ES2210251T3

ES2210251T3 - Promotor vegetal, microorganismos y celulas vegetales que contienen una unidad de expresion de una proteina de interes que comprende el indicado promotor.

Info

Publication number: ES2210251T3
Application number: ES94911205T
Authority: ES
Inventors: Yves Marco; Dominique Roby; Michel Schneider; Alain Toppan
Original assignee: Biogemma SAS
Current assignee: Biogemma SAS
Priority date: 1993-03-23
Filing date: 1994-03-23
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2014-03-23
Also published as: DE69433238D1; DE69433238T2; FR2703054A1; WO1994021793A1; AU6378994A; FR2703054B1; EP0689595B1; EP0689595A1; ATE252152T1; US5792932A

Abstract

LAPRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROMOTOR VEGETAL QUE COMPRENDE LA SECUENCIA (B) [SEQ ID NO:] O UNA SECUENCIA QUE PRESENTA UN GRADO DE HOMOLOGIA ELEVADA CON LA SECUENCIA (B). APLICACION: PROTECCION DE LOS VEGETALES POR INGENIERIA GENETICA Y PARTICULARMENTE DEFENSA DE LAS PLANTAS EN ESTADO DE STRESS.

Description

Promotor vegetal, microorganismos y células vegetales que contienen una unidad de expresión de una proteína de interés que comprende el indicado promotor.

La presente invención tiene por objeto un nuevo promotor vegetal y los microorganismos y células vegetales que contienen una unidad de expresión de una proteína de interés que comprende dicho promotor. El promotor según la invención es un promotor constitutivo fuerte que permite la expresión de dicha proteína en los microorganismos y las células vegetales, cualquiera que sea el estado de desarrollo del vegetal.

Además, el promotor según la invención halla una aplicación particular en el campo de la protección de los vegetales por ingeniería genética y, en particular, en el de la defensa de las plantas en estado de estrés.

En el transcurso de los últimos años, las aplicaciones de la transformación de los vegetales se han multiplicado. Se han aislado y transferido después a plantas numerosos genes de origen procarionte o eucarionte (animal o vegetal) codificantes especialmente de proteínas que confieren al expresarse un carácter agronómico nuevo.

En muchos casos, los genes introducidos por ingeniería genética en plantas son quiméricos, asociando elementos de regulación de diferentes orígenes. Es así que muy frecuentemente el gen codificante de una proteína de interés está bajo el control de un promotor constitutivo fuerte que permite una expresión de dicha proteína en toda la planta (o en la mayor parte de ésta) durante toda su vida, cualquiera que sea el estado de desarrollo. El promotor del transcripto 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S CaMV), el más utilizado en las construcciones de genes quiméricos, corresponde a esta descripción).

Ahora bien, para un cierto número de aplicaciones, no es necesario que el gen codificante de la proteína de interés, soporte del carácter agronómico, tenga una expresión continua o repartida en toda la planta. Tales características pueden incluso en ciertos casos disminuir o anular los efectos benéficos del gen transferido. En efecto, la expresión continua a un elevado nivel de una proteína puede desviar una parte del metabolismo hacia esta expresión y finalmente eliminar parte del rendimiento.

Muy pronto se inició la búsqueda de una expresión génica más específica; ésta llevó, por ejemplo, a aislar promotores específicos de tejidos o de órganos.

Puede ser interesante inducir la expresión de un gen dado únicamente en una situación precisa, o mejor aún asegurar un nivel de expresión basal a lo largo de toda la vida de un vegetal, permitiendo al mismo tiempo la sobreexpresión del gen en una situación dada.

Se han descrito ya varios promotores inducibles, algunos de los cuales responden a la vez a la infección por microorganismos patógenos y a compuestos químicos u hormonas vegetales, como el etileno (Roby y col., 1990, Plant Cell 2, 999) o la auxina.

Un promotor vegetal aislado del tabaco fue descrito por Takahashi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 8013-8016,

Estos autores, en otra publicación, precisan que este promotor no reacciona específicamente más que con auxinas y no con otras hormonas o con el estrés (Takahashi y col., The Plant Journal, 1991, 1(3), 327-332).

La presente invención tiene por objeto un promotor, que se expresa a un nivel mantenido en los diferentes órganos y tejidos de un vegetal y, en particular, en las raíces y el meristemo de una planta, y que es muy fuertemente inducible en las situaciones de estrés, tales como, especialmente, después de un choque térmico, una herida, un choque hormonal, un estimulador biótico o abiótico o una infección bacteriana, fúngica o vírica.

La invención se relaciona también con las células vegetales, a excepción de las células vegetales presentes en el estado natural, los microorganismos (bacterias) y las células de microorganismos que han integrado una unidad de expresión de una proteína de interés, cuya unidad incluye el promotor según la invención.

También tiene por objeto los vegetales o partes de vegetales, así como las semillas, que contienen las células vegetales de la invención.

Por último, se relaciona también con la utilización de un vegetal o de una parte de un vegetal antes citado para seleccionar moléculas con actividad fitosanitaria susceptibles de inducir reacciones de defensa natural de los vegetales contra las agresiones de organismos fitopatógenos o fitófagos (hongos, bacterias, virus, insectos y nemátodos).

El promotor según la invención comprende la secuencia de ADN (B) [SEC ID Nº: 4] o una secuencia que presenta un grado de homología de al menos un 80% con respecto a la secuencia (B).

Según una variante, el promotor según la invención contiene, aguas arriba de la secuencia (B), una secuencia (C) [SEC ID Nº: 5] o una secuencia que presenta un grado de homología elevado con la secuencia (C).

Por último, según una variante preferida de la invención, el promotor de la invención contiene, aguas arriba de la secuencia (B), una secuencia (D) [SEC ID Nº: 6] o una secuencia que presenta un grado de homología elevado con la secuencia (D).

Un grado de homología elevado significa aquí una homología (relación entre los nucleótidos idénticos y el número total de nucleótidos) de al menos un 70%, preferiblemente de al menos un 80%, de las secuencias de nucleótidos, cuando están alineadas según la homología máxima, según el método de alineación óptimo de las secuencias de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48, 443-453. Este método es especialmente utilizado en el programa UWGCG de la Universidad Wisconsin: Devereux y col., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 387-395 - opción GAP.

Los elementos necesarios para el funcionamiento de este promotor y para la expresión de sus características (factores transactivadores, etc.) están presentes en otros vegetales, dicotiledóneas o monocotiledóneas. Su presencia permite, pues, la utilización de este promotor en numerosos vegetales cultivados, tales como especialmente plantas (tabaco, patata, tomate, maíz, girasol, cebada y colza) u otros vegetales, tales como levaduras y hongos.

Todas las secuencias de ADN codificantes de las proteínas de interés pueden ser puestas bajo el control del promotor según la invención, en particular secuencias codificantes de las proteínas que permiten asegurar la protección de un vegetal, por ejemplo una planta, contra las infecciones víricas, bacterianas o fúngicas y contra los otros estados de estrés. A modo de ejemplo de tales proteínas, se pueden citar, en particular, las endoquitinasas del tomate-tabaco, tales como la descrita en EP-A-493.581, cuya secuencia codificante es [SEC ID Nº: 16].

El promotor según la invención fue obtenido por selección de un banco genómico de tabaco con ayuda de una sonda de ADN que tiene la secuencia [SEC ID Nº: 1].

Se obtuvo un clon correspondiente a la secuencia [SEC ID Nº: 1] por estudio diferencial de clones de ADNc procedentes de ARNm poli(A)^{+}, específicamente sintetizados en el curso de la infección de hojas de tabaco Nicotiana tabacum por la cepa de Pseudomonas solanacearum GMI 1000. Esta cepa bacteriana es bien conocida por provocar una reacción de hipersensibilidad en el tabaco de la variedad Bottom spécial. A este efecto, se puede hacer referencia al trabajo de Message y col., 1978, Proc. 4^{th} Intl. Conf. of Plant Pathogenic Bacteria, pp. 823-833. El clon que contiene la secuencia [SEC ID Nº: 1] será denominado a continuación "clon 246".

El clon 246 ha permitido después, por selección de un banco genómico de tabaco, aislar un clon, denominado a continuación clon 246 C [SEC ID Nº: 7], que contiene la secuencia de ADN (D) [SEC ID Nº: 6], la secuencia de ADN (C) [SEC ID Nº: 5], la secuencia de ADN (B) [SEC ID Nº: 4] y una secuencia que encierra 2 marcos abiertos de lectura separados por un intrón.

Por asociación del promotor (secuencias B+C+D) con el gen de la \beta-glucuronidasa, se obtuvo, según el modo operativo descrito en la sección 9 a continuación, el vector de expresión pSG 123. El promotor constituido por las secuencias B+C+D es denominado promotor 246C.

El vector de expresión pSG 123 fue utilizado para estudiar la expresión transitoria en protoplastos de tabaco del gen de la glucuronidasa, estando dichos protoplastos en situación de estrés, ya sea por infección con Pseudomonas solanacearum, ya sea por tratamiento con ayuda de un estimulador o de una hormona.

A partir del vector de expresión pSG 123, se preparó, según el modo operativo descrito en la sección 13, un vector de expresión estable en células vegetales, el vector binario pSG 246.

Este vector binario pSG 246 fue transferido a células de Agrobacterium tumefaciens o de Agrobacterium rhizogenes, las cuales fueron utilizadas después para obtener plantas transgénicas de tabaco, de colza y de girasol. Para la transformación de los tejidos de monocotiledóneas (cebada y maíz), se utilizó el vector de expresión pSG 123. Se estudió el comportamiento de estas plantas o tejidos en estado de estrés.

El promotor según la invención, que comprende la secuencia (B), (C) y (D), fue también asociado al gen codificante de la quitinasa de tomate-tabaco. Se utilizaron los genes quiméricos resultantes para transformar células de Agrobacterium.

Se puede sintetizar fácilmente la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 1] según las técnicas conocidas por los expertos en este campo (L.J. Mac PRIDE y H.M. CARUTHURS, Tetrahedron Letters (1983), vol. 24: 245).

El estudio de las plantas transgénicas obtenidas por transformación de plantas con ayuda de células de Agrobacterium obtenidas anteriormente ha permitido evidenciar la actividad promotora basal del promotor según la invención, así como la sobreexpresión de las proteínas de interés (\beta-glucuronidasa y quitinasa) en situaciones de estrés.

Los resultados que figuran en la parte ilustrativa que se dará a continuación muestran claramente que el promotor según la invención tiene una actividad promotora basal fuertemente aumentada cuando se ponen las plantas transgénicas que contienen este promotor y un gen codificante de una proteína de interés en condiciones de estrés: choque térmico, heridas, infecciones por patógenos (hongos, bacterias) y estimuladores (bióticos y abióticos).

Por diferentes deleciones del plásmido pSG 123, efectuadas en la región 5' del promotor mediante enzimas de restricción y/o nucleasa Exo3, se han evidenciado los vectores pSG 251 y pSG 33, cuyas secuencias son respectivamente la secuencia (B) (pSG 33) [SEC ID Nº: 4] o la secuencia (B) que lleva aguas arriba la secuencia (C) (pSG 251) [SEC ID Nº: 5].

La visualización facilitada de la expresión de la glucuronidasa (Jefferson y col., 1987, Plant Molec. Biol. Reporter, 5, 387) o de su autoexpresión en el caso de una inducción del promotor de la invención, permite utilizar plantas que expresan este gen quimérico para la selección de moléculas inductoras.

