ES2232950T3 - Vectores adenoviricos recombinantes que comprenden una secuencia de empalme. - Google Patents
Vectores adenoviricos recombinantes que comprenden una secuencia de empalme.Info
- Publication number
- ES2232950T3 ES2232950T3 ES98928412T ES98928412T ES2232950T3 ES 2232950 T3 ES2232950 T3 ES 2232950T3 ES 98928412 T ES98928412 T ES 98928412T ES 98928412 T ES98928412 T ES 98928412T ES 2232950 T3 ES2232950 T3 ES 2232950T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- adenoviral vector
- gene
- sequence
- vector according
- interest
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Signal Processing For Digital Recording And Reproducing (AREA)
- Tyre Moulding (AREA)
- Image Processing (AREA)
- Optical Fibers, Optical Fiber Cores, And Optical Fiber Bundles (AREA)
- Communication Control (AREA)
Abstract
La invención se refiere a un vector adenoviral recombinante que se dirige desde un genoma de adenovirus mediante borrado de toda o parte de la región E1, dicho vector adenoviral comprende una expresión cassette de un gen de interés colocado bajo el control de elementos necesarios para su expresión en una célula huésped o en un organismo huésped, dichos elementos necesarios para sus expresiones incluyen al menos una secuencia de empalme. La invención se caracteriza porque dicha secuencia de empalme se deriva de un gen nuclear eucaríotico seleccionado de entre genes ovalbumen, {al} o {be}globina, colágeno y factor VIII de mamíferos o una secuencia de empalme sintética.- La invención también se refiere a células huésped y a una partícula viral infecciosa que incluye a este vector, un procedimiento para la preparación de estas partículas y su empleo terapéutico o profiláctico. La invención además se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen este vector adenoviral, dichas células huésped o dicha partícula viral.
Description
Vectores adenovíricos recombinantes que
comprenden una secuencia de empalme.
La presente invención se refiere a vectores
adenovíricos que comprenden un casete de expresión de un gen de
interés puesto bajo control de los elementos necesarios para su
expresión, y que contienen secuencias de empalme. Su presencia
permite aumentar sensiblemente la expresión del gen terapéutico en
una célula o un organismo huésped. La invención tiene igualmente
por objeto las células y partículas víricas infecciosas que
contienen estos nuevos vectores, así como un método para
prepararlos. La invención presenta un interés particular para una
futura terapia génica, especialmente en el ser humano.
La terapia génica se define como la transferencia
de información genética en una célula o un organismo huésped. El
primer protocolo aplicado al ser humano se inició en los Estados
Unidos, en septiembre de 1990, en un paciente genéticamente
inmunodeficiente debido a una mutación que afecta al gen que
codifica la adenina desaminasa (ADA). El éxito relativo de esta
primera experimentación ha animado al desarrollo de esta tecnología
para diversas enfermedades tanto genéticas (con el objetivo de
corregir el mal funcionamiento de un gen defectuoso) como adquiridas
(enfermedades infecciosas, cánceres, etc.). Hoy en día la mayoría de
los protocolos utilizan vectores retrovíricos para transferir y
expresar el gen terapéutico en las células a tratar. Sin embargo,
además de su capacidad restringida de clonación, presentan dos
inconvenientes importantes que limitan su utilización sistemática:
por un lado, infectan mayoritariamente a células en división y, por
otro lado, por el hecho de su integración al azar en el genoma de la
célula huésped, no es despreciable el riesgo de mutagénesis de
inserción. Por eso, numerosos equipos de científicos se han
empeñado en desarrollar otros tipos de vectores, entre ellos los
adenovirus.
Conocidos en numerosas especies animales, los
adenovirus son pocos patógenos, no son integrables y se replican
tanto en células en división como en células quiescentes. Además,
presentan un amplio espectro de huésped, y son capaces de infectar
a un gran número de tipos celulares, especialmente las células
epiteliales, endoteliales, los miocitos, los hepatocitos, las
células nerviosas y los sinoviocitos. Además, poseen un tropismo
natural por las vías respiratorias. Estas propiedades particulares
hacen de los adenovirus vectores de elección para numerosas
aplicaciones terapéutica y también en vacunas.
De manera general, el genoma adenovírico está
constituido de una molécula de ADN lineal y bicatenaria, y de
aproximadamente 36 Kb, que contiene más de 30 genes que codifican
las proteínas víricas, y en sus extremos dos repeticiones invertidas
(denominadas ITR por Inverted Terminal Repeat en inglés) y la
región de encapsidamiento. Los genes precoces se reparten en 4
regiones dispersas en el genoma (E1 a E4; E por Early, que
significa precoz en inglés) que contienen 6 unidades
transcripcionales provistas de su propio promotor. Los genes
tardíos (L1 a L5; L por Late, que significa tardío en inglés), que
codifican las proteínas de estructura, recubren en parte las
unidades de transcripción precoces y son, en su mayoría,
transcritos a partir del promotor principal tardío MLP (por Major
Late Promotor en inglés) (véase Figura 1).
Los vectores adenovíricos actualmente utilizados
en los protocolos de terapia génica son vectores denominados de
primera generación, desprovistos de la mayor parte de la región E1
esencial para la replicación, a fin de evitar su diseminación en el
entorno y en el organismo huésped. La supresión de la región E3 no
esencial permite aumentar su capacidad de clonación. Los genes de
interés se introducen en el ADN vírico en el sitio de una u otra de
las regiones suprimidas. Estos virus defectuosos para la
replicación se pueden propagar en una línea celular que complementa
la función E1. Se utiliza corrientemente la línea 293, establecida
a partir de células de riñón embrionario humano (Graham et
al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72). La
supresión de la región E3 no esencial no necesita complementación
particular. Si la factibilidad de la transferencia de los genes,
utilizando estos vectores de primera generación, está ahora bien
establecida, la cuestión de su inocuidad queda abierta. Además de
los aspectos de seguridad (riesgo de generar partículas competentes
para la replicación), se plantea el problema de su toxicidad. En
efecto, los primeros ensayos clínicos han puesto en evidencia la
inducción de respuestas inflamatorias debidas a la expresión de los
genes víricos en el huésped, oponiéndose a la persistencia de las
células transducidas y a la expresión del transgén. Estos
inconvenientes, unidos a la estimulación del sistema inmunitario
del huésped mediante los epítopos adenovíricos, han justificados la
construcción de virus de nuevas generaciones.
La obtención de un vector adenovírico se basa por
una parte en el esqueleto vírico y, por otra parte, en el casete de
expresión del gen terapéutico asociado a elementos de regulación
que permiten una expresión óptima en la célula huésped. Con respecto
al primer punto, los vectores adenovíricos de segunda generación
conservan las regiones en cis de las ITR y las secuencias de
encapsidamiento, y contienen supresiones internas importantes con
el objeto de suprimir lo esencial de los genes víricos cuya
expresión in vivo no se desea (véase la solicitud
internacional WO94/28152). Su propagación está asegurada mediante
un virus auxiliar o de líneas celulares que complementan las
funciones defectuosas. Por ejemplo, se utilizará una línea derivada
de la 293 y que expresa las secuencias adenovíricas que codifican
las proteínas esenciales de E4 para complementar un vector de
segunda generación cuyo esqueleto genómico se suprime de las
regiones E1, E3 y E4.
En cuanto al casete de expresión, éste comprende
generalmente en 5' una región promotora que dirige la transcripción
del gen situado a continuación y, eventualmente, en dirección 3',
una secuencia de poliadenilación (polyA) que contribuye
especialmente a estabilizar el mensajero transcrito. En algunos
contextos, elementos adicionales pueden mejorar la expresión. Ya se
ha dado a conocer in vitro el efecto positivo de las
secuencias intrónicas sobre la expresión génica (Buchman y Berg,
1988, Mol. Cell. Biol. 8, 4395-4405; Huang y
Gorman, 1990, Nucleic Acid Res. 18, 937-947),
in vivo en los animales transgénicos (Brinster et
al., 1988, Proc Natl. Acad. Sci. USA 85,
836-840), y más recientemente en un contexto de
vector adenovírico de primera generación (Connelly et al.,
1996, Human Gene Therapy 7, 183-195). Este
documento demuestra que los ratones tratados con un adenovirus que
tiene suprimidas las regiones E1 y E3, y que expresa el factor VIII
humano, producen niveles de 3 a 13 veces más elevados de factor VIII
sérico cuando el ADN complementario FVIII contiene secuencias de
empalme.
Se puede también citar la solicitud de patente
internacional publicada con el número WO94/29471, el 22 de
diciembre de 1994, que describe un vector adenovírico recombinante
que contiene un gen de interés que codifica el factor de
coagulación FIX bajo control de un promotor y de una secuencia de
poliadenilación. La adición de una secuencia de empalme homóloga,
que proviene del gen FIX, permite aumentar sustancialmente el nivel
de producción del FIX, esencialmente en presencia de las secuencias
5' y 3' que no codifican este gen.
