ES2210081T3

ES2210081T3 - Utilizacion de los marcos de lectura de la region e4 para la mejora de la expresion de genes.

Info

Publication number: ES2210081T3
Application number: ES01124236T
Authority: ES
Inventors: Majid Mehtali; Monika Lusky
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1998-07-07
Filing date: 1999-07-01
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2019-07-01
Also published as: EP1199368A2; AU756607B2; HK1043390A1; EP0974668B1; AU3800999A; ES2180258T3; EP1199368A3; EP0974668A1; DK1199368T3; DE69903229T2; US6475480B1; DK0974668T3; DE69903229D1; JP2000106875A; CA2276791A1; ATE258228T1; PT974668E; ATE225400T1; DE69914382T2; EP1199368B1

Abstract

Vector recombinante que comprende un gen de interés unido de forma operable a elementos reguladores, en el que dicho vector comprende una combinación de pautas de lectura abierta de E4 que consiste en: (i) ORF3, ORF6 y ORF7; o (ii) ORF3 y ORF4; o (iii) ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, y en el que los elementos reguladores comprenden un promotor que es estimulado en células tumorales o cancerosas.

Description

Utilización de los marcos de lectura de la región E4 para la mejora de la expresión de genes.

La presente invención se refiere a un vector adenoviral recombinante en el que se ha suprimido toda o parte de la región E1 y parte de la región E4, aunque conserva suficientes secuencias de E4 para mejorar la expresión y/o el mantenimiento de la expresión de un gen recombinante en un organismo o una célula huésped. Además, se refiere al uso de pautas de lectura abierta (ORFs) adenovirales de E4 para mejorar la expresión o el mantenimiento de la expresión de un gen recombinante insertado en un vector de expresión. Por último, la invención se refiere a un método para preparar una partícula viral, una célula, una composición farmacéutica que comprende estos vectores, así como a su uso terapéutico o profiláctico. La invención tiene un gran interés en relación a la perspectiva de la terapia génica, en particular en el hombre.

La terapia génica se puede definir como la transferencia de material genético a una célula o a un organismo para tratar o prevenir una enfermedad genética o contraída. La posibilidad de tratar enfermedades en humanos mediante terapia génica ha evolucionado en unos pocos años de un estadio de consideraciones teóricas a aplicaciones clínicas. El primer protocolo aplicado al hombre se inició en los Estados Unidos en septiembre de 1990 en un paciente que era genéticamente inmunodeficiente como resultado de una mutación que afectaba al gen que codifica la adenina desaminasa (ADA). El éxito relativo de este primer experimento alentó el desarrollo de esta tecnología para varias enfermedades genéticas y contraídas. La gran mayoría de protocolos actuales utilizan vectores para transportar el gen terapéutico a las células que se deben tratar. Se han desarrollado varios vectores sintéticos o virales durante estos últimos años. En la literatura disponible para las personas que tienen conocimientos de esta técnica se describe su estructura, organización y biología.

Los adenovirus, que se han detectado en muchas especies animales, no son integrativos y tampoco son muy patógenos. Son capaces de infectar varios tipos celulares, tanto células que se dividen como quiescentes. Tienen un tropismo natural por el epitelio de la vía respiratoria. Además, durante muchos años se han utilizado como vacunas entéricas naturales con un perfil de seguridad excelente. Por último, se pueden replicar y purificar fácilmente en grandes cantidades. Estas características han hecho que los adenovirus sean particularmente adecuados para su uso como vectores de terapia génica con propósitos terapéuticos y de vacuna. Su genoma consiste en una molécula de ADN lineal de doble cadena de aproximadamente 36kb que tiene más de aproximadamente treinta genes necesarios para completar el ciclo viral. Los genes tempranos se dividen en 4 regiones diseminadas en el genoma adenoviral (E1 a E4), que contienen 6 unidades de transcripción dirigidas por sus propios promotores. Las regiones E1, E2 y E4 son esenciales para la replicación viral, mientras que la región E3, que se cree que modula la respuesta inmune antiviral del huésped, no es necesaria para la replicación viral in vitro. Los genes tardíos (L1 a L5) codifican, en su mayoría, las proteínas estructurales que constituyen la cápsida viral. Se solapan, como mínimo en parte, con las unidades de transcripción tempranas y se transcriben a partir de un único promotor (MLP procedente de la expresión Promotor Tardío Principal en inglés). Además, el genoma adenoviral tiene en ambos extremos regiones de actuación en cis necesarias para la replicación del ADN. Éstas son las ITR 5' y 3' (Repetición Terminal Invertida) y la secuencia de empaquetamiento que sigue a la ITR 5'.

Se cree que la región E4 está implicada en la replicación del ADN viral, la síntesis de ARNm tardío, el ensamblaje viral y el bloqueo de la síntesis de proteínas del huésped. Es una unidad de transcripción compleja que codifica varios polipéptidos. Se supone que los codificados por las pautas de lectura abierta (ORFs) 6 y 7 compiten con la proteína celular RB por la unión al factor de transcripción E2F, confiriéndoles una función de transactivadores. El producto de expresión de la ORF4 es capaz de unirse y regular la fosfatasa celular 2A para modular la actividad de los factores de transcripción celulares y virales (E1A). Los polipéptidos codificados por las ORFs 3 y 6 son esenciales para la replicación viral debido a su capacidad para madurar el tránscrito primario de 28 kb que proviene del genoma adenoviral o su exportación al citoplasma. Su ausencia se puede complementar en trans para permitir la replicación viral. Además, el polipéptido de la ORF6 interacciona con el polipéptido de 55K codificado por E1B para formar un complejo que facilita la acumulación citoplasmática de mensajeros tardíos a costa del ARNm celular.

Los vectores adenovirales utilizados actualmente en protocolos de terapia génica no tienen la mayor parte de la región E1 para evitar su difusión en el entorno y en el cuerpo del huésped. Deleciones adicionales en la región E3 permiten aumentar la capacidad de clonación. El gen de interés se introduce en el ADN viral en lugar de una región suprimida. La viabilidad de la transferencia genética utilizando estos vectores denominados de "primera generación" se ha demostrado en varios casos. Sin embargo, la cuestión de su seguridad aun se encuentra en evaluación. Realmente, la probabilidad de generar virus competentes para la replicación durante su propagación en líneas celulares de complementación convencionales no es despreciable. Además, la inmunogenicidad potencial de las proteínas virales que aun son expresadas por el esqueleto viral puede reducir la persistencia de las células transducidas, así como la expresión a largo término del transgen recombinante, y puede estar asociada con episodios
inflamatorios.

Estos importantes inconvenientes han conducido a la construcción de vectores de segunda generación que conservan las regiones cis necesarias para la replicación viral (ITRs y secuencias de empaquetamiento) y que contienen modificaciones genéticas sustanciales dirigidas a suprimir la síntesis residual de los antígenos virales que se supone son responsables de la estimulación de respuestas inflamatorias (véanse, por ejemplo, la solicitud internacional WO94/28152 o la patente USA 5.670.488 que describen vectores adenovirales en los que se han suprimido parcialmente secuencias de E4, con la excepción de la ORF3 o la ORF6/7, que no requieren complementación de E4). También se puede considerar un vector mínimo deficiente para todas las funciones adenovirales.

El mantenimiento de la expresión del transgen es un prerrequisito antes de considerar el uso general de los vectores adenovirales en protocolos de terapia génica en humanos, en particular desde el punto de vista del tratamiento de las enfermedades genéticas y crónicas. Sin embargo, recientemente se ha mostrado que la deleción de la región E4 altera la expresión del transgen dirigida por un promotor heterólogo (es decir, promotor de CMV, LTR del RSV). Estudios de coinfección indicaron que se podían suministrar en trans los productos de E4 para restituir la expresión estable del transgen (publicaciones Armentano y otros, J. Virol. 71 (1997) 2408-2416; Brough y otros, J. Virol. 71 (1997), 9206-9213). Armentano y otros (loc. cit.) describen construcciones que comprenden la región E4 salvaje completa o únicamente la ORF6, o construcciones en las que la región E4 se ha suprimido completamente. Brough y otros (loc. cit.) describen construcciones que comprenden la región E4 completa o que no tienen ninguna ORF de E4.

La patente WO 98/46781 describe un sistema de expresión de transgenes que comprende una unidad de transcripción, un casete de E3 y un casete de E4, es decir, una región E4 modificada que contiene (i) la ORF3 de E4 y como mínimo otro fragmento de E4, que puede ser la ORF4, la ORF6/7 o la ORF3/4 o (ii) únicamente la ORF4 de E4.

Por lo tanto, el problema técnico en el que se basa la presente invención consiste en vectores de expresión que no presentan la inestabilidad de la expresión del transgen que se observa en los vectores adenovirales en los que se ha suprimido E4, y de medios que permiten obtener una expresión a largo término de un transgen en células.

Este problema se soluciona mediante lo establecido en las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Como consecuencia, la presente invención se refiere a un vector adenoviral recombinante que comprende un gen de interés unido de forma operable a elementos reguladores, en la que dicho adenoviral comprende una combinación de pautas de lectura abierta de E4 que consiste en:

(i)	ORF3 y ORF6 y ORF7; o
(ii)	ORF3 y ORF4; o
(iii)	ORFs 1, 2, 3 y 4,

y en el que los elementos reguladores comprenden un promotor que es estimulado en células tumorales o cancerígenas.

Se descubrió de forma sorprendente que se podía restituir la expresión disminuida de un transgen en vectores adenovirales en los que se había suprimido la región E4 mediante la presencia y expresión de determinadas ORFs de E4, en particular de las ORFs de E4 mencionadas anteriormente.

