ES2212798T3 - Vacuna viva recombinante aviar, que utiliza como vector un virus del herpes de pavas. - Google Patents
Vacuna viva recombinante aviar, que utiliza como vector un virus del herpes de pavas.Info
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Abstract
LA VACUNA VIVA RECOMBINANTE DE AVE COMPRENDE COMO VECTOR, UN VIRUS HERPES DE AVE QUE COMPRENDE AL MENOS UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA, Y EXPRESA, UN POLIPEPTIDO ANTIGENICO DE UN AGENTE PATOGENO DE AVE, INSERTADO EN LA REGION COMPRENDIDA ENTRE ATG DE ORF UL55 Y LA UNION DE U{SUB,L} CON LA REGION REPETIDA ADYACENTE , BAJO EL CONTROL DEL PROMOTOR CMV INMEDIATAMENTE DESDE EL PRINCIPIO. EL VECTOR SE ELIGE PREFERENTEMENTE ENTRE EL GRUPO QUE CONSISTE EN EL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE MAREK (MDV Y HVT), VIRUS DE LARINGOTRAQUEITA INFECCIOSA ILTV Y HERPES DEL PATO. UNA FORMULA DE VACUNA MULTIVALENTE COMPRENDE AL MENOS DOS VACUNAS DE ESTE TIPO, CON SECUENCIAS INSERTADAS DIFERENTES.
Description
Vacuna viva recombinante aviar, que utiliza como
vector un virus del herpes de pavas.
La presente invención se refiere a vacunas para
uso aviar a base de virus HVT (Herpes Virus of Turkeys), en el que
se ha insertado, mediante recombinación genética, al menos una
secuencia nucleotídica que codifica, y que expresa, un polipéptido
antigénico de un agente patógeno aviar, en condiciones que aseguran
un inmunizado que conduce a una protección eficaz del animal
vacunado contra dicho agente patógeno.
Se ha propuesto ya un cierto número de vectores
víricos aviares recombinantes con la intención de vacunar a los
pájaros contra los agentes patógenos aviares, principalmente virus
patógenos, entre los cuales figuran el virus de la enfermedad de
Marek (MDV), de la enfermedad de Newcastle (NDV), de la
laringotraqueitis infecciosa (ILTV), de la enfermedad de Gumboro
(Infectious Bursl Disease, IBDV), de la bronquitis infecciosa (IBV)
y de la anemia aviar (CAV).
Los vectores víricos utilizados comprenden
avipox, en particular el Fowlpox,
(EP-A-0 517 292; H.-G. Heine et
al., Arch. Virol. 1993. 131. 277-292 D.B.
Boyle et al., Veterinary Microbiology 1994. 41.
173-181; C.D. Bayliss et al., Arch. Virol.
1991. 120. 193-205), los virus de Marek,
principalmente los serotipos 2 et 3 (HVT)
(WO-A-87 04463;
WO-A-89 01040;
WO-A-93 25665;
EP-A-O 513 921; J. McMillen,
Poultry Condemnation Meeting, October 1994, 359-363;
P.J.A. Sondermeijer et al., Vaccine 1993. 11.
349-357; R.W. Morgan et al., Avian Diseases
1992. 36. 858-870, et 1993. 37.
1032-1040) o incluso los virus ILTV y el adenovirus
aviar.
Cuando son utilizados para la vacunación, estos
virus recombinantes inducen protecciones de niveles variables,
generalmente débiles o parciales, incluso si, en casos particulares
raros, ha podido ser demostrada una protección importante.
Entre las protecciones más difíciles de asegurar
por medio de vacunas aviares vivas recombinantes, se encuentra la
correspondiente a la protección contra el virus de la enfermedad de
Gumboro, o virus IBDV. En efecto, aún cuando existen vacunas vivas
atenuadas o inactivadas clásicas, eficaces contra esta enfermedad,
ninguna vacuna viva recombinante está dotada, todavía, con una
eficacia conveniente.
El genoma del virus de la enfermedad de Gumboro
está constituido por un ARN de doble hebra. El segmento mayor
(segmento A) codifica una poliproteína de 115 kDa escindida en tres
proteínas VP2 (41 kDa), VP4 (28 kDa), VP3 (32 kDa). VP4 sería una
proteasa que intervendría en la maduración de la poliproteína de 115
kDa. La posición del sitio de escisión entre VP2 y VP4 solo está
determinada de manera aproximada (M. Jagadish, J. Virol. 1988,
62. 1084-1087). La proteína VP2 es un
inmunógeno que induce anticuerpos neutralizantes y una protección
contra la enfermedad de Gumboro.
Se ha propuesto ya la inserción de los genes que
codifican proteínas inmunógenas de IBDV en diversos vectores vivos:
EP-A-0 517 292 (inserción de
secuencias que codifican VP2 o la poliproteína en un avipox); C.D.
Bayliss 1991, H.-G. Heine 1993 y D.B. Boyle 1994 supra (VP2
en el Fowlpox).
Los virus de la enfermedad de Marek han sido
igualmente propuestos en la WO-A-90
02802 y en la WO-A-90 02803 (sitios
de inserción diversos tales como gC, TK, RR1, RR2), en las
solicitudes de patente francesas Nº 90 03105 (RR2) y 90 11146
(US3), así como, principalmente, en las solicitudes de patente
WO-A-87 04463 y
WO-A-89 01040 (BamHI #16 y #19) y
WO-A-93 25655 (US2).
Los autores R.J. Isfort et al. (Virology
1994, 203. 125-133) han determinado un
cierto número de sitios de integración de retrovirus en el genoma de
HVT, sitios que están situados en los fragmentos de restricción
BamH I F, A e I. Otros ejemplos de sitios de inserción en el genoma
de HVT, han sido propuestos en la
EP-A-0 431 668 (región Us) y en la
JP 4 200 384 (gA).
Se han utilizado diversos promotores, con
inclusión de aquellos que están generalmente disponibles en el
comercio, en las diferentes construcciones del arte anterior, entre
los cuales se encuentran los promotores PRV gX, HCMV IE (CMV
immediate early humain), herpes simplex alpha-4, FPV
P.E/L (promotor Fowlpox) (H. Heine et al., Arch. Virol.
1993. 131. 277-292), P7.5 (C. Bayliss et
al., Arch. Virol. 1991. 120. 193-205) y
P11 del virus de la vacuna (D. Boyle et al. Vet. Microb.
1994. 41. 173-181), procedente de la
secuencia LTR del virus RSV (Rous Sarcoma Virus), SV40 precoz, así
como promotores MDV o HVT, tales como los promotores de los genes
gB, gC, TK, RR2, etc., sin que se haya podido apreciar una regla,
principalmente en caso de las construcciones en el HVT. Las
secuencias de ciertos promotores pueden inhibir la replicación de
los vectores recombinantes HVT o MDV (D.R. Masrshall et al.,
J. Vir. Meth. 1992. 40. 195-204 y Virology
1993 195. 638-648). Entre los promotores
citados, un cierto número como por ejemplo SV40, LTR, RSV y PRV gX,
han mostrado una cierta eficacia, igual que ciertos promotores
propios de ciertos genes del virus Marek, principalmente de
serotipo 3.
