ES2764111T3

ES2764111T3 - Anticuerpos multiespecíficos

Info

Publication number: ES2764111T3
Application number: ES15804386T
Authority: ES
Inventors: Ulrich Brinkmann; Wolfgang Schaefer; Klaus Mayer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2035-12-01
Also published as: JP6721590B2; US11999801B2; JP2018502835A; CN107001482B; US10633457B2; EP3227332B1; CN107001482A; US20170369595A1; WO2016087416A1; PL3227332T3; EP3227332A1; US20200392254A1

Abstract

Un anticuerpo multiespecífico que comprende al menos tres sitios de unión a antígeno, en el que dos sitios de unión a antígeno se forman por un primer fragmento Fab y un segundo fragmento Fab, en el que a) un tercer sitio de unión a antígeno se forma por un dominio variable de la cadena pesada (VH3) y un dominio variable de la cadena ligera (VL3), en el que - el extremo N del dominio VH3 se conecta al extremo C del dominio constante de la cadena pesada (CH1) o del dominio constante de la cadena ligera (CL) del primer fragmento Fab por medio de un primer conector peptídico, y - el extremo N del dominio VL3 se conecta al extremo C del dominio constante de la cadena pesada (CH1) o del dominio constante de la cadena ligera (CL) del segundo fragmento Fab por medio de un segundo conector peptídico, b) el anticuerpo multiespecífico comprende dos dominios constantes de la cadena pesada 3 (CH3), que se alteran para promover la heterodimerización por i) generación de una protuberancia en uno de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original, y generación de una cavidad en el otro de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, de modo que la protuberancia generada en uno de los dominios CH3 es posicionable en la cavidad generada en el otro de los dominios CH3; o sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en uno de los dominios CH3 con un aminoácido cargado positivamente, y sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en el otro de los dominios CH3 con un aminoácido cargado negativamente; ii) introducción de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3, o iii) ambas modificaciones de i) y ii); c) el extremo C del dominio VH3 del tercer sitio de unión a antígeno se conecta a uno de los dominios CH3, y el extremo C del dominio VL3 del tercer sitio de unión a antígeno se conecta al otro de los dominios CH3, y d) el anticuerpo multiespecífico está desprovisto de los dominios constantes de la cadena pesada 2 (CH2).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos multiespecíficos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a anticuerpos multiespecíficos, procedimientos para su producción, composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos y usos de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las proteínas genomanipuladas, tales como anticuerpos bi o multiespecíficos que se pueden unir a dos o más antígenos, son conocidas en la técnica. Dichas proteínas de unión multiespecífica se pueden generar usando técnicas de fusión celular, conjugación química o ADN recombinante.

Se ha desarrollado una amplia variedad de formatos de anticuerpos multiespecíficos recombinantes en el pasado reciente, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos tetravalentes por fusión de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios monocatenarios (véase, por ejemplo, Coloma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15 (1997) 159-163; documento WO 2001/077342; y Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234).

Una desventaja en la generación de anticuerpos multiespecíficos es la formación de subproductos con emparejamientos incorrectos, que se tienen que separar de los anticuerpos multiespecíficos deseados por procedimientos de purificación complejos, y reducen el rendimiento de producción.

Un enfoque para superar el problema de los subproductos con emparejamientos incorrectos, que es conocido como "tecnología de botones en ojales", tiene como objetivo forzar el emparejamiento de dos cadenas pesadas de anticuerpo diferentes introduciendo mutaciones en los dominios CH3 para modificar la interfase de contacto. En una cadena se reemplazaron aminoácidos voluminosos por aminoácidos con cadenas laterales cortas para crear un "ojal'. A la inversa, se introdujeron aminoácidos con cadenas laterales grandes en el otro dominio CH3, para crear un "botón". Al coexpresar estas dos cadenas pesadas (y dos cadenas ligeras idénticas, que tienen que ser apropiadas para ambas cadenas pesadas), se observaron rendimientos altos de formación de heterodímero ("botón-ojal") frente a la formación de homodímero ("ojal-ojal" o "botón-botón") (Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; y documento WO 96/027011). El porcentaje de heterodímero se podría incrementar adicionalmente remodelando las superficies de interacción de los dos dominios CH3 usando un enfoque de presentación en fagos y la introducción de un puente disulfuro para estabilizar los heterodímeros (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol.

270 (1997) 26-35).

El documento WO 2010/115598 A1 divulga anticuerpos biespecíficos trivalentes basados en una molécula de IgG de longitud completa monoespecífica, en los que en los respectivos extremos C de cada una de las cadenas pesadas se fusionan un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera para formar un tercer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno. Para promover la heterodimerización de las dos cadenas pesadas modificadas, se sugiere la modificación de los dominios CH3 de acuerdo con la tecnología de botones en ojales.

También se han desarrollado otros formatos de anticuerpos varios, en los que la estructura central del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) ya no está mantenida; tales como dia, tria o tetracuerpos, minicuerpos y varios formatos monocatenarios (scFv, Bis-scFv), que se pueden unir a dos o más antígenos (Holliger, P., et. al., Nature Biotech. 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., y Léger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et. al., J. Immunol. Methods 318 (2007) 65 74; Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297). Todos de dichos formatos usan enlazadores para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a otra proteína de unión (por ejemplo, scFv) o bien para fusionar, por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv (Fischer, N., y Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14).

El documento WO 2014/144357 A1 divulga anticuerpos multiespecíficos, es decir, TetBiAb que comprenden al menos tres sitios de unión a antígeno en los que los dos sitios de unión a antígeno adicionales se forman por un segundo par de fragmentos Fab unidos al extremo C de los fragmentos Fab del anticuerpo.

El documento WO 94/09131 divulga anticuerpos multiespecíficos, en los que una primera y una segunda región de unión formada por fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, fragmentos Fab, se asocian entre sí por dominios de asociación que se pueden unir entre sí. De acuerdo con el documento WO 94/09131, un dominio de asociación (por ejemplo, un dominio VH y VL, respectivamente) se fusiona a cada uno de los fragmentos Fab, de modo que la primera y segunda región de unión se combinan para proporcionar una única proteína que incluye ambas especificidades de unión.

Los fragmentos de anticuerpo tienen tanto pros como contras como productos terapéuticos en comparación con los anticuerpos monoclonales de tamaño normal: Una ventaja es que son más pequeños y penetran en tejidos y tumores más rápidamente. Además, se ha sugerido que el pequeño tamaño de los fragmentos permite la unión a epítopos no accesibles para los anticuerpos monoclonales de tamaño normal. Como inconveniente, los fragmentos demuestran semividas en circulación breves en seres humanos, probablemente debido al aclaramiento renal. La semivida más breve puede prevenir la acumulación suficiente de tratamiento en el sitio seleccionado. La producción de fragmentos de anticuerpo no es trivial, ya que es probable que los fragmentos formen agregados y puedan ser menos estables que los anticuerpos monoclonales de tamaño normal. Además, el emparejamiento no deseado de cadenas pesadas y ligeras no análogas da como resultado la formación de sitios de unión a antígeno inactivos y/u otros productos secundarios no deseados no funcionales, lo que es un problema principal en la producción a escala clínica y en la aplicación terapéutica de los fragmentos de anticuerpo. Estas desventajas se superan con el formato de anticuerpo de la invención.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un anticuerpo multiespecífico que comprende al menos tres sitios de unión a antígeno, en el que dos sitios de unión a antígeno se forman por un primer fragmento Fab y un segundo fragmento Fab de antígeno, en el que

a) un tercer sitio de unión a antígeno se forma por un dominio variable de la cadena pesada (VH3) y un dominio variable de la cadena ligera (VL3), en el que

- el extremo N del dominio VH3 se conecta al extremo C del dominio constante de la cadena pesada (CH1) o del dominio constante de la cadena ligera (CL) del primer fragmento Fab por medio de un primer conector peptídico, y

- el extremo N del dominio VL3 se conecta al extremo C del dominio constante de la cadena pesada (CH1) o del dominio constante de la cadena ligera (CL) del segundo fragmento Fab por medio de un segundo conector peptídico,

b) el anticuerpo multiespecífico comprende dos dominios constantes de la cadena pesada 3 (CH3), que se alteran para promover la heterodimerización por

i) generación de una protuberancia en uno de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original, y generación de una cavidad en el otro de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, de modo que la protuberancia generada en uno de los dominios CH3 es posicionable en la cavidad generada en el otro de los dominios CH3; o

sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en uno de los dominios CH3 con un aminoácido cargado positivamente, y sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en el otro de los dominios CH3 con un aminoácido cargado negativamente;

ii) introducción de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3, o

iii) ambas modificaciones de i) y ii);

c) el extremo C del dominio VH3 del tercer sitio de unión a antígeno se conecta a uno de los dominios CH3, y el extremo C del dominio VL3 del tercer sitio de unión a antígeno se conecta al otro de los dominios CH3, y

d) el anticuerpo multiespecífico está desprovisto de los dominios constantes de la cadena pesada 2 (CH2).

Un modo de realización de la invención se refiere a un anticuerpo multiespecífico, en el que

i) los dominios CH3 se alteran por generación de una protuberancia en uno de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original, y generación de una cavidad en el otro de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, de modo que la protuberancia generada en uno de los dominios CH3 es posicionable en la cavidad generada en el otro de los dominios CH3; o

ii) los dominios CH3 se alteran por introducción de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3; y

en el que el tercer sitio de unión se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH3 y VL3 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat): - VH3 en la posición 44, y VL3 en la posición 100;

- VH3 en la posición 105, y VL3 en la posición 43; o

- VH3 en la posición 101, y VL3 en la posición 100.

en el que el tercer sitio de unión se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44, y en el dominio VL3 en la posición 100.

Un modo de realización de la invención se refiere a un anticuerpo multiespecífico, en el que el primer y segundo conector peptídico son péptidos de al menos 15 aminoácidos. Un modo de realización de la invención se refiere a un anticuerpo multiespecífico, en el que el primer y segundo conector peptídico son péptidos de al menos 15 - 70 aminoácidos. Un modo de realización de la invención se refiere a un anticuerpo multiespecífico, en el que el primer y segundo conector peptídico son péptidos que consisten en residuos de glicina y serina.

Un modo de realización de la invención se refiere a un anticuerpo multiespecífico, en el que el extremo C del dominio VH3 se conecta directamente a uno de los dominios CH3, y el extremo C del dominio VL3 se conecta directamente al otro de los dominios CH3.

Un modo de realización de la invención se refiere a un anticuerpo multiespecífico trivalente. Un modo de realización de la invención se refiere a un anticuerpo multiespecífico biespecífico trivalente. Un modo de realización de la invención se refiere a un anticuerpo multiespecífico biespecífico trivalente, en el que el primer y el segundo fragmento Fab se unen específicamente a un primer antígeno, y en el que el tercer sitio de unión se une específicamente a un segundo antígeno, que es diferente del primer antígeno.

Un modo de realización de la invención se refiere a un anticuerpo multiespecífico triespecífico trivalente.

Otro aspecto de la invención es un complejo que comprende (i) un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que el anticuerpo se une específicamente al menos a un hapteno y una proteína diana, y (ii) el hapteno, que está unido por el anticuerpo multiespecífico, en el que el hapteno se conjuga con un agente terapéutico o de diagnóstico. Otro aspecto de la invención es un procedimiento para la preparación del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, que comprende las etapas de

- transformar una célula huésped con vectores de expresión que comprenden ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo multiespecífico,

- cultivar dicha célula huésped en condiciones que permiten la síntesis de dicho anticuerpo multiespecífico, y

- recuperar dicho anticuerpo multiespecífico de dicho cultivo de célula huésped.

Otro aspecto de la invención es un ácido nucleico que codifica el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención. Otro aspecto de la invención es un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Otro aspecto de la invención es una célula huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con la invención. Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención es un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención.

Los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención por una parte muestran nuevas propiedades debido a su unión a diferentes antígenos, y por otra parte son adecuados para la producción y formulación farmacéutica debido a su estabilidad, baja agregación y propiedades farmacocinéticas y biológicas (por ejemplo, bajo aclaramiento renal debido a que tienen aproximadamente el mismo peso molecular que una IgG de longitud completa; semivida en suero media debido a que evita la unión a FcRn). Se evitan productos secundarios con emparejamientos incorrectos debido al uso de estrategias de heterodimerización asimétrica. Debido a la disposición distintiva de los al menos tres sitios de unión unos con respecto a otros, los anticuerpos de acuerdo con la invención son en particular adecuados para unirse a múltiples antígenos presentes en la superficie de una única célula o para unirse a diferentes epítopos en un antígeno. Ya que ningún dominio CH2 está presente en los anticuerpos de acuerdo con la invención, se anula la mediación de las funciones efectoras por los anticuerpos.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: diseño de anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención.

Figura 1: estructura de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención. El anticuerpo comprende dos fragmentos Fab como brazos de unión que forman un primer y segundo sitio de unión. Un tercer sitio de unión a antígeno formado por los dominios VH3 y VL3 que se fusiona al extremo N de los respectivos dominios CH3. Los conectores peptídicos enlazan el extremo N de los dominios VH3 y VL3 con el primer y segundo fragmento Fab, respectivamente. Se promueve la heterodimerización de las cadenas polipeptídicas incluyendo el dominio VH3 o bien el VL3 por alteración de los dominios CH3 al menos uno de los enfoques de la estabilización con disulfuro y genomanipulación de CH3 por la tecnología de botones en ojales (denominada en todas las figuras "genomanipulado por KiH") o por introducción de aminoácidos con carga opuesta en las correspondientes posiciones de la interfase CH3/CH3 (denominado en todas las figuras "genomanipulado (+/-)"). Además, se puede aplicar estabilización con disulfuro en la interfase VH3/VL3 (no indicado). En esta ilustración, los fragmentos Fab se unen al mismo epítopo. Sin embargo, se pueden generar anticuerpos triespecíficos de acuerdo con la invención usando dos fragmentos Fab que se unen a diferentes epítopos.

Figura 2: diseño de anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención que comprenden un primer fragmento Fab y un segundo fragmento Fab.

Figura 2A: estructura de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención (lado derecho) en comparación con una IgG de longitud completa (lado izquierdo). Un tercer sitio de unión a antígeno formado por los dominios VH3 y VL3, que reemplazan los dominios CH2 de una molécula de IgG de longitud completa. Se retiraron los disulfuros de bisagra para garantizar el acceso a antígeno conectando los fragmentos Fab con VH3 y VL3 por medio de conectores peptídicos que carecen de un enlace disulfuro intercatenario. Se promueve la heterodimerización de las cadenas polipeptídicas incluyendo el dominio VH3 o bien el VL3 por alteración de dominios CH3 al menos uno de los enfoques de la estabilización con disulfuro y genomanipulación de CH3 por la tecnología de botones en ojales o por introducción de aminoácidos con carga opuesta en las correspondientes posiciones de la interfase CH3/CH3. Además, se puede aplicar estabilización con disulfuro en la interfase VH3/VL3 (no indicado).

Figura 2B: estructura de los anticuerpos biespecíficos generados en el ejemplo 1. Se usaron los conectores peptídicos (Gly4Ser)4 para fusionar el primer y segundo fragmento Fab con VH3 o bien VL3. Además, se promovió la heterodimerización de las diferentes cadenas polipeptídicas por modificaciones de botones en ojales y estabilización con disulfuro en la interfase CH3 así como estabilización con disulfuro del sitio de unión a VH3/VL3 como se explica en detalle en el ejemplo 1.

Figura 3: anticuerpos multiespecíficos ejemplares de acuerdo con la invención.

Figura 3A: anticuerpo triespecífico, en el que el segundo fragmento Fab incluye un entrecruzamiento de dominios de los ^{dominios VH}2 ^{y VL}2^{, dando como resultado una arquitectura de dominio VL}2^-CH1 ^{(cadena pesada), VH}2^{-CL (cadena}ligera). El primer fragmento Fab no incluye un entrecruzamiento de dominios, permaneciendo así en la arquitectura de ^{dominio natural de VH}1^-CH1 ^{, VL}1^-CL.

Figura 3B: anticuerpo triespecífico, en el que el segundo fragmento Fab incluye un entrecruzamiento de dominios de los ^{dominios VH-CH1 y VL-CL, dando como resultado una arquitectura de dominio VL}2^{-CL (cadena pesada), VH}2^-CH1 (cadena ligera). El primer fragmento Fab no incluye un entrecruzamiento de dominios, permaneciendo así en la ^{arquitectura de dominio natural de VH}1^-CH1 ^{, VL}1^-CL.

Figura 3C: anticuerpo triespecífico, en el que el segundo fragmento Fab incluye un entrecruzamiento de dominios de los ^{dominios CH1 y CL, dando como resultado una arquitectura de dominio VH}2^{-CL (cadena pesada), VL}2^-CH1 ^(cadenaligera). El primer fragmento Fab no incluye un entrecruzamiento de dominios, permaneciendo así en la arquitectura de ^{dominio natural de VH}1^-CH1 ^{, VL}1^-CL.

Figura 3D: anticuerpo triespecífico, en el que el segundo fragmento Fab incluye un entrecruzamiento de dominios de los ^{dominios CH1 y CL, dando como resultado una arquitectura de dominio VH}2^{-CL (cadena pesada), VL}2^-CH1 ^(cadenaligera), y el primer fragmento Fab incluye un entrecruzamiento de dominios, de los dominios VH1 y VL1, dando como resultado una arquitectura de dominio VL2-CH1 (cadena pesada), VH2-CL (cadena ligera).

Figura 3E: anticuerpo triespecífico, en el que el segundo fragmento Fab es un fragmento Fab monocatenario.

Figura 4: diseño de conexión flexible entre fragmentos Fab y el tercer sitio de unión que permite el acceso a antígeno.

Figura 4A: retirada de disulfuros de la región bisagra por conectores peptídicos suficientemente largos sin disulfuros intercatenarios que permiten acceso a antígeno para el tercer sitio de unión a antígeno. Para estabilizar el formato de anticuerpo generado, se requiere al menos un enfoque de heterodimerización además de la interacción VH3/VL3 natural (indicado: disulfuros en líneas gruesas, modificaciones de botones en ojales en la interfase CH3/CH3).

Figura 4B: Comparación de sitios de conexión de IgG1 naturales entre CH1, región bisagra y CH2 con los sitios de fusión de CH1, conector peptídico, dominio VH3 del anticuerpo generado de acuerdo con el ejemplo 1.

Figura 5: diseño de interfase estabilizada entre dominios variables del tercer sitio de unión con sus respectivos dominios CH3.

Figura 5A: estabilización con disulfuro de ambos, el fragmento Fv que comprende VH3 y VL3 así como la interfase CH3/CH3 da lugar a residuos de cisteína introducidos artificialmente que se producen en estrecha proximidad (a) entre sí, y (b) con cisteínas que forman enlaces disulfuro intracatenarios naturales en los respectivos dominios variables o constantes. Debido a la estrecha proximidad de dichos residuos de cisteína se puede producir un emparejamiento incorrecto potencial a favor de la formación de enlaces disulfuro deseados lo que da lugar a un plegamiento incorrecto de la proteína y reducción del rendimiento (como se indica en la tabla).