Aunque la región E4 puede variar entre las diferentes cepas de adenovirus, se puede identificar basándose en secuencias de nucleótidos disponibles en diferentes fuentes (publicaciones o bancos de datos) o mediante homología con la región E4 del Ad5 que está bien caracterizada. Como indicación, la región E4 se encuentra localizada en el extremo derecho del genoma adenoviral, con el promotor de E4 estando localizado 5' a 3' ITR. La transcripción se produce de derecha a izquierda por lo que se refiere al mapa adenoviral. La región E4 tiene 7 pautas de lectura abierta de las que 6 contienen un codón de inicio AUG (ORFs 1, 2, 3, 4, 6 y 7) y codifica, como mínimo, para 6 polipéptidos (la proteína codificada por la ORF7 aun no se ha identificado) que se pueden identificar mediante análisis de secuencia. Estudios de mapeo de ARNm también han identificado dos nuevas ORFs creadas por corte y empalme ("splicing") del ARNm, es decir, ORF3/4 y ORF6/7. En particular, en el genoma del Ad5 la ORF6 se extiende desde nt 34074 hasta 33192, la ORF7 se extiende desde nt 33111 hasta 32913 y la ORF6/7 se extiende desde nt 34074 hasta 33901 (dador de corte y empalme ("splice donor")) y desde 33189 (aceptor de corte y empalme ("splice acceptor")) hasta 32913 (véanse las publicaciones Cutt y otros, J. Virol. 61 (1987), 543-552; Freyer y otros, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 3503-3519; Virtanen y otros, J. Virol. 51 (1984), 822-831). Por lo tanto, un vector adenoviral recombinante según la invención puede, entre otras cosas, conservar la ORF6 y la ORF7. Una construcción que conserva la ORF6 y la ORF7 contiene ambas ORF6 y ORF7, que pueden producir los ARNm correspondientes y el producto de corte y empalme ORF6/7. Esta secuencia se denomina ORF6+7 en el ámbito de la presente invención. Además, el vector adenoviral recombinante según la presente invención también puede comprender la ORF3 y la ORF4, que incluye las combinaciones ORF3 y ORF3/4, ORF3/4 y ORF4, ORF3 y ORF4 o sólo ORF3/4. Las personas que tienen conocimientos de esta técnica son capaces de modificar la región E4 de un genoma adenoviral mencionada anteriormente mediante técnicas de biología molecular convencionales para obtener una región E4 que conserve las ORFs mencionadas anteriormente y que no tenga el resto de secuencias. En particular, las personas que tienen conocimientos de esta técnica pueden suprimir de una región E4 adenoviral una parte específica de ADN, por ejemplo, mediante la adecuada restricción o digestión con endonucleasas y religación. Otra posibilidad consiste en aislar las secuencias de E4, conservadas, por PCR.

Las personas que tienen conocimientos de esta técnica pueden determinar las ORFs presentes en la región E4 que ejercen un efecto positivo en la expresión de un transgen, por ejemplo, suprimiendo estas ORFs de la región E4 y determinando si afectan a la expresión del transgen. Además, es posible evaluar el efecto de una ORF de E4 colocándola en cis o en trans respecto a un vector que contiene un transgen en el que se ha suprimido la región E4 y determinando su efecto en la expresión de dicho tansgen. Estos métodos se describen en los ejemplos. La(s) ORF(s) de E4 conservada(s) en el vector adenoviral es (son) capaz(ces), sola(s) o en combinación, directamente o mediante otros factores virales o celulares, de mejorar la expresión de un gen de interés insertado en el vector adenoviral. Este efecto positivo en la expresión del transgen se puede ejercer a diferentes niveles: transcripción, elongación, transporte, estabilidad del ARNm del transgen o traducción alternativa. La mejora se determina evaluando el producto de expresión del transgen o el mantenimiento de su expresión en experimentos in vivo o in vitro.

Además, los vectores adenovirales según la invención pueden presentar una hepatotoxicidad reducida en comparación con los vectores que comprenden la región E4 completa.

Preferentemente, los vectores adenovirales recombinantes conservan las secuencias codificantes completas de una o más de las ORFs de E4 mencionadas anteriormente, que se extienden desde el iniciador ATG hasta el codón de terminación. Sin embargo, también se puede utilizar una variante funcional que tiene la capacidad de regular el promotor. Esta variante se puede obtener por mutación o truncación de las secuencias ORF originales. Para ilustrar esta realización, se puede hacer referencia a una variante de la ORF6 de E4 en la que se ha suprimido la secuencia comprendida entre el primer y el segundo codón ATG. Más preferentemente, las ORFs de E4 que se conservan en el vector adenoviral comprenden elementos reguladores que permiten su expresión, más preferentemente sus elementos reguladores naturales, en particular el promotor de E4. Por otra parte, también se pueden unir de forma operable a un promotor heterólogo. Para estabilizar la expresión de las ORFs de E4, puede ser ventajoso que la(s) ORF(s) de E4 conserve(n) o comprenda(n) secuencias de corte y empalme. Pueden ser homólogas (respecto a las secuencias de E4) o heterólogas (es decir, de origen sintético o que provienen de cualquier gen eucariota). En principio son adecuadas todas las secuencias de corte y empalme descritas en la técnica anterior, por ejemplo las de los genes que codifican la \alpha o \beta globina, la apolipoproteína, la inmunoglobulina, el factor IX, el factor VIII, el CFTR o las del vector pCI (Promega). Las ORFs de E4 conservadas en el vector adenoviral según la invención pueden ser las ORFs naturales de dicho vector. En particular, pueden permanecer en su localización natural. Sin embargo, también es posible que el vector se construya suprimiendo todas las secuencias de E4, en particular todas las ORFs de E4, e insertando en el vector adenoviral determinadas ORFs de E4 de los mismos esqueletos de adenovirus o de otros en una localización en la que normalmente se encuentra la región E4 o en una localización diferente, por ejemplo, en lugar de la región E1 o E3 suprimida. Las ORFs se pueden colocar en orientación en sentido o antisentido respecto a la dirección de transcripción de la región E4 salvaje.

El vector adenoviral según la invención es un vector adenoviral en el que como mínimo toda o parte de la región E1 se ha suprimido o no es funcional. Este vector puede provenir de un genoma de adenovirus en el que se ha suprimido, como mínimo, toda o parte de la región E1. Se puede obtener de un adenovirus original cuyo genoma se ha modificado. Las modificaciones pueden ser diversas (deleción, mutación y/o adición de uno o más nucleótidos) e implicar cualquier secuencia viral. Además, se pueden localizar en las secuencias codificantes del genoma viral o fuera de estas secuencias, por ejemplo, en los elementos reguladores tales como los promotores. Como guía, algunas secuencias virales se pueden suprimir, convertirlas en no funcionales o sustituirlas por secuencias heterólogas de nucleótidos y, en particular, por genes cuya expresión se busca en una célula huésped (uno o más genes de
interés).

Preferentemente, el vector según la invención es defectuoso en las funciones de E1 debido a la deleción parcial o total de la región respectiva. La deleción engloba, como mínimo, las secuencias E1a y se puede extender a la unidad de transcripción E1b. Preferentemente no se suprimen las secuencias E1b que se solapan con el gen pIX. Estas deleciones de E1 están incluidas en vectores descritos en la técnica anterior y publicados en la literatura.

Ni que decir tiene que el esqueleto adenoviral del vector según la invención puede comprender modificaciones adicionales, tales como deleciones, inserciones o mutaciones en uno o más genes virales. Según una realización ventajosa, proviene de un genoma de adenovirus en el que uno o más genes virales de las regiones E2 y/o L1-L5 no son funcionales. La no funcionalidad se puede obtener mediante una deleción parcial o completa o mediante la mutación de una o más de las regiones mencionadas. Como ejemplo, se puede hacer referencia a la mutación termosensible localizada en el gen que codifica la DBP (Proteína de Unión a ADN) de la región E2a (publicación Ensinger y otros, J. Virol. 10 (1972), 328-339). También se puede considerar un vector adenoviral deficiente en todas las regiones tempranas y tardías.

En otra realización preferente el vector no tiene toda o parte de la región E3. En este contexto, podría ser interesante conservar las secuencias de E3 que codifican para los polipéptidos que permiten evitar el sistema inmune del huésped, en particular aquéllos que codifican para la glicoproteína gp19k (publicación Gooding y otros, Critical Review of Immunology 10 (1990), 53-71).

El vector adenoviral según la presente invención puede provenir de un genoma de adenovirus humano o animal, en particular de origen canino, aviar, bovino, múrido, ovino, felino, porcino o simio, o, alternativamente, de un híbrido de los mismos. Se puede utilizar cualquier serotipo, en particular el adenovirus múrido Mav1 (publicación Beard y otros, Virology 175 (1990), 81-90), los CAV-1 o CAV-2 de perro (publicaciones Spibey y Cavanagh, J. Gen. Virol. 70 (1989), 165-172; Linné, Virus Research 23 (1992), 119-133; Shibata y otros, Virol. 172 (1989), 460-467; Jouvenne y otros, Gene 60 (1987), 21-28), el DAV aviar (publicación Zakharchuk y otros, Arch. Virol. 128 (1993), 171-176) o el BAV3 bovino (publicación Mittal y otros, J. Gen. Virol. 76 (1995), 93-102). Sin embargo, son preferentes los adenovirus humanos del subgrupo C, y especialmente los adenovirus 2 (Ad2) y 5 (Ad5). Hablando de forma general, los virus mencionados están disponibles en colecciones, tal como ATCC, y han sido el objeto de numerosas publicaciones que describen su secuencia, organización y biología, lo que permite a una persona con conocimientos de esta técnica emplearlos. Por ejemplo, la secuencia del adenovirus humano de tipo 5 se describe en la base de datos de Genebank con la referencia M 73260, y se incorpora por referencia en su totalidad.

Tal como se ha mencionado anteriormente, se descubrió que determinadas ORFs de la región E4 son capaces de regular de forma positiva la expresión de un gen de interés insertado en un vector adenoviral. El término "gen" se refiere a un ácido nucleico (ADN, ARN u otros derivados de polinucleótidos) que pueden tener cualquier origen (procariota, eucariota, viral...). El gen de interés puede codificar, por ejemplo, para un ARN antisentido, un ribozima o un mensajero (ARNm) que se traducirá en una proteína de interés. Incluye ADN genómico, ADNc o tipos mixtos (minigen). Puede codificar para un polipéptido maduro, un precursor (es decir, un precursor destinado a ser secretado y que comprende una secuencia señal, un precursor destinado a ser madurado mediante corte proteolítico...), un fragmento de una proteína (proteína truncada), un polipéptido quimérico que proviene de la fusión de diversas secuencias o un polipéptido mutado que presenta propiedades biológicas modificadas y/o mejoradas. El gen se puede aislar de cualquier organismo o célula mediante técnicas convencionales de biología molecular (PCR, clonación con sondas adecuadas, síntesis química) y, si se requiere, su secuencia se puede modificar por mutagénesis, PCR o cualquier otro protocolo.

