ES2212340T3 - Secuencias de peptidos como regiones bisagra en fragmentos de inmunoglobulina similares a proteinas y su uso en medicina. - Google Patents

Abstract

Un péptido de fórmula (1) NTCPPCPXYCPPCPAC (1) en el que X e Y, que pueden ser iguales o diferentes, son, cada uno de ellos, un resto de L-aminoácido alifático neutro y los derivados protegidos y reactivos del mismo.

Description

Secuencias de péptidos como regiones bisagra en fragmentos de inmunoglobulina similares a proteínas y su uso en medicina.

Esta invención se refiere a péptidos que funcionan como regiones bisagra en las proteínas, a las proteínas que contienen tales regiones bisagra y al uso de tales proteínas en medicina.

En las aplicaciones clínicas de la terapia y el diagnóstico por imagen mediante anticuerpos, frecuentemente, se requiere la avidez de una especie de anticuerpo dimérico para conseguir una afinidad eficaz del anticuerpo in vivo, pero sin las funciones efectoras o la permanencia prolongada en suero conferidas mediante el dominio Fc (ref. 1-3 - véase la lista de la "bibliografía" para los artículos científicos que se mencionan mediante números en el presente documento de aquí en adelante). Las moléculas F(ab')_{2} satisfacen este requerimiento y pueden producirse mediante ruptura proteolítica de IgG monoclonal de isotipos apropiados comediante el uso de dominios derivados de inmunoglobulinas recombinantes producidas en E. coli.

La capacidad de secretar fragmentos de anticuerpos al periplasma oxidante de E. coli ha conducido a avances rápidos en la ingeniería de fragmentos Fab' introducidos y expresados en una alta concentración. De un modo importante, el uso de E. coli también permite la rentabilidad y la producción rápida de la cantidad de sustancia de anticuerpos requerida para abastecer un gran mercado (ref. 4, 5). Frecuentemente, el Fab' modificado se expresa con solamente una cisteína bisagra. La cisteína puede usarse para unir otros Fab' para hacer un F(ab')_{2} o para unir moléculas efectoras terapéuticas tales como radionucleidos, enzimas o toxinas (ref. 6).

Se han publicado diversos enfoques para modificar proteínas para producir especies divalentes de unión a antígenos in vivo en E. coli, usando tanto scFv como Fab' modificados. Las modificaciones sencillas de la bisagra no proporcionan rendimientos sustanciales in vivo de las especies diméricas a partir de E. coli (ref. 7-9). Las técnicas para aumentar la dimerización in vivo están bien caracterizadas, pero, frecuentemente, usan motivos de dimerización grandes que no son de inmunoglobulinas, que son potencialmente inmunógenos y que pueden provocar reducciones graves en el nivel de expresión de la proteína soluble (ref. 10-13). La forma más sencilla para producir especies diméricas de unión a antígenos sigue siendo la reticulación directa con puentes disulfuro o la reticulación química de Fab' in vitro (ref. 2, 7, 14, 15). La elección del enlace covalente entre los dos Fab' es importante. Si el F(ab')_{2} se corta in vivo, entonces las moléculas Fab' resultantes sufren tanto pérdida de avidez como una rápida eliminación a partir de la circulación (ref. 1, 2). Se sabe que los enlaces disulfuro únicos son más susceptibles de ser escindidos in vivo que los enlaces disulfuro, sulfuro o tioéter protegidos (ref. 2, 9, 16). Sin embargo, se ha encontrado, previamente, que dos puentes disulfuro, como se encuentran en la región bisagra del F(ab')_{2} aislado partir de la ruptura proteolítica de la IgG1, son tan robustos como un enlace tioéter, a juzgar por su permanencia en el suero (ref. 9).

Hay una necesidad de especies de anticuerpos diméricos que no sean inmunógenos que superen el problema de la escisión fácil in vivo mientras siga siendo eficaz su elaboración y el acoplamiento de otras moléculas efectoras. Los autores de la invención han encontrado un péptido que, cuando es parte de una proteína mayor tal como un fragmento Fab', genera eficazmente dímeros y proporciona una sustancia dimérica que es muy resistente a la reducción química in vitro y que tiene tiempos de permanencia en el suero largos in vivo. De una manera ventajosa, el péptido es bien tolerado por E. coli y, hasta la fecha, los ensayos han mostrado que no es inmunógeno.

De este modo, de acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un péptido de fórmula (1):

(1)^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C}

en el que X e Y, que pueden ser iguales o diferentes, son, cada uno de ellos, un resto de L-aminoácido neutro y alifático; y derivados protegidos y reactivos del mismo.

En la fórmula (1) y en los otros péptidos descritos de aquí en adelante, se usaron las abreviaturas ordinarias de una letra para representar los restos de aminoácidos, excepto cuando se indique de otro modo. Los superíndices "N" o "C" se usan para indicar, respectivamente, el resto N o C-terminal de un péptido.

Los restos de L-aminoácidos neutros, representados por cada uno de los grupos X e Y, incluyen restos de glicina, alanina, valina, leucina, Isoleucina, serina y treonina.

Los derivados protegidos de los péptidos de fórmula (1) incluyen derivados protegidos en los extremos N y C en los que el grupo amino N-terminal o el grupo carboxilo C-terminal está unido a un grupo protector. Los derivados protegidos en N incluyen, por ejemplo, derivados, opcionalmente sustituidos, benciloxicarbonilamino, aliloxicarbonilamino, cicloalcoxicarbonilamino, t-butoxicarbonilamino, trifluoroacetilamino, ftalilamino, aralquilamino, por ejemplo, bencilamino, difenilmetilamino o trifenilmetilamino, tosilamino o formilamino. Los derivados protegidos en C incluyen, por ejemplo, ésteres, tales como los ésteres de alquilo, por ejemplo, metilo, etilo o t-butilo, de aralquilo, por ejemplo, bencilo o bencidrilo, de sililo, por ejemplo, trimetilsililo y de ftalimidometilo, opcionalmente sustituidos, y ésteres con polímeros, por ejemplo, resinas a base de estireno funcionalizadas.

Los derivados reactivos de los péptidos de fórmula (1) incluyen aquellos en los que el grupo carboxilo C-terminal está funcionalizado y es, por ejemplo, un halogenuro de acilo tal como un cloruro de acilo, un cianuro de acilo o azida, un anhídrido, un éster, por ejemplo, una N-hidroxisuccinimida, éster de p-nitrofenilo o pentaclorofenilo, un heterociclo de N-acilo tal como un imidazol, pirazol o triazol de N-acilo o un ácido activado mediante la adición de un reactivo de carbodiimida o isoxazolio.

Los péptidos particularmente útiles de fórmula (1) incluyen aquellos en los que X es un resto de alanina. En otra preferencia, Y es, en particular, un resto de treonina. Un péptido especialmente útil de acuerdo con la invención tiene la fórmula (2):

(2)^{N}TCPPCPATCPPCPA^{C}

y los derivados protegidos y reactivos del mismo.

Los péptidos de acuerdo con la invención pueden prepararse a partir de los aminoácidos apropiadamente activados y/o protegidos [por ejemplo, utilizando derivados reactivos y grupos protectores de los tipos mencionados en conexión con los péptidos de fórmula (1)], usando técnicas de síntesis de péptidos ordinarias [véase, por ejemplo, Merrifield, B. Science (1985), 232, 341-347].

La presencia de cuatro restos de cisteína en cada péptido de fórmula (1) proporciona cuatro centros para la formación de un enlace disulfuro y/o tioéter, permitiéndose, de este modo, la reacción con otras moléculas que contienen grupos reactivos tiol. En particular, las proteínas diméricas pueden obtenerse mediante la incorporación de péptidos en las cadenas de proteína y la invención se extiende a tal uso. Para conseguir la dimerización de la proteína, primero debe acoplarse un péptido de fórmula (1) a una cadena de proteína existente o sintetizarse de novo como parte de ésta y, por tanto, los autores de la invención proporcionan en otro aspecto de la invención una proteína que comprende una cadena de polipéptido caracterizada porque dicha cadena contiene una secuencia aminoacídica ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C}, en la que X e Y son como se define en el péptido de fórmula (1).

La invención también se extiende a las proteínas que contienen dos cadenas de polipéptidos covalentemente unidas a través de los restos de cisteína de ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C}, como se explicó anteriormente y, de este modo, de acuerdo con un aspecto adicional de la invención, los autores de la invención proporcionan una proteína que comprende dos cadenas de polipéptidos caracterizadas porque cada una de tales cadenas contiene una secuencia de aminoácidos ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C} [en la que X e Y son como se define en el péptido de fórmula (1)] y cada cadena está covalentemente unida a la otra a través de uno, dos, tres o cuatro restos de la cisteína presente en cada una de dichas secuencias de aminoácidos.

En las proteínas de acuerdo con la invención la secuencia de aminoácidos ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C} es, preferentemente, una secuencia ^{N}TCPPCPAYCPPCPA^{C} o ^{N}TCPPCPXTCPPCPA^{C}, especialmente la secuencia ^{N}TCPPCPATCPP
CPA^{C}.

Las proteínas de acuerdo con la invención pueden ser proteínas que se presentan de un modo natural a las que se ha acoplado el péptido de fórmula (1), o proteínas recombinantes que incorporan la secuencia de aminoácidos ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C}. Generalmente, las proteínas pueden ser estructurales o, especialmente, proteínas de unión. Las proteínas de unión particulares incluyen hormonas, citoquinas, factores estimulantes de colonias, factores de crecimiento, factores de liberación, vehículos iónicos, toxinas y receptores de los mismos, incluyendo todos o parte de los receptores asociados con la unión a moléculas asociadas a la superficie celular, el receptor de linfocitos T, CD4, CD8, CD28, receptores de citoquinas, por ejemplo un receptor de interleuquina, el receptor de TNF o el receptor de interferón, receptores de factores estimulantes de colonias, por ejemplo, G-CSF o GM-CSF, factores de crecimiento derivados de plaquetas, por ejemplo, PDGF-\alpha y PDGF-\beta y , en particular, anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos.

Cuando la proteína de acuerdo con la invención tiene una cadena peptídica que contiene una secuencia de aminoácidos ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C}, puede ser una proteína monomérica o estar unida, de un modo separado, a una o más de otras cadenas polipeptídicas para formar una estructura multimérica global. En estas proteínas de la invención que contienen dos cadenas polipeptídicas con secuencias ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C} covalentemente unidas, la proteína será, claramente, al menos, dimérica pero también puede consistir en otras cadenas unidas, de un modo separado, para formar una estructura multimérica global. Los dímeros y multímeros pueden estar compuestos de más de un tipo de cadena polipeptídica y pueden ser homo o heteroméricos.

