ES2295497T3 - Vacuna viva recombinante aviaria que utiliza como vector un virus del herpes aviario. - Google Patents
Vacuna viva recombinante aviaria que utiliza como vector un virus del herpes aviario. Download PDFInfo
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Abstract
Utilización de un virus HVT (virus del herpes del pavo) recombinante, que comprende al menos una secuencia nucleotídica que codifica, y expresa, un antígeno de un agente patógeno aviario, insertado en una de las zonas intergénicas 1, 2 y 3 del fragmento BamHI I del genoma del virus HVT, estas zonas intergénicas, por referencia a la cepa de HVT concreta que posee la secuencia nucleotídica de la FIGURA 1, corresponden a los nucleótidos de la FIGURA 1 1213 a 1383 para el intergén 1, 1942 a 2283 para el intergén 2, y 3082 a 3569 para el intergén 3, para la producción de una vacuna viva recombinante aviaria, destinada a la vacunación in ovo, de los polluelos de un día, o de los adultos, contra dicho agente patógeno aviario.
Description
Vacuna viva recombinante aviaria que utiliza
como vector un virus del herpes aviario.
La presente invención tiene por objeto la
utilización, para la producción de vacunas de uso aviario, de los
virus HVT (virus del herpes del pavo); en los cuales se ha
insertado, mediante recombinación genética, al menos una secuencia
nucleotídica que codifica, y expresa, un polipéptido antigénico de
un patógeno aviario, en condiciones que pretenden asegurar una
inmunización que conduzca a una protección eficaz del animal
vacunado contra dicho agente patógeno.
Se han propuesto ya un cierto número de vectores
virales aviarios recombinantes con la intención de vacunar las aves
contra agentes patógenos aviarios, particularmente los virus
patógenos, entre los cuales figuran los virus de la enfermedad de
Marek (MDV), de la enfermedad de Newcastle (NDV), de la
laringotraqueitis infecciosa (ILTV), de la enfermedad de Gumboro
(enfermedad Infecciosa de la Bolsa de Fabricio, IBDV), de la
bronquitis infecciosa (IBV), y de la anemia aviaria (CAV).
Los vectores virales utilizados comprenden los
avipox, en particular la viruela aviaria,
(EP-A-0 517 292; H.-G. Heine et
al., Arch. Virol., 131:277-292 (1993);
D.B. Boyle et al., Veterinary Microbiology,
41:173-181 (1994); C.D. Bayliss et al.,
Arch. Virol., 120:193-205 (1991)), los virus
de Marek, particularmente los serotipos 2 y 3 (HVT)
(WO-A-87 04463;
WOA-89 01040;
WO-A-93 25665;
EP-A-0 513 921; J. McMillen,
Poultry Condemnation Meeting, Octubre 1994,
359-363; P.J.A. Sondermeijer et al.,
Vaccine, 11:349-357 (1993); R.W. Morgan et
al., Avian Diseases, 36:858-870 (1992),
y 37:1032-1040 (1993)), o incluso los virus ILTV y
el adenovirus aviario.
Cuando se utilizan para la vacunación, estos
virus recombinantes inducen protecciones de niveles variables,
generalmente débiles o parciales, aunque, en raros casos
determinados, puede demostrarse una protección importante.
Entre las protecciones más difíciles de
garantizar mediante vacunas aviarias vivas recombinantes, se
encuentra aquella contra el virus de la enfermedad de Gumboro, o
virus IBDV. En efecto, si bien existen vacunas vivas atenuadas o
inactivadas clásicas eficaces contra esta enfermedad, ninguna vacuna
viva recombinante ha probado aún una eficacia apropiada.
El genoma del virus de la enfermedad de Gumboro
está constituido por un ARN de doble hebra. El segmento más grande
(segmento A) codifica un poliproteína de 115 kDa, cortada
secundariamente en tres proteínas: VP2 (41 kDa), VP4 (28 kDa), VP3
(32 kDa). VP4 es una proteasa que interviene en la maduración de la
poliproteína de 115 kDa. La posición del sitio de corte entre VP2 y
VP4 está determinada sólo de forma aproximada (M. Jagadish, J.
Virol., 62:1084-1087 (1988)). La proteína VP2 es
un inmunogén que induce anticuerpos neutralizantes y una protección
contra la enfermedad de Gumboro.
Se ha propuesto ya la inserción de los genes
codificantes de las proteínas inmunogénicas del IBDV en diversos
vectores vivos: EP-A-0 517 292
(inserción de secuencias codificantes de la VP2 o de la poliproteína
en un avipox); C.D. Bayliss 1991, H.-G. Heine 1993 y D.B. Boyle
1994 ver más arriba (VP2 en la viruela aviar).
Los virus de la enfermedad de Marek se han
propuesto igualmente en WO-A-90
02802 y WO-A-90 02803 (diversos
sitios de inserción, tales como el gC, TK, RR1, RR2), en las
solicitudes de patentes francesas nº 90 03105 (RR2) y 90 11146
(US3), al igual que, particularmente, en las solicitudes de patentes
WO-A-87 04463 y
WO-A-89 01040 (BamHI #16 y #19), y
WO-A-93 25655 (US2).
R.J. Isfort et al. (Virology,
203:125-133 (1994)) han determinado un cierto número
de sitio de integración de retrovirus en el genoma del HVT, sitios
que están situados en los fragmentos de restricción BamH I F, A y
I.
Se han propuesto otros ejemplos de sitios de
inserción en el genoma del HVT en la
EP-A-0 431 668 (región US) y EP 4
200 384 (gA).
FR-A-2 697 534
describe un virus recombinante HVT que expresa una secuencia que
codifica la proteína VP2 del IBDV insertada en el US2 (Secuencia
Única Corta, BaM HI A), bajo el control del promotor IE del HCMV.
Este virus recombinante expresa in vitro la proteína, pero no
se ha ensayado in vivo en un protocolo de vacunación.
Darteil, R. et al., Virology,
211:481-490 (1995), divulga la utilización de dos
virus HVT recombinantes que expresan la proteína VP2 del IBDV,
insertada en un locus no esencial del genoma del HVT en el fragmento
BamHI K1, bien en la subunidad pequeña del gen de la reductasa de
ribonucleasa (RR2) sin promotor exógeno (virus vHVT001), bien en el
locus del gen bajo el control del promotor IE (inmediato temprano)
del CMV humano, para la producción de una vacuna viva recombinante
aviaria, destinada a la vacunación de polluelos de un día o de
adultos contra el virus de la enfermedad de Gumboro (IBDV). Los
polluelos SPF de un día se han vacunado mediante inyección
intramuscular única con dosis variables, y se han ensayado a la edad
de 21 días por vía intraocular con un virus IBDV de la cepa 52/70.
Los resultados se han comparado con los de animales control no
vacunado o vacunados con la vacuna inactivada GUMBORIFFA (ND), y han
mostrado una protección por el virus recombinante vHVT002 capaz de
inducir la producción de anticuerpos anti-VP2
neutralizantes, y de reducir la mortalidad y las lesiones clínicas,
mientras que el vHVT001 sólo ofrece una protección parcial. La
comparación de los dos virus HVT recombinantes muestra que el sitio
de inserción del
gen exógeno, así como el promotor utilizado para controlar la expresión de este gen, son dos parámetros importantes.
gen exógeno, así como el promotor utilizado para controlar la expresión de este gen, son dos parámetros importantes.
