y C) de sangre se recogió en tubo con citrato de sodio al 3,8%.

El plasma se separó de la sangre total mediante centrifugación a 92 g, 10 min a +4ºC, justo después de la extracción. El plasma se conservó hasta análisis por congelación a -18ºC inmediatamente después de la separación.

El dosificado cuantitativo de la heparina en el plasma de rata o de perro se realizó por un método colorimétrico (SIGMA Diagnostics® Héparine Accucolor^{TM} Méthode nº CRS106). Se realizó una curva de contraste con el fin de poder expresar en heparinémia los resultados obtenidos en densidad óptica a 405 nm.

Curva de contraste

Para la preparación de patrones de heparina, se utilizó un grupo de plasmas extraídos de animales en ayunas, del mismo modo que las muestras a ensayar. Se realizaron cuatro patrones de heparina de concentración igual a 0, 0,226, 0,452 y 0,905 unidades/ml.

Se refiere a la absorbáncia obtenida a 405 nm para cada patrón de heparina en función de la concentración en heparina (unidades/ml). El porcentaje de heparina de una muestra puede determinarse a partir de esta curva de contraste.

Resultados

Los resultados se facilitan en las figuras 1 a 3 donde la heparinémia (en unidades/ml), normalizada a 0 en T = 0 se llevó en función del tiempo.

Formulación A (figura 1)

Se observó que la curva obtenida por administración oral de heparina incorporada en las vesículas de la invención aumenta, para alcanzar un máximo y vuelve a bajar seguidamente. Este fenómeno es similar al observado en la inyección subcutánea de una solución de heparina, mostrada de forma comparativa. Por el contrario la administración por vía oral de la solución no encapsulada de heparina no produce ningún efecto significativo sobre la heparinémia de los animales.

Formulación B (figura 2)

Se observó que la curva obtenida por administración oral de heparina incorporada en las vesículas de la invención aumenta, para llegar a un máximo de aproximadamente 1 hora después de la toma y vuelve a bajar seguidamente. Este fenómeno es similar, pero más acusado al observado en la inyección subcutánea de la solución de heparina testigo positivo, mostrada de forma comparativa.

Formulación C (figura 3)

Se observó en este caso un crecimiento más lento de la curva obtenida por administración oral de heparina incorporada en las vesículas de la invención, cuyo máximo no se ha alcanzado todavía 6 horas después de la toma. Este tiempo de actividad largo es notable y claramente superior al que se observa en el caso de la inyección subcutánea.

Además, comparando las dos curvas obtenidas para las dosis I y II, se observa un efecto "dosis", la heparinémia obtenida para la dosis II (18.600 unidades USP/kg) es claramente superior a la correspondiente a la dosis I (5460 unidades USP/kg).

1.d Estudio de la administración en el perro de vesículas que incorporan heparina

Un estudio análogo al del ejemplo precedente se realizó en el perro, con la formulación D indicada a continuación:

Formulación D
\code{1}	Alcohol laurico etoxilado (SEPPIC, Simulsol P4):	4,0%
\code{2}	Colesterol de lanolina (FLUKA):	3,0%
\code{3}	PBS 1x estéril:	10,0%
\code{4}	Heparina al 25% en PBS 1x estéril	40,0%
\code{5}	Lecitina de soja (NATTERMANN Phospholipon 90)	43,0%

Modo operativo

Los constituyentes \code{1}, \code{2} y \code{3} se introdujeron en un formador de pastillas estéril de 3 ml, en un orden indistinto, y luego se mezclaron mediante agitación magnética durante 2 h. La solución total del constituyente 2 se comprobó mediante observación microscópica. Se introdujo seguidamente el constituyente \code{4} y se homogeneizó con espátula y luego se añadió el constituyente \code{5}.

El conjunto se homogeneizó con espátula, luego se dejó en reposo una noche a 4ºC.

La preparación se dispersó seguidamente al 10% en PBS 1x estéril lo cual condujo a un título en heparina de la dispersión de 10 mg/ml.

