ES2212272T3

ES2212272T3 - Anhidrovinblastina para el tratamiento del cancer.

Info

Publication number: ES2212272T3
Application number: ES98909249T
Authority: ES
Inventors: Bruce Schmidt; James Kutney; Lawrence Mayer
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 1997-03-04
Filing date: 1998-03-04
Publication date: 2004-07-16
Anticipated expiration: 2018-03-04
Also published as: AU6388598A; DE69819875T2; WO1998039004A1; HK1026610A1; US20020103218A1; CA2219095A1; US6326376B1; NZ337752A; EP0969839A1; DK0969839T3; EP0969839B1; ATE254460T1; DE69819875D1

Abstract

La presente invención está particularmente dirigida al uso de un derivado de vinblastina, la 3'',4''-anhidrovinblastina (AHVB), que difiere de las vinblastina en que posee un doble enlace en la posición 3'',4'' del núcleo de carantina, en lugar del grupo hidroxilo que está presente en la estructura original, como agente antineopl sico en el tratamiento terapéutico del cáncer.

Description

Anhidrovinblastina para el tratamiento del cáncer.

Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, al uso de alcaloides de la vinca antineoplásicos como agentes antitumorales. De manera más particular, la presente invención se refiere a proporcionar el uso de un derivado de vinblastina, anhidrovinblastina (denominada en lo sucesivo AHVB), como agente antineoplásico con propiedades terapéuticas mejoradas, que muestra una dosis tolerada máxima significativamente aumentada y menor toxicidad que el compuesto original y compuestos relacionados.

Antecedentes de la invención

Debido a un elevado grado de imposibilidad de predicción, las técnicas clásicas de desarrollo de fármacos son inventivas. Principalmente, a través de un proceso de eliminación, se analizan en un alto número de productos naturales y compuestos químicos sintéticos los efectos deseados, utilizando una serie de sistemas crecientemente complejos, que se inician con un sencillo ensayo in vitro a nivel celular, progresan a ensayos con animales y, finalmente, ensayos clínicos en seres humanos. Pero, debido a características esenciales tales como adsorción, distribución y metabolismo, los ensayos in vitro iniciales, que no pueden tomar en consideración estas características, podrían eliminar un potente fármaco que no rinda de manera adecuada en estos sistemas sencillos. El fármaco podría metabolizar en diferentes compuestos en modelos animales que en humanos, lo que podría poner de manifiesto también diferentes patrones de adsorción y distribución. O, por último, los compuestos pueden presentar un aspecto muy prometedor durante todo el proceso, hasta los ensayos clínicos, pero, entonces, evidenciar desagradables efectos secundarios o un alto grado de tolerancia al ser utilizado por la población humana en general. Nunca resulta evidente qué compuesto seguirá pareciendo prometedor cuando se inicia una nueva etapa de ensayos y desarrollo.

En cierta medida, se ha logrado controlar el crecimiento tumoral usando alcaloides oncolíticos de la vinca como agentes antitumorales solos o en combinación con otros medicamentos antineoplásicos en la quimioterapia del cáncer desde hace más de 20 años. Se han extraído aproximadamente 30 alcaloides, con un extenso intervalo de actividades farmacológicas, de la Vinca rosea (Catharanthus roseus), conocida comúnmente como vincapervinca. De éstos, sólo vinleurosina, vinrosidina, vinblastina y vincristina poseen una actividad antitumoral importante. En particular, se han utilizado ampliamente vinblastina y vincristina como agentes únicos y en combinación con fármacos antineoplásicos externos en la quimioterapia del cáncer. Además de los alcaloides de origen natural, se han sintetizado algunos análogos de alcaloides de la vinca por transformación funcional por medio de procesos semi-sintéticos (RJ Cersosimo et al., Pharmacotherapy 3:359-374, 1983;P. Mangency et al., Org. Chem. 44:3765-3768, 1979; R. Maral et al., Cancer Lett. 22:49- 54, 1984).

Desde el punto de vista químico, estos alcaloides de la vinca tienen una estructura dímera asimétrica compuesta por dos núcleos unidos por un enlace carbono-carbono; un núcleo dihidroindol (vindolina), que es el principal alcaloide contenido en la vincapervinca, y el núcleo indol catarantina (Figura 1). La diferencia estructural entre vincristina y vinblastina se encuentra en la posición R1, en tanto que vinblastina y vindesina se diferencian con respecto a los sustituyentes R2 y R3.

Falta todavía por comprender del todo el modo de acción de los alcaloides antineoplásicos de la vinca. Sin embargo, se ha establecido que la actividad antitumoral está directamente relacionada con la alta afinidad de fijación de estos compuestos por latubulina, la subunidad proteica básica de los microtúbulos (R.A. Bender y B. Chabner, en: Chabner (ed) Pharmacol. Princ. of Cancer Treat., Sauders, Phil, PA, pág 256, 1982; W.A. Creasey, en: Hahn (ed) Antibiotica, Vol. 2, Springer, Berlín, pág. 414, 1979). Se ha creado el consenso de que estos agentes detienen la mitosis celular en la metafase, impidiendo la polimerización de la tubulina para formar microtúbulos, e induciendo depolimerización (R.J. Owellen y C.A. Hartke, Cancer Res., 36:1499- 1504, 1976; R.H. Himes y R.N. Kersey, Cancer Res., 36:3798-3806, 1976; R.S. Camplejohn, Cell Tissue Kinet. 13:327-332, 1980). En sentido exacto, los alcaloides de la vinca son agentes antimitóticos específicos para el ciclo celular, o venenos para el huso. La afinidad de fijación de los alcaloides de la vinca a la tubulina se correlaciona escasamente con la capacidad relativa de vincristina, vinblastina y vindesina para inhibir el crecimiento celular (R.S. Camplejohn, véase antes; P.J. Ferguson y C.E. Cass, Cancer Res., 45:5480- 5488, 1985). Por consiguiente, la diferencia principal en la actividad antitumoral de estos fármacos parece estar relacionada con su retención en el tejido tumoral (P. Ferguson, véase antes; J.K. Horton et al., Biochem. Pharmacol. 37:3996-4000, 1988). De manera similar, los diferentes perfiles de toxicidad de los alcaloides de la vinca parecen estar relacionados con la captación tisular y las propiedades de retención más que la una diferente afinidad de fijación con la tubulina. Por ejemplo, los estudios han demostrado que vincristina es más potente que vinblastina o vindesina en bloquear el rápido transporte axoplásmico en las células nerviosas (S. Ochs y R. Worth, Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 16:70, 1976; S.Y. Chan et al., J. Neurobiol. 11:251-264, 1980). Además, se incorpora en los nervios 4 veces más rápido que los otros fármacos (Z. Iqbal y S. Ochs, J. Neurobiol., 11:251-264, 1980), y exhibe una prolongada fase de eliminación terminal de aclaramiento plasmático, lo que permite sugerir una exposición más prolongada a vincristina que a los otros alcaloides de la vinca (R.L. Nelson et al., Cancer Treta. Rev. 7:17-24, 1980).

Las diferencias in vitro e in vivo observadas entre los alcaloides de la vinca son llamativas, dadas las sutiles alteraciones químicas que muestran los diversos agentes en relación con su grande y compleja estructura molecular. Por ejemplo, vincristina es muy eficaz en el tratamiento del rabdosarcoma humano trasplantado a ratones desnudos, en tanto que vinblastina no es activa en este sistema (N. Bruchovsky et al., Cancer Res. 25:1232-1238, 1965). La diferencia se obtiene sencillamente como resultado de la sustitución de un grupo aldehído con un grupo metilo en posición R1. Además, la sustitución química da lugar a una variación del perfil de toxicología, de forma que la neuropatía periférica (en ausencia de toxicidad hematológica) limita la dosis en el ser humano para vincristina, en tanto que la anemia y leucopenia limitan típicamente la dosis para vinblastina (W.P. Brads, Proc. Int. Vincaalkaloid Symposium, 95-123, 1980; S.S. Lega, Med. Toxicol., 1:421-427, 1986). Se ha observado un perfil terapéutico especialmente interesante en un nuevo alcaloide de la vinca semi-sintético, denominado Navelbine® (vinorelbina, 5'-noranhidroblastina). Este compuesto es menos potente que vinblastina y vincristina contra la leucemia P388 y L1210 de ratón, pero es activo contra células derivadas del cáncer de pulmón humano, mientras que los otros alcaloides de la vinca son inactivos (S. Cros et al., Seminars in Oncology, 16:15-20, 1989). Igualmente, ensayos clínicos de Navelbine® confirman su utilidad en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (A. Depierre et al., Am. J. Clin.Oncol., 14:155-119, 1991; A. Yokohama et al., Am. Soc. Clin. Oncol., 11:967, 1992). El perfil de toxicidad de este agente parece ser similar al de vinblastina, siendo las toxicidades hematológicas y no los efectos secundarios neurológicos los que limitan la dosis.