La presente invención tiene por objeto poner a
disposición del público vectores adenovíricos más eficaces desde el
punto de vista de la expresión del gen terapéutico, permitiendo así
reducir las dosis de vectores y amplificar el efecto terapéutico.
Se ha mostrado ahora que la presencia de secuencias de empalme en el
seno del gen de interés es beneficiosa, incluso indispensable, para
obtener su expresión. Esta observación es particularmente verídica
en un contexto de vector adenovírico de segunda generación en el
que los niveles de expresión de los genes terapéuticos, factor IX
(FIX) canino e interleuquina-2
(IL-2) humana, se amplifican en un factor de 20 a
150 cuando el casete de expresión incluye dichas secuencias de
empalme. Con un vector de primera generación, el factor de
amplificación sigue siendo significativo (2 a 3). Esta mejora
importante de la expresión génica es inesperada y no se podía
deducir de la técnica anterior.
Es por ello que la presente invención tiene por
objeto un vector adenovírico que deriva del genoma de un adenovirus
mediante supresión de al menos toda o parte de la región E1,
comprendiendo dicho vector adenovírico un casete de expresión de un
gen de interés puesto bajo control de los elementos necesarios para
su expresión en una célula huésped o un organismo huésped,
comprendiendo dichos elementos necesarios para la expresión al
menos una secuencia de empalme, caracterizado porque dicha
secuencia de empalme comprende un sitio dador y un sitio receptor de
empalme, y deriva de un gen de \beta-globina, o
de una secuencia de empalme sintética que tiene la secuencia
representada en el identificador de secuencia IDS1.
En el sentido de la presente invención, el
término vector adenovírico designa un adenovirus defectuoso para la
replicación (incapaz de replicación autónoma en una célula huésped)
en ausencia de toda complementación. El vector según la invención se
modifica con relación al adenovirus progenitor al menos en la
región E1 mediante supresión total o parcial de esta última.
Además, según una forma de realización ventajosa, una al menos de
las regiones seleccionadas entre E2, E4, L1, L2, L3, L4 y L5 es no
funcional. La no funcionalidad se puede obtener mediante supresión
total o parcial de una o varias de las regiones concernidas, o por
introducción de una mutación o mutaciones (supresión, adición y/o
sustitución de uno o varios nucleótidos) haciendo al gen adenovírico
mutado defectuoso. Estas modificaciones pueden afectar a las
secuencias que codifican o no al genoma vírico, especialmente a las
regiones promotoras. Para ilustrar estas formas de realización, se
puede citar la mutación termosensible que afecta al gen DBP (por
DNA Binding Protein en inglés, proteína de unión a ADN) de la región
E2A (Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10,
328-339). Una supresión parcial puede consistir en
la eliminación de la región E4 con la excepción de las secuencias
que codifican los cuadros de lectura abiertos (ORF) 6 y 7, que no
necesitan complementación de la función E4 (Ketner et al.,
1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048). Una
supresión total de E4 cubre la unidad transcripcional completa.
Se indica que un vector adenovírico según la
invención conserva las regiones en cis del genoma
adenovírico, es decir, las repeticiones invertidas terminales (ITR)
y la región de encapsidamiento. Su longitud y secuencia nucleotídica
pueden variar de un estereotipo a otro. Sin embargo, se pueden
aislar fácilmente a partir de los datos de la bibliografía. A
título indicativo, los 458 primeros nucleótidos (nt) del genoma del
adenovirus de tipo 5 (Ad5) contienen la ITR 5' y la región de
encapsidamiento, y los 103 últimos nt corresponden a la ITR 3'.
Ventajosamente, el vector adenovírico según la invención comprende
igualmente las secuencias que codifican la proteína pIX, a no ser
que estén complementadas por la línea de producción. Por otra
parte, además puede estar desprovisto de todo o parte de la región
E3. Otra alternativa consiste en conservar las secuencias E3 que
codifican los polipéptidos que permiten el escape al sistema
inmunitario del huésped, especialmente la glicoproteína gp19k
(Gooding et al., 1990, Critical Review of Immunology
10, 53-71). En el ámbito de la presente
invención, se puede recurrir a los vectores denominados de segunda
generación de la técnica anterior (véanse, por ejemplo, las
solicitudes internacionales WO94/28152 y WO97/04119).
Un vector adenovírico según la invención se puede
igualmente modificar en los niveles de las secuencias que codifican
las proteínas tardías, como el hexón, el pentón o la fibra, a fin
de modificar la capacidad de infección del virión, por ejemplo,
para seleccionar un tipo celular particular (véase, por ejemplo, la
solicitud francesa FR97 04747).
Un vector adenovírico preferido según la
invención se elige entre los siguientes:
- (1)
- vector adenovírico desprovisto de todas o de parte de las regiones E1 y E2 y, de manera opcional, de toda o parte de E3,
- (2)
- vector adenovírico desprovisto de todas o de parte de las regiones E1 y E4 y, de manera opcional, de toda o parte de E3,
- (3)
- vector adenovírico desprovisto de todas o de parte de las regiones E1 y E4 y, de manera opcional, de toda o parte de E3, y que contiene una mutación no funcional en la región E2,
- (4)
- vector adenovírico desprovisto de todas o de parte de las regiones E1, E2 y E4 y, de manera opcional, de toda o parte de E3,
- (5)
- vector adenovírico desprovisto de toda o de parte de la región E1 y, de manera opcional, de toda o parte de E3.
El origen del vector adenovírico según la
invención puede variar tanto desde el punto de vista de la especie
como del estereotipo. Puede derivar del genoma de un adenovirus de
origen humano, canino, aviar, bovino, murino, ovino, porcino o
símico, o también de un híbrido que contiene fragmentos de genoma
adenovírico de diferentes orígenes. Se pueden citar más
particularmente los adenovirus CAV-1 o
CAV-2 de origen canino, DAV de origen aviar, o
también Bad de tipo 3 de origen bovino (Zakharchuk et al.,
Arch. Virol., 1993, 128: 171-176; Spibey y
Cavanagh, J. Gen. Virol., 1989, 70: 165- 172; Jouvenne et
al., Gene, 1987, 60: 21-28; Mittal et
al., J. Gen. Virol., 1995, 76: 93- 102). Sin embargo, se
prefiere un vector adenovírico de origen humano que deriva
preferentemente de un adenovirus de estereotipo C, especialmente de
tipo 2 ó 5. Por otra parte, el vector adenovírico según la presente
invención se puede generar in vitro en Escherichia coli
(E. coli) mediante las técnicas de biología molecular o también
mediante recombinación homóloga (véase, por ejemplo, la solicitud
internacional WO96/17070).
Como se indica anteriormente, el vector
adenovírico según la invención es recombinante y contiene al menos
un casete de expresión de un gen de interés puesto bajo control de
los elementos necesarios para su expresión en una célula huésped o
un organismo huésped. Preferentemente, se inserta en el vector
adenovírico según la invención, en sustitución de una de las
regiones suprimidas, especialmente de E1. En el caso en el que se
utilicen varios casetes de expresión, se pueden insertar en el
mismo sitio o en sitios diferentes del genoma vírico, utilizar los
mismos elementos de regulación o elementos de regulaciones
diferentes, y, eventualmente, estar en orientación inversa unas con
relación a otras a fin de minimizar los fenómenos de interferencia a
nivel de la expresión génica.
La característica esencial de al menos uno de los
casetes de expresión utilizado en el ámbito de la presente
invención es que contiene al menos una secuencia de empalme. El
término "secuencia de empalme" designa una secuencia
habitualmente activa en el corte y empalme de una secuencia que
interviene (ivs) situada entre dos puntos de empalme, presente en
un gen nuclear entre dos exones y ausente del ARN mensajero (ARNm)
correspondiente. Los exones son los segmentos de secuencia que
constituyen el ARNm. Pueden ser codificantes o no, especialmente
los localizados en los extremos 5' y 3'. Los puntos de empalme
representan los puntos frontera entre exón e ivs, estando el punto
dador al principio de la ivs y el punto receptor al final. Dicha
secuencia de empalme comprende al menos las secuencias situadas
directamente en 3' del punto dador y en 5' del punto receptor de
empalme, y separándoles eventualmente una secuencia de cualquier
tamaño. Igualmente puede contener secuencias suplementarias en uno u
otro o en sus dos extremos. Se utilizarán preferentemente
secuencias exónicas, no codificantes, que intervienen directamente
en el proceso de empalme y que comprenden las secuencias
directamente en 5' del punto dador y en 3' del punto dador de
empalme. Esta forma de realización es particularmente ventajosa con
un gen de interés de tipo ADN complementario (ADNc). Las secuencias
que intervienen directamente en el corte y empalme (sitios de
empalme que recubren la unión exón-ivs) se
conservan relativamente bien en la evolución y en las opiniones
divulgadas en la mayoría de los documentos que tratan de la
expresión de genes eucariotas (por ejemplo, en Watson et
al., 1989, en Molecular Biology of the Gene, 4ª ed., p.