Protocolo

Los perros eran de la raza Beagle hembras de 10 a 12 kg. El protocolo fue el siguiente:

\bullet: Volumen administrado por sonda esofagiana de 3 ml/kg, bien sea para los perros utilizados un volumen de 30 ml, correspondiente a una dosis de heparina en las vesículas de 300 mg (30 mg/kg), es decir 56.400 unidades USP por perro (5.640 unidades USP/kg),

\bullet: Los animales se encuentran en ayunas 24 h antes del tratamiento (dieta hídrica). La administración tuvo lugar en T_{0} las extracciones realizadas a nivel de la vena yugular tuvieron lugar en T_{0} (antes de la administración), T_{0}+1h, T_{0}+2h o T_{0}+3h, T_{0}+6h.

\bullet: Testigo negativo: solución acuosa de heparina a 10 mg/ml; volumen administrado de 30 ml, lo cual corresponde a 300 mg de heparina (30 mg/kg), o sea 56.400 unidades USP por perro (5.640 unidades USP/kg),

\bullet: Testigo positivo por inyección subcutánea, solución de 10 mg/ml y volumen de inyección de 0,2 ml/kg, bien para perros utilizados 2 ml, lo cual corresponde a una dosis de 20 mg de heparina (2 mg/kg), o 3.800 unidades USP por perro (380 unidades USP/kg).

\bullet: El estudio del perfil del tamaño de las vesículas por granulometría refleja un máximo secundario alrededor de 4,5 \mum más intenso que en el caso de las formulaciones A y B.

Resultados

Los resultados se presentan, como en el caso de la rata, en la figura 4.

Se observa, como en el caso de la rata, que la curva obtenida por el perro que ha recibido la heparina incorporada en las vesículas por vía oral aumenta en condiciones similares a las observadas con la solución inyectada por vía subcutánea. Se observa sin embargo un ligero desfase en los tiempos largos de la curva en función del tiempo cuando la heparina se incorpora en vesículas y se administra por vía oral. La administración por vía oral de una solución de heparina no tiene por el contrario ninguna influencia sobre la heparinémia.

Ejemplo 2 Vesículas que incorporan calcitonina 2.a Preparación y caracterización de vesículas que incorporan calcitonina

Ensayos similares se realizaron en la rata, incorporando calcitonina, que es un péptido. En este caso, la principal dificultad proviene de la fragilidad de la molécula, que se degrada muy rápidamente en el medio gastro-intestinal, en el proceso normal de digestión.

La calcitonina utilizada es una calcitonina de salmón (BACHEM H-2260), puesta en solución acuosa en PBS Ix. La formulación y el modo operativo de preparación de las vesículas son similares a las utilizadas en el caso de la heparina (formulación D).

\code{1}	Alcohol laurico etoxilado (SEPPIC, Simulsol P4):	04,0%
\code{2}	Colesterol de lanolina (FLUKA):	03,0%
\code{3}	PBS 1x estéril:	10,0%
\code{4}	Solución de calcitonina en 12.000 UI/ml PBS 1x estéril	40,0%
\code{5}	Lecitina de soja (NATTERMANN Phospholipon 90)	43,0%

Las vesículas se dispersaron al 10% en PBS 1x estéril, lo que corresponde a un título en calcitonina de 480 UI/ml.

El perfil granulométrico de las vesículas muestra un reparto de tamaño que se extiende entre 50 nm y 10 \mum, presentando un máximo principal centrado sobre 0,3 \mum, y un máximo secundario poco acusado alrededor de 3 \mum. El 85% de la muestra presenta un tamaño inferior a 1 \mum.

2.b Estudio de la administración en la rata de vesículas que incorporan calcitonina

El estudio fue realizado sobre ratas Wistar hembras de 150 g, repartidas en grupos de 4 ratas. La administración por vía oral se realizó utilizando una sonda esofagiana con un volumen de administración de 300 \mul, lo cual corresponde a 144 UI administrada por animal.