Vincristina ha demostrado ser particularmente útil como agente oncolítico administrado por vía intravenosa en combinación con otros agentes oncolíticos, para el tratamiento de diversos cánceres, incluida la leucemia del sistema nervioso central, la enfermedad de Hodgkin, linfosarcoma, sarcoma de células del retículo, rabdomiosarcoma, neuroblastoma y tumor de Wilms. Es sólo para uso intravenoso y la administración intratecal resulta siempre mortal. Tras dosis únicas semanales, la reacción adversa más frecuente es la pérdida del cabello; las más problemáticas son de origen neuromuscular. Cuando se emplean dosis únicas semanales del fármaco, pueden producirse reacciones adversas tales como leucopenia, dolor neurítico, estreñimiento y dificultad para caminar. Otras reacciones adversas descritas incluyen calambres abdominales, ataxia, "caída del pie" (parálisis de los músculos anteriores de la pierna, "footdrop" en inglés), pérdida de peso, atrofia óptica con ceguera, ceguera cortical transitoria, fiebre, manifestaciones sobre los nervios craneales, parestesia y adormecimiento de los dedos, poliuria, disuria, úlceras de la cavidad bucal, cefaleas, vómitos, diarrea y necrosis y/o perforación intestinales.

Navelbine® (tartrato de vinorelbina) es un nuevo alcaloide de la vinca en el cual la unidad caterantina es el sitio de modificación estructural. Se estima también que su actividad antitumoral obedece principalmente a su capacidad para interferir con la actividad microtubular, inhibiendo de esta forma la mitosis en la metafase a través de la interacción con la tubulina. Está indicada en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas avanzado, como agente único o en combinación, administrado solamente por vía intravenosa. Sus efectos secundarios incluyen flebitis o lesión por extravasación, puesto que es un vasicante moderado. Estudios sobre efectos adversos basados en el uso de Navelbine® como agente único indican que la granulocitopenia es la toxicidad más importante limitante de la dosis, si bien, en general, fue reversible y no acumulativa en el tiempo. Las toxicidades neurológicas más frecuentemente comunicadas incluyen neuropatía periférica leve a moderada, que se manifiesta por parestesia e hipersestesia, que se producen en 10% de los pacientes. Náuseas leves a moderadas se producen en aproximadamente una tercera parte de los pacientes tratados con Navelbine®, en tanto que una parte ligeramente menor sufre estreñimiento, vómitos, diarrea, anorexia y estomatitis.

Queda por desarrollar compuestos que exhiban menores efectos tóxicos con igual o mayor actividad quimioterapéutica. Existe, por lo tanto, la necesidad de un fármaco que proporcione una eficacia antitumoral mejorada para el tratamiento del cáncer.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para tratar el cáncer, que comprende administrar a un paciente humano enfermo de cáncer y que requiera tratamiento, una cantidad de AHVB eficaz para detener o ralentizar de forma significativa el avance de la enfermedad.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para utilizar AHVB como agente antitumoral, que comprenda una cantidad terapéutica de la sustancia clínica de la presente invención para detener el crecimiento tumoral.

Los anteriores y otros diversos objetos y ventajas de la presente invención se alcanzan mediante la administración de un derivado de vinblastina, AHVB. La siguiente descripción detallada de la presente invención permitirá poner de manifiesto otros objetos y ventajas de la misma.

Sumario de la invención

La presente invención está dirigida, de forma particular, al uso de un derivado de vinblastina, la 3',4'-anhidrovinblastina (AHVB), que se diferencia de vinblastina por poseer un doble enlace en la posición 3',3' del núcleo de catarantina, y no por el grupo hidroxilo que se encuentra presente en la estructura original, como agente antineoplásico en el tratamiento terapéutico del cáncer.

Una realización de la presente invención comprende el uso de 3', 4'-anhidrovinblastina, o variantes de la misma, como agente antineoplásico en el tratamiento del cáncer.

Otra realización de la presente invención comprende el uso de 3', 3'-anhidrovinblastina como agente antineoplásico en el tratamiento del cáncer, en la que la concentración máxima de 3',4'-anhidrovinblastina es significativamente mayor que las concentraciones terapéuticamente aceptables de vincristina o Navelbine® usadas en el tratamiento del cáncer.

Todavía otra realización de la presente invención comprende el uso de 3',4'-anhidrovinblastina como agente antineoplásico en el tratamiento del cáncer cervical.

Todavía una realización adicional de la presente invención comprende el uso de 3',4'-anhidrovinblastina como agente antineoplásico en el tratamiento del cáncer de pulmón.

Tablas y figuras

La Tabla 1 muestra la citotoxicidad relativa de vincristina, AHVB y Navelbine® sobre líneas de células tumorales.

La Tabla 2 muestra las estimaciones de dosificaciones de toxicidad subaguda del sulfato de vincristina, Navelbine® y AHVB administrados a ratas NB machos sanas en forma de inyección intraperitoneal única.

La Tabla 3 muestra datos del retraso del crecimiento del tumor sólido C-4.

La Figura 1 muestra la estructura química de algunos alcaloides de la vinca.

La Figura 2 muestra una comparación de efectos de la administración de inyecciones intraperitoneales únicas, a una dosis tóxica subaguda, de vincristina, Navelbine® y AHVB a ratas Nb portadoras de trasplantes de tumor Nb2-U17 subcutáneos, únicos y bien desarrollados, sobre el peso medio del tumor y peso medio de la rata en función del tiempo.

La Figura 3 muestra la comparación de los efectos de administrar una inyección intraperitoneal única, a media dosis tóxica subaguda, de vincristina, Navelbine® y AHVB a ratas Nb portadoras de trasplantes de tumor Nb2-U17 subcutáneos, únicos y bien desarrollados, sobre el peso medio del tumor y peso medio de la rata en función del tiempo.

La Figura 4 muestra las variaciones del peso medio de los animales en ratones BDF-1 portadores de tumores P388 intraperitoneales tras la administración i.v. de solución salina fisiológica, vincristina, Navelbine® y AHVB.

La Figura 5 muestra un ejemplo de curva de citotoxicidad usada para determinar la CI_{50} de diversos alcaloides de la vinca.

La Figura 6 muestra la actividad anti-tumor P388 de formulaciones seleccionadas de alcaloides de la vinca.

La Figura 7 muestra una curva de respuesta a la dosis obtenida para AHVB durante su uso para tratar ratones BDF-1 portadores de tumores P388.

La Figura 8 muestra curvas de citotoxicidad utilizadas para determinar la CI_{50} de AHVB sobre las líneas celulares SKOV3 y C-4.

La Figura 9 muestra el peso medio tumoral en gramos, en función del tiempo (período de 30 días), tras la administración en los días 1, 5 y 9 de Navelbine®, bisulfato de AHVB, ditartrato de AHVB y control.

Descripción detallada de la invención

Existen numerosos derivados o variaciones posibles de vinblastina. Sin embargo, no se dispone de la certeza, ni tan siquiera para los expertos en el campo del desarrollo de fármacos anticancerosos, de que cualquiera de estos derivados será tan eficaz o, incluso, más eficaz que el compuesto original. Esto implica múltiples ensayos y experimentación.