La producción de proteínas de acuerdo con la invención puede conseguirse usando técnicas estándar químicas o del ADN recombinante. Las técnicas químicas incluyen acoplamiento químico de una proteína a un péptido de fórmula (1) usando derivados de la proteína y el péptido activados y protegidos como se describe anteriormente, en relación con la producción de péptidos de fórmula (1). De este modo, por ejemplo, un péptido de fórmula (1) puede acoplarse de una forma específicamente dirigida con el extremo C-terminal de una proteína activada adecuadamente en el extremo C-terminal.

Generalmente, las técnicas del ADN recombinante implican la expresión de una proteína por una célula hospedadora, seguido de la recuperación de la proteína usando técnicas estándar de separación y purificación. El ADN que codifica la proteína puede introducirse en cualquier vector de expresión adecuado mediante la unión operativa del ADN a cualesquiera elementos de control de la expresión necesarios y transformando con el vector cualquier célula hospedadora adecuada procariota o eucariota, usando procedimientos bien conocidos. Una descripción más detallada de las técnicas adecuadas se proporciona de aquí en adelante en relación con la producción de anticuerpos de acuerdo con la invención. Éstas pueden seguirse de un modo general y/o adaptarse fácilmente para permitir la producción de cualquier proteína de acuerdo con la invención mediante medios recombinantes. El uso de la tecnología del ADN recombinante proporciona una táctica flexible para las proteínas de acuerdo con la invención porque permite la manipulación fácil y la inserción de un péptido de fórmula (1) en cualquier posición deseada de una proteína. El ADN que codifica un péptido de fórmula (1) es, de este modo, particularmente útil y constituye un aspecto adicional de la invención. El ADN que contiene la siguiente secuencia de nucleótidos:

5' ACATGCCCGCCGTGCCCGGCGACCTGCCCGCCGTGCCCGGCG 3'

[en la que cada letra utiliza el código estándar para un nucleótido], que codifica la secuencia de aminoácidos ^{N}TCPPCP
ATCPPCA^{C}, es especialmente útil y la invención se extiende al ADN que comprende esta secuencia junto con las variantes de la misma en las que uno o más nucleótidos han sido sustituidos debido a la degeneración del código genético. La invención también se extiende a los plásmidos recombinantes que contienen el ADN que codifica un péptido de fórmula (1), a las células que contienen dichos plásmidos y a un procedimiento para producir una proteína de acuerdo con la invención que comprende cultivar dichas células de forma que la proteína deseada se exprese y recuperar la proteína a partir del cultivo.

Las secuencias de aminoácidos ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C} son particularmente adecuadas para el uso con proteínas de unión tales como receptores o anticuerpos asociados a células en las que cada secuencia puede funcionar como una región bisagra para proporcionar una capacidad de dimerización. De este modo, por ejemplo, los receptores recombinantes [véase, por ejemplo, la memoria descriptiva de las patentes internacionales Nº WO 92/100591, WO 92/15322, WO 93/19163, WO 95/02686 y WO 97/23613] pueden diseñarse para que incorporen estas secuencias para facilitar la dimerización de las cadenas individuales del receptor, requerida para la unión eficaz del receptor y la invención se extiende a un receptor recombinante que comprende, al menos, un péptido de fórmula (1). Tales receptores se usan, por ejemplo, para redirigir y activar células [véanse las memorias descriptivas de las patentes mencionadas ahora mismo] y la invención incluye tales células que expresan un receptor recombinante que comprende, al menos, un péptido de fórmula (1).

En los anticuerpos, las secuencias ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C} pueden usarse como sustitutos de las regiones bisagra que se presentan de una manera natural [la región bisagra se localiza entre los dominios C_{H}1 y C_{H}2 en las inmunoglobulinas que se presentan de una manera natural]. Las secuencias son particularmente adecuadas para este fin y en un aspecto preferido de la invención se proporciona un anticuerpo que contiene una región bisagra caracterizada porque dicha región bisagra tiene una secuencia de aminoácidos ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C} en la que X e Y son como se definen en la fórmula (1). En este caso, la región bisagra tiene, preferentemente, una secuencia de aminoácidos ^{N}TCPPCPAYCPPCPA^{C} o ^{N}TCPPCPXTCPPCPA^{C}, más especialmente, ^{N}TCPPCATCPPCPA^{C}.

El término "anticuerpo" tal como se usa en el presente documento, tiene la intención, generalmente, de incluir anticuerpos monovalentes, divalentes u otros anticuerpos multivalentes. De este modo, por ejemplo, un anticuerpo monovalente de acuerdo con la invención puede ser una única cadena que comprende un dominio variable (V_{H}) de una cadena pesada de inmunoglobulina y una región bisagra ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C} unida directamente a éste, preferentemente en el extremo C-terminal del dominio V_{H}. De un modo alternativo, el dominio V_{H} y la región bisagra pueden estar separados mediante una región espaciadora que comprende uno o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos y al resto del anticuerpo. La región espaciadora puede ser, por ejemplo, uno o más dominios constantes de la cadena pesada (C_{H}) o ligera (C_{L}) de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos, por ejemplo, un dominio C_{H}1 o un fragmento del mismo y/o un dominio C_{H}2 y/o un dominio C_{H}3 o fragmentos de los mismos. Cuando se desee, la región bisagra puede tener uno o más de los otros aminoácidos unidos a su extremo C-terminal, por ejemplo, uno o más dominios de la región constante de la inmunoglobulina o fragmentos de los mismos como se acaba de describir. El dominio V_{H} puede ser monomérico o puede ser dimérico y contener dímeros V_{H}-V_{H} o V_{H}-V_{L} (en los que V_{L} es el dominio variable de una cadena ligera de inmunoglobulina) en los que las cadenas V_{H} y V_{L} están asociadas de un modo no covalente. Sin embargo, cuando se desee, las cadenas pueden estar acopladas covalentemente o bien directamente, por ejemplo, a través de un enlace disulfuro entre los dos dominios variables, o bien a través de un engarce, por ejemplo, un péptido engarzador, para formar un dominio de cadena única. Los ejemplos particulares de anticuerpos monovalentes de acuerdo con la invención incluyen Fv, Fv de cadena única y, especialmente, fragmentos Fab o Fab', conteniendo, cada uno de ellos, una región bisagra que tiene la secuencia ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C}.

Los anticuerpos divalentes de acuerdo con la invención incluyen dos de las cadenas monoméricas que se acaban de describir, unidas covalentemente a través de uno, dos, tres o cuatro restos de cisteína de la región bisagra ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C} de cada cadena. El enlace puede ser un enlace disulfuro sencillo o puede ser a través de un grupo engarzador, por ejemplo, como se describe en la memoria descriptiva de las patentes internacionales Nº WO 90/09195 y WO 90/09196. Los anticuerpos divalentes particulares incluyen fragmentos F(ab)_{2} y F(ab')_{2}.

Los anticuerpos multivalentes de acuerdo con la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos tri y tetravalentes que comprenden tres o cuatro de las cadenas monoméricas descritas anteriormente, unidas a través de sus regiones bisagras mediante un engarce, por ejemplo, como se describe en la memoria descriptiva de la patente internacional Nº 92/22583.

El anticuerpo de acuerdo con la invención será capaz, en general, de unirse selectivamente a un antígeno. El antígeno puede ser cualquier antígeno asociado a células, por ejemplo, un antígeno de superficie celular tal como un marcador de linfocitos T, de células endoteliales o de células tumorales o puede ser un antígeno soluble. Los ejemplos particulares de antígenos de superficie celular incluyen las moléculas de adhesión, tales como selectina E, selectina P o selectina L, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, el antígeno carcinoembriónico (CEA), la globulina humana de la grasa de la leche (HMFG1 y 2), antígenos MHC de clase I y MHC de clase II y VEGF y, cuando sea apropiado, receptores de los mismos. Los antígenos solubles incluyen las interleuquinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8 o IL-12, los antígenos virales, por ejemplo, los antígenos del virus sincitial o del citomegalovirus, interferones tales como interferón-\alpha, interferón-\beta o interferón-\gamma, el factor de necrosis tumoral \alpha, el factor de necrosis tumoral \beta, los factores estimuladores de colonias tales como G-CSF o GM-CSF y los factores de crecimiento derivados de plaquetas tales como PDGF-\alpha y PDGF-\beta y, cuando sea apropiado, los receptores de los mismos.

El dominio o dominios de la región variable pueden ser cualquier dominio variable que se presente de una forma natural o una versión modificada del mismo. Por versión modificada se entiende un dominio de región variable que ha sido creado usando técnicas de modificación de ADN recombinante. Tales versiones modificadas incluyen aquellas creadas, por ejemplo, a partir de regiones variables de anticuerpos naturales mediante inserciones, deleciones o cambios en o a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos naturales. Los ejemplos particulares de este tipo incluyen aquellos dominios de región variable modificados que contienen, al menos, una región de determinación de complementariedad (CDR) y, opcionalmente, uno o más aminoácidos en fase de lectura de un anticuerpo y el resto del dominio de la región variable de un segundo anticuerpo.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden obtenerse a partir de cualquier anticuerpo completo, especialmente, un anticuerpo monoclonal completo [preparado mediante procedimientos de inmunización y fusión celular ordinarios], usando cualquier ruptura enzimática estándar adecuada y/o técnicas de digestión, por ejemplo, mediante tratamiento con pepsina seguido de acoplamiento químico con un péptido de fórmula (1) o a partir de un derivado protegido o activado del mismo usando técnicas de síntesis de proteínas corrientes como se describe anteriormente en relación con la producción de péptidos de fórmula (1). De un modo alternativo, el anticuerpo de la invención puede prepararse usando técnicas de ADN recombinante que implican la manipulación y re-expresión de ADN que codifica las regiones variables y/o constantes del anticuerpo. Tal ADN se conoce y/o está disponible fácilmente a partir de genotecas de ADN que incluyen, por ejemplo, genotecas fágicas de anticuerpos [véase, Chiswell, D.J. y McCafferty, J. Tibtech. 10, 80-84 (1992)] o, cuando se desee, puede sintetizarse. Los procedimientos estándar de biología molecular y/o química pueden usarse para secuenciar y manipular el ADN, por ejemplo, para introducir codones para crear una secuencia ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C} y para modificar, añadir o eliminar otros aminoácidos o dominios según se
desee.