La invención ha permitido poner a punto una
vacuna viva recombinante a base de un vector HVT en el que se ha
insertado, al menos, una secuencia que codifica un inmunógeno
aviar, en particular la proteína VP2 de IBDV. Una vacuna de este
tipo que incorpora una secuencia que codifica VP2, asegura una
protección satisfactoria de los animales contra la enfermedad de
Gumboro, a saber protección frente a la mortalidad y a las lesiones
de la bolsa de Fabricius.
La presente invención tiene por objeto una vacuna
viva recombinante aviar, que comprende, a modo de vector, un virus
de herpes aviar, que comprende al menos una secuencia nucleotídica
que codifica, y que expresa, un polipéptido antigénico de un agente
patógeno aviar, insertado en el fragmento de restricción BamHI I de
HVT, a saber en una de las tres regiones intergénicas 1, 2 y 3
principalmente bajo el control del promotor CMV immediate early. El
fragmento BamHI I de HVT ha sido presentado por A.E. Buckmaster en
J. Gen.Virol. 1988. 69. 2033-2042. Estas
zonas intergénica corresponden, con referencia a la cepa HVT en
particular, a la que corresponde la secuencia nucleotídica de la
figura 1, a los nucleótidos de la figura 1, 1213 a 1383 para el
intergen 1. 1942 a 2283 para el intergen 2 y 3082 a 3569 para el
intergen 3.
Se entiende por inserción en la región de
inserción, principalmente la inserción sin deleción o con deleción
de algunas bases para las zonas intergénicas.
Se entiende por promotor CMV immediate early
(IE), el fragmento dado en el ejemplo así como sus subfragmentos
que conservan la misma actividad promotora.
El promotor CMV IE puede ser el promotor humano
(HCMV IE) o el promotor murino (MCMV IE), o incluso un promotor CMV
IE de otro origen, por ejemplo de rata o del cerdo de la India.
La secuencia nucleotídica, insertada en el vector
Marek, para ser expresada, puede ser cualquier secuencia que
codifique un polipéptido antigénico, de un agente patógeno aviar,
capaz, una vez expresado en las condiciones favorables
proporcionadas por la invención, de asegurar un inmunizado que
conduzca a una protección eficaz del animal vacunado contra el
agente patógeno. Por lo tanto podrán insertarse, en las condiciones
de la invención, las secuencias nucleotídicas que codifican los
antígenos de interés para una enfermedad dada.
Las vacunas, según la invención, podrán ser
utilizadas para la vacunación in ovo, de los pollitos de 1
día o más y de los adultos.
La invención puede ser utilizada, principalmente,
para la inserción de una secuencia nucleotídica que codifique
convenientemente el polipéptido VP2 del virus IBDV. De este modo se
obtiene una vacuna viva recombinante que asegura, además de una
protección contra la enfermedad de Marek, una protección
satisfactoria contra la enfermedad de Gumboro. Si se desea, puede
insertarse también una secuencia que codifique otro antígeno de
IBDV, tal como VP3 o incluso la poliproteína VP2 + VP4 + VP3, sin
que sean preferidas estas otras posibilidades.
La vacuna recombinante contra la enfermedad de
Gumboro se presenta, preferentemente, en forma de 10 a 104
pfu/dosis.
Otros casos preferidos de la invención consisten
en la inserción de secuencias nucleotídicas que codifican antígenos
del virus de la enfermedad de Marek, en particular genes gB, gC,
gD, y gH + gL (WO-A-90 02803), del
virus de la enfermedad de Newcastle, en particular genes F y HN,
virus de la bronquitis infecciosa (IBV), en particular genes S y M
(M. Binns et al., J. Gen. Virol. 1985. 66.
719-726; M. Boursnell et al., Virus Research
1984. 1. 303-313), del virus de la anemia aviar
(CAV), en particular VP1 (52 kDa) + VP2 (24 kDa) (N.H.M. Noteborn
et al., J. Virol. 1991. 65. 3131-3139)
y del virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV), en
particular gB (WO-A-90 02802), gC,
gD y gH + gL.
Las dosis serán, preferentemente, las mismas que
para la vacuna de Gumboro.
Según un desarrollo ventajoso de la invención, se
asocia con el promotor CMV IE otro promotor de tal manera que los
promotores tengan sentidos de transcripción opuestos, lo que
permite insertar, en la zona de inserción, dos secuencias
nucleotídicas, una bajo la dependencia del promotor CMV IE, la otra
bajo la del promotor asociado. Esta construcción es notable debido
a que la presencia del promotor CMV IE, y principalmente de su
parte activadora (enhancer), activa la transcripción inducida por
el promotor asociado. Un promotor asociado preferido es el promotor
Marck RNA1.8, cuya actividad de transcripción se ha revelado
multiplicada aproximadamente por 4,4 en estas condiciones.
Un caso interesante de la invención es una vacuna
que comprende una secuencia nucleotídica que codifica VP2 de IBDV
bajo el control de CMV IE y una secuencia nucleotídica que codifica
un antígeno de otra enfermedad aviar, principalmente las que se han
citado anteriormente, bajo el control del otro promotor.
También pueden montarse
cabeza-cola dos promotores CMV IE de orígenes
diferentes.
El promotor RNA1.8 podrá utilizarse también solo
en lugar del promotor CMV IE, principalmente para vacunas contra la
enfermedad de Marek, la enfermedad de Newcastle, la
laringotraqueitis infecciosa, la bronquitis infecciosa y la anemia
aviar.
La presente invención tiene por objeto también
una fórmula de vacuna multivalente, que comprende, en mezcla o a
ser mezcladas, al menos dos vacunas vivas recombinantes aviares
tales como las que se han definido más arriba, estas vacunas
comprenden secuencias insertadas diferentes, principalmente de
patógenos diferentes.
La presente invención tiene por objeto, también,
un método para la vacunación aviar, que comprende la administración
de una vacuna viva recombinante, o de una fórmula de vacuna
multivalente, tal como se ha definido anteriormente. La invención
tiene por objeto, principalmente, un método de este tipo para la
vacunación in ovo de los pollitos de 1 día o más y de los
adultos.