El término "variantes" a efectos de 3',4'-anhidrovinblastina significa cualquier estructura química que sea un derivado de 3',4'-anhidrovinblastina obtenida por la sustitución conservadora de grupos laterales, exhibiendo, sin embargo, propiedades antineoplásicas iguales o similares a las de 3', 4'-anhidrovinblastina.

Caracterización de la actividad antitumoral de AHVB in vitro

Se llevaron a cabo experimentos de citotoxicidad con AHVB en forma de comparaciones directas con vincristina y Navelbine®, con el objeto de evaluar su perfil antineoplásico inherente contra diversos tipo de células tumorales, en relación con otros alcaloides de la vinca relevantes. Se investigó la citotoxicidad de AHVB in vitro contra un conjunto de líneas de células tumorales de diverso linaje para determinar la especificidad de su actividad antitumoral con respecto al tipo de célula. Las líneas tumorales estudiadas fueron: leucemia linfocítica P388 (una leucemia linfocítica de ratón), linfoma U17 de rata Noble (Nb), carcinoma de mama humano MCF7, carcinoma de pulmón de células no pequeñas humano H460, eritroleucemia humana K562 y carcinoma de colon humano LS 180, basadas en protocolos de análisis de citotoxicidad de nuevos fármacos anticancerosos in vitro NCI establecidos.

Los ensayos estándares de citotoxicidad de respuesta a la dosis (R. Mosmass, J. Immunol. Meth., 65:55-64, 1983) se utilizaron para determinar la CI_{50} (concentración de fármaco necesaria para inducir una inhibición de 50% del crecimiento de la célula tumoral) para vincristina, Navelbine® y AHVB. Los resultados se presentan en la Tabla 1. Las líneas celulares indicadas se obtuvieron de los depósitos de tumores de ATCC o NCI y se cultivaron en medios de cultivos para tejidos por técnicas estándares bien conocidas para los expertos en la técnica, antes de su dilución a una concentración definida de células requerida para los estudios en placas de 96 pocillos.

Se expuso un amplio intervalo de concentraciones de fármacos a células tumorales cultivadas en fase log en placas de microtitulación de 96 pocillos. Las concentraciones celulares dependieron de la línea celular, así como de la duración del período de cultivo. De manera típica, las células P388 se sembraron en placas a una concentración de 30.000, 2.000 y 750 células por pocillo para los estudios de 1, 3 y 7 días de duración, respectivamente. Las células MCF7 se sembraron en placas a una concentración de 7.000 y 1.500 células por pocillos para los estudios de 3 y 7 días de duración, respectivamente. Las células H460 se sembraron en placas a una concentración de 2.500 y 1.000 células por pocillo para los estudios de 3 y 7 días de duración, respectivamente. Las células K562 se sembraron en placas a una concentración de 1.500 y 10.000 células por pocillo para los estudios de 3 y 7 días de duración, respectivamente. Las células LS 180 se sembraron en placas a una concentración de 5.000 y 2.000 células por pocillo para los estudios de 3 y 7 días de duración, respectivamente. Después de la siembra en placas, todas las líneas celulares se incubaron (incubador de CO_{2} a 37ºC, 5% de CO_{2}) durante 24 horas antes de la adición del agente citotóxico (véase
Tabla 1).

TABLA 1

1

Seguidamente, las placas se incubaron durante el período de tiempo indicado. En los tiempos específicos, las células se lavaron y, subsiguientemente, se expusieron al marcador de inclusión de tinción MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio), que se acumuló en las células viables. MTT se agregó a las células en una concentración final de 50 \mug por pocillo. Después de una incubación de 4 horas, las células se lavaron para eliminar el medio y el MTT que no había reaccionado, antes de la adición de DMSO necesario para solubilizar el precipitado insoluble de formazán que se formó en las células viables. Después de mezclar la muestra mediante pipeteo repetido, se midió el producto coloreado empleando un lector de placa que operó a 570 nm. Se consideró que los valores de absorbancia obtenidos para las células cultivadas en ausencia de fármaco representaron una viabilidad de 100%. Los experimentos se repitieron para poner de manifiesto cualquier diferencia observada entre AHVB y otros alcaloides de la
vinca.

Caracterización de la actividad antitumoral de AHVB in vivo

La evaluación de la citotoxicidad in vitro fue seguida de estudios relativos a la actividad antineoplásica de AHVB en tres modelos de roedores in vivo. De esta forma, se determinó la actividad antitumoral de AHVB usando un modelo de tumor sólido de rata (linfoma U17), el modelo de tumor P388 de ratón (R. Noble et al., Cancer Res., 37:1455-1460, 1977; P.W. Good et al., Biochem. Cell Biol., 64:659-666, 1986) y un modelo en ratón de Tumor H460 SC.

La línea celular U17 derivó originalmente de un linfoma maligno trasplantable que surgió de manera espontánea en ratas Noble machos (British Columbia Cancer Research Centre Joint Animal Breeding Facility, de padres obtenidos de los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD). La línea celular es dependiente de la prolactina y se puede cultivar fácilmente in vitro. Los tumores sólidos derivados de U17 se generan por inyección subcutánea (por medio del método del trocar) de un pequeño trozo (2 mm^{2}) de tejido tumoral obtenido de rata Noble macho. Los tejidos tumorales usados para los implantes surgieron dos semanas después de la inyección de 5 x 10^{6} células U17 (de cultivo) por vía subcutánea en la nuca. Para evaluar la actividad antitumoral de AHVB, los animales portadores de tumores (tumores de 2-4 g) recibieron un tratamiento único de fármaco y se midió el tamaño del tumor como función del tratamiento siguiente. La actividad antitumoral se evaluó con una serie de diferentes dosis para determinar la dosis terapéutica máxima de AHVB. Se llevaron a cabo estudios comparativos entre vincristina, vinblastina y AHVB. Para estos estudios, la actividad antitumoral se determinó a la dosis terapéutica máxima de cada fármaco.

Los estudios antitumorales en ratones se centraron, en un caso, en el modelo de leucemia P388. Se trata de un modelo NCI estándar para la evaluación de nuevos agentes anticancerosos, habiéndose demostrado que es sensible al tratamiento con alcaloides de la vinca. Este es un modelo de tumor ascítico generado por inoculación intraperitoneal de 1 x 10^{6} células P388 (derivadas de cultivo, con una línea celular original obtenida del depósito de tumores NCI) en ratones BDF1 (Charles Rivers). Un día después de la inoculación de células tumorales, se trató a los ratones con una única inyección intravenosa de fármaco. El peso de los animales se controló a diario y la progresión del tumor se midió como incremento del peso de los animales y por la estimación del tiempo de supervivencia. La terapia se describió como un descenso de la progresión del tumor y un aumento del tiempo de supervivencia en relación con un grupo de control no tratado. Los estudios iniciales establecieron la dosis terapéutica máxima de AHVB. Posteriormente, se llevaron a cabo estudios comparativos con vincristina y Navelbine®, en los cuales los animales se trataron con cada fármaco a la dosis terapéutica máxima.

En la experimentación, se siguieron estrictamente las Directrices de Cuidados de Animales del Consejo Canadiense y todos los protocolos animales empleados fueron aprobados por los Comités de Cuidados de Animales de la UBC y la BCCA. En los animales se evaluaron dos veces al día signos de estrés (relacionados con el tumor o el fármaco) y si parecía estar sufriendo (pérdida o ganancia excesiva de peso, letargo, piel en mal estado, etc.), se le sacrificó de inmediato.