Las plantas poseen mecanismos de defensa contra las agresiones y, en particular, contra las agresiones parasitarias (hongos, bacterias, virus o insectos): estos mecanismos que dependen del fenómeno de inducción son poco conocidos y ponen con frecuencia en marcha tardíamente para ser eficaces. Su puesta en marcha precoz (Roby y col., 1988, Physiol. Molec. Plant Pathol., 33, 409) especialmente por compuestos de tipo estimulador en reacciones en cascada permite a la planta resistir a las agresiones.

Se han puesto ya en marcha fungicidas de segunda generación, activos sobre las defensas de la planta e inactivos sobre el parásito.

Las plantas que expresan la glucuronidasa, bajo el control del promotor de la invención, inducido precoz y específicamente por una reacción de hipersensibilidad a una infección bacteriana, constituyen una herramienta de elección para seleccionar moléculas capaces de inducir la expresión o la sobreexpresión del gen de defensa.

La invención será mejor comprendida con ayuda de la siguiente exposición, dividida en secciones, que incluye resultados experimentales y una discusión de éstos. Algunas de estas secciones se relacionan con experiencias efectuadas con el fin de llevar a la práctica la invención, otras con ejemplos de realización de la invención, dadas, por supuesto, a título meramente ilustrativo.

Una gran parte del conjunto de las técnicas siguientes, bien conocidas para los expertos en esta área, está expuesta con detalle en la obra de Sambrook y col.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", publicada en 1989 por las ediciones Cold Spring Harbor Press en Nueva York (2ª edición).

El material biológico (cepas, fagos, plásmidos o plantas) utilizado en las secciones siguientes está disponible comercialmente y/o se describe respectivamente en los documentos siguientes:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 - vector binario pBIN 19: \+  \begin{minipage}[t]{100mm} BEVAN
y col., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711-8721;
obtenido de Clontech (Palo Alto, California,
EE.UU.)\end{minipage} \cr \+\cr  - vector 101.3: \+
 \begin{minipage}[t]{100mm} JEFFERSON, 1987, Plant Molec.  Biol.
Reporter 5, 387-405, obtenido de Clontech
\end{minipage} \cr \+\cr  - vector pBI 221: \+
 \hskip5cm  ''\cr \+\cr  - vector pBI 121: \+
 \hskip5cm  ''\cr \+\cr  - cepa  Pseudomonas
solanacearum : \+ MESSAGE y col., 1978,\cr   \hskip2mm 
GMI 1000 \+ Proc. 4 ^{th}  Intl. Conf. of Plant Pathogenic Bacteria,
pp. 823  -  833\cr \+\cr  - cepa  Pseudomonas
solanacearum  \+  \hskip5cm  ''\cr   \hskip2mm 
GMI 1178\+\cr \+\cr  - cepa  Pseudomonas solanacearum  \+
 \hskip5cm  ''\cr   \hskip2mm  K 60\+\cr \+\cr  -
finalizador NOS: \+ finalizador nopalina sintasa\cr \+\cr  - vector
pTZ 19R: \+ obtenido de Pharmacia\cr \+\cr  - cepa  E. coli 
MC1061: \+  \begin{minipage}[t]{100mm} MANIATIS y col., 1982,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New
York, obtenida de Clontech \end{minipage} \cr
\+\cr}

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 - cepa  E. coli  HB101: \+  \hskip5cm  ''\cr \+\cr  -
cepa  Agrobacterium tumefaciens : \+
 \begin{minipage}[t]{100mm} LBA4404, obtenida de Clontech
HOEKEMA y col., 1983, NATURE, 303, 179-180
\end{minipage} \cr \+\cr  - cepa  Agrobacterium
rhizogenes : \+ pRIA _{4} \cr \+\cr  - planta  Nicotiana
tabacum : \+  \begin{minipage}[t]{100mm} variedad Wisconsin
Havana 38: SCHNEIDER M., 1990, Plant Molec. Biol., 14,
935-947 \end{minipage} \cr \+\cr  - hongo
 Chalara elegans : \+ RAWLINGS R.E., 1940, Ann. Mo. Bot. Gdn.,
27, 561  -  598\cr \+\cr  - hongo  Alternaria
brassicae : \+ BAINS y TEWARI, 1987, Physiol. Mol. Plant. Pathol.
30: 259\cr \+\cr  - planta  Nicotiana tabacum : \+ variedad
Paraguay 49, obtenida del Institut du tabac, Bergerac, Francia\cr
\+\cr  - planta  Brassica napus : \+
 \begin{minipage}[t]{100mm} variedades de primavera Brutor y
Wester y variedad de invierno (variedad de selección Rustica
Semences) \end{minipage} \cr \+\cr  - patógeno  Rhizoctonia
solani : \+ ACHARYA y col., 1984, Can. J. Plant Pathol., 6,
325  -  328\cr \+\cr  - plantas de girasol: \+ genotipo
2603B (variedad de selección Rustica Semences)\cr \+\cr  - maíz: \+
variedad LH 132\cr \+\cr  - cebada: \+
 \begin{minipage}[t]{100mm} variedad GERBEL, obtenida del
Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), París, Francia
\end{minipage} \cr}

- Las cepas GMI 1000 y K 60 pueden ser obtenidas de la Collection Nationale des Bactéries Phytopathogènes (CNBP) INRA, Pathologie Végétal, Rue Georges MOREL, 49070 BEAUCOUZE, FRANCIA.

- La cepa GMI 1178 puede ser obtenida del INRA, Pathologie Végétale, Chemin de Borde-Rouge AUZEVILLE BP 27, 31326 CASTANET TOLOSAN Cédex, FRANCIA.

Se utilizan las abreviaturas siguientes en los ejemplos que se dan a continuación:

32P-dCTP: 5'-^{32}P-trifosfato de desoxicitidina, comercializado por AMERSHAM bajo la referencia 10205.

2 SSC: NaCl 0,3 M, citrato trisódico 30 mM, pH 7,0 (descrito por MANIATIS y col., antes citado).

SDS: dodecilsulfato de sodio.

FPLC: cromatografía líquida rápida de proteínas.

PVDF: difluoruro de polivinilideno.

EDTA: ácido etilendiaminatetraacético.

DEPC: pirocarbonato de dietilo.

NAD: nicotinamida adenina dinucleótido.

La descripción que se dará a continuación será mejor comprendida haciendo referencia a las figuras 1 a 3.

La figura 1 representa la cartografía del clon de ADN genómico 246C, establecida con ayuda de las enzimas de restricción representadas.

La figura 2 representa la alineación según el método de alineación óptima de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48, 443-453, llevado a la práctica por el programa UWGCG de la Universidad de Wisconsin (Devereux y col., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 387-395), opción GAP, de la parte 3' de 700 pb del promotor del gen 246C y del promotor descrito por Takahashi y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8013.

La figura 3 representa los diferentes vectores de expresión estudiados que llevan, con respecto al plásmido de longitud total pSG123, una deleción variable de la parte 5' del promotor.

Sección 1

Infección del tabaco, Nicotiana tabacum, por dos cepas de la bacteria patógena Pseudomonas solanacearum

Las bacterias de la cepa de Pseudomonas solanacearum son cultivadas durante 72 h en medio BG agar (Boucher y col., 1985, J. Gen Microbiol 131, 2449); se toma una colonia para sembrar 40 ml del mismo medio. Después de 16 a 24 h de incubación a 28ºC, se centrifuga la suspensión bacteriana durante 10 min. a 6.000 g y 4ºC; se elimina el sobrenadante conservando la capa de polisacáridos presente en la superficie de la pella. Después de un lavado con agua estéril, se vuelven a suspender las bacterias en 20 ml de agua. Su concentración es entonces determinada por densitometría.

Se desprenden de la planta hojas jóvenes de plantas de tabaco, se lavan con agua destilada y se sumergen en un desecador que contiene 1,2 l de suspensión bacteriana a una concentración de 3 x 10^{6} bacterias/ml. Se realiza un vacío durante 10 min. con una trompa de vacío y se detiene luego lentamente. Se coloca entonces cada hoja infiltrada en un recipiente que contiene tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 6,0, y se transfiere a una cámara de cultivo. Se recogen las hojas después de diferentes tiempos de incubación y se conservan a -70ºC.

Se utilizaron dos cepas bacterianas: la cepa GMI 1000, que provoca una reacción de hipersensibilidad en el tabaco de la variedad Bottom Special, y la cepa GMI 1178 (Message y col., 1978, Proc. 4^{th} Intl. Conf. of Plant Pathogenic Bacteria, pp. 823-833), mutante procedente de la cepa anterior y que ha perdido la capacidad de inducir la reacción de hipersensibilidad en el tabaco.

Sección 2

Extracción y aislamiento de los ARN totales de Nicotiana tabacum infectados por las cepas de Pseudomonas solanacearum

Se trituran 10 g de material vegetal en presencia de nitrógeno líquido y se recogen después en una mezcla de 3 ml de fenol, 3 ml de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1, v:v) y 6 ml de tampón de lisis de composición Tris-HCl 200 mM, pH 7,0, EDTA 200 mM, SDS 1%.

Después de agitar en el vórtex, una centrifugación durante 10 min. a 6.000 g y 4ºC permite separar las fases. Se recoge la fase acuosa se vuelve a extraer con 6 ml de mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1, v:v) y luego con 6 ml de fenol. Se añaden 16 ml de etanol absoluto y 400 \mul de acetato de sodio 3M, pH 5,5, a la fase acuosa; se precipita la mezcla durante 2 h a -20ºC. Se disuelve la pella obtenida en 5 ml de agua estéril que contiene un 0,1% de pirocarbonato de dietilo (EDPC) y luego se precipitan los ARN durante 12 h a 4ºC tras la adición de 5 ml de LiCl 4M. Después de centrifugar durante 20 min. a 6.000 g, se lava la pella de ARN con etanol al 75%, se seca y se recoge en 800 \mul de agua destilada estéril que contiene un 0,1% de DEPC. Se precipita la solución durante 2 h a -20ºC tras la adición de 0,1 vol. de acetato de sodio 3M, pH 5,5, y 2,5 vol. de etanol absoluto. Después de centrifugar durante 15 min. a 12.000 g, se lava la pella de ARN con etanol al 75% y se disuelve en 200 \mul de agua destilada que contiene un 0,1% de DEPC.

Se determinan los ARN totales entonces por espectrofotometría a 260 nm.

Sección 3

Preparación de los ARN mensajeros poli(A)^{+}

Se vuelve a suspender 1 g de gel de oligo-d(T)celulosa (Collaborative Research Inc.) en 2 ml de tampón Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl 0,4 M, SDS 0,1%. Se introduce este gel en una pipeta Pasteur cuyo extremo está tapado con lana de vidrio. Se lleva la solución de ARN a 65ºC durante 4 min. y luego se deja enfriar de nuevo lentamente hasta la temperatura ambiente. Se obtiene una concentración final de NaCl 0,4 M por adición de una solución de NaCl 5 M.

Se deposita luego la solución de ARN total sobre el gel de oligo-d(T)celulosa. Se lava éste después con 12 ml aproximadamente de tampón de composición Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,4 M, EDTA 1 mM, SDS 0,5%.