683-742, Benjamin/Cummings Publishing Company Inc.,
Menlo Park, California). Especialmente las secuencias GT y AG,
situadas respectivamente corriente arriba y corriente debajo de los
puntos de empalme 5' (dador) y 3' (receptor), son casi
invariables.
Se sabe que numerosos genes eucariotas están
constituidos por una sucesión de exones y de intrones. Las
secuencias de empalme susceptibles de ser utilizadas en la presente
invención pueden tener longitudes y secuencias muy diferentes. Se
puede tratar de una secuencia de empalme nativa tal como se
encuentra en la naturaleza. Se puede también utilizar una secuencia
de empalme modificada, especialmente mediante supresión de una o
varias secuencias no activas en el proceso de empalme, con el objeto
de reducir su tamaño o de eliminar secuencias repetidas que pueden
conducir a fenómenos de recombinación o secuencias de regulación
susceptibles de perturbar la expresión del gen de interés. Se puede
prever la utilización de una secuencia de empalme quimera formada
por secuencias de orígenes diversos. Para ilustrar este aspecto, el
intrón quimera puede estar formado de las partes 5' y 3' de dos
intrones diferentes, o puede estar provisto de un sitio dador de
empalme y/o de un sitio receptor de empalme heterólogo. Es
igualmente posible recurrir a una secuencia de empalme sintética
concebida a partir de los sitios de empalme consensuados. Una
secuencia de empalme preferida según la invención deriva del
segundo intrón del gen \beta-globina de conejo
(Green et al., 1988, Nucleic Acid Res. 16, 369;
Karasuyama et al., 1988, Eur. J. Immunol. 18,
97-104; Karasuyama et al., 1989, J. Exp.
Med. 169, 13-25), o de la encontrada en el
plásmido pCI (Promega Corp, vector de expresión E1731 de mamífero
pCI) que comprende el sitio dador de empalme del intrón 1 del gen
\beta-globina humano así como el punto de conexión
y el sitio receptor de empalme del gen de una inmunoglobina de
ratón.
Preferentemente, un vector adenovírico según la
invención comprende una secuencia de empalme idéntica a por lo menos
70% de la secuencia representada en el identificador de secuencia
IDS 1 ó 2. La identidad de secuencia entre la secuencia de
utilización en la presente invención y la dada a conocer en uno u
otro de los IDS es de por lo menos 70%, ventajosamente de al menos
80%, preferentemente de al menos 90% y, de manera muy preferida, de
al menos 95%. La identidad de secuencia significa 100% de
identidad, y "sensiblemente tal como" designa una identidad de
secuencia de al menos 95%. Una parte comprende al menos 17 nt
continuos. Particularmente, es conveniente un vector adenovírico
según la invención que comprende una secuencia de empalme
sensiblemente tal como se representa en el identificador de
secuencia IDS 1 ó 2.
Conforme a los objetivos perseguidos por la
presente invención, el casete de expresión puede contener una o
varias secuencias de empalme insertadas en el seno de uno o varios
genes de interés de tipo genómico, minigénico (tipo mixto entre
genómico y ADNc), o también ADNc (desprovisto de intrón), llevado
por dicho casete. El sitio de inserción preferente de la secuencia
de empalme en el seno del gen de interés está entre el primer exón
y el segundo exón. Cuando el gen de interés es de tipo ADNc, se
recurre preferentemente a una secuencia de empalme provista de
secuencias oxónicas cortas que se pueden insertar en 5' o en 3' del
ADNc. El gen de interés puede ser homólogo o heterólogo con la
célula huésped, y puede codificar un ARN antisentido, una ribozima
o un polipéptido de interés de localización nuclear, citoplásmico,
de la membrana o segregado. Se puede tratar de un polipéptido
nativo, tal como se encuentra en la naturaleza, de un fragmento
funcional, de un mutante que presenta propiedades biológicas
mejoradas y/o modificadas, o también de una quimera que proviene de
la fusión de secuencias de orígenes diversas. El gen de interés se
puede obtener mediante síntesis química, o mediante clonación
(identificación sistemática a partir de un banco de ADN con la
ayuda de sondas apropiadas, PCR, etc.), y se puede modificar
mediante técnicas convencionales de biología molecular.
En el ámbito de la presente invención, puede ser
ventajoso utilizar un gen de interés que codifica una citoquina
(interferón \alpha, \beta o \gamma), interleuquina (IL),
especialmente la IL-2, IL-6,
IL-10 o también IL-12, un factor de
necrosis tumoral (TNF), un factor estimulante de colonias
(GM-CSF, C-CSF,
M-CSF, etc.), un receptor celular (especialmente
reconocido por el virus del VIH), un ligante de receptor, un factor
de coagulación, un factor de crecimiento (FGF del inglés factor de
crecimiento de fibroblastos, VEGF del inglés factor de crecimiento
endotelial vascular, etc.), una enzima (ureasa, renina, trombina,
metaloproteinasa, NOS del inglés óxido nítrico sintetasa, SOD,
catalasa, etc.), un inhibidor de enzimas
(\alpha1-antitripsina, antitrombina III,
inhibidor de proteasa vírica, PAI-1 de inhibidor del
activador de plasminógeno, etc.), un antígeno del complejo mayor de
histocompatibilidad de clase I o II, o un polipéptido que actúa
sobre la expresión de los genes correspondientes, un polipéptido
capaz de inhibir una infección vírica, bacteriana o parasitaria, o
su desarrollo, un polipéptido que actúa positiva o negativamente
sobre la apoptosa (Bax, Bcl2, BclX, etc.), un agente citostático
(p21, p16, Rb, etc.), una apolipoproteína (ApoAI, ApoAIV, ApoE,
etc.), un inhibidor de la angiogénesis (angiostatina, endostatina,
etc.), un marcador (\beta-galactosidasa,
luciferasa, etc.), o cualquier otro gen de interés que tiene un
efecto terapéutico para la afección diana.
Más precisamente, con el objeto de tratar un mal
funcionamiento hereditario, se utilizará una copia funcional del gen
defectuoso, por ejemplo un gen que codifica el factor VIII o IX en
el ámbito de la hemofilia A o B, la distrofina en el ámbito de las
miopatías de Duchenne y Becker, la insulina en el ámbito de la
diabetes, la proteína CFTR (reguladora de la conductancia
transmembránica de la fibrosis cística) en el ámbito de la
mucoviscidosis. Tratando de inhibir la iniciación o la progresión de
tumores o cánceres, se utilizará preferentemente un gen de interés
que codifica un ARN antisentido, una ribozima, un producto
citotóxico (timidina quinasa de virus del herpes simplex 1
(TK-HSV-1), ricina, toxina colérica,
diftérica, producto de expresión de los genes de levadura
FCY1 y FUR1 que codifican la uracilo fosforribosil
transferasa y la citosina desaminasa, etc.), un anticuerpo, un
inhibidor de la división celular o señales de transducción, un
producto de expresión de un gen supresor de tumores (p53, Rb, p73,
etc.), un polipéptido estimulante del sistema inmunitario, un
antígeno asociado a un tumor (MUC-1,
BRCA-1, antígenos precoces o tardíos (E6, E7, L1,
L2, etc.) de un virus del papiloma HPV, etc.), eventualmente en
combinación con un gen de citoquina. Finalmente, en el ámbito de
una terapia anti-VIH, se puede recurrir a un gen que
codifica un polipéptido inmunoprotector, un epítopo antigénico, un
anticuerpo (2F5; Buchacher et al., 1992, Vaccines 92,
191-195), el campo extracelular del receptor CD4
(sCD4; Traunecker et al., 1988, Nature 331,
84-86), una inmunoadhesina (por ejemplo, un híbrido
CD4-inmunoglobina IgG; Capon et al., 1989,
Nature 337, 525-531; Byrn et al.,
1990, Nature 344, 667-670), una inmunotoxina
(por ejemplo, fusión del anticuerpo 2F5 o de la inmunoadhesina
CD4-2F5 al angiogenina; Kurachi et al.,
1985, Biochemistry 24, 5494-5499), una
variante transdominante, un producto citotóxico tal como uno de los
mencionados aquí arriba, o también un IFN\alpha o \beta.