Figura 5B: sitio de fusión ejemplar de VL3 con CH3 como se usa en un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención descrito en el ejemplo 1, en el que el tercer sitio de unión se une específicamente a digoxigenina. Los residuos de cisteína introducidos adicionalmente se indican dentro de la secuencia de aminoácidos en negrita y subrayados (SEQ ID NO: 01). Los extremos N alternativos de los dominios CH3 aplicables para fusión con un dominio VH3 o VL3 se indican a continuación (SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 03, SEQ ID NO: 04).

Figura 6: resultados de purificación de anticuerpos biespecíficos del ejemplo 1.

Figura 6A: (A) cromatograma representativo de Kappa-Select de un anticuerpo, en el que el tercer sitio de unión se une específicamente a digoxigenina (BsAb CD33-Dig(SS)-CD33). (B)-(D) cromatografía de exclusión por tamaño de las fracciones de unión de Kappa-Select de BsAb CD33-Dig(SS)-CD33, LeY-Dig(SS)-LeY y GPC3-Dig(SS)-GPC3. Las cajas sombreadas indican fracciones que contienen anticuerpo plegado apropiadamente. (E) SDS-PAGE de anticuerpos purificados sin (n.r.) y con (r.) reducción de muestra.

Figura 6B: (A)-(C) cromatografía de exclusión por tamaño de las fracciones de unión de Kappa-Select de BsAb Dig-CD33-Dig, Dig-LeY-Dig y Dig-GPC3-Dig. Las cajas sombreadas indican fracciones que contienen anticuerpo plegado apropiadamente. (D) SDS-PAGE de anticuerpos purificados sin (n.r.) y con (r.) reducción de muestra.

Figura 7: resultados de estudios de unión de anticuerpos biespecíficos del ejemplo 1. Unión a antígeno simultánea de los anticuerpos generados en el ejemplo 1 como se analiza por análisis FACS en células MCF7 que expresan LeY, células Molm13 que expresan CD33 y células HepG2 que expresan GPC3 usando Dig-Cy5 como carga para abordar la unión a hapteno.

Figura 8: resultados de estudios de unión de anticuerpos biespecíficos del ejemplo 6. Unión a antígeno simultánea de los BsAb BsAb LeY-Bio(SS)-LeY generados en el ejemplo 6 como se analiza por análisis FACS en células MCF7 que expresan LeY y negativas para CD33 usando Cy5 biotinilada como carga para abordar la unión a hapteno.

Figura 9: ilustración esquemática del anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención complejado con una toxina como carga. Se indica un complejo formado entre un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención (se pueden formar complejos de anticuerpos con múltiples especificidades en consecuencia) con una carga. El tercer sitio de unión de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se une específicamente a un hapteno (por ejemplo digoxigenina, biotina) mientras que el primer y segundo sitio de unión se unen a moléculas diana (por ejemplo antígenos asociados a tumor, como LeY, CD33, GPC3). El complejo se forma poniendo en contacto una carga acoplada a hapteno (por ejemplo una toxina, como exotoxina de Pseudomonas, PE) con el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención. El complejo se puede usar para el suministro de carga dirigido a células que expresan la molécula diana.

Figura 10: inhibición de proliferación celular de MCF7 por un complejo de BsAb LeY-Dig(SS)-LeY con PE con digoxigenina. Se indican los resultados de un ensayo de incorporación BrdU como se describe en detalle en el ejemplo 5. El eje Y indica la incorporación de BrdU en células en proliferación.

Figura 11: inhibición de proliferación celular de MCF7 por un complejo de BsAb LeY-Bio(SS)-LeY con PE biotinilada. Se indican los resultados de un ensayo de incorporación BrdU como se describe en detalle en el ejemplo 6. El eje Y indica la incorporación de BrdU en células en proliferación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

1. Definiciones

Los términos "un", "una" y "el/la" incluyen en general referentes en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.

El término "resto de unión a antígeno" como se usa en el presente documento se refiere a un resto que se une específicamente a un antígeno diana. El término incluye anticuerpos así como otras moléculas naturales (por ejemplo receptores, ligandos) o sintéticas (por ejemplo DARPins) que se pueden unir específicamente a un antígeno diana. En un modo de realización preferente, el resto de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con la invención es un fragmento de anticuerpo.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv, scFab); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Como se usa en el presente documento, un "fragmento Fab" se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende un fragmento de cadena ligera que comprende un dominio VL y un dominio constante de una cadena ligera (CL), y un dominio VH y un primer dominio constante (CH1) de una cadena pesada. Como tal, el primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab de un anticuerpo de acuerdo con la invención se refieren a dos restos Fab distintos, comprendiendo cada uno un dominio VL y CL así como un dominio VH y CH1.

Un "fragmento Fv" es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de unión a antígeno completo. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de la región variable de una cadena pesada y una ligera, opcionalmente en asociación no covalente.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una composición de aminoácidos única.

Un "anticuerpo recombinante" es un anticuerpo que se ha producido por una célula huésped genomanipulada de forma recombinante. Está opcionalmente aislado o purificado.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde con la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

El término "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos aislados de una célula huésped tal como una célula NS0 o ^cH^o, o de un animal (por ejemplo, un ratón) que sea transgénico para los genes de inmunoglobulina humana o anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes en forma reordenada. Los anticuerpos humanos recombinantes de acuerdo con la invención se han sometido a hipermutación somática in vivo. Por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de y se relacionan con las secuencias de VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas de las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente las FR completas corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos modos de realización, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la evaluación de la pureza de anticuerpo, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

"Especificidad" se refiere a un reconocimiento selectivo de un epítopo particular de un antígeno por el resto de unión a antígeno, por ejemplo un anticuerpo. Los anticuerpos naturales, por ejemplo, son monoespecíficos. El término "anticuerpo monoespecífico" como se usa en el presente documento indica un anticuerpo que tiene uno o más sitios de unión de los que cada uno se une al mismo epítopo del mismo antígeno. Los "anticuerpos multiespecíficos" se unen a dos o más epítopos diferentes (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más epítopos diferentes). Los epítopos pueden estar en los mismos o diferentes antígenos. Un ejemplo de un anticuerpo multiespecífico es un "anticuerpo biespecífico" que se une a dos epítopos diferentes. Cuando un anticuerpo posee más de una especificidad, los epítopos reconocidos se pueden asociar con un único antígeno o con más de un antígeno.

Un epítopo es una región de un antígeno que está unida por un anticuerpo o resto de unión a antígeno. El término "epítopo" incluye cualquier determinante polipeptídico que se puede unir de forma específica a un anticuerpo o resto de unión a antígeno. En determinados modos de realización, los determinantes de epítopos incluyen agrupaciones de moléculas con superficies químicamente activas tales como aminoácidos, cadenas laterales de glucanos, fosforilo o sulfonilo, y, en determinados modos de realización, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.

Como se usa en el presente documento, los términos "unión" y "unión específica" se refieren a la unión del anticuerpo o resto de unión a antígeno a un epítopo del antígeno en un ensayo in vitro, preferentemente en un ensayo de resonancia de plasmón (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Suecia) con antígeno natural purificado. En determinados modos de realización, se dice que un anticuerpo o resto de unión a antígeno se une específicamente a un antígeno cuando preferencialmente reconoce su antígeno diana en una mezcla de complejos de proteínas y/o macromoléculas.

La afinidad de la unión de un anticuerpo a un antígeno se define por los términos ka (constante de velocidad para la asociación del anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno), kü (constante de disociación) y Kd (kü/ka). En un modo de realización, unión o que se une específicamente quiere decir una afinidad de unión (Kd) de 10-8 mol/l o menos, en un modo de realización de 10-8 M a 10-13 mol/l. Por tanto, un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se une específicamente a cada antígeno para el que es específico con una afinidad de unión (Kd) de 10-8 mol/l o menos, por ejemplo, con una afinidad de unión (Kd) de 10-8 a 10-13 mol/l, en un modo de realización con una afinidad de unión (Kd) de 10-9 a 10-13 mol/l.

Los términos "sitio de unión" o "sitio de unión a antígeno" como se usa en el presente documento indican la(s) región/regiones de una molécula de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) a la que realmente se une un ligando (por ejemplo, el antígeno o fragmento de antígeno de él) y que, preferencialmente, se deriva de un anticuerpo. En el caso de anticuerpos, el sitio de unión a antígeno incluye dominios variables de la cadena pesada de anticuerpo (VH) y/o dominios variables de la cadena ligera de anticuerpo (VL), o pares de VH/VL. El tercer sitio de unión a antígeno en el anticuerpo de acuerdo con la invención se forma por un par de VH/VL.

Los sitios de unión a antígeno derivados de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno deseado se pueden derivar a) de anticuerpos conocidos que se unen específicamente al antígeno o b) de nuevos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo obtenidos por procedimientos de inmunización de novo usando entre otros la proteína antigénica o ácido nucleico o bien fragmentos del mismo o por presentación en fagos.

Cuando se deriva de un anticuerpo, un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con la invención puede contener seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que contribuyen en grados variables a la afinidad del sitio de unión para antígeno. Existen tres CüR de dominios variables de la cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) y tres CDR de dominios variables de la cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3). La extensión de las CDR y regiones estructurales (FR) se determina por comparación con una base de datos compilada de secuencias de aminoácidos en la que las regiones se han definido de acuerdo con la variabilidad entre las secuencias. También se incluyen dentro del alcance de la invención sitios de unión a antígeno funcionales compuestos de menos CDR (es decir, donde la especificidad de unión se determina por tres, cuatro o cinco CDR). Por ejemplo, menos de un conjunto completo de 6 CDR puede ser suficiente para la unión.

El término "valente" como se usa en el presente documento indica la presencia de un número especificado de sitios de unión en una molécula de anticuerpo. Un anticuerpo natural, por ejemplo, tiene dos sitios de unión y es bivalente. Como tal, el término "trivalente" indica la presencia de tres sitios de unión en una molécula de anticuerpo.

Los "dominios variables" o "región variable" como se usa en el presente documento indica cada uno del par de cadenas ligera y pesada que está implicado directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. El dominio variable de una cadena ligera se abrevia como "VL" y el dominio variable de una cadena pesada se abrevia como "VH". De acuerdo con lo mencionado anteriormente, se hace referencia en el presente documento a los dominios variables del tercer sitio de unión usando "VH3" y "VL3", indicando el número tres el tercer sitio de unión.

Los dominios variables de cadenas ligeras y cadenas pesadas humanas tienen la misma estructura general. Cada dominio variable comprende cuatro regiones estructurales (FR), de las que sus secuencias están ampliamente conservadas. Las FR se conectan por tres "regiones hipervariables" (o "regiones determinantes de la complementariedad", CDR). Las CDR en cada cadena se separan por dichos aminoácidos de región estructural. Por lo tanto, las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo comprenden en sentido de N a C terminal los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las FR adoptan una conformación de lámina beta y las CDR pueden formar bucles que conectan la estructura de lámina beta. Las CDR en cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional por las FR y forman conjuntamente con las CDR de la otra cadena un "sitio de unión a antígeno". En especial, la CDR3 de la cadena pesada es la región que más contribuye a la unión a antígeno. Las regiones CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición estándar de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

En anticuerpos naturales, los dominios VL y VH se disponen terminalmente en las cadenas ligeras y cadenas pesadas, respectivamente, lo que permite el acceso del antígeno, garantizando así la unión a antígeno. Dentro de un anticuerpo de acuerdo con la invención, los dominios VL3 y VH3 del tercer sitio de unión pueden estar dispuestos entre dos dominios constantes. Aunque está rodeada por dominios constantes, sorprendentemente se observó la unión específica del tercer sitio de unión.

El término "dominios constantes" o "región constante" como se usa dentro de la actual solicitud indica la suma de los dominios de un anticuerpo distintos de la región variable. La región constante no está implicada directamente en la unión de un antígeno, pero presenta diversas funciones efectoras.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en las "clases": IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estas se pueden dividir además en subclases, tales como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se llaman a, 6, £, y y M, respectivamente. Las regiones constantes de la cadena ligera (CL) que se pueden encontrar en las cinco clases de anticuerpos se llaman k (kappa) y A (lambda).

Los "dominios constantes" como se usa en el presente documento son de origen humano, que es de una región constante de la cadena pesada de un anticuerpo humano de la subclase IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 y/o una región constante de la cadena ligera kappa o lambda. Dichas regiones y dominios constantes son bien conocidos en el estado de la técnica y, por ejemplo, se describen por Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

La "región bisagra" se define en general como una extensión de aproximadamente Glu216, o aproximadamente Cys226, a aproximadamente Pro230 de IgG1 humana (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)). El anticuerpo de acuerdo con la invención está desprovisto de disulfuros de la región bisagra.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos distintos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Una cadena ligera natural típicamente contiene dos dominios de inmunoglobulina, normalmente un dominio variable (VL) que es importante para la unión a un antígeno y un dominio constante (CL).

Existen varios tipos diferentes de "cadenas pesadas" que definen la clase o isotipo de un anticuerpo. Una cadena pesada natural contiene una serie de dominios de inmunoglobulina, normalmente con un dominio variable (VH) que es importante para la unión a antígeno y varios dominios constantes (CH1, CH2, CH3, etc.).

El término "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En un modo de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxilo de la cadena pesada. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD, 1991.

"Funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B. Debido a la estructura del anticuerpo de acuerdo con la invención, en particular atribuida a la falta de dominios CH2, se anulan las funciones efectoras mediadas por Fc por un anticuerpo de acuerdo con la invención.

"Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que las inmunoglobulinas (Ig) secretadas unidas sobre receptores Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo linfocitos NK, neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porta antígeno y posteriormente destruyan la célula diana con citotoxinas. Las células primarias para mediar en la ADCC, linfocitos NK, expresan solo Fc-gammaRIII, mientras que los monocitos expresan Fc-gammaRI, Fc-gammaRII y Fc-gammaRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, tal como el que se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 o 5.821.337 o patente de EE. UU. n.° 6.737.056 (Presta). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen PBMC y linfocitos NK. De forma alternativa o adicional, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el que se divulga en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la vía del complemento clásica se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada), que se unen a su antígeno análogo. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Las variantes polipeptídicas con secuencias de aminoácidos de región Fc alteradas (polipéptidos con una región Fc variante) y capacidad de unión a C1q incrementada o disminuida se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 6.194.551 B1 y el documento WO 1999/51642. Véase también, por ejemplo, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

El "dominio CH2" de una región Fc de IgG humana normalmente se extiende de un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 231 a un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 340. El anticuerpo multiespecífico está desprovisto de un dominio CH2. Por "desprovisto de un dominio CH2" se quiere decir que los anticuerpos de acuerdo con la invención no comprenden un dominio CH2.

El "dominio CH3" comprende el tramo de residuos C terminales a un dominio CH2 en una región Fc (es decir, de un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 341 a un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 447 de una IgG). Dentro de un anticuerpo de acuerdo con la invención, un dominio CH3 respectivo está dispuesto en el extremo C del dominio VH3 y VL3 del tercer sitio de unión. Los "dominios CH3" en el presente documento son dominios CH3 variantes, en los que la secuencia de aminoácidos del dominio CH3 natural se sometió a al menos una sustitución aminoacídica distinta (es decir, modificación de la secuencia de aminoácidos del dominio CH3) para promover la dimerización de los dos dominios CH3 enfrentados entre sí dentro del anticuerpo multiespecífico.

Se han descrito varios enfoques para modificaciones de CH3 para soportar la heterodimerización, por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291, que se incluyen en el presente documento por referencia.

Típicamente, en los enfoques de heterodimerización conocidos en la técnica, el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se genomanipulan ambos de manera complementaria de modo que la cadena pesada que comprende un dominio CH3 genomanipulado ya no se puede homodimerizar con otra cadena pesada de la misma estructura. De este modo, la cadena pesada que comprende un dominio CH3 genomanipulado se fuerza a heterodimerizarse con la otra cadena pesada que comprende el dominio CH3, que se genomanipula de manera complementaria.

Un enfoque de heterodimerización conocido en la técnica es el denominado tecnología de "botones en ojales", que se describe en detalle proporcionando varios ejemplos, por ejemplo, en el documento WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681; y documento WO 98/ 050431, que se incluyen en el presente documento por referencia. En la tecnología de "botones en ojales", dentro de la interfase formada entre dos dominios CH3 en la estructura terciaria del anticuerpo, se genomanipulan aminoácidos particulares en cada dominio CH3 para producir una protuberancia ("botón") en uno de los dominios c H3 y una cavidad ("ojal") en el otro de los dominios CH3, respectivamente. En la estructura terciaria del anticuerpo multiespecífico, la protuberancia introducida en un dominio CH3 es posicionable en la cavidad introducida en el otro dominio CH3.

Otras técnicas para modificar los dominios CH3 de las cadenas pesadas de un anticuerpo multiespecífico (aparte de la tecnología de "botones en ojales") para forzar la heterodimerización son conocidas en la técnica. Estas tecnologías, en especial las descritas en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 y WO 2013/096291 se contemplan en el presente documento como alternativas a la "tecnología de botón en ojal" en combinación con un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención. El anticuerpo multiespecífico que incluye una de estas modificaciones para soportar la heterodimerización se denomina además en el presente documento anticuerpo multiespecífico "con CH3 genomanipulado".

De acuerdo con el enfoque descrito en el documento EP 1870459, la heterodimerización de dominios CH3 se basa en la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase de dominio CH3/CH3 entre ambas, la primera y la segunda cadena pesada (en el presente documento se denomina además "anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-)").

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el enfoque descrito en el documento WO2013/157953 se usa para soportar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K; y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido L en la posición 351 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D. En otro modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K y el aminoácido L en la posición 351 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K; y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido L en la posición 351 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D.

En otro modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K y el aminoácido L en la posición 351 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K; y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido L en la posición 351 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D. Adicionalmente, al menos una de las siguientes sustituciones está comprendida en el dominio CH3 de la otra cadena pesada: el aminoácido Y en la posición 349 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con E, el aminoácido Y en la posición 349 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D y el aminoácido L en la posición 368 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con E. En un modo de realización, el aminoácido L en la posición 368 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con E.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el enfoque descrito en el documento WO2012/058768 se usa para soportar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido L en la posición 351 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con Y y el aminoácido Y en la posición 407 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con A; y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con A y el aminoácido K en la posición 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con F. En otro modo de realización, además de las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 de la otra cadena pesada al menos uno de los aminoácidos en las posiciones 411 (originalmente T), 399 (originalmente D), 400 (originalmente S), 405 (originalmente F), 390 (originalmente N) y 392 (originalmente K) se sustituye. Las sustituciones preferentes son:

- sustitución del aminoácido T en la posición 411 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) con un aminoácido seleccionado de N, R, Q, K, D, E y W;

- sustitución del aminoácido D en la posición 399 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) con un aminoácido seleccionado de R, W, Y y K;

- sustitución del aminoácido S en la posición 400 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) con un aminoácido seleccionado de E, D, R y K;

- sustitución del aminoácido F en la posición 405 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) con un aminoácido seleccionado de I, M, T, S, V y W;

- sustitución del aminoácido N en la posición 390 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) con un aminoácido seleccionado de R, K y D; y

- sustitución del aminoácido K en la posición 392 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) con un aminoácido seleccionado de V, M, R, L, F y E.