Se eluyen luego los ARN poli(A)^{+} con 7 ml de tampón de composición Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, SDS 0,1% y se precipitan después durante 1 noche a -20ºC tras la adición de 2,5 volúmenes de etanol al 95% y 0,1 volumen de acetato de sodio 3,3 M, pH 5,5. Se lava la pella de ARN poli(A)^{+}, obtenida por centrifugación a 35.000 g durante 1 h, 3 veces con etanol al 75%, se seca, se recoge en 0,5 ml de agua destilada estéril y se somete a una nueva precipitación en las condiciones antes descritas. Tras la centrifugación, se lava después la pella con etanol al 75%, se seca y se disuelve en agua destilada estéril. Se dosifican entonces los ARN poli(A)^{+} por espectrofotometría a 260 nm.

\newpage

Sección 4

Síntesis de ADN de doble cadena a partir de ARN mensajeros poli(A)^{+} aislados de hojas de tabaco infectado por la cepa GMI 1000 de Pseudomonas solanacearum y clonación en E. coli

Se realiza esta síntesis según el método de Gubler y Hoffman (1983, Gene, 25, 263) con ayuda del kit D. Scribe de la Sociedad Genofit (Ginebra, Suiza) y siguiendo las instrucciones del fabricante.

Síntesis de la primera cadena

Se ponen a incubar 2,5 \mug de ARN poli(A)^{+} aislados de hojas de tabaco infectadas por la cepa GMI 1000 de Pseudomonas solanacearum y recogidas 6 h antes de la inoculación a 44ºC durante 30 a 60 min. en presencia de: Tris HCl 40 mM, pH 8,3, NaCl 80 mM, MgCl_{2} 6 mM, DTT 5 mM, dATP 0,5 mM, dTTP 0,5 mM, dGTP 0,5 mM, dCTP 0,5 mM, 1,5 \mug de oligo d (pT) 12-18 y 10 a 15 unidades de transcriptasa inversa de AMV (virus de la mieloblastosis aviar) en un volumen total de 25 \mul.

Síntesis de la segunda cadena

Se diluye el medio de reacción procedente de la síntesis de la primera cadena a 100 \mul con ayuda del tampón de composición Tris HCl 40 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, NaCl 80 mM; se añaden 2 unidades de ARNasa H y se incuba la mezcla a 37ºC durante 5 min.

Después de enfriar hasta 12ºC, se añaden 25 unidades de ADN polimerasa I, 0,5 unidades Weiss de ligasa de E. coli y NAD en una concentración final de 0,1 mM.

Tras una incubación de 60 min. a 12ºC y luego de 60 min. a 18ºC, se detiene la reacción por adición de EDTA y de SDS en concentraciones finales de 20 mM y del 1%, respectivamente, seguido de un calentamiento de 2 min. a 60ºC.

Purificación del ADNc

Se realiza ésta por cromatografía en columna de Sephadex G100, en tapón Tris HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM. La adición de alfa 32P dCTP en la etapa de síntesis permite marcar más fácilmente las fracciones procedentes de la cromatografía que contienen el ADN de doble hebra. Éste precipita por adición de acetato de amonio (concentración final 0,3 M) y de 2,5 vol. de etanol absoluto.

Digestión con nucleasa S1

Se lava el precipitado obtenido con etanol al 75%, se seca y se recoge en agua estéril. Se trata el ADNc luego con nucleasa S1 en un volumen total de 300 \mul a 30ºC durante 10 min. en presencia de 20 U de enzima en tampón de composición acetato de sodio 30 mM, pH 4,4, NaCl 0,25 M, ZnCl_{2} 1 mM.

Al finalizar la reacción, se extrae la mezcla una vez con una mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (50-48-2, v:v) y luego tres veces con éter etílico, antes de someterla a una precipitación con etanol.

Se seca luego el precipitado de ADN obtenido tras la centrifugación y se recoge en 20 \mul de agua estéril.

Adición en 3' de una terminación poli dC (dC tailing)

Se añaden a la solución de ADNc sucesivamente 10 \mul de tampón de transferasa terminal de composición cacodilato de potasio 70 mM, pH 7,2, CoCl_{2} 0,5 mM, ditiotreitol 0,5 mM, 2 \mul de \alpha-dCTP 0,25 mM, 5 \mul de \alpha-32P dCTP (370 MBq/ml), 12 \mul de H_{2}O y 1,2 \mul de transferasa terminal (18 unidades).

La reacción de "tailing" es llevada a cabo por incubación a 37ºC durante 30 min. y luego se detiene por adición de 30 \mul de EDTA 0,25 M, pH 8,0.

Purificación tras el tailing de los ADNc de doble cadena

Se precipita la mezcla resultante del dC tailing con etanol y se centrifuga después. Se recoge la pella de ADNc en 10 \mul de tampón de composición Tris HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 5% de glicerol, 0,02% de azul de bromofenol. Se deposita esta solución en una columna de Biogel A 0,5 M (1 ml de soporte). La elución de la columna es realizada con un tampón de composición Tris HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM; se recogen fracciones, se mide su radiactividad y se analiza el tamaño de los ADN que contienen por electroforesis en gel de agarosa. Se reúnen las fracciones que contienen ADNc de tamaño superior a 500 pares de bases y se precipita el ADNc con etanol.

\newpage

Hibridación con pBR 322-dG

Se disuelve de nuevo el ADNc recogido tras la precipitación en 500 \mul de tampón de circularización de composición Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM. Se añaden 4 \mul de solución de pBR 322-dG (21 ng, Clontech) y 46 \mul de agua.

Después de incubar durante 15 min. a 65ºC y luego durante 2 h a 57ºC, se controla la hibridación por electroforesis en gel de agarosa.

Se inserta el ADNc de doble hebra obtenido en el sitio PstI del plásmido pBR 322. Tras la ligación, se utiliza el ADN obtenido para transformar células competentes de la cepa E. coli HB101. Se obtienen colonias de bacterias recombinantes tras extensión y cultivo en placa de Petri de las células competentes transformadas.

Sección 5

Selección por estudio diferencial de clones de ADNc obtenidos de ARNm poli(A)^{+} específicamente sintetizados en el curso de la infección bacteriana por la cepa de Pseudomonas solanacearum GMI 1000

Se transfirió el ADN de las colonias bacterianas recombinantes obtenidas por clonación de ADNc sintetizado a partir de ARN mensajeros poli(A)^{+} de hojas de tabaco infectadas por la cepa GMI 1000 a una membrana de nilón Biodyne (Pall Corporation, EE.UU.) siguiendo las indicaciones del fabricante. Estos ADN son hibridados sucesivamente con 2 sondas radiactivas obtenidas por síntesis de ADNc, en presencia de alfa-32P dCTP, a partir de ARN mensajeros purificados de plantas infectadas con las cepas GMI 1000 y GMI 1178, respectivamente.

Después del lavado y de la exposición autorradiográfica de las membranas, se seleccionan las colonias bacterianas que presentan una señal de hibridación más fuerte con la sonda sintetizada a partir de hojas inoculadas con la cepa GMI 1000. Se prepara el ADN plasmídico de estas colonias, se aíslan los insertos de ADNc de estos plásmidos, se marcan después con alfa-32-dCTP y se utilizan como sonda para revelar según técnica de dot-blot y luego de Northern blot las cantidades equivalentes de ARNm correspondiente purificado a partir del ARN total de hojas de tabaco inoculadas con la cepa GMI 1000 ó GMI 1178.

Se conservan las colonias cuyo inserto utilizado como sonda da una señal más intensa en el revelado de los ARN totales purificados a partir de hojas de tabaco inoculadas con la cepa GMI 1000.

Sección 6

Caracterización de un clon de ADNc procedente de un ARNm específicamente sintetizado en el curso de la infección bacteriana por la cepa de Pseudomonas solanacearum GMI 1000

Se aislaron 14 clones bacterianos a partir del banco de ADNc construido a partir de ARN mensajeros de hojas de tabaco infectadas por la cepa de Pseudomonas solanacearum GMI 1000.

Entre éstos, un clon denominado 246, que presenta una longitud de inserto de 750 pares de bases permite revelar por Northern blot un transcripto de 800 nucleótidos aproximadamente. La acumulación de este transcripto comienza 4 a 9 h después de la inoculación y alcanza un máximo entre las 12 y las 15 h. En las hojas de tabaco infectadas por la cepa GMI 1178, se observa una ligera acumulación del transcripto entre las 12 y las 15 h.

El estudio de la secuencia del ADNc del clon 246 [SEC ID Nº: 1] pone en evidencia la existencia de un primer marco abierto de lectura incompleto, codificante de un péptido de 59 aminoácidos, y de un segundo marco potencial codificante de un péptido de 88 aminoácidos. La secuencia de estos dos péptidos está representada por [SEC ID Nº: 2]. Entre estos dos marcos de lectura, están presentes secuencias consenso de unión de un intrón (Brown, 1986, Nucl. Ac. Res., 14, 9549). Ha habido, pues, probablemente una clonación de un ADNc a partir de un ARN mensajero inmaduro. La secuencia de ADNc del clon 246 sin el intrón es la secuencia A_{1} [SEC ID Nº: 3].

Sección 7

Selección de un banco genómico de tabaco con ayuda del ADNc caracterizado

Se obtuvo un banco genómico de ADN de tabaco por digestión parcial con la enzima MboI de ADN aislado de la germinación de Nicotiana tabacum variedad NK 326 y clonación de los fragmentos de restricción en el fago EMBL-3 (Clontech). Se seleccionaron 500.000 fagos recombinantes después de la extensión a razón de 10.000 fagos por placa de Petri según la técnica conocida para el experto en este campo y descrita en Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Se transfiere el ADN fágico a una membrana de nitrocelulosa (BA 85 Schleicher y Schüll), se desnaturaliza durante 2 min. en una solución de NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M, y se empapa luego en una solución de neutralización de NaCl 1,5 M, Tris HCl 0,5 M, pH 7,4, durante 5 min. Después de un lavado rápido en 2 SSC (NaCl 0,3 M, citrato de sodio 30 mM), se secan los filtros durante 30 min. a 37ºC y se fija luego el ADN mediante tratamiento a 80ºC a vacío durante 1 h 30 min.

Se prehibridan luego las membranas durante 4 h a 37ºC en un tampón de composición 5 SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 75 mM), 50% de formamida, 0,3% de leche descremada.

Se lleva a cabo la hibridación en el mismo tampón durante 18 h a 37ºC tras la adición de la sonda marcada con alfa-32P-dCTP, constituida por el inserto de 750 pares de bases del colon de ADNc 246.

Se lavan luego las membranas 3 veces durante 20 min. a 37ºC en una solución de 5 SSC, SDS 0,1%, luego 2 veces durante 30 min. a 37ºC en una solución de 2 SSC, SDS 0,1%, y finalmente durante 30 min. a 42ºC en una solución de 2 SSC, SDS 0,1%; se autorradiografían después.

Tras el revelado de los autorradiogramas, se aísla cada placa de lisis que presenta una señal positiva, se eluyen los fagos en medio SM (NaCl 100 mM, Tris HCl 50 mM, pH 7,5, MgSO4 5 mM, gelatina 0,01%) y se purifican luego por una nueva criba en las mismas condiciones.

Se aislaron así y purificaron 12 clones. Se produjo y purificó el ADN de cada clon según la técnica bien conocida para el experto en este campo y se digirió luego con la enzima SalI, que permite aislar, tras electroforesis en gel de agarosa, el inserto de ADN genómico.

La transferencia a membrana de nilón, seguida de hibridación con la sonda constituida por el ADNc del clon 246, muestra una señal positiva, lo que confirma la presencia en este ADN genómico de una secuencia complementaria del ADNc 246.

Estos clones fueron luego cartografiados utilizando una serie de enzimas de restricción. Se retuvo un clon entre éstos, el cual presenta una señal de hibridación en la región central del fragmento insertado en el ADN fágico. Este clon fue denominado 246C.