La invención se describirá ahora, con mayor
detalle, por medio de ejemplos de realización no limitativos,
tomados con referencia al dibujo, en el que:
Lista de las figuras y de las secuencias para las
construcciones en los sitios intergénicos
Figura 1: Secuencia del fragmento HVT BamHI I
Figura 2: plásmido pEL039
Figura 3: plásmido pEL077
Figura 4: plásmido pEL079
Figura 5: plásmido pEL076
Figura 6: plásmido pEL078
Figura 7: plásmido pEL054
Figura 8: plásmido pEL055
Figura 9: plásmido pEL062
Figura 10: plásmido pEL066
Figura 11: plásmido pEL022
Figura 12: plásmido pEL023
Figura 13: plásmido pEL024
Figura 14: plásmido pCMVb
Figura 15: plásmido pEL026
Figura 16: plásmido pEL090
Figura 17: plásmido pCD002
Figura 18: plásmido pCD009
Figura 19: plásmido pEL068
Figura 20: plásmido pEL070
Figura 21: plásmido pEL091
Figura 22: plásmido pCD011
Figura 23: plásmido pCD020
Figura 24: plásmido pEL092
Figura 25: Secuencia del gen NDV HN
Figura 26: plásmido pEL028
Figura 27: plásmido pEL029bis
Figura 28: plásmido pEL030
Figura 29: plásmido pEL032
Figura 30: plásmido pEL093
Figura 31: plásmido pEL033
Figura 32: plásmido pEL034
Figura 33: plásmido pEL094
Figura 34: Secuencia del promotor MDV RNA 1.8
kpb
Figura 35: plásmido pBS002
Figura 36: plásmido pEL069
Figura 37: plásmido pEL080
Figura 38: plásmido pEL081
Figura 39: plásmido pEL095
Figura 40: plásmido pEL098
Lista de las secuencias SEQ ID para las
construcciones en los sitios intergénicos
SEQ ID Nº 1 Secuencia del fragmento HVT BamHl
l
SEQ ID Nº 2 Oligonucleótido EL102
SEQ ID Nº 3 Oligonucleótido EL161
SEQ ID Nº 4 Oligonucleótido EL147
SEQ ID Nº 5 Oligonucleótido EL162
SEQ ID Nº 6 Oligonucleótido EL154
SEQ ID Nº 7 Oligonucleótido EL163
SEQ ID Nº 8 Oligonucleótido EL164
SEQ ID Nº 9 Oligonucleótido EL165
SEQ ID Nº 10 Oligonucleótido EL132
SEQ ID Nº 11 Oligonucleótido EL 133
SEQ ID Nº 12 Oligonucleótido MB070
SEQ ID Nº 13 Oligonucleótido MB071
SEQ ID Nº 14 Oligonucleótido CD001
SEQ ID Nº 15 Oligonucleótido CD002
SEQ ID Nº 16 Oligonucleótido CD003
SEQ ID Nº 17 Oligonucleótido CD004
SEQ ID Nº 18 Secuencia del gen NDV HN
SEQ ID Nº 19 Oligonucleótido EL071
SEQ ID Nº 20 Oligonucleótido EL073
SEQ ID Nº 21 Oligonucleótido EL074
SEQ ID Nº 22 Oligonucleótido EL075
SEQ ID Nº 23 Oligonucleótido EL076
SEQ ID Nº 24 Oligonucleótido EL077
SEQ ID Nº 25 Secuencia del promotor MDV RNA 1.8
kpb
SEQ ID Nº 26 Oligonucleótido MB047
SEQ ID Nº 27 Oligonucleótido MB048
SEQ ID Nº 28 Oligonucleótido MB072
Todas las construcciones de plásmidos se han
realizado utilizando las técnicas normalizadas de biología
molecular descritas por Sambrook J. et al. (Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor
Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Todos los
fragmentos de restricción utilizados para la presente invención han
sido aislados utilizando el estuche "Geneclean" (BIO101 Inc.
La Jolla, CA).
El virus utilizado como virus parenteral es la
cepa FC126 del virus del herpes de la pava (HVT) aislado por el Dr.
Witter del Regional Poultry Research Laboratory (USDA, East
Lansing, Michigan), en una piara de pavas de 23 semanas (Witter R.
L. et al. Am. J. Vet. Res. 1970. 31,
525-538). Las condiciones de cultivo de estos virus
son las que se han descrito en otra parte (solicitud de patente
francesa 90 03105).
Se recoge la sangre total de un pollito ensayado,
de 7 días, con la cepa MDV RB1B, con una jeringuilla sobre
anticoagulante (solución de heparina con 100 Ul/ml) 14 días después
de la infección. Esta sangre se centrífuga a continuación a 30 g
durante 15 minutos a temperatura ambiente. El plasma así como el
"buffy-coat" son tomados y diluidos en PBS
estéril para tener un volumen final de 10 ml. Después de un
centrifugado durante 15 minutos a 150 g, el culote celular se
suspende nuevamente en 2 ml de medio de cultivo 199
(Gibco-BRL Cat # 042-01183M), que
contiene un 2% de suero de vaca fetal (SVF).
El ADN total de los linfocitos infectados se
extrae, a continuación según la técnica descrita por R. Morgan
et al. (Avian Diseases. 1990. 34.
345-351) y puede servir directamente de matriz para
las experiencias de PCR. Para la clonación de fragmentos genómicos
del virus MDV, se ha cultivado la cepa RB1B sobre CEP y el ADN
vírico ha sido preparado a partir de partículas víricas purificadas
como se ha descrito por Lee Y. et al. (J. Gen.Virol. 1980.
51. 245-253).
Se ha obtenido el virus MCMV cepa Smith de la
American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA (ATCC Nº
VR-194). Este virus ha sido cultivado sobre células
de embrión de ratón Balb/C y el ADN vírico de este virus ha sido
preparado como se ha descrito por Ebeling A. et al. (J.
Virol. 1983. 47. 421-433).
Se ha preparado el ADN vírico utilizado para las
experiencias de transfección, según la técnica descrita por R.
Morgan et al. (Avian Diseases. 1990. 34.
345-351) a partir de un cultivo de CEP secundarios
(CEP II) infectados con la cepa FC126 del virus HVT.
Se ha aislado el fragmento BamHI I de 5,8 kpb del
virus HVT cepa FC126 (Igarashi T. et al. J. Gen. Virol.
1989. 70. 1789-1804) por Geneclean y se ha
clonado en el sitio BamHI del vector pBS-SK + para
dar el plásmido pEL037. La secuencia de este fragmento ha sido
establecida totalmente (5838 pb) (figura 1 y SEQ ID Nº 1). En esta
secuencia se han identificado 6 cuadros abiertos de lectura (=
"open reading frames = ORFs"). El estudio de las proteínas
potencialmente codificadas por estos ORFs ha revelado que algunas
de estas proteínas presentaban una homologa con las proteínas
codificadas por los ORFs presentes en el caso de otros virus
alfaherpes. El primer ORF (ORF1( (posición 676 hasta posición 1209
sobre SEQ ID Nº 1) presenta una homología con los ORFs
HSV-1 UL55, EHV-1 gen 4 y VZV gen
5, y codifica una proteína teórica HVT UL55 de 178 aminoácidos (aa).
El ORF2 está situado en la posición 1941 hasta la posición 1387
sobre la secuencia SEQ ID Nº 1 y codifica una proteína de 185 aa
homóloga con la proteína codificada por el ORF
EHV-1 gen 3. El ORF3 está incompleto. Este se
encuentra situado en la posición 5838 hasta 3573 sobre SEQ ID Nº 1
y presenta una homología con el ORF 21 de MDV (Ross N. et
al. Virus Genes. 1993, 7. 33-51).
Otros tres ORFs, identificados en esta secuencia: ORF4 (posición
1403 hasta posición 1957 (proteína de 185 aa)), ORF5 (posición 3081
hasta posición 2287 (proteína de 265 aa)), y ORF6 (incompleto;
posición 479 hasta posición 1) no tienen homólogos en los bancos de
secuencias. La organización genómica del fragmento BamHI l del
virus HVT cepa FC126 es tal que existen 3 regiones intergénicas que
pueden ser utilizadas como sitios de inserción para las cajas de
expresión de genes extraños:
Una región intergénica (región intergénica 1)
existe entre el ORF 1 y el ORF 2. Una segunda región intergénica
(región intergénica 2) existe entre el ORF 2 y el ORF 5. Una
tercera región intergénica (región intergénica 3) existe entre el
ORF 5 y el ORF 3 HVT. Estas tres regiones son utilizables para
insertar cajas de expresión sin afectar la replicación in
vivo de los virus HVT recombinantes obtenidos de este modo. A
continuación se han descrito ejemplos de construcciones de
plásmidos donadores para estas regiones intergénicas 1, 2 y 3.