En otro modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención (genomanipulado de acuerdo con el documento WO2012/058768), en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido L en la posición 351 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con Y y el aminoácido Y en la posición 407 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con A; y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con V y el aminoácido K en la posición 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con F. En otro modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido Y en la posición 407 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con A; y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con A y el aminoácido K en la posición 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con F. En dicho último modo de realización mencionado anteriormente, en el dominio CH3 de dicha otra cadena pesada, el aminoácido K en la posición 392 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con E, el aminoácido T en la posición 411 (numeración de acuerdo con EU el índice de Kabat) se sustituye con E, el aminoácido D en la posición 399 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con R y el aminoácido S en la posición 400 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con R.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el enfoque descrito en el documento WO 2011/143545 se usa para soportar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, las modificaciones de aminoácidos en los dominios CH3 de ambas cadenas pesadas se introducen en las posiciones 368 y/o 409.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el enfoque descrito en el documento WO 2011/090762 se usa para soportar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. El documento WO 2011/090762 se refiere a modificaciones de aminoácidos de acuerdo con la tecnología de "botón en ojal". En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con W; y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido Y en la posición 407 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con A. En otro modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con Y; y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido Y en la posición 407 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con T.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, que es de isotipo IgG2, el enfoque descrito en el documento WO 2011/090762 se usa para soportar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el enfoque descrito en el documento WO 2009/089004 se usa para soportar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido K o N en la posición 392 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con un aminoácido cargado negativamente (en un modo de realización preferente con E o D, en un modo de realización preferente con D); y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido D en la posición 399, el aminoácido E o D en la posición 356 o el aminoácido E en la posición 357 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con un aminoácido cargado positivamente (en un modo de realización preferente K o R, en un modo de realización preferente con K, en un modo de realización preferente los aminoácidos en las posiciones 399 o 356 se sustituyen con K). En otro modo de realización, además de las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido K o R en la posición 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con un aminoácido cargado negativamente (en un modo de realización preferente con E o D, en un modo de realización preferente con D). Aún en otro modo de realización, además de o de forma alternativa a las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido K en la posición 439 y/o el aminoácido K en la posición 370 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye independientemente entre sí con un aminoácido cargado negativamente (en un modo de realización preferente con E o D, en un modo de realización preferente con D).

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el enfoque descrito en el documento WO 2007/147901 se usa para soportar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido K en la posición 253 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con E, el aminoácido D en la posición 282 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K y el aminoácido K en la posición 322 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D; y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido D en la posición 239 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K, el aminoácido E en la posición 240 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K y el aminoácido K en la posición 292 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el enfoque descrito en el documento WO 2007/110205 se usa para soportar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico.

Además o de forma alternativa a la genomanipulación de los dominios CH3 por estrategias de heterodimerización identificadas anteriormente, la introducción de un puente disulfuro intercatenario adicional estabiliza los heterodímeros (Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35; Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681). Esto también se denomina en el presente documento "estabilización con disulfuro de los dominios CH3".

"Fusionado" y "conectado" con respecto a polipéptidos se refiere a componentes que se enlazan por enlaces peptídicos, directamente o bien por medio de uno o más enlazadores peptídicos ("conector peptídico"). El término "enlazador peptídico" o "conector peptídico" como se usa en el presente documento indica de manera intercambiable un péptido de una secuencia de aminoácidos, que es preferentemente de origen sintético. Típicamente, los conectores peptídicos se componen de residuos flexibles como glicina y serina de modo que los dominios proteicos adyacentes se mueven libremente entre sí. Por tanto, los conectores peptídicos típicos usados de acuerdo con la invención son enlazadores de glicina-serina, es decir, conectores peptídicos que consisten en un patrón de residuos de glicina y serina.

Se usa un primer y un segundo conector peptídico para fusionar el primer fragmento Fab con el dominio VH3 y el segundo fragmento Fab con el dominio VL3. Sin embargo, la conexión entre el dominio VH3 y el dominio VL3 con su respectivo dominio CH3 se realiza directamente, es decir, por conexión directa de dichos dominios, sin incluir enlazadores peptídicos. Por lo tanto, el término "conectado directamente" como se usa en el presente documento con respecto a la fusión/conexión de polipéptidos quiere decir que el sitio de conexión no incluye un enlazador peptídico, es decir, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión incluye únicamente las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos que se fusionaron entre sí y está desprovista de otros residuos aminoacídicos de un enlazador peptídico. Esto se realiza para lograr que la estructura tridimensional de

(a) el sitio de fusión de VH3 y CH3 imite estrechamente tanto el sitio de conexión natural de VH y CH1 como el sitio de conexión natural de CH2 y CH3 del anticuerpo original, del que se deriva el tercer sitio de unión; y

(b) el sitio de fusión de VL3 y CH3 imite estrechamente tanto el sitio de conexión natural de VH y CH1 como el sitio de conexión natural de CH2 y CH3 del anticuerpo original, del que se deriva el tercer sitio de unión.

El término anticuerpos con un "entrecruzamiento de dominios" como se hace referencia en el presente documento quiere decir anticuerpos, en los que en el brazo de unión de anticuerpo (por ejemplo, dentro de la región Fab) que se desvía de la arquitectura de dominio natural de los anticuerpos, al menos un dominio de la cadena pesada se sustituyó con su correspondiente dominio de la cadena ligera y viceversa. Existen tres tipos generales de entrecruzamientos de dominios, (i) el entrecruzamiento del dominio CH1 y CL, que da lugar a cadenas ligeras de entrecruzamiento de una estructura VL-CH1 y cadenas pesadas de entrecruzamiento que incluyen una estructura VH-CL, (ii) el entrecruzamiento del dominio VH y VL, que da lugar a cadenas ligeras de entrecruzamiento de una estructura VH-CL y cadenas pesadas de entrecruzamiento que incluyen una estructura VL-CH1, y (iii) el entrecruzamiento de <VL-CL> y <VH-CH1> ("entrecruzamiento de Fab"), que da lugar a cadenas ligeras de entrecruzamiento de una estructura VH-CH1 y cadenas pesadas de entrecruzamiento que incluyen una estructura VL-CL (las estructuras de dominio se indican en sentido N terminal a C terminal). Dentro de los términos de la presente invención, "reemplazados entre sí" con respecto a las cadenas pesadas y ligeras correspondientes se refiere a las estrategias de entrecruzamiento de dominios mencionadas anteriormente. Como tal, cuando los dominios CH1 y CL se "reemplazan entre sí" se hace referencia al entrecruzamiento de dominios mencionado en el punto (i) y la arquitectura de dominio de cadena pesada y ligera resultante. En consecuencia, cuando VH1 y VL se "reemplazan entre sí", se hace referencia al entrecruzamiento de dominios mencionado en el punto (ii); y cuando los dominios CH1 y CL se "reemplazan entre sí" y los dominios VH1 y VL se "reemplazan entre sí", se hace referencia al entrecruzamiento de dominios mencionado en el punto (iii). Los anticuerpos biespecíficos que incluyen entrecruzamientos de dominios se divulgan, por ejemplo, en los documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 y Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191. Cuando los anticuerpos de acuerdo con la invención incluyen un entrecruzamiento de dominios, el entrecruzamiento de dominios es "asimétrico", lo que indica que (a) solo uno del primer y el segundo fragmento Fab incluye un entrecruzamiento de dominios, o bien (b) el primer y el segundo fragmento Fab incluyen diferentes entrecruzamientos de dominios indicados en los puntos (i) a (iii) anteriores, pero no ambos del primer y el segundo fragmento Fab incluyen el mismo entrecruzamiento de dominios.

El término "estructura terciaria" de un anticuerpo como se usa en el presente documento se refiere a la forma geométrica del anticuerpo de acuerdo con la invención. La estructura terciaria comprende una cadena principal de cadena polipeptídica que comprende los dominios de anticuerpos, mientras que las cadenas laterales de aminoácidos interactúan y se unen de varias formas.

El término "aminoácido" como se usa en el presente documento indica una molécula orgánica que posee un resto amino situado en la posición a con respecto a un grupo carboxílico. Los ejemplos de aminoácidos incluyen: arginina, glici na, ornitina, lisina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, isoleucina, leucina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptófano, metionina, serina, prolina. El aminoácido empleado es opcionalmente en cada caso la forma L. El término aminoácido "cargado positivamente" o "cargado negativamente" se refiere a la carga de cadena lateral de aminoácidos a pH 7,4. Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Tabla - Aminoácidos con propiedades específicas

Como se usa en el presente documento, las posiciones aminoacídicas de todas las regiones y dominios constantes de la cadena pesada y ligera se enumeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat descrito en Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). En particular, para dominios variables y para el dominio constante de la cadena ligera CL de isotipo kappa y lambda, se usa el sistema de numeración de Kabat (véanse las páginas 647-660) de Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) y se denomina en el presente documento "numeración de acuerdo con Kabat"; para los dominios constantes de la cadena pesada (CH1, bisagra, CH2 y CH3) se usa el sistema de numeración de índice Eu de Kabat (véanse las páginas 661 -723) y se denomina en el presente documento "numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat".

Las sustituciones (o mutaciones) aminoacídicas dentro de las cadenas polipeptídicas del anticuerpo multiespecífico se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN de anticuerpo, o por síntesis de nucleótidos. Dichas modificaciones se pueden realizar, sin embargo, solo en un intervalo muy limitado. Por ejemplo, las modificaciones no alteran las características de anticuerpos mencionadas anteriormente tales como el isotipo IgG y la unión a antígeno, pero pueden mejorar además el rendimiento de la producción recombinante, la estabilidad de proteínas o facilitar la purificación. En determinados modos de realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas conservadoras.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se producen por medios recombinantes. Los procedimientos para la producción recombinante de anticuerpos son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y comprenden la expresión de proteínas en células huésped procariotas y eucariotas con el posterior aislamiento del anticuerpo y normalmente la purificación a una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de los anticuerpos como se menciona anteriormente en una célula huésped, se insertan ácidos nucleicos que codifican las respectivas cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo en vectores de expresión por procedimientos estándar. La expresión se realiza en células huésped procariotas o eucariotas apropiadas, como células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levaduras, o células de E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (sobrenadante o células después de lisis). Los procedimientos generales para la producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

Los anticuerpos producidos por células huésped pueden experimentar escisión postraduccional de uno o más, en particular uno o dos, aminoácidos del extremo C de la cadena pesada. Por lo tanto, un anticuerpo producido por una célula huésped por expresión de una molécula de ácido nucleico específica que codifica una cadena pesada de longitud completa puede incluir la cadena pesada de longitud completa, o puede incluir una variante escindida de la cadena pesada de longitud completa (también denominada en el presente documento una cadena pesada variante escindida). Este puede ser el caso cuando los dos aminoácidos C terminales finales de la cadena pesada son glicina (G446) y lisina (K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Las composiciones de la invención, tales como las composiciones farmacéuticas o de diagnóstico descritas en el presente documento, comprenden una población de anticuerpos de la invención. La población de anticuerpos puede comprender anticuerpos que tienen una cadena pesada de longitud completa y anticuerpos que tienen una cadena pesada variante escindida.

El término "purificado", como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos, que se retiran de su entorno natural o de una fuente de producción recombinante, o se aíslan o se separan de otro modo, y están al menos un 60 %, ^{por ejemplo, al menos un}80 ^{%, libres de otros componentes, por ejemplo, membranas y microsomas, con los que se}asocian naturalmente. La purificación de anticuerpos (recuperando los anticuerpos del cultivo de células huésped) se realiza para eliminar componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, por técnicas estándar, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa, y otros bien conocidos en la técnica. Véase Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987). Los diferentes procedimientos están bien establecidos y se usan ampliamente para la purificación de proteínas, tales como cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo, con medios de afinidad para la purificación de dominios constantes de la cadena ligera de isotipo kappa o lambda, por ejemplo KappaSelect o LambdaSelect), cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo intercambio catiónico (resinas de carboximetilo), intercambio aniónico (resinas de aminoetilo) e intercambio de modo mixto), adsorción tiófila (por ejemplo, con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH), cromatografía de interacción hidrófoba o adsorción aromática (por ejemplo, con fenil-sefarosa, resinas aza-arenofílicas o ácido m-aminofenilborónico), cromatografía de afinidad de quelato metálico (por ejemplo, con material de afinidad de Ni(II) y Cu(II)), cromatografía de exclusión por tamaño y procedimientos electroforéticos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

"Polinucleótido" o "ácido nucleico" como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, bases o nucleótidos modificados, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar en un polímero por la ADN o ARN polimerasa, o por una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Una secuencia de nucleótidos se puede interrumpir por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede comprender una modificación/modificaciones realizada(s) después de la síntesis, tales como conjugación con un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "caperuzas", sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), las que contienen restos laterales, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellas que contienen alquilantes, aquellas con enlaces modificados (por ejemplo, alfa ácidos nucleicos anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del/de los polinucleótido(s). Además, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes habitualmente en los glúcidos se puede reemplazar, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, proteger por grupos protectores estándar o activar para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o se puede conjugar con soportes sólidos o semisólidos. El OH 5' y 3' terminal se puede fosforilar o sustituir con aminas o restos del grupo de caperuza orgánico de desde 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también se pueden derivatizar a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de los glúcidos ribosa o desoxirribosa que en general son conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro- o 2'-acido-ribosa, análogos de glúcidos carbocíclicos, glúcidos aanoméricos, glúcidos epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, glúcidos de piranosa, glúcidos de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos nucleosídicos básicos, tales como metil-ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster se pueden reemplazar por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, modos de realización en los que fosfato se reemplaza por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los que cada R o R' es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en el presente documento, incluyendo ARN y ADN.

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

"Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyendo dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y estando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. El término incluye vectores que funcionan principalmente para la inserción de ADN o ARN en una célula (por ejemplo, integración cromosómica), replicación de vectores que funcionan principalmente para la replicación de ADN o ARN y vectores de expresión que funcionan para la transcripción y/o traducción del ADN o ARN. También se incluyen vectores que proporcionan más de una de las funciones como se describe.

Un "vector de expresión" es un vector que puede dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que se enlaza de forma funcional. Cuando el vector de expresión se introduce en una célula huésped apropiada, se puede transcribir y traducir en un polipéptido. Cuando se transforman células huésped en procedimientos de acuerdo con la invención, se usan "vectores de expresión"; de este modo, el término "vector" en relación con la transformación de células huésped como se describe en el presente documento quiere decir "vector de expresión". Un "sistema de expresión" se refiere normalmente a una célula huésped adecuada compuesta de un vector de expresión que puede funcionar para proporcionar un producto de expresión deseado.

Como se usa en el presente documento, "expresión" se refiere al proceso por el que un ácido nucleico se transcribe en ARNm y/o al proceso por el que el ARNm transcrito (también denominado un transcrito) se traduce posteriormente en un péptido, polipéptido o proteína. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan individual o conjuntamente productos génicos. Si un ácido nucleico se deriva de ADN genómico, la expresión en una célula eucariota puede incluir el empalme del ARNm correspondiente.

El término "transformación" como se usa en el presente documento se refiere al proceso de transferencia de un vector/ácido nucleico a una célula huésped. Si se usan células sin barreras de pared celular extraordinarias como células huésped, la transfección se lleva a cabo, por ejemplo, por el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio como se describe por Graham y Van der Eh, Virology 52 (1978) 546ff. Sin embargo, también se pueden usar otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como por inyección nuclear o por fusión de protoplastos. Si se usan células procariotas o células que contienen construcciones de pared celular sustanciales, por ejemplo, un procedimiento de transfección es el tratamiento con calcio usando cloruro de calcio como se describe por Cohen, F.N., et al., PNAS 69 (1972) 7110 y siguientes.

El término "célula huésped" como se usa en la presente solicitud indica cualquier tipo de sistema celular que se pueda genomanipular para generar los anticuerpos de acuerdo con la presente invención.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan de manera intercambiable y dichas designaciones incluyen la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y cultivos derivados de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica a la cribada en la célula transformada originalmente. Cuando se pretenden designaciones distintas, quedará claro en el contexto.

La expresión transitoria se describe, por ejemplo, por Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. La clonación de dominios variables se describe por Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; y Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Un sistema de expresión transitoria preferente (HEK 293) se describe por Schlaeger, E.J., y Christensen, K., en Cytotechnology 30 (1999) 71-83 y por Schlaeger, E.J., en J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la composición. Una composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Como se apreciará por el experto en la técnica, la vía y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Para administrar un anticuerpo de acuerdo con la invención por determinadas vías de administración, puede ser necesario recubrir el anticuerpo con, o coadministrar el anticuerpo con, un material para prevenir su inactivación. Por ejemplo, el anticuerpo se puede administrar a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y soluciones tampón acuosas.

Una composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz de los anticuerpos de acuerdo con la invención. Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, un anticuerpo, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. En particular, la "cantidad eficaz" indica una cantidad de un anticuerpo de la presente invención que, cuando se administra a un sujeto, (i) trata o previene la enfermedad, afección o trastorno particular, (ii) atenúa, mejora o elimina uno o más síntomas de la enfermedad, afección o trastorno particular, o (iii) previene o retrasa la aparición de uno o más síntomas de la enfermedad, afección o trastorno particular descrito en el presente documento. La cantidad terapéuticamente eficaz variará dependiendo de las moléculas de anticuerpo usadas, estado de enfermedad que se está tratando, la gravedad o la enfermedad tratada, la edad y salud relativa del sujeto, la vía y forma de administración, el juicio del médico especialista o veterinario, y otros factores.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. En un modo de realización preferente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión).

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede garantizar tanto por procedimientos de esterilización, supra, como por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares, en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede provocar por la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral", como se usan en el presente documento, quieren decir modos de administración distintos de administración enteral y tópica, normalmente por inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intrarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intrarticular, subcapsular, subaracnoidea, intrarraquídea, epidural e intraesternal.

Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que se pueden usar en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables por procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Se pueden variar los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin que sean tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, estado, salud general y anamnesis anterior del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

La composición debe ser estéril y fluida en la medida en que la composición sea administrable por jeringuilla. Además de agua, en un modo de realización, el vehículo es una solución salina tamponada isotónica.

La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, glúcidos, polialcoholes, tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composición.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante la evolución de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, se usan los anticuerpos de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.

El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados a continuación.