Los siguientes genes son de particular interés. Pueden codificar para una citoquina (interferón \alpha, \beta o \gamma, una interleuquina (IL), en particular IL-2, IL-6, IL-10 o IL-12, un factor de necrosis tumoral (TNF), un factor estimulador de colonias GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), un receptor nuclear o celular, un ligando de receptor (ligando fas), un factor de coagulación (FVIII, FIX...), un factor de crecimiento (FGF procede de Factor de Crecimiento de Fibroblastos en inglés, VEGF procede de Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular en inglés), un enzima (ureasa, renina, trombina, metaloproteinasa, sintetasa de óxido nítrico NOS, SOD, catalasa...), un inhibidor enzimático (\alpha1-antitripsina, antitrombina III, inhibidor de proteasas viral, PAI-1 procede de inhibidor del activador de plasminógeno en inglés), la proteína CFTR, la insulina, la distrofina, un antígeno del MHC (Complejo Principal de Histocompatibilidad) de clase I o II o un polipéptido que puede modular/regular la expresión de los genes correspondientes, un polipéptido capaz de inhibir una infección viral, parasitaria o bacteriana o su desarrollo (polipéptidos antigénicos, epítopos antigénicos, variantes transdominantes que inhiben la acción de una proteína nativa por competición...), un inductor o inhibidor de apoptosis (Bax, Bcl2, BclX...), un agente citoestático (p21, p 16, Rb...), una apolipoproteína (ApoAI, ApoAIV, ApoE...), un inhibidor de la angiogénesis (angioestatina, endoestatina...), un neutralizador de radicales oxígeno, un polipéptido que tiene un efecto antitumoral, un anticuerpo, una toxina, una inmunotoxina y un marcador (\beta-galactosidasa, luciferasa...) o cualquier otro gen de interés que se conozca en la técnica como útil para el tratamiento o la prevención de un estado clínico.

Por ejemplo, para tratar una disfunción hereditaria se puede utilizar una copia funcional de un gen defectuoso, por ejemplo un gen que codifica el factor VIII o IX en el contexto de la hemofilia A o B, la distrofina (o minidistrofina) en el contexto de las miopatías, la insulina en el contexto de la diabetes y el CFTR (Regulador de la Conductancia de la Transmembrana en Fibrosis Cística) en el contexto de la fibrosis cística. Entre los genes de interés adecuados para retrasar o inhibir un tumor o la progresión del cáncer o se incluyen, aunque sin limitarse a ello, aquéllos que codifican un ARN antisentido, un ribozima, un producto citotóxico tal como la timidina quinasa del virus del herpes-1 simple (TK-HSV-1), la ricina, una toxina bacteriana, el producto de expresión de los genes de levadura FCY1 y/o FUR1 que tienen actividades UPRTasa (Uracil Fosforibosil Transferasa) y CDasa (Citosina Desaminasa), un anticuerpo, un polipéptido que inhibe la división celular o las señales de transducción, un gen supresor de tumores (p53, Rb, p73...), un polipéptido que activa el sistema inmune del huésped, un antígeno asociado a tumor (MUC-1, BRCA-1, un antígeno temprano o tardío de HPV (E6, E7, L1, L2...)...), opcionalmente en combinación con un gen de citoquina. Por último, en el contexto de la terapia anti-VIH, se puede utilizar un gen que codifica un polipéptido inmunoprotector, un epítopo antigénico, un anticuerpo (2F5; publicación Buchacher y otros, Vaccines 92 (1992), 191-195), el dominio extracelular de CD4 (sCD4; publicación Traunecker y otros, Nature 331 (1988), 84-86), una inmunoadhesina (es decir, un híbrido CD4-IgG, la fusión de CD4-2F5; publicaciones Capon y otros, Nature 337 (1989), 525-531; Byrn y otros, Nature 344 (1990), 667-670), una inmunotoxina (es decir, resultante de la fusión entre la angiogenina y 2F5 o CD4-2F5; publicación Kurachi y otros, Biochemistry 24 (1985), 5494-5499), una variante trans-dominante (patentes EP 0614980, WO95/16780), un producto citotóxico (ver anteriormente) o IFN\alpha o \beta.

Además, un gen de interés también puede comprender un gen de selección que permite la selección de las células transfectadas y transducidas. Estos genes incluyen, aunque sin limitarse a ello, el gen neo (que codifica la neomicina fosfotransferasa) que confiere resistencia a G418, la dhfr (Dihidrofolato Reductasa), la CAT (Cloranfenicol Acetil Transferasa), la pac (Puromicina Acetil Transferasa) y la gpt (Xantina Guanina Fosforibosil Transferasa). Los genes de selección se conocen en la técnica.

El gen de interés se puede manipular genéticamente para formar un casete de expresión funcional, que incluye un promotor adecuado. Éste se puede obtener a partir de cualquier gen eucariota, bacteriano o viral (incluso del gen de interés), y puede ser constitutivo o regulable. De forma opcional, se puede modificar para mejorar su actividad transcripcional, suprimir secuencias negativas, modificar su regulación, introducir sitios de restricción adecuados, etc. El promotor es un promotor que se estimula en células tumorales o cancerosas. Como ejemplo, se pueden utilizar los promotores aislados del gen MUC-1 sobreexpresado en cánceres de mama y próstata (publicación Chen y otros, J. Clin. Invest. 96 (1995), 2775-2782), CEA (Antígeno de Carcinoma Embrionario) sobreexpresado en cánceres de colon (publicación Schrewe y otros, Mol. Cell. Biol. 10 (1990), 2738-2748), de tirosinosa sobreexpresada en melanomas (publicación Vile y otros, Cancer Res. 53 (1993), 3860-3864), de ERB-2 sobreexpresado en cánceres de mama y páncreas (publicación Harris y otros, Gene Therapy 1 (1994), 170-175) y de \alpha-fetoproteína sobreexpresada en cánceres de hígado (publicación Kanai y otros, Cancer Res. 57 (1997), 461-465).

Los elementos reguladores pueden incluir, además, elementos adicionales, tales como intrones, señales de secreción, señal de localización nuclear, IRES, secuencias poli A de terminación de transcripción, una secuencia líder tripartita y orígenes de replicación.

El vector adenoviral según la presente invención puede comprender uno o más genes de interés. Los diferentes genes pueden estar incluidos en el mismo casete o en diferentes casetes controlados de este modo por elementos reguladores separados. Los casetes se pueden insertar en varios sitios en el vector, en la misma dirección o en direcciones opuestas.

Los vectores recombinantes de la presente invención pueden ser utilizados para mejorar la expresión y/o persistencia de la expresión de un gen de interés que está contenido en un vector de expresión y que está enlazado operativamente a los elementos reguladores antes descritos.

El descubrimiento de que la presencia de determinadas ORFs de la región E4 adenoviral es ventajosa para la expresión estable del transgen también tiene importancia para obtener una expresión estable de transgenes en vectores de expresión diferentes de los vectores adenovirales. Por lo tanto, las ORFs de una región E4 adenoviral mencionadas anteriormente generalmente se pueden utilizar para lograr una expresión estable de los transgenes en el sistema de expresión. En este aspecto, es posible lograr una expresión mejorada, es decir, una expresión total o una expresión estable a largo plazo, de un transgen colocando las ORFs en cis o en trans.

Tal como se ha indicado anteriormente con relación a los vectores adenovirales según la invención, la región E4 puede variar entre las diferentes cepas de adenovirus. Sin embargo, las personas que tienen conocimientos de esta técnica pueden identificar la región E4 de un adenovirus así como las ORFs contenidas en ella. Por lo tanto, las personas que tienen conocimientos de esta técnica pueden aislar las ORFs mencionadas anteriormente de un genoma adenoviral para utilizarlas según la invención.

La(s) ORF(s) de E4 utilizada(s) en el ámbito de la presente invención puede(n) ser de cualquier origen adenoviral (animal o humano). Preferentemente provienen de un adenovirus humano del subgrupo C, especialmente de forma preferente de Ad2 o Ad5.

La(s) ORF(s) de E4 es (son) capaz(ces), sola(s) o en combinación, directamente o mediante otros factores virales o celulares, de mejorar la expresión de un gen de interés insertado en un vector de expresión. Este efecto positivo en la expresión de un transgen se puede ejercer a diferentes niveles: transcripción, elongación, transporte, estabilidad del ARNm del transgen o traducción alternativa. La mejora se determina evaluando el producto de expresión del transgen o el mantenimiento de su expresión en experimentos in vivo o in vitro. Un modo de proceder consiste en inyectar un vector que contiene dicha(s) ORF(s) de E4 junto con un casete de expresión de un gen cuyo producto se puede detectar con facilidad (LacZ, luciferasa, 1-antitripsina, factor IX, CFTR...) y determinar el nivel del producto del transgen con el tiempo comparado con un control que no tiene las secuencias adenovirales de E4. La mejora se puede observar en términos de la cantidad de producto del transgen (como mínimo por un factor de 2) o en términos del mantenimiento de la expresión (estabilidad durante un largo periodo de tiempo).

De acuerdo con lo anterior, se utiliza un polinucleótido que comprende una combinación de pautas de lectura abierta de E4 que consiste en:

(i)	ORF3, ORF6 y ORF7; o
(ii)	ORFs 3 y 4; o
(iii)	ORF1, ORF2, ORF3 y ORF4

de una región E4 adenoviral.

Preferentemente, esta ORF comprende la secuencia codificante completa, es decir, desde el iniciador ATG hasta el codón de terminación. Sin embargo, también es posible emplear una variante funcional de esta ORF, por ejemplo variantes obtenidas por deleción, mutación o truncación que todavía codifican un polipéptido funcional. En particular, las variantes incluyen las ORFs que comparten un elevado grado de homología con el equivalente original, en particular como mínimo un 70% de identidad en la secuencia, más preferentemente como mínimo un 80%, y más preferente como mínimo un 90%. La identidad total es particularmente preferente.

El polinucleótido que se utiliza en la presente invención se encuentra unido de forma operable a elementos reguladores para permitir su expresión en un organismo o una célula huésped. Estos elementos incluyen un promotor que se puede aislar de cualquier gen de origen eucariota o viral. Cuando el polinucleótido comprende varias ORFs de E4, éstas se pueden expresar a partir de un único promotor o a partir de promotores independientes. En este caso, los diferentes casetes de E4 se pueden encontrar en la misma dirección o en dirección opuesta, y en las mismas y en diferentes localizaciones en uno o más vectores. Sin embargo, es preferente el uso de un único promotor para conducir la transcripción de las secuencias de E4 seleccionadas. Una primera posibilidad consiste en colocarlas bajo el control del promotor homólogo de E4. Otra posibilidad consiste en utilizar un promotor heterólogo. Preferentemente, este promotor heterólogo es constitutivo y se puede escoger entre los mencionados anteriormente. Las personas que tienen conocimientos de esta técnica son capaces de unir dicho polinucleótido a un promotor adecuado de un modo operativo. Para estabilizar la expresión, puede ser ventajoso que la(s) ORF(s) de E4 conserve(n) o comprenda(n) secuencias de corte y empalme. Pueden ser homólogas (que provienen de secuencias de E4) o heterólogas (de origen sintético o que provienen de cualquier gen eucariota). La gran variedad de secuencias de corte y empalme descritas en el estado de la técnica son adecuadas en el contexto de la invención. Más particularmente, se pueden mencionar las aisladas de los genes que codifican la \alpha o \beta globina, la apolipoproteína, la inmunoglobulina, el factor IX, el factor VIII, el CFTR o las del vector pCI (Promega).