A partir de aquí, se pueden preparar uno o más vectores de expresión replicables que contienen el ADN y usarse para transformar una línea celular apropiada, por ejemplo, una línea celular de mieloma improductiva, tal como una línea NSO de ratón o una línea bacteriana, por ejemplo, de E. coli, en la que puede suceder la producción del anticuerpo. Para obtener la transcripción y la traducción eficaces, la secuencia de ADN de cada vector debe incluir secuencias reguladoras apropiadas, particularmente, un promotor y una secuencia líder unidas operativamente a la secuencia del dominio variable. Los métodos particulares para la producción de anticuerpos de este modo son, generalmente, bien conocidos y usados corrientemente. Por ejemplo, los procedimientos de biología molecular básicos se describen en Maniatis y col. [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989]; la secuenciación de ADN puede llevarse a cabo como se describe en Sanger y col. [PNAS 74, 5463, (1977)] y en el manual de secuenciación de Amersham International; y la mutagénesis dirigida puede llevarse a cabo de acuerdo con el método de Kramer y col. [Nucl. Acids Res. 12, 9441, (1984)] y el del manual de Anglian Biotechnology. Además, hay numerosas publicaciones, incluyéndose memorias descriptivas de patentes, que detallan las técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos mediante manipulación del ADN, creación de vectores de expresión y transformación de células apropiadas, por ejemplo, como se revisa por Mountain A. y Adair J.R. en Biotechnology and Genetic Engineering Reviews [ed. Tombs, M.P., 10, capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, Reino Unido] y en la memoria descriptiva de la patente internacional Nº WO 91/09967. Una vez expresado, el anticuerpo puede separarse a partir de la célula hospedadora y purificarse usando técnicas estándar de centrifugación, filtración, cromatografía y otras técnicas de separación y purificación, por ejemplo, como se describe en los ejemplos de aquí en adelante.

Los fragmentos de anticuerpo que contienen una secuencia ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C}, particularmente los fragmentos Fab o Fab', son particularmente adecuados para la fabricación en E. coli como se describe anteriormente y en los ejemplos de aquí en adelante.

Cuando se desee, la proteína, incluyéndose el anticuerpo, de acuerdo con la invención puede tener una o más moléculas efectoras o testigos unidas a ella y la invención se extiende a tales proteínas modificadas y, en particular, a los anticuerpos. Las moléculas efectoras o testigos pueden unirse a la proteína a través de cualquier cadena lateral disponible de aminoácidos o a través de un grupo funcional de un aminoácido terminal localizado en la proteína, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, hidroxilo o carboxilo libre. Sin embargo, en una preferencia la molécula puede unirse a un resto de cisteína de una secuencia de aminoácidos ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C}. Los dímeros que contienen estas secuencias son particularmente resistentes a la reducción química in vitro y pueden reducirse parcialmente de una manera ventajosa para exponer tioles reactivos a los que pueden unirse las moléculas efectoras o testigos. Pueden unirse de este modo una, dos, tres o más moléculas efectoras o testigos.

Las moléculas efectoras incluyen, por ejemplo, agentes antineoplásicos, toxinas (tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano o vegetal y fragmentos de las mismas, por ejemplo, ricina y fragmentos de la misma), proteínas biológicamente activas, por ejemplo, enzimas, polímeros sintéticos o que se presentan de una manera natural, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, por ejemplo, ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionucleidos, particularmente, yodo radiactivo y metales quelados. Los grupos testigos adecuados incluyen metales quelados, compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse mediante espectroscopia RMN o
ESR.

Los agentes antineoplásicos particulares incluyen agentes citotóxicos y citoestáticos, por ejemplo, agentes de alquilación, tales como compuestos mostaza nitrogenados (por ejemplo, clorambucil, melfalán, clormetina, ciclofosfamida o mostaza de uracilo) y derivados de los mismos, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, busulfano o cisplatino; antimetabolitos, tales como metotrexato, fluorouracilo, floxuridina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, ácido fluoroacético o ácido fluorocítrico, antibióticos, tales como bleomicinas (por ejemplo, sulfato de bleomicina), doxorubicina, daunorubicina, mitomicinas (por ejemplo, mitomicina C), actinomicinas (por ejemplo, dactinomicina), plicamicina, caliquemicina y derivados de los mismos o esperamicina y derivados de la misma; inhibidores mitóticos, tales como etopósido, vincristina o vinblastina y derivados de los mismos; alcaloides, tales como elipticina; polialcoholes tales como taxicina I o taxicina II; hormonas, tales como andrógenos (por ejemplo, dromostanolona o testolactona), progestinas (por ejemplo, acetato de megestrol o acetato de medroxiprogesterona), estrógenos (por ejemplo, difosfato de dimetilestilbestrol, fosfato de poliestradiol o fosfato de estramustina) o antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno); antraquinonas, tales como mitoxantrona, ureas, tales como hidroxiurea; hidracinas, tales como procarbacina; o imidazoles, tales como dacarbacina.

Los polímeros sintéticos o que se presentan de una manera natural incluyen, por ejemplo, polímeros de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituidos, tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, polivinilalcohol y, especialmente, metoxipolietilenglicol o polisacáridos ramificados o lineales, por ejemplo, un homo o heteropolisacárido tal como lactosa, amilosa, dextrano o glucógeno.

Los metales quelados incluyen quelatos de metales di o tripositivos que tienen un número de coordinación de 2 a 8, ambos inclusive. Los ejemplos particulares letales metales incluyen tecnecio (Tc), renio (Re), cobalto (Co), cobre (Cu), oro (Au), plata (Ag), plomo (Pb), bismuto (Bi), indio (In), galio (Ga), Itrio (Y), terbio (Tb), gadolinio (Gd) y escandio (Sc). En general, el metal es, preferentemente, un radionucleido. Los radionucleidos particulares incluyen ^{99m}Tc, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{58}Co, ^{60}Co, ^{67}Cu, ^{195}Au, ^{199}Au, ^{110}Ag, ^{203}Pb, ^{206}Bi, ^{207}Bi, ^{111}In, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{88}Y, ^{90}Y, ^{160}Tb, ^{153}Gd y ^{47}Sc.

El metal quelado puede ser, por ejemplo, uno de los tipos anteriores de metal quelado con cualquier agente de quelación polidentado, por ejemplo, poliaminas acíclicas o cíclicas, poliéteres (por ejemplo, éteres en corona y derivados de los mismos); poliamidas; porfirinas y derivados carbocíclicos.

En general, el tipo de agentes de quelación dependerá del metal en uso. Sin embargo, un grupo particularmente útil de agentes de quelación en los conjugados de acuerdo con la invención son las poliaminas acíclicas y cíclicas, especialmente los ácidos poliaminocarboxílicos, por ejemplo, el ácido dietilentriaminopentacético y los derivados del mismo y las aminas macrocíclicas, por ejemplo, derivados cíclicos triaza y tetraza (por ejemplo, como se describe en la memoria descriptiva de la patente internacional Nº WO 92/22583) y poliamidas, especialmente, desferrioxamina y derivados de las mismas.

Los grupos efectores particularmente útiles son la caliquemicina y derivados de la misma (véase, por ejemplo, la memoria descriptiva de las patentes de Sudáfrica Nº 85/8794, 88/8127 y 90/2839).

Cuando se desee obtener una proteína de acuerdo con la invención unida a una molécula efectora o testigo, se puede preparar mediante procedimientos estándar químicos o de ADN recombinante en los que la proteína se une o bien directamente o a través de un agente de acoplamiento a la molécula efectora o testigo. Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, los descritos en la memoria descriptiva de las patentes internacionales Nº WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/09195 y WO 89/01476 y en los ejemplos, de aquí en adelante, que utilizan grupos funcionales, por ejemplo, tioles, en la proteína y, cuando sea necesario, moléculas efectoras o testigos apropiadamente activadas, por ejemplo, derivados selectivos de tiol tales como maleimidas, en los que la diana es un grupo tiol de una proteína. De un modo alternativo, cuando la molécula efectora o testigo es una proteína o polipéptido el enlace puede conseguirse usando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo, como se describe en el presente documento o en la memoria descriptiva de la patente internacional Nº WO 86/01533 y en la memoria descriptiva de la patente europea Nº 392745.

La proteína de acuerdo con la invención puede ser útil en la detección o tratamiento de diversas enfermedades o trastornos. Tales enfermedades o trastornos pueden incluir aquellas descritas en el encabezamiento general de enfermedades infecciosas, por ejemplo, infecciones virales; enfermedades inflamatorias/autoinmunitarias, por ejemplo, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad inflamatoria intestinal; cáncer; enfermedades alérgicas/atópicas, por ejemplo, asma, eccema; enfermedades congénitas, por ejemplo, fibrosis quística, anemia drepanocítica; enfermedades dermatológicas, por ejemplo, soriasis; enfermedades neurológicas, por ejemplo, esclerosis múltiple; transplantes; por ejemplo, rechazo de trasplantes de órganos, enfermedad del injerto contra el hospedador; y enfermedades metabólicas/idiopáticas, por ejemplo, diabetes.

Las proteínas de acuerdo con la invención pueden formularse para su uso en la terapia y/o diagnóstico y, de acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de acuerdo con la invención junto con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se explicó anteriormente, la proteína, en este aspecto de la invención, puede unirse opcionalmente a uno o más grupos efectores o testigos.

La composición farmacéutica puede tomar cualquier forma adecuada de administración y, preferentemente, está en una forma adecuada para la administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión intravenosa, por ejemplo, mediante inyección de una dosis rápida o mediante infusión intravenosa continua. Cuando la composición es para la inyección o la infusión intravenosa, puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo aceitoso o acuoso y puede contener agentes para la formulación tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes.

De un modo alternativo, la composición de la proteína puede estar en forma seca, para reconstituirse antes del uso con un líquido estéril apropiado.

Si la composición de la proteína es adecuada para la administración oral, la formulación puede contener, además del ingrediente activo, aditivos tales como almidón, por ejemplo, almidón de patata, de maíz o de trigo, o derivados de celulosa o almidón tales como celulosa micro cristalina; sílice; diversos azúcares tales como lactosa; carbonato magnésico y/o fosfato cálcico. Es deseable que, si la formulación es para la administración oral, sea bien tolerada por el aparato digestivo del paciente. Con este fin, puede ser deseable incluir en la formulación formadores de mucus y resinas. También puede ser deseable mejorar la tolerancia mediante la formulación de la proteína en una cápsula que sea insoluble en los jugos gástricos. También puede ser preferible incluir la proteína o la composición en una formulación de liberación controlada.