Sección 8

Secuenciación y análisis de la secuencia del clon de ADN genómico 246C

Se aisló un fragmento del inserto contenido en este fago por digestión con la enzima SstI y se clonó después en el fago pBluescript® 11 KS +/- Stragagène), obteniéndose el fagémido pKS246. Se estableció su cartografía, que se presenta en la Figura 1. Se determinó después la secuencia de este inserto [SEC ID Nº: 7] por el método de Sanger y col. (PNAS-USA, 14, 5463, 1977) tras la creación de deleciones progresivas con enzimas Exo III, mungo y nucleasa S1 según la técnica de Henikoff (Gene, 28, 351, 1984).

Este inserto, denominado genes 246C, de 3046 pares de bases, está constituido por una región codificante de 853 pb iniciada en un ATG en posición 2146 y acabada en un codon TGA en posición 2998; esta región está entrecortada por un intrón que comienza en la posición 2464 y que termina en la posición 2653. Se determinaron tres sitios potenciales de iniciación de la transcripción por extensión de cebo según la técnica descrita por Sambrook y col. (antes citado, 1989); el sitio más probable está en posición 2068.

La región promotora del gen 246C aguas arriba de la posición 2146 es denominada promotor 246C. El estudio de la secuencia del promotor 246C muestra la presencia de varios motivos conocidos por estar implicados en la regulación de los genes.

Están presentes dos secuencias consenso CAAT correspondientes a este elemento regulador de la transcripción de los genes eucariotas, así como una secuencia complementaria e inversa ATTG, en las posiciones 2051, 2101 y 1967.

Dos secuencias consenso TATAA están presentes en las posiciones 2089 y 2111, así como una secuencia complementaria AATAT en la posición 2020. Estos tres motivos están todos ellos situados entre 10 y 50 partes de bases aguas abajo de los motivos CAAT y 30 a 50 pares de bases aguas arriba de los sitios de transcripción potenciales.

Se ha identificado una secuencia TGACG en la posición 1950; esta secuencia, puesta en evidencia en el promotor 35S de CaMV, parece responsable de la expresión de genes quiméricos en las raíces y en las hojas (LAM y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 7890).

Tres regiones presentan un homogeneidad importante con los motivos HSE (Heat Shock Elements) de las plantas (GURLEY y KEY, 1991, Biochemistry, 30, 1). Estas regiones son homólogas a la secuencia consenso GAANNGAANNTTCNNTTC o TTCNNTTCNNGAANNGAA; están próximas a las cajas TATA y CAAT y están duplicadas [SEC ID Nº: 17 y Nº: 18].

Se localizó una secuencia homóloga al motivo CCGTCC caracterizado como implicado en la respuesta a los estimuladores de origen fúngico (LOIS y col., 1989, EMBO J., 8, 1641) en la posición 1822.

El promotor del gen 246 C presenta en aproximadamente un 30% de su longitud una elevada homología (>90%) en 700 pares de bases con el promotor vegetal aislado del tabaco que tiene la secuencia [SEC ID Nº: 8] descrito por TAKAHASHI y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 87, pp. 8013-8016. En la figura 2 se representa la alineación de la secuencia de ADN de este promotor [SEC ID Nº: 9, 10 y 11] (línea superior) con la parte correspondiente de la secuencia de ADN del promotor de la invención [SEC ID Nº: 12 y 13] (línea inferior).

Sección 9

Construcción del vector de expresión pSG123 asociando el promotor del gen 246C al gen de la \beta-glucuronidasa

A partir del fagémido pKS 246, la digestión por las enzimas HindIII y BalI permite aislar un inserto de 2200 pares de bases aproximadamente, que contiene la parte promotora del gen 246C, el codon de iniciación de la traducción y 11 codones codificante de la parte amino-terminal de la proteína.

El plásmido pBI 101.3 (Clontech) es digerido por las enzimas HindIII y EcoRI; el fragmento de aproximadamente 2100 pares de bases, que contiene el gen de la \beta-glucuronidasa codificado por el locus uidA de E. coli, seguido del finalizador de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, es ligado en el plásmido pUC 19, abierto en los mismos sitios, dando un plásmido denominado plásmido pBI 201.3.

Se clona el inserto HindIII-BalI portador de las secuencias promotoras del gen 246C en el plásmido pBI201.3 abierto en los sitios HindIII y SmaI.

El vector obtenido, denominado pSG 123, contiene, pues, el gen de la glucuronidasa bajo el control del promotor del gen 246C. La secuencia nucleotídica del gen quimérico completo es la secuencia [SEC ID Nº: 14].

Sección 10

Protocolo de la expresión transitoria en protoplastos de tabaco del gen de la glucuronidasa bajo el control del promotor del gen 246C Purificación de protoplastos de tabaco

Se recogen hojas de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum, var. Samsun NN), de 4 a 5 semanas de edad, cortadas en tiras e incubadas en medio T.O (tabla 1, adaptada de Chupeau y col., 1974, C.R. Acad. Sci. (París), 278 D, 1565) que contiene 1 g/litro de celulasa R 100 Onozuka, 200 mg/l de macerozima Onozuka (Yakult Honsha, Nishinoniya, Japón) y 500 mg/l de pectoliasa Y23 (Sheishin Pharmaceutical Ind. Japón) durante 15 h a 22ºC.

Se separan los protoplastos de los restos celulares por tamizado sobre un tamiz de nilón de malla de 85 \mum, seguido de centrifugación durante 5 min. a 50 g en una solución de sacarosa al 19% (peso/volumen). Se lavan los protoplastos que flotan en este medio una vez en medio T.O., se cuentan y se ajusta su número a una densidad de 1,5 x 10^{6} protoplastos/ml.

Preparación del vector pSG 123

Se cultiva la cepa de E. coli que contiene el vector pSG 123 en medio de Luria (Gibco) que contiene 50 mg/l de ampicilina. Se realiza la amplificación del plásmido según el protocolo descrito en Sambrook y col., 1989 (antes citado). Se purifica luego el plásmido pSG 123 por centrifugación en gradiente de cloruro de cesio y por dos precipitaciones sucesivas con etanol. Se disuelve de nuevo la pella plasmídica en tampón Tris-HCl 10 mM, pH 8,0.

Transformación con polietilenglicol

Se incuban las suspensiones de protoplastos (320 \mul por alícuota) a 45ºC durante 5 min. y se enfrían luego rápidamente sobre hielo. Se añaden luego 50 \mug de plásmido pSG123, 160 \mul de una solución de polietilenglicol (40% de polietilenglicol, 0,4 M de manitol, 30 mM de MgCl_{2}, 0,1% de Mes, pH 5,8). Al cabo de 10 min., se recogen los protoplastos por centrifugación y se vuelven a suspender por agitación suave en 500 \mul de tampón TO y se incuban en obscuridad a 28ºC.

Medida de la expresión transitoria

Al cabo de 24 h de incubación, se lisan los protoplastos tras la adición de 50 \mul de tampón de extracción 10X de \beta-glucuronidasa por congelación a -80ºC, seguida de congelación a 37ºC (Jefferson, 1987, Plant Molec. Biol. Reporter, 5, 387).

Se utiliza el sobrenadante obtenido después de centrifugar a 10.000 g para medir la actividad \beta-glucuronidasa por fluorimetría (Jefferson, 1987, Plant Molec. Biol. Reporter, 5, 387).

Paralelamente, se mide la cantidad de proteínas presentes en los extractos según el método de Bradford con el kit Bio Rad (Bio Rad. Lab.).

TABLA 1 Composición del medio TO (para 1 litro)

NH_{4}NO_{3}	825 mg
KNO_{3}	950 mg
CaCl_{2}, 2H_{2}O	220 mg
MgSO_{4}, 7H_{2}O	185 mg
KH_{2}PO_{4}	85 mg
H_{3}BO_{3}	1 mg
MnSO_{4}, 4H_{2}O	100 \mug
ZnSO_{4}, 7H_{2}O	1 mg
KI	100 \mug
AlCl_{3}	30 \mug
NiCl_{2}, 6H_{2}O	30 \mug
CuSO_{4}, 5H_{2}O	30 \mug
FeSO_{4}, 7H_{2}O	27,8 mg
Na_{2} EDTA, 2H_{2}O	37,2 mg
Tiamina	100 \mug
Ácido nicotínico	200 \mug
Piridoxina	1 mg
Biotina	10 \mug
Pantotenato de Cal	1 mg
Sacarosa	20 g
Inositol	100 mg
Manitol	80 mg
Ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico (MES)	200 mg

pH ajustado a 5,8 antes del autoclavado.

Sección 11

Expresión transitoria del gen de la glucuronidasa bajo el control del promotor del gen 246C en protoplastos de tabaco infectados por Pseudomonas solanacearum

Se mide esta expresión transitoria, determinada según el protocolo de la sección 10, tras incubación durante 24 h de los protoplastos preparados según el protocolo anterior en medio TO (descrito en la sección 10), que contiene una suspensión de bacterias Pseudomonas solanacearum (10 bacterias/protoplasto) obtenidas como se ha descrito en la sección 1.

Se expresa la actividad \beta-glucuronidasa en pmoles de metilumbeliferona formada/min/mg de proteína.

No se descubre ninguna actividad en los protoplastos de plantas que no han recibido ADN del vector pSG123. Se mide una actividad de 450 pmol/min./mg de proteína en protoplastos tratados con vector pBI221 (Clontech) que contiene el gen de la \beta-glucuronidasa bajo el control del promotor constitutivo 35S de CaMV; esta actividad se reduce a 300 pmol/min./mg de proteína tras la infección por cepas de Pseudomonas solanacearum GMI 1000 y GMI 1178.

Se mide una actividad de 600 pmol/min./mg de proteína en protoplastos tratados con plásmido pSG 123; esta actividad resulta poco modificada tras la inoculación con la cepa GMI 1178; aumenta hasta un valor de 1.000 pmol/min./mg de proteína tras la incubación con la cepa GMI 1000.

El promotor del gen 246C permite, pues, una expresión basal importante del gen de la glucuronidasa, expresión más importante que la ordenada por el promotor 35S de CaMV, que sirve aquí de control. Este promotor presenta además una fuerte inductilidad, ya que la expresión de la \beta-glucuronidasa aumenta un 40% tras la infección con la cepa bacteriana GMI 1000.

Sección 12

Expresión transitoria del gen de la glucuronidasa bajo el control del promotor del gen 246 C de protoplastos de tabaco tratados con un estimulador (heptasacáridos de quitina) o una hormona

Se mide la expresión tras incubación de los protoplastos durante 24 h como se ha descrito antes en medio TO que contiene un estimulador a una concentración de 25 \muM o una hormona, el 2-4-D (ácido 2,4- diclorofenoxiacético) a una concentración de 4 \muM. Los estimuladores utilizados (compuestos glicosídicos obtenidos de la pared de hongos patógenos) son heptasacáridos de quitina que tienen la propiedad de inducir reacciones de defensa en las plantas (Roby y col., 1987, BBRC, 143, 885).

No se detecta ninguna actividad en los protoplastos no tratados y que sirven de control. Se mide una actividad del orden de 400 pmol de metilumbeliferona formada/min/mg de proteína a partir de protoplastos que han recibido ADN del vector pBI 221; esta actividad no resulta afectada por el tratamiento (estimuladores u hormona).

