ES2212799T3 - Dispositivo y procedimiento que utilizan matrices de estructuras de fijacion de objetos de analisis. - Google Patents

Dispositivo y procedimiento que utilizan matrices de estructuras de fijacion de objetos de analisis.

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ES2212799T3 ES95936210T ES95936210T ES2212799T3 ES 2212799 T3 ES2212799 T3 ES 2212799T3 ES 95936210 T ES95936210 T ES 95936210T ES 95936210 T ES95936210 T ES 95936210T ES 2212799 T3 ES2212799 T3 ES 2212799T3
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Douglas D. Hansmann
John P. Grace
Michael G. Lowery
Gary M. Oosta
Neil W. Loomis
Eric B. Shain
Thomas G. Schapira
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE RELACIONA CON DISPOSITIVOS ANALITICOS PAR DETERMINAR LA PRESENCIA O CANTIDAD DE UN ANALITO EN UNA MUESTRA DE PRUEBA. LOS DISPOSITIVOS ANALITICOS COMPRENDEN UN PUERTO DE ENTRADA, UN RESPIRADERO, UN CANAL Y UN SISTEMA DE ESTRUCTURAS. LAS ESTRUCTURAS TIENEN UN REACTIVO INMOVILIZADO UNIDO COVALENTE O NO-COVALENTEMENTE CON LA SUPERFICIE DE LAS ESTRUCTURAS. EL REACTIVO INMOVILIZADO CAPTURA EL ANALITO EN LA MUESTRA DE PRUEBA DONDE ES DETECTADO POR UN SISTEMA DE DETECCION. LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA TAMBIEN UNOS METODOS Y REACTIVOS PARA LLEVAR A CABO ENSAYOS QUE UTILIZAN LOS DISPOSITIVOS ANALITICOS DE LA PRESENTE INVENCION. LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA TAMBIEN LOS METODOS DE FABRICACION DE LOS DISPOSITIVOS ANALITICOS DE LA PRESENTE INVENCION.

Description

Dispositivo y procedimiento que utilizan matrices de estructuras de fijación de objetos de análisis.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a dispositivos analíticos para la detección de analitos en una muestra de prueba. Los dispositivos utilizan una red de estructuras en el dispositivo para capturar el analito.
Antecedentes de la invención
La determinación cualitativa o cuantitativa de analitos en muestras de prueba sigue siendo importante en los diagnósticos de estados fisiológicos y no fisiológicos. El análisis de una muestra de prueba mezclada con reactivos da lugar a una señal detectable con y sin la ayuda de instrumentación.
Se han facilitado métodos y dispositivos que dan determinaciones de varios analitos en una muestra de prueba. De interés particular a los efectos de la presente invención son los pequeños dispositivos desechables. Tales dispositivos implican en general una tira o un dispositivo de pista.
Los dispositivos porosos emplean en general alguna forma de material poroso que transporta un fluido a través del dispositivo. Estos dispositivos tienen generalmente forma de hojas, tiras, varillas de inmersión, etc. Los dispositivos de tira tienen ventajosamente un área superficial grande y poros pequeños. Una de las desventajas de los dispositivos que utilizan tales materiales es que el material poroso puede variar de un lote a otro debido al proceso aleatorio al formar los dispositivos. Las variaciones pueden producir diferencias del rendimiento de los dispositivos.
Los dispositivos de pista proporcionan superficies uniformes que son fácilmente reproducibles, pero, no obstante, proporcionan una espaciación demasiado grande para permitir la difusión de analito y la captura siguiente en una superficie interior en un período de tiempo razonable.
Por lo tanto, sería ventajoso crear pequeños dispositivos desechables que tengan la reproducibilidad dimensional de los dispositivos de pista y los poros pequeños y el área superficial grande de los dispositivos que emplean material poroso. Entonces se resolverían simultáneamente los problemas de los dispositivos porosos y los dispositivos de pista.
Se ha utilizado varios procesos para crear dispositivos pequeños en la industria electrónica. Por ejemplo, Munchmeyer y otros, Rev. Sci. Instrum., 63 (1) 713-721, (1992), describen tecnología LIGA para producir microcomponentes ópticos y eléctricos que utilizan litografía por radiación sincrotónica para producir maestros. Angell y otros, Scientific American, 248: 44-55 (1983) describen atacar por tecnología de micromaquinado pastillas de silicio para efectos microelectrónicos. Manz y otros, Trends en Analytical Chemistry. Vol. 10, nº 5, pp. 144-149, (1991), describen vidrio y silicio microcristalinos micromaquinados reproducibles para análisis de inyección de flujo y detector celdas que proporcionan para separaciones cromatográficas y electroforéticas más rápidas.
La tendencia a los dispositivos pequeños no se limita a la industria electrónica. Sato y otros, Sensors and Actuators, A21-A23, pp. 948-953, (1990), describen dispositivos micromecánicos de silicio que permiten realizar simultáneamente operaciones de fusión celular una a una entre dos grupos de células diferentes. Se halló que las células se fundían con éxito en las microcámaras.
La patente de Estados Unidos 4.789.628 concedida a Nayak describe una pluralidad de salientes espaciados que se extienden hacia arriba desde el fondo para proporcionar un área superficial incrementada para ensayos de ligando:antiligando. La pluralidad de salientes espaciados forma un canal de interconexión. Sin embargo, los tamaños grandes de los salientes y las anchuras grandes de los canales no proporcionan ensayos de microvolumen o desarrollo rápido de señal con niveles bajos de analitos.
WO 93/22053 A1 concedida a Wilding y otros describe dispositivos de detección microfabricados que detectan analito en una muestra de prueba. El dispositivo tiene un canal de escala micrométrica que se extiende desde el orificio de entrada. Los canales se construyeron por micromaquinado en silicio. Los radicales de unión alinean el canal que realiza la detección de analito.
Las técnicas analíticas corrientes, a saber, los dispositivos porosos y de pista, no proporcionan materiales que dan lugar a realización satisfactoria de ensayos. Se necesita un dispositivo reproducible que permita microvolúmenes de flujo de fluido a tasas aceptables y la captura de analito con eficiencias aceptables.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra una red de estructuras en forma de diamante. Las superficies de las estructuras son el lugar de captura de analito. Las flechas en las figuras representan la dirección de flujo de fluido en el dispositivo. Las filas de diamantes en la red están escalonadas con relación a la dirección de flujo de fluido.
\newpage
La figura 2 ilustra una red de estructuras de forma hexagonal a usar en los dispositivos analíticos de la presente invención.
La figura 3 ilustra una red de estructuras de forma triangular a usar en los dispositivos analíticos de la presente invención.
La figura 4 ilustra una red de estructuras de forma circular a usar en los dispositivos analíticos de la presente invención.
La figura 5 muestra los resultados de un ensayo hTSH realizado en el Ejemplo 1 utilizando un dispositivo analítico de la presente invención.
La figura 6 ilustra una realización de un dispositivo analítico de la presente invención.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a dispositivos analíticos para determinar la presencia o una cantidad de un analito en una muestra de prueba incluyendo una red de estructuras donde las estructuras tienen una superficie que proporciona un lugar para inmovilizar reactivo. El reactivo inmovilizado se une covalentemente o no covalentemente a dicha superficie de las estructuras y es capaz de unir un analito, análogo de analito, elemento auxiliar de unión, o un reactivo marcado. Los dispositivos analíticos de la presente invención también incluyen una pluralidad de canales donde una muestra de prueba conteniendo un analito, análogo de analito, elemento auxiliar de unión, o reactivo marcado puede fluir a través de los canales, y el analito, análogo de analito, elemento auxiliar de unión, o reactivo marcado puede difundirse a lo ancho de dichos canales uniéndose por lo tanto al reactivo inmovilizado. El reactivo marcado incluyendo un elemento de unión específico se conjuga a un marcador detectable donde el marcador detectable produce una señal que determina la presencia o cantidad del analito presente en la muestra de prueba.
La presente invención también se refiere a métodos de utilizar los dispositivos analíticos de la presente invención así como a métodos de fabricar tales dispositivos.
Descripción detallada de la invención Definiciones
Antes de proseguir con la descripción de las varias realizaciones de la presente invención, se definirán varios términos utilizados en la presente memoria.