Identificación de la dosis máxima tolerada de AHVB

Se realizaron estudios de toxicidad aguda (14 días) de dosis única para establecimiento de la dosis en ratas Nb machos sanas para determinar la máxima dosis tolerada de sulfato de vincristina, Navelbine® y AHVB administrados como inyección intraperitoneal única a estos roedores (véase Tabla 2).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Estimación de las dosificaciones tóxicas subagudas de sulfato de vincristina, Navelbine® y AHVB administrados a ratas Nb machos sanas en forma de inyección intraperitoneal única

2

Con este fin, se distribuyeron ratas Nb machos sanas, no portadoras de tumores (intervalo de peso 333-339 gramos) en grupos de 3 animales. Cada grupo se utilizó para ensayar un fármaco a una dosificación. En un grupo, cada animal recibió una inyección intraperitoneal a una dosis particular, como se indica en la Tabla 2. Los volúmenes en los que se administraron los fármacos dependieron de la concentración de la solución del fármaco (en solución salina) y del peso de los animales, y se encontraron en un intervalo de 0,1 - 1,0 ml. Se utilizó solución salina como control. La dosis máxima de cada fármaco que permitió la supervivencia de todos los animales en un grupo (3 de 3) se consideró como la dosificación tóxica subaguda para el fármaco, es decir, 0,7 mg/kg para vincristina, 2,0 mg/kg para Navelbine® y 3,0 mg/kg para AHVB.

La salud de los animales se evaluó mediante mediciones diarias del peso, además de indicaciones conductuales de estrés. Se continuó la monitorización de los animales durante la totalidad de los 14 días del período de estudio. Los animales se sometieron a eutanasia en caso de aparición de signos de estrés grave o pérdidas de peso superiores a 20%. Todos los animales se sometieron a necropsia al final del período de estudio, o en el momento de la eutanasia prematura. En el momento en que se registró una pérdida de peso superior a 20% o una muerte prematura del animal a un nivel de dosis, la dosis se redujo hasta que el punto más bajo de la pérdida de peso fue inferior a 20% y no se observaron muertes prematuras de animales.

Estudios en el modelo de linfoma U17 de rata

Se inyectaron en la nuca de ratas Nb machos maduras (5 ratas: 310-380 gramos; 5 x 10^{6} células/rata en 1 ml de medio de cultivo), anestesiadas con metoxiflurano, y utilizando una aguja de calibre 20 de 1,5'', cultivos de la línea de linfoma pre TNb2, no metastático desarrollado originalmente en la Universidad de Columbia Británica y designada Nb2-U17 (Anticancer Research, 14:2485-2492, 1994), y que se encuentran disponibles en el British Columbia Cancer Research Centre Cells a partir de cultivos en suspensión de Nb2-U17 de crecimiento exponencial. Aproximadamente 3 semanas después, cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 4-7 cm (longitud + anchura), los animales fueron sacrificados y los tumores se usaron para trasplante como se describe más adelante.

El tumor procedente de una rata se escindió, se trituró y el tejido tumoral se insertó en trocares (2'', calibre 13). Las muestras de tejido se implantaron de forma subcutánea en la nuca de ratas Nb machos, anestesiadas con metoxiflurano (248-404 gramos; 1 trocar por rata). Este procedimiento se repitió 5 veces para obtener un total de 60 ratas portadoras de tumores a utilizar en los estudios de eficacia de los 3 fármacos.

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Cuando los tumores estuvieron bien establecidos (1,5 a 2 semanas más tarde), se seleccionaron tres grupos separados de 20 ratas, lo más comparables posible tanto en lo que respecta al peso del tumor como al peso del animal, para la administración de las tres sustancias de ensayo (es decir, un grupo para cada sustancia).

Vincristina se administró a ratas con un peso de 281-384 gramos, portadoras de tumores con un peso de 6,3 - 16,3 gramos. Navelbine® se administró a ratas con un peso de 274-389 gramos, portadoras de tumores con un peso de 9,1-23,3 gramos. AHVB se administró a ratas con un peso de 303-400 gramos, portadoras de tumores con un peso de 7,9-25,9 gramos. Los pesos de los tumores se estimaron usando el modelo semi-elipsoidal (peso en gramos = longitud x profundidad x \pi/6 en cm).

Los efectos oncolíticos de cada uno de los tres fármacos se evaluaron a una dosis tóxica subaguda, determinada para cada fármaco en estudios preliminares, en los que se emplearon ratas Nb machos maduras, no portadoras de tumores, es decir, 3,0, 2,0 y 0,7 mg/kg para AHVB, Navelbine® y vincristina, respectivamente, tal como se ilustra en la Figura 2. Adicionalmente, cada fármaco se evaluó a 50% y 25% de su dosis tóxica subaguda. Se utilizaron cinco ratas portadoras de tumores para evaluar el efecto de cada nivel de dosis. Los fármacos se administraron por vía intraperitoneal en forma de bolo único, en un volumen de 0,19-0,31 ml, tal como lo indicó el peso de los animales. A este efecto, las preparaciones de fármacos se diluyeron a las concentraciones apropiadas, usando solución salina ajustada con ácido acético a pH 4,2. Para cada fármaco, un grupo de 5 ratas de control recibió una inyección intraperitoneal de la cantidad equivalente de solución salina (pH 4,2). Las ratas portadoras de tumores se organizaron en los grupos siguientes:

Grupo	Fármaco/Sol. salina	Dosis (mg/kg)
1	Sol. salina	-
2	AHVB	3,0
3	AHVB	1,5
4	AHVB	0,75
5	Sol. salina	-
6	Navelbine®	2,0
7	Navelbine®	1,0
8	Navelbine®	0,5
9	Sol. salina	-
10	Vincristina	0,7
11	Vincristina	0,35
12	Vincristina	0,175

Tras la administración de las sustancias de ensayo, se determinaron diariamente el peso de los animales y el tamaño del tumor (empleando calibres), hasta que el tumor alcanzó un peso estimado de 35 gramos, o comenzó a ulcerarse, momento en el que los animales fueron sacrificados (por inhalación de dióxido de carbono) y sometidos a necropsia. Asimismo, los animales fueron monitorizados, al menos diariamente, en busca de signos de estrés durante la totalidad del estudio. Los animales que manifestaron síntomas graves de estrés (rápida pérdida de peso, respiración difícil, postura encorvada, piel en mal estado) también fueron sacrificados y sometidos a necropsia.

El sulfato de anhidrovinblastina (3',4'-dehidrovinblastina) se obtuvo de la Agencia del Cáncer de Columbia Británica (BCCA), Sección de Fármacos en Investigación. El sulfato de vincristina (sulfato de 22-oxovinvaleucoblastina) se obtuvo de los Laboratorios David Bull, Ltda., Australia. Navelbine® (tartrato de vinorelbina; di-L-tartrato de 3',4'-didehidro-4'-desoxi-C'' norvincaleucoblastina) se adquirió en Burroughs Wellcome Inc., Canadá; la Solución de Cloruro Sódico al 0,9% USP, pH 4,2, se adquirió en Baxter.

La metodología aplicada a los animales contó con la aprobación del Comité Institucional para el Cuidado de Animales (IACC) de la UBC de BCCA antes de llevar a cabo los estudios (Certificado de Cuidado de Animales nº A94-1602). Durante el estudio, los cuidados, alojamiento y uso de animales se llevó a cabo de acuerdo con las Directrices de Cuidados de Animales del Consejo Canadiense.

Los resultados de los estudios de eficacia se ofrecen en las Figuras 2-3. Las Figuras 2-3 presentan los promedios de datos de 5 o menos animales.