Los protoplastos que han recibido ADN del vector pSG 123 presentan una actividad de 450 pmol/min/mg de proteína; esta actividad aumenta en un 50% si los protoplastos son tratados con la hormona 2-4-D y en un 70% si los protoplastos son tratados con el heptasacárido de quitina.

Las características de este promotor evidenciadas tras la infección de protoplastos por la cepa bacteriana GMI 1000 (nivel basal elevado e inductilidad) pueden ser reproducidas utilizando un inductor obtenido de la pared de hongos fitopatógenos.

Sección 13

Construcción de un vector de expresión estable en células vegetales: vector binario pSG246

A partir del vector pSG 123, un corte con las endonucleasas de restricción HindIII y EcoRI, seguido de electroforesis en gel de agarosa, permite aislar el gen quimérico que asocia el promotor 246C a la parte codificante de la \beta- glucuronidasa y el finalizador NOS. El gen quimérico es introducido y ligado en el vector binario pBIN 19 (Clontech) previamente abierto en los sitios HindIII y EcoRI, dando el vector pSG246. Este vector binario posee dos genes de resistencia a la kanamicina, uno que puede expresarse en bacterias y el otro que está situado inmediatamente aguas arriba del gen recombinante completo (Bevan, 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711) y que puede ser transferido a células vegetales. El gen de resistencia a la kanamicina servirá como marcador de selección en el curso de las etapas de transformación y de análisis de la descendencia de las plantas transformadas.

El vector obtenido, denominado pSG246, es clonado en la cepa de E. coli DH5 \alpha.

Sección 14

Transferencia en Agrobacterium del plásmido pSG246 que contiene la \beta-glucuronidasa bajo el control del promotor del gen 246C del tabaco a) Transferencia en Agrobacterium tumefaciens

Se realiza esta transferencia por transformación según el método de congelación-descongelación descrito en Plant Molecular Biology Manual (Gelvin y col., eds., Kluwer Academic Publishers, 1988) y resumido a continuación.

Se preparan células competentes de Agrobacterium tumefaciens (cepa LBA 4404, Clontech) por enfriamiento rápido en hielo de un cultivo en fase exponencial de crecimiento. Se vuelven a suspender entonces las bacterias en CaCl_{2} 20 mM. Se distribuyen alícuotas de esta suspensión en tubos Eppendorf y se congelan después en nitrógeno líquido.

Se añade 1 \mug de plásmido pSG246 a las células congeladas, contenidas en un tubo Eppendorf. Se incuba luego la suspensión a 37ºC durante 5 min.; se añade entonces 1 ml de medio de Luria (Gibco) y se incuba el tubo a 28ºC durante 4 h. Se extienden partes alícuotas sobre placas de Petri que contienen un medio de agar mínimo, descrito en Plant Molecular Biology Manual (antes citado) en presencia de 100 mg de rifampicina y 25 mg/l de kanamicina. En estas condiciones, sólo proliferan las colonias de Agrobacterium tumefaciens que han integrado el plásmido pSG246. Éstas contienen el gen quimérico en un contexto que permite su replicación.

La resistencia a los dos antibióticos de las colonias seleccionadas es verificada trasplantándolas al mismo medio de selección dos veces seguidas. Se verifica la presencia del gen quimérico que asocia el promotor 246 C a la parte codificante de la \beta-glucuronidasa en Agrobacterium tumefaciens por el método de Southern Blot sobre una preparación de ADN total (lisis de las células, purificación del ADN por extracción con una mezcla de fenol/cloroformo según el protocolo descrito por Gelvin en el trabajo antes citado, corte del ADN purificado con enzimas de restricción, electroforesis en gel de agarosa, transferencia a membrana e hibridación según las técnicas conocidas por el experto en este campo).

b) Transferencia en Agrobacterium rhizogenes

Se realiza esta transferencia del mismo modo que la transferencia en Agrobacterium tumefaciens descrita en a), con la cepa de Agrobacterium rhizogenes A4 descrita por Guerche y col. (1987), Mol. Gen. Genet. 206, 382.

\newpage

Sección 15

Obtención de plantas de tabaco transformadas con Agrobacterium tumefaciens que contiene el plásmido pSG246

Se infectó el tabaco Nicotiana tabacum cultivado in vitro con Agrobacterium tumefaciens que contenía el plásmido pSG246 según el procedimiento de Horsch y col, conocido por el experto en la técnica (Horsch, R.B. y col., 1985, Science 227, 1229-1231), cuyas principales etapas son expuestas a continuación.

Se incuban discos de hojas de plantas axénicas de tabaco Nicotiana tabacum (variedad Bottom Special) en un cultivo de A. tumefaciens que alberga el plásmido pSG246. Se transfieren los discos escurridos sobre papel Whatman a medios de cultivo en placas de Petri con el fin de multiplicar las células transformadas para obtener callos (Murashige y Skoog, 1962, Physiol. Plant., 15, 473) y luego producir yemas en presencia de cefotaxima (500 \mug/ml), destinada a eliminar el Agrobacterium tumefaciens, y de kanamicina (100 \mug/ml).

Paralelamente, se realizaron transformaciones con cepas de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 que contenían los vectores:

-: pBI 101 (Clontech), constituido por la parte codificante de la glucuronidasa que precede al finalizador de la nopalina sintasa en el vector binario pBIN 19. Esta construcción, denominada en adelante construcción pBI 101, está desprovista de promotor.

-: pBI 221 (Clontech), constituido por un fragmento de 800 pares de bases del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor insertado delante de la parte codificante de la glucuronidasa en el vector pBI 101. Esta construcción será denominada en adelante construcción pBI 221.

Las yemas resistentes a la kanamicina fueron luego transferidas a un medio que permite la inducción de las raíces en presencia de carbenicilina y de kanamicina. Las plántulas son luego transferidas a recipientes con un substrato compuesto de turba y de mantilla y se les deja crecer en estufa. Todas las plantas transformadas (generación R0) que han sobrevivido a las etapas de regeneración y de aclimatación en estufa se revelan como morfológicamente normales y fértiles. Fueron fecundadas y dieron semillas (generación R1).

Sección 16

Análisis del ADN genómico de las plantas de tabaco transformadas con Agrobacterium tumefaciens que contiene el plásmido pSG246 (generación R0) según la técnica de Southern Blot

Se aisló el ADN genómico de tabaco de alto peso molecular a partir de hojas maduras de plantas transgénicas de la generación R0 según el método de extracción con ayuda de bromuro de cetiltrimetilamonio y de purificación por precipitación, descrita en la obra "Plant Molecular Biology Manual" ya citada.

Se digirieron 10 \mug de este ADN genómico durante una noche a 37ºC con 20 unidades de enzimas de restricción HindIII y EcoRI. Los fragmentos de restricción obtenidos fueron separados por electroforesis en gel de agarosa (1%). Se transfirió el ADN según el método de Southern Blot a un filtro de Nilón (Hybond N^{+} Amersham) y se hibridó con una sonda nucleotídica que contenía una parte de la secuencia del gen recombinante, marcada por acoplamiento a peroxidasa (kit ECL, Amersham). Se lavaron luego las membranas y se revelaron según el protocolo recomendado por Amersham.

El análisis de las películas permite sacar las conclusiones siguientes:

\bullet: ciertas plantas no poseen copias del gen recombinante transferido (ausencia de señal);

\bullet: la mayor parte de las plantas estudiadas contienen al menos una copia sin reorganización de la construcción: promotor 246C - secuencia codificante de la \beta-glu-curonidasa-finalizador NOS, denominada en adelante construcción pSG 246;

\bullet: ciertos perfiles sugieren que existen reorganizaciones internas en esta construcción, pero estos fenómenos son raros.

Sección 17

Estudio de las características de activación del promotor 246 C en plantas de tabaco transgénicas

Este estudio fue realizado en plantas de la generación R1 que fueron previamente seleccionadas in vitro en medio de agar de Murashige y Skoog que contenía 500 \mug/ml de kanamicina.

Se transfirieron 10 plantas por descendencia de transformante seleccionadas por su resistencia a la kanamicina a mantillo y se cultivaron después durante 4 a 5 semanas en una cámara de cultivo.

a) Activación por la bacteria fitopatógena Pseudomonas solanacearum Inoculación por infiltración

Se realizan pruebas de inoculación según el protocolo descrito en la sección 1 en cuatro hojas pertenecientes a 2 plantas diferentes. Las medidas de actividad glucuronidasa son efectuadas según el método descrito por Jefferson (Plant Molecular Biology Reporter, 5, 387, 1987) utilizando 4-metilumbeliferil-\beta- D-glucurónido como substrato.

Los resultados muestran que:

\bullet: las plantas que contienen la construcción pBI 101 no presentan actividad glucuronidasa detectable;

\bullet: las plantas que contienen la construcción pBI 121 presentan una actividad glucuronidasa comprendida entre 5.000 y 70.000 pmoles de metilumbeliferona/min/mg de proteína, correspondiente a una expresión constitutiva esperada para esta construcción. Se constató una ligera activación de este promotor en respuesta al estrés de infiltración para ciertos transformantes;

\bullet: las plantas que contienen la construcción pSG246 presentan una actividad glucuronidasa débil en las plantas no inoculadas, comprendida entre 2.000 y 5.000 pmol/mg de proteína. Se mide una fuerte inducción en respuesta a la infección bacteriana y ello cualquiera que sea la cepa bacteriana utilizada (GMI 1000 ó K60) (Sequeira y col., Physiol. Plant Pathol., 10, 43, 1977), cepa compatible que provoca síntomas). El factor de inducción (razón entre la actividad medida tras la inoculación y la actividad medida antes de la inoculación) es del orden de 20 veces y los valores de actividad sobrepasan a veces los obtenidos con las plantas que expresan la construcción pBI 121.

Infección bacteriana localizada

Se lleva a cabo una infección bacteriana localizada por depósito de una gota de suspensión bacteriana de Pseudomonas solanacearum (3 \mul que contienen 3 x 10^{5} bacterias obtenidas como se ha descrito en la sección 1) sobre una herida obtenida por perforación de una hoja con ayuda de una aguja de jeringa.

El promotor 246C se activa alrededor de la lesión creada por la infección y también en todas las partes de la planta infectada (hoja inoculada, hojas superiores y hojas inferiores de la planta y raíces). Esta activación sistémica se produce en las primeras horas tras la inoculación.

No se observó ninguna activación en plantas de generación R1 obtenidas de plantas transformadas por las construcciones pBI 101 y pBI 121.

El mismo tipo de infección localizada, realizada a nivel de las raíces de plantas de tabaco cultivadas in vitro, conduce igualmente a una gran activación del promotor en el sitio de inoculación, pero también en el conjunto de la raíz y en la parte aérea de la planta.

b) Activación por el hongo patógeno Chalara elegans Estudio in vitro

Se vierten 10 a 15 ml de medio líquido de Murashige y Skoog en una placa de Petri que contiene un cultivo de 3 semanas de Chalara elegans en vías de esporulación (cultivo en medio de agar Potato Dextrose Agar PDA, Difco).

El raspado de la superficie del cultivo permite recoger las esporas. Después del recuento, una dilución apropiada permite obtener suspensiones de 10^{4} a 10^{5} esporas por ml.