"Elemento de unión específico auxiliar" se refiere a cualquier elemento de unión específico que se utilice en el ensayo además de los elementos de unión específicos del reactivo marcado o reactivo inmovilizado. Se puede utilizar uno o varios elementos de unión específicos auxiliares en un ensayo. Por ejemplo, un elemento de unión específico auxiliar puede ser capaz de unir el reactivo marcado al analito de interés, en los casos en que el analito propiamente dicho no podría unirse directamente al reactivo marcado. Alternativamente, un elemento de unión específico auxiliar puede ser capaz de unir el reactivo inmovilizado al analito de interés, en los casos en que el analito propiamente dicho no podría unirse directamente al reactivo inmovilizado. El elemento de unión específico auxiliar se puede incorporar al dispositivo de ensayo, añadir a la muestra, o añadir como un reactivo separado.
"Analito" o "analito de interés" se refiere al compuesto o composición a detectar o medir, que tiene al menos un epítopo o lugar de unión. El analito puede ser cualquier sustancia para la que existe un elemento de unión natural específico de analito o para la que se puede preparar un elemento de unión específico de analito. Los analitos incluyen, aunque sin limitación, toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, lípidos, ácidos grasos, péptidos, microorganismos, aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas, azúcares, esteroides, vitaminas, drogas (incluyendo las administradas para efectos terapéuticos así como las administradas para fines ilícitos), y metabolitos o anticuerpos de alguna de las sustancias anteriores. El término "analito" también incluye cualquier sustancia antigénica, haptenos, anticuerpos, macromoléculas y sus combinaciones.
"Análogo de analito" se refiere a una sustancia que reacciona transversalmente con el elemento de unión específico de analito, aunque puede hacerlo así en mayor o menor medida que lo hace el analito propiamente dicho. El análogo de analito puede incluir un analito modificado así como una porción fragmentada o sintética de la molécula de analito, a condición de que el análogo de analito tenga al menos un sitio epitópico en común con el analito de interés. Un ejemplo de un análogo de analito es una secuencia de péptidos sintéticos que duplica al menos un epítopo del analito de molécula entera de manera que el análogo de analito se pueda unir al elemento de unión específico de analito.
"Capilar" se refiere a una superficie sólida que rodea un vacío, en el que el aire puede ser desplazado preferentemente por un líquido de la tensión superficial correcta. El mecanismo de capilaridad depende de la energía superficial libre del sistema. Para que se produzca dispersión espontánea del líquido mediante un capilar, la energía superficial libre del sistema debe disminuir durante el proceso de dispersión. Esto se puede realizar para los dispositivos aquí utilizados seleccionando las superficies sólidas apropiadas para el fluido biológico de interés.
"Lugar de captura" se refiere a una porción delimitada o definida de las estructuras de tal manera que la reacción de unión específica se produzca entre el reactivo inmovilizado y el analito.
"Cámara" se refiere a un espacio cerrado o cavidad de dimensiones definidas que no es un capilar. La cámara puede tener agujeros de entrada y de salida. La cámara se puede llenar por fuerzas capilares o por presión diferencial. El control de las dimensiones para una cámara particular permite el control de adiciones de reactivo, flujo, incubación, zonas de reacción, o detección. Además, el reactivo se puede unir covalentemente o no covalentemente a la superficie de las cámaras.
"Canal(es)" se refiere al espacio entre estructuras adyacentes en el dispositivo. Los canales también pueden ser capilares. En general, el canal tiene acceso a un orificio de entrada, otros capilares o una cámara. La longitud de canal será suficiente para determinaciones y detecciones de analito.
"Conjugación" se refiere al acoplamiento químico de un radical a otro para formar un conjugado. Se ha descrito agentes de acoplamiento para conjugación covalente a proteína en la Patente de Estados Unidos número 5.053.520. También se conocen en la técnica agentes de acoplamiento homobifuncionales para acoplar enzimas a anticuerpos como se describe en la Publicación P.C.T. número WO 92/07268, publicada el 30 de abril de 1992.
"Agente de acoplamiento" se refiere a agentes bifuncionales de entrecruzamiento o acoplamiento, es decir, moléculas conteniendo dos grupos reactivos o "extremos", que pueden ser unidos por un separador. Los extremos reactivos pueden ser cualquiera de varias funcionalidades incluyendo, aunque sin limitación: extremos amino reactivos, tal como ésteres n-hidroxisuccinimida (NHS) activos, imidoésteres, aldehídos, epóxidos, sulfonil haluros, isocianato, isotiocianato, y nitroaril haluros; y extremos tiol reactivos tal como disulfuros de piridilo, maleimidas, tioftalimidas, y halógenos activos. Los reactivos heterobifuncionales de entrecruzamiento tienen dos extremos reactivos diferentes, por ejemplo, un extremo amino-reactivo y un extremo carboxilo-reactivo, mientras que los reactivos homobifuncionales tienen radicales reactivos similares en cada extremo.
Los reactivos heterobifuncionales comercialmente disponibles para uso en la presente invención incluyen, aunque sin limitación, los agentes de acoplamiento de ésteres maleimido-NHS activos, tal como m-maleimidobenzoil-N-hidroxi-succinimida éster (MBS); succinimidil 4-(N-maleimido-metil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC); succinimidil 4-(p-maleimidofenil) butirato (SMPB) y sus derivados, incluyendo derivados de sulfosuccinimidil tales como sulfosuccinimidil-4-(N-maleimido-metil) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC); m-maleimidobenzoil-sulfosuccinimida éster (sulfo-MBS) y sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirato (sulfo-SMPB).
Otros reactivos heterobifuncionales incluyen los agentes de acoplamiento de halógeno activo-ésteres NHS activos comercializados tal como N-succinimidil bromoacetato y N-succinimidil (4-yodoacetil)aminobenzoato (STAB) y los derivados de sulfosuccinimidil tal como sulfosuccinimidil (4-yodoacetil)aminobenzoato (sulfo-SIAB).
Otro grupo de agentes de acoplamiento son los agentes heterobifuncionales y tiol clivables tal como N-succinimidil 3-(2-piridiltio)propionato (SPDP). También se puede utilizar agentes tiol clivables, tal como N, N'-didansil-L-cistina y L-cistina dimetiléster dihidrocloruro.
"Zona(s) muerta(s)" se refiere a zonas dentro del (de los) canal(es) donde se acumulan fluidos o el flujo de fluido no es en un sentido directo desde el orificio de entrada a la zona de detección del dispositivo.
"Difusión" se refiere al movimiento aleatorio de una entidad debido a colisiones de moléculas de fluido circundantes. La difusión da lugar a un movimiento neto de la entidad desde niveles de concentración más altos a más bajos de la entidad.
"Reactivo inmovilizado" se refiere a reactivo que está unido covalentemente o no covalentemente a la superficie de la estructura. El reactivo inmovilizado se puede aplicar a la superficie de la estructura mediante varios métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, inmersión, inscripción con un lápiz, dispensación mediante un tubo capilar o mediante la utilización de impresión por chorro de reactivo u otras técnicas de dispensación adecuadas. Los métodos de aplicación y unión no son críticos para la presente invención.
En general, el reactivo inmovilizado es un elemento de unión específico que se une covalentemente o non covalentemente en una superficie de la estructura para formar un "lugar de captura". Típicamente, el reactivo inmovilizado se selecciona para unir el analito, el reactivo marcado o su complejo. En realizaciones preferidas, el reactivo inmovilizado se une al analito para la terminación de un complejo intercalado. El reactivo inmovilizado se puede elegir para unir directamente el analito o unir indirectamente el analito por medio de un elemento de unión específico auxiliar que se une al analito. El reactivo inmovilizado se puede inmovilizar en la estructura antes o durante la realización del ensayo por medio de cualquier método de unión adecuado. Además, el reactivo inmovilizado puede ralentizar la migración del analito y/o reactivo marcado a través del canal. El reactivo inmovilizado también se puede unir a la estructura de tal forma que pueda ser extraído por el fluido. Además, el lugar de captura puede estar marcado, por ejemplo con un colorante, de tal manera que la posición del lugar de captura en las estructuras se pueda determinar visual o instrumentalmente incluso cuando no haya marcador inmovilizado en el lugar de captura. Para ello, se puede utilizar cualquier colorante, a condición de que el colorante no interfiera con el ensayo o componentes del ensayo.
El reactivo inmovilizado se puede disponer en un solo lugar de captura o en múltiples lugares de captura. El reactivo inmovilizado también puede estar configurado para proporcionar varias configuraciones, es decir, para producir diferentes formatos de detección o medición. alternativamente, el reactivo inmovilizado se puede distribuir sobre una porción grande de la estructura de manera sustancialmente uniforme para formar el lugar de captura. El grado de producción de señal en el lugar de captura se refiere a la cantidad de analito en la muestra de prueba.
"Orificio de entrada" u "orificio de admisión" o "muestra introducida" son términos sinónimos. Se refieren al lugar donde la muestra de prueba es introducida en el dispositivo analítico. El lugar accede a una zona receptora del dispositivo. La zona receptora del dispositivo puede ser una cámara, un capilar o un canal.