El plásmido pEL037 ha sido digerido por BamHI y
EcoRI para aislar los fragmentos BamHI-EcoRI de
2672 pb y 2163 pb. Estos fragmentos han sido ligados con el vector
pBS-SK +, previamente digerido por BamHI y EcoRI,
para dar, respectivamente, los plásmidos pEL039 de 5167 pb y pELO40
de 6104 pb). El plásmido pEL039 (figura 2) ha sido digerido por
BamHI y Pstl para aislar el fragmento BamHI-PstI de
997 pb (fragmento A). Se ha realizado una PCR con los
oligonucleótidos siguientes:
EL 102 (SEQ ID Nº 2) 5' CATTATAAGACCAACGTGCGAGTC
3'
EL 161 (SEQ ID Nº 3) 5'
GTTCACGTCGACAATTATTTTATTTAATAAC 3'
y la matriz pEL039 para producir un fragmento 420
pb. Este fragmento ha sido digerido por Pstl y Sall para aislar un
fragmento Pstl- Sall de 250 pb (fragmento B). Los fragmentos A y B
han sido ligados junto con el vector pBSII-SK +
(Stratagene), previamente digerido por BamHI y Sall, para dar el
plásmido pEL077 de 4160 pb (figura 3). El plásmido pEL039 ha sido
digerido por BstBl y Scal para aislar un fragmento
BstBl-Scal (extremo franco) de 475 pb (fragmento
C). Se ha realizado una PCR con los oligonucleótidos
siguientes:
EL 147 (SEQ ID Nº 4) 5' AAGATAATGGGCTCCCGCTGTTC
3'
EL 162 (SEQ ID Nº 5) 5'
TAATTGTCGACCCCGGGGAATTCGTTTAATGTTAGTTTATTC 3'
y la matriz pEL039 para producir un fragmento PCR
de 715 pb. Este fragmento ha sido digerido por BstBI y Sall para
aislar el fragmento BstBl-Sall de 465 pb (fragmento
D). Los fragmentos C y D han sido ligados junto con el plásmido
pEL077, previamente digerido por Apal, marcado con la polimerasa
Klenow, y digerido por Sall, para dar el plásmido pEL079 de 5082 pb
(figura 4). Este plásmido contiene un poly-linker
EcoRl-Smal-Sall en el sitio
intergénico
1.
El plásmido pEL039 (ejemplo 5) ha sido digerido
por BstBl y PstI para aislar el fragmento
BstBl-Pstl de 715 pb (fragmento A). Se ha realizado
una PCR con los oligonucleótidos siguientes:
EL 154 (SEQ ID Nº 6) 5' GAAATGCAAACTAACATTATTGTC
3'
EL 163 (SEQ ID Nº 7) 5'
GTGTAAATAGTCGACAATATAGATAACGGGC 3'
y la matriz pEL039 para producir un fragmento PCR
de 500 pb. Este fragmento ha sido digerido por BstBI y Sali para
aislar el fragmento BstBl-Sall de 430 pb (fragmento
B). Los fragmentos A y B han sido ligados junto con el vector
pBSII-SK +, previamente digerido por PstI y Sali,
para dar el plásmido pEL076 de 4081 pb (figura
5).
Se ha realizado otra PCR con los oligonucleótidos
siguientes:
EL 164 (SEQ ID Nº 8) 5'
CTATATTGTCGACCCCGGGGAATTCATCGACATGATTAAATAC 3'
EL 165 (SEQ ID Nº 9) 5'
CAATGAAGAAATATTTTCTTTGTTCCTTGAAATGC 3'
y la matriz pEL039 para producir un fragmento PCR
de 565 pb. Este fragmento ha sido digerido por Sall y Sspl para
aislar el fragmento Sall-Sppl de 535 pb. Este
fragmento ha sido ligado con el plásmido pEL076, previamente
digerido por Apal, marcado con la polimerasa Klenow, y digerido por
Sall, para dar el plásmido pEL078 de 4598 pb (figura 6). Este
plásmido contiene un poly-linker
EcoRI-Smal-Sall en la región
intergénica
2.
Se ha digerido el plásmido pEL040 (véase el
ejemplo 5) por Ncol y Sphl para aislar el fragmento
Ncol-Sphl de 1468 pb. Este fragmento ha sido ligado
con el plásmido pUC BM20 (Boehringer Mannheim Cat # 1219235),
previamente digerido por Ncol y Sphl, para dar el plásmido pEL054
de 4182 pb (figura 7). El plásmido pEL040 ha sido digerido por
EcoRI y SphI para aislar el fragmento EcoRl-Sphl de
614 pb. Este fragmento ha sido ligado con el plásmido pUC BM20,
previamente digerido por EcoRI y Sphl, para dar el plásmido pEL055
de 3263 pb (figura 8). El plásmido pEL055 ha sido digerido por
EcoRI, marcado con la polimerasa Klenow, ligada sobre sí misma,
digerida por HindIII, marcada con la polimerasa Klenow, y finalmente
ligada sobre sí misma para dar el plásmido pEL062 de 3279 pb (figura
9). El plásmido pEL054 ha sido digerido por Ncol y SalI para aislar
el fragmento Ncol-Sall de 1492 pb (fragmento A). Se
han hibridado entre sí los dos oligonucleótidos siguientes:
EL 132 (SEQ ID Nº 10) 5' CCGAATTCATATAACGTTACGTG
3'
EL 133 (SEQ ID Nº 11) 5'
TCGACACGTAAGCTTATATGAATTCGGCATG 3'
para producir el fragmento
Sall-Sphl de 24 pb (fragmento B). Los fragmentos A y
B han sido ligados junto con el plásmido pEL062, previamente
digerido por Ncol y Sphl, para dar el plásmido pEL066 de 4787 pb
(figura 10). Este plásmido contiene un poly-linker
EcoRl-Hindlll-Sall en la región
intergénica
3.
El plásmido pEL004 (= plásmido pGH004 descrito en
la solicitud de patente francesa 92.13109) que contiene el gen IBDV
VP2, en forma de una caja BamHl-Hindlll ha sido
digerido por BamHI y Xbal para aislar el fragmento
BamHl-Xbal (gen VP2 truncado) de 1104 pb. Este
fragmento ha sido clonado en el vector pBS-SK +,
previamente digerido con Xbal y BamHI para dar el plásmido pEL022
de 4052 pb (figura 11). El vector pBS-SK + ha sido
digerido por EcoRV y Xbal, y a continuación se ha ligado así mismo
para dar pBS-SK* (modificado). El plásmido pEL004
ha sido digerido por Kpnl y Hindlll para aislar el fragmento
Kpnl-Hindlll de 1387 pb que contiene el gen IBDV VP2
completo. Este fragmento ha sido clonado en el vector
pBS-SK*, previamente digerido por Kpnl y Hindlll,
para dar el plásmido pEL023 de 4292 pb (figura 12). El plásmido
pEL022 ha sido digerido por BamHI y Notl para aislar el fragmento
BamHl-Notl de 1122 pb (fragmento A). El plásmido
pEL023 ha sido digerido por BamHI y Notl para aislar el fragmento
BamHl-Notl de 333 pb (fragmento B). Los fragmentos A
y B han sido ligados junto con el vector pBS-SK +,
previamente digerido por Notl y tratado con la fosfatasa alcalina
para dar el plásmido pEL024 de 4369 pb (figura 13). El plásmido
pEL024 ha sido digerido por Notl para aislar el fragmento
Not-Notl de 1445 pb. Este fragmento ha sido ligado
con el plásmido pCMVb (Clontech Cat# 6177-1)
(figura 14), previamente digerido por Notl, para dar el plásmido
pEL026 de 5095 pb (figura 15). El plásmido pEL026 ha sido digerido
por EcoRl, Sall y Xmnl para aislar el fragmento
EcoRl-Sall de 2428 pb. Este fragmento ha sido
ligado con el plásmido pEL079 (véase el ejemplo 5), previamente
digerido por EcoRI y Sall, para dar el plásmido pEL090 de 7514 pb
(figura 16). Este plásmido permite la inserción de la caja de
expresión HCMV-IE/IBDV VP2 en el sitio intergénico
1 del virus HVT.