2. Descripción detallada de los modos de realización de la invención

I. Anticuerpo multiespecífico

La invención se refiere a un anticuerpo multiespecífico que comprende al menos tres sitios de unión a antígeno, en el que dos sitios de unión a antígeno se forman por un primer fragmento Fab y un segundo fragmento Fab, en el que

i) generación de una protuberancia en uno de los dominios de CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original, y generación de una cavidad en el otro de los dominios de CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, de modo que la protuberancia generada en uno de los dominios CH3 es posicionable en la cavidad generada en el otro de los dominios CH3 (que corresponde a soportar la heterodimerización por la tecnología de botones en ojales); o

sustitución de al menos un residuo aminoacídico original en uno de los dominios CH3 con un aminoácido cargado positivamente; y sustitución de al menos un residuo aminoacídico original en el otro de los dominios CH3 con un aminoácido cargado negativamente (que corresponde a soportar la heterodimerización introduciendo aminoácidos de cargas opuestas dentro de los dominios CH3 correspondientes);

iii) ambas modificaciones de i) y ii);

c) el extremo C del dominio VH3 del tercer sitio de unión a antígeno se conecta a uno de los dominios CH3 mencionados en b), y el extremo C del dominio VL3 del tercer sitio de unión a antígeno se conecta al otro de los dominios CH3 mencionados en b), y

Un esquema de la estructura general de dicho anticuerpo multiespecífico se representa en la fig. 1. Los dos brazos de unión del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención formados por el primer y segundo fragmento Fab se pueden unir al mismo o diferentes antígenos. A diferencia de una molécula de IgG natural, dentro del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, los dominios CH2 se reemplazaron por un tercer sitio de unión, que en el presente documento se denomina VH3/VL3. Como el anticuerpo multiespecífico está desprovisto de dominios CH2, se anula la función efectora mediada por Fc, que se desea para varias aplicaciones terapéuticas. Los anticuerpos multiespecíficos son en particular adecuados para unir diferentes epítopos en el mismo antígeno diana (por ejemplo, diferentes epítopos en la misma biomolécula) o diferentes biomoléculas en la misma célula.

Heterodimerización

En un modo de realización del anticuerpo multiespecífico, los dominios CH3 se alteran de acuerdo con la tecnología de botones en ojales. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización también se denomina en el presente documento "anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH)" (en el que la abreviatura "KiH" representa la "tecnología de botón en ojal"). Por lo tanto, de acuerdo con el presente modo de realización dentro de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH), los dominios CH3 se alteran para promover la heterodimerización por generación de una protuberancia en uno de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original; y generación de una cavidad en el otro de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, de modo que la protuberancia generada en uno de los dominios CH3 es posicionable en la cavidad generada en el otro de los dominios CH3.

En otras palabras, el presente modo de realización se refiere a un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención que comprende una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada, en el que en la estructura terciaria del anticuerpo el dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio c H3 de la segunda cadena pesada forman una interfase que se encuentra entre los respectivos dominios CH3 del anticuerpo, en el que las respectivas secuencias de aminoácidos del dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio CH3 de la segunda cadena pesada comprenden cada una un conjunto de aminoácidos que se encuentra dentro de dicha interfase en la estructura terciaria del anticuerpo,

- en el que del conjunto de aminoácidos que se encuentra en la interfase en el dominio CH3 de una cadena pesada, al menos un residuo aminoacídico se sustituye con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original, generando de este modo una protuberancia dentro de la interfase, en el que la protuberancia se encuentra en el dominio CH3 de una cadena pesada, y en el que la protuberancia es posicionable en una cavidad situada en el dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro de la interfase; y

- en el que del conjunto de aminoácidos que se encuentra en la interfase en el dominio CH3 de la otra cadena pesada al menos un residuo aminoacídico se sustituye con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, generando de este modo una cavidad dentro de la interfase, en el que la cavidad se encuentra en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, y en el que en la cavidad la protuberancia dentro de la interfase situada en el dominio CH3 de la cadena pesada es posicionable.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W; y dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, el dominio CH3 de una cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "botón") comprende una mutación T366W y el dominio CH3 de la otra cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, el dominio CH3 de una cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "botón") comprende las mutaciones T366W y G407Y, y el dominio CH3 de la otra cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, el dominio CH3 de una cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "botón") comprende las mutaciones T366W, R409D y K370E, y el dominio CH3 de la otra cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V, D399R y E357R (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

De forma alternativa a o en combinación con las modificaciones de acuerdo con la tecnología de botones en ojales como se define anteriormente, los dominios CH3 del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se alteran para promover la heterodimerización basada en otros enfoques de heterodimerización conocidos en la técnica, preferentemente los descritos en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 y WO 2013/096291.

En otro modo de realización del anticuerpo multiespecífico, de forma alternativa a o en combinación con las modificaciones de acuerdo con la tecnología de botones en ojales, los dominios CH3 se alteran por la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase de dominio CH3/CH3 (por ejemplo, como se describe en el documento EP 1870459). El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización también se denomina en el presente documento "anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-)" (en el que la abreviatura "+/-" representa los aminoácidos con carga opuesta que se introdujeron en los respectivos dominios CH3). Por lo tanto, de acuerdo con el presente modo de realización dentro de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-), los dominios CH3 se alteran para promover la heterodimerización sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en uno de los dominios CH3 con un aminoácido cargado positivamente; y sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en el otro de los dominios CH3 con un aminoácido cargado negativamente.

En otras palabras, el presente modo de realización se refiere a un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-) de acuerdo con la invención que comprende una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada, en el que en la estructura terciaria del anticuerpo el dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio CH3 de la segunda cadena pesada forman una interfase que se encuentra entre los respectivos dominios CH3 del anticuerpo, en el que las respectivas secuencias de aminoácidos del dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio CH3 de la segunda cadena pesada comprenden cada una un conjunto de aminoácidos que se encuentra dentro de dicha interfase en la estructura terciaria del anticuerpo, en el que del conjunto de aminoácidos que se encuentra en la interfase en el dominio CH3 de una cadena pesada, un primer aminoácido se sustituye con un aminoácido cargado positivamente y del conjunto de aminoácidos que se encuentra en la interfase en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, un segundo aminoácido se sustituye con un aminoácido cargado negativamente.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-) de acuerdo con la invención, el aminoácido cargado positivamente se selecciona de K, R y H; y el aminoácido cargado negativamente se selecciona de E o D.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-) de acuerdo con la invención, el aminoácido cargado positivamente se selecciona de K y R; y el aminoácido cargado negativamente se selecciona de E o D.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-) de acuerdo con la invención, el aminoácido cargado positivamente es K; y el aminoácido cargado negativamente es E.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-) de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido R en la posición 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D y el aminoácido K en la posición 370 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con E; y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido D en la posición 399 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K y el aminoácido E en la posición 357 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K.

En otro modo de realización del anticuerpo multiespecífico, los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización también se denomina en el presente documento "anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S)" (en el que la abreviatura "S-S" representa la estabilización con disulfuro). Por lo tanto, de acuerdo con el presente modo de realización dentro de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S), los dominios CH3 se alteran para promover la heterodimerización por introducción de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3.

En otras palabras, el presente modo de realización se refiere a un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S) de acuerdo con la invención que comprende una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada, en el que en la estructura terciaria del anticuerpo el dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio c H3 de la segunda cadena pesada forman una interfase que se encuentra entre los respectivos dominios CH3 del anticuerpo, en el que las respectivas secuencias de aminoácidos del dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio CH3 de la segunda cadena pesada comprenden cada una un conjunto de aminoácidos que se encuentra dentro de dicha interfase en la estructura terciaria del anticuerpo, del conjunto de aminoácidos que se encuentra en la interfase en el dominio CH3 de una cadena pesada, un primer aminoácido se sustituye con cisteína; y del conjunto de aminoácidos que se encuentra en la interfase en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, un segundo aminoácido se sustituye con cisteína, en el que el segundo aminoácido se orienta hacia el primer aminoácido dentro de la interfase; de modo que se puede formar un puente disulfuro entre el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada por medio de los residuos de cisteína introducidos.

En un modo de realización del anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S), los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización del anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S), los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación S354C en uno de los dominios CH3 y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Aún en otro modo de realización preferente del anticuerpo multiespecífico, los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro y se alteran de acuerdo con la tecnología de botones en ojales. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización también se denomina en el presente documento "anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS)" (en el que la abreviatura "K" representa la tecnología de botones en ojales y "SS" representa la estabilización con disulfuro). Por lo tanto, de acuerdo con el presente modo de realización, dentro de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS), los dominios CH3 se alteran para promover la heterodimerización por generación de una protuberancia en uno de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original; y generación de una cavidad en el otro de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, de modo que la protuberancia generada en uno de los CH3 dominios es posicionable en la cavidad generada en el otro de los dominios CH3; y una introducción adicional de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3.

En otras palabras, el presente modo de realización se refiere a un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención que comprende una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada, en el que en la estructura terciaria del anticuerpo el dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio c H3 de la segunda cadena pesada forman una interfase que se encuentra entre los respectivos dominios CH3 del anticuerpo, en el que las respectivas secuencias de aminoácidos del dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio CH3 de la segunda cadena pesada comprenden cada una un conjunto de aminoácidos que se encuentra dentro de dicha interfase en la estructura terciaria del anticuerpo,

- en el que del conjunto de aminoácidos que se encuentra en la interfase en el dominio CH3 de la otra cadena pesada al menos un residuo aminoacídico se sustituye con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, generando de este modo una cavidad dentro de la interfase, en el que la cavidad se encuentra en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, y en el que en la cavidad la protuberancia dentro de la interfase situada en el dominio CH3 de la cadena pesada es posicionable; y en el que

- del conjunto de aminoácidos que se encuentra en la interfase en el dominio CH3 de una cadena pesada, un primer aminoácido se sustituye con cisteína; y del conjunto de aminoácidos que se encuentra en la interfase en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, un segundo aminoácido se sustituye con cisteína, en el que el segundo aminoácido se orienta hacia el primer aminoácido dentro de la interfase; de modo que se puede formar un puente disulfuro entre el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada por medio de los residuos de cisteína introducidos.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, la mutación E356C o S354C se introduce en el dominio CH3 de la cadena con "botón" y las mutaciones Y349C se introducen en el dominio CH3 de la cadena con "ojal".

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W; y dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W; y dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V, y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, el dominio CH3 de una cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "botón") comprende una mutación T366W y el dominio CH3 de la otra cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat), y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, el dominio CH3 de una cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "botón") comprende las mutaciones T366W y G407Y, y el dominio CH3 de la otra cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat), y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, el dominio CH3 de una cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "botón") comprende las mutaciones T366W, R409D y R370E, y el dominio CH3 de la otra cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V, D399R y E357R (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat), los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Aún en otro modo de realización preferente del anticuerpo multiespecífico, los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro y se alteran por la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase de dominio CH3/CH3. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización también se denomina en el presente documento "anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-/SS)" (en el que la abreviatura "+/-" representa los aminoácidos con carga opuesta y "SS" representa la estabilización con disulfuro). Por lo tanto, de acuerdo con el presente modo de realización, dentro de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-/SS) los dominios CH3 se alteran para promover la heterodimerización sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en uno de los dominios CH3 con un aminoácido cargado positivamente; y sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en el otro de los dominios CH3 con un aminoácido cargado negativamente; y una introducción adicional de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3.

En otras palabras, el presente modo de realización se refiere a un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-/SS) de acuerdo con la invención que comprende una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada, en el que en la estructura terciaria del anticuerpo el dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio CH3 de la segunda cadena pesada forman una interfase que se encuentra entre los respectivos dominios c H3 del anticuerpo, en el que las secuencias de aminoácidos respectivas del dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio CH3 de la segunda cadena pesada comprenden cada una un conjunto de aminoácidos que se encuentra dentro de dicha interfase en la estructura terciaria del anticuerpo,

- en el que del conjunto de aminoácidos que se encuentra en la interfase en el dominio CH3 de una cadena pesada, un primer aminoácido se sustituye con un aminoácido cargado positivamente; y

- en el que del conjunto de aminoácidos que se encuentra en la interfase en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, un segundo aminoácido se sustituye con un aminoácido cargado negativamente; y en el que

- del conjunto de aminoácidos que se encuentra en la interfase en el dominio CH3 de una cadena pesada, un primer aminoácido se sustituye con cisteína; y del conjunto de aminoácidos que se encuentra en la interfase en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, un segundo aminoácido se sustituye con cisteína, en el que el segundo aminoácido se orienta hacia el primer aminoácido dentro de la interfase; de modo que se puede formar un puente disulfuro entre el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada por medio de los residuos de cisteína introducidos. En un modo de realización de la invención, el tercer sitio de unión del anticuerpo multiespecífico se estabiliza con disulfuro. Por lo tanto, los dominios VH3 y VL3 se alteran por introducción de al menos un residuo de cisteína en el dominio VH3 y un residuo de cisteína en el dominio VL3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios VH3 y VL3. En un modo de realización de la invención, el tercer sitio de unión del anticuerpo multiespecífico se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH3 y VL3 (numeración de acuerdo con Kabat):

- VH3 en la posición 44, y VL3 en la posición 100;

- VH3 en la posición 105, y VL3 en la posición 43; o

- VH3 en la posición 101, y VL3 en la posición 100.

En un modo de realización preferente, el tercer sitio de unión se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44, y en el dominio VL3 en la posición 100.

En un modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión del anticuerpo multiespecífico se estabiliza con disulfuro y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro. Sin quedar vinculado a esta teoría, los al menos dos enlaces disulfuro formados por esta modificación en diferentes dominios del dominio Fc alterado del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención reemplazan las interacciones disulfuro de bisagra de la IgG natural y, de este modo soportan la heterodimerización mientras que permiten el acceso del antígeno al tercer sitio de unión. En un modo de realización, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH3 y VL3 (numeración de acuerdo con a Kabat):

- VH3 en la posición 44, y VL3 en la posición 100;

- VH3 en la posición 105, y VL3 en la posición 43; o

- VH3 en la posición 101, y VL3 en la posición 100.

En un modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44 y en el dominio VL3 en la posición 100.

En otro modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44 y en el dominio VL3 en la posición 100; y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización preferente de la invención, la heterodimerización se soporta por modificaciones de botones en ojales dentro de los dominios CH3 y, además, el tercer sitio de unión del anticuerpo multiespecífico y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro, respectivamente. En un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización, la heterodimerización de las cadenas pesadas modificadas con botones en ojales se soporta además por un enlace disulfuro intercatenario artificial, que, en contraste con los enfoques de botones en ojales conocidos, no se encuentra dentro del CH3 dominio, sino en un dominio diferente (es decir, entre los dominios VH3 y VL3). Dentro del anticuerpo de acuerdo con el presente modo de realización, la heterodimerización del tercer módulo de unión (que ^{comprende los polipéptidos VH}3^-CH3 ^{y VL3-CH3) se promueve por cuatro interacciones distintas: (i) la interacción natural}entre VH3 y VL3, (ii) la estabilización con disulfuro en la interfase VH3/VL3, (iii) la estabilización con disulfuro en la interfase CH3/CH3; y (iv) las modificaciones de botones en ojales en la interfase CH3/CH3. Por esto, se promueve la formación de heterodímeros en lugar de la formación de homodímeros y se mejora la estabilidad del anticuerpo.

En un modo de realización, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH3 y VL3 (numeración de acuerdo con a Kabat):

- VH3 en la posición 44, y VL3 en la posición 100;

- VH3 en la posición 105, y VL3 en la posición 43; o

- VH3 en la posición 101, y VL3 en la posición 100.

En un modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44 y en el dominio VL3 en la posición 100.

En otro modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44, y en el dominio VL3 en la posición 100; y el residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W; y el residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V, y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44, y en el dominio VL3 en la posición 100; y el dominio CH3 de una cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "botón") comprende una mutación T366W, y el dominio CH3 de la otra cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat), y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44, y en el dominio VL3 en la posición 100; y el dominio CH3 de una cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "botón") comprende las mutaciones T366W y G407Y, y el dominio CH3 de la otra cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat), y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44, y en el dominio VL3 en la posición 100; y el dominio CH3 de una cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "botón") comprende las mutaciones T366W, R409D y K370E, y el dominio CH3 de la otra cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V, D399K y E357K (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat), los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización preferente de la invención, la heterodimerización se soporta por la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase de dominio CH3/CH3 y, además, el tercer sitio de unión del anticuerpo multiespecífico y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro, respectivamente. En un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización, la heterodimerización de las cadenas pesadas modificadas se soporta además por un enlace disulfuro intercatenario artificial, que no se encuentra dentro del dominio CH3, sino en un dominio diferente (es decir, entre los dominios VH3 y VL3). En un modo de realización, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-/SS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH3 y VL3 (numeración de acuerdo con a Kabat):

- VH3 en la posición 44, y VL3 en la posición 100;

- VH3 en la posición 105, y VL3 en la posición 43; o

- VH3 en la posición 101, y VL3 en la posición 100.

En un modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-/SS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44 y en el dominio VL3 en la posición 100.

Conector peptídico

Dentro de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el extremo N terminal de los dominios VH3 y VL3 del tercer sitio de unión se fusionan a los fragmentos Fab respectivos por medio de un primer y segundo conector peptídico, respectivamente. En un modo de realización de la invención, no se forma un enlace disulfuro intercatenario entre el primer y el segundo conector peptídico. En un modo de realización de la invención, el primer y segundo conectores peptídicos son idénticos entre sí.

En un modo de realización de la invención, el anticuerpo multiespecífico está desprovisto de una región bisagra. En otro modo de realización alternativo de la invención, el anticuerpo multiespecífico comprende una región bisagra natural, que no forma disulfuros intercatenarios. Un ejemplo es el péptido de región bisagra derivado de un anticuerpo de isotipo IgG4.

En un modo de realización preferente de la invención, el primer y segundo conector peptídico son péptidos de al menos 15 aminoácidos. En otro modo de realización de la invención, el primer y segundo conector peptídico son péptidos de 15 - 70 aminoácidos. En otro modo de realización de la invención, el primer y segundo conector peptídico son péptidos de 20-50 aminoácidos. En otro modo de realización de la invención, el primer y segundo conector peptídico son péptidos de 10-50 aminoácidos. Dependiendo, por ejemplo, del tipo de antígeno que se va a unir por el tercer sitio de unión, también pueden ser aplicables conectores peptídicos más cortos (o incluso más largos) en anticuerpos de acuerdo con la invención.

Aún en otro modo de realización de la invención, el primer y segundo conector peptídico son aproximadamente de la longitud de la región bisagra natural (que es para moléculas de anticuerpo natural de isotipo IgG1 de aproximadamente 15 aminoácidos, y para isotipo IgG3 de aproximadamente 62 aminoácidos). Por lo tanto, en un modo de realización, en el que el anticuerpo multiespecífico es de isotipo IgG1, los conectores peptídicos son péptidos de 10-20 aminoácidos, en un modo de realización preferente de 12-17 aminoácidos. En otro modo de realización, en el que el anticuerpo multiespecífico es de isotipo IgG3, los conectores peptídicos son péptidos de 55 - 70 aminoácidos, en un modo de realización preferente de 60 - 65 aminoácidos.

En un modo de realización de la invención, los primer y segundo conectores peptídicos son enlazadores de glicina-serina. En un modo de realización de la invención, los primer y segundo conectores peptídicos son péptidos que consisten en residuos de glicina y serina. En un modo de realización de la invención, los enlazadores de glicina-serina son de la estructura

(GxS)n o (GxS)nGm

con G = glicina, S = serina, x = 3 o 4, n = 2, 3, 4, 5 o 6, y m = 0, 1,2 o 3.

En un modo de realización, de los enlazadores de glicina-serina definidos anteriormente, x = 3, n = 3, 4, 5 o 6, y m = 0, 1, 2 o 3; o x = 4, n = 2, 3, 4 o 5 y m = 0, 1, 2 o 3. En un modo de realización preferente, x = 4 y n = 2 o 3, y m = 0. Aún en otro modo de realización preferente, x = 4 y n = 2. En un modo de realización, dicho conector peptídico es (G4S)2.