"Reactivo marcado" se refiere a una sustancia incluyendo un marcador detectable unido a un elemento de unión específico. La unión puede ser unión covalente o no covalente, pero el método de unión no es crítico para la presente invención. El reactivo marcado produce una señal detectable que está relacionada directa o indirectamente con la cantidad de analito en la muestra de prueba. El componente elemento de unión específico del reactivo marcado se selecciona para unirse directamente al analito o para unirse indirectamente al analito por medio de un elemento de unión específico auxiliar, que se describe con más detalle más adelante. Además, el reactivo marcado puede incluir un marcador detectable unido a un elemento de unión específico que se une específicamente al reactivo inmovilizado. El reactivo marcado se puede incorporar al dispositivo de prueba, se puede combinar con la muestra de prueba para formar una solución de prueba, se puede añadir al dispositivo por separado de la muestra de prueba o puede estar predepositado o inmovilizado de forma reversible en el lugar de captura. Adicionalmente, el elemento de unión específico puede ser marcado antes o durante de la realización del ensayo por medio de un método de unión adecuado.
"Marcador" o "marcado" se refiere a cualquier sustancia que sea capaz de producir una señal que es detectable por medios visuales o instrumentales. Varios marcadores adecuados para ser utilizados en la presente invención incluyen marcadores que producen señales mediante medios químicos o físicos. Tales marcadores pueden incluir enzimas y sustratos; cromógenos; catalizadores; compuestos fluorescentes; compuestos quimiluminiscentes; marcadores radioactivos; marcadores visuales directos incluyendo partículas metálicas coloidales tal como oro, partículas no metálicas coloidales tal como selenio, partículas teñidas o coloreadas tal como un plástico teñido o un microorganismo teñido, partículas de color o coloreables de látex de polímero orgánico, y liposomas u otras vesículas conteniendo directamente sustancias visibles, y análogos. Se describen metales coloidales y partículas colorantes en las Patentes de Estados Unidos 4.313.734 y 4.373.932. La preparación y el uso de coloidales no metálicos se describen en la Patente de Estados Unidos 4.954.452. Se describen partículas de látex de polímero orgánico para uso como marcadores en la Patente de Estados Unidos 4.252.459.
La selección de un marcador particular no es crítica para la presente invención, a condición de que el marcador sea capaz de generar una señal detectable por sí mismo, tal como una partícula de látex de polímero orgánico de color detectable visualmente, o detectable instrumentalmente, tal como un compuesto fluorescente, o detectable en unión con uno o varios componentes adicionales productores de señal, tal como un sistema productor de señal de enzima/sustrato. Se puede formar varios reactivos marcados diferentes variando el marcador o el componente elemento de unión específico del reactivo marcado; los expertos en la técnica apreciarán que la elección implica consideración del analito a detectar y los medios de detección deseados.
"Mezcla de reacción", en el sentido en que se usa aquí, significa una mezcla de la muestra de prueba y otras sustancias biológicas, químicas y físicas y reactivos para la detección de analito en la muestra de prueba. La mezcla de reacción también puede incluir diluyentes y soluciones tampón.
"Componente productor de señal" se refiere a cualquier sustancia capaz de reaccionar con otro reactivo de ensayo o con el analito para producir un producto de reacción o señal que indica la presencia del analito y que es detectable por medios visuales o instrumentales. "Sistema de producción de señal", en el sentido en que se usa aquí, se refiere al grupo de reactivos de ensayo que se necesitan para producir el producto de reacción o señal deseado. Por ejemplo, se puede hacer reaccionar con el marcador uno o varios componentes productores de señal para generar una señal detectable, por ejemplo, cuando el marcador es una enzima, la amplificación de la señal detectable se obtiene reaccionando la enzima con uno o varios sustratos o enzimas y sustratos adicionales para producir un producto de reacción detectable.
"Elemento de unión específico" se refiere a un elemento que se une específicamente a otra molécula mediante medios químicos o físicos. Además de elementos específicos de unión a antígeno y anticuerpo, otros elementos de unión específicos incluyen, como ejemplos sin limitación, biotina y avidina, hidratos de carbono y lectinas, secuencias de nucleótidos complementarias, secuencias de péptidos complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores de enzima y enzimas, inhibidores enzimáticos y enzimas, una secuencia de péptidos y un anticuerpo específico para la secuencia o la proteína completa, ácidos poliméricos y bases, colorantes y aglutinantes proteínicos, péptidos y aglutinantes proteínicos específicos (por ejemplo, ribonucleasa, péptido S y proteína S ribonucleasa), y análogos. Además, los elementos de unión específicos pueden incluir moléculas que son análogas del elemento de unión específico original, por ejemplo un análogo de analito o un elemento de unión específico hecho por técnicas recombinantes o ingeniería molecular. Si el elemento de unión específico es un inmunorreactivo, puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, antígeno, hapteno, o su complejo, y si se utiliza un anticuerpo, puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína recombinante o anticuerpo, un anticuerpo quimérico, una(s) mezcla(s) o fragmento(s) de los mismos, así como una mezcla de un anticuerpo y otros elementos de unión específicos. Los detalles de la preparación de tales anticuerpos y su idoneidad para uso como elementos de unión específicos son conocidos por los expertos en la materia.
"Estructuras" se refiere a la forma física que surge de la capa base de los dispositivos de la presente invención. Las superficies de las estructuras proporcionan un área superficial grande. Las estructuras están dispuestas en una configuración o red para proporcionar suficiente captura de analito en lugares de captura en las superficies de las estructuras. Se puede utilizar varias formas para las estructuras. Por ejemplo, se puede utilizar estructuras triangulares para capturar analito. Además, se puede utilizar varias formas diferentes conjuntamente en el mismo dispositivo, por ejemplo, se puede utilizar estructuras triangulares y estructuras en forma de diamante en el mismo dispositivo para capturar reactivo.
"Muestra de prueba" se refiere a la muestra conteniendo un analito a detectar usando la presente invención. Una muestra de prueba puede contener otros componentes además del analito, puede tener los atributos físicos de líquidos, líquidos biológicos, o un sólido donde el sólido se puede hacer soluble en un líquido, y puede ser de cualquier tamaño o volumen, incluyendo por ejemplo, una corriente móvil de líquido. La muestra de prueba puede contener sustancias distintas del analito a condición de que las otras sustancias no interfieran con el analito o el análogo de analito. Los ejemplos de muestras de prueba incluyen, aunque sin limitación: suero, plasma, alimentos, fluido espinal, esputo, fluido seminal, fluido amniótico, orina, saliva, otros fluidos corporales, y muestras medioambientales tal como agua subterránea o agua residual, extractos de tierra y residuos de pesticidas.
Descripción de la invención
Los dispositivos de la presente invención utilizan una red de estructuras para capturar analito en una muestra de prueba. Las estructuras están dispuestas en una red para proporcionar esencialmente canales uniformes para el transporte de fluido y un área superficial grande. El analito se difunde en la muestra de prueba donde es capturado por un elemento de unión específico unido en la superficie de las estructuras. Los dispositivos analíticos de la presente invención se pueden utilizar como hojas, varillas de inmersión, tiras, cubetas, etc. Además, la presencia o cantidad de más de un analito se puede determinar en un solo dispositivo analítico. La presente invención proporciona preferiblemente dispositivos y métodos, donde los dispositivos se basan en acción capilar o presión diferencial para realizar el movimiento de fluidos a través del dispositivo para controlar la medición de fluidos, la secuencia de eventos, la captura de reactivos o entidades, los tiempos de reacción, la mezcla de reactivos, y para determinar una señal detectable, etc. Variando el recorrido por el que fluye el fluido, se puede realizar varias actividades tal como mezcla, incubación, reacción y detección.
1. Métodos de fabricar los dispositivos de la presente invención
Los dispositivos analíticos de la presente invención se basan en una red de estructuras en el dispositivo para captura de analito. Las estructuras se pueden hacer por varios procesos incluyendo, aunque sin limitación acción láser, gofrado, Lithographie Galvanoformung Abforrnung (LIGA), electrochapado, electroformación, fotolitografía, ataque de iones reactivos, fresado por haz de iones, moldeo por compresión, fundición, moldeo de inyección y reacción, moldeo por inyección, y micromaquinado del material. Como se entenderá, los métodos utilizados para fabricar las estructuras de la presente invención no son críticos a condición de que el método dé lugar a grandes cantidades de estructuras y dispositivos uniformes. Además, el método debe dar lugar a un área superficial grande de la estructura y dispuesta muy cerca una de otra para producir canales estrechos. Los canales estrechos permiten que se produzca difusión de analito en el fluido para mejorar la eficiencia de captura de analito y/o reactivo marcado en el lugar de captura. En general y preferiblemente, las estructuras en el dispositivo analítico se hacen del mismo material que la capa base del dispositivo.