Se han utilizado diversos promotores, incluyendo
los generalmente disponibles comercialmente, en las diferentes
construcciones de la técnica previa, entre los cuales se hallan los
promotores PRV gX, HCMV IE (inmediatamente temprano del CMV
humano), herpes simplex alfa-4, FPV P.E/L (promotor
de la viruela aviar) (H. Heine et al., Arch. Virol.,
131:277-292 (1993)), P7.5 (C. Bayliss et al.,
Arch. Virol., 120:193-205 (1991)), y el
virus P11 de la viruela vacuna (D. Boyle et al., Vet.
Microb., 41:173-181 (1994)), procedente de la
secuencia LTR del virus RSV (Virus del sarcoma de Rous), precoz del
SV40, así como los promotores MDV o HVT, tales como los promotores
de los genes gB, gC, TK, RR2, etc., sin que haya podido aparecer una
regla, particularmente en el caso de las construcciones en el HVT.
Las secuencias de ciertos promotores pueden inhibir la replicación
de los vectores recombinantes del HVT o MDV (D.R. Marshall et
al., J. Vir. Meth., 40:195-204 (1992) y
Virology, 195:638-648 (1993)). Entre los
promotores citados, un cierto número, como por ejemplo el SV40, LTR
RSV y PRV gX, han mostrado una cierta eficacia, al igual que
ciertos promotores propios de ciertos genes del virus Marek,
particularmente del serotipo 3. Existe una necesidad en la técnica
de desarrollar otros vectores HVT para la vacunación in ovo, para
los polluelos de un día, y en los adultos, a fin de ofrecer un
abanico de vacunación más amplio, y de desarrollar una protección
apropiada contra diversos patógenos aviarios.
La invención ha permitido poner a punto una
vacuna viva recombinante a base de un vector HVT, en el cual se ha
insertado al menos una secuencia que codifica un inmunogén aviario,
en particular la proteína VP2 del IBDV. Una vacuna tal que
incorpore una secuencia codificante para la VP2 debe asegurar una
protección satisfactoria de los animales contra la enfermedad de
Gumboro, a saber, protección con respecto de la mortalidad y de las
lesiones de la bolsa de Fabricio.
La presente invención tiene por objeto la
utilización, para la producción de una vacuna viva recombinante
aviaria, de un virus del herpes aviario HVT, el cual comprende al
menos una secuencia nucleotídica que codifica, y expresa, un
polipéptido antigénico de un agente patógeno aviario, insertado en
el fragmento de restricción BamHI I del HVt, a saber, dentro de una
de las tres regiones intergénicas 1, 2 y 3, particularmente bajo el
control del promotor inmediato temprano del CMV. El fragmento BamHI
del HVT ha sido descrito por A.E. Buckmaster en J. Gen.
Virol., 69:2033-2042 (1988).
Estas zonas intergénicas corresponden, por
referencia a la cepa HVT, particularmente aquella a la que
corresponde la secuencia nucleotídica de la Figura 1, a los
nucleótidos de la Figura 1, 1213 a 1383 para el intergén 1, 1942 a
2283 para el intergén 2, y 3082 a 3569 para el intergén 3.
Por inserción en la región de inserción, se
entiende particularmente inserción sin supresión o con supresión de
algunas bases de las zonas intergénicas.
Por promotor inmediato temprano (IE) del CMV se
entiende el fragmento mencionado en los ejemplos, así como sus
subfragmentos que conservan la misma actividad promotora.
El promotor IE del CMV puede ser el promotor
humano (HCMV IE) o el promotor múrido (MCMV IE), o aún un promotor
CMV IE de otro origen, por ejemplo, de rata o de cobaya.
La secuencia nucleotídica insertada en el vector
Marek para expresarla, puede ser cualquier secuencia codificante de
un polipéptido antigénico, de un agente patógeno aviario, capaz, una
vez expresada en las condiciones favorables proporcionadas por la
invención, de asegurar una inmunización que conduzca a una
protección eficaz del animal vacunado contra el agente patógeno.
Por tanto, se podrán insertar, en las condiciones de la invención,
las secuencias nucleotídicas que codifican los antígenos de interés
para una enfermedad determinada.
Las vacunas obtenidas según la invención podrán
destinarse a la vacunación in ovo, de polluelos de 1 día o más, y
de adultos.
La invención puede usarse particularmente para
la inserción de una secuencia nucleotídica codificante apropiada
para el polipéptido VP2 del virus IBDV. Se obtiene de ese modo una
vacuna viva recombinantes que asegura, además de una protección
contra la enfermedad de Marek, una protección satisfactoria contra
la enfermedad de Gumboro. Si se desea, se puede insertar también
una secuencia codificante de otro antígeno del IBDV, tal como la
VP3 o incluso la poliproteína VP2 + VP4 + VP3, estas otras
posibilidades no son las preferidas.
La vacuna recombinante contra la enfermedad de
Gumboro se presentará preferiblemente en de 10 a 10^{4}
pfu/dosis.
Otros casos preferidos de la invención son la
inserción de secuencias nucleotídicas que codifican antígenos del
virus de la enfermedad de Marek, en particular los genes gB, gC, gD,
y gH+gL (WO-A-90 02803), del virus
de la enfermedad de Newcastle, en particular los genes F y HN, del
virus de la bronquitis infecciosa (IBV), en particular los genes S
y M (M. Binns et al., J. Gen. Virol.,
66:719-726 (1985); M. Boursnell et al.,
Virus Research, 1:303-313 (1984)), del virus
de la anemia aviaria (CAV), en particular de la VP1 (52 kDa) + VP2
(24 kDa) (N.H.M. Noteborn et al., J. Virol.,
65:3131-3139 (1991)), y del virus de la
laringotraqueitis infecciosa (ILTV), en particular el gB
(WO-A-90 02802), gC, gD y gH
+gL.
Las dosis serán preferiblemente las mismas que
las de la vacuna de Gumboro.
Según un desarrollo ventajoso de la invención,
se asocia al promotor IE del CMV otro promotor, de forma que los
promotores tengan sentidos de transcripción opuestos, los que
permite insertar, en la zona de inserción, dos secuencias
nucleotídicas, una bajo dependencia del promotor IE del CMV, la otra
bajo dependencia del promotor asociado. Esta construcción es
notable por el hecho de que la presencia del promotor IE del CMV, y
particularmente de su parte activadora (potenciador), activa la
transcripción inducida por el promotor asociado. Un promotor
asociado preferido es el promotor Marek RNA1.8, cuya actividad de
transcripción se ha visto multiplicada aproximadamente por 4,4 en
estas condiciones.
Un caso interesante de la invención es una
vacuna que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la VP2
del IBDV bajo control del IE del CMV, y una secuencia nucleotídica
que codifica un antígeno de otra enfermedad aviaria,
particularmente aquéllas citadas más arriba, bajo el control del
otro promotor.
También se pueden montar cabeza con cola dos
promotores IE del CMV de orígenes diferentes.
El promotor RNA1.8 puede utilizarse también
solo, en lugar del promotor IE del CMV, particularmente para las
vacunas contra la enfermedad de Marek, la enfermedad de Newcastle,
la laringotraqueitis infecciosa, la bronquitis infecciosa, y la
anemia aviaria.