En un modo de realización preferente de la invención, los primer y segundo conectores peptídicos son péptidos (G4S)2, y el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) como se define anteriormente, en el que el tercer sitio de unión se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44, y en el dominio VL3 en la posición 100; y en el que en el anticuerpo multiespecífico el dominio CH3 de una cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "botón") comprende las mutaciones T366W y G407Y, y el dominio CH3 de la otra cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat), y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización preferente de la invención, los primer y segundo conectores peptídicos son péptidos (G4S)2, y el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) como se define anteriormente, en el que el tercer sitio de unión se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44, y en el dominio VL3 en la posición 100; y en el que en el anticuerpo multiespecífico el dominio CH3 de una cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "botón") comprende las mutaciones T366W, G407Y y S354C, y el dominio CH3 de la otra cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V e Y349C (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Sitio de fusión de los dominios VH ³ y VL ³ con respectivos dominios CH3

Dentro de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el respectivo extremo C de los dominios VH3 y VL3 del tercer sitio de unión se fusiona con los dominios CH3. La obtención de un pliegue proteico similar a una región Fc de IgG natural se puede lograr mejor, cuando los dominios variables VH3 y VL3 se conectan directamente a los respectivos dominios CH3 sin la ayuda de un conector peptídico. Además, incluso en el caso de que el tercer sitio de unión y la interfase CH3/CH3 se estabilicen ambos con disulfuro, la conexión directa de los dominios variables con el respectivo dominio CH3 previene ventajosamente el emparejamiento incorrecto de los residuos de cisteína, que se encuentran en estrecha proximidad, cuando se forman los enlaces disulfuro intercatenarios deseados.

Por lo tanto, en un modo de realización de la invención, el extremo C del dominio VH3 se conecta directamente a uno de los dominios CH3, y el extremo C del dominio VL3 se conecta directamente al otro de los dominios CH3. En un modo de realización preferente de la invención, el extremo C del dominio VH3 se conecta directamente a uno de los dominios CH3, y el extremo C del dominio VL3 se conecta directamente al otro de los dominios CH3, en los que los sitios de conexión están desprovistos de un péptido enlazador adicional.

Para proporcionar un sitio de fusión que imite de forma estrechamente estructural los sitios de transición naturales entre dominios variables y constantes de moléculas de anticuerpo natural, el extremo C de los dominios variables (VH3 y VL3, respectivamente) y/o el extremo N de los dominios CH3 (que se conectan directamente a los respectivos dominios variables) pueden incluir mutaciones sustituyendo residuos aminoacídicos distintos.

Por lo tanto, en un modo de realización de la invención, el extremo N del dominio CH3 se modifica sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original. En un modo de realización de la invención, el extremo C del dominio VH3 se modifica sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original. En un modo de realización de la invención, el extremo C del dominio VL3 se modifica sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original.

En un modo de realización preferente, el extremo N de cada uno de los dominios CH3 incluye al menos una mutación aminoacídica, el extremo C del dominio VH3 incluye al menos una mutación aminoacídica y el extremo C del dominio VL3 incluye al menos una mutación aminoacídica.

En un modo de realización del mismo, las mutaciones aminoacídicas para mejorar la estructura terciaria del sitio de fusión para imitar los sitios de transición naturales entre dominios variables y constantes de moléculas de anticuerpo natural se realizan sustituyendo al menos un residuo aminoacídico situado en las posiciones 341 a 350 de los dominios CH3 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, se sustituye al menos un residuo aminoacídico situado en las posiciones 341 a 345 de los dominios CH3 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización de la invención, el extremo N del dominio CH3 consiste en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2. En un modo de realización de la invención, el extremo N del dominio CH3 consiste en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

En otro modo de realización, las mutaciones aminoacídicas para mejorar la estructura terciaria del sitio de fusión para imitar los sitios de transición naturales entre dominios variables y constantes de moléculas de anticuerpos naturales se realizan sustituyendo al menos un residuo aminoacídico de los diez residuos aminoacídicos C terminales del dominio VH3, el dominio VL3 o ambos, el dominio VH3 y el dominio VL3.

En un modo de realización preferente, el extremo N de cada uno de los dominios CH3 incluye al menos una mutación aminoacídica situada en las posiciones 341 a 350 de los dominios CH3 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y los diez residuos aminoacídicos C terminales del dominio VH3 incluyen al menos una mutación aminoacídica, y los diez residuos aminoacídicos C terminales del dominio VL3 incluyen al menos una mutación aminoacídica.

En otro modo de realización preferente, el extremo N de cada uno de los dominios CH3 incluye al menos una mutación aminoacídica situada en las posiciones 341 a 345 de los dominios CH3 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y los cinco residuos aminoacídicos C terminales del dominio VH3 incluyen al menos una mutación aminoacídica, y los cinco residuos aminoacídicos C terminales del dominio VL3 incluyen al menos una mutación aminoacídica.

Primer y segundo fragmentos Fab

El primer y segundo sitios de unión a antígeno de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención son fragmentos Fab, por tanto, el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención tiene una forma similar a IgG y presenta un peso molecular comparable al de una molécula de IgG natural. Similar a una molécula de IgG natural, dicho anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención comprende dos brazos de unión basados en fragmentos Fab. Los brazos de unión pueden ser de una estructura Fab natural o comprender otras modificaciones como es conocido en la técnica (por ejemplo, los fragmentos Fab pueden ser Fab monocatenarios, Fab estabilizados con disulfuro, Fab monocatenarios estabilizados con disulfuro o Fab con entrecruzamiento de dominios). Para garantizar la unión a antígeno del tercer sitio de unión, la región bisagra de un anticuerpo natural, que incluye naturalmente enlaces disulfuro estabilizadores, se reemplaza por conectores peptídicos desprovistos de enlaces disulfuro intercatenarios. Debido a la falta de estabilización que surge de la retirada de la interacción de disulfuros de bisagra natural, la región similar a Fc alterada del anticuerpo multiespecífico se estabiliza soportando la heterodimerización CH3/CH3 por modificaciones de botones en ojales o introducción de aminoácidos con carga opuesta y/o disulfuros intercatenarios adicionales. Además, se soporta de este modo el ensamblaje correcto de la molécula de anticuerpo deseada (por ejemplo, se evita el emparejamiento incorrecto como la formación de homodímeros de la cadena pesada).

En un modo de realización, el dominio constante de la cadena ligera del primer y/o el segundo fragmento Fab es de isotipo kappa. En un modo de realización, el dominio constante de la cadena ligera del primer y/o segundo fragmento Fab es de isotipo lambda. En un modo de realización, el dominio constante de la cadena ligera del primer fragmento Fab es de isotipo kappa y el dominio constante de la cadena ligera del segundo fragmento Fab es de isotipo lambda.

En un modo de realización de la invención, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, se estabilizan con disulfuro. En un modo de realización, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, se estabilizan con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los correspondientes dominios VH y VL (numeración de acuerdo con Kabat):

- VH en la posición 44 y VL en la posición 100;

- VH en la posición 105 y VL en la posición 43; o

- VH en la posición 101 y VL en la posición 100.

En un modo de realización preferente de la invención, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, se estabilizan con disulfuro, respectivamente, por introducción de residuos de cisteína en su dominio VH en la posición 44, y en su dominio VL en la posición 100.

En otro modo de realización de la invención, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, se estabilizan con disulfuro. En un modo de realización, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, se estabilizan con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los correspondientes dominios VH y VL (numeración de acuerdo con Kabat):

- VH en la posición 44 y VL en la posición 100;

- VH en la posición 105 y VL en la posición 43; o

- VH en la posición 101 y VL en la posición 100, y

y el enlace disulfuro natural entre las cadenas polipeptídicas del respectivo fragmento Fab se anula sustituyendo al menos uno de los residuos de cisteína que forman enlaces disulfuro intercatenarios con otro residuo aminoacídico.

Aún en otro modo de realización de la invención, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, se estabilizan con disulfuro, respectivamente, por introducción de residuos de cisteína en su dominio VH en la posición 44, y en su dominio VL en la posición 100; y el enlace disulfuro natural entre las cadenas polipeptídicas del respectivo fragmento Fab se anula sustituyendo al menos uno de los residuos de cisteína que forman enlaces disulfuro intercatenarios con otro residuo aminoacídico. De acuerdo con el presente modo de realización, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, se estabilizan solo por el enlace disulfuro artificial entre VH en la posición 44 y VL en la posición 100.

En un modo de realización de la invención, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, son fragmentos Fab monocatenarios (scFab), es decir, los dominios del fragmento Fab se disponen en una única cadena polipeptídica. El presente modo de realización es en particular útil, cuando el primer y segundo fragmento Fab se unen a diferentes epítopos (y, por lo tanto, el anticuerpo multiespecífico es al menos triespecífico). Por esto, la formación de producto secundario y el emparejamiento incorrecto de la cadena ligera (es decir, emparejamiento de una cadena ligera con la cadena pesada errónea formando de este modo sitios de unión no funcionales) durante la expresión recombinante se puede reducir y el rendimiento de la expresión se puede mejorar. En un modo de realización preferente, exactamente uno de los fragmentos Fab (es decir, el primer fragmento Fab o bien el segundo fragmento Fab) es un fragmento Fab monocatenario (mientras que el otro fragmento Fab no es un fragmento Fab monocatenario sino que está formado por dos cadenas polipeptídicas).

Por lo tanto, en un modo de realización preferente de un anticuerpo multiespecífico que incluye al menos un fragmento Fab monocatenario, el anticuerpo multiespecífico es al menos triespecífico. En otro modo de realización preferente de un anticuerpo multiespecífico que incluye al menos un fragmento Fab monocatenario, el anticuerpo multiespecífico es triespecífico. Aún en otro modo de realización preferente de un anticuerpo multiespecífico que incluye al menos un fragmento Fab monocatenario, el anticuerpo multiespecífico es trivalente y triespecífico.

En un modo de realización de la invención, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, son fragmentos Fab monocatenarios estabilizados con disulfuro (dsFab). En un modo de realización, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, son fragmentos Fab monocatenarios, que se estabilizan con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los correspondientes dominios VH y VL (numeración de acuerdo con Kabat):

- VH en la posición 44 y VL en la posición 100;

- VH en la posición 105 y VL en la posición 43; o

- VH en la posición 101 y VL en la posición 100.

En un modo de realización preferente de la invención, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, son fragmentos Fab monocatenarios, que se estabilizan con disulfuro, respectivamente, por introducción de residuos de cisteína en su dominio VH en la posición 44, y en su dominio VL en la posición 100. En un modo de realización preferente, exactamente uno de los fragmentos Fab (es decir, el primer fragmento Fab o bien el segundo fragmento Fab) es un fragmento Fab monocatenario, que se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en su dominio VH en la posición 44, y en su dominio VL en la posición 100.

En otro modo de realización preferente, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, son fragmentos Fab monocatenarios, que se estabilizan con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los correspondientes dominios VH y VL (numeración de acuerdo con Kabat):

- VH en la posición 44 y VL en la posición 100;

- VH en la posición 105 y VL en la posición 43; o

- VH en la posición 101 y VL en la posición 100; y

el enlace disulfuro natural entre las cadenas polipeptídicas del respectivo fragmento Fab monocatenario se anula sustituyendo al menos uno de los residuos de cisteína que forman enlaces disulfuro intercatenarios con otro residuo aminoacídico. Aún en otro modo de realización preferente de la invención, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, son fragmentos Fab monocatenarios, que se estabilizan con disulfuro, respectivamente, por introducción de residuos de cisteína en su dominio VH en la posición 44, y en su dominio VL en la posición 100, y el enlace disulfuro natural entre las cadenas polipeptídicas del respectivo fragmento Fab monocatenario se anula sustituyendo al menos uno de los residuos de cisteína que forman enlaces disulfuro intercatenarios con otro residuo aminoacídico.

En un modo de realización de la invención, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, se alteran por entrecruzamiento de dominios, de modo que:

a) solo los dominios CH1 y CL se reemplazan entre sí;

b) solo los dominios VH y VL se reemplazan entre sí; o bien

c) los dominios CH1 y CL se reemplazan entre sí y los dominios VH y VL se reemplazan entre sí,

con la condición de que en caso de que ambos el primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab se alteren por entrecruzamiento de dominios, se alteren por diferentes entrecruzamientos de dominios. Esto quiere decir, por ejemplo, que en caso de que ambos fragmentos Fab comprendan un entrecruzamiento de dominios, cuando el primer fragmento Fab comprende el entrecruzamiento de dominios definido en a), es decir, los dominios CH1 y CL se reemplacen entre sí, entonces el segundo fragmento Fab comprende el entrecruzamiento de dominios definido en b) (es decir, reemplazo de los correspondientes dominios VH y VL) o bien el entrecruzamiento de dominios definido en c) (es decir, reemplazo de VH-CH1 por VL-CL), pero el segundo fragmento Fab no comprende el entrecruzamiento de dominios definido en a) (es decir, solo los dominios CH1 y CL se reemplazan entre sí). Por lo tanto, el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización comprende un entrecruzamiento de dominios asimétrico con respecto al primer y segundo fragmento Fab, lo que quiere decir que debido al entrecruzamiento de dominios las cadenas ligeras del primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab ya no se componen de la misma arquitectura de dominio, sino que más bien se componen de una arquitectura de dominio diferente. De este modo, se evita el emparejamiento de la cadena ligera del primer fragmento Fab con la cadena pesada del segundo fragmento Fab (y viceversa). El presente modo de realización es en particular útil, cuando el primer y segundo fragmento Fab se unen a diferentes epítopos (y, por lo tanto, el anticuerpo multiespecífico es al menos triespecífico). Por el presente modo de realización, la formación de producto secundario y el emparejamiento incorrecto de la cadena ligera (es decir, el emparejamiento de una cadena ligera con la cadena pesada errónea que forma de este modo sitios de unión no funcionales) durante la expresión recombinante se puede reducir y el rendimiento de la expresión del anticuerpo se puede mejorar.

Por lo tanto, en un modo de realización preferente de un anticuerpo multiespecífico que incluye un entrecruzamiento de dominios en al menos uno de los fragmentos Fab, el anticuerpo multiespecífico es al menos triespecífico. En otro modo de realización preferente de un anticuerpo multiespecífico que incluye un entrecruzamiento de dominios en al menos uno de los fragmentos Fab, el anticuerpo multiespecífico es triespecífico. Aún en otro modo de realización preferente de un anticuerpo multiespecífico que incluye un entrecruzamiento de dominios en al menos uno de los fragmentos Fab, el anticuerpo multiespecífico es trivalente y triespecífico.

En un modo de realización de la invención, solo uno de los fragmentos Fab (es decir, el primer fragmento Fab o el segundo fragmento Fab pero no ambos fragmentos Fab) se altera por un entrecruzamiento de dominios de modo que solo los dominios CH1 y CL del fragmento Fab se reemplazan entre sí.

En un modo de realización de la invención, solo uno de los fragmentos Fab (es decir, el primer fragmento Fab o el segundo fragmento Fab pero no ambos fragmentos Fab) se altera por un entrecruzamiento de dominios de modo que solo los dominios VH y Vl del fragmento Fab se reemplazan entre sí.

Como los fragmentos Fab se usan como brazos de unión del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el anticuerpo presenta una estructura similar a IgG, sin embargo, comprende un sitio de unión adicional que reemplaza la interfase c H2/CH2 original.

Se pueden fusionar otros sitios de unión a los extremos N o extremos C de las cadenas pesadas o cadenas ligeras del anticuerpo multiespecífico para proporcionar anticuerpos de mayor valencia. En un modo de realización preferente, el anticuerpo multiespecífico es trivalente, asemejándose de este modo a la estructura tridimensional natural de una molécula de IgG.

Enlace a diferentes epítopos

En un modo de realización de la invención, el anticuerpo multiespecífico comprende al menos un sitio de unión poliepitópica (es decir, que se puede unir a dos epítopos diferentes en una molécula biológica o dos epítopos diferentes de diferentes moléculas biológicas, por ejemplo, como se divulga en el documento WO 2008/027236 A2). Por esto, se pueden generar anticuerpos multiespecíficos de más de tres especificidades (por ejemplo, anticuerpos tetraespecíficos) en una estructura y peso molecular similares a las moléculas de IgG natural. En un modo de realización de la invención, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, comprenden un sitio de unión poliepitópica. En otro modo de realización de la invención, el tercer sitio de unión comprende un sitio de unión poliepitópica. Aún en otro modo de realización, el primer y el segundo fragmento Fab y el tercer sitio de unión del anticuerpo multiespecífico comprenden un sitio de unión poliepitópica.

El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se puede unir a diferentes epítopos. Esto se puede lograr combinando sitios de unión que se unen específicamente a un único antígeno o, además, incluyendo sitios de unión que son poliepitópicos y, por lo tanto, se unen específicamente a más de un epítopo (en un modo de realización preferente, dicho sitio de unión poliepitópica se une a dos epítopos diferentes). De este modo, se pueden producir anticuerpos multiespecíficos trivalentes que se pueden unir a un gran número de epítopos diferentes. Como el primer y segundo sitios de unión a antígeno son respectivos fragmentos Fab, el anticuerpo multiespecífico mantiene de forma ventajosa una forma y peso molecular similares a IgG. Los anticuerpos multiespecíficos son en particular adecuados para unir diferentes epítopos en el mismo antígeno diana (por ejemplo, diferentes epítopos en la misma biomolécula) o diferentes biomoléculas en la misma célula.

En un modo de realización preferente, el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención incluye tres sitios de unión, uniéndose cada uno a un único epítopo. De este modo, el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización puede ser biespecífico o triespecífico.

En otro modo de realización preferente, el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención incluye al menos un sitio de unión poliepitópica (en un modo de realización preferente, dicho sitio de unión poliepitópica se une a dos epítopos diferentes). En un modo de realización, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo triespecífico, en el que los primer y segundo fragmentos Fab de antígeno incluyen dos sitios de unión poliepitópicos idénticos (que se unen específicamente cada uno a dos epítopos diferentes) y el tercer sitio de unión se une específicamente a otro (tercer) epítopo. En otro modo de realización, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo triespecífico, en el que los primer y segundo fragmentos Fab se unen específicamente a un primer epítopo y el tercer sitio de unión es un sitio de unión poliepitópica que se une específicamente a un segundo y un tercer epítopo. De este modo, el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización es al menos triespecífico. Cuando se combinan tres sitios de unión poliepitópicos diferentes que se unen cada uno a dos epítopos diferentes, en un modo de realización del anticuerpo multiespecífico, el anticuerpo puede ser hasta hexaespecífico.

En un modo de realización de la invención, el anticuerpo es biespecífico. En un modo de realización de la invención, el anticuerpo es trivalente y biespecífico. En un modo de realización de la invención, el anticuerpo es biespecífico y se une específicamente a dos antígenos diferentes en una célula o dos epítopos diferentes del mismo antígeno. En un modo de realización de la invención, el anticuerpo es trivalente y biespecífico, y se une específicamente a dos antígenos diferentes en una célula o dos epítopos diferentes del mismo antígeno.