Todas estas técnicas comienzan con una tecnología que producirá un maestro. Se suele hacer una herramienta del maestro que después se utilizará para producir en serie los dispositivos analíticos de la presente invención, o, en algunos casos, los maestros se pueden hacer en cantidad suficiente para utilizarlos directamente como los dispositivos analíticos de la presente invención.
Las estructuras producidas en serie se hacen preferiblemente de cualquier número de materiales poliméricos. Entre estos se incluyen, aunque sin pretender limitación alguna, poliolefinas tal como polipropileno y polietileno, poliésteres tal como tereftalato de polietileno, polímeros conteniendo estireno tal como poliestireno, estireno acrilonitrilo, y acrilonitrilo butadieno estireno, policarbonato, polímeros acrílicos tal como polimetilmetacrilato y poliacrilonitrilo, polímeros conteniendo cloro tal como cloruro de polivinilo y cloruro de polivinilideno, homopolímeros y copolímeros de acetal, celulósicos y sus ésteres, nitrato de celulosa, polímeros conteniendo flúor tal como fluoruro de polivinilideno, politetrafluoroetileno, poliamidas, poliimidas, polieteretercetona, polímeros conteniendo azufre tal como sulfuro de polifenileno y polietersulfona, poliuretanos, polímeros conteniendo silicio tal como polidimetilsiloxano. Además, las estructuras se pueden hacer de copolímeros, mezclas y/o laminados de los materiales anteriores, láminas metálicas tal como lámina de aluminio, películas metalizadas y metales depositados sobre los materiales anteriores, así como vidrio y materiales cerámicos.
En tal método se puede usar un láser, tal como un láser excimer, para iluminar una fotomáscara de manera que la luz que pase a través de la fotomáscara ablada un material subyacente que forma canales en el sustrato del material. Sercel, J., y otros, SPIE Proceedings, Vol. 998, (septiembre, 1988). Esta técnica se puede usar para hacer un maestro. El maestro puede ser utilizado directamente como un dispositivo y producido en grandes cantidades o se puede utilizar como una plantilla para fabricar una herramienta que se usará para reproducir dispositivos en grandes cantidades.
Otro método de hacer los dispositivos es la técnica LIGA, descrita por D. Munchmeyer y otros, Rev. Sci. Instrum., 63 (1), 1992. Se utiliza una fuente sincrotónica de rayos X para irradiar un fotorresist. El fotorresist desarrollado forma un maestro que puede ser electrochapado con níquel para formar una cavidad de molde. Después se puede vaciar o inyectar un polímero líquido al molde de níquel. Esta técnica se puede usar para hacer directamente dispositivos analíticos o para fabricar una herramienta a partir de un maestro.
Otro método de hacer los dispositivos de la presente invención es utilizar técnicas de fabricación de semiconductores tal como, aunque sin pretender limitación alguna, fotolitografía, ataque de iones reactivos, y fresado por haz de iones para definir estructuras apropiadas en fotorresists u otros materiales. Estas técnicas se pueden usar para hacer dispositivos directamente o se puede usar para hacer una herramienta de la que se puede hacer grandes cantidades de dispositivos.
Otro método de hacer los dispositivos de la presente invención es micromaquinarlos. El micromaquinado implica el proceso de utilizar herramientas finas para cortar canales en los materiales tal como, aunque sin limitación, acero, plástico, polímeros sintéticos y no sintéticos, pastillas de silicio, y otros metales, cerámica y vidrio. Estas técnicas se pueden usar para hacer dispositivos directamente o se puede usar para hacer una herramienta de la que se puede hacer grandes cantidades de dispositivos.
Las herramientas que se fabrican para producir en serie los dispositivos analíticos de la presente invención se pueden hacer a partir de las técnicas anteriores. Las herramientas se pueden hacer por medios tales como, aunque sin pretender limitación alguna, electrochapado. Este proceso genera una herramienta endurecida, tal como níquel, para reproducir el maestro.
Una vez que se ha fabricado una herramienta, los dispositivos analíticos pueden ser producidos en serie, aunque sin pretender limitación alguna, por gofrado, moldeo por inyección, moldeo de inyección y reacción, fundición, y moldeo por compresión. El gofrado implica imprimir una herramienta duradera calentada en un sustrato polimérico calentado. Alternativamente, se puede imprimir una herramienta fría en un sustrato polimérico calentado. El moldeo por inyección usa un polímero fundido a inyectar a una cavidad de molde. El moldeo de inyección y reacción inyecta una resina líquida que solidifica por un proceso químico. La fundición usa un proceso de moldeo a baja presión. El moldeo por compresión utiliza una herramienta calentada que se funde y conforma los dispositivos.
2. Configuración de los dispositivos de la presente invención
En general, los dispositivos de la presente invención incluirán un orificio de entrada al que se presenta inicialmente la muestra de prueba. En general, los canales son capilares y realizan el transporte de la muestra de prueba desde el orificio de entrada a través del dispositivo, una red de estructuras que proporcionan un lugar de captura, y un agujero de ventilación, tal como un orificio de salida, que ventea los gases en el dispositivo. Además, se puede añadir cámaras y capilares adicionales para personalizar un dispositivo. En general, el movimiento de la muestra de prueba a través del dispositivo se basa en fuerzas capilares. Además, se puede usar uno o varios capilares para llevar la muestra de prueba desde el orificio de entrada a los canales. Además, se puede usar uno o varios capilares para salir del área de estructuras del dispositivo. Sin embargo, se puede usar presión diferencial para mover el flujo de fluido en los dispositivos en lugar o además de las fuerzas capilares.
En lugar de un orificio de salida, se puede usar materiales de autoventilación para ventear gases en el dispositivo así como realizar la admisión de oxígeno al dispositivo. El oxígeno se puede usar en reacciones. Por ejemplo, reacciones de oxidasa, dentro del dispositivo. Se describen materiales de autoventilación y sus usos en dispositivos analíticos en la Patente de Estados Unidos US 5 478 751.
Se crean canales entre estructuras adyacentes mediante las que puede fluir fluido. Los diseños de los canales y las estructuras son importantes para optimizar el contacto entre las superficies de las estructuras y las moléculas de fluido. Típicamente, la profundidad de los canales es del orden de aproximadamente 1 micrómetro (\mum) a aproximadamente 1 milímetro (mm). La anchura media de los canales es típicamente del orden de aproximadamente 0,02 \mum a 20 \mum. La altura de las estructuras es típicamente del orden de aproximadamente 1 \mum a 1 mm y la anchura media es típicamente del orden de 1 \mum a 1 mm. Se puede seleccionar cualquier número de redes de estructuras configuradas a condición de que las zonas muertas se minimicen o eliminen. Las configuraciones preferidas de la red de estructuras están dispuestas en una red, tal como una red de diamantes, una red de octágonos, una red de hexágonos, o análogos. Las estructuras preferidas minimizan las zonas muertas. Las figuras 1, 2, 3 y 4 muestran las configuraciones preferidas de las estructuras. Además, se puede disponer más de un área de estructuras en una serie. La serie de redes se pueden conectar entre sí por capilares.
Los ensayos realizados en los dispositivos de la presente invención optimizan la captura en la superficie de la estructura. Utilizando los métodos aquí descritos, el control estricto de la geometría del lugar de captura mejora la uniformidad y eficiencia de la captura. Los canales estrechos profundos y el área superficial grande de las estructuras realizan la difusión de analito y una mejor captura de analito. El diseño de canal se basa en la difusión de una entidad en la muestra de prueba para interactuar con reactivo inmovilizado en la superficie de las estructuras. Típicamente, la entidad se distribuye aleatoriamente en la sección transversal del canal. La entidad se difunde a la superficie de estructura donde la entidad puede interactuar con el reactivo inmovilizado.
El reactivo inmovilizado puede estar unido covalentemente o no covalentemente sobre la superficie de las estructuras así como dentro de los capilares y/o cámaras. El reactivo se puede aplicar como un reactivo de liberación en el tiempo, reactivo separado espacialmente, o recubrir y secar sobre la superficie. Tales técnicas de colocación de reactivo inmovilizado en las superficies son conocidas por los expertos en la materia.