Ventajosamente, la secuencia de polinucleótidos se inserta en un vector de expresión. En el contexto de la presente invención, puede ser un vector plásmido, sintético o viral. Plásmido indica un ADN circular extracromosómico capaz de replicación autónoma en una célula dada. La elección de los plásmidos es muy amplia. Preferentemente se diseña para la amplificación en bacterias y la expresión en células huésped eucariotas. Estos plásmidos se pueden adquirir de varios fabricantes. Entre los plásmidos adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ello, los derivados del pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogene), pCI (Promega) y p Poly (publicación Lathe y otros, Gene 57 (1987), 193-201). También se puede modificar genéticamente este plásmido mediante técnicas de biología molécula (publicación Sambrook y otros, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), NY). Un plásmido también puede comprender un gen de selección para seleccionar o identificar las células transfectadas (mediante complementación de la auxotrofía de una célula, resistencia a antibióticos), elementos estabilizadores (es decir, secuencia cer; publicación Summers y Sherrat, Cell 36 (1984), 1097-1103) o elementos integrativos (secuencias virales de LTR).

Un vector de expresión también puede ser de origen viral, y puede provenir de varios virus, tales como los virus del herpes, los citomegalovirus, los AAV (virus adenoasociados), los poxvirus (poxvirus de canario, poxvirus aviar, virus vacuna, MVA) y los retrovirus.

En una realización preferente, el polinucleótido y el gen de interés se insertan en el mismo vector de expresión. Se pueden insertar en la misma localización (es decir, en lugar de las secuencias de E1 suprimidas en un vector adenoviral E1^{-}) o en diferentes localizaciones (por ejemplo, el gen de interés en lugar de las secuencias de E1 suprimidas y el polinucleótido en lugar de la región E4 original). También es viable el uso de dos vectores de expresión independientes, cada uno llevando dicho polinucleótido y dicho gen de interés. En este caso, se pueden introducir los dos vectores en la célula huésped de forma conjunta (cotransfección o coinfección) o por separado.

En una realización especialmente preferente, el vector en el que se inserta el polinucleótido que comprende las ORFs de E4 es un vector adenoviral, preferentemente un vector adenoviral en el que se ha suprimido la región E4.

Respecto a la naturaleza y estructura del vector adenoviral, a la localización de las ORFs de E4 insertadas, a la naturaleza del gen de interés y a las regiones reguladoras, se aplica lo mismo que lo que se ha indicado anteriormente en relación con los vectores adenovirales según la invención.

Además, la presente invención se refiere a un vector no adenoviral que comprende un gen de interés unido de forma operable a elementos reguladores, en la que dicho vector comprende una combinación de pautas de lectura abierta de E4 que consiste en:

(i)	ORF3, ORF6 y ORF7; o
(ii)	ORF3 y ORF4; o
(iii)	ORF1, ORF2, ORF3 y ORF4

y en el que los elementos reguladores comprenden un promotor que es estimulado en células tumorales o cancerosas.

Con relación a las características de las ORFs y a la naturaleza del gen de interés, se aplica lo mismo que lo que se ha expuesto anteriormente para el uso de un polinucleótido según la invención.

La presente invención también se refiere a una partícula viral infecciosa que comprende un vector adenoviral según la invención o un vector de expresión que comprende ORFs de E4 tal como se han descrito con relación al uso según la invención. Se puede preparar según cualquier técnica convencional en el sector de la técnica. Cuando se considera un vector adenoviral, se puede proceder mediante la cotransfección de fragmentos adenovirales adecuados en una línea celular, tal como la línea 293 (tal como se describe en la publicación Graham y Prevect, Methods in Molecular Biology, Volumen 7 (1991), Gene Transfer and Expression Protocols; Editor E. J. Murray, The Human Press Inc, Clinton, NJ). También es posible reconstituir el vector en Escherichia coli mediante ligación o recombinación homóloga (tal como se describe en la patente WO96/17070) antes de transfectar la línea celular. Además, los viriones se pueden amplificar mediante el paso por una célula permisiva para generar una reserva viral de elevado título que se puede utilizar en la preparación de lotes clínicos. Se puede propagar en una línea celular de complementación, que suministra en trans las funciones virales suprimidas/mutadas. Habitualmente se utiliza la línea 293, establecida a partir de células de riñón de embrión humano (publicación Graham y otros, J. Gen. Virol. 36 (1977), 59-72), para complementar la función de E1. Se han modificado genéticamente otras líneas celulares para complementar vectores deficientes por duplicado (E1º E4º o E1º E2º), tales como las descritas en las publicaciones Yeh y otros (J. Virol. 70 (1996), 559-565), Krougliak y Graham (Human Gene Therapy 6 (1995), 1575-1586), Wang y otros (Gene Therapy 2 (1995), 775-783), Lusky y otros (J. Virol. 72 (1998), 2022-2033) y en las solicitudes internacionales WO94/28152 y WO97/04119. Alternativamente, también es posible utilizar además un virus auxiliar que suministra en trans como mínimo una parte de las deficiencias virales.

La invención también se refiere a un método para preparar una partícula viral infecciosa conforme a la invención, según el cual:

(i): el vector adenoviral de la invención o el vector de expresión que comprende ORFs de E4, tal como se ha descrito anteriormente, se introduce en una célula de complementación capaz de complementar en trans dicho vector, para obtener una célula de complementación transfectada;

(ii): dicha célula de complementación transfectada se cultiva en condiciones adecuadas para permitir la producción de dicha partícula viral infecciosa; y

(iii): dicha partícula viral infecciosa se recupera del cultivo celular.

El vector se puede introducir en la línea celular mediante cualquiera de los diferentes métodos conocidos en la técnica. Se puede realizar mediante transfección del vector o de fragmentos del mismo, mediante lipofección, electroporación e infección. Las partículas virales infecciosas se pueden recuperar del sobrenadante del cultivo, aunque también de las células, que se pueden lisar, por ejemplo mediante una serie de ciclos de congelación/descongelación. Opcionalmente, los viriones se pueden amplificar y purificar según técnicas estándar (cromatografía, ultracentrifugación, por ejemplo en un gradiente de cloruro de cesio...).

Además, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende un vector adenoviral de la invención o un polinucleótido y un vector de expresión, tal como se ha definido con relación al uso de la invención, o que está infectada por una partícula viral infecciosa de la invención. Preferentemente, esta célula proviene de mamífero y, en particular, es de origen humano. El vector se puede insertar en el genoma celular o no (episoma). Entre las células adecuadas se incluyen, aunque sin limitarse a ello, células tumorales o primarias de origen hematopoiético (célula madre pluripotencial, leucocito, linfocito, monocito, macrófago...), muscular (célula satélite, miocito, mioblasto, células musculares lisas...), cardíaco, de pulmón, de tráquea, de hígado, vascular, epitelial, fibroblástico o endotelial.

La presente invención también se refiere a una composición, preferentemente una composición farmacéutica, que comprende como agente un vector adenoviral según la invención, un polinucleótido y un vector de expresión tal como se ha descrito anteriormente, una célula huésped o una partícula viral infecciosa según la invención o preparada según el proceso de la invención. Especialmente, la composición de la invención está destinada al tratamiento preventivo o curativo de enfermedades, tales como las enfermedades genéticas (hemofilia, diabetes, fibrosis cística, miopatías de Duchenne o Becker, enfermedades autoinmunes) o las enfermedades contraídas (cánceres, tumores, enfermedades cardiovasculares, enfermedades virales tales como el SIDA o la hepatitis B o C...).

La composición según la invención se puede producir de un modo convencional para la administración local, general u oral. Se pueden considerar aerosoles, intilación ("intillation") o inyección. Entre las vías de administración adecuadas se incluyen la vía intragástrica, subcutánea, intercardíaca, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonar o endotraqueal. La administración se puede efectuar en una única dosis o se puede repetir la dosis una o varias veces después de un determinado intervalo de tiempo. La dosis y la vía de administración adecuadas varían según varios parámetros, por ejemplo, el individuo, la enfermedad que se debe tratar o el gen de interés que se transfiere. Las partículas virales según la invención se pueden formular como dosis que contienen entre 10^{4} y 10^{14} iu (unidad infecciosa), ventajosamente entre 10^{5} y 10^{13} iu y preferentemente entre 10^{6} y 10^{12} iu. El título se puede determinar mediante técnicas convencionales (véase, por ejemplo, la anterior publicación Lusky y otros, 1998). Las dosis basadas en el vector pueden comprender entre 0,01 y 100 mg de ADN, ventajosamente entre 0,05 y 10 mg, y preferentemente entre 0,5 y 5 mg. Además, el agente de la composición se puede combinar con un vehículo que sea aceptable desde un punto de vista farmacéutico. La formulación también puede incluir un diluyente, un adyuvante o un excipiente. Se puede presentar como un líquido directamente inyectable o como un polvo anhidro (liofilizado... etc) que se puede reconstituir antes de su uso.

Además, el vector, la célula huésped y las partículas virales según la presente invención se pueden combinar, opcionalmente, con una o más sustancias que mejoran la estabilidad o la eficiencia de la transferencia genética. Estas sustancias son bien conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, las publicaciones Felgner y otros (Proc. West. Pharmacol. Soc. 32 (1987), 115-121); Hodgson y Solaiman (Nature Biotechnology 14 (1996), 339-342); Remy y otros (Biconjugate Chemistry 5 (1994), 647-654)) e incluyen, en particular, polímeros, lípidos catiónicos, liposomas, proteínas nucleares y lípidos neutros. También se pueden utilizar en combinación (es decir, lípidos catiónicos y neutros).

Además, la presente invención se refiere al uso de un vector adenoviral según la invención, de un polinucleótido y un vector de expresión, tal como se ha descrito anteriormente, de una partícula viral o una célula huésped según la invención para la preparación de un fármaco destinado a la transferencia genética en un organismo o una célula huésped, y preferentemente para el tratamiento de animales o humanos mediante inmunoterapia o terapia génica. Según una primera posibilidad, el fármaco se puede administrar directamente in vivo (por ejemplo mediante inyección intravenosa, en un tumor accesible, en los pulmones mediante un aerosol...). También es posible adoptar la aproximación ex vivo, que consiste en extraer células del paciente (células madre del tuétano de hueso, linfocitos de sangre periférica, células musculares...), transfectarlas o infectarlas in vitro según protocolos estándar y reintroducirlas al paciente.

En una realización preferente de dicho uso de la presente invención, las secuencias de E4 conservadas en dicho vector adenoviral son una combinación de pautas de lectura abierta de E4 que consiste en:

(i)	ORFs 3 y 4; o
(ii)	ORFs 3 y 6 y 7.

Preferentemente, las composiciones farmacéuticas correspondientes son para la transferencia genética en tejido pulmonar.