Células CEP primarias de 24 horas han sido
transfectadas con la mezcla siguiente: 1 mg de plásmido pEL090
linealizado + 5 mg de ADN vírico de HVT en 300 ml de medio OptiMEM
(Gibco BRL Cat# 041-01985H) y 100 mg de
LipofectAMINE diluidos en 300 ml de medio (volumen final de la
mezcla = 600 ml). Estos 600 ml han sido diluidos a continuación en
3 ml (volumen final) del medio y se han extendido sobre 3.106 CEP
I. Las mezcla se ha dejado en contacto con las células durante 5
horas, a continuación se ha eliminado y se ha reemplazado por 5 ml
de medio de cultivo. Las células se han dejado entonces en cultivo
durante 3 días a +37ºC, a continuación se han pronasado, se han
mezclado con CEP II frescos (mezcla 3:1), y se han vuelto a
extender sobre 1 placa con 96 pocillos. Cada placa se ha dejado en
cultivo durante 3 días, a continuación las células han sido
pronasadas, se han mezclado con CEP II frescos, y se han vuelto a
extender sobre 2 placas de 96 pocillos, dando una copita inicial 2
copitas hermanas. Las placas de 96 pocillos se han puesto en
cultivo hasta la aparición de un efecto citopático. Al cabo de 72
horas de cultivo, se ha fijado con acetona al 95% una de las dos
placas de 96 pocillos durante 30 minutos y se ha realizado una
reacción de inmunofluorescencia indirecta (IFI) con anticuerpo
monoclonal anti-VP2 para buscar las zonas que
expresan la proteína VP2. Las copitas "hermanas" de las
copitas que presentan zonas positivas IFI han sido pronasadas,
mezcladas con CEP II frescos, y depositadas en dilución límite
sobre placas de 96 pocillos. Al cabo de 3 días de cultivo, las
copitas que presentan un efecto citopático han sido pronasadas,
mezcladas con CEP II, y extendidas de nuevo sobre placas de 96
pocillos, dando una copita inicial 2 copitas hermanas. Al cabo de 3
días, las zonas que expresan la proteína VP2 han sido buscadas de
nuevo como en el caso precedente por IFI sobre una de las 2 placas
hermanas.
En general, son suficientes 4 ciclos de
aislamiento sucesivos (recogida de una copita, extendido de nuevo,
control por IFI, transplante de una copita hermana ...) para
obtener virus recombinantes, cuya progenie presenta, en su
totalidad, una fluorescencia específica. Una zona vírica, que ha
dado 100% de zonas positivas en IFI con un anticuerpo monoclonal
anti-VP2 ha sido designada como vHVT16. El ADN
genómico de este virus recombinante se ha caracterizado a nivel
molecular mediante técnicas clásicas de PCR y de Southern blot
utilizándose los oligonucleótidos y las sondas de ADN
apropiadas.
Se ha digerido el plásmido pCMVb (figura 14) por
Sali y Smal para aislar el fragmento Sall-Smal de
3679 pb que contiene el gen lacZ así como la señal de
poli-adenilación del gen tardío de virus SV40. Este
fragmento ha sido insertado en el vector pBS-SK +,
previamente digerido por Sall y EcoRV, para dar el plásmido pCD002
de 6625 pb (figura 17). Este plásmido contiene el gen informador
lacZ pero ningún promotor está situado aguas arriba de este
gen. El ADN genómico vírico del virus MCMV ha sido preparado como
se ha descrito en el ejemplo 2 y se ha digerido por PstI para
aislar el fragmento Pstl-Pstl de 2285 pb. Este
fragmento ha sido clonado en el vector pBS-SK +,
previamente digerido por Pstl y tratado con la fosfatasa alcalina,
para dar el plásmido pCD004. El plásmido pCD004 ha sido digerido
por Hpal y Pstl para aislar el fragmento Hpal-Pstl
de 1389 pb, que contiene la región promotora/activadora del gen
Immediate-Early del citomegalovirus murino (Murine
CytoMegalo Virus = MCMV) (Dorsch-Häster K. et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1985, 82.
8325-8329, y solicitud de patente
WO-A-87/03905). Este fragmento a
sido clonado en el plásmido pCD002 previamente digerido por PstI y
Saml, para dar el plásmido pCD009 de 8007 pb (figura 18).
Se ha obtenido un oligonucleótido de doble hebra
por hibridación de los dos oligonucleótidos siguientes:
MB070 (SEQ ID Nº 12) 5'
CGAATTCACTAGTGTGTGTCTGCAGGCGGCCGCGTGTGTGCGACGGTAC 3'
MB071 (SEQ ID Nº 13) 5'
CGTCGACACACACGCGGCCGCCTGCAGACACACACTAGTGAATTCGAGCT 3'
Este oligonucleótidos de doble hebra se ha ligado
en el vector pBS-SK +, previamente digerido por
Kpnl y Sacl, para dar el plásmido pEL067. El plásmido pCD009 ha
sido digerido por Pstl y Spel para aislar el fragmento
Pstl-Spel de 1396 pb. Este fragmento ha sido ligado
con el plásmido pEL067, previamente digerido por Pstl y Spel, para
dar el plásmido pEL068 de 4297 pb (figura 19). El plásmido pEL026
(véase el ejemplo 8) ha sido digerido por HindIII y Sali para
aislar el fragmento Hindlll-Sall de 235 pb
(fragmento B). Los fragmentos A y B han sido digeridos junto con el
plásmido pEL068, previamente digerido por Notl y Sall, para dar el
plásmido pEL070 de 5908 pb (figura 20). El plásmido pEL070 ha sido
digerido por EcoRI, Sall y Xmnl para aislar el fragmento
EcoRl-Sall de 3035 pb. Este fragmento ha sido
ligado con el plásmido pEL079 (véase el ejemplo 5), previamente
digerido por EcoRI y Sall, para dar el plásmido pEL091 de 8109 pb
(figura 21). Este plásmido permite la inserción de la caja de
expresión MCMV-IE/IBDV VP2 en el sitio intergénico
1 del virus HVT.
Una co-transfección realizada
como se ha descrito en el ejemplo 8, con el plásmido pEL091 y el
ADN genómico del virus HVT ha conducido al aislamiento y a la
purificación del recombinante vHVT17.