En la Figura 2 se muestra el efecto de administrar una única dosis tóxica subaguda e intraperitoneal, de AHVB, Navelbine® y vincristina sobre el tamaño de trasplantes únicos y bien establecidos de linfoma Nb2-U17 (peso medio 10-13 gramos) y sobre el peso de los animales, en función del tiempo. En tanto que los tumores de los animales de control siguieron aumentando de tamaño hasta un peso medio de aproximadamente 40 gramos en 6 días, los tumores en los animales tratados con los fármacos regresaron, en cada caso, a una ausencia práctica de palpación dentro de los 5 días siguientes a la administración del fármaco. Después del día 10, se produjo la recurrencia de los tumores en los animales tratados con Navelbine® y AHVB en aproximadamente la misma medida. Por el contrario, no se observó recurrencia de los tumores en los animales tratados con vincristina (ni tan siquiera en el día 29). La Figura 2 muestra también que los animales perdieron peso tras la administración de los fármacos. Sin embargo, se recuperó la mayor parte del peso perdido después de aproximadamente 17 días. Como controles para cada fármaco, se utilizaron ratas portadoras de trasplantes tumorales Nb2-U17 inyectadas con solución salina. En cada uno de los seis grupos, se utilizaron 5 animales. El sulfato de vincristina (0,7 mg/kg) se administró en un volumen de 0,20-0,23 ml a ratas con un peso de 281-331 gramos, portadoras de tumores con un peso de 7,6-14,2 gramos. Navelbine® (2,0 mg/kg) se administró en un volumen de 0,24-0,31 ml a ratas con un peso de 297-389 gramos, portadoras de tumores con un peso de 11,5-13,7 gramos. AHVB (3,0 mg/kg) se administró en un volumen de 0,20-0,24 ml a ratas con un peso de 314-374 gramos, portadoras de tumores con un peso de 8,2-14,2 gramos. A los controles del sulfato de vincristina, se administró solución salina en un volumen de 0,21-0,26 ml a ratas con un peso de 294-370 gramos, portadoras de tumores con un peso de 9,4-14,6 gramos. Los controles de Navelbine® recibieron solución salina administrada en un volumen de 0,25-0,29 ml a ratas con un peso de 310-365 gramos, portadoras de tumores con un peso de 8,5-18,2 gramos. Los controles de AHVB recibieron solución salina administrada en un volumen de 0,19-0,25 ml a ratas con un peso de 303-400 gramos, portadores de tumores con un peso de 7,9-16,6 gramos. La eficacia de cada fármaco se determinó por separado a tres diferentes dosificaciones frente a un control.

La Figura 3 muestra los efectos antitumorales de los tres fármacos a 50% de sus dosis toleradas máximas individuales. Los datos demuestran que Navelbine® fue menos potente que AHVB que, a su vez, fue menos potente que vincristina.

Se utilizaron como controles ratas portadoras de trasplantes de tumor Nb2-U17 inyectadas con solución salina. Para cada uno de los seis grupos, se utilizaron cinco animales. El sulfato de vincristina (0,35 mg/kg) se administró en un volumen de 0,23-0,27 ml a ratas con un peso de 327-384 gramos, portadoras de tumores con un peso de 6,4-13,4 gramos. Navelbine® (1,0 mg/kg) se administró en un volumen de 0,24-0,28 ml a ratas con un peso de 296-351 gramos, portadoras de tumores con un peso de 9,1-14,1 gramos. AHVB (1,5 mg/kg) se administró en un volumen de 0,24-0,28 ml a ratas con un peso de 308-359 gramos, portadoras de tumores con un peso de 9,7-19,5 gramos. Controles de sulfato de vincristina: se administró solución salina en un volumen de 0,21-0.26 ml a ratas con un peso de 294-370 gramos, portadoras de tumores con un peso de 9,4-14,6 gramos. Controles de Navelbine®: se administró solución salina en un volumen de 0,26-0,29 ml a ratas con un peso de 310-365 gramos, portadoras de tumores con un peso de 9,5-18,2 gramos. Controles de AHVB: se administró solución salina en un volumen de 0,19-0,25 ml a ratas con un peso de 303-400 gramos, portadoras de tumores con un peso de 7,9-16,6 gramos. La eficacia de cada fármaco se determinó por separado a tres niveles de dosificación diferentes frente a un control. En la Figura 3 se comparan los resultados de los tres fármacos a dosificaciones equivalentes, es decir, media dosis tóxica subaguda. Los controles de la Figura 3 son los mismos que en la Figura 2.

Estudios en el modelo P388 de ratón

Se generó una curva de citotoxicidad para determinar la CI_{50} de vincristina, Navelbine® y AHVB en la línea celular P388 de ratón (véase la Figura 5). En este estudio, se separaron de los eritrocitos, en primer lugar, células P388 derivadas de tumores ascíticos cultivados en BDF1, empleando Ficoll-Paque. Los leucocitos aislados se lavaron dos veces y, a continuación, se colocaron en suero que contenía medio de cultivo de tejidos (1 x 10^{5} células por ml de RPMI 1640 suplementado con L-glutamina, penicilina, estreptomicina y suero bovino fetal al 10%), y se cultivó durante 2 horas. Se recogieron todas las células no adherentes y dicha población celular se definió como células P388 que se utilizaron para los ensayos de citotoxicidad 24 horas más tarde. Los ensayos de citotoxicidad se llevaron a cabo de la forma descrita en la sección titulada "Caracterización de la actividad antitumoral de AHVB in vitro". Las concentraciones de fármaco utilizadas se indican en el eje X. Vincristina se representa mediante círculos macizos, Navelbine® por triángulos macizos y AHVB, por cuadrados macizos.

La actividad antitumoral in vivo de AHVB se comparó con la de vincristina, Navelbine® en el modelo P388 de ratón BDF1 en el procedimiento siguiente. Las células P388 procedieron de la ascitis de ratones BDF1 hembras previamente inyectadas (19-21 gramos). Se inocularon células P388, del depósito de tumores de NCI, directamente en los ratones. Las células llegaron del NCI congeladas en partes alícuotas de 1 ml. Estas muestras se descongelaron rápidamente a 37ºC y, a continuación, se inyectaron (en el plazo de 1 hora) por vía intraperitoneal en dos ratones, 0,5 ml por ratón. Una semana (7 días) después de la inoculación, se cosecharon las células tumorales, retirando el líquido peritoneal mediante el uso de una jeringuilla estéril con una aguja del calibre 22. Las células, combinadas de 2 animales, se sometieron a recuento utilizando un hemocitómetro, se diluyeron (medio RPMI) a una concentración de 2 x 10^{6} células/ml y se reinyectaron 0,5 ml en cada uno de los dos ratones BDF1. Las células remanentes se lavaron, se depositaron en medio que contenía DMSO y se congelaron (en envases de congelación que enfrían a una velocidad definida). Este proceso se repitió semanalmente durante un período de 2 semanas. Las células utilizadas para estudios antitumorales se recogieron desde el tercer pasaje hasta el 20º pasaje. Después el 20º pasaje, las células ya no se utilizaron para estudios experimentales. A partir de las células congeladas, preparadas de la forma anteriormente descrita, se derivaron células recién establecidas.

Grupos (cinco ratones por grupo) de ratones BDF1 hembras (Charles Rivers, Canadá) recibieron inyecciones (intraperitoneales) de 10^{6} células P388 (como se ha descrito anteriormente). Un día después de la inoculación de las células tumorales, los ratones recibieron una inyección de bolo intravenoso del fármaco indicado, a través de la vena caudal lateral. Los grupos de control recibieron inyecciones de solución salina. Se prepararon muestras de fármaco libre el día de la inyección, de modo que las concentraciones finales fueron suficientes para suministrar la dosis del fármaco indicado en un volumen de 200 \mul. Todas las diluciones se realizaron usando Inyección de Cloruro Sódico al 0,9% USP. Durante las inyecciones intravenosas, se inmovilizó brevemente (menos de 30 seg) a los ratones. La dilatación de la vena se logró sujetando a los animales bajo una lámpara de calor durante un período de cinco a diez minutos. Tras la administración de las sustancias de ensayo, los animales se pesaron diariamente durante 14 días y se monitorizó la aparición de signos de estrés dos veces al día durante los primeros 14 días (una vez al día en los fines de semana), y una vez al día durante el resto del estudio. Los animales con fuerte distrés fueron sacrificados por inhalación de CO_{2} y se registró la hora de la muerte al día siguiente. Aunque se completaron titulaciones completas de dosis para cada fármaco, los datos que se muestran en la Figura 6 son los obtenidos tras la administración de los fármacos libres a su dosis máxima tolerada. Éstas fueron de 3, 40 y 40 mg/kg para vincristina, Navelbine® y AHVB, respectivamente.