Los métodos para utilizar dispositivos de la presente invención implican elementos de unión específicos. Los métodos de detección pueden implicar la unión de un marcador de color, tal como un colorante fluorescente o una partícula de color. Alternativamente, la detección puede implicar la unión de una enzima que puede producir un producto de color.
Dado que los dispositivos se basan en capilares u otras cámaras para controlar el movimiento de fluidos, es esencial el control exacto de las dimensiones de las cámaras internas. Los dispositivos de la presente invención se pueden utilizar en aglutinación, ensayos competitivos, no competitivos e intercalados, así como con ensayos químicos clínicos estándar, tal como de glucosa y colesterol. Los ensayos pueden ser homogéneos, donde no son necesarios unos medios de separación, o heterogéneos, donde se utiliza un paso de separación. Típicamente, los ensayos realizados en los dispositivos de la presente invención son homogéneos.
Se puede usar uno o varios recorridos de flujo alternativos en los dispositivos de la presente invención. El capilar que transporta la muestra de prueba desde el orificio de entrada se bifurca en recorridos diferentes, el recorrido principal a las estructuras y los recorridos alternativos. Los recorridos alternativos pueden volver a entrar en el recorrido principal a cierta distancia del punto de bifurcación. Si la resistencia fluídica del recorrido alternativo es aproximadamente la misma que la del recorrido principal, el flujo de muestra de prueba pasará por igual por los recorridos del dispositivo. Si el recorrido alternativo tiene una resistencia fluídica sustancialmente mayor que la del recorrido principal, el flujo en el recorrido alternativo será más lento. Si el recorrido alternativo tiene una resistencia fluídica inferior a la del recorrido principal, el flujo de la muestra de prueba en el recorrido alternativo será mayor. La resistencia fluídica se puede variar dentro de cada recorrido variando el área en sección transversal del flujo, la tensión superficial, la ventilación, y viscosidad de la muestra de prueba. Estos parámetros y la distancia pueden determinar el tiempo para la reentrada en el recorrido principal. Alternativamente, cada recorrido alternativo puede fluir directamente a su propia red separada de estructuras a caudales independientes. Esto permitiría múltiples lugares de captura y permitiría determinaciones simultáneas de la presencia o cantidad de múltiples analitos en un único lugar de
prueba.
Los recorridos alternativos pueden incluir zonas para la mezcla de reactivos con muestras de prueba. Por ejemplo, se puede usar cámaras como zonas de adición de reactivo. La cámara o cámaras se pueden colocar en el recorrido alternativo así como en el recorrido principal.
Además, se puede incluir dispositivos de atrapamiento en el recorrido del dispositivo para quitar constituyentes de fluido superiores a un cierto tamaño. Por ejemplo, los dispositivos de la presente invención pueden incluir separadores, por ejemplo, para separar plasma o suero de sangre entera. Por ejemplo, una matriz de material poroso sinterizado hidrófilo puede tener un agente aglutinante de glóbulos rojos aplicado a su superficie. La matriz se podría colocar en el dispositivo antes que las estructuras. Los glóbulos rojos en toda la muestra de sangre quedan atrapados en los intersticios de la matriz mientras que el suero o plasma sustancialmente libre de glóbulos pasa a través de la matriz y es transportado por acción capilar a la parte de estructuras del dispositivo (véase la Patente de Estados Unidos 4.933.092).
Una ventaja de los dispositivos de la presente invención es que permite verificar la presencia o cantidad de un analito en microvolúmenes de muestras de prueba. Por ejemplo, se puede usar microvolúmenes de suero o plasma de una muestra de sangre entera para comprobar un analito.
Las muestras de prueba conteniendo un analito a detectar pueden ser un fluido que se utiliza directamente tal como se obtiene de la fuente o puede ser pretratado de varias formas para modificar su carácter. La muestra de prueba se introducirá entonces en el dispositivo mediante un orificio de entrada que accede a una zona receptora del dispositivo. La zona receptora del dispositivo será una cámara o un capilar. La muestra de prueba será transportada después mediante el capilar. La muestra de prueba puede encontrar uno o varios reactivos dentro de los capilares, las cámaras anteriores a las estructuras, o en las superficies de las estructuras. Los reactivos pueden implicar un sistema a partir del que se puede producir una señal detectable.
Se puede emplear cualquier muestra de prueba líquida, donde la muestra de prueba tendrá una velocidad de flujo razonable debido a la acción capilar o presión diferencial. Se ha de entender que la acción capilar o presión diferencial es la fuerza motriz del transporte de muestra de prueba. La acción capilar depende de tres factores críticos: (1) las energías superficiales del gas, la superficie en la que fluye el fluido, y el fluido, (2) las dimensiones del canal capilar, y (3) la eficiencia de ventilación. El caudal para el flujo capilar y el flujo a presión diferencial será influenciado por la geometría del capilar o la cámara y la viscosidad del fluido. Se puede influir, además, en el caudal incrementando o disminuyendo la presión diferencial. Los métodos de aplicar presiones diferenciales incluyen, aunque sin pretender limitación alguna, manuales, motores, bombas, vacío o análogos.
Si la muestra de prueba es demasiado viscosa, se puede diluir para proporcionar un caudal capilar que permite un tiempo de flujo razonable que controlará el período de tiempo para el ensayo.
La muestra de prueba se puede derivar de una fuente tal como, pero no se pretende limitarla, un fluido fisiológico tal como sangre, suero, plasma, saliva, fluido del cristalino ocular, fluido espinal cerebral, pus, sudor, exudado, orina, leche o análogos. La muestra de prueba se puede someter a tratamiento anterior, tal como, aunque sin pretender limitación alguna, extracción, adición, separación, dilución, concentración, filtración, destilación, diálisis o análogos. Además de fluidos fisiológicos, se puede emplear otras muestras de prueba líquidas y los componentes de interés pueden ser líquidos o sólidos por lo que los sólidos se disuelven o suspenden en un medio líquido.
El medio de muestra de prueba empleado puede ser un medio natural o la muestra de prueba se puede introducir en un medio líquido que proporcione las características deseadas necesarias para acción capilar y una señal detectable. Se pueden añadir aditivos y solventes al medio de muestra de prueba para incrementar o disminuir la oxigenación, estabilidad y fluidez.
Los métodos de detección incluyen, aunque sin pretender limitación alguna, cambios de color, absorción de luz, o transmisión de luz, pH, conductividad, fluorescencia, cambio de fase física o análogos.
Las muestras de prueba pueden proporcionar un componente detectable del sistema de detección, o se puede añadir tales componentes. Los componentes variarán ampliamente dependiendo de la naturaleza del sistema de detección. Tal método de detección implicará el uso de partículas, donde las partículas proporcionan dispersión de luz o un cambio de la velocidad de flujo. Las partículas puede ser, aunque sin pretender limitación alguna, células, partículas poliméricas que no son miscibles con un sistema líquido, partículas de látex, partículas de carbón vegetal, partículas metálicas, polisacáridos o partículas proteínicas, partículas cerámicas, partículas de ácido nucleico, partículas aglutinadas o análogos. La elección de las partículas dependerá del método de detección, la dispersibilidad o la estabilidad de la dispersión, inercia, participación en el cambio de flujo, o análogos.
La unión de un analito a un elemento de unión específico en el lugar de captura se puede detectar opcionalmente verificando la presión de la muestra de prueba en el dispositivo. Por ejemplo, un detector de presión conectado a la muestra de prueba que entra y sale del canal permitirá la detección de las disminuciones de presión producidas por unión de analito que da lugar a restricción del flujo del canal.
Otro método de detección incluye ensayos de hibridación. La superficie de las estructuras se puede recubrir con un reactivo inmovilizado tal como sondas de polinucleótido. Después de la unión del polinucleótido de analito complementario a la sonda de polinucleótido inmovilizada, se puede añadir una sonda marcada, por ejemplo, una sonda marcada con fluorescente, para unión al polinucleótido de analito. La cantidad de fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra de prueba. Alternativamente, el ensayo de hibridación se puede realizar en un formato competitivo donde un polinucleótido se conjuga a un marcador detectable. El polinucleótido reactivo marcado compite con el analito para unión al polinucleótido inmovilizado.
La reacción de un analito con un elemento de unión específico en el lugar de captura se puede detectar por medio de aglutinación. Por ejemplo, se puede usar una molécula marcada con fluorescente o luminiscente capaz de unirse al analito o el elemento de unión específico de analito complejo en el lugar de captura para detectar la presencia o cantidad de analito en la muestra de prueba. Por ejemplo, la aglutinación de células sanguíneas en el lugar de captura puede servir como una prueba positiva del tipo de sangre de la muestra de prueba. El reactivo inmovilizado en la superficie de las estructuras induce aglutinación, dando por ello una prueba positiva del tipo de sangre.