Un grupo testigo positivo recibió por vía subcutánea un volumen de 100 \mul de una solución acuosa de calcitonina en 20 UI/ml, lo cual corresponde a una dosis de 2 UI de calcitonina por animal.

Un grupo testigo negativo recibió por vía oral un volumen 300 \mul de una solución acuosa de calcitonina titulada de 240 UI/ml, lo cual corresponde a 72 UI por animal.

Los animales se dejaron en ayunas (dieta hídrica) 24 horas antes del ensayo. Las extracciones se realizaron por vía retro-orbital, bajo anestesia general en T_{0} (antes de la administración) T_{0}+1h, T_{0}+2h o T_{0}+3h, T_{0}+5h. 50 \mul de sangre fueron extraídos en microcapilares heparinados.

La medición de calcio y del pH sanguíneo se realizó inmediatamente después de la extracción, directamente sobre el microcapilar de extracción, mediante un analizador automático CIBA-CORNING modelo 634, proporcionando la calcemia.

Los resultados se resumen en la figura 5. En el caso de la calcitonina incorporada en las vesículas según la invención, administrada por vía oral, se observó una disminución de la calcemia en el transcurso de la primera hora, en aproximadamente un 75% de su valor inicial, luego una subida progresiva en la hora siguiente. Este comportamiento es similar al obtenido con la inyección subcutánea de la calcitonina en solución acuosa, por el contrario este fenómeno no se observa en la administración por vía oral de una solución de calcitonina no encapsulada. Se puede por consiguiente concluir que la encapsulación de la calcitonina según la invención ha permitido una protección de este péptido respecto a la digestión en medio gastro-intestinal así como un paso a través de la mucosa intestinal.

Leyendas de las figuras Figura 1

-\newmoon-	Heparina en solución, vía SC, (450 unidades USP/kg)
-\Diamondblack-	Heparina en solución, vía oral (6260 unidades USP/kg)
-\blacksquare-	Heparina en las vesículas, vía oral (6280 unidades USP/kg)

Figura 2

-\newmoon-	Heparina en solución, vía SC, (340 unidades USP/kg)
-\blacksquare-	Heparina en las vesículas, vía oral (3760 unidades USP/kg)

Figura 3

-\newmoon-	Heparina en solución, vía SC, (340 unidades USP/kg)
-\Diamondblack-	Heparina en las vesículas, vía oral (18600 unidades USP/kg)
-\blacksquare-	Heparina en las vesículas, vía oral (5640 unidades USP/kg)

Figura 4

-\newmoon-	Heparina en solución, vía SC, (380 unidades USP/kg)
-\Diamondblack-	Heparina en las vesículas, vía oral (5640 unidades USP/kg)
-\blacksquare-	Heparina en solución, vía oral (5640 unidades USP/kg)

Figura 5

-\newmoon-	Testigo negativo, solución acuosa de calcitonina, administrada por vía oral.
-\Diamondblack-	Calcitonina incorporada en las vesículas de la invención administrada por vía oral.
-\blacksquare-	Testigo positivo, solución acuosa de calcitonina, inyectada por vía subcutánea.

Claims

1. Utilización de vesículas multilaminares que presentan una estructura interna de cristal-líquido laminar formada, desde el centro hasta la periferia de las indicadas vesículas, por un apilamiento de bicapas concéntricas a base de agentes anfífilos que alternan con capas de agua, solución acuosa o de solución de un líquido polar y en el seno de las cuales se encuentra incorporado al menos un principio activo, para la fabricación de una composición farmacéutica destinada para una administración por vía oral.

2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque las indicadas vesículas se utilizan como vectores de dicho principio activo destinados a facilitar su paso a través de la barrera gastro-intestinal y/o para protegerlo de la degradación, en particular de la degradación por los enzimas presentes en el medio gastro-intestinal.

3. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque el indicado principio activo es la heparina.