En otra realización preferente de dicho uso de la presente invención, las secuencias de E4 conservadas en dicho vector adenoviral son:

(i)	ORFs 3 y 4; o
(ii)	ORFs 3 y 6 y 7.

Preferentemente, las composiciones farmacéuticas correspondientes son para la transferencia genética en tejido de hígado.

Los vectores adenovirales mencionados en relación a dichas realizaciones preferentes del uso de la presente invención muestran una toxicidad reducida y/o provocan una respuesta inflamatoria reducida por parte de la célula o del organismo huésped. Esto se ilustrará mediante los ejemplos que se muestran a continuación.

Los vectores, partículas virales y células huésped descritos son útiles para realizar un método de tratamiento según el cual se administra a un paciente que necesita este tratamiento una cantidad efectiva terapéuticamente de un vector adenoviral según la invención, de un polinucleótido y un vector de expresión tal como se describen en relación al uso según la invención, de una partícula viral o de una célula huésped según la invención.

Materiales y métodos

Las construcciones descritas a continuación se realizan según las técnicas generales de ingeniería genética y clonación molecular descritas en la publicación Sambrook y otros (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, o ediciones más recientes), o según las recomendaciones de producción cuando se utiliza un estuche ("kit") comercial. Las etapas de recombinación homóloga preferentemente utilizan la cepa de E. coli BJ 5183 (publicación Hanahan, J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580) y se realizan tal como se describe en la publicación Chartier y otros (J. Virol. 70 (1996), 4805-4810). Considerando la reparación de los sitios de restricción, la técnica utilizada consiste en rellenar los extremos 5' protuberantes utilizando el fragmento grande de la ADN polimerasa I de E. coli (Klenow). Los fragmentos de genoma adenoviral utilizados en las diferentes construcciones descritas a continuación se indican exactamente según sus posiciones en la secuencia de nucleótidos del genoma del Ad5, tal como se describe en el banco de datos de Genebank con la referencia M73260.

Considerando la biología celular, las células se transfectan o transducen según técnicas estándar bien conocidas por las personas que tienen conocimientos de esta técnica. Se puede mencionar la técnica del fosfato cálcico, aunque también se puede utilizar cualquier otro protocolo. Por su parte, las condiciones de cultivo son convencionales. La línea 293 (publicación anterior Graham y otros, 1977; ATCC CRL-1573) resulta de la integración del extremo 5' del genoma del Ad5 en sus cromosomas. La línea TG5606 (descrita en la anterior publicación Lusky y otros (1998)) proviene de la línea 293 transfectada de forma estable por el plásmido pTG5606 que contiene las secuencias ORF6+7 de E4 del Ad5 (es decir, una secuencia que contiene la ORF6 y la ORF7 susceptible de producir los polinucleótidos correspondientes y el producto de corte y empalme ORF6/7) y el gen de selección pac. La A549 se puede adquirir en ATCC (CCL-125). También se pueden utilizar otras líneas celulares.

Generación de virus, replicación viral y valoración. Para la generación de virus, se liberaron los genomas virales de los plásmidos recombinantes respectivos mediante digestión con PacI y se transfectaron en las líneas celulares de complementación adecuadas, tal como se ha descrito con anterioridad (publicación Chartier y otros, 1996, J. Virol 70, 4805-4810). Los vectores E4 salvaje se generaron en células 293, mientras que todos los vectores modificados en E4 se generaron en células TG5606. La propagación vírica, la purificación y la valoración de las unidades infecciosas (IU/ml), mediante inmunofluorescencia de DBP indirecta, se realizó exactamente del mismo modo que el descrito (publicación anterior Lusky y otros, 1998). Se calculó la concentración de partículas virales (P/ml) de cada preparación de vector utilizando la densidad óptica para medir el contenido de ADN viral (publicación Mittereder y otros, 1996, J. Virol. 70, 7498-7509). Se evaluó la replicación de los vectores modificados en E4 en presencia y en ausencia de complementación de E4 en células 293 y se comparó con la de las células TG5606.

Estudios en animales. Los ratones utilizados en este estudio tenían entre 6 y 8 semanas de edad y eran ratones hembra inmunocompetentes C57Bl/6, CBA o inmunodeficientes C.B17-scid/scid (IFFA Credo, L'albresle, Francia). Se administraron los vectores que contenían el transgen CFTR por vía intratraqueal (I.T.) o intravenosa (IV) en las dosis indicadas. Los animales se sacrificaron en los tiempos indicados. Se extrajeron los órganos, se cortaron en piezas iguales y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido hasta el análisis.

Análisis de ADN. Se extrajo el ADN total de los órganos y de las células de cultivo de tejidos tal como se ha descrito (publicación anterior Lusky y otros, 1998). En resumen, se digirieron las células o los tejidos hasta el día siguiente con solución de proteinasa K (1 mg de proteinasa K en SDS al 1%) en tampón de lisis de ADN (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 400 mM NaCl, 2 mM EDTA). El ADN se aisló mediante extracción con fenol-cloroformo seguido de precipitación con etanol. Se digirió el ADN (10 \mug) con BamHI y se analizó mediante análisis de transferencia de tipo Southern ("Southern blot") utilizando un fragmento de restricción EcoRI-HindIII marcado con ^{32}P purificado del ADN genómico del Ad5 (nt 27331 a 31993).

Análisis de ARN. Se extrajo el ARN total de los órganos y las células de cultivo de tejidos tal como se describe y se recomienda por el proveedor. Para el análisis de transferencia de tipo Northern ("Northern blot"), se sometieron entre 10 y 15 \mug de ARN total a electroforesis en gel y se transfirieron a filtros de nitrocelulosa. Se detectó el ARNm específico de CFTR utilizando un fragmento de restricción BamHI marcado con ^{32}P (2540 bp) purificado del ADNc de CFTR. Se detectó el ARNm específico de virus utilizando un oligonucleótido marcado con ^{32}P, que se hibrida específicamente al ARNm de hexona de los mensajes L3 virales.

Estudios de toxicidad. Se realizaron estudios de toxicidad de las diferentes construcciones adenovirales en ratones hembra inmunocompetentes de seis semanas de edad (C57BL/6, Balb/c, C3H o CBA) adquiridos de Iffa Credo (L'albresles, Francia). Los ratones se ubicaron en instalaciones libres de patógenos específicos. Los vectores adenovirales se administraron por vía intravenosa (i.v.) mediante la infusión de un volumen de 100 \mul a través de la vena de la cola. Los animales se sacrificaron a diferentes tiempos a lo largo de un periodo de como mínimo un mes (5, 16 y 30 ó 4, 14, 30 y 60 días). Se extrajeron los hígados y se almacenaron en un tampón de formaldehído al 10% hasta el análisis anatomopatológico. Se calculó la concentración de partículas virales utilizando la densidad óptica para medir el contenido de ADN viral (publicación Mittereder y otros, 1996, J. Virol. 70, 7498-7509).

El análisis anatomopatológico se realizó en tejidos incluidos en parafina y fijados con formalina teñidos con hematoxilina y eosina. Se estimaron visualmente los daños en el hígado (distrofia) y el estado de inflamación (infiltración linfocítica).

Se evaluó la toxicidad en el hígado analizando el contenido de transaminasas de muestras de suero tomadas en el momento del sacrificio. Se midieron los niveles de GOT (transaminasa glutámica oxalacética) y GPT (transaminasa glutámica pirúvica) mediante un método enzimático estándar. La GOT es representativa de la actividad de la aspartato aminotransferasa (AST) que cataliza la transferencia de un grupo amino entre el L-aspartato y el 2-oxoglutarato para obtener L-glutamato y oxaloacetato, donde este último reacciona con NADH en presencia de malato deshidrogenasa. La velocidad de oxidación del NADH se evalúa como la disminución de la absorbancia óptica a 340 nm (Cobas Integra), que es directamente proporcional a la actividad catalítica de la AST. La GPT es representativa de la actividad de la alanina aminotransferasa (ALT) que cataliza la reacción entre L-alanina y 2-oxoglutarato para obtener L-glutamato y piruvato, donde este último reacciona con NADH en presencia de lactato deshidrogenasa. La velocidad de oxidación del NADH se evaluó como la reducción de la absorbancia óptica a 340 nm, que es directamente proporcional a la actividad catalítica de la ALT.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención.

Ejemplo 1 Construcción de vectores modificados en E4

Se generó una serie de vectores AdE1º y AdE1º E4º isogénicos que contenían casetes de expresión dirigidos por el promotor de CMV. Todos los vectores tienen un esqueleto adenoviral en el que se ha suprimido la parte esencial de las secuencias de E1 (deleción desde nt 459 hasta 3327) y de E3 (una pequeña deleción (S) que abarca desde nt 28592 hasta 30470) o una gran deleción (L) que se extiende desde nt 27871 hasta 30748). La numeración de los nucleótidos a lo largo de la especificación se realiza según la publicación Chroboczek y otros (Virology 186 (1992), 280-285) (o ATCC M73260). Todos contienen el ADNc del CFTR humano transcrito a partir del promotor de hCMV y finalizado por la señal poli A de \betaglobina, insertado en lugar de la región E1. Los siguientes vectores difieren en el tamaño de la deleción de E4. Aunque todos utilizan el promotor viral de E4 para conducir la expresión de la región E4 o de la(s) ORF(s) de E4 individual(es). Se construyen como plásmidos infecciosos mediante recombinación homóloga en E. coli, tal como se describe en las anteriores publicaciones Chartier y otros, (1997), y Lusky y otros, (1998). Los virus se generan en líneas celulares de complementación de E1 (293) o de E1 y E4 (TG5606) según sus deficiencias. Los vectores que contienen la región E4 completa y la ORF6/7 de E4 no requieren complementación de las funciones de E4. Además, en todos los vectores se utiliza el sitio poliA endógeno.

El AdTG6421 contiene las ORFs 6+7 de E4 (es decir, una secuencia que contiene la ORF6 y la ORF7 susceptible de producir los correspondientes polinucleótidos y el producto de corte y empalme ORF6/7). Se suprimió la secuencia entre los sitios de restricción BglII (nt 34112) y AvrII (nt 35461) y los extremos se nivelaron y ligaron.

El AdTG6447 contiene las ORFs 1 a 4 y se le han suprimido las ORFs 6 y 7. Esto se realizó suprimiendo las secuencias virales nt 32827 a 33985 entre el sitio MunI (nt 32822) y el sitio AccI (nt 33984). A continuación los sitios se nivelaron y ligaron.

El AdTG6449 contiene las ORFs 3 y 4 de E4. Se obtiene a partir del AdTG6447 en el que se han suprimido además las secuencias ORFs 1 y 2 que se extienden entre nt 34799 y 35503 mediante el corte de restricción con PvuII (nt 34796) y Eco47-3 (35501) y religación.