Por otra parte, el casete de expresión utilizado
en la presente invención puede igualmente comprender un gen de
selección que permite seleccionar o identificar las células
transfectadas. Se pueden citar los genes neo (que codifican
la neomicina fosfotransferasa) que confiere una resistencia al
antibiótico G418, dhfr (dihidrofolato reductasa), CAT
(cloranfenicol acetil transferasa), pac (puromicina acetil
transferasa), o también gpt (xantina guanina fosforibosil
transferasa). De manera general, los genes de selección son
conocidos por el experto en la materia.
La expresión "elementos necesarios para la
expresión" designa los elementos genéticos que permiten la
transcripción de un gen de interés en ARN, y la traducción de un
ARNm en polipéptido. Entre ellos, el promotor tiene una importancia
particular. Se puede aislar de un gen cualquiera de origen
eucariota o también vírico, y puede ser constitutivo o regulable.
Como alternativa, se puede tratar del promotor natural del gen en
cuestión. Por otra parte, se puede modificar a fin de mejorar la
actividad promotora, suprimir una región inhibidora de la
transcripción, producir un promotor constitutivo regulable o
viceversa, introducir un sitio de restricción, etc. Se pueden
mencionar, a título de ejemplos, los promotores víricos CMV
(Citomegalovirus), RSV (virus del sarcoma de Rous), del gen
TK del virus HSV-1, el promotor precoz del virus
SV40 (virus del simio 40), el promotor adenovírico de un gen precoz
o tardío (ElA, MLP, etc.), o también los promotores eucariotas de
los genes de PGK (FosfoGlicerato Quinasa), de MT (metalotioneina),
de \alphal-antitripsina, de CFTR, del surfactante
(específico del pulmón), de la inmunoglobulina (específico de
linfocitos), de la actina (específico del músculo), o también del
SR\alpha (híbrido entre el origen del SV40 y el LTR de
HTLV-I; Takebe et al., 1988, Mol. Cell.
Biol. 8, 466-472). Se puede tratar igualmente
de un promotor que estimula la expresión en una célula tumoral o
cancerígena. Se pueden citar especialmente los promotores de los
genes de MUC-l sobrexpresado en los cánceres de mama
y de próstata (Chen et al., 1995, J. Clin. Invest.
96, 2775-2782), de CEA (en inglés, antígeno
carcino-embriónico) sobrexpresado en los cánceres
de colon (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10,
2738-2748), de tirosinasa sobrexpresado en los
melanomas (Vile et al., 1993, Cancer Res. 53,
3860-3864), de ERB-2 sobrexpresado
en los cánceres de mama y de páncreas (Harris et al., 1994,
Gene Therapy 1, 170-175) y de
\alpha-fetoproteína sobrexpresado en los cánceres
de hígado (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57,
461-465). Se prefiere particularmente el promotor
precoz del citomegalovirus (CMV).
Cuando el casete de expresión utilizado en la
presente invención comprende varios genes de interés, estos se
pueden poner bajo control de los mismos elementos genéticos (casete
policistrónico que utiliza un sitio interno de iniciación de la
traducción de tipo IRES para reiniciar la traducción del segundo
cistrón), o de elementos independien-
tes.
tes.
Evidentemente, el casete puede, además,
comprender elementos adicionales que mejoran la expresión del gen de
interés (secuencia señal, secuencia de localización nuclear,
secuencia de poliadenilación, IRES, líder tripartita, etc.), o
también el mantenimiento en la célula huésped (origen de
replicación, etc). Tales elementos son conocidos por el experto en
la materia. Una secuencia de poliadenilación preferida deriva del
virus SV40 o también del gen de \beta-globina de
conejo.
Una forma de realización particularmente
ventajosa reside en un vector adenovírico cuyo genoma se suprime de
las regiones E1, E3 y E4, en el que se inserta, en el lugar de la
región E1, un casete de expresión que contiene el promotor CMV, la
secuencia de empalme sintética aislada del plásmido pCI, el ADNc
que codifica la IL-2 humana y el polyA del virus
SV40 (tal como pTG6215). Otra variante interesante se suministra
mediante un vector adenovírico de esqueleto genómico similar
(supresión de E1, E3 y E4) que comprende un casete de expresión
formado del promotor RSV seguido de las secuencias de empalme que
comprenden el intrón 2 del gen de \beta-globina de
conejo, del ADNc del factor IX canino y del poly A del gen de
\beta-globina de conejo (tal como pTG9378). Otro
ejemplo preferido consiste en un vector E1^{*}E3^{*} en el que
se inserta un casete, el promotor de CMV, el intrón sintético de
pCI, el ADNc que codifica la IL-2 humana, seguido
del polyA de SV40 (tal como pTG6624).
La invención se refiere asimismo a una partícula
vírica infecciosa así como a una célula huésped eucariota que
comprende un vector adenovírico según la invención. Dicha célula
huésped es, ventajosamente, una célula de mamífero y,
preferentemente, una célula humana, y puede comprender dicho vector
en forma integrada, o no, en el genoma. Se puede tratar de una
célula primaria o tumoral de origen hematopoyético (célula cepa
totipotente, leucocito, linfocito, monocito o macrófago, etc.),
muscular (célula satélite, miocito, mioblasto, etc.), cardiaca,
hepática, pulmonar, traqueal, epitelial o fibroblástica. Una
partícula vírica infecciosa según la invención se prepara según
cualquier técnica convencional en el campo de la técnica anterior
(Graham y Prevect, 1991, véase más arriba). Más
precisamente, el vector adenovírico según la invención se propaga
en una línea de complementación capaz de suministrar en trans
las funciones defectuosas a fin de producir los polipéptidos
necesarios para la constitución de las partículas víricas
infecciosas. Se recurre especialmente a las líneas descritas en las
Solicitudes Internacionales WO94/28152 y WO97/04119. Se puede
igualmente utilizar una línea celular apropiada, tal como la línea
293, para complementar la función E1 (Graham et al., 1977,
véase más arriba), o A549-E1 (documento
WO94/28152). Para una complementación múltiple, es igualmente
posible utilizar un virus auxiliar o una línea de complementación
de la técnica anterior (por ejemplo, Lusky et al., 1988, J.
Virol 72, 2022-2033).
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de preparación de una partícula vírica infecciosa que
comprende un vector adenovírico según la invención, en el que:
- (i)
- dicho vector adenovírico según la invención se introduce en una célula de complementación capaz de complementar en trans a dicho vector, a fin de obtener una célula de complementación transfectada,
- (ii)
- dicha célula de complementación transfectada se cultiva en condiciones apropiadas para permitir la producción de dicha partícula vírica infecciosa, y
- (iii)
- dicha partícula vírica infecciosa se recupera en el cultivo celular.
Evidentemente, la partícula vírica infecciosa se
puede recuperar del sobrenadante de cultivo, pero igualmente de las
células. Uno de los métodos corrientemente utilizado consiste en
lisar las células mediante ciclos consecutivos de
congelación/descongelación para recuperar los viriones en el
sobrenadante de la lisis. Éstos se pueden amplificar y purificar
según las técnicas de la técnica anterior (procedimiento
cromatográfico, ultracentrifugación, especialmente a través de un
gradiente de cloruro de cesio, etc.).
La invención tiene igualmente por objeto una
composición farmacéutica que comprende, como agente terapéutico o
profiláctico, un vector adenovírico, una partícula vírica
infecciosa o una célula huésped eucariota según la invención, o
también una partícula vírica infecciosa susceptible de ser obtenida
mediante un procedimiento de preparación de partícula vírica
infecciosa según la invención, en asociación con un soporte
aceptable desde un punto de vista farmacéutico. La composición según
la invención está particularmente destinada al tratamiento
preventivo o curativo de enfermedades genéticas (hemofilia,
diabetes, mucoviscosidosis, miopatía de Duchenne o de Becker,
enfermedades autoinmunitarias, etc.), de cánceres y tumores, de
enfermedades víricas (hepatitis B o C, SIDA, infecciones
herpéticas, etc.), enfermedades cardiovasculares (restenosis,
etc.).
Una composición farmacéutica según la invención
se puede fabricar de manera convencional con vistas a una
administración por vía local, parenteral o digestiva. En
particular, se asocia una cantidad terapéuticamente eficaz del
agente terapéutico o profiláctico a un soporte aceptable desde un
punto de vista farmacéutico. Las vías de administración posibles
son múltiples. Se puede citar, por ejemplo, la vía intragástrica,
subcutánea, intracardíaca, intramuscular, intravenosa,
intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonar o
intratraqueal. Para estas tres últimas formas de realización, es
ventajosa una administración por aerosol o instilación. La
administración puede tener lugar en una dosis única o repetida, una
o varias veces tras un intervalo apropiado. La vía de
administración y la dosificación apropiadas varían en función de
diversos parámetros, por ejemplo, del individuo o de la enfermedad
a tratar, o también del o de los genes de interés a transferir. En
particular, las partículas víricas según la invención se pueden
formular en forma de dosis comprendidas entre 10^{4} y 10^{14}
ufc (unidades formadoras de colonias), ventajosamente 10^{5} y
10^{13} ufc y, preferentemente, 10^{6} y 10^{12} ufc. La
formulación puede igualmente incluir un diluyente, un adyuvante o un
excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico. Se puede
presentar en forma líquida o seca (liofilizado, etc.).