La invención se describirá a continuación más
detalladamente con la ayuda de ejemplos de realización no
limitantes, tomados en referencia a las figuras, entre las
cuales:
Figura 1: secuencia del fragmento BamHI I del
HVT
Figura 2: plásmido pEL039
Figura 3: plásmido pEL077
Figura 4: plásmido pEL079
Figura 5: plásmido pEL076
Figura 6: plásmido pEL078
Figura 7: plásmido pEL054
Figura 8: plásmido pEL055
Figura 9: plásmido pEL062
Figura 10: plásmido pEL066
Figura 11: plásmido pEL022
Figura 12: plásmido pEL023
Figura 13: plásmido pEL024
Figura 14: plásmido pCMVb
Figura 15: plásmido pEL026
Figura 16: plásmido pEL090
Figura 17: plásmido pCD002
Figura 18: plásmido pCD009
Figura 19: plásmido pEL068
Figura 20: plásmido pEL070
Figura 21: plásmido pEL091
Figura 22: plásmido pCD011
Figura 23: plásmido pCD020
Figura 24: plásmido pEL092
Figura 25: secuencia del gen HN del NDV
Figura 26: plásmido pEL028
Figura 27: plásmido pEL029bis
Figura 28: plásmido pEL030
Figura 29: plásmido pEL032
Figura 30: plásmido pEL093
Figura 31: plásmido pEL033
Figura 32: plásmido pEL034
Figura 33: plásmido pEL094
Figura 34: secuencia del promotor MDV RNA 1,8
kpb
Figura 35: plásmido pBS002
Figura 36: plásmido pEL069
Figura 37: plásmido pEL080
Figura 38: plásmido pEL081
Figura 39: plásmido pEL095
Figura 40: plásmido pEL098
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. Nº ID. 1: secuencia del fragmento BamHI 1
del HVT
SEC. Nº ID. 2: oligonucleótido EL102
SEC. Nº ID. 3: oligonucleótido EL161
SEC. Nº ID. 4: oligonucleótido EL147
SEC. Nº ID. 5: oligonucleótido EL162.
SEC. Nº ID. 6: oligonucleótido EL154
SEC. Nº ID. 7: oligonucleótido EL163
SEC. Nº ID. 8: oligonucleótido EL164
SEC. Nº ID. 9: oligonucleótido EL165
SEC. Nº ID. 10: oligonucleótido EL132
SEC. Nº ID. 11: oligonucleótido EL133
SEC. Nº ID. 12: oligonucleótido MB070
SEC. Nº ID. 13: oligonucleótido MB071
SEC. Nº ID. 14: oligonucleótido CD001
SEC. Nº ID. 15: oligonucleótido CD002
SEC. Nº ID. 16: oligonucleótido CD003
SEC. Nº ID. 17: oligonucleótido CD004
SEC. Nº ID. 17: secuencia del gen HN del NDV
SEC. Nº ID. 19: oligonucleótido EL071
SEC. Nº ID. 20: oligonucleótido EL073
SEC. Nº ID. 21: oligonucleótido EL074
SEC. Nº ID. 22: oligonucleótido EL075
SEC. Nº ID. 23: oligonucleótido EL076
SEC. Nº ID. 24: oligonucleótido EL077
SEC. Nº ID. 25: secuencia del promotor MDV RNA
1,8 kpb
SEC. Nº ID. 26: oligonucleótido MB047
SEC. Nº ID. 27: oligonucleótido MB048
SEC. Nº ID. 28: oligonucleótido MB072
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las construcciones de plásmidos se han
realizado utilizando las técnicas estándares de biología molecular
descritas por Sambrook J. et al., (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). Todos los fragmentos de
restricción utilizados en la presente invención se han aislado
utilizando el equipo "Geneclean" (BIO101 Inc., La Jolla,
CA).
El virus utilizado como virus progenitor es la
cepa FC126 del virus del herpes del pavo (HVT), aislada Dr Witter
del Regional Poultry Research Laboratory (USDA, East Lansing,
Michigan), a partir de un grupo de pavos de 23 semanas (Witter R.L.
et al., Am. J. Vet. Res., 31:525-538
(1970)). Las condiciones de cultivo de estos virus son las
descritas en otro lugar (solicitud de patente francesa 90
03105).
La totalidad de la sangre de un polluelo,
tratado a los 7 días con la cepa RB1B del MDV, se recolectó con una
jeringa sobre anticoagulante (solución de heparina a 100 Ul/ml) 14
días después de la infección. Esta sangre se centrifugó a
continuación a 30 g durante 15 minutos, a temperatura ambiente. El
plasma, así como la "capa leuco-plaquetaria",
se lavaron y diluyeron en PBS esterilizado para obtener un volumen
final de 10 ml. Después de una centrifugación de 15 minutos a 150
g, el precipitado celular se resuspendió en 2 ml de medio de
cultivo 199 (Gibco-BRL Cat#
042-01183M) que contenía un 2% de suero bovino fetal
(SVF).
El ADN total de los linfocitos infectados se
extrajo a continuación según la técnica descrita por R. Morgan
et al. (Avian Diseases, 34:345-351
(1990)), y puede servir directamente de matriz para los experimentos
de PCR. Para la clonación de fragmentos genómicos del virus MVD, se
ha cultivado la cepa RB1 B sobre CEP, y el ADN viral se ha
preparado a partir de partículas víricas purificadas, como
describieron Lee Y. et al. (J. Gen. Virol.,
51:245-253 (1980)).
El virus MCMV, cepa Smith, se obtuvo de la
American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. (ATCC
Nº VR-194). Este virus se cultivó sobre células
embrionarias de ratón Balb/C, y el ADN viral de este virus se
preparó como describieron Ebeling A. et al. (J.
Virol., 47:421-433 (1983)).
El ADN vírico utilizado para los experimentos de
transfección se ha preparado según la técnica descrita por R.
Morgan et al. (Avian Diseases,
34:345-351 (1990)) a partir de un cultivo de CEP
secundarios (CEP II) infectados con la cepa FC126 del virus
HVT.
El fragmento BamHI 1 de 5,8 kpb del virus HVT
cepa FC126 (Igarashi T. et al., J. Gen. Virol.,
70:1789-1804 (1989)) se aisló mediante Geneclean, y
se clonó en el sitio BamHI del vector pBS-SK+ para
rendir el plásmido pEL037. La secuencia de este fragmento ha sido
establecida en su totalidad (5838 pb) (Figura 1 y SEC. Nº ID. 1).
Se han identificado 6 marcos de lectura abiertos (= "open reading
frames = ORF") en esta secuencia. El estudio de proteínas
potencialmente codificadas por estos ORF ha revelado que algunas de
estas proteínas presentan una homología con proteínas codificadas
por los ORF presentes en otros alfavirus del herpes. El primer ORF
(ORF1) (posición 676 a posición 1209 sur SEQ ID Nº 1) presenta una
homología con los ORF HSV-1 UL55,
EHV-1 gen 4 y VZV gen 5, y codifican una proteína
teórica HVT UL55 de 178 aminoácidos (aa). El ORF2 está situado
desde la posición 1941 a la posición 1387, sobre la secuencia SEC.
Nº ID. 1, y codifica una proteína de 185 aa homóloga de la proteína
codificada por el ORF EHV-1 gen 3. El ORF3 está
incompleto. Está situado desde la posición 5838 a 3573, sobre la
SEC. Nº ID. 1, y presenta homología con el ORF 21 del MDV (Ross N.
et al., Virus Genes, 7:33-51 (1993)).