Si la composición de la proteína es adecuada para la administración rectal, la formulación puede contener un agente de unión y/o lubricante; por ejemplo, glicoles poliméricos, gelatinas, manteca de cacao u otras ceras o grasas vegetales.

Los usos terapéuticos y diagnósticos de las proteínas de acuerdo con la invención comprenden, típicamente, la administración de una cantidad eficaz de la proteína a un sujeto humano. La cantidad exacta a ser administrada variará de acuerdo con el uso de la proteína y con la edad, sexo y estado del paciente pero puede variar, típicamente, de, aproximadamente, 0,1 mg a 1000 mg, por ejemplo, de, aproximadamente, 1 mg a 500 mg. La proteína puede administrarse en forma de una dosis única o de una manera continua a lo largo de un período de tiempo. Las dosis pueden repetirse si fuera apropiado. Las dosis típicas pueden estar, por ejemplo, entre 0,1 y 50 mg/kg de peso corporal para una dosis terapéutica única, particularmente, entre 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal para una dosis terapéutica única.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención. Se usan las siguientes abreviaturas:

AUC, área debajo de la curva; \beta-ME, \beta-mercaptoetilamina; DCM, di-Fab' maleimida; DTDP, 4,4'-ditiodipiridina; Fab', fragmento de unión al antígeno del anticuerpo (con bisagra); F(ab')_{2}, Fab' dimérico; HC, cadena pesada; LC, cadena ligera; NEM, N-etilmaleimida; PEG, polietilenglicol.

Ejemplo 1 Evaluación de la producción de di-Fab' en E. coli utilizando diferentes secuencias bisagra Estrategia

Para minimizar cualesquiera posibles enlaces disulfuro incorrectos intercatenarios entre las regiones bisagra y cualquier otra cisteína se eliminó el enlace disulfuro intercatenario de todas las construcciones Fab'. Previamente, se había mostrado que la eliminación del enlace disulfuro intercatenario de un di-Fab' no afectó la estabilidad de la proteína a juzgar por los tiempos de permanencia en el suero (ref. 9). Se usó la mutagénesis mediante PCR para cambiar por serinas las cisteínas intercatenarias de cKappa y C_{H}1. Esto también permitió el análisis del porcentaje de formación de di-Fab' mediante el análisis de los extractos periplásmicos en electroforesis no reductora SDS-PAGE, seguida de inmunodetección específica de la cadena pesada (HC). De este modo, este enfoque permite el análisis de muchas construcciones a una escala de matraz. Se ha tomado ventaja de la mutagénesis de C_{H}1 para introducir un sitio de restricción Spe I para facilitar el clonado rápido de las secuencias bisagra novedosas en forma de módulos de oligonucleótidos hibridados. Para introducir este sitio la Ser N-terminal respecto a la Cys del disulfuro intercatenario en la cadena pesada se cambió por una Thr, cambiando, por lo tanto, el C-terminal de C_{H}1 de ^{N}KSCDKTHTCAA^{C} a ^{N}KTSDKTHTCAA^{C} (los cambios están subrayados).

Cepa bacteriana y construcciones plasmídicas

Todos los plásmidos finales de expresión se basaron en el pACYC184 [Yarranton, G.T. y Mountain A. (1992) en: Protein Engineering - A practical Approach (Rees, A.R., Starnberg, M.J.E. y Wetzel, R. eds) IRL Press, Oxford págs. 303-326) y se usaron para transformar W3110, E. coli de tipo silvestre ATCC 27325.

Se construyó primero una variante de A5B7g3 Fab' (número de injerto 3 de un Fab' humanizado que se une a CEA - antígeno carcinoembriónico) sin el enlace disulfuro intercatenario. El codón de la Cys intercatenaria en la cadena ligera (LC) de cKappa se cambió por el de la Ser mediante mutagénesis por PCR, usando el oligonucleótido mutagénico:

5'-GCCGCGAATTCCGCACTTCTCCCTCTAAGACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3'

Se usó una estrategia similar para eliminar el codón de la Cys intercatenaria de C_{H}1 de la cadena pesada (HC) e introducir el sitio de restricción Spe I, usando el oligonucleótido mutagénico:

5'-CCGCAAGCTTGGATCCTCATCACGCGGCGCATGTGTGAG TTTTGTCACTAGTTTTGGGCTCAACTTTC-3'

Éstos y todos los clones subsecuentes se comprobaron mediante secuenciación de ADN en un secuenciador ABI 373A, usando el kit de secuenciación cíclica PRISM. Las secuencias bisagra novedosas se produjeron mediante ligación de los pares de oligonucleótidos hibridados con extremos 5' Spel-Hind III 3' con sólo un plásmido A5B7g3 HC cortado de un modo similar, seguido de la reconstitución del plásmido de expresión dicistrónico final.

La región que codifica Fab' 40.4 (un Fab' humanizado que se une a una citoquina humana) cKappa se alteró de un modo similar usando el oligonucleótido mutagénico:

5'-GGCCTGAGCTCACCAGTAACAAAAAGCTTTAATAGAG GAGAGTCTTGAGGAGGAAAAAAAAATGAAG-3'.

Se trasladó un fragmento de restricción del Fab' bisagra (^{N}CAA^{C}) C_{H}1 original, sin la cisteína del enlace disulfuro intercatenario, del A5B7g3 al plásmido de expresión de Fab 40.4, en forma de un fragmento de restricción. Puesto que el sitio Spe I en el plásmido de expresión de Fab 40.4 final, pDPH40, fue único, fue posible hacer variantes de bisagras adicionales rápidamente mediante ligación directa de los pares de oligonucleótidos hibridados con extremos protuberantes 5' Spe I-Not I 3' con el pDPH40 cortado de un modo similar. Los detalles de las secuencias bisagra y de los plásmidos se muestran en la tabla I. Durante las etapas de manipulación del ADN, se eligieron codones preferidos de E. coli como se definen en Wada, K.N. y col., Nucleic Acids Res. (1991) 19, 1981.

Experimentos en matraces

Los experimentos en matraces se llevaron a cabo esencialmente como se describe previamente excepto que éstos fueron experimentos con plásmido único y requirieron tetraciclina a 10 \mug/ml [Humphreys, D.P. y col., FEBS Lett. (1996), 380, 194]. Se usó el caldo L para todos los experimentos con A5B7 y para proporcionar la mayor densidad posible de células se usó 2xTY para aquellos con Fab 40.4. Se añadieron compuestos activos redox en forma de sólidos a una concentración final de 1 mM cuando se requirió. Se tomaron muestras a 0, 1, 2 y 4 horas después de la inducción.

Fermentación

Medio sintético SM6 C: (NH_{4})_{2}SO_{4} 5,0 g/l, Na_{2}H_{2}PO_{4}.H_{2}O 3,312 g/l, KCl 3,870 g/l, MgSO_{4}.7H_{2}O 1,0 g/l, citrato 1,0 g/l, ácido cítrico 4,00 g/l, CaCl_{2}.6H_{2}O 0,05 g/l, ZnSO_{4}.4H_{2}O 0,02 g/l, MnSO_{4}.4H_{2}O 0,02 g/l, CuSO_{4}.5H_{2}O 0,005 g/l, CoSO_{4}.6H_{2}O 0,004 g/l, FeCl_{3}.6H_{2}O 0,0967 g/l, H_{3}BO_{3} 0,0003 g/l, NaMoO_{4} 0,0002 g/l. Se usó glicerol como fuente de carbono al 3% (peso/vol.) y se usó MAZU como antiespumante a 0,02% (vol./vol.). El pH se controló con NH_{4}OH 50% (vol./vol.). La expresión de Fab' se indujo cambiando la fuente de carbono a lactosa al 5% (peso/peso), y las células se recogieron 24-36 horas después de la inducción. Típicamente, el rendimiento de Fab' fue 100-150 mg/litro.

Inmunotransferencia

Las muestras equivalentes a 2 litros de las fracciones periplásmicas se diluyeron 5 veces con H_{2}O destilada y se hirvieron durante 5 minutos en tampón de carga para SDS-PAGE no reductora, antes de ser sometidas a electroforesis en geles de Tris-glicina 4-20% (Novex) a 125 v durante 1,75 horas. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Novex) durante 2 horas a 100 mA. La membrana se bloqueó durante 1 hora a temperatura ambiente con 50 ml por membrana de tampón de bloqueo (PBS/Tween 20 0,1% (vol./vol.)/leche desnatada 2% (peso/vol.)) antes de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora con 5 ml por membrana de anticuerpo anti-Fd (IgG de oveja anti-IgG(Fd) humana, ref. PC075, The Binding Site, Birmingham, Reino Unido) a 1/1000 (vol./vol.) en tampón de anticuerpo (PBS/Tween 20 0,1% (vol./vol.)/tampón de bloqueo 0,1%). La membrana se lavó ampliamente en PBS/Tween 20 0,1% (vol./vol.) antes de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora con 5 ml por membrana de un anticuerpo de burro anti-oveja conjugado con HRP (F(ab')_{2} de conejo anti-fragmento Fc de IgG de oveja conjugado con HRP, ref. 313-036-046, Jackson) a 1/1000 (vol./vol.) en tampón de anticuerpo. La membrana se lavó ampliamente en PBS/Tween 20 0,1% (vol./vol.) antes de revelar con el sustrato DAB (Pierce). Las bandas de reactividad cruzada con LC se muestran en las líneas 4 y 1 de las figuras 1 y 2, respectivamente. Se usaron transparencias positivas de las inmunomembranas a tamaño real para la densitometría mediante exploración láser en una máquina Molecular Dynamics modelo 300A, usando el programa ImageQuant versión 4.2. El di-Fab derivado de las cadenas pesadas (di-HC) se separa del Fab derivado de HC (HC libre) durante la electroforesis. La cuantificación de las intensidades relativas de las dos bandas fácilmente identificables en cada línea proporcionó una estimación del porcentaje de di-Fab formado. Esto asume un nivel relativamente constante de producción de HC y su asociación con LC entre diferentes variantes Fab'. Los plásmidos derivados de pTTO-1 usados producen un exceso de LC y por tanto la HC libre en el periplasma no es detectable (Sauna West, comunicación personal). El di-HC de las proteínas sin el disulfuro intercatenario migra con una movilidad similar a un Fab' estándar purificado con el disulfuro intercatenario (compárense la línea 11 y 3 de la figura 1). La absorbancia total de cada pico se cuantificó y el porcentaje de di-Fab en cada muestra se calculó de este modo: absorbancia de la banda di-HC/absorbancia de la banda di-HC + absorbancia de la banda HC.