El vector y las partículas víricas según la
invención se pueden eventualmente asociar con una o varias
sustancias que mejoran la eficacia transfeccional y/o la
estabilidad. Estas sustancias se documentan ampliamente en la
bibliografía accesible al experto en la materia (véase, por
ejemplo, Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc.
32, 115-121; Hodgson y Solaiman, 1996, Nature
Biotechnology 14, 339-342; Remy et
al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5,
647-654). A título ilustrativo pero no limitativo,
se puede tratar de polímeros, de lípidos especialmente catiónicos,
de liposomas, de proteínas nucleares, o también de lípidos neutros.
Estas sustancias se pueden utilizar solas o en combinación.
Por último, la presente invención se refiere a la
utilización de un vector adenovírico, de una partícula vírica
infecciosa o de una célula huésped eucariota según la invención, o
también de una partícula vírica infecciosa susceptible de ser
obtenida mediante un procedimiento de preparación de partícula
vírica infecciosa según la invención, para la transferencia de un
gen de interés en una célula o un organismo huésped. Según una
primera posibilidad, el medicamento se puede administrar
directamente in vivo (por ejemplo, mediante inyección
intravenosa, intramuscular, en un tumor accesible, en los pulmones
mediante aerosol, etc.). Se puede igualmente adoptar la
administración ex vivo que consiste en tomar muestras de las
células del paciente (células cepas de la médula ósea, linfocitos
de la sangre periférica, etc.), transfectarlas o infectarlas in
vitro según las técnicas anteriores, y readministrarlas al
paciente. Se describe igualmente la preparación de un medicamento
destinado al tratamiento del cuerpo humano o animal mediante
terapia
génica.
génica.
Finalmente, la presente invención tiene
igualmente por objeto la utilización de un vector adenovírico según
la invención para mejorar la expresión de un gen de interés en un
factor de al menos 20, ventajosamente de al menos 50 y
preferentemente de al menos 100, en una célula o un organismo
huésped. El nivel de mejora se puede fácilmente determinar
comparando la expresión del gen de interés en presencia y en
ausencia de dicha secuencia de empalme en un contexto adenovírico
dado.
Se describe igualmente un método de tratamiento
según el cual se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de
un vector adenovírico, de una partícula vírica o de una célula
huésped eucariota según la invención, a un paciente que necesita tal
tratamiento.
La Figura 1 es una representación esquemática del
genoma del adenovirus humano de tipo 5 (representado en unidades
arbitrarias de 0 a 100) indicando el sitio de los diferentes
genes.
La presente invención se ilustra a través de los
ejemplos siguientes, sin estar limitada por ellos.
Las construcciones descritas a continuación se
realizan según las técnicas generales de ingeniería genética y de
clonación molecular, detalladas en Maniatis et al., (1989,
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY), o según las recomendaciones del fabricante
cuando se utiliza un kit comercial. Las etapas de recombinación
homóloga se realizan preferentemente en la cepa BJ 5183 de E.
coli (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166,
557-580). En cuanto a la reparación de los sitios
de restricción, la técnica utilizada consiste en llenar los extremos
5' protuberantes con la ayuda del gran fragmento de ADN polimerasa
I de E. coli (Klenow). Las técnicas de amplificación
mediante PCR (en inglés, reacción en cadena de polimerasa) son
conocidas por el experto en la materia (véase, por ejemplo, PCR
Protocols - A Guide to Methods and Applications, 1990, editada por
Innis, Gelfand, Sninsky y White, Academic Press Inc). Por otra
parte, los fragmentos de genoma adenovírico, utilizados en las
diferentes construcciones descritas aquí a continuación, se indican
precisamente según su posición en la secuencia nucleotídica del
genoma del Ad5, tal como se divulga en el banco de datos Genebank
con la referencia M73260.
Haciendo referencia a la biología celular, las
células se transfectan o se transducen y se cultivan según las
técnicas estándares bien conocidas por el experto en la materia. En
los ejemplos siguientes, se recurre a las líneas celulares 293
(Graham et al, 1977, véase más arriba; disponible en
el ATCC con la referencia CRL1573), LCA-1 (que
corresponde al clon 5606#5-38 descrito en el ejemplo
3 de la solicitud WO94/04119), A549 de origen epitelial y que
deriva de un carcinoma pulmonar (ATCC CCL-185) y
A549-E1 (ejemplo 6 del documento WO94/28156). Se
entiende que se pueden utilizar otras líneas celulares. Se indica
que la línea A549-E1 es una línea de complementación
de la función adenovírica E1 obtenida mediante transfección de un
plásmido que contiene las secuencias E1 de Ad5 (nt 505 a 4034)
expresadas a partir del promotor de PGK. Los clones estables
seleccionados en puromicina se ensayan para determinar su capacidad
de complementación, y se selecciona el mejor clon productor
(#73).
Se aísla del plasmido pCI (Promega) el fragmento
BglII-BamHI, que contiene el promotor de CMV, la
secuencia de empalme, un sitio múltiple de clonación (MCS) y la
secuencia polyA del virus SV40, el cual se inserta en un plásmido
convencional. Las secuencias de ADNc que codifican la
IL-2 humana (Taniguchi et al., 1983, Nature
302, 305-311) se aíslan en forma de un
fragmento XhoI-EcoRI (eventualmente mediante PCR) y
se introducen al nivel del MCS. El casete se clona en el sitio de la
región adenovírica E1 en un vector de transferencia adenovírica
para dar el pTG6601. El vector de transferencia contiene los nt 1 a
458 y 3329 a 6241 del Ad5 en un plásmido ppolyII. El pTG6215 se
genera mediante recombinación homóloga entre el fragmento
PacI-BstEII, aislado del pTG6601, y el vector pTG8595
(Chartier et al., 1996, J. Virol. 70,
4805-4810) linealizado mediante ClaI. El
vector adenovírico pTG6215 contiene el genoma Ad5 desprovisto de
las regiones E1 (nt 459 a 3327), E3 (nt 28592 a 30470) y E4 (nt
32994 a 34998), y el casete "promotor de CMV - secuencia de
empalme de pCI - ADNc de IL-2 y pA de SV40" se
inserta en el sitio de las secuencias adenovíricas E1.
Como testigo, el vector pTG6692 se genera
suprimiendo las secuencias de empalme del bloque de expresión
aislado de pCI mediante digestión PstI y religación. La
clonación del ADNc de IL-2 y la inserción del casete
"sin intrón" se realizan en el seno del genoma adenovírico
como se indica aquí arriba.
Finalmente, es útil comparar el efecto de las
secuencias de empalme en un contexto de vector adenovírico de
primera generación. Para ello, el vector pTG6624 se construye
mediante recombinación homóloga entre el fragmento
PacI-BstEII, aislado del pTG6601, y el vector pTG4656
linealizado mediante ClaI. Este último es equivalente a
pTG8595 con la diferencia de que contiene una región E4 íntegra, de
manera que la construcción final, pTG6624, corresponde al genoma
Ad5 al que se le han suprimido las regiones E1 (nt 459 a 3327) y E3
(nt 28592 a 30470), y con el casete "promotor de CMV - secuencia
de empalme de pCI - ADNc de IL-2 y pA de SV40"
insertado en el sitio del E1. El vector "sin intrón" de
primera generación, denominado pTG6229, resulta de la supresión de
las secuencias de empalme mediante digestión PstI y de la
clonación del casete sin intrón en el genoma adenovírico mediante
recombinación homóloga con el vector pTG4656.
Los adenovirus AdTG6215 y AdTG6692 se obtienen
mediante transfección del fragmento PacI aislado de los
vectores correspondientes en las células LCA1 mediante la técnica
con fosfato de calcio. Los viriones de primera generación AdTG6624 y
AdTG6229 se producen en la línea 293. Los virus se aíslan, se
propagan y se purifican en las condiciones habituales.
Las células humanas A549 se cultivan y después se
infectan hasta confluencia mediante los viriones anteriores,
respetando una multiplicidad de infección de aproximadamente 100.