Otros tres ORF identificados sobre esta secuencia: ORF4 (posición
1403 a posición 1957 (proteína de 185 aa)), ORF5 (posición 3081 a
posición 2287 (proteína de 265 aa)), y ORF6 (incompleto; posición
479 a posición 1) no tienen homólogos en las bases de datos de
secuencias. La organización genómica del fragmento BamHI I del
virus HVT, cepa FC126, es tal que existen tres regiones intergénicas
que pueden utilizarse como sitios de inserción para los casetes de
expresión de genes ajenos.
Existe una región intergénica (región
intergénica 1) entre el ORF UL55 y el ORF HVT gen 3. Existe una
segunda región intergénica (región intergénica 2) entre el ORF HVT
gen 3 y el ORF de 265 aa. Existe una tercera región intergénica
(región intergénica 3) entre el ORF de 265 aa y el ORF 3 HVT. Estas
tres regiones son utilizables para insertar casetes de expresión
sin afectar la replicación in vivo de los virus HVT
recombinantes obtenidos de este modo. Más abajo se describen
ejemplos de construcciones de plásmidos donantes para estas regiones
intergénicas 1, 2 y 3.
El plásmido pEL037 se digirió con BamHI y EcoRI
para aislar los fragmentos BamHI-EcoRI de 2672 pb y
2163 pb. Estos fragmentos se ligaron con el vector
pBS-SK+, previamente digerido con BamHI y EcoRI,
para originar respectivamente los plásmidos pEL039 de 5167 pb y
pEL040 de 6104 pb. El plásmido pEL039 (Figura 2) se digirió con
BamHI y PstI para aislar el fragmento BamHI-PstI de
997 pb (fragmento A). Se realizó una PCR con los oligonucleótidos
siguientes:
EL102 (SEC Nº ID.: 2)
5' CATTATAAGACCAACGTGCGAGTC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
EL161 (SEC Nº ID.: 3)
5' GTTCACGTCGACAATTATTTTATTTAATAAC 3'
y la matriz pEL039 para producir un fragmento de
420 pb. Este fragmento se digirió con PstI y SalI para aislar un
fragmento PstI-SalI de 250 pb (fragmento B). Los
fragmentos A y B se ligaron juntos con el vector
pBSll-SK+ (Stratagene), previamente digerido con
BamHI y SalI, para originar el plásmido pEL077 de 4160 pb (Figura
3). El plásmido pEL039 se digirió con BstBI y ScaI para aislar un
fragmento BstBI-ScaI (extremos romos) de 475 pb
(fragmento C). Se realizó una PCR con los oligonucleótidos
siguientes:
EL147 (SEC Nº ID.: 4)
5' AAGATAATGGGCTCCCGCTGTTC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
EL162 (SEC Nº ID.: 5)
5' TAATTGTCGACCCCGGGGAATTCGTTTAATGTTAGTTTATTC
3'
y la matriz pEL039 para producir un fragmento de
715 pb. Este fragmento se digirió con BstBI y SalI para aislar el
fragmento BstBI-SalI de 465 pb (fragmento D). Los
fragmentos C y D se ligaron juntos con el plásmido pEL077,
previamente digerido con ApaI, reparado con la polimerasa Klenow, y
digerido con SalI, para originar el plásmido pEL079 de 5082 pb
(figura 4). Este plásmido contiene un poli-engarce
EcoRI-SmaI-SalI en el sitio
intergénico 1.
El plásmido pEL039 (Ejemplo 5) se digirió con
BstBI y PstI para aislar el fragmento BstBI-PstI de
715 pb (fragmento A). Se realizó una PCR con los oligonucleótidos
siguientes:
EL154 (SEC Nº ID.: 6)
5' GAAATGCAAACTAACATTATTGTC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
EL163 (SEC Nº ID.: 7)
5' GTGTAAATAGTCGACAATATAGATAACGGGC 3'
y la matriz pEL039 para producir un fragmento de
500 pb. Este fragmento se digirió con BstBI y SalI para aislar un
fragmento BstBI-SalI de 430 pb (fragmento B). Los
fragmentos A y B se ligaron juntos con el vector pBSllSK+,
previamente digerido con PstI y SalI, para originar el plásmido
pEL076 de 4081 pb (Figura 5).
Se realizó una PCR con los oligonucleótidos
siguientes:
EL164 (SEC Nº ID.: 8)
5' CTATATTGTCGACCCCGGGGAATTCATCGACATGATTAAATAC
3'
\vskip1.000000\baselineskip
EL165 (SEC Nº ID.: 9)
5' CAATGAAGAAATATTTTCTTTGTTCCTTGAAATGC 3'
y la matriz pEL039 para producir un fragmento de
565 pb. Este fragmento se digirió con SalI y SspI para aislar el
fragmento SalI-SspI de 535 pb. Este fragmento se
ligó con el plásmido pEL076, previamente digerido con ApaI,
reparado con la polimerasa Klenow, y digerido por SalI, para
originar el plásmido pEL078 de 4598 pb (Figura 6). Este plásmido
contiene un poliengarce
EcoRI-SmaI-SalI en la región
intergénica 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pEL040 (ver Ejemplo 5) se digirió
con NcoI y SphI para aislar el fragmento NcoI-SphI
de 1468 pb. Este fragmento se ligó con el plásmido pUC BM20
(Boehringer Mannheim Cat# 1219235), previamente digerido con NcoI y
SphI, para originar el plásmido pEL054 de 4182 pb (Figura 7). El
plásmido pEL040 se digirió con EcoRI y SphI para aislar el
fragmento EcoRI-SphI de 614 pb. Este fragmento se
ligó con el plásmido pUC BM20, previamente digerido con EcoRI y
SphI, para originar el plásmido pEL055 de 3263 pb (Figura 8). El
plásmido pEL055 se digirió con EcoRI, se reparó con la polimerasa
Klenow, se ligó consigo mismo, se digirió con HindIII, se reparó
con la polimerasa Klenow, y finalmente se ligó consigo mismo para
originar el plásmido pEL062 de 3279 pb (Figura 9). El plásmido
pEL054 se digirió con NocI y SalI para aislar el fragmento
NocI-SalI de 1492 pb (fragmento A). Los dos
oligonucleótidos siguientes:
EL132 (SEC Nº ID.: 10)
5' CCGAATTCATATAAGCTTACGTG 3'
\vskip1.000000\baselineskip
EL133 (SEC Nº ID.: 11)
5' TCGACACGTAAGCTTATATGAATTCGGCATG 3'
se hibridaron entre ellos para producir el
fragmento SalI-SphI de 24 pb (fragmento B). Los
fragmentos A y B se ligaron juntos con el plásmido pEL062,
previamente digerido con NcoI y SphI, para originar el plásmido
pEL066 de 4787 pb (Figura 10). Este plásmido contiene un poliengarce
EcoRI-HindIII-SalI en la región
intergénica 3.