Se ha ligado el fragmento
EcoRI-Sall de 3,9 kpb del ADN genómico del virus MDV
cepa RB1B, que contiene el gen MDV gB (secuencia publicada por Ross
N. et al. J. Gen. Virol. 1989.70
1789-1804) con el vector pUC13, previamente
digerido por EcoRI y Sall, para dar el plásmido pCD007. Este
plásmido ha sido digerido por Sacl y Xhol, para aislar el fragmento
Sacl-Xhol de 2260 pb (parte central del gen gB =
fragmento A). Se ha realizado una PCR con los oligonucleótidos
siguientes:
CD001 (SEQ ID Nº 14) 5'
GACTGGTACCGCGGCCGCATGCACTTTTTAGGCGGAATTG 3'
CD002 (SEQ ID Nº 15) 5' TTCGGGACATTTTCGCGG 3'
y la matriz pCD007 para producir un fragmento PCR
de 222 pb. Este fragmento ha sido digerido por Kpnl y Xbal para
aislar un fragmento Kpnl-Xbal de 190 pb (extremidad
5' del gen gB = fragmento B). Se ha realizado otra PCR con los
oligonucleótidos
siguientes:
CD003 (SEQ ID Nº 16) 5' TATATGGCGTTAGTCTCC 3'
CD004 (SEQ ID Nº 17) 5'
TTGCGAGCTCGCGGCCGTTATTACACAGCATCATCTTCTG 3'
y la matriz pCD007 para producir un fragmento PCR
de 195 pb. Este fragmento ha sido digerido por Sacl y Sacll para
aislar el fragmento Sacl-Sacll de 162 pb
(extremidad 3' del gen gB = fragmento C). Los fragmentos A, B y C
han sido ligados junto con el vector pBS-SK +,
previamente digerido por Kpnl y SacI, para dar el plásmido pCD011
de 5485 pb (figura 22). El plásmido pCD011 ha sido digerido por
Notl para aislar el fragmento Not-Notl de 2608 pb
(gen MDV gB entero). Este fragmento ha sido ligado con el plásmido
pCMVb, previamente digerido por Notl y tratado con la fosfatasa
alcalina, para dar el plásmido pCD020 de 6299 pb (figura 23). (En
este plásmido, el gen MDV gB reemplaza al gen lacZ). El
plásmido pCD020 ha sido digerido por EcoRI y Sall para aislar el
fragmento EcoRI-SalI de 3648 pb. Este fragmento ha
sido ligado con el plásmido pEL079 (véase el ejemplo 5),
previamente digerido por EcoRI y Sali, para dar el plásmido pEL092
de 8718 pb (figura 24). Este plásmido permite la inserción de la
caja de expresión HCMV-IE/MDV gB en el sitio
intergénico del virus
HVT.
Una co-transfección realizada,
como se ha descrito en el ejemplo 8, con el plásmido pEL092 y con
ADN genómico del virus HVT ha conducido al aislamiento y a la
purificación del recombinante vHVT18.
Se ha realizado la constitución de un banco de
ADN complementario del genoma del virus de la enfermedad de
Newcastle (NDV), cepa Texas, como se ha descrito por Taylor J.
et al. (J.Virol. 1990, 64. 1441-1450).
Se ha identificado un clon pBR322 que contiene el final del gen
fusión (F), la totalidad del gen
hemaglutinina-neuramidinasa (HN) y el inicio del gen
de la polimerasa, pHN01. La secuencia del gen NDV HN presente sobre
este clon está representada en la figura 25 (SEQ ID Nº 18). El
plásmido pHN01 ha sido digerido por Sphl y Xbal para aislar el
fragmento Sphl-Xbal de 2520 pb. Este fragmento ha
sido ligado con el vector pUC19, previamente digerido por Sphl y
Xbal, para dar el plásmido pHN02 de 5192 pb. El plásmido pHN02 ha
sido digerido por Clal y Pstl para aislar el fragmento
Clal-Pstl de 700 pb (fragmento A). Se ha realizado
una PCR con los oligonucleótidos siguientes:
EL 071 (SEQ ID Nº 19) 5' CAGACCAAGCTTCTTAAATCCC
3'
EL 073 (SEQ ID Nº 20) 5' GTATTCGGGACAATGC 3'
y la matriz pHN02 para producir un fragmento PCR
de 270 pb. Este fragmento ha sido digerido por HindIII y Pstl para
aislar un fragmento HindIII-PstI de 220 pb
(fragmento B). Los fragmentos A y B han sido ligados junto con el
vector pBS-SK +, previamente digerido por Clal y
HindIII, para dar el plásmido pEL028 de 3872 pb (figura 26). El
plásmido pHN02 ha sido digerido por Bsphl y Clal para aislar el
fragmento Bsphl-Clal de 425pb (fragmento C). Se ha
realizado una PCR con los oligonucleótidos
siguientes:
EL 074 (SEQ ID Nº 21) 5' GTGACATCACTAGCGTCATCC
3'
EL 075 (SEQ ID Nº 22) 5'
CCGCATCATCAGCGGCCGCGATCGGTCATGGACAGT 3'
y la matriz pHN02 para producir un fragmento PCR
de 424 pb. Este fragmento ha sido digerido por Bsphl y Notl para
aislar el fragmento Bsphl-Notl de 390 pb (fragmento
D). Los fragmentos C y D han sido ligados junto con el vector
pBS-SK +, previamente digerido por ClaI y Notl,
para dar el plásmido pEL029bis de 3727 pb (figura 27). El plásmido
pEL028 ha sido digerido por Clal y Sacll para aislar el fragmento
Clal-Sacll de 960 pb (fragmento E). El plásmido
pEL029bis ha sido digerido por Clal y Notl para aislar el fragmento
Clal-Notl de 820 pb (fragmento F). Los fragmentos E
y F han sido ligados junto con el vector pBS-SK +,
previamente digerido por Notl y Sacll, para dar el plásmido pEL030
de 4745 pb (figura 28). El plásmido pEL030 ha sido digerido por
Notl para aislar el fragmento Notl-Notl de 1780 pb
(gen NDV HN entero). Este fragmento ha sido ligado, en lugar del
gen lacZ, con el plásmido pCMVb, previamente digerido por
Notl y tratado con la fosfatasa alcalina, para dar el plásmido
pEL032 de 5471 pb (figura 29). El plásmido pEL032 ha sido digerido
por EcoRI y Clal para aislar el fragmento
EcoRI-Clal de 1636 pb (fragmento G). El plásmido
pEL032 ha sido digerido por Clal y Sall para aislar el fragmento
Clal-Sall de 1182 pb (fragmento H). Los fragmentos
G y H han sido ligados junto con el plásmido pEL079 (véase el
ejemplo 5), previamente digerido por EcoRI y Sall, para dar el
plásmido pEL093 de 7890 pb (figura 30). Este plásmido permite la
inserción de la caja de expresión HCMV-IE/NDV HN en
el sitio intergénico 1 del virus
HVT.
Una co-transfección realizada,
como se ha descrito en el ejemplo 8, con el plásmido pEL093 y con
ADN genómico del virus HVT ha conducido al aislamiento y a la
purificación del recombinante vHVT19.