Purificación de Fab'

Los extractos periplásmicos se clarificaron mediante centrifugación a 25.000 g durante 30 minutos, el pH se incrementó hasta 6,5 con Tris 2,5 M y se aplicaron a una columna de proteína G-sefarosa (GammaBind, Pharmacia Biotech) pre-equilibrada con PBS. Después de lavar con PBS para eliminar las sustancias no unidas, las sustancias relacionadas con Fab' se eluyeron mediante el lavado de la columna con glicina.Cl 0,1 M, pH 2,7. El pH del eluido se incrementó hasta un pH neutro con Tris 2,5 M para el almacenamiento a 4ºC; las concentraciones de Fab' después de la purificación fueron, típicamente, \leq0,2 mg/ml.

Los plásmidos se construyeron con dos copias de la secuencia repetida TCPPCPA con 0 a 5 restos espaciadores, véase pDPH30-35, tabla I (la nomenclatura de la construcción Fab' muestra el número de repeticiones de la secuencia bisagra del medio, seguido de un número romano para mostrar el número de restos espaciadores y si la proteína tiene o le falta la cisteína formadora del enlace disulfuro intercatenario. Por ejemplo, pDPH34 expresa A5B7g3 bisagra 2iv inter = inserto 3 de A5B7 con dos repeticiones de bisagras, espaciadas cuatro aminoácidos y sin el enlace disulfuro intercatenario. pDPH42 expresa Fab' 40.4 bisagra 2o + Cys, tiene dos repeticiones de bisagras, sin restos espaciadores y tiene el enlace disulfuro intercatenario). Éstos se evaluaron en su capacidad para formar di-Fab' en cultivos de matraces, juzgándola mediante inmunotransferencia y comparando frente a las construcciones bisagra ½ y bisagra 1. Los resultados se muestran en la tabla II.

De un modo similar a lo visto por otros (ref. 7), el Fab' bisagra ½ no produjo di-Fab' detectable en los matraces. Los "bisagra 1" y "bisagra 2o" produjeron una cantidad moderada de di-Fab' (7,3% y 4,8%, respectivamente). Seguidamente, estas versiones se hicieron en el Fab 40.4 que se expresa a más concentración, para ver si el incremento de la concentración proteínica del periplasma de estos Fab haría efecto en tanto un incremento en la formación de di-Fab' in vivo como en discriminar los méritos relativos de un número aumentado de repeticiones de bisagras.

Fue sorprendente ver que todas las construcciones A5B7 con restos espaciadores entre las repeticiones de bisagras no produjeron di-Fab' detectable. El incremento de la longitud y la flexibilidad de estas regiones espaciadoras podría permitir que la segunda copia de la repetición de la bisagra se doblara hacia atrás y formara enlaces disulfuro intra-HC, impidiendo, de este modo, que las cisteínas formen los enlaces disulfuro inter-HC deseados. Aunque es difícil probar esta suposición directamente, se diseñaron dos nuevas construcciones usando Fab 40.4 con espaciamiento y flexibilidad reducidos, eliminando uno (Ala) o dos (Ala-Thr) de los restos espaciadores endógenos entre las hélices rígidas de poliprolina II. Los resultados como se muestran en la tabla II no fueron favorables puesto que se hizo un Fab' 40.4 con tres copias de la bisagra, "bisagra 3o".

Los resultados muestran que un incremento del número de copias de las repeticiones de las bisagras da como resultado un descenso estable del porcentaje de di-Fab' producido. Puede presumirse que este descenso en el porcentaje de di-Fab' es debido al incremento de la toxicidad de la proteína en el periplasma a medida que las proteínas se enriquecen en cisteína. El descenso en el porcentaje de di-Fab' se relaciona con el descenso en la viabilidad celular después de la inducción de Fab' como se muestra por el pico más bajo de la O.D. 600 y el incremento de la lisis celular en los tiempos más tardíos. La maquinaria redox de disulfuros en el periplasma de E. coli es, ahora, bien conocida, pero se piensa que está peor adaptada a arreglárselas con proteínas que tienen disposiciones complejas de disulfuros que con las del retículo endoplásmico (revisado por Humphreys y col., 1996 ibid). Parece probable que las bisagras complejas no sean bien toleradas.

La reducción del espaciamiento entre dos repeticiones de bisagras no incrementa la formación de di-Fab'. El "Fab' 40.4 inter bisagra 2_{-1}" muestra concentraciones disminuidas de di-Fab' en comparación con la variante "bisagra 2o" (8,1% \pm 4,3 en comparación al 25,1% \pm 8,43 - véase la tabla II). El "Fab' 40.4 inter bisagra 2_{-2}" muestra el 49,8% \pm 16,78 de di-Fab'. Esta cifra sugiere un alto nivel de producción de di-Fab'. De hecho, esta proteína parece incapaz de, incluso, producir cantidades sustanciales de Fab' completo; esto se demuestra por el incremento del número y la intensidad de las bandas proteolíticas en la línea 7 de la inmunomembrana mostrada en la figura 1. Por lo tanto, hay una pequeña cantidad de di-Fab' que es alta en relación a la cantidad de Fab' pero se produce muy poca cantidad de cada una de las proteínas en relación a los "bisagra 1" y "bisagra 2o". Se puede postular que la eliminación de uno o ambos restos espaciadores hace a las regiones bisagra tan inflexibles que las cisteínas se ven forzadas en una conformación que las hace estar expuestas proteolíticamente o reaccionar con proteínas de E. coli naturales. Puesto que la bisagra 1 sin modificar proporciona el mayor rendimiento de di-Fab' in vivo, se decidió comprobar la eficacia de otros isotipos de bisagras.

Efecto del isotipo de bisagra

Las secuencias verdaderas de bisagras de IgG 2, 3 y 4 no pudieron crearse, pero, en vez de eso, la bisagra del medio de cada una de ellas se fusionó con la bisagra superior existente de IgG1. Por lo tanto, las bisagras creadas se denominaron "similares a" IgG2. Puesto que las bisagras muy ricas en cisteína son poco toleradas, sólo se usaron la secuencia CPRC y la primera de las tres secuencias repetidas de la bisagra del medio de la IgG3. El superíndice prima se usó para mostrar que esta secuencia de IgG3 está truncada. Estas construcciones se analizaron del mismo modo que previamente y los resultados se muestran en la tabla II.

La bisagra similar a IgG3' fue poco tolerada y proporcionó, de este modo, una alta medida del porcentaje de di-Fab' de un modo artefactual, del mismo modo que lo hizo la bisagra 2_{-2}; un ejemplo de esta proteólisis se muestra en la línea 4 de la figura 2. Se piensa que la larga bisagra de IgG3 es muy flexible [Brekke, O.H. y col., (1995) Immunol. Today 16, 85] y que esto es responsable de algunas de las propiedades de este isotipo. Es probable que, en el periplasma, esta longitud del péptido expuesto sea susceptible a proteólisis y ésta puede ser la razón del bajo nivel de producción de esta proteína. La bisagra similar a IgG2 produce una cantidad razonable de di-Fab' (20,8% \pm 3,58), pero no proporcionó un incremento sobre el visto anteriormente con los derivados de IgG1. Se observó una incapacidad relativa del Fab' similar a IgG4 de producir di-Fab' (8,63% \pm 1,41). Sólo hay una diferencia en un aminoácido entre la bisagra similar a IgG4 y la bisagra de IgG1 - CPSP respecto a CPPC, respectivamente. Estos resultados son coherentes con los trabajos previos (ref. 22, 23), que encontraron que la IgG4 fue menos capaz de formar enlaces disulfuro inter-HC que la IgG1. La presencia de una serina entre las dos cisteínas puede permitir una flexibilidad aumentada de la bisagra del medio y, de este modo, la formación de disulfuros intra-HC que bloqueen la formación del disulfuro

\hbox{inter-HC.}

Efecto de las colas de IgM e IgA

Tanto IgM como IgA tienen extensiones de 18 aminoácidos C-terminales, denominadas colas secretoras, que están implicadas en su polimerización. El penúltimo resto de ambas colas es una cisteína. Se sabe que ésta y otras cisteínas de HC, junto con interacciones no covalentes, están implicadas en la formación del polímero, aunque la organización exacta de los enlaces disulfuro no se comprende completamente [Davis, A.C. y col., (1989), EMBO J. 8, 2519 y Wiersma, E.J. y Shulman, M.J. (1995), J. Immunol. 154, 5265]. La cola ha sido unida a todos los cuatro isotipos de IgG y llevó a cabo su polimerización incluso en ausencia de cisteínas de HC adicionales y de los restos que interactúan de un modo no covalente encontrados en IgM e IgA [Smith, R.I.F. y col., (1995), J. Immunol. 154, 2226]. Se añadieron las secuencias naturales y las secuencias de la cola descritas por Sorensen, V. y col. [(1996) J. Immunol. 156, 2858], al Fab' 40.4 que contiene una secuencia "bisagra 1". Se eligió la secuencia "bisagra 1" porque parecía posible que al menos una cisteína libre pudiera requerirse para simular la actuación de Cys^{414} de IgM, proporcionada en la cola de HC, y otra permitiera las interacciones directas entre las HC como se piensa que son proporcionadas por la Cys^{337} de IgM. Se muestran en la tabla I las secuencias construidas en pDPH 50 y 51.

Los Fab' se analizaron mediante cultivo en matraces e inmunotransferencia para detectar la presencia de la formación aumentada de polímeros. Aunque se sabe que la "bisagra 1" proporciona \sim30% de formación de di-Fab', se encontró que la presencia de cada una de las colas abolió completamente la formación de di-Fab'. No se encontró indicio de la formación de estados poliméricos superiores a juzgar por las inmunomembranas de las electroforesis PAGE no reductoras naturales y de SDS. Se asumió que la abolición de la formación de dímeros inherente a la "bisagra 1" fue debida al plegado hacia atrás de las colas para formar un puente disulfuro intra-HC entre la Cys de la cola y una de las de la bisagra. Parece bastante posible que se permita que la Cys de la cola esté cerca de la bisagra porque se piensa que las secuencias de la cola son capaces de formar una cadena \beta [Pumphrey, R. (1986), Immunol. Today 7, 174].