El plásmido pEL004 (= plásmido pGH004 descrito
en la solicitud de patente francesa 92.13109), que contenía el gen
VP2 del IBDV en forma de una casete BamHI-HindIII,
se digirió con BamHI y XbaI para aislar el fragmento
BamHI-XbaI (gen VP2 truncado) de 1104 pb. Este
fragmento se clonó en el vector pBS-SK+, previamente
digerido con XbaI y BamHI, para originar el plásmido pEL022 de 4052
pb. El vector pBS-SK+ se dirigió con EcoRV y XbaI,
a continuación se ligó consigo mismo para originar el
pBS-SK* (modificado). El plásmido pEL004 se digirió
con KpnI y HindIII para aislar el fragmento
KpnI-HindIII de 1387 pb que contenía el gen VP2
completo del IBDV. Este fragmento se clonó en el vector
pBS-SK*, previamente digerido con KpnI y HindIII,
para originar el plásmido pEL023 de 4292 pb (Figura 12). El
plásmido pEL022 se digirió con BamHI y NotI para aislar el fragmento
BamHI-NotI de 1122 pb (fragmento A). El plásmido
pEL023 se digirió con BamHI y NotI para aislar el fragmento
BamHI-NotI de 333 pb (fragmento B). Los fragmentos
A y B se ligaron juntos con el vector pBS-SK+,
previamente digerido con NotI y tratado con la fosfatasa alcalina,
para originar el plásmido pEL024 de 4369 pb (Figura 13). El
plásmido pEL024 se digirió con NotI para aislar el fragmento
NotI-NotI de 1445 pb. Este fragmento se ligó con el
plásmido pCMVb (Clontech Cat# 6177-1) (Figura 14),
previamente digerido con NotI, para originar el plásmido pEL026 de
5095 pb (Figura 15). El plásmido pEL026 se digirió con EcoRI, SalI y
XmnI para aislar el fragmento EcoRI-SalI de 2428
pb. Este fragmento se ligó con el plásmido pEL079 (ver el Ejemplo
5), previamente digerido con EcoRI y SalI, para originar el
plásmido pEL090 de 7514 pb (Figura 16). Este plásmido permite la
inserción de la casete de expresión HCMV-IE/IBDV VP2
en el sitio intergénico 1 del virus HVT. A continuación se
transfectaron unas células CEP primarias de 24 horas con la mezcla
siguiente: 1 \mug de plásmido pEL090 linealizado + 5 \mug de
ADN vírico de HVT en 300 \mul de medio OptiMEM (Gibco BRL Cat#
041-01985H), y 100 \mug de LipofectAMINE diluida
en 300 \mul de medio (volumen final de la mezcla = 600 \mul).
Estos 600 \mul se han diluido a continuación en 3 ml (volumen
final) de medio, y se han sembrado sobre 3\cdot10^{6} CEP I. La
mezcla se dejó en contacto con las células durante 5 horas, después
se eliminó y se remplazó con 5 ml de medio de cultivo. Las células
se dejaron entonces en cultivo durante 3 días a +37ºC, después de
trataron con pronasa, se mezclaron con CEP II frescas (mezcla 3:1),
y se sembraron de nuevo sobre 1 placa de 96 pocillos. Esta placa se
dejó en cultivo durante 3 días, a continuación se trataron las
células con pronasa, se mezclaron con CEP II frescas, y se
sembraron de nuevo sobre 2 placas de 96 pocillos, originando cada
pocillo inicial dos pocillos hijos. Las placas de 96 pocillos
estuvieron en cultivo justo hasta la aparición de un efecto
citopático. Después de 72 horas de cultivo, una de las dos placas de
96 pocillos se fijo con acetona al 9% durante 30 minutos, y se
realizó una reacción de inmunofluorescencia indirecta (IFI) con un
anticuerpo monoclonal anti-VP2 para buscar las zonas
que expresaban la proteína VP2. Los pocillos "hijos" de los
pocillos que presentaban zonas positivas en el IFI se trataron con
pronasa, se mezclaron con CEP II frescas, y se depositaron en
dilución límite sobre placas de 96 pocillos. Después de 3 días de
cultivo, los pocillos que presentaban un efecto citopático se
trataron con pronasa, se mezclaron con CEP II, y se resembraron
sobre placas de 96 pocillos, dando cada pocillo inicial 2 pocillos
hijos. 3 días después, las zonas que expresaban la proteína VP2 se
buscaron de nuevo tal como antes mediante IFI sobre una de las 2
placas hijas.
En general, 4 ciclos de aislamiento sucesivos
(recogida de un pocillo, resembrado, control mediante la IFI,
trasplante a un pocillo hijo...) son suficientes para obtener virus
recombinantes en donde la totalidad de la progenie presenta una
fluorescencia específica. Un cultivo vírico, que había dado un 100%
de placas positivas en IFI con un anticuerpo monoclonal
anti-VP2, se denominó vHVT16. El ADN genómico de
este virus recombinante se caracterizó a nivel molecular mediante
técnicas clásicas de PCR y de transferencia Southern, utilizando
los oligonucleótidos y sondas de ADN apropiados.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pCMVb (Figura 14) se digirió con
SalI y SmaI para aislar el fragmento SalI-SmaI de
3679 pb que contenía el gen lacZ, así como la señal de
poliadenilación del gen tardío del virus SV40. Este fragmento se
insertó en el vector pBS-SK+, previamente digerido
con SalI y EcoRV, para originar el plásmido pCD002 de 6625 pb
(Figura 17). Este plásmido contiene el gen indicador lacZ, pero
ningún promotor está situado cadena arriba respecto este gen. El
ADN genómico vírico del virus MCMV se preparó como se describió en
el Ejemplo 2, y se digirió con PstI para aislar el fragmento
PstI-PstI de 2285 pb. Este fragmento se clonó en el
vector pBS-SK +, previamente digerido con PstI y
tratado con la fosfatasa alcalina, para originar el plásmido pCD004.
El plásmido pCD004 se digirió con HpaI y PstI para aislar el
fragmento HpaI-PstI de 1389 pb, el cual contiene la
región promotora/activadora del gen
Inmediato-Temprano del citomegalovirus múrido
(Citomegalovirus múrido = MCMV) (Dorsch-Häsler K.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
82:8325-8329 (1985), y solicitud de patente
WO-A-87/03905). Este fragmento se
clonó en el vector pCD002, previamente digerido con PstI y SmaI,
para originar el plásmido pCD009 de 8007 pb (Figura 18).
Se obtuvo un oligonucleótido de doble hebra
mediante la hibridación de los dos oligonucleótidos siguientes:
MB070 (SEC Nº ID.: 12)
5'
CGAATTCACTAGTGTGTGTCTGCAGGCGGCCGCGTGTGTGTCGACGGTAC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
MB071 (SEC Nº ID.: 13)
5'
CGTCGACACACACGCGGCCGCCTGCAGACACACACTAGTGAATTCGAGCT 3'
Este oligonucleótido de doble hebra se ligó en
el vector pBS-SK+, previamente digerido con KpnI y
SacI, para originar el plásmido pEL067. El plásmido pCD009 se
digirió con PstI y SpeI para aislar el fragmento
PstI-SpeI de 1396 pb. Este fragmento se ligó con el
plásmido pEL067, previamente digerido con PstI y SpeI, para originar
el plásmido pEL068 de 4297 pb (Figura 19). El plásmido pEL026 (ver
el Ejemplo 8) se digirió con HindIII y SalI para aislar el
fragmento HindIII-SalI de 235 pb (fragmento B). Los
fragmentos A y B se ligaron juntos con el plásmido pEL068,
previamente digerido con NotI y SalI, para originar el plásmido
pEL070 de 5908 pb (Figura 20). El plásmido pEL070 se digirió con
EcoRI, SalI y XmnI para aislar el fragmento
EcoRI-SalI de 3035 pb. Este fragmento se ligó con
el plásmido pEL079 (ver el Ejemplo 5), previamente digerido con
EcoRI y SalI, para originar el plásmido pEL091 de 8109 pb (Figura
21). Este plásmido permite la inserción de la casete de expresión
MCMV-IE/IBDV VP2 en el sitio intergénico 1 del virus
HVT.