Se distribuyen alícuotas de 7 ml en placas Magenta (Sigma). Se introduce una planta de tabaco transgénica (de 3 semanas de edad aproximadamente y cultivada en medio estéril) transformada por el gen de la \beta-glucuronidasa bajo el control del promotor 246C en cada placa, con las raíces sumergidas en la suspensión de esporas. Se recogen luego las plantas, se congelan y se determina la actividad glucuronidasa. En el momento de la infección, la actividad específica es de 20.000 pmoles de metilumbeliferona por mg de proteína. En comparación con controles no inoculados puestos en las mismas condiciones, esta actividad se multiplica por factores de 8 y 8,5 para las infecciones con 10^{4} y 10^{5} esporas por mol, respectivamente, desde los 4 días después de la inoculación.

Estudio en estufa

Se transfieren 10 plantas por descendencia de transformante, seleccionadas por su resistencia a la kanamicina, a vasos con una dimensión de 3 x 3 cm. Al aparecer la 5ª hoja, las plantas son inoculadas depositando a nivel del cuello una suspensión de 5 x 10^{5} endoconidios de Chalara elegans.

c) Activación por el hongo patógeno Sclerotinia sclerotiorum Estudio en discos foliares

Se ponen discos foliares de 20 mm de diámetro procedentes de plantas que expresan la construcción pSG246 en supervivencia en un medio líquido apropiado. Se pone sobre cada uno de estos discos un cubo de agar de 5 mm de lado aproximadamente que contiene micelio de Sclerotinia sclerotiorum. La actividad glucuronidasa, medida en función del tiempo, revela que la presencia de micelio induce la actividad glucuronidasa después de 7 horas de contacto. Al cabo de 24 horas, la actividad se multiplica por 4 con respecto a la de discos foliares que no han tenido contacto con el micelio. La misma experiencia realizada con discos de hojas obtenidos de tabacos control (que no expresan la construcción pSG246) no revela más que una actividad glucuronidasa asimilable a la de un ruido de fondo.

d) Activación por estimuladores

Se utilizaron dos tipos de estimuladores, uno de un tipo biótico correspondiente a moléculas obtenidas de moléculas o de macromoléculas naturales y el otro de tipo abiótico, correspondiente a moléculas químicas.

d1. Estimuladores bióticos de origen bacteriano o fúngico

Los estimuladores utilizados son la harpina, que es una proteína aislada de Erwinia amylovora, y una proteína aislada del sobrenadante de cultivo de Pseudomonas solanacearum. Igualmente, se han estudiado estimuladores proteicos, tales como la criptogeína, aislada de Pseudomonas cryptogen, y la capsiceína, aislada de Pseudomonas capsici (Ricci y col., 1989, Eur. J. Biochem. 183: 555-563).

En todos los casos, se infiltraron concentraciones apropiadas de estimuladores con una jeringa bajo la epidermis inferior de las hojas de tabaco que expresaban la construcción pSG246. La inducción de actividad, en todos los casos, se debe a la presencia de estimulador, en un anillo de 5 mm aproximadamente inmediatamente adyacente a la zona de infiltración. La estimulación es muy aparente 24 horas después de la infiltración, pero visible desde las 6 horas. La actividad al cabo de 24 horas está con frecuencia multiplicada por 5 a 6 en comparación con la de las plantas control (plantas que expresan la construcción pSG246, pero sin inyectar estimuladores bajo su epidermis).

d2. Estimuladores abióticos: ácido salicílico, sulfato de cobre

Se sumergen hojas de tabaco que expresan la construcción pSG246 y separadas de la planta en soluciones con una concentración de 1 a 10 \mug/ml de ácido salicílico o de 0,025 a 0,25 mM de sulfato de cobre.

En presencia de ácido salicílico, la actividad glucuronidasa se multiplica por 5 al cabo de 6 horas y por 10 después de 24 horas. En el caso del sulfato de cobre, la actividad glucuronidasa se multiplica por 17 a 0,025 mM y por 11 a 0,25 mM si se compara con hojas de plantas control no tratadas.

d3. Inducción con reguladores del crecimiento

Se llevó a cabo la aplicación de una auxina en forma de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a concentraciones de 1,5 y 10 \muM. La aplicación realizada por inmersión de peciolos de hojas separadas de tabaco que expresan la construcción pSG246 muestra que la inducción en la hoja comienza 6 horas después de la aplicación de la auxina a una concentración de 5 \muM, para resultar estimulada 18 veces después de 12 horas, en comparación con las hojas de plantas control no tratadas con la auxina.

Se mide la actividad glucuronidasa tras la aparición de los síntomas de la enfermedad, a saber, 15 días aproximadamente tras la inoculación.

Los resultados de la actividad medida a nivel de la parte aérea de la planta completa muestran que:

\bullet: las plantas transformadas por la construcción pBI 121 presentan una actividad de 12.000 a 60.000 pmoles de metilumbeliferona/min/mg de proteína. Esta actividad varía poco después de la inoculación.

\bullet: las plantas transformadas con la construcción pSG246 presentan una actividad glucuronidasa débil en el caso de las plantas sanas. Esta actividad aumenta considerablemente en las plantas que presentan síntomas, alcanzando vectores de 85.000 pmoles de umbeliferona formada/min/mg de proteína.

e) Activación por una herida

Esta activación fue investigada en hojas de plantas de generación R1 que contenían la construcción pSG246, de aproximadamente 5 semanas de edad y previamente seleccionadas por su resistencia a la kanamicina.

La excisión simple de una hoja conlleva una activación lenta y débil del promotor, a la vez en la hoja y en la planta; sin embargo, la laceración de una hoja conlleva un aumento muy grande (5 veces) y extremadamente rápido (30 min.) de la actividad glucuronidasa de la hoja lacerada.

f) Activación por un choque térmico

Se transfieren plantas de tabaco de generación R1, que contienen la construcción pSG246, de aproximadamente 5 semanas de edad y previamente seleccionadas por su resistencia a la kanamicina, durante 2 ó 4 h a un recinto a 40ºC para provocar un choque térmico. Al final del tratamiento, las hojas son inmediatamente congeladas en nitrógeno líquido y se determina su actividad \beta-glucuronidasa en el conjunto de la parte aérea.

Se aplica el mismo protocolo a plantas transformadas por la construcción pBI 121; la actividad de estas últimas no resulta modificada por el choque térmico.

Por el contrario, las plantas que contienen la construcción pSG246 presentan un gran aumento de la actividad glucuronidasa tras el choque térmico; el factor medio de estimulación, determinado en varias plantas, está próximo a 12.

g) Expresión en el curso del desarrollo y reparto espacial de la expresión en la planta

La utilización del substrato histoquímico de revelado de la actividad glucuronidasa, el 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónido de ciclohexilamonio (X-gluc), según el método descrito por Jefferson (Plant Molecular Biology Reporter, 5, 387, 1987), permite visualizar la localización de la actividad en los tejidos de la planta.

Germinación de las semillas

En el curso de la germinación de las semillas de tabaco de generación R1 que expresan la glucuronidasa bajo el control del promotor 246C, la expresión no es detectable en los cotiledones, es elevada en toda la raíz y muy fuerte en los meristemos radiculares y caulinares. En la planta desarrollada, la detección de la actividad glucuronidasa aumentó en todos los tejidos estudiados, incluyendo la semilla seca.

Sección 18

Obtención de plantas de colza transformadas con Agrobacterium rhizogenes que contiene el plásmido pSG246

Se realiza la transformación según el protocolo de P. Guerche y col. (P. Guerche y col., 1987, Mol. Gen. Genet., 206, 382). Los diferentes medios de cultivo son los descritos por Pelletier y col. (Pelletier y col., 1983, Mol. Gen. Genet., 191, 244). Su composición será dada más adelante (tabla 2).

a) Obtención de raíces transformadas

Se toman segmentos de tallo del extremo apical de plantas de colza (Brassica napus: variedades de primavera Brutor y Westar y variedad de invierno) de 1 m de altura aproximadamente. Se esterilizan estos segmentos en superficie, se lavan con agua estéril, se cortan en segmentos de 1,5 cm de largo aproximadamente y se ponen en un tubo que contiene medio A.

Se efectúa la inoculación del extremo de este segmento por depósito de una suspensión de la cepa de Agrobacterium rhizogenes que contiene el plásmido pSG 246.

Aparecen raíces transformadas en el segmento de tallo al cabo de 1 a 2 semanas, se recogen y se ponen en medio de agar B (15 g/l) complementado con 500 \mug de cefotaxima/ml.

b) Generación de plantas transformadas

Se incuban fragmentos de raíces durante 15 días en medio D que contiene 3 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético y se ponen después en medio RCC de inducción de la gemación. Se obtienen entonces plantas radiculadas por pase de las yemas en los medios F y G.

TABLA 2 Composición de los diferentes medios utilizados para la obtención de plantas de colza transformadas

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1

100

NAA	:	ácido naftalenacético
BA	:	6-bencilaminopurina
2,4D	:	ácido dicloro-2,4-fenoxiacético
IPA	:	N^{6}-(2-isopentil)adenina
GA_{3}	:	ácido gibberélico
EDTA	:	ácido etilendiaminatetraacético

Sección 19

Características de la expresión del gen de la glucuronidasa bajo el control del promotor 246C en plantas de colza a) Activación por una herida

Se cortaron, o cortaron y laceraron, hojas de plantas de colza de la generación R1, que contienen la glucuronidasa bajo el control del promotor 246C.

Se observa una activación débil de la actividad glucuronidasa en las hojas cortadas; una actividad muy intensa (6 veces la actividad basal) y extremadamente rápida (aproximadamente 30 min.) es consecutiva a la laceración.

b) Infección por hongos fitopatógenos Parásito foliar (Alternaria brassicae)

Se cultivan plantas de colza de la generación R1, que poseen la construcción pSG246, durante 3 semanas aproximadamente en un tiesto con mantillo. Se inoculan entonces las plantas localmente con una suspensión de esporas (10 ml que contienen 1.000 esporas obtenidas tras cultivar en medio de agar PDA) del hongo patógeno Alternaria brassicae, depositada sobre una herida realizada con una aguja. Se desarrolla entonces una necrosis alrededor de esta herida.

Se observa entonces una fuerte estimulación de la actividad glucuronidasa (detectada por la prueba de X-gluc, Sección 17e) en la hoja inoculada alrededor de la zona necrótica.

Parásito radicular (Rhizoctonia solani)

Se siembran semillas de colza de la generación R1, transformadas con la construcción pSG246, en un substrato constituido por una mezcla de turba, vermiculita y arena (10:10:5, v:v) contenido en una maceta de 1 litro. Se recubren los granos con una capa de 1 cm de substrato que contiene 10.000 propágulos de Rhizoctonia solani por gramo. Estos propágulos son obtenidos por cultivo durante 15 días de una cepa de Rhizoctonia en botella de Roux sobre semillas de arroz, seguido de trituración a una granulometría inferior a 1 mm.

En el curso de su desarrollo, las plantas de colza son atacadas a nivel radicular.

Se observa una fuerte estimulación de la actividad glucuronidasa (detectada por la prueba de X-gluc, Sección 17e) en las raíces de las plantas infectadas, en comparación a la actividad medida en las raíces de plantas control (misma descendencia R1 de plantas transformadas, pero no infectadas). Además, se induce una fuerte estimulación de la actividad glucuronidasa de forma sistémica en las partes aéreas.

\newpage

c) Activación por un choque térmico de las plantas de colza de la generación R1

Se transfieren plantas de colza, de la generación R1, que contienen la construcción pSG246, de 5 semanas de edad aproximadamente, durante 2 ó 4 h a un recinto a 40ºC con el fin de provocar un choque térmico. Al finalizar el tratamiento, las plantas son inmediatamente congeladas en nitrógeno líquido y se determina su actividad \beta-glucuronidasa sobre el conjunto de la parte aérea.