Se puede detectar luminiscencia en dispositivos de la presente invención. Por ejemplo, la emisión de luminiscencia puede ser fácilmente detectable usando un lector de microplacas. El analito se puede detectar por un elemento de unión específico incluyendo dos anticuerpos capaces de unión al analito, donde un anticuerpo está marcado con fluoresceína, que emite luz, y un segundo anticuerpo está marcado con rodamina, que absorbe luz. Cuando los anticuerpos marcados con rodamina y fluoresceína se unen al analito, se puede observar un apagado de la fluoresceína, indicando la presencia del analito. Otro ejemplo es donde los anticuerpos de fluoresceína se inmovilizan en el lugar de captura. El analito y el anticuerpo marcado con rodamina se suministran después al lugar de captura y se observa apagado de la fluoresceína indicando la presencia del analito.
Otro sistema de detección puede incluir detección química. Por ejemplo, la medición de glucosa correlaciona los cambios de absorción o reflectancia del medio con la concentración de glucosa. Un método común para la determinación de glucosa emplea glucosa oxidasa (GOD) y peroxidasa (POD) junto con 4-minoantipireno (4-AAP) y sulfonato de diclorohidroxibenceno (DCHBS) para medir los niveles de glucosa en orina o suero. Todos los reactivos se combinan en una matriz hinchable en agua tal como gelatina, y disponen sobre las estructuras. Las estructuras se laminan por arriba con una película clara tal como tereftalato de polietileno (PET). La muestra de prueba, generalmente suero u orina, se introduce en el orificio de entrada. Al contacto con la muestra de prueba, la gelatina dispuesta en las estructuras se hincha y libera los reactivos que reaccionan con la glucosa. A la reacción con glucosa, se forma un colorante soluble rojo que se puede medir por absorbancia, reflectancia o por observación visual.
Alternativamente, se pueden inmovilizar POD o GOD en las estructuras y se puede introducir 4-AAP y DCHBS con la muestra de prueba, iniciando la reacción.
A veces, es conveniente inmovilizar los reactivos formadores de color en un ensayo para glucosa, colesterol o analitos similares. En este caso, se puede añadir grupos de lastre, grupos alquilo de cadena larga, a una parte de la molécula colorante para hacerla menos soluble. Ejemplos de moléculas colorantes hechas menos solubles por la incorporación de unos grupos de lastre se puede hallar en Principles and Chemistry of Color Photography, Thirtle, J.R., en The Theory of the Photographic Process, 4ª edición., T.H. James, Ed., MacMillian Publishing Co., Inc., New York, 1977, pp. 369-372. Los análogos de DCHBS con lastre se podrían recubrir directamente sobre las estructuras permitiendo que se produzca formación de color solamente en una zona localizada de las estructuras.
La detección también se puede realizar utilizando enzimas. El reactivo inmovilizado se une específicamente al analito. El reactivo marcado incluye una enzima conjugada a un elemento de unión específico para el analito. Se adiciona un sustrato para la enzima haciendo por ello una reacción enzimática entre la enzima y el sustrato. La cantidad de la enzima detectada y medida se puede correlacionar con la cantidad de analito presente en la muestra de prueba. Por ejemplo, se usa comúnmente fosfatasa alcalina como un reactivo de detección enzimático en ensayos de diagnóstico, en particular formatos de ensayo de unión específica. Alternativamente, el reactivo marcado puede incluir una enzima y un elemento de unión específico que se une específicamente al reactivo inmovilizado. Se añade un sustrato para la enzima haciendo por ello una reacción enzimática entre la enzima y el sustrato. La cantidad de la enzima detectada y medida se puede correlacionar con la cantidad de analito presente en la muestra de prueba.
Los analitos de interés varían ampliamente dependiendo de las finalidades del ensayo y la fuente de la muestra de prueba. Los analitos pueden incluir una proteína, un péptido, un aminoácido, un hidrato de carbono, una hormona, un esteroide, una vitamina, un lípido, un ácido nucleico, un elemento traza, una droga incluyendo las administradas para efectos terapéuticos así como las administradas para fines ilícitos, una bacteria, un virus, y un metabolito. La agregación de moléculas también puede ser de interés, en particular las agregaciones que existen naturalmente tal como viroides, virus, células procarióticas y eucarióticas incluyendo microorganismos unicelulares, células de mamíferos tal como linfocitos, células epiteliales, neoplásicos y análogos. Además, los analitos pueden ser cualquier sustancia para la que existe una molécula de unión natural (por ejemplo, un receptor de unión de anticuerpo) o para la que se puede preparar una molécula de unión, y el analito se puede unir a una o varias moléculas de unión en un ensayo. El analito incluye así sustancias antigénicas, haptenos, anticuerpos, sus combinaciones, y análogos.
Se puede incluir otros aditivos para efectos específicos. Las soluciones tampón pueden ser deseables para mantener un pH particular. También se puede incluir inhibidores enzimáticos. Otros reactivos de interés son, aunque sin pretender limitación alguna, anticuerpos, enzimas, antígenos, péptidos, biotina/avidina, conservantes, estabilizantes, activadores, sustratos enzimáticos y cofactores, oxidantes, reductores, o análogos. Como se entenderá, los aditivos o reactivos adicionales no interferirán con la realización del ensayo.
Además, se puede utilizar unos medios de control para verificar un resultado de ensayo. Unos medios de control incluyen un ensayo de confirmación que se lleva a cabo esencialmente automática y simultáneamente con el ensayo para la detección de analito. En una realización concreta, la muestra de prueba conteniendo el analito se pone en contacto con una cantidad predeterminada de reactivo marcado para formar una mezcla conteniendo un complejo de analito/reactivo marcado. La mezcla resultante es transportada a través del dispositivo por acción capilar. En un primer recorrido, la mezcla contacta un lugar de captura conteniendo un elemento de unión específico antianalito inmovilizado que se une al complejo de analito/reactivo marcado. Este lugar de captura es el lugar de captura de muestra de prueba. En un segundo recorrido, la mezcla contacta primero una zona de reactivo conteniendo un reactivo de control positivo. El reactivo de control positivo es un elemento de unión específico móvil que tiene la misma especificidad de unión para el reactivo marcado que el analito de muestra de prueba. El reactivo de control positivo puede ser un analito idéntico al de la muestra de prueba o un análogo de analito correspondiente. Cuando la mezcla contacta la zona de reactivo de control positivo, el reactivo de control positivo se reconstituye y une específicamente con reactivo marcado no unido para formar un complejo de reactivo de control positivo/reactivo marcado. Este complejo migra al lugar de captura de control positivo. El lugar de captura de control positivo contiene el mismo elemento de unión específico antianalito inmovilizado que el primer recorrido. Por lo tanto, el lugar de captura de control positivo es capaz de formar un complejo inmovilizado detectable. Una señal detectable en el lugar de captura de control positivo confirma que los reactivos de ensayo son funcionales y que el resultado de prueba es válido. Por ejemplo, cuando no está presente analito en una muestra de prueba, el resultado negativo de la muestra de prueba se confirma como un resultado de prueba válido cuando el lugar de captura de control positivo tiene una señal detectable y el lugar de muestra de prueba no tiene señal detectable. Cuando está presente analito en una muestra de prueba, el resultado positivo de la muestra del paciente se confirma como un resultado de prueba válido cuando el lugar de captura de control positivo tiene una señal detectable y el lugar de captura de muestra de prueba tiene señal detectable. Ninguna señal detectable en el lugar de captura de control positivo propiamente dicho indica que los reactivos del sistema de marcación se han degradado o que otros factores en la muestra de prueba han interferido con la unión del reactivo marcado al reactivo de control positivo o con la unión del complejo de control positivo marcado al elemento de unión específico inmovilizado situado en el lugar de captura de control
positivo.
Los dispositivos de la presente invención también pueden incorporar mecanismos y/o zonas de control adicionales, por ejemplo, para indicar el final de un ensayo. Estos otros mecanismos de control son conocidos por los expertos en la materia.
El dispositivo puede tener varias regiones que se pueden usar para adición de reactivo, filtración y análogos así como que tiene zonas separadas donde la acción capilar y la presión diferencial mueven por separado el flujo de fluido.
Los tipos de ensayos que utilizan los dispositivos analíticos de la presente invención son numerosos. En ensayos intercalados, el reactivo marcado que incluye un elemento de unión específico con afinidad para el antígeno se puede unir al complejo de elemento de unión específico/analito inmovilizado. La respuesta de señal es directamente proporcional a la concentración de analito.