La Figura 4 muestra los resultados de un estudio que demostró que los alcaloides de la vinca indujeron pérdida de peso tras una única inyección intravenosa del fármaco indicado a la máxima dosis tolerada (véase la Figura 6). Estos datos se obtuvieron como parte de un estudio detallado en la Figura 6. Después de tratar ratones (portadores del tumor P388) con una única dosis del fármaco indicado, los animales se examinaron dos veces al día durante los 14 primeros días (una vez al día en los fines de semana). Se determinó diariamente el peso corporal medio durante este período de tiempo y los resultados se muestran en la Figura 4. La ganancia de peso en los controles es una indicación de progresión del tumor. Los resultados indican que AHVB, administrado a 40 mg/kg, es el menos tóxico de los tres fármacos evaluados.

En la Figura 7 se presenta la curva de respuesta a la dosis para AHVB utilizado para tratar ratones BDF1 portadores de tumores P388. Los estudios se llevaron a cabo de la forma descrita en la Figura 6. La dosis tolerada máxima de AHVB (40 mg/kg), tal como se especifica en estos estudios, refleja una reacción tóxica muy aguda (en el plazo de 1 hora) que limita incrementos adicionales de la dosis para la administración i.v. de AHVB. Esto contrasta con la toxicidad más prolongada observada para Navelbine® a su máxima dosis tolerada, sugiriendo que la capacidad de eludir la toxicidad aguda de AHVB podría conducir a incrementos significativos de su máxima dosis tolerada.

Basándose en la observación de los estudios analíticos in vitro de los fármacos, resulta sorprendente comprobar que AHVB podría actuar de forma adecuada como agente antineoplásico en la terapia del cáncer. Los ensayos in vitro indican que AHVB es consistentemente 10 a 16 veces menos activo, sobre una base molar (Tabla 1 y Figura 5) que vincristina y Navelbine®. Estos resultados señalan que AHVB no podría ser adecuado como agente antitumoral. Sin embargo, en un estudio de eficacia, en el que también se empleó la línea celular P388 (véase la Figura 6), la actividad antitumoral de AHVB a su máxima dosis tolerada (40 mg/kg, inyección i.v. única) es significativamente mejor que la observada con vincristina (administrada a la máxima dosis tolerada del fármaco libre de 3 mg/kg). La actividad antitumoral mejorada, en este caso, se mide por el número de supervivientes a largo plazo (>60 días). Es importante destacar que, para este ejemplo, AHVB es aproximadamente 10 veces menos tóxico (sobre una base ponderal) que vincristina. Por lo tanto, se pueden administrar 10 veces más de fármaco y es a esta dosis cuando se observaron las mejorías en la supervivencia a largo plazo de los animales con tumores P388. En comparación con Navelbine®, los resultados in vitro son todavía más sorprendentes, puesto que la máxima dosis tolerada de los dos fármacos en animales portadores de tumores P388 es aproximadamente igual (40 mg/kg).

La Figura 8 muestra la citotoxicidad de AHVB sobre células SKOV3 y células C-4 con una incubación de 3 días. Las CI_{50} para células SKOV3 y C-4 fueron 0,4 \muM y 0,02 \muM, respectivamente, Las dos líneas celulares se obtuvieron de ATCC y se cultivaron usando técnicas y medios convencionales de cultivo, según se ha descrito anteriormente. Las CI_{50} se determinaron mediante ensayos convencionales de citotoxicidad anteriormente descritos, conteniendo cada pocillo aproximadamente 10^{4} células.

Estudios en el modelo de ratón del tumor H460 SC

En el Centro de Investigación del Cáncer de Columbia Británica hubo disponibles cultivos de células de Pulmón Humano H460. Se inyectaron dos veces células por vía subcutánea en ratones Rag-2 machos maduros (24 ratones, 1 x 10^{6} células/ratón), usando una aguja de calibre 26. Las células H460 se suspendieron en Solución Salina Equilibrada de Hank sin calcio. Se permitió la formación de tumores en los ratones durante 11 días.

Una vez que los tumores estuvieron bien establecidos, se seleccionaron cuatro grupos separados de ratones para la administración de las tres sustancias de ensayo (es decir, un grupo para cada sustancia de ensayo: bisulfato de AHVB, ditartrato de AHVB y Navelbine®), y un control.

Bisulfato y ditartrato de AHVB y Navelbine® se disolvieron usando dextrosa al 5% saturada con argón. Todas estas sustancias estuvieron a uuna concentración de 20 mg/ml Cualquier dilución de dosis se realizó con dextrosa al 5%.

Las sustancias se administraron por vía intravenosa en los días 1, 5 y 9, recibiendo los controles dextrosa al 5%. Diariamente se determinaron el peso corporal y mediciones del tumor, usando calibres, durante los 10 primeros días y, seguidamente, en días alternos durante el resto del estudio.

Tras la administración de las sustancias de ensayo, se determinaron diariamente el peso de los animales y el tamaño del tumor (usando calibres) durante los primeros 10 días y, a continuación, en días alternos durante el resto del estudio. Si el tamaño del tumor alcanzó 1 gramo de peso o empezó a ulcerarse, los animales fueron sacrificados (por inhalación de dióxido de carbono), sometiéndolos a necropsia. Asimismo, se controlaron al menos a diario los signos de estrés durante la totalidad del estudio. Los animales que manifestaron síntomas graves de estrés (rápida pérdida de peso, respiración difícil, postura encorvada, piel en mal estado) también fueron sacrificados, realizando la necropsia.

El sulfato de anhidrovinblastina (3',4'-dehidrovinblastina) se obtuvo de la Agencia del Cáncer de Columbia Británica (BCCA), Sección de Fármacos de Investigación. Navelbine® (tartrato de vinorelbina; di-L-tartrato de 3',4'-didehidro-4'-desoxi-C''-norvincaleuco-blastina) se adquirió en Glaxo/Burroughs Wellcome, Inc., Canadá.

Los resultados de los estudios de eficacia se ofrecen en la Figura 9 y presentan los promedios de datos de 6 o menos animales. Cada ratón en un grupo determinado de sustancia tuvo dos tumores subcutáneos en el lomo. Se midieron la longitud y anchura de cada tumor, calculando el volumen de cada uno de ellos (L x A)^{2}/2. Seguidamente, se promediaron los dos volúmenes tumorales. Los promedios de volumen de todos los ratones/grupo se promediaron para dar un valor medio para el punto de dato único que aparece en el gráfico de la Figura 8. El cálculo se realizó cada día en que se midieron los tumores. La desviación estándar de la media y el error estándar de la media se calcularon con las barras de error que aparecen en el gráfico de la Figura 9.

Estudios en el modelo de tumor sólido C-4 (cervical)

En el Centro de Investigación del Cáncer de Columbia Británica hubo disponibles cultivos de células de Carcinoma Cervical Humano C-4. Las células se inyectaron dos veces por vía subcutánea en ratones Rag-2 machos maduros (24 ratones, 1 x 10^{6}células/ratón) utilizando una aguja de calibre 26. Las células C-4 se suspendieron en Solución Salina Equilibrada de Hank sin calcio. Los tumores se dejaron crecer en el ratón durante 31 días.

Una vez que los tumores estuvieron bien establecidos, se seleccionaron cuatro grupos separados de ratones para la administración de las tres sustancias de ensayo (es decir, un grupo para cada sustancia de ensayo: bisulfato de AHVB, ditartrato de AHVB y Navelbine®) y un control.

El bisulfato y ditartrato de AHVB y Navelbine® se disolvieron usando dextrosa al 5% saturada con argón. Estas sustancias se administraron a dosis de 20 mg/kg i.v.. Cualquier dilución de la dosis se realizó con dextrosa al 5%.

Las sustancias se administraron por vía intravenosa en los días 1, 5 y 9, y los controles recibieron dextrosa al 5%. Durante el período del estudio, de 69 días, se determinaron regularmente los pesos corporales y las mediciones de los tumores, con calibres.

Tras la administración de las sustancias de ensayo, se determinaron regularmente durante el período de estudio el peso de los animales y el tamaño de los tumores (usando calibres). En el caso que el tamaño del tumor alcanzó 1 gramo de peso o empezó a ulcerarse, los animales fueron sacrificados (por inhalación de dióxido de carbono), y sometidos a necropsia. Asimismo, se controlaron al menos a diario los signos de estrés durante la totalidad del estudio. Los animales que manifestaron síntomas graves de estrés (rápida pérdida de peso, respiración difícil, postura encorvada, piel en mal estado) también fueron sacrificados, realizando la necropsia.