Las cantidades de IL-2, segregadas en los
sobrenadantes de cultivo recuperados 48h después de la infección,
se determinan mediante ELISA (estuche Quantikine
hIL-2, R&D System, Minneapolis). En un contexto
de vector adenovírico de segunda generación (E1^{*}, E3^{*} y
E4^{*}), la IL-2 se produce en cantidades de 100
a 150 veces más elevadas cuando los viriones contienen un casete de
expresión provisto de un intrón (AdTG6215) que cuando están
desprovistos del mismo (AdTG6692). Estos últimos sintetizan niveles
de IL-2 muy bajos que no permiten considerar su uso
terapéutico. En comparación, el factor de amplificación en un
contexto de virus de primera generación (E1^{*}, E3^{*}) es de
2,5.
En primer lugar, se reconstituye el casete
recombinante constituido del promotor de RSV, de la secuencia de
empalme del segundo intrón del gen de
\beta-globina de conejo dispuesto en 5' del ADNc
del FIX canino, seguido de polyA del gen de
\beta-globina de conejo. Las secuencias de empalme
y la polyA de \beta-globina se eliminan, mediante
corte, del vector pBCMGNeo (Karasuyama et al., 1989, más
arriba) mediante digestión SalI-BamHI, y se
clonan corriente abajo del promotor de RSV portado por el fragmento
SalI-BamHI aislado del vector pREP4 (Invitrogen
V004-50). Después, se inserta, corriente abajo de
las secuencias de empalme, el ADNc que codifica el FIX canino cuya
secuencia se describe en Evans et al. (1989, Blood 74,
207-212). La unidad de transcripción se coloca en
un vector de transferencia que contiene las secuencias Ad5 1 a 458 y
3328 a 5778, para dar pTG9350. El vector adenovírico pTG9378 se
obtiene mediante recombinación homóloga entre el fragmento
PacI-BglI, aislado de pTG9350, y el vector pTG8595
(Chartier et al., 1996, más arriba) linealizado
mediante ClaI. Contiene el genoma Ad5, desprovisto de las
regiones E1 (nt 459 a 3327), E3 (nt 28592 a 30470) y E4 (nt 32994 a
34998), y el casete FIX indicado aquí arriba insertado en lugar del
E1.
Como anteriormente, se construye un testigo
denominado pTG5666 cuyo esqueleto adenovírico corresponde a un
vector de segunda generación, pero en el que el casete FIX está
desprovisto de secuencias de empalme, mediante digestión
PstI.
Igualmente, se construyen dos vectores de primera
generación pTG9370 y pTG9383 diferentes, respectivamente, por la
presencia o no del intrón de 2\beta-globina en el
casete FIX. El primero se obtiene mediante recombinación homóloga
entre el fragmento PacI-BglI, aislado del pTG9350, y
el vector pTG4656 al que se la han suprimido las regiones E1 (nt
459 a 3327) y E3 (nt 28592 a 30470), linealizado mediante
ClaI. El segundo resulta de la recombinación entre el
fragmento PacI-BglI, desprovisto del intrón, y el
pTG4656.
Las partículas víricas se generan mediante
transfección de los fragmentos PacI de los plásmidos
anteriores en las líneas 293 (AdTG9370 y AdTG9383) o LCA1 (AdTG9378
y AdTG5666). Los virus se aíslan, se propagan y se purifican en las
condiciones habituales. Las células dianas A549 se cultivan, y
después, una vez hasta confluencia, se infectan mediante los
viriones anteriores, respetando una multiplicidad de infección de
aproximadamente 100. Las cantidades de FIX canino segregadas en los
sobrenadantes de cultivo, recuperados 48h después de la infección,
se determinan mediante ELISA (véase, por ejemplo, Axelrod et
al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,
5173-5177; Roman et al., 1992, Somat. Cell
Mol. Genet. 18, 247-258; Miyanohara et
al., 1992, New Biol. 4, 238-246; Lozier
et al., 1994, JAMA 271, 47-51). Un
ensayo particularmente apropiado utiliza como anticuerpo de captura
el monoclonal FXCOO8 (Bajaj et al., 1985, J. Biol. Chem.
260, 11574-11580), a razón de 200 ng por
pocillo, y como anticuerpo de detección un anticuerpo de conejo
específico del FIX humano (STAGO) acoplado a la peroxidasa. La
secreción de FIX canino en las células A549 infectadas por los virus
de segunda generación es 20 veces más elevada cuando el casete
contiene secuencias de empalme (AdTG9378) que cuando está
desprovisto (AdTG5666) de las mismas. Cuando la transducción utiliza
vectores de primera generación, el efecto beneficioso del intrón se
nota menos (factor de amplificación de aproximadamente 2,5).
La sustitución del ADNc del FIX por el que
codifica la IL-2 humana da como resultado el vector
pTG6214. Es el equivalente al AdTG9378 con la diferencia del gen de
interés.
Se cultivan aproximadamente 10^{7} células
A549-E1 #73 en matraces F25 y se infectan con una
MOI (en inglés, multiplicidad de infección) de 1 con los virus
AdTG6624 (\DeltaE1\DeltaE3 + intrón) o AdTG6229
(\DeltaE1\DeltaE3 - intrón). La infección se realiza 30 minutos
a 37ºC en medio DMEM (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco) al que
se añaden 2% de suero. Los cultivos se recogen en los tiempos 24h,
48h, 72h y 96h, y los viriones se liberan de las células mediante
choques térmicos. El título vírico se evalúa mediante
inmunofluorescencia de la proteína DBP con la ayuda de un anticuerpo
monoclonal específico (Reich et al., 1983, Virology
128, 480-484). El factor de amplificación se
determina mediante la relación del número de unidades infecciosas
(u.i.) finales sobre las iniciales. Se observa un factor de
amplificación del orden de 1900, 4100 y 3300 a 48, 72 y 96h tras la
infección, respectivamente, con los dos tipos de construcción.
Cuando el mismo ensayo se conduce en un matraz de 175 (MOI = 3, y
recolección 3 días tras la infección), el rendimiento de producción
(i.u./célula) es sensiblemente más elevado (de aproximadamente 25%)
con los virus AdTG6624 que contienen un casete de expresión
provisto de un intrón. En su conjunto, estos resultados indican que
la presencia del intrón sintético de pCI no tiene efecto negativo
sobre los rendimientos de producción vírica.
Se transducen de manera estándar diversos tipos
celulares, tanto líneas establecidas de diverso origen [humana,
símica o murina: A549, Vero y W162 (Weinberg y Ketner, 1983, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80, 5384-5386)] como células
primarias de ratones (fibroblastos), caninas (mioblastos) y sobre
todo de origen humano [tumores primarios que provienen de un cáncer
del estómago (pasaje 5) y de una metástasis hepática de un cáncer
de colón (pasaje 2)], con una moi de 50 a 100. Los virus utilizados
son los siguientes: AdTG6624 (\DeltaE1\DeltaE3 pCMV + intrón),
AdTG6229 (\DeltaE1\DeltaE3 pCMV - intrón), AdTG6215
(\DeltaE1\DeltaE3\DeltaE4 pCMV + intrón) o AdTG6692
(\DeltaE1\DeltaE3\DeltaE4 pCMV - intrón), AdTG6214
(\DeltaE1\DeltaE3\DeltaE4 pRSV + intrón) y su control
(\DeltaE1\DeltaE3\DeltaE4 pRSV - intrón). Los sobrenadantes
se recogen 24 y 72h tras la infección, y las cantidades de la
IL-2 segregadas se determinan mediante ELISA como
anteriormente.
Las dosificaciones indican el efecto beneficioso
del intrón en términos de producción de la IL-2,
siendo ésta 2 a 3 veces más elevada en un contexto de vector de
primera generación, y más de 100 veces en un contexto
\DeltaE1\DeltaE3\DeltaE4. Se observa que los viriones AdTG6624
son los más productivos en IL-2, mostrando el
interés de asociar el promotor de CMV y el intrón sintético en un
esqueleto vector de primera generación.
La actividad antitumoral de los viriones que
expresan la IL-2 se evalúa in vivo en un
modelo murino de tumores. Ratones hembras inmunodeficientes B6D2 de
6 a 8 semanas se hacen cancerígenas mediante la administración de 3
x 10^{5} células tumorales p815. Una vez que los tumores son
palpables (3 a 4 mm de diámetro), se inoculan 5 x 10^{8}
partículas infecciosas de AdTG6624 por vía intratumoral en D0, D1 y
D2, y se monitoriza la supervivencia de los animales a lo largo del
tiempo. El porcentaje de supervivencia de los animales tratados con
los virus AdTG6624 llega a 40% tras 40 días después de la
infección. En comparación, los animales tratados con un virus
control que contiene un casete de expresión de la
IL-2 sin intrón dirigido por el promotor MLP
presenta un porcentaje de supervivencia mucho más baja.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Transgene S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 11, rue de Molsheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Estrasburgo
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL: 67082
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 03 88 27 91 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX: 03 88 27 91 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos vectores adenovíricos recombinantes que contienen una secuencia de empalme
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: DISQUETE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, versión #1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 250 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN(genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de empalme sintética
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 652 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN(genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: intrón 2 betaglobina de conejo
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Vector adenovírico que deriva del genoma de un
adenovirus al menos por supresión total o parcial de la región E1,
conteniendo dicho vector adenovírico un casete de expresión de un
gen de interés puesto bajo control de los elementos necesarios para
su expresión en una célula o un organismo huésped, conteniendo
dichos elementos necesarios para la expresión al menos una secuencia
de empalme, caracterizado porque dicha secuencia de empalme
comprende un sitio dador y un sitio receptor de empalme, y porque
deriva de un gen \beta-globina, o de una secuencia
de empalme sintética que tiene la secuencia representada en el
identificador de secuencia IDS1.