En ensayos de competición, la competición se establece entre los analitos y el reactivo marcado. La respuesta de señal es inversamente proporcional a la concentración de analito.
Los dispositivos de la presente invención también se pueden hacer en forma de una cubeta. Las estructuras se pueden hacer dentro de una caja que tiene una ventana transparente que permitirá a los instrumentos detectar la captura en el lugar de captura. La cubeta se puede colocar en un espectrofotómetro y leer. Por ejemplo, se puede construir una cubeta colocando una capa superior de película Filcher Hamilton (Filcher Hamilton Corporation, Greer, S.C., 29651) encima del dispositivo de la presente invención. Se puede colocar un orificio de entrada en la capa superior o puede permanecer como una parte del dispositivo. Se aplicó una cinta adhesiva de doble cara (3M Corp., St. Paul, MN., 55144) a la superficie inferior de la capa superior. Se puede colocar una muestra de prueba en el orificio de entrada y la captura se produce en los lugares de captura.
Los dispositivos de la presente invención también se pueden hacer en forma de una tira de ensayo donde un extremo de la tira de ensayo se pone en contacto con una muestra de prueba líquida conteniendo un analito. La muestra de prueba es transportada a través del dispositivo por acción capilar donde la captura del analito se producirá en las estructuras. Tales dispositivos también se pueden hacer en forma de varillas de inmersión (véase la Patente de Estados Unidos 5.200.317).
Los dispositivos de la presente invención también pueden comprobar múltiples analitos en un solo dispositivo analítico. Se puede diseñar regiones de estructuras diferentes y/o separadas, teniendo cada una un reactivo inmovilizado específico para un analito diferente colocado en ellas que se unirá al analito y/o reactivo marcado respectivo. Las regiones de estructuras separadas se pueden disponer en una serie o se pueden disponer con múltiples recorridos. La instrumentación se puede programar para leer independientemente las diferentes regiones. Un ejemplo es un ensayo de abuso de drogas por lo que una región de las estructuras tiene anticuerpos antibenzoilecognina inmovilizados en ella, otra región de las estructuras tiene anticuerpos anticannabinoides inmovilizados, y otra región de las estructuras tiene anticuerpos antianfetamina inmovilizados. Una muestra de prueba conteniendo metabolitos y/o moléculas de alguna o las tres drogas se unirá a sus regiones respectivas. Las detecciones de positivos y negativos se pueden hacer visualmente y/o con instrumentación. Cada región de las estructuras que comprueba un analito diferente puede tener reactivos específicos inmovilizados para dicho analito.
3. Diseño de canales para captura de entidades por difusión
Lo que sigue es un resumen de las ecuaciones necesarias para calcular aproximadamente la eficiencia de captura en dispositivos de la presente invención que utilizan estructuras para captura de analito. Las ecuaciones se han generalizado para aplicación a una geometría en sección transversal arbitraria de los canales. Estas ecuaciones deberán dirigir una amplia variedad de diseños de canal potenciales. Puesto que las ecuaciones se aplican a un diseño general, no proporcionan directamente una predicción numérica de la eficiencia de captura. En cambio, la forma en sección transversal de los canales se debe definir primero y se debe precalcular la correspondiente distribución de velocidad de fluido, U(y, z), usando métodos estándar. Después, incorporando estos dos valores a las ecuaciones, se puede derivar una única aproximación numérica de la eficiencia de captura y correlacionar frente a parámetros tales como la longitud de canal (L), el diámetro de entidad (d), y los coeficientes de reacción de pared (k). Dos secciones transversales de canal ejemplares para las que se puede formular fácilmente un resultado numérico incluyen una forma rectangular y otra circular. Sin embargo, no hay límites con respecto al tipo de forma en sección transversal que se puede evaluar.
A continuación se describen todos los supuestos analíticos que implican las ecuaciones. Éstas definen el rango de diseños de canal y condiciones de flujo para los que las ecuaciones son válidas.
Supuestos primarios para cálculos
1. Condiciones de estado de régimen del fluido. El fluido (con entidades) llena completamente el canal, y la velocidad del fluido no varía con el tiempo.
2. Flujo laminar incompresible. Este supuesto es aplicable a todos los tipos de líquidos y valores de caudal explicados.
3. Niveles diluidos de concentración de entidades (inferiores a 5% por volumen). Esto garantiza que la distribución de velocidad del fluido se pueda resolver independientemente de presencia de entidades, y que no se produzcan interacciones apreciables entre entidades durante el transporte de fluido.
4. La forma en sección transversal de los canales y el tamaño permanecen constantes en toda la longitud del canal (por lo tanto, se excluyen los pasos convergentes o divergentes de fluido en la zona de captura). Esto implica que todo el fluido avanza exclusivamente en la dirección del canal y no hay variaciones de la velocidad a lo largo de la longitud.
Ecuaciones generales (tridimensionales)
Transporte de régimen de entidades suspendidas dentro del canal, debido a efectos de convección y difusión de fluido, donde C = C(x,y,z) = nivel de concentración de entidades locales:
1
Coordenadas espaciales normalizadas y velocidad normalizada del fluido dentro del canal:
x^{*}=x/L 
\hskip0.5cm
U^{*}_{x}=U_{x}/\overline{U}
y^{*} =y/\overline{W}
z^{*} =z/\overline{W}
Ecuación de la velocidad de unión de entidades que contactan las paredes de canal:
2
Velocidad de flujo de las entidades que entran en el canal y salen del canal:
3
Valor de eficiencia de captura de entidades:
4
Densidad local de entidades capturadas a lo largo de la longitud de canal:
5
Definiciones de los símbolos
C
Nivel de concentración local de entidades suspendidas dentro del canal = f(x,y,z).
x
Coordenada espacial en la dirección de flujo de canal (paralela a las paredes de canal).
y,
z Coordenadas espaciales ortogonales a la dirección de flujo de canal.
\overline{W}
Valor característico de la anchura de canal.
L
Longitud de canal.
d
Diámetro de entidad.
D
Coeficiente de difusión de entidades dentro del fluido.
k
Coeficiente de unión-reacción de entidades en las paredes de canal.
\Phi
Parámetro de dispersión de canal.
\overline{U}
Velocidad media del fluido de canal.
U_{x}
Perfil de velocidad de fluido de canal = f(y, z).
n_{y}
Vector normal unitario en la pared de canal que mira al fluido (componente y de vector).
n_{z}
Vector normal unitario en la pared de canal que mira al fluido (componente z de vector).
\varepsilon
Valor de eficiencia de captura de entidades del canal.
\rho(x)
Densidad local de entidades capturadas a lo largo de la longitud de canal (entidades/longitud unitaria).
N_{in}
Cantidad total de entidades que entran en el canal.
Las directrices de diseño del dispositivo para maximizar la captura de entidades por difusión son: minimizar la anchura de canal y los caudales maximizando al mismo tiempo el área superficial de captura de las estructuras. El uso de diseños de estructura particulares puede minimizar las zonas muertas de fluido. Esto permite exponer al flujo de fluido cualquier reactivo inmovilizado en la superficie de las estructuras.
Además, los dispositivos de la presente invención pueden tener un aspecto de control del caudal volumétrico de fluido. En otros dispositivos movidos por capilares, los caudales muestran una disminución en el tiempo cuando el fluido pasa a través del dispositivo, dando lugar a una eficiencia de captura cambiante con el tiempo. La presente invención puede incluir una disminución de las dimensiones de los capilares, un cambio del área en sección transversal, o un cambio de la humectabilidad para mantener constante el caudal de muestra total con el tiempo en el dispositivo. El control de la velocidad de flujo volumétrico en dispositivos de la presente invención permite una eficiencia de captura controlada.
En los ejemplos siguientes se describen ensayos que utilizan la presente invención. Se pretende que los ejemplos sean realizaciones de la presente invención y no se pretende limitar la presente invención a los ejemplos. En los ejemplos, las estructuras están dispuestas en filas a lo ancho del dispositivo. En los Ejemplos 2-5, un resultado positivo para analito en una muestra de prueba producirá una barra visual a lo ancho del dispositivo en el lugar de captura.
Ejemplo 1
Se recubren las estructuras con 0,5 microlitros (\mul) de solución de 2 miligramos por mililitro (mg/ml) de hormona humana estimulante del tiroides anti-beta (hTSH) (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL., 60064) e incuban durante 90 minutos a 37º Celsius (C). Las estructuras se recubren después con 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) en solución tampón de ácido 3-[N-morfolino] propanosulfónico (MOPS) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., 63178), pH 7,0, y se deja incubar durante 4 horas al menos. Las estructuras se lavan después en salina fosfato tamponada (PBS) para quitar cualquier proteína no unida.