Una cotransfección realizada, como se describió
en el Ejemplo 8, con el plásmido pEL091 y el ADN genómico del virus
HVT, ha conducido al aislamiento y la purificación del vHVT17
recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento EcoRI-SalI de 3,9
kpb del ADN genómico del virus MDV, cepa RB1 B, que contenía el gen
gB del MDV (secuencia publicada por Ross N. et al., J.
Gen. Virol., 70:1789-1804 (1989)) se ligó con el
vector pUC13, previamente digerido con EcoRI y SalI, para originar
el plásmido pCD007. Este plásmido se digirió con SacI y XhoI para
aislar el fragmento SacI-XhoI de 2260 pb (parte
central del gen gB = fragmento A). Se realizó una PCR con los
oligonucleótidos siguientes:
CD001 (SEC Nº ID.: 14)
5' GACTGGTACCGCGGCCGCATGCACTTTTTAGGCGGAATTG
3'
\vskip1.000000\baselineskip
CD002 (SEC Nº ID.: 15)
5' TTCGGGACATTTTCGCGG 3'
y la matriz pCD007 para producir un fragmento de
222 pb. Este fragmento se digirió con KpnI y XbaI para aislar un
fragmento KpnI-XbaI de 190 pb (extremo 5' del gen gB
= fragmento B). Se realizó otra PCR con los oligonucleótidos
siguientes:
CD003 (SEC Nº ID.: 16)
5' TATATGGCGTTAGTCTCC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
CD004 (SEC Nº ID.: 17)
5' TTGCGAGCTCGCGGCCGCTTATTACACAGCATCATCTTCTG
3'
y la matriz pCD007 para producir un fragmento de
195 pb. Este fragmento se digirió con SacI y SacII para aislar un
fragmento SacI-SacII de 162 pb (extremo 3' del gen
gB = fragmento C). Los fragmentos A, B y C se ligaron juntos con el
vector pBS-SK+, previamente digerido con KpnI y
SacI, para originar el plásmido pCD011 de 5485 pb (Figura 22). El
plásmido pCD011 se digirió con NotI para aislar el fragmento
NotI-NotI de 2608 pb (gen gB completo del MDV).
Este fragmento se ligó con el plásmido pCMVb, previamente digerido
con NotI y tratado con la fosfatasa alcalina, para originar el
plásmido pCD020 de 6299 pb (Figura 23) (En este plásmido, el gen gB
del MDV remplaza el gen lacZ). El plásmido pCD020 se digirió con
EcoRI y SalI para aislar el fragmento EcoRI-SalI de
3648 pb. Este fragmento se ligó con el plásmido pEL079 (ver el
Ejemplo 5), previamente digerido con EcoRI y SalI, para originar el
plásmido pEL092 de 8718 pb (Figura 24). Este plásmido permite la
inserción de la casete de expresión HCMV-IE/MDV gB
en el sitio intergénico 1 del virus HVT.
Una co-transfección realizada,
como se describió en el Ejemplo 8, con el plásmido pEL092 y el ADN
genómico del virus HVT, ha conducido al aislamiento y la
purificación del vHVT18 recombinante.
La constitución de una biblioteca de ADN
complementario del genoma del virus de la enfermedad de Newcastle
(NDV), cepa Texas, se realizó tal como describieron Taylor J. et
al. (J. Virol., 64:1441-1450 (1990)). Un
clon pBR322 que contenía el final del gen de fusión (F), la
totalidad del gen hemaglutinina-neuraminidasa (HN),
y el inicio del gen de la polimerasa, se ha identificado como pHN01.
La secuencia del gen HN del NDV presente en este clon se muestra en
la Figura 25 (SEC. Nº ID.: 18). El plásmido pHN01 se digirió con
SphI y XbaI para aislar el fragmento SphI-XbaI de
2520 pb. Este fragmento se ligó con el vector pUC19, previamente
digerido con SphI y XbaI, para originar el plásmido pHN02 de 5192
pb. El plásmido pHN02 se digirió con ClaI y PstI para aislar el
fragmento ClaI-PstI de 700 pb (fragmento A). Se
realizó una PCR con los oligonucleótidos siguientes:
EL071 (SEC Nº ID.: 19)
5' CAGACCAAGCTTCTTAAATCCC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
EL073 (SEC Nº ID.: 20)
5' GTATTCGGGACAATGC 3'
y la matriz pHN02 para producir un fragmento PCR
de 270 pb. Este fragmento se digirió con HindIII y PstI para aislar
un fragmento HindIII-PstI de 220 pb (fragmento B).
Los fragmentos A y B se ligaron juntos con el vector pBSSK+,
previamente digerido con ClaI y HindIII, para originar el plásmido
pEL028 de 3872 pb (Figura 26). El plásmido pHN02 se digirió con
BsphI y ClaI para aislar el fragmento BsphI-ClaI de
425 pb (fragmento C). Se realizó una PCR con los oligonucleótidos
siguientes:
EL074 (SEC Nº ID.: 21)
5' GTGACATCACTAGCGTCATCC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
EL075 (SEC Nº ID.: 22)
5' CCGCATCATCAGCGGCCGCGATCGGTCATGGACAGT 3'
y la matriz pHN02 para producir un fragmento PCR
de 425 pb. Este fragmento se digirió con BstBI y NotI para aislar
el fragmento BstBI-NotI de 390 pb (fragmento D). Los
fragmentos C y D se ligaron juntos con el vector pBSSK+,
previamente digerido con ClaI y NotI, para originar el plásmido
pEL029bis de 3727 pb (Figura 27). El plásmido pEL028 se digirió con
ClaI y SacII para aislar el fragmento ClaI-SacII de
960 pb (fragmento E). El plásmido pEL029bis se digirió con ClaI y
NotI para aislar el fragmento ClaI-NotI de 820 pb
(fragmento F). Los fragmentos E y F se ligaron juntos con el vector
pBS-SK+, previamente digerido con NotI y SacII, para
originar el plásmido pEL030 de 4745 pb (Figura 28). El plásmido
pEL030 se digirió con NotI para aislar el fragmento
NotI-NotI de 1780 pb (gen HN completo del NDV). Este
fragmento se ligó, en el lugar del gen lacZ, con el plásmido pCMVb,
previamente digerido con NotI y tratado con la fosfatasa alcalina,
para originar el plásmido pEL032 de 5471 pb (Figura 29). El
plásmido pEL032 se digirió con EcoRI y ClaI para aislar el fragmento
EcoRI-ClaI de 1636 pb (fragmento G). El plásmido
pEL032 se digirió con ClaI y SalI para aislar el fragmento
ClaI-SalI de 1182 pb (fragmento H). Los fragmentos G
y H se ligaron juntos con el plásmido pEL079 (ver Ejemplo 5),
previamente digerido con EcoRI y SalI, para originar el plásmido
pEL093 de 7890 pb (Figura 30). Este plásmido permite la inserción
de la casete de expresión HCMV-IE/NDV HN en el sitio
intergénico 1 del virus HVT.