Los resultados de los estudios de eficacia se ofrecen en la Tabla 3 y presentan los promedios de los datos de 6 o menos animales. Cada ratón en un grupo determinado de sustancia tuvo dos tumores subcutáneos en el lomo. Se midieron la longitud y anchura de cada tumor, calculando el volumen de cada uno de ellos (L x A)^{2}/2. Seguidamente, se promediaron los dos volúmenes tumorales. Los promedios de volumen de todos los ratones/grupo se promediaron para dar un valor medio para el punto de dato único que aparece en el gráfico de la Figura 8. El cálculo se realizó cada día en que se midieron los tumores.

Los tumores tratados con Navelbine® alcanzaron su "umbral de crecimiento" detectable en el día 41 y continuaron creciendo de manera constante, en tanto que el ditartrato de AHVB alcanzó el umbral el día 55. El tumor tratado con bisulfato de AHVB mostró un crecimiento despreciable hasta el día 69. Navelbine determinó un retardo de 84% en el crecimiento del tumor, el ditartrato de AHVB tuvo un retardo extendido de 106% y el bisulfato de AHVB exhibió un marcado retardo del crecimiento tumoral superior a 209%. El crecimiento del tumor no alcanzó el umbral detectable de crecimiento durante 70 días. Estos datos aparecen en la Tabla 3 siguiente.

TABLA 3

3

Considerados en su conjunto, los resultados que se presentan aquí demuestran que AHVB posee propiedades significativas y únicas in vivo que dan lugar a mejorías importantes en la eficacia antitumoral in vivo, en relación con otros alcaloides de la vinca tales como vincristina y Navelbine®. Estos resultados son únicos y nuevos, puesto que la previsión de la actividad in vivo de AHVB parecía ser significativamente menor sobre la base de los estudios de citotoxicidad in vitro.

La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto, según se describe en las reivindicaciones, en combinación con uno o más diluyentes o coadyuvantes farmacológicamente aceptables, inertes o fisiológicamente activos. Los compuestos de la invención se puede liofilizar y, si se desea, combinar con otros excipientes farmacológicamente aceptables para preparar formulaciones para su administración. Estas composiciones se pueden presentar en cualquier forma apropiada para la vía de administración prevista. Las vías de administración preferidas son las vías parenteral e intravenosa.

3',4'-anhidrovinblastina se puede administrar por vía oral, tópica, parenteral, por inhalación o nebulización, o por vía rectal en formulaciones de dosis unitarias que contienen vehículos, coadyuvantes y excipientes atóxicos convencionales, farmacológicamente aceptables. El término parenteral, como se usa en este documento, incluye inyecciones subcutáneas, inyecciones intravenosas, intramusculares, intraesternales o técnicas de infusión. Adicionalmente, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende 3',4'-anhidrovinblastina y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 3',4'-anhidrovinblastina se puede presentar asociada con uno o más vehículos y/o diluyentes y/o coadyuvantes atóxicos, farmacéuticamente aceptables y, si así se desea, con otros ingredientes activos. Las composiciones farmacéuticas que contienen 3',4'-anhidrovinblastina pueden encontrarse en una forma adecuada para uso oral, por ejemplo, en forma de comprimidos, discos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires.

Las composiciones previstas para ser utilizadas por vía oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier técnica conocida para la fabricación de composiciones farmacéuticas, y estas composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo consistente en agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y conservantes, con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y de sabor agradable. Los comprimidos contienen el ingrediente activo mezclado con excipientes atóxicos, farmacéuticamente aceptables, adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes tales como carbonato de calcio, carbonato sódico, lactosa, fosfato de calcio o fosfato sódico; agentes granuladores y desintegrantes, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo, almidón, gelatina o acacia, y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden carecer de recubrimiento o pueden estar recubiertos mediante técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y conseguir, de esta forma, una acción sostenida durante un período más prolongado de tiempo. Por ejemplo, se puede utilizar un material retardante tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Las formulaciones para uso oral se pueden presentar también como cápsulas de gelatina dura, en las que el ingrediente activo está mezclado con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda, en las que el ingrediente activo está mezclado con agua o un medio oleoso, por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos mezclados con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Estos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropil-metilcelulosa, alginato sódico, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma acacia; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser una fosfatida de origen natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de polietileno-sorbitán. Las suspensiones acuosas pueden contener, igualmente, uno o más conservantes, por ejemplo, p- hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina.

Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo los ingredientes activos en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de semilla de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de cacahuete, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un espesante, por ejemplo, cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden agregar agentes edulcorantes tales como los mencionados anteriormente, y agentes saborizantes para proporcionar preparaciones orales de sabor agradable. Estas composiciones se pueden conservar con la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.

Los polvos y gránulos dispersables, adecuados para la preparación de una suspensión acuosa por medio de la adición de agua, proporcionan el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Agentes dispersantes o humectantes, y agentes de suspensión adecuados se corresponden con los ya anteriormente mencionados. Asimismo, pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden encontrarse también en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de semillas de cacahuetes, o un aceite mineral, por ejemplo, parafina líquida o mezclas de éstos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas de origen natural, por ejemplo, goma acacia o goma tragacanto, fosfatidas de origen natural, por ejemplo, soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán, y productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietilen-sorbitán. Las emulsiones pueden contener, también, agentes edulcorantes y saborizantes.

Los jarabes y elixires se pueden formular con agentes edulcorantes, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Estas formulaciones pueden contener también un demulgente, un conservante y agentes saborizantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril, la cual se puede formular de acuerdo con técnicas conocidas, usando los agentes dispersantes o humectantes adecuados y los agentes de suspensión anteriormente mencionados. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente atóxico, aceptable por vía parenteral, por ejemplo, en forma de una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, se utilizan convencionalmente aceites fijos, estériles, como medio de disolución o suspensión. A este efecto, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos los mono- y diglicéridos sintéticos. Adicionalmente, se utilizan ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de inyectables.

Del mismo modo, 3',4'-anhidrovinblastina se puede administrar en forma de supositorios para la administración rectal del fármaco. Estas composiciones se pueden preparar mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado, que sea sólido a temperaturas normales, pero líquidos a la temperatura rectal y que, por lo tanto, se funda en el recto para liberar el fármaco. Estos materiales son mantequilla de cacao y polietilenglicoles.

3',4'-anhidrovinblastina se puede administrar por vía parenteral en un medio estéril. El fármaco, dependiendo del vehículo y de la concentración utilizados, se puede suspender o disolver en el vehículo. De manera ventajosa, se pueden disolver en el vehículo coadyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y agentes tamponantes.

Para los compuestos de esta invención, la dosis a administrar, ya sea dosis única, dosis múltiple o una dosis diaria, variará según el compuesto particular utilizado. Los factores que se deben considerar al decidir un régimen de dosis incluyen potencia del compuesto, vía de administración, tamaño del receptor y naturaleza de la enfermedad del paciente.

La dosificación administrada no está sujeta a límites definidos, sino que normalmente será una cantidad eficaz. Habitualmente, será el equivalente, sobre una base molar, de la forma libre, farmacológicamente activa, producida a partir de una formulación de dosificación, basada en la liberación metabólica del fármaco activo libre, para alcanzar sus efectos farmacológicos y fisiológicos deseados.

Un oncólogo experto en el tratamiento del cáncer podrá determinar, sin experimentaciones innecesarias, los protocolos adecuados para la administración eficaz de los compuestos de la presente invención, haciendo referencia a los anteriores estudios sobre vinblastina y sus derivados.