En general, los resultados muestran que la presencia de cisteínas de bisagra extra por encima de la única encontrada en el Fab' original fue el factor más importante en promover la formación de di-Fab' in vivo, siendo la "bisagra 1" y la "bisagra 2o" las mejores secuencias. No se encontró ningún beneficio con otras versiones de la bisagra 1 ni con cualquiera de los otros tres isotipos de IgG comprobados. Se comprobó que las bisagras simples fueron las más útiles, pero produciendo, la longitud aumentada de la bisagra, menos porcentaje de di-Fab' y una mayor mortalidad celular. Esto se ha visto tanto con un número aumentado de copias de la secuencia bisagra de la IgG1, es decir, la bisagra 1, 2o y 3o, como con la IgG3 truncada, larga y flexible.

También afectan a la eficacia de la formación de di-Fab' in vivo diferencias estructurales más sutiles. La manipulación de los restos espaciadores entre dos copies de la secuencia bisagra ^{N}TCPPCPA^{C} sugiere la importancia de la conformación para mantener a las cisteínas de la bisagra en el estado de formación de di-Fab'. Si la región espaciadora se hace demasiado larga, la formación de di-Fab' se ve completamente abolida, presumiblemente, por el plegado hacia atrás de la bisagra, enmascarándose las cisteínas de la bisagra, mientras que si el espaciamiento es demasiado corto, la bisagra se degrada gravemente in vivo.

Los informes previos encuentran una producción variable de di-Fab' de 5-70% a partir de la fermentación en una alta densidad celular, usando la secuencia bisagra ^{N}CPPCPPCPP^{C} (ref. 9). Los resultados del presente documento demuestran que es muy difícil producir más del 5-10% de di-Fab' in vivo a partir de fermentaciones y que esto es reproducible. Además de por la secuencia bisagra, estas diferencias pueden explicarse por las diferencias en los niveles de expresión de Fab', por las condiciones de la fermentación y por la cepa hospedadora. El rendimiento de Fab' en el presente documento fue 5 a 10 veces menor que el descrito por Rodrigues y col. (ref. 9). Sin embargo, se sabe que las condiciones específicas pueden provocar una alta eficacia espontánea (\sim80%) y una formación específica de di-Fab' discontinua durante la purificación. Tales condiciones de purificación de proteína no se usaron durante estos experimentos de pequeña escala.

En resumen, la formación de di-Fab' in vivo en el periplasma de E. coli es un procedimiento ineficaz que está modulado, entre otros, por la secuencia bisagra y la complejidad. Se han identificado dos secuencias bisagra ("bisagra 1" y "bisagra 2o") en condiciones de selección in vivo como las más eficaces en la formación de di-Fab'.

Ejemplo 2 Investigación de los tiempos de permanencia en suero y de la pegilación específica de la bisagra de las moléculas F(ab')_{2} con bisagras modificadas Reactivos

NEM, \beta-MA, DTDP y Tris fueron de Sigma (Reino Unido) y de la mayor calidad disponible. Se usó agua apirógena "Flowfusor" para la cromatografía (Fresenius, Basingstoke, Reino Unido). Todos los demás reactivos de laboratorio fueron de calidad reactiva y de BDH (Reino Unido).

Producción y purificación de Fab'

El Fab' usado fue "Fab 40.4", como se describe en el ejemplo 1. Las fermentaciones de Fab' y las purificaciones en proteína G-sefarosa (GammaBind Plus, Pharmacia Biotech) fueron como se describen el ejemplo 1, con una modificación. Las proteínas periplásmicas de E. coli se extrajeron a partir de la pasta celular de fermentación mediante incubación toda una noche a 30ºC y con agitación a 250 rpm en un volumen de fermentación para recogida de Tris 100 mM/EDTA 10 mM (pH 7,4). La conductividad y el pH del extracto bruto se alteraron hasta \leq3,5 mS cm^{-1} y \leq4,5 mediante la adición de agua y ácido acético glacial, respectivamente. Seguidamente, el extracto bruto se hizo pasar sobre un lecho de un volumen de 80 ml (compactado) de resina de intercambio catiónico Streamline SP (Pharmacia Biotech) en el modo de lecho expandido. La resina fue pre-equilibrada con acetato sódico 50 mM, pH 4,5, en el modo de lecho expandido. Después de un lavado amplio, la sustancia unida se eluyó en el modo compacto con acetato sódico 50 mM/NaCl 200 mM, pH 4,5. El pH de la fracción del pico se incrementó hasta \geq6,5 con Tris 2,5 M y se aplicó a una columna de proteína G-sefarosa pre-equilibrada con PBS. Después de lavar con PBS para eliminar la sustancia no unida, la sustancia de Fab' se eluyó con glicina.Cl 0,1 M, pH 2,7. El eluido se neutralizó con Tris 2,5 M para almacenarlo a 4ºC.

Producción y purificación de F(ab')_{2}

La sustancia de Fab' se concentró y el tampón se cambió a \geq12 mg/ml en tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 8,0, usando ultrafiltración con una membrana de corte en 10 kDa. Los tioles de la bisagra se activaron y los restos de F(ab')_{2}, dependiendo de la concentración final de proteína, se eliminaron mediante reducción con \beta-MA 9 mM en tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 8,0, durante 45 minutos a 37ºC. Se eliminó el reductor mediante desalación en columna de sefadex G25M (PD10) (Pharmacia Biotech) pre-equilibrada con tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 8,0. Se permitió que los F(ab')_{2} se formaran mediante incubación a temperatura ambiente durante toda una noche. Cualquier grupo tiol remanente se bloqueó mediante incubación con NEM 10 mM en PBS antes del análisis mediante SDS-PAGE (geles de Tris/glicina 4-20%, Novex, Reino Unido) y HPLC (columna GF-250 equilibrada con tampón fosfato sódico 0,2 M, pH 7,0).

El F(ab')_{2} se separó del Fab', en una escala pequeña, mediante recolección de las fracciones de la HPLC preparativa (columna GF-250XL equilibrada con tampón fosfato sódico 0,2 M, pH 7,0), o, en una escala grande, usando cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). Se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido a la mezcla Fab'/F(ab')_{2} hasta 0,75 M antes de cargarla en una columna de fenil-sefarosa HP (Pharmacia Biotech) equilibrada con tampón fosfato 50 mM, pH 7,0/(NH_{4})_{2}SO_{4}0,75 M. Después de lavar con el tampón de equilibrado, la sustancia unida se eluyó con tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,0. Las especies diméricas tienen una mayor afinidad por la matriz HIC que las Fab' monoméricas. El F(ab')_{2} totalmente purificado fue F(ab')_{2} 100% a juzgar por la HPLC y fue F(ab')_{2} \geq95% a juzgar por la tinción Coomassie del gel de SDS-PAGE.

Producción de F(ab')_{2} químicamente reticulado (DFM)

DFM se produjo como se describió previamente usando el reticulador 1,6-bismaleimido-hexano (BMH) (ref. 2).

Resistencia a la reducción de F(ab')_{2}

El F(ab')_{2} purificado a 0,25 mg/ml en fosfato 0,1 M, pH 7,0, se trató con \beta-MA de 0 a 2 mM durante 45 minutos a 37ºC. Las reducciones se detuvieron mediante la adición de NEM hasta 10 mM y las cantidades relativas de F(ab')_{2} y Fab' se calcularon mediante análisis HPLC.

Reducción parcial de F(ab')_{2} "bisagra 2o" para la modificación específica de la bisagra

El F(ab')_{2} purificado a 6 mg/ml en fosfato 0,1 M, pH 6,0, se trató con \beta-MA de 0 a 2 mM durante 45 minutos a 37ºC. El reductor se eliminó mediante desalación con una columna Biospin P6 (BioRad, Reino Unido) y se tomaron muestras inmediatamente para el ensayo del tiol, inactivación con NEM y análisis HPLC y modificación. Se usó \beta-MA 1,3 mM para todas las reducciones parciales preparativas.

Producción y purificación mediante intercambio catiónico de F(ab')_{2}

El PEG-F(ab')_{2} parcialmente reducido como el anterior, se mezcló con un volumen igual de PEG-maleimida lineal 25 kDa en fosfato 0,1 M, pH 6,0 (Shearwater Polymers Inc, Birmingham, Alabama, EE.UU.) para proporcionar un exceso molar final de PEG:F(ab')_{2} de 30 veces. Después de hacerlo reaccionar a temperatura ambiente durante toda una noche, el PEG-F(ab')_{2} se separó del volumen remanente de F(ab')_{2}, usando HPLC en una escala preparativa. Después de la concentración y del cambio del tampón a acetato sódico 50 mM, pH 4,5, usando una columna PD 10, la fracción de PEG-F(ab')_{2}/PEG sin reaccionar se cargó sobre una columna Poros HS de un volumen del lecho de 1,6 ml (PerSeptive Biosystems, Hertford, Reino Unido) en una estación de trabajo BioCad Vision. Después de lavar con 5 volúmenes de columna para eliminar la PEG-maleimida no unida, el PEG-F(ab')_{2} se eluyó con acetato sódico 50 mM/NaCl 40 mM, pH 4,5 y el F(ab')_{2} se eliminó de la columna con un gradiente lineal de acetato sódico 50 mM, pH 4,5, con NaCl de 40 mM a 1 M. Las fracciones se concentraron y el tampón se cambió a tampón fosfato sódico 0,2 M, pH 7,0, antes de estimar la concentración proteínica usando la absorbancia a 280. La proteína se analizó mediante SDS-PAGE usando geles de Tris-MES 4-12% (Novex, Reino Unido).

Ensayo del tiol

Se determinaron los tioles por F(ab')_{2} usando DTDP como se describió previamente (ref. 17).

Yodación de F(ab')_{2}

Se marcaron con ^{125}I, 300 \mug de F(ab')_{2} por grupo de animales, usando el reactivo Bolton & Hunter (Amersham) hasta una actividad específica de 0,22-0,33 \muCi/\mug.

Espectrometría de masas

La masa molecular de Fab' se determinó usando un equipo Fisons VG Quattro triple quadrupole en el modo de ionización por electropulverización.

Estudios en animales

Se inyectaron intravenosamente 20 \mug de F(ab')_{2} de Fab 40.4 con variantes de bisagra marcado con ^{125}I a ratas macho Sprague Dawley de 220-250 g (Harlan) mientras se encontraban bajo anestesia de halotano (n = 6 por grupo, excepto para "bisagra 2o", en la que n = 10). Se tomaron sangrados arteriales seriados a partir de la cola a 0,5, 2, 4, 6, 24, 48, 72 y 144 horas después de la administración. Se realizó el recuento de las muestras usando un contador COBRA^{TM} Autogamma (Canberra Packard). Los datos se representaron, se calculó la curva debajo del área usando GraphPad Prism (programa GraphPad incorporado) y se expresó como porcentaje de dosis inyectada por hora (% id.hr). El t½\beta se define por los tiempos 24, 48 y 72. Se muestran la media y la desviación típica de la media (SEM, abreviadamente en inglés "standard errors of means") de los datos.