En un modo de realización preferente de la invención, el anticuerpo es biespecífico, en el que el primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab se unen específicamente al mismo epítopo, y en el que el tercer sitio de unión se une específicamente a un epítopo diferente. En un modo de realización preferente de la invención, el anticuerpo es trivalente y biespecífico, en el que el primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab se unen específicamente al mismo epítopo, y en el que el tercer sitio de unión se une específicamente a un epítopo diferente.

Dentro de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con estos modos de realización que comprende un primer y segundo fragmento Fab, en un modo de realización, el primer y segundo fragmento Fab no comprenden un entrecruzamiento de dominios. Por lo tanto, en un modo de realización preferente, las cadenas ligeras del primer y segundo fragmento Fab se componen de dominios VL y CL (en sentido de N terminal a C terminal).

En otro modo de realización de la invención, el anticuerpo es biespecífico, en el que el primer fragmento Fab y el tercer sitio de unión se unen específicamente al mismo epítopo, y en el que el segundo fragmento Fab se une específicamente a un epítopo diferente. En otro modo de realización de la invención, el anticuerpo es trivalente y biespecífico, en el que el primer fragmento Fab y el tercer sitio de unión se unen específicamente al mismo epítopo, y en el que el segundo fragmento Fab se une específicamente a un epítopo diferente.

Dentro de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con estos modos de realización que comprende un primer y segundo fragmento Fab, al menos uno de los fragmentos Fab comprende un entrecruzamiento de dominios o bien se proporciona en forma de un fragmento Fab monocatenario. En un modo de realización preferente, al menos uno de los fragmentos Fab comprende un entrecruzamiento de dominios como se define anteriormente (incluyendo opcionalmente otros modos de realización de entrecruzamiento de dominios tales como introducción de aminoácidos cargados en al menos uno de los fragmentos Fab). De este modo, se evita el emparejamiento incorrecto de la cadena y se mejora el rendimiento de la expresión del anticuerpo multiespecífico.

En un modo de realización de la invención, el anticuerpo es triespecífico. En un modo de realización de la invención, el anticuerpo es trivalente y triespecífico.

En un modo de realización preferente de un anticuerpo triespecífico de acuerdo con la invención, cada sitio de unión se une a un único epítopo, en el que el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab y el tercer sitio de unión se unen específicamente a un epítopo diferente, respectivamente.

En otro modo de realización de un anticuerpo triespecífico de acuerdo con la invención, el primer y segundo fragmento Fab se unen al mismo epítopo y el tercer sitio de unión se une a dos epítopos diferentes (y por lo tanto es poliepitópico).

Aún en otro modo de realización de un anticuerpo triespecífico de acuerdo con la invención, el primer y segundo fragmento Fab se basan en los mismos sitios de unión poliepitópicos (uniéndose cada uno a dos epítopos diferentes), y el tercer sitio de unión se une a un único epítopo que es diferente de los epítopos unidos por el primer y segundo fragmento Fab.

En todos los modos de realización, en los que el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende un primer fragmento Fab y un segundo fragmento Fab, en el que dicho primer fragmento Fab y dicho segundo fragmento Fab se basan en diferentes sitios de unión y, por lo tanto, se unen específicamente a diferentes epítopos, los fragmentos Fab se diseñan específicamente para evitar el emparejamiento incorrecto de la cadena ligera entre las cadenas ligeras y las cadenas pesadas del primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab, respectivamente, usando fragmentos Fab monocatenarios (que se pueden estabilizar además con disulfuro) o bien usando estrategias de entrecruzamiento de dominios para lograr una arquitectura de dominio diferente en las cadenas ligeras del primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab, suprimiendo de este modo el emparejamiento incorrecto de la cadena ligera.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que el primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab se unen específicamente a diferentes epítopos, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, se alteran por un entrecruzamiento de dominios, de modo que:

a) solo los dominios CH1 y CL se reemplazan entre sí;

b) solo los dominios VH y VL se reemplazan entre sí; o bien

con la condición de que en caso de que ambos el primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab se alteren por entrecruzamiento de dominios, se alteren por diferentes entrecruzamientos de dominios.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que el primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab se unen específicamente a diferentes epítopos, solo uno de los fragmentos Fab (es decir, el primer fragmento Fab o el segundo fragmento Fab pero no ambos fragmentos Fab) se altera por un entrecruzamiento de dominios de modo que solo los dominios CH1 y CL del fragmento Fab se reemplazan entre sí.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que el primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab se unen específicamente a diferentes epítopos, solo uno de los fragmentos Fab (es decir, el primer fragmento Fab o el segundo fragmento Fab pero no ambos fragmentos Fab) se altera por un entrecruzamiento de dominios de modo que solo los dominios VH y VL del fragmento Fab se reemplazan entre sí.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que el primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab se unen a diferentes epítopos, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, son fragmentos Fab monocatenarios (scFab).

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que el primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab se unen a diferentes epítopos, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, son fragmentos Fab monocatenarios estabilizados con disulfuro (dsFab). En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que el primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab se unen a diferentes epítopos, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, son fragmentos Fab monocatenarios, que se estabilizan con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los correspondientes dominios VH y VL (numeración de acuerdo con Kabat):

- VH en la posición 44 y VL en la posición 100;

- VH en la posición 105 y VL en la posición 43; o

- VH en la posición 101 y VL en la posición 100.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que el primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab se unen a diferentes epítopos, el primer fragmento Fab, el segundo fragmento Fab o ambos, el primer y el segundo fragmento Fab, son fragmentos Fab monocatenarios, que se estabilizan con disulfuro, respectivamente, por introducción de residuos de cisteína en su dominio VH en la posición 44, y en su dominio VL en la posición 100. En un modo de realización preferente, exactamente uno de los fragmentos Fab (es decir, el primer fragmento Fab o bien el segundo fragmento Fab) es un fragmento Fab monocatenario, que se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en su dominio VH en la posición 44, y en su dominio VL en la posición 100.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que el primer fragmento Fab y el segundo fragmento Fab se unen a diferentes epítopos, el primer fragmento Fab es un fragmento Fab monocatenario (en un modo de realización, un fragmento Fab monocatenario estabilizado con disulfuro) y el segundo fragmento Fab comprende un entrecruzamiento de dominios como se define anteriormente.

Isotipos de anticuerpos

En un modo de realización de la invención, el anticuerpo multiespecífico comprende regiones constantes de inmunoglobulina de una o más clases de inmunoglobulina. Las clases de inmunoglobulina incluyen los isotipos IgG, IgM, IgA, IgD e IgE y, en el caso de IgG e IgA, sus subtipos. En un modo de realización de la invención, el anticuerpo multiespecífico tiene una estructura de dominio constante de un anticuerpo de tipo IgG.

En un modo de realización, los dominios constantes de un anticuerpo de acuerdo con la invención son de subclase IgG1 o IgG4 humana. En un modo de realización, el dominio CH3 se deriva de un anticuerpo IgG1 humano. En un modo de realización, el anticuerpo multiespecífico está desprovisto de un dominio CH4.

En un modo de realización de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En un modo de realización de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado. En un modo de realización de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano.

En un modo de realización de la invención, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo aislado.

En un modo de realización, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que incluye un dominio CH3 como se especifica en el presente documento, comprende un dipéptido de glicina-lisina C terminal adicional (G446 y K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que incluye un dominio CH3, como se especifica en el presente documento, comprende un residuo de glicina C terminal adicional (G446, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Complejo que incluye anticuerpo y agente acoplado a hapteno para suministro de carga dirigido

Otro objetivo de la invención es un complejo que comprende (i) un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que el anticuerpo se une específicamente al menos a un hapteno y una proteína diana (incluyendo de este modo al menos un sitio de unión que se une específicamente al hapteno y al menos un sitio de unión que se une específicamente a la proteína diana), y (ii) el hapteno, que está unido por el anticuerpo multiespecífico, en el que el hapteno se conjuga con un agente terapéutico o de diagnóstico. Dentro del complejo, el hapteno está unido al sitio de unión del anticuerpo, que se une específicamente al hapteno. De este modo, el hapteno conjugado con el agente terapéutico o de diagnóstico se acopla de forma no covalente al anticuerpo. Dentro del complejo, el anticuerpo mantiene su especificidad y afinidad de unión, mientras que el agente terapéutico o de diagnóstico acoplado al hapteno también mantiene su actividad. Los complejos de un anticuerpo biespecífico de unión a hapteno con agente terapéutico o de diagnóstico haptenilado en general son conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir del documento WO 2011/1003557 A1. Los complejos de acuerdo con la invención se pueden diseñar y aplicar como se describe en el documento WO 2011/1003557 A1, del que su contenido se incorpora por completo en el presente documento por referencia.

En un modo de realización, el anticuerpo presente en el complejo de acuerdo con la invención es biespecífico. En un modo de realización, el hapteno se selecciona de digoxigenina, biotina, teofilina, fluoresceína, DOTA y DOTAM. En un modo de realización, la proteína diana es un antígeno de la superficie celular o un antígeno intracelular. En un modo de realización, la proteína diana es un antígeno asociado a tumor intracelular o uno de la superficie celular. En un modo de realización, la proteína diana es un antígeno asociado a tumor de la superficie celular. En un modo de realización, la proteína diana es Lewis Y. En un modo de realización, la proteína diana es CD33. En un modo de realización, la proteína diana es glipicano 3.

En un modo de realización de la invención, dicho anticuerpo multiespecífico se usa como un vehículo de suministro de carga para el agente terapéutico o de diagnóstico. El agente terapéutico o de diagnóstico se conjuga con el hapteno y por tanto se acopla por el sitio de unión a hapteno del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención para formar el complejo de acuerdo con la invención. Este complejo está definido y es estable y suministra específicamente la carga a una célula o tejido diana. Dado que el agente terapéutico o de diagnóstico haptenilado se acopla de manera no covalente al anticuerpo multiespecífico, la carga se une de manera estable a su vehículo de suministro durante la circulación, pero también se libera eficazmente después de la internalización. La conjugación con el hapteno no afecta a la actividad de la mayoría de los agentes terapéuticos o de diagnóstico. Por tanto, el anticuerpo multiespecífico no contiene una carga acoplada covalentemente inusual y, por lo tanto, presenta un bajo riesgo de inmunogenicidad. Por lo tanto, este sencillo procedimiento de conjugación se puede usar para una gran variedad de moléculas de carga en combinación con solo un único anticuerpo multiespecífico; siendo las moléculas de carga, por ejemplo, péptidos, proteínas, moléculas pequeñas, reactivos de formación de imágenes y ácidos nucleicos. Los complejos de un agente de diagnóstico o terapéutico haptenilado con el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención que contienen al menos un sitio de unión de hapteno pueden conferir un comportamiento biofísico benigno y una mejora en los parámetros FC al agente de diagnóstico o terapéutico, por ejemplo, a proteínas, péptidos o moléculas pequeñas de diagnóstico o terapéuticos. Además, dichos complejos pueden dirigir la carga de suministro a las células que presentan el antígeno de proteína diana que se reconoce por el al menos un sitio de unión adicional del anticuerpo multiespecífico.

En un modo de realización, el agente terapéutico o de diagnóstico acoplado al hapteno se selecciona del grupo que consiste en un péptido, una proteína, una molécula pequeña, una molécula pequeña marcada radioactivamente, un ácido nucleico y un agente de formación de imágenes.

En un modo de realización, el agente terapéutico o de diagnóstico es un péptido. Tras la unión de un péptido haptenilado a un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el péptido mantiene su actividad biológica completa. Los ejemplos no limitantes de péptidos son melitina, Fam5B, INF7, FallV1 y FallV2. Un aspecto de la invención es el uso de los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención para el suministro de péptidos derivados de toxinas a células tumorales que expresan el antígeno diana.

En un modo de realización, el agente terapéutico o de diagnóstico es una proteína. Tras la unión de una proteína haptenilada a un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, la proteína mantiene su actividad biológica completa.

En un modo de realización, el agente terapéutico o de diagnóstico es una molécula pequeña. En un modo de realización, la molécula pequeña es una toxina o es una molécula pequeña derivada de una toxina. En un modo de realización, la molécula pequeña es la exotoxina Pseudomonas.

En un modo de realización, el agente terapéutico o de diagnóstico es una molécula pequeña marcada radioactivamente. El radioisótopo haptenilado o el radioisótopo unido a la molécula pequeña haptenilada presenta penetración tisular eficaz, aclaramiento rápido y se mantiene solo en células cubiertas por el complejo de acuerdo con la invención que expresa el antígeno de proteína diana. Esto permite la dirección específica y evita la liberación inespecífica sistémica de radioisótopos terapéuticos. Un aspecto de la invención es el uso de los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención para el suministro de un radioisótopo haptenilado o un radioisótopo unido a una molécula pequeña haptenilada a un tejido enfermo. En un modo de realización, dicho tejido enfermo es un tumor y la proteína diana es un antígeno asociado a tumor.

En un modo de realización, el agente terapéutico o de diagnóstico es un ácido nucleico. En un modo de realización, el ácido nucleico es ARN bicatenario (ARNds). Se ha demostrado que las moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) bloquean la expresión génica en un mecanismo regulador altamente conservado conocido como interferencia de ARN (ARNi). Por lo tanto, un aspecto de la invención es el de los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención para el tratamiento génico dirigido del suministro de ARNds dirigido.

En un modo de realización, el agente terapéutico o de diagnóstico es un agente de formación de imágenes. En un modo de realización, el agente de formación de imágenes es un fluoróforo. El agente de formación de imágenes mantiene sus propiedades a pesar de estar haptenilado y complejado con el anticuerpo de acuerdo con la invención. El agente de formación de imágenes haptenilado presenta penetración tisular eficaz, aclaramiento rápido y se mantiene solo en células cubiertas por el complejo de acuerdo con la invención que expresan el antígeno de proteína diana. Esto permite una formación de imágenes con resolución temporal eficaz y la evaluación de la vascularización tumoral o cambios dentro de la vascularización tumoral. Un aspecto de la invención es el uso de los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención para la formación de imágenes de un tejido enfermo. Otro aspecto de la invención es el uso de los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención de formación de imágenes in vitro, por ejemplo, para análisis FACS. En un modo de realización, dicho tejido enfermo es un tumor y la proteína diana es un antígeno asociado a tumor.

Otro aspecto es un procedimiento para la preparación de un complejo de acuerdo con la invención, incluyendo el procedimiento las etapas de

- proporcionar un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que el anticuerpo multiespecífico se une específicamente a un hapteno y una proteína diana,

- proporcionar un hapteno, que está unido específicamente por el anticuerpo multiespecífico, en el que el hapteno se conjuga con un agente terapéutico o de diagnóstico, y

- poner en contacto el anticuerpo multiespecífico con el hapteno, que se conjuga con el agente terapéutico o de diagnóstico.

Otro aspecto de la invención es el uso del complejo de acuerdo con la invención como medicamento. Otro aspecto de la invención es el uso del complejo de acuerdo con la invención para propósitos de diagnóstico.

Otro aspecto de la invención es el uso del complejo de acuerdo con la invención para el suministro de un agente terapéutico o de diagnóstico a una célula o tejido diana. Otro aspecto de la invención es el uso del complejo de acuerdo con la invención para tratamiento del cáncer dirigido. Otro aspecto de la invención es el uso del complejo de acuerdo con la invención para radioterapia dirigida.

Otro aspecto de la invención es el uso del complejo de acuerdo con la invención para la formación de imágenes de células o tejidos.

Otro aspecto de la invención es una composición que comprende un complejo de acuerdo con la invención que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, que se une específicamente a un hapteno y una proteína diana, y un hapteno que se conjuga con un agente terapéutico o de diagnóstico. En un modo de realización, dicha composición es una composición de diagnóstico. En otro modo de realización, la composición es una composición farmacéutica. II. Procedimiento recombinante

El anticuerpo multiespecífico se prepara por procedimientos recombinantes. Por tanto, la invención también se refiere a un procedimiento para la preparación de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, que comprende las etapas de

En un modo de realización de la invención, el procedimiento incluye la etapa de purificación del anticuerpo multiespecífico por medio de cromatografía de afinidad. En un modo de realización de la invención, el procedimiento incluye la etapa de purificación del anticuerpo multiespecífico por medio de cromatografía de afinidad en una columna específica de cadena ligera kappa o cadena ligera lambda.

Otro objetivo de la invención es un anticuerpo multiespecífico producido por un procedimiento de acuerdo con la invención. Otro objetivo de la invención es un ácido nucleico que codifica el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención. En un modo de realización, el ácido nucleico de acuerdo con la invención es un ácido nucleico aislado.

Otro objetivo de la invención es un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Otro objetivo de la invención es un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención, en el que el vector de expresión puede expresar dicho ácido nucleico en una célula huésped.

Otro objetivo de la invención es una célula huésped que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Otro objetivo de la invención es una célula huésped que comprende un vector de expresión de acuerdo con la invención. En un modo de realización, la célula huésped es una célula HEK293 o una célula CHO.

III. Composición farmacéutica

Otro objetivo de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención. Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un modo de realización, una composición (en un modo de realización preferente, una composición farmacéutica) que comprende una población de anticuerpos de la invención comprende un anticuerpo que comprende una cadena pesada que incluye un dominio CH3, como se especifica en el presente documento, con un dipéptido de glicina-lisina C terminal adicional (G446 y K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, una composición que comprende una población de anticuerpos de la invención comprende un anticuerpo que comprende una cadena pesada que incluye un dominio CH3, como se especifica en el presente documento, con un residuo de glicina C terminal adicional (G446, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización, una composición de este tipo comprende una población de anticuerpos compuesta de anticuerpos que comprenden una cadena pesada que incluye un dominio CH3, como se especifica en el presente documento; anticuerpos que comprenden una cadena pesada que incluye un dominio CH3, como se especifica en el presente documento, con un residuo de glicina C terminal adicional (G446, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat); y anticuerpos que comprenden una cadena pesada que incluye un dominio CH3, como se especifica en el presente documento, con un dipéptido de glicina-lisina C terminal adicional (G446 y K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Otro objetivo de la invención es una composición farmacéutica que comprende un complejo de acuerdo con la invención que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, que se une específicamente a un hapteno y una proteína diana, y un hapteno que se conjuga con un agente terapéutico o de diagnóstico. Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un complejo de acuerdo con la invención que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, que se une específicamente a un hapteno y una proteína diana, y un hapteno que se conjuga con un agente terapéutico o de diagnóstico en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro objetivo de la invención es un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención acoplado a un agente citotóxico.

Otro objetivo de la invención es una composición farmacéutica que comprende un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención acoplado a un agente citotóxico. Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención acoplado a un agente citotóxico en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro objetivo de la invención es el uso de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención para la fabricación de una composición farmacéutica. Otro objetivo de la invención es un procedimiento para la fabricación de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, incluyendo formular el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro objetivo de la invención es el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención para su uso como medicamento. Otro objetivo de la invención es el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento del cáncer. Otro objetivo de la invención es el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, artritis reumatoide, artritis psoriásica, enfermedades musculares (por ejemplo, distrofia muscular), esclerosis múltiple, nefropatías crónicas, enfermedades óseas (por ejemplo, degeneración ósea en mieloma múltiple), lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica y/o lesión vascular.