4. Utilización según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el indicado principio activo es un péptido.

5. Utilización según la reivindicación 4, caracterizada porque el indicado péptido es una hormona peptídica.

6. Utilización según una de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizada porque el indicado principio activo es la calcitonina.

7. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque las indicadas vesículas contienen al menos un agente tensioáctivo seleccionado entre el grupo constituido:

\vardiamondsuit: ésteres, etoxilados o no, sacarosa o sorbitol, o manitol, o glicerol o poliglicérol conteniendo de 2 a 20 unidades de glicerol o glicol de los ácidos grasos indicados anteriormente,

\vardiamondsuit: colesterol y sus derivados, en particular los ésteres de colesterol cargados o neutros como el sulfato de coles-terol,

\vardiamondsuit: éteres, etoxilados o no, de sacarosa, o sorbitol, o manitol, o de glicerol o poliglicerol conteniendo de 2 a 20 unidades de glicerol o de glicol y alcoholes grasos indicados anteriormente,

\vardiamondsuit: polímeros secuenciales de polioxietileno y de polioxipropileno (poloxámeros),

\vardiamondsuit: hidroxiéstearato de polietilenglicol,

\vardiamondsuit: los esfingolípidos, y derivados de la esfingosina,

\vardiamondsuit: los polialquilglucósidos,

\vardiamondsuit: las ceramidas,

\vardiamondsuit: copolímeros de polietilenglicol y de alquilglicol,

\vardiamondsuit: copolímeros di- o tribloque de éteres de polietilenglicol y de polialquilenglicol.

8. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque las indicadas vesículas tienen un diámetro comprendido entre 0,1 y 25 \mum, y de preferencia entre 0,2 y 15 \mum.

9. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque las bicapas de las indicadas vesículas comprenden al menos dos agentes tensioáctivos de los cuales uno presenta un balance hidrófilo-lipófilo (HLB) comprendido entre 1 y 6, de preferencia comprendido entre 1 y 4, y el otro balance hidrófilo-lipófilo (HLB) comprendido entre 3 y 15, de preferencia comprendido entre 5 y 15.

10. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque las indicadas vesículas contienen además un polímero incorporado a las indicadas vesículas o depositado alrededor de las indicadas vesículas en forma de un revestimiento.

11. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque la indicada composición comprende una dispersión de las indicadas vesículas en el seno de un medio farmacéuticamente aceptable.

12. Utilización según la reivindicación 11, caracterizada porque el indicado medio farmacéuticamente aceptable está constituido por agua o un tampón.

13. Utilización según la reivindicación 11, caracterizada porque el indicado medio farmacéuticamente aceptable está constituido por un medio hidrófobo tal como un aceite.

14. Utilización según la reivindicación 11, caracterizada porque la indicada composición farmacéutica comprende una emulsión en un medio acuoso de las indicadas vesículas propiamente dichas previamente dispersadas en un aceite.

15. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque las indicadas vesículas se obtienen por transformación de una fase de cristal-líquido laminar que incorpora el indicado principio activo, bajo la acción de un cizallamiento o de una solicitación mecánica.

16. Composición farmacéutica destinada para la administración oral y que contiene heparina a título de principio activo, caracterizada porque la indicada heparina se encuentra incorporada en el seno de vesículas multilaminares tales como las definidas en la reivindicación 1 o en una de las reivindicaciones 7 a 10 o tales como se han obtenido según el procedimiento definido en la reivindicación 15, dispersándose las indicadas vesículas en un medio farmacéuticamente aceptable tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 11 a 14.

17. Composición farmacéutica destinada a una administración oral y que contiene calcitonina a título de principio activo, caracterizada porque la indicada calcitonina se encuentra incorporada en el seno de vesículas multilaminares tales como las definidas en la reivindicación 1 o en una de las reivindicaciones 7 a 10 o tales como se han obtenido según el procedimiento definido en la reivindicación 15, dispersándose las indicadas vesículas en un medio farmacéuticamente aceptable tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 11 a 14.