El AdTG6477 proviene del AdTG6449 y tiene la ORF4 inactivada mediante una deleción parcial entre los sitios TthI (nt 34064) y NarI (nt 34189). Por lo tanto, este vector contiene la ORF3 de E4.

El AdTG6487 proviene del AdTG6447 mediante la deleción de las secuencias que se extienden entre nt 34632 y 35503, entre los sitios SspI y Eco47-3. Por lo tanto, este vector contiene la ORF4 de E4.

El AdTG6490 contiene dos deleciones separadas. En primer lugar se suprimen las ORFs 1 y 2 que se extienden desde nt 34799 hasta 35503, entre los sitios PvuII (nt 34796) y Eco47-3 (35501). Además, se inactiva la ORF4 mediante la deleción de las secuencias nt 34069 a 34190, entre TthI (nt 34064) y NarI (nt 34189). Por lo tanto, este vector contiene las ORFs 3, 6 + 7. Se debe indicar que a la ORF6 de E4 le falta el primer ATG (nt 34074). Debido a que el vector se puede amplificar en células 293 en ausencia de complementación de E4, se puede considerar que la traducción empieza en el segundo ATG (nt 34047) y que el producto resultante es funcional.

El AdTG6418 es un control positivo que tiene todas las características descritas anteriormente y que contiene la región E4 salvaje (E4+). El AdTG5643 es el control negativo que contiene una gran deleción en la región E4 (E4º). Esta deleción de E4 es idéntica a la deleción H2dl808 en el Ad2 (publicación Challberg y Ketner, Virology 114 (1981), 196-209) que elimina la mayoría de las secuencias codificantes de E4 con la excepción de la ORF1 (publicación anterior Lusky y otros (1998)).

Las partículas virales se recuperan, se purifican y se valoran tal como se describe en la anterior publicación Lusky y otros (1998). El AdTG6418 se produjo en células 293 mientras que los otros se produjeron en células 293-E4 (TG5606). Los datos de la valoración se muestran en la siguiente Tabla 1, que también resume las características del esqueleto del vector.

TABLA 1

Virus	deleción de E3	región E4	título en IU/ml
6418	S	tipo salvaje (E4+)	1 x 10^{11}
5643	S	E4º (ORF1+)	2 x 10^{11}
6421	L	ORF 6+7	2,3 x 10^{11}
6447	S	ORF 1-4	2 x 10^{11}
6449	S	ORF 3 y 4	2,2 x 10^{11}
6477	S	ORF 3	1,3 x 10^{11}
6487	S	ORF 4	1 x 10^{11}
6490	S	ORF 3, 6 + 7	3,8 x 10^{11}

Los resultados indican que una deleción en la región E4 no perjudica la replicación viral, tal como se observa con los valores similares de la valoración, mientras se proporcione la complementación adecuada. Además, la deleción de todas las ORFs de E4 excepto las ORFs 3, 6 y 7 tiene un efecto beneficioso, permitiendo que se produzcan más virus infecciosos.

Estudios anteriores indicaron que los vectores Ad que contenían las ORFs 3, o 6, o 6+7 de E4 mantenían la capacidad de propagación en ausencia de complementación de E4 (publicación Huang y Hearing, 1989, J. Virol. 63, 2605-2615). Por lo tanto, para determinar la funcionalidad de ORFs de E4 individuales o combinaciones de las mismas en los vectores, se controló la replicación de estos vectores en ausencia de complementación de E4 (células 293) o en presencia de complementación de E4 (células TG5606). Consecuente con los datos de Huang y Hearing, los vectores que contenían la ORF 6+7 de E4 (AdTG6421) o las ORFs 3, 6 + 7 de E4 (AdTG6490) eran capaces de propagarse con un elevado rendimiento en las células 293, con un rendimiento similar al obtenido con el vector que contenía la región E4 salvaje (AdTG6418). En este contexto, se debe indicar que en el vector AdTG6421 la traducción de las proteínas de la ORF6 de E4 y de la ORF6/7 de E4 puede empezar en el primer ATG presente en la pauta traduccional de la ORF6. Por el contrario, en el vector AdTG6490 se ha suprimido el primer ATG de la ORF6 de E4 y de la ORF6/7 de E4 en el transcurso de la construcción de este vector. Por lo tanto, la traducción de las ORFs 6 y 6/7 de E4 debe utilizar el segundo ATG (aminoácido 10) en la pauta traduccional de la ORF6. Debido a que este vector (AdTG6490) se puede propagar hasta unos niveles elevados en células 293, estos datos indican que los primeros nueve aminoácidos N-terminales de las proteínas de la ORF 6 y 6/7 de E4 son prescindibles, como mínimo para la replicación viral.

Los vectores que contenían las ORFs 1-4 de E4 (AdTG6447) y las ORFs 3 + 4 de E4 (AdTG6449) también eran capaces de propagarse en ausencia de complementación de E4, aunque con unos niveles reducidos (disminución de 100 veces comparado con el vector E4 salvaje). La replicación del vector que contenía únicamente la ORF3 (AdTG6477) fue apreciable en las células 293, aunque el rendimiento viral se encontraba reducido en aproximadamente 1000 veces si se compara con el del vector E4 salvaje. Por lo tanto, la replicación de los vectores AdTG6447, AdTG6449 y AdTG6477 confirmó la funcionalidad de la ORF 3 en estas construcciones. Tal como se ha descrito con anterioridad (publicación anterior Lusky y otros, 1998), los vectores que contenían la ORF4 de E4 (AdTG6487) o la ORF1 (AdTG5643) eran incapaces de propagarse en células 293. Sin embargo, todos los vectores eran capaces de propagarse hasta elevados títulos en presencia de complementación de E4.

Ejemplo 2 Expresión de CFTR A. Efecto de la función de E4 en la activación del promotor de CMV

Se utilizaron vectores E1º (AdTG6418) y E1º E4º (AdTG5643) para infectar in vitro células A549 humanas de no complementación a una moi de 100 IU/célula. Se extrajo el ARN celular total de las células infectadas a las 72 h p.i. y se analizó para determinar el nivel de ARNm de CFTR en el estado estacionario utilizando una sonda específica de CF. Los resultados mostraron una fuerte expresión de CFTR a partir del vector E1º. Por el contrario, no se pudo detectar expresión de CFTR a partir del vector E1ºE4º. Estos datos indican que la región E4 viral puede influir en la transcripción desde el promotor de CMV utilizado para conducir la expresión de CFTR. Sin embargo, se restituyen unos elevados niveles en el estado estacionario mediante coinfección con vectores sin CFTR que contienen la región E4 salvaje o las ORF1-4 de la región E4, lo que indica que determinados productos de los genes de E4 pueden activar la expresión del transgen conducida por CMV. Se obtuvieron unos resultados similares utilizando el promotor del RSV. En ausencia de la región E4, la expresión del transgen conducida por RSV se paró, y ésta se pudo restituir mediante el suministro de la región E4 en trans.

B. Expresión del transgen en ratones inmunodeficientes

Los vectores AdE1º y E1º E4º se inyectaron por vía intratraqueal (IT) en ratones Scid (dosis viral 1,5 x 10^{9} IU / animal). Para el vector E1º, se controló la persistencia de los genomas virales y del ARNm de CFTR hasta 100 días p.i. El ADN viral se detectó mediante análisis de transferencia de tipo Southern con un fragmento de restricción adenoviral radioactivo. A continuación se cuantificó la señal mediante una exploración densitométrica de las autorradiografías (densitómetro de imágenes GS-700; Bio-Rad). Se evaluó el nivel de ARNm de CFTR en el estado estacionario del mismo modo que se ha descrito anteriormente.

Aunque la cantidad de genomas de AdE1º disminuía de forma constante con el tiempo hasta menos de un 10% de los valores iniciales, de forma sorprendente se mantuvo e indujo la elevada expresión inicial de CFTR a partir del promotor de CMV durante un periodo de 100 días, a pesar de la disminución de genomas virales. Por lo tanto, con los vectores que contenían la región E4 los genomas virales disminuían de forma activa, aunque la expresión del transgen permanecía constante e incluso parecía que se activaba con el tiempo.

Se realizó un análisis similar para el vector AdE1ºE4º correspondiente. Se produjo la disminución del genoma viral virtualmente de forma idéntica a la observada con el vector E1º. Si bien la expresión del transgen conducida por CMV a los 3 días p.i. era muy similar a la observada con el vector E1º, a los 14 días p.i. la expresión del transgen a partir del vector E1ºE4º se paró de forma abrupta. Debido a que la persistencia y desaparición de los genomas virales es virtualmente idéntica para los vectores E1º y E1ºE4º, los datos de expresión indican que el potencial del casete de expresión de CMV estaba aumentado en presencia de la región E4.

Para analizar este hecho, se coinyectó el vector de CFTR E1º E4º con un vector sin CFTR E1º con las ORF1-4 de E4 (AdTG4680). Los resultados muestran que la presencia de las ORF1-4 de E4 en trans permitía una expresión del transgen CFTR elevada y estable. En un segundo experimento, se reinyectaron ratones Scid, inyectados con un vector de CFTR AdE1ºE4º, con AdTG4680 en el día 45 p.i., produciendo un rescate de la expresión del transgen conducida por CMV durante 14 días. Estos resultados indican que el promotor de CMV no estaba silenciado de forma irreversible.

C. Expresión del transgen en ratones inmunocompetentes

La persistencia del genoma viral y la expresión del transgen CFTR también se controló y se comparó en ratones inmunocompetentes en los que se había inyectado AdTG6418 (E1º) o AdTG5643 (E1º E4º) que contenían el casete de expresión CMV-CFTR. En ratones C57Bl/6 la cinética de desaparición de ADN fue muy similar para los dos tipos de vectores, reduciéndose el número de copias de genomas virales a menos del 10% de los valores iniciales en 14 días p.i. En ratones CBA, el genoma del vector AdE1ºE4º disminuyó con una cinética similar. Por el contrario, el genoma del vector AdE1º disminuyó a menos del 1% de los valores iniciales en 14 días p.i.

La expresión del transgen a partir del vector AdE1º E4º en ratones C57bl/6 y CBA no era estable, y no se pudo detectar a los 14 días p.i. De forma sorprendente, únicamente en ratones CBA se paró la expresión del transgen a partir del vector AdE1º a los 14 días p.i. Sin embargo, en ratones C57Bl/6, la expresión de CFTR a partir del vector AdE1º todavía se observaba después de 120 días p.i. Estos resultados sostienen la idea de que los ratones C57Bl6 son de algún modo tolerantes para el transgen. Además, el mantenimiento de la expresión del transgen CFTR en AdE1º también podría estar influenciado por las funciones activantes de la transcripción de E4.