2. Vector adenovírico según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicha secuencia de empalme deriva del
intrón 2 del gen \beta-globina de conejo o de una
secuencia de empalme que comprende el sitio dador de empalme del
intrón 1 del gen \beta-globina humano así como el
punto de conexión y el sitio receptor de empalme del gen de una
inmunoglobulina de ratón.
3. Vector adenovírico según la reivindicación 2,
caracterizado porque dicha secuencia de empalme comprende
una secuencia idéntica en al menos 70% o idéntica a la secuencia
representada en el identificador de secuencia IDS 1 ó 2.
4. Vector adenovírico según la reivindicación 3,
caracterizado porque dicha secuencia de empalme comprende
una secuencia sensiblemente tal como se representa en el
identificador de secuencia IDS 1 ó 2.
5. Vector adenovírico según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha secuencia
de empalme se inserta en dicho casete de expresión entre el primer
y el segundo exón del gen de interés.
6. Vector adenovírico según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicha secuencia
de empalme comprende en uno u otro de sus extremos una secuencia
exónica y se inserta en dicho casete de expresión en 5' ó 3' del gen
de interés, siendo éste de tipo ADNc.
7. Vector adenovírico según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque al menos una de
las regiones seleccionadas de entre E2, E4, L1, L2, L3, L4 y L5
tampoco es funcional.
8. Vector adenovírico según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque además está
desprovisto de toda o de parte de la región E3.
9. Vector adenovírico según una de las
reivindicaciones 1 a 8, seleccionado de entre el grupo
siguiente:
- (1)
- vector adenovírico desprovisto de todas o de parte de las regiones E1 y E2 y, de manera opcional, de toda o de parte de la región E3,
- (2)
- vector adenovírico desprovisto de todas o de parte de las regiones E1 y E4 y, de manera opcional, de toda o de parte de la región E3,
- (3)
- vector adenovírico desprovisto de todas o de parte de las regiones E1 y E4 y, de manera opcional, de toda o de parte de la región E3, y que contiene una mutación no funcional en la región E2,
- (4)
- vector adenovírico desprovisto de todas o de parte de las regiones E1, E2 y E4 y, de manera opcional, de toda o de parte de la región E3,
- (5)
- vector adenovírico desprovisto de todas o de parte de las regiones E1 y, de manera opcional, de toda o de parte de la región E3.
10. Vector adenovírico según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque deriva del
genoma de un adenovirus de origen humano, canino, aviar, bovino,
murino, ovino, porcino, o símico, o también de un híbrido que
contiene fragmentos de genoma adenovírico de diferentes
orígenes.
11. Vector adenovírico según la reivindicación
10, caracterizado porque deriva del genoma de un adenovirus
humano de tipo 5.
12. Vector adenovírico según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el gen de
interés codifica un ARN antisentido, una ribozima o un polipéptido
de interés terapéutico seleccionado entre una citoquina, un receptor
celular, un ligante, un factor de coagulación, la proteína CFTR, la
insulina, la distrofina, un factor de crecimiento, una enzima, un
inhibidor de enzima, un polipéptido con efecto antitumoral, un
inhibidor de la angiogénesis, un polipéptido capaz de inhibir una
infección bacteriana, parasitaria o vírica y, especialmente el VIH,
un anticuerpo, una toxina, una inmunotoxina y un marcador.
13. Vector adenovírico según una de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque dichos
elementos necesarios para la expresión de dicho gen de interés en
una célula o en un organismo huésped contienen un promotor,
especialmente seleccionado de entre los promotores de MLP (en
inglés Promotor Tardío Principal), PGK (en inglés Fosfoglicerato
quinasa), RSV (virus del sarcoma de Rous), SR\alpha y CMV
(Citomegalovirus).
14. Vector adenovírico según una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque dichos
elementos necesarios para la expresión de dicho gen de interés en
una célula o en un organismo huésped contienen una secuencia de
poliadenilación, especialmente derivada del virus SV40 o del gen
\beta-globina de conejo.
15. Partícula vírica infecciosa que comprende un
vector adenovírico según una de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Célula huésped eucariota que comprende un
vector adenovírico según una de las reivindicaciones 1 a 14, o
infectada mediante una partícula vírica infecciosa según la
reivindicación 15.
17. Procedimiento para la preparación de una
partícula vírica infecciosa según la reivindicación 15, según el
cual:
- (i)
- se introduce un vector adenovírico según una de las reivindicaciones 1 a 14 en una célula de complementación capaz de complementar en trans dicho vector adenovírico para obtener una célula de complementación transfectada;
- (ii)
- se cultiva dicha célula de complementación transfectada en condiciones apropiadas para permitir la producción de dicha partícula vírica infecciosa; y
- (iii)
- se recupera dicha partícula vírica infecciosa en el cultivo celular.
18. Composición farmacéutica que contiene, como
agente terapéutico o profiláctico, un vector adenovírico según una
de las reivindicaciones 1 a 14, una partícula vírica infecciosa
según la reivindicación 15 o susceptible de ser obtenida utilizando
un procedimiento de preparación según la reivindicación 17, o una
célula huésped eucariota según la reivindicación 16, en asociación
con un soporte aceptable desde un punto de vista farmacéutico.
19. Utilización de un vector adenovírico según
una de las reivindicaciones 1 a 14, de una partícula vírica
infecciosa según la reivindicación 15 o susceptible de ser obtenida
utilizando un procedimiento de preparación según la reivindicación
17, o de una célula huésped eucariota según la reivindicación 16, y
en el que o en la que dicho gen de interés es una copia funcional
del gen que codifica la distrofina, para la preparación de un
medicamento destinado al tratamiento preventivo o curativo de las
miopatías de Duchenne y Becker.
20. Utilización de un vector adenovírico según
una de las reivindicaciones 1 a 14, de una partícula vírica
infecciosa según la reivindicación 15 o susceptible de ser obtenida
utilizando un procedimiento de preparación según la reivindicación
17, o de una célula huésped eucariota según la reivindicación 16,
en el que o en la que dicho gen de interés codifica un producto
citotóxico, para la preparación de un medicamento destinado al
tratamiento de cánceres, siendo seleccionado dicho producto
citotóxico de entre: timidina quinasa del virus del herpes simple
(TK-HSV-1), ricina, toxina colérica
o diftérica, el producto de expresión de los genes de levadura
FCY1 y FUR1 que codifican la uracilo fosforribosil
transferasa y la citosina desaminasa, el producto de expresión del
gen supresor de tumores p53, Rb o p73.
21. Utilización de un vector adenovírico según
una de las reivindicaciones 1 a 14, de una partícula vírica
infecciosa según la reivindicación 15 o susceptible de ser obtenida
utilizando un procedimiento de preparación según la reivindicación
17, o de una célula huésped eucariota según la reivindicación 16,
en el que o en la que dicho gen de interés codifica un antígeno
asociado a un tumor, eventualmente en combinación con un gen que
codifica una citoquina, para la preparación de un medicamento
destinado al tratamiento de cánceres, siendo seleccionado dicho
antígeno de entre MUC-1, BRCA-1, los
antígenos precoces o tardíos E6, E7, L1 y L2 de un virus de
papiloma HPV.