Se aplica el mismo protocolo a plantas transformadas por la construcción pBI 121; la actividad de estas últimas plantas no resulta afectada por el choque térmico.

Por el contrario, las plantas que contienen la construcción pSG246 presentan un fuerte aumento de la actividad glucuronidasa después del choque térmico; el factor medio de estimulación, determinado sobre varias plantas, está próximo a 12.

d) Expresión en el curso del desarrollo

En el curso de la germinación de semillas de colza de generación R1 que contienen glucuronidasa bajo el control del promotor 246C, se observa una expresión de esta proteína en los cotiledones, una expresión elevada en toda la raíz y muy potente en los meristemos radiculares y caulinares.

También se midió una expresión muy potente en las raíces y en los callos transformados, en el curso de las etapas de regeneración de plantas transgénicas, así como en las diversas plantas de la planta (incluyendo las semillas maduras).

Sección 20

Obtención de callos de girasol transformados por Agrobacterium rhizogenes que contienen el plásmido pSG246

Se realiza la transformación según el protocolo de Guerche y col. (Mol. Gen. Genet., 206, 382, 1987), inicialmente puesto a punto para la transformación de la colza. Los diferentes medios de cultivo son los descritos por Pelletier y col. (Mol. Gen. Genet., 191, 244, 1983) y su composición ha sido descrita (tabla 2).

Se obtienen hipocotilos de girasol por germinación durante 7 a 10 días de semillas sobre vermiculita. Se ponen estos granos en una cámara de cultivo, en condiciones de iluminación de 8 h/20ºC y de obscuridad a 17ºC. Se esterilizan los hipocotilos en superficie, se lavan en agua estéril y se ponen en un tubo que contiene medio de Murashige y Skoog, cuya concentración de macroelementos se reduce a la mitad.

La inoculación del extremo de este segmento es efectuada por depósito de una suspensión de la capa de Agrobacterium rhizogenes que contiene el plásmido pSG246.

Aparecen raíces transformadas al cabo de un mes y se toman y ponen en medio B agar (15 g/l) complementado con 500 \mug de cefotaxima/ml durante 4 semanas, trasplantando cada semana. Se cultivan luego en el mismo medio líquido con agitación (100 revoluciones/minuto) y se trasplantan cada mes. El pase de estas raíces en medio D permite la formación de callos a partir de las raíces transformadas.

La actividad glucuronidasa de las raíces cultivadas en el medio B líquido y de los callos cultivados en medio D, calculada por fluorimetría, presenta valores muy importantes, comprendidos entre 10^{4} y 10^{5} pmoles de metilumbeliferona formada/min/mg de proteínas.

Sección 21

Expresión transitoria del gen de la glucuronidasa bajo el control del promotor del gen 246C en embriones inmaduros de girasol

Se recogieron embriones inmaduros de plantas madre de campo del genotipo 105 y se pusieron en cultivo durante 14 días en medio I (tabla 3) a 25ºC y en obscuridad. Se cultivan luego estos embriones durante 3 días en medio II a 25ºC bajo un fotoperíodo de 16 horas por día/8 horas por noche. Se depositan luego una veintena de embriones uno al lado del otro en medio III.

Preparación del vector pSG123:

Se realiza ésta según el protocolo descrito en la Sección 10.

Transformación del material vegetal:

La introducción de ADN plásmídico (vector pSG123) en las células vegetales es realizada utilizando un cañón de partículas construido sobre el principio descrito por Zumbrunn (Zumbrunn y col., 1989, Technique 1(3), 204-216). El ADN plasmídico es adsorbido sobre micropartículas de tungsteno a razón de 4 \mug/mg de tungsteno y se depositan luego 2,5 mg de la mezcla de tungsteno/ADN sobre un macroproyectil, que se acelera por explosión de un cartucho.

El aplastamiento del macroproyectil sobre una placa de parada horadada por un agujero permite proyectar las micropartículas de tungsteno y ADN a las células.

Medida de la expresión transitoria

Se libera el ADN adsorbido sobre las micropartículas de tungsteno que han penetrado en las células vegetales; se transcribe entonces el gen quimérico que asocia el promotor del gen 246C a la glucuronidasa y se traduce después. Se visualiza entonces la glucuronidasa obtenida por la prueba histoquímica descrita por JEFFERSON y col., 1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 387, utilizando el substrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónido de ciclohexilamonio (x-gluc). Las células que expresan el gen presentan entonces una coloración azul.

El recuento del número de células azules obtenidas en placa de Petri en el curso de un experimento de expresión transitoria permite contar el número de células transformadas y calcular la expresión de la construcción quimérica estudiada.

La expresión transitoria medida utilizando el substrato X-gluc 48 horas después del bombardeo con el cañón de micropartículas muestra que el gen de la \beta-glucuronidasa se expresa en los embriones inmaduros del girasol.

La intensidad es más fuerte que la inducida por la utilización del plásmido pBI221 (Clontech), donde el gen de la glucuronidasa está bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor.

El número de células transformadas que expresan el gen de la glucuronidasa bajo el control del promotor del gen 246C está próximo a 140 por placa (valor medio de 4 experimentos), mientras que el número de células transformadas es de 60 por placa (valor medio de 4 experimentos) en presencia del plásmido pBI221, donde el gen de la glucuronidasa está bajo el control del promotor 35 S del virus del mosaico de la coliflor.

Se escurren luego los embriones sobre papel de filtro estéril y se vuelven a poner en cultivo en medio II y en obscuridad durante 3 días. Los embriones son entonces lavados brevemente con medio de Murashige y Skoog líquido (Murashige y Skoog, 1962, Physiol. Plant 15: 473) que contiene 500 mg/l del antibiótico cefotaxima. Se escurren luego sobre papel de filtro estéril y se cultivan en medio III que contiene 250 mg/l de cefotaxima, 250 mg/l de carbenicilina y 50 mg/l de paromomicina. Se efectúa este cultivo a 25ºC bajo un fotoperíodo de 16 h día/8 h noche; se trasplantan los tejidos vegetales cada 21 días a este mismo medio.

Se transfieren las yemas neoformadas a partir de estos tejidos a medio IV en las mismas condiciones de temperatura y de fotoperíodo. Se ponen luego a crecer las plantas enraizadas en estufa.

Sección 22

Expresión de la \beta-glucuronidasa bajo el control del promotor 246C en plantas de girasol transformadas

Las plantas que expresan la construcción pSG246 tienen una expresión de la glucuronidasa al menos igual a la obtenida con plantas transformadas con ayuda de la construcción pBI121.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Composición de los diferentes medios utilizados para la obtención de plantas de girasol transformadas

2

200

Sección 23

Protocolos de expresión en los tejidos de monocotiledóneas del gen de la \beta-glucuronidasa bajo el control del promotor 246C. Obtención del material vegetal

Se ponen a germinar semillas del genotipo de la cebada GERBEL en estufa sobre vermiculita. Al cabo de 7 días, se recogen las hojas y las raíces y se ponen en una placa de Petri que contiene medio de agar de Murashige y Skoog para los experimentos de expresión transitoria.

Se recogen embriones inmaduros de maíz 10 a 14 días después de la polinización a partir de pies madre (línea LH132) cultivados en estufa. Se ponen los embriones con el lado del eje embrionario en contacto con el medio de inducción (composición dada en la tabla 4 a continuación) y luego en medio de mantenimiento (tabla 5) 3 semanas después. Los callos obtenidos son trasplantados cada semana. Los experimentos de expresión transitoria son realizados varias horas después del trasplante.

Preparación del vector pSG123

Se realiza según el protocolo descrito en la Sección 10.

Transformación del material vegetal

La introducción de ADN plasmídico (vector pSG123) en las células vegetales es realizada utilizando el cañón de partículas construido según el principio descrito por Zumbrunn (Zumbrunn y col., 1989, Technique 1 (3), 204-216). Se absorbe el ADN plasmídico sobre micropartículas de tungsteno a razón de 4 \mug/mg de tungsteno. Se depositan entonces 2,5 mg de la mezcla de tungsteno/ADN sobre un macroproyectil, que se acelera por la explosión de un cartucho.

El aplastamiento del proyectil sobre una placa de parada horadada por un agujero permite proyectar las micropartículas de tungsteno y ADN a las células.

Medida de la expresión transitoria

TABLA 4 Medio de inducción de callos de maíz a partir de embriones inmaduros (en mg por litro)

3

TABLA 5 Medio de mantenimiento de los callos de maíz (en mg por litro)

4

Sección 24

Expresión transitoria del gen de la \beta-glucu-ronidasa bajo el control del promotor del gen 246C en los tejidos de la cebada y los callos del maíz

La expresión transitoria medida utilizando el substrato X-gluc 48 horas después de bombardear con ayuda de un cañón de micropartículas muestra que el gen de la \beta-glucuronidasa se expresa en las hojas y las raíces de la cebada y también en los callos del maíz.

La intensidad de la expresión es tan fuerte como la inducida por la utilización del plásmido pBI 221 (Clontech), donde el gen de la glucuronidasa está bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor.

El promotor del gen 246C del tabaco es, pues, capaz de dirigir la expresión del gen en las monocotiledóneas.

\newpage

Sección 25

Construcción de un plásmido que pone el gen de la quitinasa del tomate-tabaco bajo el control del promotor inducible y expresión de éste en el tabaco. a) Preparación de la secuencia promotora

Se digiere el plásmido pSG123 antes descrito con las endonucleasas Hind III y Sca I. Tras electroforesis en gel de agarosa, se purifica el fragmento Hind III-ScaI de 2.088 pares de bases, que contiene todo el promotor inducible a excepción de los 57 pares de bases situados inmediatamente aguas arriba del ATG.

La ligación de este fragmento purificado, del oligonucleótido de síntesis Sca I-Bam HI de 62 pares de bases de secuencia [SEC ID Nº: 15] y de un vector pTZ 19R (Pharmacia) linealizado con las endonucleasas Hind III y Bam HI dio lugar al plásmido pPH 111.

A partir de este plásmido pPH 111, cortando con las endonucleasas Hind III-Bam HI y con electroforesis luego en gel de agarosa, se aísla el fragmento Hind III-Bam HI de 2.150 pares de bases que contiene el promotor inducible íntegro.

b) Preparación del fragmento portador de un gen híbrido que codifica para una proteína con actividad endoquitinasa

Se purifica el fragmento BamHI-EcoRI procedente del plásmido pBR1 descrito en la solicitud de patente EP-493.581, Ejemplo 1, y que contiene un gen quimérico codificante de una proteína con actividad endoquitinasa [SEC ID Nº: 16], que comprende la secuencia codificante de una endoquitinasa híbrida del tomate-tabaco (en posición 438-1.587) y el finalizador NOS.

c) Clonación en el vector binario pBIN 19

Se ligó con ADN ligasa T4 la secuencia promotora (véase lo anterior), la secuencia codificante de la quitinasa y la secuencia finalizadora en el vector binario pBIN 19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res., 12, 8711-8721), abierta por medio de las endonucleasas Hind III y EcoRI. Este vector lleva dos genes de resistencia a la kanamicina, uno que puede expresarse en bacterias y el otro situado inmediatamente aguas arriba del gen recombinante completo que puede ser transferido a las células vegetales.

El vector obtenido, denominado pBR 20, es clonado en la cepa de E. coli HB 101 (Clontech).