Una cotransfección realizada, como se describió
en el Ejemplo 8, con el plásmido pEL093 y el ADN genómico del virus
HVT, ha conducido al aislamiento y purificación del vHVT19
recombinante.
Un clon procedente de la biblioteca de ADN
complementario del genoma del virus de la enfermedad de Newcastle
(ver Ejemplo 11), y que contiene el gen de fusión (F) completo, se
ha denominado pNDV81. Este plásmido ha sido descrito previamente, y
la secuencia del gen F del NDV presente en este clon ha sido
publicada (Taylor J. et al., J. Virol.,
64:1441-1450 (1990)). El plásmido pNDV81 se digirió
con NarI y PstI para aislar el fragmento NarI-PstI
de 1870 pb (fragmento A). Se realizó una PCR con los
oligonucleótidos siguientes:
EL076 (SEC Nº ID.: 23)
5' TGACCCTGTCTGGGATGA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
EL077 (SEC Nº ID.: 24)
5'GGATCCCGGTCGACACATTGCGGCCGCAAGATGGGC 3'
y la matriz pNDV81 para producir un fragmento de
160 pb. Este fragmento se digirió con PstI y SalI para aislar el
fragmento PstI-SalI de 130 pb (fragmento B). Los
fragmentos A y B se ligaron juntos con el vector
pBS-SK+, previamente digerido con ClaI y SalI, para
originar el plásmido pEL033 de 4846 pb (Figura 31). El plásmido
pEL033 se digirió con NotI para aislar el fragmento
NotI-NotI de 1935 pb (gen F completo). Este
fragmento se ligó con el plásmido pCMVb, previamente digerido con
NotI y tratado con la fosfatasa alcalina, para originar el plásmido
pEL034 de 5624 pb (el gen F del NDV ha remplazado el gen lacZ)
(Figura 32). El plásmido pEL034 se digirió con EcoRI y KpnI para
aislar el fragmento EcoRI-KpnI de 866 pb (fragmento
C). El plásmido pEL034 se digirió con KpnI y SalI para aislar el
fragmento KpnI-SalI de 2114 pb (fragmento D). Los
fragmentos C y D se ligaron juntos con el plásmido pEL079 (ver
Ejemplo 5), previamente digerido con EcoRI y SalI, para originar el
plásmido pEL094 de 8043 pb (Figura 33). Este plásmido permite la
inserción de la casete de expresión HCMV-IE/NDV F
en el sitio intergénico 1 del virus HVT.
Una cotransfección realizada, como se describió
en el Ejemplo 8, con el plásmido pEL094 y el ADN genómico del virus
HVT, ha conducido al aislamiento y la purificación del vHVT20
recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias situadas cadena arriba respecto
el gen RNA 1,8 kpb del MDV se describen en Bradley G. et al.
(J. Virol., 63:2534-2542 (1989)) (Figura 34 y
SEC. Nº ID.: 25). Se ha realizado una amplificación PCR, a partir
del ADN extraído de linfocito recolectados de los polluelos
infectados por la cepa RB1B del MDV (ver Ejemplo 1), con los
siguientes oligonucleótidos:
MBO47 (SEC Nº ID.: 26)
5' GGTCTACTAGTATTGGACTCTGGTGCGAACGC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
MBO48 (SEC Nº ID.: 27)
5' GTCCAGAATTCGCGAAGAGAGAAGGAACCTC 3'
El fragmento de la PCR de 163 pb obtenido de
este modo se digirió con EcoRI y SpeI, a continuación se ligó con
el plásmido pCD002 (ver Ejemplo 9), previamente digerido con EcoRI y
SpeI, para originar el plásmido pBS002 de 6774 pb (Figura 35). El
plásmido pBS002 contiene el promotor del gen RNA 1,8 kb del MDV,
clonado cadena arriba respecto el gen lacZ.
Se realizó una PCR con los oligonucleótidos:
MB047 (SEC Nº ID.: 26) y
\vskip1.000000\baselineskip
MB072 (SEC Nº ID.: 28)
5' GTGTCCTGCAGTCGCGAAGAGAGAAGGAACCTC 3'
y la matriz pBS002. El fragmento de la PCR
obtenido de este modo se digirió con PstI y SpeI para aislar un
fragmento PstI-SpeI de 200 pb. Este fragmento se
ligó con el plásmido pEL067, previamente digerido con PstI y SpeI,
para originar el plásmido pEL069 (Figura 36). El plásmido pCD007
(ver el Ejemplo 10) se digirió con EcoRI y XbaI para aislar el
fragmento EcoRI-XbaI de 2670 pb (fragmento A). El
plásmido pCD011 (ver el Ejemplo 10) se digirió con NotI y XbaI para
aislar el fragmento NotI-XbaI de 180 pb (fragmento
B). El plásmido pEL069 se digirió con NotI y SpeI para aislar el
fragmento NotI-SpeI de 180 pb (fragmento C). Los
fragmentos A, B y C se ligaron juntos con el plásmido pEL067 (ver
Ejemplo 9), previamente digerido con EcoRI y SpeI, para originar el
plásmido pEL080 de 5939 pb (Figura 37). El plásmido pEL070 (ver el
Ejemplo 9) se digirió con KpnI y SpeI para aislar el fragmento
KpnI-SpeI de 1345 pb (fragmento D). El plásmido
pEL070 se digirió también con KpnI y SalI para aislar el fragmento
KpnI-SalI de 1658 pb (fragmento E). Los fragmentos D
y E se ligaron juntos con el plásmido pEL080, previamente digerido
con SalI y SpeI, para originar el plásmido pEL081 de 8938 pb
(Figura 38). El plásmido pEL081 se digirió con EcoRI y SalI para
aislar el fragmento EcoRI-SalI de 6066 pb. Este
fragmento se ligó con el plásmido pEL079 (ver el Ejemplo 5),
previamente digerido con EcoRI y SalI, para originar el plásmido
pEL095 de 11.139 pb (Figura 39). Este plásmido permite la inserción
de la casete doble de expresión VP2/HCMV-IE/RNA 1,8
kbp/MDV gB en el sitio intergénico 1 del virus HVT.
Una cotransfección realizada, como se describió
en el Ejemplo 8, con el plásmido pEL095 y el ADN genómico del virus
HVT, ha conducido al aislamiento y purificación del vHVT21
recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pEL080 (ver el Ejemplo 13) se
digirió con EcoRI y SalI para aislar el fragmento
EcoRI-SalI de 3040 pb (casete RNA 1,8 kpb / MDV
gB). Este fragmento se ligó con el plásmido pEL079 (ver el Ejemplo
5), previamente digerido con EcoRI y SalI, para originar el
plásmido pEL098 de 8140 pb (Figura 40). Este plásmido permite la
inserción de la casete de RNA 1,8 kpb / MDV gB en el sitio
intergénico 1 del virus HVT.