Se ha denominado pNDV81 a un clon procedente del
banco de ADN complementario del genoma del virus de la enfermedad
de Newcastle (véase el ejemplo 11) y que contiene el gen fusión (F)
entero. Ese plásmido ha sido descrito precedentemente y la
secuencia del gen NDV F presente en este clon ha sido publicada
(Taylor J. et al. J.Virol. 1990. 64.
1441-1450). El plásmido pNDV81 ha sido digerido por
Narl y Pstl para aislar el fragmento Narl-Pstl de
1870 pb (fragmento A). Se realiza una PCR con los oligonucleótidos
siguientes:
EL 076 (SEQ ID Nº 23) 5' TGACCCTGTCTGGGATGA
3'
EL 077 (SEQ ID Nº 24) 5'
GGATCCCGGTCGACACATTGCGGCCGCAAGATGGGC 3'
y la matriz pNDV81 para producir un fragmento de
160 pb. Este fragmento es digerido por Pstl y SalI para aislar el
fragmento Pstl-Sall de 130 pb (fragmento B). Los
fragmentos A y B han sido ligados junto con el vector
pBS-SK +, previamente digerido por Clal y Sali,
para dar el plásmido pEL033 de 4846 pb (figura 31). El plásmido
pEL033 ha sido digerido por Notl para aislar el fragmento
NotI-NotI de 1935 pb (gen F entero). Este fragmento
ha sido ligado con el plásmido pCMVb, peviamente digerido por Notl
y tratado con la fosfatasa alcalina, para dar el plásmido pEL034 de
5624 pb (el gen NDV F ha reemplazado al gen lacZ) (figura
32). El plásmido pEL034 ha sido digerido por EcoRl y Kpnl para
aislar el fragmento EcoRl-Kpnl de 866 pb (fragmento
C). El plásmido pEL034 ha sido digerido por Kpnl y SalI para aislar
el fragmento Kpnl-Sall de 2114 pb (fragmento D).
Los fragmentos C y D han sido ligados junto con el plásmido pEL079
(véase el ejemplo 5), previamente digerido por EcoRI y Sall, para
dar el plásmido pEL094 de 8043 pb (figura 33). Ese plásmido permite
la inserción de la caja de expresión HCMV-IE/NDV F
en el sito intergénico 1 del virus
HVT.
Una co-transfección realizada,
como se ha descrito en el ejemplo 8, con el plásmido pEL094 y con
el ADN genómico del virus HVT, ha conducido al aislamiento y a la
purificación del recombinante vHVT20.
Las secuencias situadas aguas arriba del gen MDV
-RNA 1.8 kpb han sido descritas en Bradley G. et al. (J.
Virol. 1989. 63. 2534-2542) (figura 34 y SEQ
ID Nº 25). Una amplificación PCR se ha realizado a partir del ADN
extraído de linfocitos recogidos de pollos infectados por la cepa
MDV RB1B (véase el ejemplo 1) con los oligonucleótidos
siguientes:
MB047 (SEQ ID Nº 26) 5'
GGTCTACTAGTATTGGACTCTGGTGCGAACGC 3'
MB048 (SEQ ID Nº 27) 5'
GTCCAGAATTCGCGAAGAGAGAAGGAACCTC 3'.
El fragmento PCR de 163 pb obtenido de este modo
se ha digerido por EcoRI y Spel, y a continuación se ha ligado con
el plásmido pCD002 (véase el ejemplo 9), previamente digerido por
EcoRI y Spel, para dar el plásmido pBS002 de 6774 pb (figura 35).
El plásmido pBS002 contiene el promotor del gen MDV RNA 1.8 kb
clonado aguas arriba del gen lacZ. Se ha realizado una PCR
con los oligonucleótidos:
MB047 (SEQ ID Nº 26) y
MBO72 (SEQ ID Nº 28) 5'
GTGTCCTGCAGTCGCGAAGAGAGAAGGAACCTC 3'
y la matriz pBS002. El fragmento PCR obtenido de
este modo se ha digerido por Pstl y Spel para aislar un fragmento
Pstl-Spel de 200 pb. Este fragmento ha sido ligado
con el plásmido pEL067 (véase el ejemplo 9), previamente digerido
por PstI y Spel, para dar el plásmido pEL069 (figura 36). El
plásmido pCD007 (véase el ejemplo 10) ha sido digerido por EcoRI y
Xbal para aislar el fragmento EcoRl-Xbal de 2670 pb
(fragmento A). El plásmido pCD011 (véase el ejemplo 10) ha sido
digerido por Notl y Xbal para aislar el fragmento
Notl-Xbal de 180 pb (fragmento B). El plásmido
pEL069 ha sido digerido por Notl y Spel para aislar el fragmento
Notl-Spel de 180 pb (fragmento C). Los fragmentos A,
B y C han sido ligados junto con el plásmido pEL067 (véase el
ejemplo 9), previamente digerido por EcoRI y Spel, para dar el
plásmido pEL080 de 5939 pb (figura 37). El plásmido pEL070 (véase
el ejemplo 9) ha sido digerido por Kpnl y Spel para aislar el
fragmento Kpnl-Spel de 1345 pb (fragmento D). El
plásmido pEL070 ha sido digerido también por Kpnl y Sall para
aislar el fragmento Kpnl-Sall de 1658 pb (fragmento
E). Los fragmentos D y E han sido ligados junto con el plásmido
pEL080, previamente digerido por Sall y Spel, para dar el plásmido
pEL081 de 8938 (figura 38). El plásmido pEL081 ha sido digerido por
EcoRI y Sall para aislar el fragmento EcoRl-Sall de
6066 pb. Este fragmento ha sido ligado con el plásmido pEL079
(véase el ejemplo 5), previamente digerido por EcoRI y Sall, para
dar finalmente el plásmido (pEL095 de 11139 pb (figura 39). Este
plásmido permite insertar la doble caja de expresión
VP2/MCMV-IE/RNA 1.8 kpb/MDV gB en el sito
intergénico 1 del virus
HVT.
Una co-transfección realizada
como se ha descrito en el ejemplo 8, con el plásmido pEL095 y con
el ADN genómico del virus HVT ha conducido al aislamiento y a la
purificación recombinante vHVT21.
El plásmido pEL080 (véase el ejemplo 13) ha sido
digerido por EcoRI y Sall para aislar el fragmento
EcoRl-Sall de 3040 pb (caja RNA 1.8 kpb/DMV gB).
Este fragmento ha sido ligado con el plásmido pEL079 (véase el
ejemplo 5), previamente digerido por EcoRI y Sali, para dar el
plásmido pEL098 de 8140 pb (figura 40). Este plásmido permite la
inserción de la caja RNA 1.8 kpb/MDV gB en el sitio intergénico 1
del virus HVT.
Una co-transfección realizada,
como se ha descrito en el ejemplo 8, con el plásmido pEL098 y con
ADN genómico del virus HVT ha conducido al aislamiento y a la
purificación del recombinante vHVT24.