22. Utilización de un vector adenovírico según
una de las reivindicaciones 1 a 14, de una partícula vírica
infecciosa según la reivindicación 15 o susceptible de ser obtenida
utilizando un procedimiento de preparación según la reivindicación
17, o de una célula huésped eucariota según la reivindicación 16,
en el que o en la que dicho gen de interés codifica la
IL-2, para la preparación de un medicamento
destinado al tratamiento de cánceres.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9706757A FR2763959A1 (fr) | 1997-06-02 | 1997-06-02 | Nouveaux vecteurs adenoviraux recombinants comprenant une sequence d'epissage |
| FR9706757 | 1997-06-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2232950T3 true ES2232950T3 (es) | 2005-06-01 |
Family
ID=9507493
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98928412T Expired - Lifetime ES2232950T3 (es) | 1997-06-02 | 1998-06-02 | Vectores adenoviricos recombinantes que comprenden una secuencia de empalme. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6399587B1 (es) |
| EP (1) | EP0988391B1 (es) |
| JP (1) | JP4386971B2 (es) |
| AT (1) | ATE284969T1 (es) |
| AU (1) | AU753809B2 (es) |
| CA (1) | CA2292792C (es) |
| DE (1) | DE69828167T2 (es) |
| DK (1) | DK0988391T3 (es) |
| ES (1) | ES2232950T3 (es) |
| FR (1) | FR2763959A1 (es) |
| PT (1) | PT988391E (es) |
| WO (1) | WO1998055639A2 (es) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2162497A1 (en) | 1993-06-10 | 1994-12-22 | Sheila Connelly | Adenoviral vectors for treatment of hemophilia |
| IL126757A0 (en) * | 1998-09-07 | 1999-08-17 | Yissum Res Dev Co | Regulation of gene expression through manipulation of mRNA splicing and its uses |
| EP1038959A1 (en) | 1999-03-17 | 2000-09-27 | Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Factor VIII without B-domain, comprising one or more insertions of a truncated intron I of factor IX |
| EP1048726B1 (en) * | 1999-04-27 | 2006-07-26 | Négrier, Claude | Modified factor VIII cDNA |
| EP1048736A1 (en) * | 1999-04-27 | 2000-11-02 | Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung | DNA-construct for the tissue specific expression of a blood coagulation factor |
| AU6280600A (en) * | 1999-08-06 | 2001-03-05 | Develogen Aktiengesellschaft Fur Entwicklungsbiologische Forschung | Non-human adenoviral vector for gene transfer, its use and the production thereof |
| CA2415347A1 (en) * | 2000-07-14 | 2002-01-24 | University Of Saskatchewan | Adenovirus vectors comprising introns |
| EP1233064A1 (en) | 2001-02-09 | 2002-08-21 | Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Modified factor VIII cDNA and its use for the production of factor VIII |
| US20030026783A1 (en) * | 2001-08-03 | 2003-02-06 | Amine Abina | Method of modulating neutralizing antibodies formation in mammals, and uses thereof in gene therapy, animal transgenesis and in functional inactivation of an endogenous proteins |
| EP1284290A1 (en) * | 2001-08-08 | 2003-02-19 | Aventis Behring GmbH | Increase of the expression levels of factor VIII by insertion of spliceable nucleotide sequences into factor VIII cDNA |
| EP1283263A1 (en) * | 2001-08-08 | 2003-02-12 | Aventis Behring GmbH | Modified cDNA for high expression levels of factor VIII and its derivatives |
| ITMI20012110A1 (it) * | 2001-10-12 | 2003-04-12 | Keryos Spa | Vettori multi-cistronici utilizzabili in protocolli di trsferimento genico |
| WO2003057709A2 (en) * | 2001-10-19 | 2003-07-17 | Sirna Therapeutics, Inc | Method and reagent for the detection of proteins and peptides |
| DK1648931T3 (da) | 2003-07-21 | 2011-03-07 | Transgene Sa | Multifunktionelle cytokiner |
| ES2371175T3 (es) * | 2004-10-14 | 2011-12-28 | Crucell Holland B.V. | Vacunas de sensibilización/refuerzo de malaria. |
| US20090110695A1 (en) * | 2006-03-27 | 2009-04-30 | Menzo Jans Emko Havenga | Compositions Comprising a Recombinant Adenovirus and an Adjuvant |
| JP6430949B2 (ja) | 2012-10-23 | 2018-11-28 | エモリー ユニバーシティ | Ｇｍ−ｃｓｆとｉｌ−４のコンジュゲート、組成物、ならびにそれに関連する方法 |
| CA2909733C (en) * | 2013-04-18 | 2023-10-17 | Fondazione Telethon | Effective delivery of large genes by dual aav vectors |
| KR102252423B1 (ko) * | 2019-02-22 | 2021-05-13 | 알지노믹스 주식회사 | 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5518913A (en) * | 1991-10-10 | 1996-05-21 | National Research Council Of Canada | High level recombinant protein production using conditional helper-free adenovirus vector |
| AU680459B2 (en) * | 1992-12-03 | 1997-07-31 | Genzyme Corporation | Gene therapy for cystic fibrosis |
| JPH08512220A (ja) | 1993-04-23 | 1996-12-24 | ヨハンソン、オーヴェ | 使い捨て防水カバー |
| CA2162497A1 (en) * | 1993-06-10 | 1994-12-22 | Sheila Connelly | Adenoviral vectors for treatment of hemophilia |
| WO1995016772A1 (en) * | 1993-12-14 | 1995-06-22 | Cornell Research Foundation, Inc. | Adenovirus gene expression system |
| JP3770333B2 (ja) * | 1995-03-15 | 2006-04-26 | 大日本住友製薬株式会社 | 組換えｄｎａウイルスおよびその製造方法 |
| DE69628744D1 (de) * | 1995-04-17 | 2003-07-24 | Univ Texas System Austin Board | Adenovirus helfervirus system |
| FR2737222B1 (fr) * | 1995-07-24 | 1997-10-17 | Transgene Sa | Nouveaux vecteurs viraux et lignee pour la therapie genique |
-
1997
- 1997-06-02 FR FR9706757A patent/FR2763959A1/fr not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-06-02 JP JP50171699A patent/JP4386971B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-02 ES ES98928412T patent/ES2232950T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-02 US US09/445,093 patent/US6399587B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-06-02 CA CA2292792A patent/CA2292792C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1998-06-02 AU AU80247/98A patent/AU753809B2/en not_active Ceased
- 1998-06-02 DK DK98928412T patent/DK0988391T3/da active
- 1998-06-02 EP EP98928412A patent/EP0988391B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-02 WO PCT/FR1998/001105 patent/WO1998055639A2/fr not_active Ceased
- 1998-06-02 PT PT98928412T patent/PT988391E/pt unknown
- 1998-06-02 DE DE69828167T patent/DE69828167T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-02 AT AT98928412T patent/ATE284969T1/de active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0988391T3 (da) | 2005-07-25 |
| EP0988391B1 (fr) | 2004-12-15 |
| ATE284969T1 (de) | 2005-01-15 |
| AU8024798A (en) | 1998-12-21 |
| JP4386971B2 (ja) | 2009-12-16 |
| CA2292792A1 (fr) | 1998-12-10 |
| CA2292792C (fr) | 2010-03-30 |
| FR2763959A1 (fr) | 1998-12-04 |
| JP2002511751A (ja) | 2002-04-16 |
| DE69828167D1 (de) | 2005-01-20 |
| PT988391E (pt) | 2005-05-31 |
| WO1998055639A3 (fr) | 1999-03-04 |
| AU753809B2 (en) | 2002-10-31 |
| DE69828167T2 (de) | 2005-12-22 |
| EP0988391A2 (fr) | 2000-03-29 |
| US6399587B1 (en) | 2002-06-04 |
| WO1998055639A2 (fr) | 1998-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2232950T3 (es) | Vectores adenoviricos recombinantes que comprenden una secuencia de empalme. | |
| RU2361611C2 (ru) | Конструирование рекомбинанта онколитического аденовируса, специфически экспрессирующего иммуномодуляторный фактор gm-csf в опухолевых клетках, и его применение | |
| ES2150595T5 (es) | Procedimiento de preparacion de un vector viral de por lo menos 20 kb por recombinacion homologa intermolecular en una celula procariota. | |
| ES2210081T3 (es) | Utilizacion de los marcos de lectura de la region e4 para la mejora de la expresion de genes. | |
| CA2173975C (en) | Recombinant adenoviral vector and methods of use | |
| ES2246533T3 (es) | Fibra adenovirica modificada y adenovirus dianas. | |
| US7041284B2 (en) | Recombinant adenoviral vector and method of use | |
| ES2230820T3 (es) | Procedimiento de inactivacion de virus envueltos en una preparacion virica de adenovirus. | |
| US20030104624A1 (en) | Novel vector constructs | |
| US20060034804A1 (en) | Adenoviral vectors having a protein IX deletion | |
| ES2239841T3 (es) | Vectores adenovirales quimericos. | |
| ES2249773T3 (es) | Nuevo implante y nuevo vector para el tratamiento de enfermedades adquiridas. | |
| US20030091534A1 (en) | Adenoviral vectors having a protein IX deletion | |
| ES2325303T3 (es) | Vectores adenoviricos lanzadera con e1b suprimida. | |
| WO1996036365A1 (en) | Gene therapy of hepatocellular carcinoma through cancer-specific gene expression | |
| US20020137212A1 (en) | Adenoviral vectors having a protein IX deletion | |
| US20060171925A1 (en) | Adenoviral vectors having a protein IX deletion |