Una cotransfección realizada, como se describió
en el Ejemplo 8, con el plásmido pEL098 y el ADN genómico del virus
HVT, ha conducido al aislamiento y purificación del vHVT24
recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la misma estrategia que la descrita más
arriba para la inserción de casetes de expresión (genes colocados
bajo el control de los promotores HCMV-IE o
MCMV-IE, o del promotor doble
MCMV-IE//RNA 1,8 kpb) en el sitio intergénico 1, es
posible realizar virus HVT recombinantes que expresan a un nivel
elevado las proteínas de membrana (M) o "spike" (S) del virus
de la bronquitis infecciosa aviaria (IBV). Preferiblemente se
realiza una construcción en donde el gen IBV S está bajo la
dependencia del promotor HCMV-IE o del promotor
MCMV-IE, o bien una construcción en donde los gene
IBV M e IBV S se insertan junto con el promotor doble
MCMV-IE/RNA 1,8 kpb en el sitio intergénico 1,
estando el gen M bajo el control del promotor RNA 1,8 kpb, y estando
el gen S bajo el control del promotor MCMVIE. En esta
configuración, el promotor RNA 1,8 kpb es activado por las regiones
activadoras del promotor MCMV-IE.
\vskip1.000000\baselineskip
La obtención de virus HVT recombinantes que
tengan insertadas casetes de expresión de genes ajenos en los
sitios intergénicos 2 y 3 se hace siguiendo la estrategia descrita
para los ejemplos 8 a 14, pero utilizando respectivamente los
plásmidos pEL078 (sitio intergénico 2) y pEL066 (sitio intergénico
3) en el lugar del plásmido pEL079 en los ejemplos 8 a 14, para
construir los plásmidos donadores específicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de vacunas según la invención
pueden hacerse mediante cualquier técnica usual conocida por el
especialista, por ejemplo, mediante el cultivo en frascos rodantes.
Los frascos rodantes (175 cm^{2}), sembrados con
200\cdot10^{6} células primarias de embrión de pollo, se
inoculan, después de 24 horas de incubación a 37ºC, con 1 ml de una
solución viral del virus HVT recombinante que tiene un título de
10^{5} pfu/ml. Después de una incubación de 4 días a 37ºC, se
elimina el sobrenadante, las células se disocian con una solución
de tripsina-Versene, y a continuación se recolectan.
Las células infectadas se centrifugan entonces. El sobrenadante se
elimina y las células se retoman en 20 ml de una solución que
contiene un estabilizador para la liofilización (por ejemplo, SPGA
sacarosa, fosfato, glutamato, albúmina). Esta mezcla se sonica a
continuación, se reparte en los frascos a razón de fracciones de 1
ml, y finalmente se liofiliza.
Si es necesario, la vacuna puede igualmente
repartirse y congelarse en lugar de liofilizarse.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha utilizado una vacuna recombinante,
obtenida según la invención y que expresa la proteína VP2 del virus
de la enfermedad de Gumboro, para inmunizar por vía intramuscular
unos polluelos de 1 día. A continuación, estos polluelos se
infectaron a la edad de 21 días con el virus de la enfermedad de
Gumboro. Los resultados de protección se evaluaron 11 días después
de la infección comparando las lesiones de la bolsa de Fabricio y
la mortalidad entre los grupos vacunados y el grupo control no
vacunado. Los resultados de este protocolo de vacunación/infección
han mostrado que la vacuna obtenida según la invención permite
obtener un buen nivel de protección.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante pretende únicamente ayudar al lector, y no forma parte
del documento de patente europea. Aunque se ha tenido el máximo
cuidado en su elaboración no pueden excluirse errores u omisiones,
y la EPO rehúsa cualquier responsabilidad en este aspecto.
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\bullet WO 8704463 A [0003] [0008]
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido que sirve de cebador
de la PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaccctgtc tgggatga
\hfill18
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido que sirve de cebador
de la PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatcccggt cgacacattg cggccgcaag atgggc
\hfill36
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 800
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> gammavirus del herpes
MKT-1 de la enfermedad de Marek
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
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<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido que sirve de cebador
de la PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtctactag tattggactc tggtgcgaac gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido que sirve de cebador
de la PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccagaatt cgcgaagaga gaaggaacct c
\hfill31
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido que sirve de cebador
de la PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgtcctgca gtcgcgaaga gagaaggaac ctc
\hfill33
Claims (18)
1. Utilización de un virus HVT (virus del herpes
del pavo) recombinante, que comprende al menos una secuencia
nucleotídica que codifica, y expresa, un antígeno de un agente
patógeno aviario, insertado en una de las zonas intergénicas 1, 2 y
3 del fragmento BamHI I del genoma del virus HVT, estas zonas
intergénicas, por referencia a la cepa de HVT concreta que posee la
secuencia nucleotídica de la Figura 1, corresponden a los
nucleótidos de la Figura 1 1213 a 1383 para el intergén 1, 1942 a
2283 para el intergén 2, y 3082 a 3569 para el intergén 3, para la
producción de una vacuna viva recombinante aviaria, destinada a la
vacunación in ovo, de los polluelos de un día, o de los adultos,
contra dicho agente patógeno aviario.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
cual el agente patógeno aviario es el virus de la enfermedad de
Gumboro (IBDV).
3. Utilización según la reivindicación 1, en la
cual el agente patógeno aviario es el virus de la enfermedad de
Marek.
4. Utilización según la reivindicación 1, en la
cual el agente patógeno aviario es el virus de la enfermedad de
Newcastle (NDV).
5. Utilización según la reivindicación 1, en la
cual el agente patógeno aviario es el virus de la bronquitis
infecciosa (IBV).
6. Utilización según la reivindicación 1, en la
cual el agente patógeno aviario es el virus de la laringotraqueitis
infecciosa (ILTV).
7. Utilización según la reivindicación 1, en la
cual el agente patógeno aviario es el virus de la anemia aviaria
(CAV).
8. Utilización según la reivindicación 2, en la
cual la secuencia nucleotídica insertada es una secuencia
nucleotídica que codifica el polipéptido VP2 del virus IBDV.
9. Utilización según la reivindicación 2, en la
cual la secuencia nucleotídica insertada codifica el VP3 o el VP2 +
VP4 + VP3 del virus IBDV.
10. Utilización según la reivindicación 3, en la
cual la secuencia nucleotídica codifica el gB, gC, gD ou gH + gL
del virus de la enfermedad de Marek.
11. Utilización según la reivindicación 4, en la
cual la secuencia nucleotídica codifica el F o HN del virus de la
enfermedad de Newcastle.
12. Utilización según la reivindicación 5, en la
cual la secuencia nucleotídica codifica el S o M del virus de la
bronquitis infecciosa.
13. Utilización según la reivindicación 6, en la
cual la secuencia nucleotídica codifica el gB, gC, gD ou gH + gL
del virus de la laringotraqueitis infecciosa.
14. Utilización según la reivindicación 7, en la
cual la secuencia nucleotídica codifica el VP1 (52 kDa) + VP2 (24
kDa) del virus de la anemia aviaria.
15. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en la cual dicha secuencia nucleotídica
está insertada bajo el control del promtor inmediato temprano del
CMV.
16. Utilización según la reivindicación 15, en
la cual el promotor inmediato temprano del CMV es el promotor
humano HCMV IE o el promotor múrido MCMV IE.
17. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en la cual dicha secuencia nucleotídica
está insertada bajo el control del promtor Marek RNA1.8.
18. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en la cual se utilizan de 10 a 10^{4}
pfu del virus HVT recombinante por dosis de vacuna.
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