Resultados Producción de F(ab')_{2} in vitro

Se usaron tres secuencias bisagra para producir F(ab')_{2} in vitro: "bisagra ½" = ^{N}THTCAA^{C}; "bisagra 1" = ^{N}THTCP
PCPA^{C}; y "bisagra 2o" = ^{N}THTCPPCPATCPPCPA^{C}. Éstas contienen 1, 2 y 4 cisteínas, respectivamente. Las proteínas "bisagra 1" y "bisagra 2o" también contienen una diferencia en un aminoácido respecto a la "bisagra ½" de un cambio de Ser a Thr en el extremo C-terminal del C_{H}1 como se describe en el ejemplo 1.

Después de la purificación y la concentración a pH 8,0, se encontró que los Fab' contenían cantidades significativas de F(ab')_{2}. Para hacer el producto de F(ab')_{2} tan homogéneo como fuera posible, las preparaciones de Fab' se sometieron a idénticas condiciones fuertemente reductoras (\beta-MA 80 mM, pH 8,0) para que el procedimiento de oxidación comenzara en el 100% de los Fab'. El análisis de unión al antígeno (BIAcore) de los F(ab')_{2} muestra que estas condiciones muy fuertemente reductoras no afectan a la afinidad del Fab por el antígeno soluble. El Fab' reducido y desalado se dejó a temperatura ambiente durante toda una noche para el máximo rendimiento de F(ab')_{2}. Sin embargo, puede verse que, tomando muestras durante la oxidación para inactivar con NEM, aproximadamente el 60% del
F(ab')_{2} conseguido se forma dentro de los primeros 60 minutos de oxidación - véase la figura 3. Tanto la "bisagra ½" como la "bisagra 2o" alcanzan un rendimiento final similar del \sim 65% con una incubación durante toda una noche, sin embargo, la formación de F(ab')_{2} dentro de los primeros 30 minutos fue más rápida en la "bisagra 2o" que en la "bisagra ½". Probablemente, esto es una consecuencia del número superior de cisteínas de la bisagra que aumentan las oportunidades de interacción Fab'-Fab' de las cisteínas de la bisagra. El rendimiento de F(ab')_{2} usando la "bisagra 2o" puede incrementarse hasta el 80% simplemente aumentando la concentración de Fab' hasta \geq20 mg/ml.

Fue sorprendente que la "bisagra 1" no alcanzara los mismos rendimientos finales de formación de F(ab')_{2} que las otras dos proteínas. Es posible que después de la reducción, un porcentaje de "bisagras 1" sufra rápidamente la formación de enlaces disulfuro intra-bisagra, impidiendo a los tioles la formación de enlaces disulfuro inter-bisagra.

No se observó proteólisis del C-terminal en la purificación de los F(ab')_{2} "bisagra 1" o "bisagra 2o", eliminando la posibilidad de que una proporción de moléculas "bisagra" tuvieran una pérdida de cisteínas. Se ha mostrado, mediante espectrometría de masas, que las HC a partir de la reducción de tanto la "bisagra 1" como la "bisagra 2o" son moléculas completas - la "bisagra 1" tiene una masa observada de 24.703,65 \pm 0,55 Da en relación a la masa predicha de 24.705,12 Da; la "bisagra 2o" tiene una masa observada de 25.366,40 \pm 6,13 Da en relación a la masa predicha de 25.374,88 Da.

Número de enlaces disulfuro en las regiones bisagra de F(ab')_{2}

El F(ab')_{2} "bisagra ½" tiene una ventaja sobre la "bisagra 1" y la "bisagra 2o" porque el producto de la formación de enlaces disulfuro entre las bisagras es homogéneo. Por el contrario, la "bisagra 1" es capaz de formar tres especies diferentes de F(ab')_{2} con una mezcla de enlaces disulfuro únicos y dobles y especies "cabeza a cabeza" y "cabeza a cola" (véase la figura 4). La figura es, potencialmente, incluso más compleja con la "bisagra 2o". La consideración de la secuencia primaria (en ausencia de predicciones de modelo) muestra un gran número de especies que pueden formarse. Éstas difieren en el número de enlaces disulfuro (entre uno y cuatro), en disposiciones lineales asombrosas y en estructura cuaternaria completa (tanto formaciones "cabeza a cabeza" como "cabeza a cola"). La rotación alrededor de un enlace disulfuro hace que parezca improbable que las formas unidas con un enlace disulfuro único de "bisagra 2o" sobrevivan más que transitoriamente en ausencia de agentes de remate de tioles.

En el F(ab')_{2} producido in vivo en E. coli, la presencia de más cisteínas de la bisagra no da per se como resultado una bisagra muy unida con enlaces disulfuro (ref. 9). Por lo tanto, fue importante mostrar si las dos bisagras más grandes contenían más de un enlace disulfuro. Se aprovechó una observación hecha mientras se optimizaban las condiciones de reducción/oxidación y es que la "bisagra 2o" requirió una mayor concentración de \beta-MA para reducir todo el F(ab')_{2} contaminante en el Fab' purificado. Fue posible que las diferentes proteínas F(ab')_{2} purificadas mostraran diferencias en su capacidad de resistir la reducción a Fab'. Se encontró que a 0,25 mg/ml y pH 7,0 la "bisagra ½" se reduce completamente mediante \beta-MA 125 \muM (véase la figura 5). A la misma concentración de \beta-MA el 68,3% de la preparación de "bisagra 1" es todavía dimérico. Esto implica que, aproximadamente, 68% de la población de F(ab')_{2} "bisagra 1" tiene dos enlaces disulfuro. A la concentración de \beta-MA ligeramente superior de 166 \muM, el 100% de la preparación de "bisagra 2o" es todavía dimérico. Por lo tanto, mediante extrapolación, más de 68% de las moléculas de "bisagra 2o" deben tener más de dos enlaces disulfuro, es decir, 3 ó 4. Aunque las diferencias estructurales de la bisagra pueden tener un efecto en la accesibilidad o en la reactividad química de los disulfuros de la bisagra, parece improbable que fueran suficientemente significativas para provocar las diferencias completas mostradas en la figura 5. Por lo tanto, la "bisagra 1" y la "bisagra 2o" tienen un alto grado de enlaces disulfuro múltiples.

Efecto de la secuencia de la bisagra en la farmacocinética de F(ab')_{2} en la rata

El F(ab')_{2} hecho partir de las tres construcciones de bisagras junto con un control DFM se marcaron con ^{125}I para que su farmacocinética pudiera seguirse en un modelo de rata. Los datos mostrados en la tabla III corroboran las comparaciones hechas in vitro entre las bisagras ½, 1 y 2o. El F(ab')_{2} con un disulfuro de bisagra único "bisagra ½" es eliminado más rápidamente de la circulación, con un AUC de 166,2 \pm9,8% de dosis inyectada.hora (% id.hr). El F(ab')_{2} con una secuencia proteínica idéntica, pero unido mediante enlaces tioéter, se elimina más lentamente con un AUC = 384,2 \pm 32,1 (% id.hr). Esto se interpreta como indicio de una labilidad mayor del disulfuro con respecto al enlace tioéter, conduciendo a una descomposición hacia Fab' más rápida in vivo. El Fab' más pequeño es excretado más rápidamente a través de los riñones que el F(ab')_{2}. El aumento del número medio de enlaces disulfuro en la bisagra con la "bisagra 1" y la "bisagra 2o" da como resultado un aumento en AUC (423,6 \pm 35,0 y 509,7 \pm 31,3 (% id.hr), respectivamente) sobre el de la "bisagra ½". Las curvas de eliminación de la circulación de las ratas de las cuatro moléculas F(ab')_{2} ensayadas se muestran en la figura 6. Esto demuestra gráficamente que el efecto principal de la estabilidad de las diferentes bisagras parece estar en la fase \alpha. La eliminación inicial del F(ab')_{2} "bisagra ½" es más rápida que la de las otras tres moléculas F(ab')_{2} que se encuentran más agrupadas. Presumiblemente, la resistencia aumentada de los F(ab')_{2} "bisagra 1", "bisagra 2o" y DFM a las fuerzas reductoras o proteolíticas de la sangre circulante conduce a que las moléculas sobrevivan durante más tiempo como las especies mayores de F(ab')_{2} que se eliminan más lentamente de la circulación.

Reducción parcial y pegilación del F(ab')_{2} "bisagra 2o" in vitro

Como el F(ab')_{2} "bisagra 2o" tiene una proporción mayor de moléculas con enlaces disulfuro entre las bisagras múltiples, parecía posible que varios enlaces disulfuro pudieran romperse y los tioles desacoplados activarse mientras la molécula permaneciera como una especie dimérica. Tales tioles serían particularmente útiles para unir grupos efectores o testigos tales como radionucleótidos, toxinas o PEG. La unión covalente de PEG a las proteínas es atractiva porque es una vía simple de incrementar la permanencia en el suero, reducir la inmunogenia y disminuir la proteólisis in vivo.

Usando un intervalo de concentraciones de \beta-MA a pH 6,0 y análisis de las muestras de HMPC inactivadas con NEM se encontró que con \beta-ME \leq1,8 mM el 100% de la población F(ab')_{2} permanecía dimérico. Esta cifra puede variar entre lotes de F(ab')_{2} debido a la heterogeneidad en la ocupación de enlaces disulfuro de la bisagra. Con \beta-ME 1,3 mM el ensayo del tiol con DTDP mostró 1,034 \pm 0,090 tioles por F(ab')_{2}, estando liberados para la reacción. El F(ab')_{2} no tratado con \beta-ME mostró pocos tioles libres por F(ab')_{2}. La eficacia de la pegilación de F(ab')_{2} fue calculada después de la purificación de PEG-F(ab')_{2} mediante intercambio catiónico y la estimación de la concentración proteínica mediante absorbancia a 280 fue \leq1,3%.