Otro objetivo de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso como medicamento. Otro objetivo de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento del cáncer. Otro objetivo de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, artritis reumatoide, artritis psoriásica, enfermedades musculares (por ejemplo, distrofia muscular), esclerosis múltiple, nefropatías crónicas, enfermedades óseas (por ejemplo, degeneración ósea en mieloma múltiple), lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica y/o lesión vascular.

Otro objetivo de la invención es un complejo de acuerdo con la invención que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, que se une específicamente a un hapteno y una proteína diana, y un hapteno que se conjuga con un agente terapéutico o de diagnóstico para su uso como medicamento. Otro objetivo de la invención es un complejo de acuerdo con la invención que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, que se une específicamente a un hapteno y una proteína diana, y un hapteno que se conjuga con un agente terapéutico o de diagnóstico para su uso en el tratamiento del cáncer. Otro objetivo de la invención es un complejo de acuerdo con la invención que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, que se une específicamente a un hapteno y una proteína diana, y un hapteno que se conjuga con un agente terapéutico o de diagnóstico para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, artritis reumatoide, artritis psoriásica, enfermedades musculares (por ejemplo, distrofia muscular), esclerosis múltiple, nefropatías crónicas, enfermedades óseas (por ejemplo, degeneración ósea en mieloma múltiple), lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica y/o lesión vascular.

Otro objetivo de la invención es un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención acoplado a un agente citotóxico para su uso como medicamento. Otro objetivo de la invención es un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención acoplado a un agente citotóxico para su uso en el tratamiento del cáncer. Otro objetivo de la invención es un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención acoplado a un agente citotóxico para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, artritis reumatoide, artritis psoriásica, enfermedades musculares (por ejemplo, distrofia muscular), esclerosis múltiple, nefropatías crónicas, enfermedades óseas (por ejemplo, degeneración ósea en mieloma múltiple), lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica y/o lesión vascular.

Otro objetivo de la invención es el uso de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento. Otro objetivo de la invención es el uso de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Otro objetivo de la invención es el uso de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, artritis reumatoide, artritis psoriásica, enfermedades musculares (por ejemplo, distrofia muscular), esclerosis múltiple, nefropatías crónicas, enfermedades óseas (por ejemplo, degeneración ósea en mieloma múltiple), lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica y/o lesión vascular.

3. Modos de realización específicos de la invención

A continuación, se enumeran modos de realización específicos de la invención.

1. Un anticuerpo multiespecífico que comprende al menos tres sitios de unión a antígeno, en el que dos sitios de unión a antígeno se forman por un primer fragmento Fab y un segundo fragmento Fab, en el que

a) un tercer sitio de unión a antígeno se forma por un dominio variable de la cadena pesada (VH³) y un dominio variable de la cadena ligera (VL³), en el que

- el extremo N del dominio VH³se conecta al extremo C del dominio constante de la cadena pesada (CH1) o del dominio constante de la cadena ligera (CL) del primer fragmento Fab por medio de un primer conector peptídico, y

- el extremo N del dominio VL³se conecta al extremo C del dominio constante de la cadena pesada (CH1) o del dominio constante de la cadena ligera (CL) del segundo fragmento Fab por medio de un segundo conector peptídico,

iii) ambas modificaciones de i) y ii);

c) el extremo C del dominio VH³del tercer sitio de unión a antígeno se conecta a uno de los dominios CH3, y el extremo C del dominio VL³del tercer sitio de unión a antígeno se conecta al otro de los dominios CH3, y

2. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 1, en el que el anticuerpo multiespecífico comprende dos dominios constantes de la cadena pesada 3 (CH3), que se alteran para promover la heterodimerización por generación de una protuberancia en uno de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original, y generación de una cavidad en el otro de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, de modo que la protuberancia generada en uno de los dominios CH3 es posicionable en la cavidad generada en el otro de los dominios CH3.

3. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 2, en el que dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W.

4. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 2 o 3, en el que dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V.

5. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 2 a 4, en el que el dominio CH3 de una cadena pesada comprende una mutación T366W, y el dominio CH3 de la otra cadena pesada (la cadena pesada que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A y 407V (numeraciones de acuerdo con el índice e U de Kabat).

6. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 2 a 5, en el que el dominio CH3 de una cadena pesada comprende las mutaciones T366W y G407Y, y el dominio CH3 de la otra cadena pesada comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

7. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 1, en el que el anticuerpo multiespecífico comprende dos dominios constantes de la cadena pesada 3 (CH3), que se alteran para promover la heterodimerización sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en uno de los dominios CH3 con un aminoácido cargado positivamente, y sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en el otro de los dominios CH3 con un aminoácido cargado negativamente.

8. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 2 a 6, en el que el anticuerpo multiespecífico comprende dos dominios constantes de la cadena pesada 3 (CH3), que se alteran para promover la heterodimerización sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en uno de los dominios CH3 con un aminoácido cargado positivamente, y sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en el otro de los dominios CH3 con un aminoácido cargado negativamente.

9. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 7 u 8, en el que dicho aminoácido cargado positivamente se selecciona de K, R y H.

10. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 7 a 9, en el que dicho aminoácido cargado negativamente se selecciona de E o D.

11. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 7 a 10, en el que en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido R en la posición 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D y el aminoácido K en la posición 370 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con E; y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido D en la posición 399 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K y el aminoácido E en la posición 357 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K.

12. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 2, en el que el anticuerpo multiespecífico comprende dos dominios constantes de la cadena pesada 3 (CH3), que se alteran para promover la heterodimerización por introducción de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3.

13. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 3 a 6, en el que el anticuerpo multiespecífico comprende dos dominios constantes de la cadena pesada 3 (CH3), que se alteran para promover la heterodimerización por introducción de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3.

14. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 7, en el que el anticuerpo multiespecífico comprende dos dominios constantes de la cadena pesada 3 (CH3), que se alteran para promover la heterodimerización por introducción de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3.

15. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 8, en el que el anticuerpo multiespecífico comprende dos dominios constantes de la cadena pesada 3 (CH3), que se alteran para promover la heterodimerización por introducción de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3.

16. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 9 o 10, en el que el anticuerpo multiespecífico comprende dos dominios constantes de la cadena pesada 3 (CH3), que se alteran para promover la heterodimerización por introducción de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3.

17. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 12 a 16, en el que los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

18. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 12 a 16, en el que los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación S354C en uno de los dominios CH3 y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

19. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 1, en el que el tercer sitio de unión se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH³y VL³(numeración de acuerdo con Kabat):

- VH³en la posición 44, y VL³en la posición 100;

- VH³en la posición 105, y VL³en la posición 43; o

- VH³en la posición 101, y VL³en la posición 100.

20. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 2, en el que el tercer sitio de unión se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH³y VL³(numeración de acuerdo con Kabat):

- VH³en la posición 44, y VL³en la posición 100;

- VH³en la posición 105, y VL³en la posición 43; o

- VH³en la posición 101, y VL³en la posición 100.

21. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 7 u 8, en el que el tercer sitio de unión se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH³y VL³(numeración de acuerdo con Kabat):

- VH³en la posición 44, y VL³en la posición 100;

- VH³en la posición 105, y VL³en la posición 43; o

- VH³en la posición 101, y VL³en la posición 100.

22. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el tercer sitio de unión se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH³y VL³(numeración de acuerdo con Kabat):

- VH³en la posición 44, y VL³en la posición 100;

- VH³en la posición 105, y VL³en la posición 43; o

- VH³en la posición 101, y VL³en la posición 100.

23. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 19 a 22, en el que el tercer sitio de unión se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH³en la posición 44, y en el dominio VL³en la posición 100.

24. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que no se forma un enlace disulfuro intercatenario entre el primer y el segundo conector peptídico.

25. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que los primer y segundo conectores peptídicos son idénticos entre sí.

26. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el primer y segundo conector peptídico son péptidos de al menos 15 aminoácidos.

27. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el primer y segundo conector peptídico son péptidos de 15 - 70 aminoácidos.

28. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 25, en el que el primer y segundo conector peptídico son péptidos de 10 - 20 aminoácidos.

29. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 27, en el que el primer y segundo conector peptídico son péptidos de 55 - 70 aminoácidos.

30. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que los conectores peptídicos son enlazadores de glicina-serina.

31. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 30, en el que los enlazadores de glicina-serina son de la estructura

(GxS)n o (GxS)nGm

con G = glicina, S = serina, x = 3 o 4, n = 2, 3, 4, 5 o 6, y m = 0, 1,2 o 3.

32. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que los dominios variables VH³y VL³se conectan directamente a los respectivos dominios CH3 sin la ayuda de un conector peptídico.

33. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el extremo C del dominio VH³se conecta directamente a uno de los dominios CH3, y el extremo C del dominio VL³se conecta directamente al otro de los dominios CH3, en los que los sitios de conexión están desprovistos de un péptido enlazador adicional.

34. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el extremo N del dominio CH3 se modifica sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original.

35. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 34, en el que se sustituye al menos un residuo aminoacídico situado en las posiciones 341 a 350 de los dominios CH3 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

36. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 34 o 35, en el que el extremo N del dominio CH3 consiste en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

37. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el extremo C del dominio VH³se modifica sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original.

38. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el extremo C del dominio VL³se modifica sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original.

39. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el extremo N de cada uno de los dominios CH3 incluye al menos una mutación aminoacídica, el extremo C del dominio VH³incluye al menos una mutación aminoacídica y el extremo C del dominio VL³incluye al menos una mutación aminoacídica.

40. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el dominio constante de la cadena ligera del primer y/o el segundo fragmento Fab es de isotipo kappa.

41. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el dominio constante de la cadena ligera del primer y/o el segundo fragmento Fab es de isotipo lambda.

42. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el dominio constante de la cadena ligera del primer fragmento Fab es de isotipo kappa y el dominio constante de la cadena ligera del segundo fragmento Fab es de isotipo lambda.

43. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que al menos un fragmento Fab se estabiliza con disulfuro.

44. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que los fragmentos Fab se estabilizan con disulfuro.

45. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que los fragmentos Fab se estabilizan con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los correspondientes dominios VH y VL (numeración de acuerdo con Kabat):

- VH en la posición 44 y VL en la posición 100;

- VH en la posición 105 y VL en la posición 43; o

- VH en la posición 101 y VL en la posición 100.

46. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 43 a 45, en el que el enlace disulfuro natural entre las cadenas polipeptídicas del respectivo fragmento Fab se anula sustituyendo al menos uno de los residuos de cisteína que forman el enlace disulfuro intercatenario con otro residuo aminoacídico.

47. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que al menos un fragmento Fab es un fragmento Fab monocatenario.

48. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que al menos un fragmento Fab se altera por un entrecruzamiento de dominios, de modo que:

a) solo los dominios CH1 y CL se reemplazan entre sí;

b) solo los dominios VH y VL se reemplazan entre sí; o bien

49. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el anticuerpo es trivalente.

50. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el anticuerpo comprende al menos un sitio de unión poliepitópica.

51. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el anticuerpo es trivalente.

52. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el anticuerpo comprende tres sitios de unión, uniéndose cada uno a un único epítopo.

53. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el anticuerpo es biespecífico o triespecífico.

54. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el anticuerpo comprende al menos un sitio de unión que se une específicamente a un hapteno.

55. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el anticuerpo comprende exactamente un sitio de unión que se une específicamente a un hapteno.

56. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el anticuerpo comprende al menos un sitio de unión que se une específicamente a una proteína diana.

57. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 61, en el que la proteína diana es un antígeno asociado a tumor intracelular o uno de la superficie celular.

58. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización precedentes, en el que el anticuerpo comprende al menos un sitio de unión que se une específicamente a un hapteno y al menos un sitio de unión que se une específicamente a una proteína diana.

59. Un complejo que comprende

(i) el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 58, en el que el anticuerpo multiespecífico se une específicamente a un hapteno y una proteína diana, y

(ii) el hapteno, que está unido específicamente por el anticuerpo multiespecífico, en el que el hapteno se conjuga con un agente terapéutico o de diagnóstico.

60. El complejo de acuerdo con el modo de realización 59, en el que el hapteno se selecciona de digoxigenina, biotina, teofilina, fluoresceína, DOTA y DOTAM.

61. El complejo de acuerdo con el modo de realización 59 o 60, en el que la proteína diana es un antígeno de la superficie celular o un antígeno intracelular.

62. El complejo de acuerdo con el modo de realización 61, en el que la proteína diana es un antígeno asociado a tumor intracelular o uno de la superficie celular.

63. El complejo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 59 a 62, en el que el agente terapéutico o de diagnóstico acoplado al hapteno se selecciona del grupo que consiste en un péptido, una proteína, una molécula pequeña, una molécula pequeña marcada radioactivamente, un ácido nucleico y un agente de formación de imágenes.

64. Un procedimiento para la preparación del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 58, que comprende las etapas de

65. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 64, que incluye además la etapa de purificación del anticuerpo multiespecífico por medio de cromatografía de afinidad en una columna específica de cadena ligera kappa o cadena ligera lambda.

66. Un anticuerpo multiespecífico producido por el procedimiento de acuerdo con el modo de realización 64 o 65.

67. Un procedimiento para la preparación de un complejo, incluyendo las etapas de

- proporcionar un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con los modos de realización 58, en el que el anticuerpo multiespecífico se une específicamente a un hapteno y una proteína diana,

68. Un complejo producido por el procedimiento de acuerdo con el modo de realización 67.

69. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 58.

70. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con el modo de realización 68.

71. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico de acuerdo con el modo de realización 69.

72. Una célula huésped que comprende un vector de expresión de acuerdo con el modo de realización 70.

73. Una composición que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 58.

74. Una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 58.

75. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 58 en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

76. Una composición que comprende el complejo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 59 a 63.

77. Una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende el complejo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 59 a 63.

78. Una composición farmacéutica que comprende el complejo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 59 a 63 en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

79. Una composición de diagnóstico que comprende el complejo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 59 a 63.

80. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 58 acoplado a un agente citotóxico.

81. El inmunoconjugado de acuerdo con el modo de realización 80, en el que el anticuerpo multiespecífico se une específicamente a un antígeno asociado a tumor de la superficie celular o un antígeno asociado a tumor intracelular. 82. Una composición que comprende el inmunoconjugado de acuerdo con el modo de realización 80 u 81.

83. Una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende el inmunoconjugado de acuerdo con el modo de realización 80 u 81.

84. Una composición farmacéutica que comprende el inmunoconjugado de acuerdo con el modo de realización 80 u 81 en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

85. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 57, o un complejo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 59 a 63, o un inmunoconjugado de acuerdo con el modo de realización 81, en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable

86. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 58 para su uso como medicamento.

87. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 57 para su uso como medicamento.

88. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el modo de realización 57 para su uso como en el tratamiento del cáncer.

89. El complejo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 59 a 63 para su uso como medicamento. 90. El complejo de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 59 a 63 para su uso en el tratamiento del cáncer.

91. El inmunoconjugado de acuerdo con el modo de realización 80 u 81 para su uso como medicamento.

92. El inmunoconjugado de acuerdo con el modo de realización 81 para su uso como medicamento.

93. El inmunoconjugado de acuerdo con el modo de realización 80 u 81 para el tratamiento del cáncer.

94. Uso del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con uno cualquiera de los modos de realización 1 a 58 para propósitos de diagnóstico.

95. Uso de acuerdo con el modo de realización 94 para formación de imágenes.

DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ayudar a entender la presente invención, el verdadero alcance de ésta se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1:

Producción y expresión de anticuerpos biespecíficos trivalentes de acuerdo con la invención que se unen específicamente a digoxigenina (Dig) y uno de los antígenos de la superficie celular Lewis-Y (LeY), CD33 y glipicano3 (GPC3)

Se diseñaron anticuerpos biespecíficos que comprenden tres sitios de unión a antígeno en una estructura similar a IgG que se compone de dos brazos Fab regulares como primer y segundo restos de unión, que se fusionaron por medio de enlazadores peptídicos de glicina-serina flexibles a un tercer módulo de unión de tamaño Fab aproximadamente. Este tercer módulo de unión reemplaza la región Fc de IgG original de un anticuerpo de longitud completa y se compone de un dominio variable de la cadena pesada VH³fusionado a un primer dominio c H3, y un dominio variable de la cadena ligera VL³fusionado a un segundo dominio CH3 (fig. 2A). La arquitectura de dominio de los anticuerpos biespecíficos se indica en las figuras 2A y 2B (que ilustran anticuerpos con y sin un enlace disulfuro adicional presente dentro del tercer sitio de unión).

Las secuencias de aminoácidos del tercer módulo de unión, en particular el sitio de fusión de los dominios CH3 con VH ³o bien VL³, se diseñaron de manera que no posee tensión ni perturbación estérica en la estructura similar a IgG global, y mantiene propiedades similares a IgG.

Los fragmentos Fab se fusionan al tercer módulo de unión por medio de conectores peptídicos que se diseñan para reemplazar la región bisagra original de una IgG de longitud completa (fig. 4). Los conectores peptídicos no contienen puentes disulfuro intercatenarios, lo que facilita el acceso de antígeno al tercer sitio de unión. Sin embargo, la pérdida de puentes disulfuro de bisagra también desestabiliza el derivado de anticuerpo ya que retira la conexión intercatenaria covalente. Para compensar la pérdida de disulfuros de bisagra y recuperar estabilidad, se aplicaron estrategias de heterodimerización para promover la heterodimerización de los dominios del tercer módulo de unión (véase la fig. 2A).

Las moléculas de anticuerpos biespecíficos generados en este ejemplo comprenden dominios CH3 estabilizados con disulfuro con una modificación de "botón" (protuberancia) o bien de "ojal" (cavidad) (fig. 2A y 2B). Dentro de estos ejemplos, se proporcionaron anticuerpos con y sin estabilización con disulfuro en los dominios VH³y VL³(véase la tabla 2).

Los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la tabla 1 se generaron por técnicas de biología molecular clásicas y se expresaron de forma transitoria en células en suspensión HEK293.

En resumen, los anticuerpos se produjeron por cotransfección de vectores de expresión que codifican las cadenas ligeras de los anticuerpos deseados con vectores de expresión que codifican las dos correspondientes "cadenas pesadas" (es decir, los polipéptidos de las estructuras de dominio VH-CH1-enlazador-VH3-CH3 y VH-CH1-enlazador-VL3-CH3, respectivamente). Los casetes de expresión, propiedades de plásmido y las condiciones para la expresión transitoria fueron los mismos como se describe por Metz et al. Protein Engineering Design and Selection 09/2012; 25(10):571-8 y en el documento WO 2012025525 A1, ambos documentos se incluyen en el presente documento por referencia. Los componentes polipeptídicos de los anticuerpos se expresaron por transcripción controlada por promotor CMV en células en suspensión HEK293 que se cultivaron a 37 °C en un entorno de CO²al 8 % humidificado. 7 días después de la transfección, se filtraron de forma estéril los sobrenadantes de cultivo que contenían los anticuerpos biespecíficos secretados.