2) Transformación de Agrobacterium tumefaciens

Se realiza la transformación de la cepa de Agrobacterium tumefaciens 4404 (Clontech) según el método de congelación-descongelación descrito en Plant Molecular Biology Manual (Gelvin y col., antes citado) (resumido en la sección 14) a partir de 1 mg de plásmido pBR20.

3) Transformación del tabaco

Se infectó tabaco, Nicotiana tabacum, cultivado in vitro, con Agrobacterium tumefaciens que contenía el plásmido pBR 20 según el procedimiento de Horsch y col., conocido para el experto en la técnica (Horsch R.B. y col., 1985, Science 227, 1229-1231), cuyas principales etapas se exponen a continuación.

Se incuban discos de hojas axénicas de tabaco, Nicotiana tabacum (variedad Wisconsin Havana 38), en un cultivo de A. tumefaciens que alberga el plásmido pBR 20. Se cultivan los discos, escurridos sobre papel Whatman, en medios de cultivo en placas de Petri para multiplicar las células transformadas y obtener callos. Se transfieren entonces estos callos a medio que contiene cefotaxima a 500 mg/ml, destinada a descontaminar los tejidos vegetales (eliminación de los Agrobacterium tumefaciens), y kanamicina a 100 mg/ml, para seleccionar el material transgénico.

Evidenciación de la expresión de la proteína con actividad endoquitinasa en los tabacos transgénicos a) Preparación de los extractos brutos de proteínas de tabaco transformado

Se prepararon los extractos brutos de proteínas a partir de diferentes tejidos de la planta (raíz, tallo, hoja, etc.). Se congelaron los fragmentos de tejidos en nitrógeno líquido, se redujeron a polvo y se guardaron a -20ºC. Se extrajo el polvo a 4ºC en presencia de tampón acetato de amonio 0,1 M, pH 5,2, y se sometió a centrifugación a 10.000 g. Se determinó la concentración de proteínas totales sobre los sobrenadantes, denominados a continuación extractos brutos de proteínas, siguiendo la técnica de Bradford (Bradford, M.M., 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254).

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b) Evidenciación de la quitinasa híbrida por inmunoimpresión (Western Blot)

Se someten los extractos brutos de proteínas a un Western blot, técnica bien conocida para el experto en este campo y descrita por H. Towbin y col. (Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 76, 1979, 4350-4354).

La inmunodetección de la proteína de interés se realiza gracias a un suero inmune que contiene anticuerpos policlonales que reconocen la proteína híbrida con actividad quitinasa (véase, EP-493.581, sección 5).

Se revela entonces el complejo antígeno-anticuerpo con un sistema de estreptavidina-biotina conjugado a fosfatasa alcalina con el kit RPN 23 de Amersham ("Blotting detection kit"), utilizado según las indicaciones del fabricante.

La impresión obtenida muestra, para las hojas de plantas de tabaco transformadas con el plásmido pBR 20, la presencia de una proteína con un peso molecular aparente de aproximadamente 26 \pm 6 kDa reconocida por los anticuerpos policlonales y ausente en las hojas de tabaco control. Esta proteína tiene el mismo peso molecular aparente que la proteína híbrida con actividad quitinasa descrita en la solicitud EP-493.581.

Sección 26

Localización de las secuencias mínimas del promotor 246C responsables de las características descritas

A partir del vector pSG123, que asocia el promotor del gen 246C al gen de la \beta-glucuronidasa, se efectuaron diferentes deleciones en la región 5' de este promotor. Éstas fueron obtenidas por utilización de enzimas de restricción y/o de la nucleasa Exo3. La extensión precisa de las deleciones fue determinada por secuenciación según el método de Sanger. La figura 3 presenta los diferentes vectores obtenidos con estas deleciones de la parte 5' del promotor, contadas a partir del sitio de iniciación de la transcripción en posición 2.068.

a. Estudio de la fuerza del promotor 246C por expresión transitoria en protoplastos de tabaco

Estos vectores fueron utilizados en expresión transitoria en protoplastos de tabaco que no reciben ningún efector. El análisis de los resultados muestra que se obtiene la máxima expresión con los vectores pSG 251 y pSG 33, alcanzando 30.000 pmol de metilumbeliferona formada/min/mg de proteína. Deleciones más importantes efectuadas en este promotor (correspondientes a los vectores pSG29, pSG23, pSG451, pSG2, pSG24, pSG3 y pSG1) tienen como consecuencia una reducción de la expresión de la glucuronidasa tanto más grande cuanto más importante es la deleción (siguiente tabla).

Deleciones sucesivas de pSG123	Actividad GUS (pmoles/min/mg)

Control	0
pBI221	\sim1.000
pSG123	5.000
pSG251	29.000
pSG33	31.000
pSG29	26.000
pSG23	22.000
pSG451	10.000
pSG2	4.000
pSG14	1.000
pSG3	0
pSG1	0

Los vectores pSG 251 y pSG33 corresponden, respectivamente, a los promotores que contienen la secuencia (B) [vector pSG 33] y la secuencia (C) [vector pSG 251].

b. Estudio de la fuerza del promotor por expresión estable de construcciones quiméricas que contienen promotores suprimidos en tabacos transgénicos

Para cada uno de los vectores descritos por la figura 3, el gen quimérico que asocia el promotor (completo o truncado) a la parte codificante de la glucuronidasa y el finalizador NOS fue purificado en gel de agarosa tras cortar con endonucleasas de restricción HindIII y EcoRI. En cada uno de los casos, el gen quimérico fue introducido y ligado en el vector binario pBIN19 (Clontech) previamente abierto en los sitios HindIII y EcoRI (Sección 13).

Se infectó tabaco, Nicotiana tabacum, cultivado in vitro con Agrobacterium tumefaciens que contenía las diferentes construcciones descritas anteriormente. El procedimiento seguido es el descrito en la Sección 15.

La actividad glucuronidasa es la media de las medidas efectuadas en 10 a 20 transformantes independientes. En ausencia de inductor, la actividad glucuronidasa basal de los diferentes genotipos no resulta sensiblemente afectada por las deleciones para las construcciones que van de pSG251 a pSG451: es sensiblemente idéntica a la de los genotipos que llevan la construcción pSG123 (fig. 3). Por el contrario, para las construcciones pSG2, pSG24, pSG3 y pSG1, la expresión es tanto más débil cuando más corta sea la longitud del promotor: siendo nulas las expresiones para pSG3 y pSG1.

En presencia de inductores bacterianos (véase la sección 17), las plantas que contienen las construcciones pSG251 y pSG33 tienen una expresión estimulada por un factor de 3 con respecto a la construcción pSG123. Esto indica que la parte suprimida correspondiente a la secuencia D [SEC. ID. Nº 6] contiene una secuencia que disminuye la capacidad de inducción del promotor 246 C; por el contrario, la secuencia B [SEC. ID. Nº 4] sola, o en presencia de la secuencia C [SEC. ID. Nº 5] permite una inductilidad superior a la de la secuencia del promotor 246 C (secuencias B+C+D).

La expresión permanece, por el contrario, inalterada para los genotipos que contienen las construcciones pSG29 y pSG23 con respecto a los genotipos que llevan las construcciones pSG123.

Para los genotipos que contienen las construcciones pSG451, pSG2, pSG24, pSG3 y pSG1, la capacidad de inducción es sistemáticamente inferior a las de los genotipos que llevan la construcción pSG123: es tanto más débil cuando más corto es el promotor y se anula para las plantas que llevan las construcciones pSG3 y pSG1.

Estos resultados indican que la secuencia D [SEC. ID. Nº 6] lleva una información de tipo "silenciador" que inhibe parcialmente la capacidad de inducción del promotor completo (secuencias B+C+D).

(1) INFORMACIONES GENERALES:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: BIOGEMMA

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: 1, rue Edouard Colonne

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CIUDAD: PARÍS

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAÍS: Francia

\vskip0.333000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 75001

\vskip0.333000\baselineskip

(G): TELÉFONO: 01 55 34 94 06

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROMOTOR VEGETAL, MICROORGANISMOS Y CÉLULAS VEGETALES QUE CONTIENEN UNA UNIDAD DE EXPRESIÓN DE UNA PROTEÍNA DE INTERÉS QUE COMPRENDE DICHO PROMOTOR

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 18

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): FORMA LEÍBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO DE SOPORTE: Disco flotante

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (OEB)

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 631 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: 246

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): EMPLAZAMIENTO: unión (1..177, 368..631)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: intrón

\vskip0.333000\baselineskip

(B): EMPLAZAMIENTO: 178..367

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: señal misc.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): EMPLAZAMIENTO: 175..182

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRAS INFORMACIONES: /función = "secuencias consenso de ayustamiento"

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: señal misc.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): EMPLAZAMIENTO: 323..333

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRAS INFORMACIONES: /función = "secuencias consenso de ayustamiento"

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: señal misc.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): EMPLAZAMIENTO: 363..368

\vskip0.333000\baselineskip

(C): OTRAS INFORMACIONES: /función = "secuencias consenso de ayustamiento"

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 1:

5

6

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 147 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 2:

7

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 441 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: 246

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 3:

8

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1.096 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 4:

9

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 236 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 5:

10

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 813 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 6:

11

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID.Nº: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3.046 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: 246C

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

12

120

13

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 809 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 8:

14

\vskip0.666000\baselineskip

(2)INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 331 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 9:

15

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 314 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 10:

16

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 161 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATTAAGTAG TCTTTCTTGG AAAAGAAGTA TTTGCAATAT CAAACCAAAT CTTCCCATTA

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCAAGCAAT GACATCTAAG CAAATATATA TCACTATAAA TAGTACTACT AATGTTCAAT

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACTTTTATA AGCACTACAT ATATATTCTC AAACAAAAAG A

\hfill

161

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 307 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 12:

17

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 538 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 13:

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4.284 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 14:

19

20

2000

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 58 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTACTAATG TTCAATGACT TTTATAAGCA CTACATATAT ATACTCAAAC AAAAAGAG

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1.863 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAANNGAANN TTCNNTTC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCNNTTCNN GAANNGAA

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Promotor vegetal, caracterizado por comprender la secuencia (B) [SEC. ID. Nº: 4] que se da a continuación:

24

o una secuencia que tiene un grado de homología de al menos el 80% con la secuencia (B).

2. Promotor según la reivindicación 1, caracterizado por comprender, aguas arriba de la secuencia (B), la secuencia (C) [SEC. ID. Nº: 5] que se da a continuación:

25

o una secuencia que tiene un grado de homología elevado con la secuencia (C).

3. Promotor según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por comprender, aguas arriba de la secuencia (B), la secuencia (D) [SEC. ID. Nº: 6] que se da a continuación:

26

o una secuencia que tiene un grado de homología elevado con la secuencia (D).

4. Utilización de un promotor según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para obtener, en situación de estrés, la sobreexpresión en un vegetal de una proteína de interés, cuya proteína puede estar destinada a ayudar a los vegetales a superar un estado de estrés.

5. Células vegetales, a excepción de las células vegetales presentes en el estado natural, microorganismos (bacterias) o células de microorganismos que han integrado una unidad de expresión de una proteína que comprende el promotor vegetal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Vegetal o parte de vegetal, caracterizado por contener células vegetales según la reivindicación 5.

7. Semilla caracterizada por contener células vegetales según la reivindicación 5.

8. Utilización de un vegetal o de una parte de un vegetal según las reivindicaciones 6 y 7 para seleccionar moléculas con actividad fitosanitaria susceptible de inducir reacciones de defensa naturales de los vegetales contra organismos fitopatógenos o fitófagos (hongos, bacterias, virus, insectos y nemátodos).