De acuerdo con la misma estrategia que la que se
ha descrito más arriba para la inserción de cajas de expresión
(genes colocados bajo el control de los promotores
HCMV-IE o MCMV-IE o doble promotor
MCMV-IE/RNA 1.8 kpb) en el sitio intergénico 1, es
posible realizar virus HVT recombinantes que expresan, con un nivel
elevado, las proteínas membrana (M) o cola (S) del virus de la
bronquitis infecciosa aviar (IBV). Preferentemente se lleva a cabo
una construcción en la que el gen IBV S se encuentra bajo la
dependencia del promotor HCMV-IE o del promotor
MCMV-IE, o bien una construcción en la que los genes
IBV M e IBV S están insertados junto con el doble promotor
MCMV-IE/RNA 1.8 kpb en el sitio intergénico 1,
encontrándose el gen M bajo el control del promotor RNA 1.8 kpb y
estando el gen S bajo el control del promotor
MCMV-IE. En esta configuración, el promotor RNA 1.8
kpb es activado por la región activadora del promotor
MCMV-IE.
Se lleva a cabo la obtención de virus HVT
recombinantes que han insertado cajas de expresión de genes
extraños en los sitios intergénicos 2 y 3 según la estrategia
descrita para los ejemplos 8 a 14, pero utilizándose,
respectivamente, los plásmidos pEL078 (sitio intergénico 2) y pEL066
(sitio intergénico 3) en lugar del plásmido pEL079 en los ejemplos
8 a 14, para construir los plásmidos donadores específicos.
La preparación de las vacunas según la invención
puede hacerse por cualquier técnica usual conocida por el técnico
en la materia, por ejemplo por cultivo en frasco giratorio. Se
inoculan frascos giratorios (175 cm^{2}), sembrados con
200\cdot10^{6} células primarias de embrión de pollo, al cabo de
24 horas de incubación a 37ºC con 1 ml de una solución vírica de
virus HVT recombinante que tiene un título de 10^{5} pfu/ml. Tras
una incubación de 4 días a 37ºC, se elimina el sobrenadante, las
células son disociadas con una solución de tripsina versenada, y a
continuación se recolectan. Las células infectadas se centrifugan
entonces. El sobrenadante se elimina y las células son recogidas
con 20 ml de una solución que contiene un estabilizante para
liofilizado (por ejemplo SPGA sacarosa, fosfato, glutamato,
albúmina). Esta mezcla se somete a continuación a la acción de
ultrasonidos, se distribuye en frascos a razón de fracciones de 1
ml y finalmente se liofiliza.
Si es necesario, la vacuna puede ser igualmente
distribuida y congelada en lugar de ser liofilizada.
Se ha utilizado un virus recombinante, obtenido
según la invención y que expresa la proteína VP2 del virus de la
enfermedad Gumboro, para inmunizar por vía intramuscular pollitos
de 1 día. Estos pollitos han sido ensayados, a la edad de 21 días,
con el virus de la enfermedad de Gumboro. Los resultados de
protección han sido evaluados al cabo de 11 días desde el ensayo
comparando las lesiones de la bolsa de Fabricius y la mortalidad
entre los grupos vacunados y el grupo testigo, no vacunado. Los
resultados de este protocolo de vacunación/ensayo han mostrado que
la vacuna obtenida según la invención permite obtener un buen nivel
de protección.
Claims (14)
1. Vacuna viva recombinante aviar, que comprende
a modo de vector un virus HVT (Herpes Virus of Turkeys), que
comprende al menos una secuencia nucleotídica que codifica, y que
expresa, un polipéptido antigénico de un agente patógeno aviar,
insertado en una de las zonas intergénicas 1, 2 y 3 del fragmento
BamH1 1 del genoma del virus HVT, correspondiendo estas zonas
intergénicas con referencia a la cepa HVT particular a la que
corresponde la secuencia nucleotídica de la figura 1, a los
nucleótidos de la figura 1; 1231 a 1383 para el intergen 1, 1942 a
2283 para el intergen 2 y 3082 a 3569 para el intergen 3.
2. Vacuna viva recombinante aviar, según la
reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia
nucleotídica está insertada bajo el control del promotor CMV
immediate early.
3. Vacuna viva recombinante aviar, según la
reivindicación 1, caracterizada porque la citada secuencia
nucleotídica está insertada bajo el control del promotor Marek
RNA1.8.
4. Vacuna viva recombinante aviar, según la
reivindicación 2, caracterizada porque el promotor CMV
immediate early es el promotor humano HCMV IE o el promotor murino
MCMV IE.
5. Vacuna viva recombinante aviar, según una de
las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la
secuencia nucleotídica insertada es una secuencia nucleotídica que
codifica un antígeno elegido entre el grupo de los antígenos de la
enfermedad de Gumboro, de la enfermedad de Marek, de la enfermedad
de Newcastle, de la bronquitis infecciosa, de la laringotraqueitis
infecciosa y de la anemia aviar.
6. Vacuna viva recombinante aviar, según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada
porque la secuencia nucleotídica insertada es una secuencia
nucleotídica que codifica el polipéptido VP2 del virus IBDV.
7. Vacuna viva recombinante aviar, según una
cualquiera de las reivindicaciones 2, y 4 a 6, cuando éstas
dependen de la reivindicación 2, caracterizada porque
comprende, asociado con el promotor CMV immediate early, otro
promotor, estando insertadas las secuencias nucleotídicas en la
región de inserción, una de ellas bajo la dependencia del promotor
CMV immediate early, la otra bajo la dependencia del promotor
asociado, estando dispuestos los dos promotores con el fin de tener
sentidos opuestos de transcripción.
8. Vacuna viva recombinante aviar, según la
reivindicación 7, caracterizada porque el promotor asociado
es el promotor Marek RNA1.8.
9. Vacuna viva recombinante aviar, según la
reivindicación 7 y 8, caracterizada porque la secuencia
nucleotídica insertada bajo el control del promotor CMV immediate
early es una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido VP2
del virus IBDV y porque la secuencia nucleotídica insertada bajo el
control del promotor asociado, es una secuencia nucleotídica que
codifica un antígeno de otra enfermedad aviar.
10. Vacuna viva recombinante aviar, según la
reivindicación 9, caracterizada porque la secuencia
nucleotídica, que codifica un antígeno de otra enfermedad aviar, se
elige entre el grupo de los antígenos de la enfermedad de Marek, de
la enfermedad de Newcastle, de la bronquitis infecciosa, de la
laringotraqueitis infecciosa y de la anemia aviar.
11. Vacuna viva recombinante aviar, según la
reivindicación 7, caracterizada porque el promotor asociado
es un promotor CMV immediate early de origen diferente.
12. Vacuna viva recombinante aviar, según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada
porque la o las secuencias nucleotídicas insertadas se eligen entre
el grupo de las secuencias que codifican los genes:
- -
- VP2, VP3 y VP2 + VP4 + VP3 del virus de la enfermedad de Gumboro,
- -
- gB, gC, gD y gH + gL de los virus de la enfermedad de Marek,
- -
- VP1 (52 kDa) + VP2 (24 kDa) del virus de la anemia aviar,
- -
- S y M del virus de la bronquitis infecciosa, y
- -
- gB, gC, gD y gH + gl del virus de la laringotraqueitis infecciosa.
13. Fórmula de vacuna multivalente que comprende,
en mezcla o para ser mezcladas, al menos dos vacunas vivas
recombinantes aviares, como las que se han definido en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, comprendiendo estas
vacunas secuencias insertadas diferentes.
\newpage
14. Fórmula de vacuna multivalente según la
reivindicación 13, caracterizada porque las secuencias
nucleotídicas insertadas diferentes proceden de patógenos
diferentes.
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