T a b la 1: A rq u ite c tu ra d e d o m in io d e los a n tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s in d icad o s

Los anticuerpos biespecíficos incluyeron las características indicadas en la tabla 2. Todas las construcciones comprendieron dominios constantes de la cadena ligera de isotipo kappa. Además, en todas las construcciones, las sustituciones de "botones" se introdujeron en el dominio CH3 fusionado a VH³y las sustituciones de "ojales" se introdujeron en el dominio CH3 fusionado a VL³. Sin embargo, con el mismo efecto, el "botón" se puede introducir en el dominio CH3 fusionado a VL³y el "ojal" se puede introducir en el dominio CH3 fusionado a VH³.

T a b la 2: C a ra c te r ís tic a s d e los a n tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s in d icad o s

Las secuencias de aminoácidos de las cadenas polipeptídicas de los anticuerpos biespecíficos sometidos a prueba se indican en la tabla 3.

Tabla 3: Secuencias de aminoácidos de cadenas polipeptídicas de anticuerpos biespecíficos indicados

Ejemplo 2:

Purificación y caracterización de anticuerpos biespecíficos trivalentes de acuerdo con la invención

Los anticuerpos biespecíficos expresados anteriormente en el ejemplo 1 se purificaron del sobrenadante por cromatografía de afinidad por medio de una columna HiTrap KappaSelect (GE Healthcare), ya que debido a la falta de dominios CH2 los anticuerpos biespecíficos no se unen a la proteína A. En una segunda etapa de purificación, se obtuvieron anticuerpos biespecíficos homogéneos aplicando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, Superdex200 HiLoad 26/60, GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, NaCl 140 mM, a pH 6,0 en un Aekta Avant (GE Healthcare) como se describe previamente para anticuerpos biespecíficos derivados de IgG (S. Metz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (2011) 8194-8199).

Los resultados ejemplares de estas etapas de purificación para anticuerpos biespecíficos con diferentes especificidades como se indica en la tabla 1 se muestran en la fig. 6. Los análisis de SDS PAGE que demuestran la identidad y pureza de los anticuerpos multiespecíficos generados también se muestran en la fig. 6.

Los anticuerpos biespecíficos se pudieron generar por el procedimiento de producción y purificación descrito con rendimientos de entre 3-20 mg/l, como se indica en detalle en la tabla 4.

Tabla 4: Rendimiento de los anticuerpos biespecíficos indicados

Ejemplo 3:

Diseño del patrón de disulfuro de complejo para promover la heterodimerización

Dentro de los anticuerpos biespecíficos generados en el ejemplo 1, la heterodimerización del tercer módulo de unión se promueve por cuatro interacciones distintas: (i) la interacción entre VH³y VL³, (ii) la estabilización con disulfuro en la interfase VH³/VL³, (iii) la estabilización con disulfuro en la interfase CH3/CH3; y (iv) las modificaciones de botones en ojales en la interfase CH3/CH3 (que se pueden reemplazar de forma alternativa por otras estrategias de heterodimerización comparables conocidas por soportar la interacción de dominios CH3, como por ejemplo, la introducción de aminoácidos con carga opuesta dentro de la interfase CH3/CH3). Por esto, se promueve la formación de heterodímeros en lugar de la formación de homodímeros.

Como las estabilizaciones de disulfuro del VH³/VL³así como de la interfase CH3/CH3 requirieron la introducción de disulfuros adicionales en estrecha proximidad, fue necesario evitar la formación de disulfuros con emparejamiento incorrecto durante el procedimiento de producción dando lugar a moléculas mal plegadas y no funcionales (fig. 5A). Como es bien conocido, la IgG de longitud completa natural posee un enlace disulfuro intracatenario dentro de cada uno de sus dominios, así como enlaces disulfuro intercatenarios para conectar las cadenas pesadas por medio de las regiones bisagra del anticuerpo. Las cisteínas de la región bisagra no interfieren con el plegamiento de los dominios de anticuerpo individuales y no interactúan en la formación de disulfuro intradominio.

Sin embargo, dentro de los anticuerpos de acuerdo con la invención que comprenden estabilizaciones con disulfuro dentro de la interfase VH³/VL³, así como en la interfase CH3/CH3, se introducen cisteínas adicionales no emparejadas, que para garantizar el plegamiento correcto no se deben emparejar con cisteínas que forman enlaces disulfuro intracatenarios sino que en su lugar deben formar enlaces interdominios separados definidos. Dentro de los anticuerpos de acuerdo con la invención, los dominios variables se conectan directamente a sus respectivos dominios CH3 (es decir, por la formación de enlaces peptídicos entre aminoácidos de un dominio variable con un aminoácido de un dominio CH3, sin incluir un enlazador peptídico). Se esperaba que una composición de secuencia de este tipo y la estrecha proximidad de residuos de cisteína (incluyendo los residuos de cisteína naturales y los introducidos adicionalmente) favorecería en gran medida la formación de disulfuros con emparejamiento incorrecto (fig. 5A).

Por lo tanto, se creó un sitio de fusión entre los dominios variables (VH³y VL³) y sus respectivos dominios CH3 (fig. 5B, C), lo que permite la correcta formación del enlace disulfuro y evita el emparejamiento incorrecto del disulfuro. En cada cadena polipeptídica del tercer módulo de unión, los residuos de cisteína necesarios para la estabilización de disulfuro adicional están en estrecha proximidad a los residuos de cisteína requeridos para la formación de enlaces disulfuros intracatenarios, pero sorprendentemente no obstante no interfieren con los disulfuros intracatenarios y se emparejan con el correspondiente residuo de cisteína correcto en la otra cadena polipeptídica.

Las fig. 5B y C representan sitios de fusión que incluyen un patrón de cisteína de complejo de este tipo en el tercer módulo de unión, lo que permite el plegamiento de proteína correcto.

Otro objetivo del diseño del sitio de fusión entre los dominios variables y los dominios CH3 fue imitar estrechamente los sitios de transición naturales presentes en el anticuerpo original entre (i) los dominios VH y CH1, así como los dominios CH2 y CH3 para el sitio de fusión entre VH³y CH3; y (ii) los dominios VL y CL así como los dominios CH2 y CH3 para el sitio de fusión entre VL³y CH3. Por lo tanto, los residuos aminoacídicos distintos en el extremo C de los dominios variables y el extremo N de los dominios CH3 se pueden sustituir con otro residuo aminoacídico para proporcionar un sitio de fusión de una estructura terciaria de una homología distinta al sitio de transición natural entre regiones variables y constantes. Las secuencias de aminoácidos alternativas ejemplares del extremo N de los dominios CH3 se indican en la fig. 5B.

Ejemplo 4:

Estudios de unión de anticuerpos biespecíficos trivalentes de acuerdo con la invención

La unión a antígeno simultánea de los anticuerpos generados en el ejemplo 1 se analizó por análisis FACS en células MCF7 que expresan LeY, células Molm13 que expresan CD33 y células HepG2 que expresan GPC3 usando Dig-Cy5 como carga para abordar la unión a hapteno. Los resultados se muestran en la fig. 7.

Se observó unión a hapteno y unión a la superficie celular simultáneas para todos los anticuerpos biespecíficos con el sitio de unión específica a Dig en el tercer módulo de unión y los sitios de unión a antígeno específicos para el respectivo marcador de superficie celular dentro de los fragmentos Fab. También se observó unión a hapteno y unión a la superficie celular simultáneas para los anticuerpos con los sitios de unión específica a Dig en los fragmentos Fab y los sitios de unión a antígeno específicos para el respectivo marcador de superficie celular en el tercer módulo de unión.

Los datos indican que el tercer sitio de unión es fácilmente accesible para antígenos pequeños, por ejemplo, haptenos (como digoxigenina). El tercer sitio de unión también es accesible para unir antígenos más grandes tales como proteínas, por ejemplo, proteínas de la superficie celular. Para esos antígenos, la eficacia de unión puede depender de la accesibilidad del epítopo y el impedimento estérico potencial. Como se demostró, los antígenos de la superficie celular CD33, GPC3 o LeY son accesibles al tercer sitio de unión de un anticuerpo de acuerdo con la invención.

Debido a estas características, los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden aplicar para abordar o reticular simultáneamente dos dianas, por ejemplo, para formación de imágenes o para suministro de carga dirigido.

Ejemplo 5:

Aplicación de anticuerpos biespecíficos trivalentes de acuerdo con la invención para suministro de carga dirigido

Los anticuerpos de acuerdo con la invención (BsAb LeY-Dig(SS)-LeY) proporcionados en el ejemplo 1 y 2 se complejaron con un derivado de exotoxina de Pseudomonas (PE) truncada digoxigenilada como carga tóxica. Una ilustración esquemática de dicho complejo se indica en la fig. 9. Para evaluar si los complejos que incluyen los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden dirigir a células cancerosas induciendo de este modo la muerte celular, se pusieron en contacto células de una línea celular de cáncer de mama MCF7 que expresa LeY in vitro con los complejos. Se evaluó la inducción de la muerte celular por un ensayo BrdU comercial (ELISA de proliferación celular, BrdU (quimioluminiscencia), n.° cat.

11 669915001, Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los siguientes controles se analizaron en paralelo:

- estaurosporina (control positivo),

- sin aditivos (medio solo, control negativo)

- PE libre,

- PE digoxigenilada libre (PE-Dig),

- anticuerpo libre BsAb LeY-Dig(SS)-LeY que no se complejó con PE-Dig,

- anticuerpo libre BsAb GPC3-Dig(SS)-GPC3 (que no se une a células de cáncer de mama MCF7),

- complejo de BsAb CD33-Dig(SS)-CD33 (proporcionado en los ejemplos 1 y 2) con PE digoxigenilada (control negativo para evaluar la actividad inespecífica de un complejo que incluye un anticuerpo de acuerdo con la invención y una toxina como CD33 no se une a células de cáncer de mama MCF7; demostrado en la fig. 7).

El siguiente ejemplo comparativo se analizó en paralelo:

Como los complejos de anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a digoxigenina y un antígeno diana con moléculas pequeñas acopladas a digoxigenina son conocidos en la técnica (divulgados en el documento WO 2011/1003557 A1, arquitectura de dominio como se indica en la fig. 17a), se usó dicho complejo de anticuerpo como ejemplo comparativo. En resumen, el anticuerpo biespecífico estaba compuesto de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a LeY con un fragmento Fv que se une específicamente a Dig fusionada al extremo C de cada cadena pesada (denominado "BsAb LeY-Dig(2+2)"). Los dominios variables de este anticuerpo fueron los mismos que el anticuerpo BsAb LeY-Dig(SS)-LeY de acuerdo con la invención.

Los resultados (fig. 10) demuestran que solo el complejo del anticuerpo BsAb LeY-Dig(SS)-LeY de acuerdo con la invención y la PE digoxigenilada se pueden dirigir eficazmente a células de cáncer de mama MCF7 en concentraciones nanomolares bajas, lo que indica la dirección específica a las células cancerosas. Por el contrario, los complejos que abordan el antígeno c D33 que no está presente en células de cáncer de mama MCF7 apenas muestran toxicidad. Además, la toxina sin dirigir a vehículos o anticuerpos de control sin una carga tóxica no mostró actividad notable. E je m p lo 6:

P ro d u c c ió n y a n á lis is d e a n tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s triv a le n te s d e a c u e rd o co n la in v en c ió n q u e s e unen e s p e c ífic a m e n te a b io tin a (B io ) y uno d e los an tíg e n o s d e la s u p e rfic ie c e lu la r L e w is -Y (L eY ), C D 33 y g lip ic a n o 3 (G P C 3)

Los anticuerpos biespecíficos que comprenden tres sitios de unión a antígeno con la misma arquitectura de dominio que se une específicamente a biotina y LeY, o biotina y CD33, o biotina y GPC3 se diseñaron como se describe para los anticuerpos de acuerdo con el ejemplo 1.

La arquitectura de dominio de los anticuerpos biespecíficos se indica en las figuras 2A y 2B, lo que indica que se usaron fragmentos Fab como primer y segundo sitio de unión a antígeno.

T a b la 5: A rq u ite c tu ra d e d o m in io d e los a n tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s in d icad o s

Los anticuerpos biespecíficos incluyeron las características indicadas en las tablas 5 y 6. Todas las construcciones comprendieron dominios constantes de la cadena ligera de isotipo kappa. Además, en todas las construcciones, las sustituciones de "botones" se introdujeron en el dominio CH3 fusionado a VH³y las sustituciones de "ojales" se introdujeron en el dominio CH3 fusionado a VL³.

T a b la 6: C a ra c te r ís tic a s d e los a n tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s in d icad o s

Las secuencias de aminoácidos de las cadenas polipeptídicas de los anticuerpos biespecíficos sometidos a prueba se indican en la tabla 7.

T a b la 7: S e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e c a d e n a s p o lip e p tíd ic a s d e a n tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s in d icad o s

Los tres anticuerpos se expresaron de forma transitoria en células HEK293 y se purificaron como se describe en los ejemplos 1 y 2.

T a b la ⁸ : R e n d im ie n to d e los a n tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s in d icad o s

Para someter a prueba la unión a antígeno simultánea de BsAb LeY-Bio(SS)-LeY, se analizó el anticuerpo por análisis FACS en células MCF7 que expresan LeY usando Cy5 biotinilada como carga. Los resultados del análisis FACS se muestran en la fig. 8.

Se observó unión simultánea a biotina y la superficie celular de MCF7 para el anticuerpo BsAb LeY-Bio(SS)-LeY. Como control, se pasó en paralelo un complejo del BsAb CD33-Bio(SS)-CD33 con Cy5 biotinilada como carga, demostrando que no se identificó una unión inespecífica del complejo a las células cancerosas. Los resultados fueron que el tercer sitio de unión del anticuerpo de acuerdo con la invención es fácilmente accesible para la unión a hapteno, específicamente para la unión a biotina y cargas acopladas a biotina.

E je m p lo 7:

A p lic a c ió n d e a n tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s tr iv a le n te s d e ac u e rd o co n la in v en c ió n p ara s u m in is tro d e c a rg a d ir ig id o Usando el mismo enfoque como se describe en el ejemplo 5, se evaluaron los anticuerpos de acuerdo con la invención preparados en el ejemplo 6 para determinar su aplicabilidad en el suministro de carga dirigido. Para esto, se complejaron los anticuerpos con un derivado de exotoxina de Pseudomonas (PE) truncada biotinilada como carga tóxica. Una ilustración esquemática de dicho complejo se indica en la fig. 9.

Para evaluar si los complejos de BsAb LeY-Bio(SS)-LeY con PC biotinilada se pueden dirigir a células cancerosas, induciendo de este modo la muerte celular, se pusieron en contacto las células de una línea celular de cáncer de mama MCF7 que expresa LeY in vitro con los complejos. Se evaluó la inducción de la muerte celular por un ensayo BrdU comercial (ELISA de proliferación celular, BrdU (quimioluminiscencia), n.° cat. 11 669 915 001, Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los siguientes controles se analizaron en paralelo:

- estaurosporina (control positivo),

- sin aditivos (medio solo, control negativo)

- PE biotinilada libre (PE-Bio),

- complejo de BsAb CD33-Bio(SS)-CD33 (proporcionado en los ejemplos 1 y 2) con PE biotinilada (control negativo para evaluar la actividad inespecífica de un complejo que incluye un anticuerpo de acuerdo con la invención y una toxina como CD33 no se une a células de cáncer de mama MCF7; demostrado en la fig. 7).

Los resultados (fig. 11) demuestran que solo el complejo del anticuerpo BsAb LeY-Bio(SS)-LeY de acuerdo con la invención y la PE biotinilada se pueden dirigir eficazmente a células de cáncer de mama MCF7 en concentraciones nanomolares bajas, lo que indica la dirección específica a las células cancerosas. Por el contrario, los complejos que abordan el antígeno c D33 que no está presente en células de cáncer de mama MCF7 apenas muestran toxicidad. Además, la toxina sin dirigir a vehículos o anticuerpos de control sin una carga tóxica no mostró actividad notable. E je m p lo 8:

P ro d u c c ió n d e a n tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s triv a le n te s d e a c u e rd o co n la in v en c ió n q u e s e unen e s p e c ífic a m e n te a b io tin a (B io ) o b ien d ig o x ig e n in a (D ig ) en co m b in a c ió n con uno d e los an tíg e n o s d e la s u p e rfic ie c e lu la r L e w is -Y (L eY ), C D 33 y G P C 3

Se diseñaron anticuerpos biespecíficos que comprenden tres sitios de unión a antígeno con la misma arquitectura de dominio que se une específicamente a biotina (Bio) o bien digoxigenina (Dig) en combinación con uno de los antígenos de la superficie celular Lewis-Y (LeY), CD33 y GPC3, como se describe para los anticuerpos de acuerdo con el ejemplo 1. La arquitectura de dominio de los anticuerpos biespecíficos se indica en las figuras 2A y 2B, lo que indica que se usan fragmentos Fab como primer y segundo sitio de unión a antígeno.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen las características indicadas en las tablas 9 y 10. Todas las construcciones comprenden dominios constantes de la cadena ligera de isotipo kappa. Además, en todas las construcciones, las sustituciones de "botones" se introducen en el dominio CH3 fusionado a VH³y las sustituciones de "ojales" se introducen en el dominio CH3 fusionado a VL³.

T a b la 9: A rq u ite c tu ra d e d o m in io d e los a n tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s in d icad o s

T a b la 10: C a ra c te r ís tic a s d e los an tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s in d icad o s

Las secuencias de aminoácidos de las cadenas polipeptídicas de los anticuerpos biespecíficos sometidos a prueba se indican en la tabla 11.

T a b la 11: S e c u e n c ia s d e am in o á c id o s d e c a d e n a s p o lip e p tíd ic a s d e a n tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s in d icad o s

Los anticuerpos se expresan y purifican como se describe en los ejemplos 1 y 2.

Claims

REIVINDICACIONES

iii) ambas modificaciones de i) y ii);

2. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tercer sitio de unión a antígeno se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH³y VL³(numeración de acuerdo con Kabat):

- VH³en la posición 44, y VL³en la posición 100;

- VH³en la posición 105, y VL³en la posición 43; o

- VH³en la posición 101, y VL³en la posición 100.

3. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el primer y segundo conector peptídico son péptidos de al menos 15 aminoácidos.

4. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que no se forma un enlace disulfuro intercatenario entre el primer y el segundo conector peptídico.

5. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el extremo C del dominio VH³se conecta directamente a uno de los dominios CH3, y el extremo C del dominio VL³se conecta directamente al otro de los dominios CH3.

6. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo es trivalente.

7. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo es biespecífico o triespecífico.

8. Un complejo que comprende

- el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo multiespecífico se une específicamente a un hapteno y una proteína diana, y

- el hapteno, que está unido específicamente por el anticuerpo multiespecífico, en el que el hapteno se conjuga con un agente terapéutico o de diagnóstico.

9. Un procedimiento para la preparación del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende las etapas de

10. Un anticuerpo multiespecífico producido por el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

12. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11.

13. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11.

14. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un complejo de acuerdo con la reivindicación 8, en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 acoplado a un agente citotóxico.