AHVB, un derivado del alcaloide de la vinca Vinblastina, ha demostrado un significativo potencial citotóxico contra una serie de líneas celulares de cánceres humanos, así como una actividad importante contra el injerto heterólogo tumoral del carcinoma de pulmón de células no pequeñas H460 humano en ratones SCID/Rag-2. Los ensayos de citotoxicidad in vitro que utilizaron el ensayo de citotoxicidad MTT con un tiempo de exposición al fármaco de 72 horas, han demostrado que AHVB es un fármaco citotóxico activo con valores de CI_{50} en el intervalo de 20-24 nM contra las líneas celulares del carcinoma de pulmón de células no pequeñas H460 humano, el carcinoma cervical humano C-4, la leucemia humana K562 y epidermoides humanas A431. AHVB fue aproximadamente 10 veces menos activo que Navelbine® en los ensayos in vitro contra las mismas líneas celulares. Sorprendentemente, sin embargo, al ensayar AHVB in vivo en experimentos de eficacia sobre tumores sólidos, se encontró que fue más potente que Navelbine®. Se inocularon por vía s.c. en ratones SCID/Rag-2 células H460 y, después de 12 días de crecimiento tumoral, se administraron AHVB y Navelbine® por vía i.v. a dosis de 10 mg/kg y 20 mg/kg en los días 1, 5 y 9 en este modelo. AHVB provocó una inhibición mayor del crecimiento tumoral y fue menos tóxico que Navelbine®. Estos resultados sugieren que AHVB puede tener propiedades farmacológicas deseables para aplicaciones terapéuticas.

Se debe entender que los ejemplos descritos anteriormente no limitan en absoluto el alcance de la presente invención. Numerosas variantes resultarán evidentes para los expertos en la técnica correspondiente a la presente invención, sin que se aparten delespíritu de la presente invención. Las reivindicaciones anexas, adecuadamente interpretadas, constituyen la única limitación sobre el alcance de la presente invención.

Claims

1. 3',4'-anhidrovinblastina, o sales farmacéuticamente aceptables de la misma, para utilizar en el tratamiento de carcinomas en un mamífero.

2. 3',4'-anhidrovinblastina, o sales farmacéuticamente aceptables de la misma, según la reivindicación 1, en el que el carcinoma es un cáncer de mama, un cáncer cervical, un cáncer de pulmón o un cáncer de colon.

3. 3',4'-anhidrovinblastina, o sales farmacéuticamente aceptables de la misma, según la reivindicación 1 ó 2, en el que el carcinoma es un cáncer de mama.

4. 3',4'-anhidrovinblastina, o sales farmacéuticamente aceptables de la misma, según la reivindicación 1 ó 2, en el que el carcinoma es un cáncer cervical.

5. 3',4'-anhidrovinblastina, o sales farmacéuticamente aceptables de la misma, según la reivindicación 1 ó 2, en el que el carcinoma es un cáncer de pulmón.

6. 3',4'-anhidrovinblastina, o sales farmacéuticamente aceptables de la misma, según la reivindicación 1 ó 2, en el que el carcinoma es un cáncer de colon.

7. 3',4'-anhidrovinblastina, o sales farmacéuticamente aceptables de la misma, para utilizar en el tratamiento de un sarcoma en un mamífero.

8. 3',4'-anhidrovinblastina, o sales farmacéuticamente aceptables de la misma, para utilizar en el tratamiento de un linfoma en un mamífero.

9. 3',4'-anhidrovinblastina, o sales farmacéuticamente aceptables de la misma, según la reivindicación 8, en el que el linfoma es un linfoma de células T.

10. 3',4'-anhidrovinblastina, o sales farmacéuticamente aceptables de la misma, para utilizar en el tratamiento de la leucemia en un mamífero.

11. 3',4'-anhidrovinblastina, o sales farmacéuticamente aceptables de la misma, según la reivindicación 10, en el que la leucemia es una eritroleucemia.

12. La sal farmacéuticamente aceptable de 3',4'-anhidrovinblastina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha sal es sulfato de 3',4'-anhidrovinblastina, bisulfato de 3',4'-anhidrovinblastina o ditartrato de 3',4'-anhidrovinblastina.

13. 3',4'-anhidrovinblastina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha sal se utiliza a una concentración máxima aproximadamente diez veces superior a las concentraciones terapéuticamente aceptables para vincristina.

14. Uso de 3',4'-anhidrovinblastina, o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un carcinoma en un mamífero.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que el carcinoma es un cáncer de mama, un cáncer cervical, un cáncer de pulmón o un cáncer de colon.

16. Uso según la reivindicación 14 ó 15, en el que el carcinoma es un cáncer de mama.

17. Uso según la reivindicación 14 ó 15, en el que el carcinoma es un cáncer cervical.

18. Uso según la reivindicación 14 ó 15, en el que el carcinoma es un cáncer de pulmón.

19. Uso según la reivindicación 14 ó 15, en el que el carcinoma es un cáncer de colon.

20. Uso de 3',4'-anhidrovinblastina, o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del sarcoma en un mamífero.

21. Uso de 3',4'-anhidrovinblastina, o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del linfoma en un mamífero.

22. Uso según la reivindicación 21, en el que el linfoma es un linfoma de células T.

23. Uso de 3',4'-anhidrovinblastina, o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento e la leucemia en un mamífero.

24. Uso según la reivindicación 23, en el que la leucemia es una eritroleucemia.

25. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 24, en el que 3',4'-anhidrovinblastina se encuentra presente a una concentración máxima que es aproximadamente diez veces superior a las concentraciones terapéuticamente aceptables para vincristina.

26. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 25, en el que la sal farmacéuticamente aceptable de 3',4'-anhidrovinblastina es sulfato de 3',4'- anhidrovinblastina, bisulfato de 3',4'-anhidrovinblastina o ditartrato de 3',4'- anhidrovinblastina.

27. Una composición terapéutica o farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de 3',4'-anhidrovinblastina, o sales farmacéuticamente aceptables de la misma, y uno o más diluyentes o coadyuvantes farmacéuticamente aceptables y fisiológicamente inertes o activos, en la que 3',4'-anhidrovinblastina está presente a una concentración máxima que es aproximadamente diez veces superior a las concentraciones terapéuticamente aceptables para vincristina para utilizar en el tratamiento de un carcinoma en un mamífero.

28. La composición según la reivindicación 27, en la que el carcinoma es cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de pulmón o cáncer de colon.

29. La composición según la reivindicación 27 ó 28, en la que el carcinoma es cáncer de mama.

30. La composición según la reivindicación 27 ó 28, en la que el carcinoma es cáncer cervical.

31. La composición según la reivindicación 27 ó 28, en la que el carcinoma es cáncer de pulmón.

32. La composición según la reivindicación 27 ó 28, en la que el carcinoma es cáncer de colon.

33. Una composición terapéutica o farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de 3',4'-anhidrovinblastina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y uno o más diluyentes o coadyuvantes farmacéuticamente aceptables y fisiológicamente inertes o activos, en la que 3',4'-anhidrovinblastina se encuentra presente a una concentración máxima que es aproximadamente diez veces superior a las concentraciones terapéuticamente aceptables para vincristina para utilizar en el tratamiento de un sarcoma en un mamífero.

34. Una composición terapéutica o farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de 3',4'-anhidrovinblastina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y uno o más diluyentes o coadyuvantes farmacéuticamente aceptables y fisiológicamente inertes o activos, en la que 3',4'-anhidrovinblastina se encuentra presente a una concentración máxima que es aproximadamente diez veces superior a las concentraciones terapéuticamente aceptables para vincristina para utilizar en el tratamiento de un linfoma en un mamífero.

35. La composición de la reivindicación 34, en la que la leucemia es una eritroleucemia.

36. Una composición terapéutica o farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de 3',4'-anhidrovinblastina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y uno o más diluyentes o coadyuvantes farmacéuticamente aceptables y fisiológicamente inertes o activos, en la que 3',4'-anhidrovinblastina se encuentra presente a una concentración máxima que es aproximadamente diez veces superior a las concentraciones terapéuticamente aceptables para vincristina para utilizar en el tratamiento de un linfoma en un mamífero.

37. La composición de la reivindicación 36, en la que el linfoma es un linfoma de células T.

38. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 27-37, en la que dicha sal farmacéuticamente aceptable es el sulfato de 3',4'- anhidrovinblastina, el bisulfato de 3',4'-anhidrovinblastina o el ditartrato de 3',4'-anhidrovinblastina.