D. Análisis funcional de la región E4 viral

Para estudiar en más detalle la activación transcripcional de la región E4 viral, se evaluaron in vitro e in vivo vectores que contenían ORFs de E4 individuales y combinaciones de las mismas en ratones Scid del mismo modo que se ha descrito anteriormente.

Después de la transducción de células A549 se detectó ADN viral en todas las muestras, indicando que las deleciones en la región E4 no alteran la persistencia del ADN in vitro. Sin embargo, el nivel de ARNm de CFTR en el estado estacionario variaba de manera espectacular según las diferentes muestras. Tal como se esperaba, se observó una fuerte señal con el control positivo AdTG6418 (E1ºE4+), mientras que una deleción de la región E4 (AdTG5643) tenía como resultado una parada completa de la expresión de CFTR. La presencia de la ORF3 (AdTG6477), la ORF4 (AdTG6487) o la ORF6+7 (AdTG6421) restituía parcialmente la expresión del transgen. Sin embargo, el nivel de ARNm de CFTR permanecía muy bajo comparado con el obtenido con el control positivo (E4 salvaje). La presencia de las ORFs 3 y 4 (AdTG6449) casi restituía completamente la actividad del promotor de CMV, como lo hacía la presencia de las ORFs 1 a 4 (Ad TG6447). Sin embargo, en presencia de las ORFs3, 6+7 (AdTG6490) la actividad del promotor de CMV incluso se encuentra mejorada si se compara con la del tipo salvaje.

Los experimentos muestran que, en presencia de la región E4 viral, la expresión del transgen en el pulmón (I.T.) era estable hasta 100 días. Por el contrario, la deleción de la región E4 viral tenía como resultado una parada completa de la expresión del gen entre 3 días y 14 días p.i. En un sistema en el que estaba presente un AdE1º E4º se podía activar la expresión del transgen en trans mediante las ORFs 1-4 de E4 virales. Además, en ratones que contenían el vector AdE1ºE4º-CFTR se podía rescatar la expresión del transgen mediante la inyección de un vector AdE1º que contenía las ORF 1-4 de E4 45 días después de la inyección inicial. Este resultado indica que el promotor de CMV no estaba silenciado irreversiblemente y que el (los) producto(s) de los genes de E4 regula(n) de forma positiva el promotor de CMV. Los datos con ORF(s) de E4 individuales indican que las funciones de transactivación se mantienen en vectores que contienen la ORF3 de la región E4 más la ORF4 o la ORF3 más la ORF6+7.

E. Expresión específica de tejido

Para controlar el efecto de las modificaciones en E4 sobre la activación y el mantenimiento de la expresión del transgen in vivo, sin ninguna interferencia con las respuestas inmunes del huésped, se administraron 1,5x10^{9} viriones de cada construcción (que contenían E4 salvaje, ORFs 1-4, ORFs 3 y 4, ORFS 3, 6 y 7, ORF 3 o sólo ORF 1) mediante inyecciones por vía intratraqueal (I.T.) e intravenosa (I.V.) en ratones Scid inmunodeficientes. Se controló la persistencia del vector y la expresión del transgen con el tiempo (3, 14, 45 y 83 días en tejido pulmonar y 3, 14 y 30 días en tejido hepático) en los pulmones y los hígados de los animales infectados mediante análisis de transferencia de tipo Southern y mediante análisis de transferencia de tipo Northern del CFTR, respectivamente.

En los pulmones, la desaparición del vector era similar para todos los vectores y se producía a una velocidad similar, con la excepción de los vectores que contenían la ORF 3 de E4 (AdTG6477) y las ORFs 3, 6+7 de E4 (AdTG6490), que eran más estables con el tiempo. Todos los vectores expresaban el transgen inicialmente (día 3 p.i.) con unos niveles elevados y comparables. Sin embargo, tal como se observó con el vector con doble deleción AdE1ºE4º, la expresión de CFTR se paró entre el día 3 y el día 14 p.i. en los vectores que contenían la ORF3 de E4 (AdTG6477), la ORF4 de E4 (AdTG6487) y las ORFs 6+7 de E4 (AdTG6421). Por el contrario, la expresión de CFTR persistía, aunque con unos niveles diferentes, en los vectores que contenían las ORFs 1-4 de E4 (AdTG6447), las ORFs 3+4 de E4 (AdTG6449) y en el vector que contenía las ORFs 3, 6+7 de E4 (AdTG6490) a lo largo de un periodo de 83 días (la duración del experimento). Interesantemente, la expresión del transgen obtenida con el vector AdTG6490 parecía persistir a unos niveles constitutivamente elevados a lo largo del tiempo controlado y los niveles de ARNm de CFTR en el estado estacionario eran incluso mayores que los obtenidos con el vector E4 salvaje (AdTG6418). Por el contrario, la expresión del transgen a partir de los vectores que contenían las ORF1-4 de E4 (AdTG6447) y las ORF3,4 de E4 (AdTG6449), aunque persistente, no se producía a niveles constitutivamente elevados. Con estos vectores la expresión del transgen se reducía en el día 14 p.i., seguido de una inducción en el día 45, antes de que se redujese de nuevo en el día 83 p.i.

En ratones C57Bl/6 inmunocompetentes se observó un patrón de mantenimiento de la expresión del CFTR similar.

De forma sorprendente, en el hígado, la ORF3 de E4 por si sola era suficiente para promover la expresión persistente y estable del transgen. Las combinaciones de las ORF3+4 de E4 o de las ORF3,6+7 también permitían una expresión del gen persistente. El descubrimiento de que la ORF3 de E4 por si sola podía rescatar la expresión del transgen en el hígado y no en el pulmón indicó que factores específicos de célula o de tejido debían cooperar con las funciones de E4 para regular la expresión génica a partir del promotor de CMV. Considerándolos en conjunto, los resultados confirman la idea de que el estado de la región E4 de Ad regula la expresión de los promotores heterólogos, tal como el promotor de CMV, probablemente mediante un/unos mecanismo(s) de transactivación. Además, los datos indican que la influencia de la región E4 es compleja. La ORF3 de E4 claramente es necesaria para la regulación del promotor de CMV. En el hígado, la función de la ORF3 de E4 por si sola es suficiente para promover una expresión génica persistente. Además, el efecto de la ORF 3 se encontraba aumentado en presencia de la ORF4 o de las ORFs 6+7. La restitución de la expresión del transgen en los pulmones, después de la administración I.T., únicamente se obtenía con la combinación ORF3 + ORF4 de E4 o con las ORFs3, 6+7 de E4. Se han obtenido unos resultados similares en un segundo experimento en el que se controló la persistencia del vector y la expresión del transgen durante 3, 21, 45 y 90 días en el hígado.

Ejemplo 3 Influencia de los productos de los genes de E4 - Ad5 en la expresión de los genes virales tardíos

Para controlar el efecto de los productos de los genes de E4 en la expresión de los genes virales tardíos, se infectaron vectores AdE1º que contenían ORFs de E4 individuales o combinaciones de las mismas en células A549 a una moi de 1000 IU/célula. Se infectaron de forma similar AdE1ºE4 salvaje y Ad5 como controles. 72 horas después de la infección se preparó el ARN mensajero total de las células infectadas y se sometió a análisis de transferencia de tipo Northern; se utilizó una sonda de ADN específica para ARNm de hexona para detectar el ARNm de hexona viral representativo de la expresión de genes virales tardíos. En la Tabla 2 se resumen los resultados.

TABLA 2 Expresión de genes virales tardíos y expresión del transgen (CMV-CFTR) en vectores Ad modificados en E4

vector	ARNm de hexona	expresión del transgen
Ad5 salvaje	+++++	ND
Ad5E1ºE4 salvaje	++	+++++
Ad5E1ºE4º	-	-
Ad5E1ºORF1-4	++	+++
Ad5E1ºORF3,4	++	+++
Ad5E1ºORF3	+	++
Ad5E1ºORF4	-	-
Ad5E1ºORF6+7	+	-
Ad5E1ºORF3,6+7	+/-	+++++

Estos resultados demuestran que la deleción de toda la región E4 tiene como resultado una eliminación de la expresión de los genes virales tardíos. Los vectores que contenían las ORFs 1-4 de E4 o las ORFs 3,4 de E4 tenían unos niveles de expresión de genes virales tardíos similares a los del Ad5E1ºE4 salvaje. La expresión de genes virales tardíos estaba disminuida en presencia de la ORF3 o de las ORFs6+7. Interesantemente, la combinación de la ORF3 de E4 con las ORFs6+7 (Ad5E1ºORF3,6+7) tuvo como resultado una reducción más notable en la expresión de los genes virales tardíos. Importantemente, la combinación de las ORFs3,6+7 de E4 mostró el mayor nivel y mantenimiento de la expresión del transgen in vitro e in vivo.

Esto muestra que este vector, Ad5E1º, que contiene las ORFs3,6+7 de E4, combina características importantes en lo que se refiere a aplicaciones terapéuticas: elevados niveles de expresión del transgen y mantenimiento de dicha expresión junto con niveles extremadamente bajos de expresión de antígenos virales y por lo tanto un riesgo bajo de inmunogenicidad en el huésped.

Ejemplo 4 Hepatotoxicidad de vectores adenovirales A. Hepatotoxicidad de vectores adenovirales en los que se ha suprimido E1

Se evaluó la hepatotoxicidad de construcciones adenovirales en las que se ha suprimido E1 en ratones Balb/c y C57BL/6 después de la administración intravenosa de 1,2x10^{11} partículas virales producidas a partir de vectores vacíos (sin transgen). El análisis patológico de secciones de hígado mostró varios daños en las células del hígado, tales como hinchamiento hepatocelular, contracción, degeneración acidofílica, apoptosis y mitonecrosis. No se observó necrosis confluente. Los canalículos portales eran normales. Las lesiones eran difusas, sin una localización dominante precisa. Además de los daños en el hígado, varios tractos portales se encontraban dilatados por una infiltración linfocítica. Algunos focos de células mononucleares estaban distribuidas cerca de las paredes de las venas porta y centrolobular. En algunos experimentos el daño hepático era evidente en tan sólo 4 días y fue empeorando hasta los 21-30 días.

Además, la administración intravenosa de vectores adenovirales en los que se ha suprimido E1 inducía unos elevados niveles de transaminasas en suero (GOT, GPT), comparados con los niveles de control. En algunos experimentos, el aumento de transaminasas se podía observar en tan sólo 4-5 días después de la inyección. Habitualmente el máximo se obtiene entre 14 y 21 días después de la inyección y es más pronunciado en la GPT que en la GOT. La GPT es un marcador sensible de daño hepatocelular y necrosis del hígado, mientras que la GOT se encuentra elevada durante el infarto de miocardio. Los valores de transaminasas obtenidos con vectores E1- confirmaron los daños hepáticos observados mediante el análisis patológico.