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TABLA II Efecto de las secuencias de las bisagras en la eficacia de la formación de di-Fab in vivo en experimentos de matraz

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TABLA III Efecto de la composición de la bisagra en la farmacocinética de F(ab')_{2} en la rata

7

Leyendas de las figuras Figura 1 Efecto de la secuencia de la bisagra y la complejidad en la formación de di-Fab' in vivo

Inmunotransferencia anti-Fd de SDS-PAGE en Tris-glicina 4-20%; reductora en las líneas 1 y 2; no reductora en las líneas 3 a 12. Se muestra el tamaño molecular de los patrones (kDa) en la derecha. Todas las muestras periplásmicas se cargaron en igualdad, excepto el control de LC sola (línea 4) que tiene un exceso de 5 veces. Línea 1, pDPH52 Fab 40.4 bisagra 1 + Cys; línea 2, pDPH44 Fab 40.4 bisagra 1 inter; línea 3, Fab' 40.4 purificado + control Cys; línea 4, control de cadena ligera de Fab 40.4 sola; línea 5, pDPH42 Fab 40.4 bisagra 2o + Cys; línea 6, pDPH52 Fab 40.4 bisagra 1 + Cys; línea7, pDPH54 Fab 40.4 bisagra 2_{-2} inter; línea 8, pDPH53 Fab 40.4 bisagra 2_{-1} inter; línea 9, pDPH69 Fab 40.4 bisagra 3o Inter; línea 10, pDPH41 bisagra 2o inter; línea 11, pDPH44 bisagra 1 inter; línea 12, pDPH40 bisagra inter.

Figura 2 Comparación del efecto del isotipo de la bisagra en la formación de di-Fab' in vivo

Inmunotransferencia anti-Fd de SDS-PAGE no reductora en Tris-glicina 4-20%. Se muestra el tamaño molecular de los patrones (kDa) en la derecha. Todas las muestras periplásmicas se cargaron en igualdad, excepto el control de LC sola (línea 1) que tiene un exceso de 5 veces. Línea 1, control de cadena ligera de Fab 40.4 sola; línea 2, Fab' 40.4 purificado + control Cys; línea 3, pDPH63 Fab 40.4 bisagra "similar a IgG4" inter; línea 4, pDPH62 Fab 40.4 bisagra "similar a IgG3" inter; línea 5, pDPH62 Fab 40.4 bisagra "similar a IgG2" inter; línea 6, pDPH44 Fab 40.4 bisagra 1 inter (IgG1).

Figura 3 Efecto de las secuencias de las bisagras y de la duración de la oxidación en la formación de F(ab')_{2} in vitro

Se muestran la media y la desviación típica de tres experimentos independientes realizados a pH 8,0 y temperatura ambiente.

Figura 4 Intervalo de moléculas de F(ab')_{2} capaces de ser formadas

A. F(ab')_{2} formado por la "bisagra 1" y B. F(ab')_{2} formado por la "bisagra 2o"; sólo se muestran las formas "cabeza a cabeza" de la "bisagra 2o", de ahí el uso de "x2" para denotar las posibles formas "cabeza a cola".

Figura 5 Efecto de las secuencias de las bisagras en la resistencia de F(ab')_{2} a la reducción in vitro

Se sometió el F(ab')_{2} a 0,25 mg/ml a reducción a pH 7,0, 37ºC, durante 45 minutos, en el intervalo de concentraciones de \beta-MA mostrado.

Figura 6 Efecto de la composición de la bisagra en la farmacocinética de F(ab')_{2} en la rata

Se muestran la media y la desviación típica de cada F(ab')_{2}. Hubo seis animales en cada grupo, excepto en el de la "bisagra 2o", en el que n = 10.

Bibliografía

1. Covell DG, Barbet J, Holton OD, Black CD, Parker RJ, Weinstein JN. Pharmacokinetics of monoclonal immunoglobulin G1, F(ab')_{2}, and Fab' in mice. Cancer Res. 1986;46:3969.

2. King DJ, Turner A, Farnsworth AP, Adair JR, Owens RJ, Pedley B, Baldock D, Proudfoot KA, Lawson AG, Beeley NRA, K. Millar, T.A. Millican, B.A. Boyce, P. Antoniw, A. Mountain, R.H.J3. Begent, D. Shochat and G.T. Yarranton et al. Improved tumor targeting with chemically cross-linked recombinant antibody fragments. Cancer Res. 1994;54:6176.

3. Kaku S, Yano S, Kawasaki T, Sakai Y, Suzuki K, Kawamura K, Masuho Y, Satoh N, Takenaka T, Landolfi NF, Co MS. Comparison of the antiplatelet agent potential of the whole molecule, F(ab')_{2} and Fab fragments of humanized anti-GPIIb/IIIa monoclonal antibody in monkeys. Gen Pharmacol. 1996;27:435.

4. Pluckthun A. Mono- and bivalent antibody fragments produced in Escherichia coli: engineering, folding and antigen binding. Immunol Rev. 1992;130:151.

5. George, AJT and A. Epenetos. Advances in antibody engineering. Expert Opinion in Therapeutic Patents 1996; 6: 441.

6. Melton, RG. Preparation and purification of antibody-enzyme conjugates for therapeutic applications. Advanced Drug Delivery Reviews 1996; 22: 289.

7. Carter P, Kelley RF, Rodrigues ML, Snedecor B, Covarrubias M, Velligan MD, Wong WLT, Rowland AM, Kotts CE, Carver ME, Yang M., et al. High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment. Biotechnology (N Y). 1992;10:163.

8. Better M, Bernhard SL, Lei SP, Fishwild DM, Lane JA, Carroll SF, Horwitz AH. Potent anti-CD5 ricin A chain immunoconjugates from bacterially produced Fab' and F(ab')_{2}. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90:457.

9. Rodrigues ML, Snedecor B, Chen C, Wong WLT, Garg S, Blank GS, Maneval D, Carter P. Engineering Fab' fragments for efficient F(ab')_{2} formation in Escherichia coli and for improved in vivo stability. J Immunol. 1993; 12:6954.

10. Pack P, Pluckthun A. Miniantibodies: use of amphipathic helices to produce functional, flexibly linked dimeric FV fragments with high avidity in Escherichia coli. Biochemistry. 1992;31:1579.

11. Ducancel F, Gillet D, Carrier A, Lajeunesse E, Menez A, Boulain JC. Recombinant colorimetric antibodies: construction and characterization of a bifunctional F(ab)_{2}/alkaline phosphatase conjugate produced in Escherichia coli. Biotechnology (N Y). 1993;11:601.

12. Speck RR, Couto JR, Godwin SG, Christian RB, Kiwan RL, Ceriani RL, Peterson JA. Inverted Fab2s (Ifab2s): engineering and expression of novel, dimeric molecules, with a molecular weight of 100 000. Molecular Immunology 1996; 33: 1095.

13. Rheinnecker M, Hardt C, Hag LL, Kufer P, Gruber R, Hoess A, Lupas A, Rottenberger C, Pluckthun A, Pack P. Multivalent antibody fragments with high functional affinity for a tumor-associated carbohydrate antigen. J Immunol. 1996;157:2989.

14. Glennie MJ, McBride HM, Worth AT, Stevenson GT. Preparation and performance of bispecific F(ab' \gamma)_{2} antibody containing thioether-linked Fab' gamma fragments. J Immunol. 1987;139:2367.

15. King DJ, Adair JR, Angal S, Low DC, Proudfoot KA, Lloyd JC, Bodmer MW, Yarranton GT. Expression, purification and characterization of a mouse-human chimeric antibody and chimeric Fab' fragment. Biochem J. 1992;281: 317.

16. Worrell NR, Cumber AJ, Parnell GD, Mirza A, Forrester JA, Ross WCI Cucumberq. Effect of linkage variation on pharmacokinetics of ricin A chain-antibody conjugates in normal rats. Anticancer Drug Des. 1986;1(3):179-88.

17. Lyons A, King DJ, Owens RJ, Yarranton GT, Millican A, Whittle NR, Adair JR. Site-specific attachment to recombinant antibodies via introduced surface cysteine residues. Protein Eng. 1990;3:703.

18. Moroder L, Hübener G, Göhring-Romani S, Göhring W, Musiol HJ, Wünsch E. Fully synthetic immunogens. Part I. Kinetic studies on air oxidation of the human IgGi bis-cysteinyl fragment 225-232. Tetrahedron 1990; 46: 3305.

19. Harris LJ, Larson SB, Hasel KW, Day J, Greenwood A, McPherson A. The three-dimensional structure of an intact monoclonal antibody for canine lymphoma. Nature. 1992;360: 369.

20. Burton DR, Woof JM. Human antibody effector function. Adv Immunol. 1992;51:1.

21. Buchegger F, Pelegrin A, Hardman N, Heusser C, Lukas 3, Dolci W, Mach JP. Different behaviour of mouse-human chimeric antibody F(ab')_{2} fragments of IgG_{1}, IgG_{2} and IgG_{4} sub-class in vivo. International Journal of Cancer 1992; 50: 416.

22. Angal S, King DJ, Bodmer MW, Turner A, Lawson AD, Roberts G, Pedley B, Adair JR. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol Immunol. 1993;30:105.

23. Bloom JW, Madanat MS, Marriott D, Wong T, Chan SY. Intrachain disulfide bond in the core hinge region of human IgG4. Protein Sci. 1997;6:407.

24. Yoshimori T, Semba T, Takemoto H, Akagi S, Yamamoto A, Tashiro Y. Protein disulfide-isomerase in rat exocrine pancreatic cells is exported from the endoplasmic reticulum despite possessing the retention signal. J Biol Chem. 1990;265:15984.

Claims (8)

1. Un péptido de fórmula (1)

(1)^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C}

en el que X e Y, que pueden ser iguales o diferentes, son, cada uno de ellos, un resto de L-aminoácido alifático neutro, y los derivados protegidos y reactivos del mismo.

2. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X es un resto de alanina.

3. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que Y es un resto de treonina.

4. Una proteína que comprende una cadena de polipéptido caracterizada porque dicha cadena contiene una secuencia de aminoácidos ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C},en la que X e Y son como se define en la reivindicación 1.

5. Una proteína que comprende dos cadenas de polipéptido caracterizada porque cada una de dichas cadenas contiene una secuencia de aminoácidos ^{N}TCPPCPXYCPPCPA^{C}, en la que X e Y son como se define en la reivindicación 1 y porque cada cadena está covalentemente unida a la otra a través de uno, dos, tres o cuatro de los restos de cisteína presentes en cada una de dichas secuencias de aminoácidos.

6. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 4 o la reivindicación 5, que es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

7. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 6, que es un fragmento Fab o Fab'.

8. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, que tiene una o más moléculas efectoras o testigos unidas a ella.