B. Hepatotoxicidad de vectores adenovirales en los que se ha suprimido E4

El propósito de este estudio consiste en comparar la toxicidad de vectores adenovirales vacíos en los que se han suprimido E1 y E4 con otros en los que sólo se ha suprimido E1. El experimento se realizó en las mismas condiciones experimentales que las descritas anteriormente. El análisis anatomopatológico de secciones de hígado obtenidos de ratones inyectados con 1,2x10^{11} partículas E1-E4- muestra una toxicidad en el hígado reducida. Ocasionalmente se observaron lesiones distróficas, aunque se encontraban claramente reducidas si se comparaban con los vectores adenovirales en los que se ha suprimido E1. Interesantemente se observaron algunas infiltraciones linfocíticas, aunque sin inducir ninguna lesión distrófica.

Además, la concentración de transaminasas GOT y GPT medida en el suero de ratones inyectados con vectores vacíos en los que se ha suprimido E1 y E4 era equivalente a los niveles de referencia (controles). Estos resultados confirmaron las observaciones patológicas que indicaban que se producían menos daños en el hígado cuando se eliminaba la región E4 del esqueleto adenoviral.

Como consecuencia, a diferencia de sus equivalentes en los que se ha suprimido la región E1, los vectores Ad en los que se ha suprimido E1/E4 provocaban de forma reproducible una respuesta inflamatoria y tóxica mucho menor, sugiriendo que los propios productos de los genes de E4 están implicados en la inducción de respuestas inflamatorias.

C. Papel de las ORFs de E4 individuales en la toxicidad de vectores adenovirales

En un esfuerzo para entender el papel de los productos de los genes de E4 en la toxicidad de los vectores adenovirales, se diseñaron y produjeron una serie de vectores vacíos e isogénicos que presentaban ORFs individuales de la región E4, o combinaciones de las mismas. Estos vectores difieren de los descritos en el Ejemplo 1 únicamente en la ausencia del casete de expresión de CFTR para eliminar la interferencia del transgen en las respuestas inmune e inflamatoria del huésped. Se inyectaron por vía intravenosa 2x10^{11} partículas de estas construcciones en ratones CBA para evaluar su toxicidad en el hígado. En la Tabla 3 se resumen los resultados del análisis patológico de las secciones de hígado.

TABLA 3 Patología en el hígado después de la inyección intravenosa de vectores adenovirales vacíos modificados en E4 (2 ratones por grupo y por punto de tiempo)

E4	Día 4 p.i.	Día 21 p.i.
	Distrofia	Inflamación	Distrofia	Inflamación
E4 salvaje	+	+	++	++
sin E4	-	+/-	+/-	+/-
ORF6+7	-	+/-	+/-	+/- a +
ORF3,4	-	+/-	+/-	+/-
ORF3	-	+/-	-	+/-
ORF4	-	-	+/-	+/- a +
ORF3, 6+7	-	-	++ a +++	+ a ++
- representa no patología mientras que +++ representa muchas lesiones y/o inflamación

Tal como se ha mostrado anteriormente, los vectores en los que se ha suprimido E1 (con una región E4 salvaje) inducían distrofia e inflamación en tan sólo 4 días después de la inyección y la toxicidad fue aumentando hasta los 21 días después de la inyección. La deleción de toda la región E4 reducía de manera espectacular esta toxicidad. Con la excepción del vector que contenía las ORF3, 6+7, los vectores que contenían ORFs de E4 individuales y los vectores que contenían las combinaciones ORF6+7 y ORF3,4 mostraban una toxicidad y una inflamación reducidas, comparable a los vectores adenovirales en los que se ha suprimido la región E4. Por el contrario, el vector que contenía las ORF3,6+7 de E4 inducía inflamación y distrofia hepática del mismo modo que un vector adenoviral que conserva la región E4 salvaje.

Estos resultados se completaron con la determinación de la GOT y la GPT 4 y 21 días después de la infección. Tal como se ha mencionado anteriormente, la inyección de viriones que expresaban los productos de los genes de E4 salvaje inducía unos niveles de transaminasas elevados 21 días p.i., mostrando su toxicidad en células hepáticas. Se observa una inducción similar, aunque ligeramente menos pronunciada, con los vectores E1- que contienen la ORF4 de E4 sola así como la combinación de la ORF3 de E4 con 6+7. Por el contrario, las concentraciones de transaminasas obtenidas con los adenovirus que contienen sólo la ORF3 o las ORFs3,4 se encuentran en el mismo rango que las medidas con los controles y los vectores E1-/E4-, con lo que se puede decir que no son tóxicos para las células hepáticas. Los vectores que conservan sólo la ORF6+7 muestran una concentración en suero de GOT y GPT ligeramente aumentada.

Para verificar si el estado tóxico o no tóxico era consecuencia de una menor entrada de virus inyectados, se determinó la persistencia del ADN viral en el hígado mediante análisis de transferencia de tipo Southern. Se observaron cantidades similares de ADN viral para todos los vectores, lo que sugería que la elevada toxicidad observada con los vectores que conservaban la E4 salvaje, la ORF3,6+7 de E4 o la ORF4 de E4, es un efecto de algunos productos de los genes de E4.

En conclusión, el estudio de la región E4 y la evaluación de los vectores modificados en E4 para determinar el mantenimiento de la expresión del transgen en pulmón e hígado, así como su hepatotoxicidad, tuvo como resultado algunos resultados inesperados:

-: La combinación de la ORF3 de E4 con la ORF4 de E4 o la ORF6 + 7 de E4 permitía el mantenimiento de la expresión del transgen en el pulmón. Sin embargo, el perfil de expresión del transgen era cuantitativa y cualitativamente diferente con las distintas combinaciones. La expresión del transgen en presencia de las ORFs 3, 6+7 de E4 era constitutiva e incluso se producía a niveles más elevados que en presencia de la región E4 salvaje. Por el contrario, la expresión del transgen en presencia de las ORFs 3 y 4 de E4, aunque era persistente, disminuía y se inducía de forma periódica. Interesantemente, los vectores con las ORFs3,4 de E4 inducían una baja hepatotoxicidad.

-: En el hígado, la presencia de la ORF3 de E4 era suficiente para regular la expresión del gen CFTR a partir del promotor de CMV. De forma similar, la combinación de las ORF3,4 de E4 o de las ORF3,6+7 de E4 permitía una expresión del transgen persistente. Además, los vectores que contienen la ORF3 de E4 o las ORF3,4 de E4 muestran un nivel muy bajo de inflamación y toxicidad en el hígado. Debido a que estos vectores combinan una expresión del transgen persistente con una baja toxicidad, pueden ser útiles para aplicaciones en protocolos de terapia génica específica del hígado.

Claims

1. Vector recombinante que comprende un gen de interés unido de forma operable a elementos reguladores, en el que dicho vector comprende una combinación de pautas de lectura abierta de E4 que consiste en:

(i) ORF3, ORF6 y ORF7; o (ii) ORF3 y ORF4; o (iii) ORF1, ORF2, ORF3, ORF4,

2. Vector, según la reivindicación 1, en el que dicho promotor es un promotor de MUC-1, CEA, tirosinasa, ERB-2 o gen de \alpha-fetoproteína.

3. Vector, según la reivindicación 1 ó 2, que es un vector adenoviral recombinante que proviene de un genoma de adenovirus.

4. Vector, según la reivindicación 3, en el que dicho vector adenoviral recombinante proviene de un genoma de adenovirus en el que toda o parte de la región E1 se ha suprimido o no es funcional, toda la región E3 se ha suprimido y una parte de la región E4 se ha suprimido, y en el que las secuencias de E4 que se han conservado son una combinación de pautas de lectura abierta de E4 que consiste en:

(i) ORF3, ORF6 y ORF7; o (ii) ORF3 y ORF4; o (iii) ORF1, ORF2, ORF3 y ORF4.

5. Vector, según la reivindicación 4, en el que toda o parte de la región E2 y/o de las regiones L1-L5 de dicho genoma de adenovirus se ha suprimido o no es funcional.

6. Vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas secuencias de E4 conservadas están unidas de forma operable a un promotor homólogo de E4.

7. Vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas secuencias de E4 conservadas están unidas de forma operable a un promotor heterólogo.

8. Vector, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que dicho genoma de adenovirus es de origen humano, canino, aviar, bovino, múrido, ovino, felino, porcino o simio, o, alternativamente, es un híbrido de los mismos.

9. Vector, según la reivindicación 8, en el que dicho vector proviene del adenovirus humano 5 (Ad5) o 2 (Ad2).

10. Vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho gen de interés se selecciona del grupo que consiste en los genes que codifican para una citoquina, un receptor nuclear o celular, un ligando, un factor de coagulación, la proteína CFTR, la insulina, la distrofina, un factor de crecimiento, un enzima, un inhibidor enzimático, un inductor de apoptosis, un inhibidor de apoptosis, un agente citoestático, una apolipoproteína, un neutralizador de radicales oxígeno, un polipéptido que tiene un efecto antitumoral, un polipéptido capaz de inhibir una infección bacteriana, parasitaria o viral, un anticuerpo, una toxina, una inmunotoxina y un marcador.

11. Compuesto farmacéutico que comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Partícula vírica infecciosa que comprende el vector adenovírico recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10.

13. Método para preparar una partícula viral adenoviral infecciosa, según la reivindicación 12, según el cual:

(i): el vector adenoviral recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, se introduce en una célula de complementación capaz de complementar en trans dicho vector adenoviral, para obtener una célula de complementación transfectada;

(ii): dicha célula de complementación transfectada se cultiva en condiciones adecuadas para permitir la producción de dicha partícula viral adenoviral infecciosa; y

(iii): dicha partícula viral adenoviral infecciosa se recupera del cultivo celular.

\newpage

14. Célula huésped que comprende el vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o que está infectada por una partícula viral infecciosa, según la reivindicación 12.

15. Composición que comprende el vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, una partícula viral infecciosa, según la reivindicación 12, o una célula huésped según la reivindicación 14.

16. Uso de un vector, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, de una partícula viral infecciosa, según la reivindicación 12, o de una célula huésped, según la reivindicación 14, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la transferencia génica.

17. Uso, según la reivindicación 16, en el que en dicho vector las secuencias de E4 conservadas son una combinación de pautas de lectura abierta de E4 que consiste en:

(i) ORF 3 y ORF4; o (ii) ORF 3, ORF6 y ORF7;

y en el que dicha composición farmacéutica es para la transferencia génica en tejido pulmonar.

18. Uso, según la reivindicación 16, en el que en dicho vector las secuencias de E4 conservadas son una combinación de pautas de lectura abierta de E4 que consiste en:

(i) ORF 3 y ORF4; o (ii) ORF 3, ORF6 y ORF7;

y en el que dicha composición farmacéutica es para la transferencia génica en tejido de hígado.