Las estructuras de poliestireno se laminan en la parte superior con una capa de película de policarbonato recubierta Vistek con refuerzo de adhesivo.
Se introducen muestras de 50 \mul de calibradores hTSH en un orificio de entrada de los dispositivos mediante una Hamiliton Syringe de 250 \mul (Hamilton Co., Reno, NV., 89502) movida por una Sage Instruments Syringe Pump (Cole-Parmer Instruments, Chicago, IL., 60648) a un caudal de 0,55 \mul/minuto. Las muestras se premezclan con micropartículas fluorescentes naranja de 282 nanómetros (nm) de diámetro en solución (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR., 97402) con hTSH antialfa (Abbott Laboratories) conjugada a la superficie de las micropartículas.
La mezcla incluye 1 parte de una solución de micropartículas a 0,1%, 2 partes de diluyente IMx® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) y 6 partes de los calibradores hTSH (50 \mul = 6 partes). El ensayo se realiza durante aproximadamente 5 minutos.
Los dispositivos se analizan con un medidor de reflectancia usando un haz dividido de 2 milímetros (mm) explorado mediante un filtro de excitación de 485 nm, un filtro dicroico de 505 nm, y un filtro de emisión de 560 nm. Las micropartículas tienen una longitud de onda de excitación máxima de 505 nm y una fluorescencia máxima a 560 nm. Las partes se exploran a través de toda su longitud de 15 mm con una velocidad de muestreo de 100 puntos por milímetro. La captura de micropartículas por anticuerpo hTSH antibeta unido a estructura es directamente proporcional a la concentración de hTSH en la muestra.
Ejemplo 2
Se recubren partículas de polipirrol negras con anticuerpo policlonal de cabra a antígeno de superficie de hepatitis B (antiHBsAg). Las partículas de polipirrol recubiertas se aplican a la superficie de una cámara anterior a las estructuras del dispositivo. Las estructuras tienen anticuerpo antiHBsAg monoclonal de ratón inmovilizado en sus superficies. El anticuerpo monoclonal de ratón es reactivo a un epítopo de antígeno de superficie diferente del anticuerpo policlonal de cabra.
Se adiciona una muestra de prueba conteniendo HBsAg al orificio de entrada del dispositivo donde se transporta a la cámara. La muestra de prueba se mezcla con las partículas de polipirrol recubiertas, por lo que la muestra de prueba HBsAg se une específicamente a las partículas recubiertas de antiHBsAg. La acción capilar saca el complejo antígeno-anticuerpo-partícula de la cámara y lo lleva a la red de estructuras. El complejo antígeno-anticuerpo-partícula se acumulará en el lugar de captura en proporción a la cantidad de muestra de prueba HBsAg. Una inspección visual de la formación de una barra negra indica la presencia de HBsAg en la muestra de prueba.
Ejemplo 3
Se recubren partículas de polipirrol negras con un antígeno HBsAg recombinante. Las partículas de polipirrol recubiertas se aplican a la superficie de una cámara anterior a las estructuras del dispositivo. Las estructuras se recubren con un antígeno HBsAg recombinante diferente. Se adiciona una muestra de prueba conteniendo anticuerpo antiHBsAg al orificio de entrada del dispositivo donde se transporta a la cámara. La muestra de prueba se mezcla con las partículas de polipirrol recubiertas, por lo que el anticuerpo antiHBsAg de la muestra de prueba se une específicamente a las partículas recubiertas con HBsAg recombinante. La acción capilar saca el complejo antígeno-anticuerpo-partícula de la cámara y lo lleva a la red de estructuras. Las partículas de polipirrol se acumularán en el lugar de captura en proporción a la cantidad de anticuerpo antiHBsAg de la muestra de prueba. La presencia del anticuerpo antiHBsAg en la muestra de prueba se determina por la formación de una barra negra.
Ejemplo 4
Se recubren partículas de polipirrol negras con antígeno VIH recombinante p41 que es común a ambos VIH-1 y VIH-2. Las partículas de polipirrol recubiertas se aplican a la superficie de una cámara anterior a las estructuras del dispositivo. Las estructuras se recubren con antígeno recombinante p41 así como antígeno p24 de ambos virus VIH-1 y VIH-2.
Una muestra de prueba conteniendo anticuerpo antiVIH se adiciona al orificio de entrada del dispositivo donde se transporta a la cámara. La muestra de prueba se mezcla con las partículas de polipirrol recubiertas, por lo que se une anticuerpo antiVIH de muestra de prueba específico para el antígeno VIH recombinante recubierto en las partículas. La acción capilar saca el complejo anticuerpo-antígeno-partícula de la cámara y lo lleva a la red de estructuras.
Las partículas de polipirrol se acumularán en el lugar de captura en proporción a la cantidad de anticuerpo antiVIH de muestra de prueba. Una inspección visual de la formación de una barra negra indica la presencia de anticuerpo antiVIH en la muestra de prueba.
Ejemplo 5
Se recubren partículas de polipirrol negras con una mezcla de anticuerpos monoclonales específicos para antígeno VIH común a ambos VIH-1 y VIH-2. Las estructuras se recubren con una mezcla de anticuerpos monoclonales específicos para antígeno VIH común a ambos virus VIH-1 y VIH-2.
Una muestra de prueba conteniendo antígeno VIH común a ambos virus VIH-1 y VIH-2 se adiciona al orificio de entrada del dispositivo donde es transportada por acción capilar a la red de estructuras. El antígeno VIH común a ambos virus VIH-1 y VIH-2 en la muestra de prueba se une específicamente a los anticuerpos monoclonales que se recubren en la superficie de las estructuras. Una solución de partículas de polipirrol recubiertas en salina fosfato tamponada (PBS) se adiciona al orificio de entrada y es transportada por fuerzas capilares a las estructuras donde las partículas de polipirrol se unen específicamente al antígeno VIH capturado en el lugar de captura.
Las partículas de polipirrol se acumularán en el lugar de captura en proporción a la cantidad de antígeno VIH de la muestra de prueba. Una inspección visual de la formación de una barra negra indica la presencia de VIH antígeno en la muestra de prueba
Ejemplo 6
Se une un polinucleótido a una partícula marcada con fluorescente (fluoresceína). Las partículas fluorescentes recubiertas se aplican a la superficie de una cámara anterior a las estructuras del dispositivo. Las estructuras también se recubren con un polinucleótido que es complementario del nucleótido de interés.
Una muestra de prueba conteniendo una secuencia de nucleótidos de interés que está presente en una muestra de prueba o ha sido amplificada mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) o reacción en cadena de ligasa (LCR), se adiciona al orificio de entrada del dispositivo donde se transporta a la cámara. La muestra de prueba se mezcla con las partículas fluorescentes recubiertas de polinucleótido, por lo que el nucleótido de interés de la muestra de prueba se une a las partículas marcadas con fluorescente de polinucleótido complementario. La acción capilar saca el completo de nucleótido-polinucleótido complementario-partícula fluorescente de la cámara y lo lleva a la red de estructuras.
El complejo se unirá al polinucleótido complementario en el lugar de captura en proporción a la cantidad de nucleótido de interés de la muestra de prueba.
Ejemplo 7
Se acopla un material polianiónico a una mezcla de anticuerpos antiVIH monoclonales que son específicos para antígeno VIH común a ambos VIH-1 y VIH-2. El material polianiónico se coloca en la superficie de una cámara anterior a las estructuras del dispositivo. Las estructuras se tratan con una solución catiónica, tal como ácido poliglutámico.
Una muestra de prueba conteniendo antígeno VIH común a ambos VIH-1 y VIH-2 se adiciona al orificio de entrada del dispositivo donde es transportada por acción capilar a la cámara. La muestra de prueba se mezcla con los anticuerpos acoplados al material polianiónico, por lo que el antígeno VIH de la muestra de prueba común a ambos VIH-1 y VIH-2 se unirá específicamente a los anticuerpos. La acción capilar saca el complejo de antígeno VIH-anticuerpo antiVIH-polianión de la cámara y lo lleva a la red de estructuras.
El material polianiónico se capturará por el material catiónico en las superficies de las estructuras. Las partículas marcadas con fluorescente (fluoresceína) acopladas a anticuerpos antiVIH que son específicos para antígeno VIH común a ambos VIH-1 y VIH-2 se adicionan al orificio de entrada del dispositivo. La acción capilar transporta las partículas marcadas acopladas a anticuerpos antiVIH a las estructuras del dispositivo donde se unirán a antígeno VIH común a ambos VIH-1 y VIH-2 que son capturados al lugar de captura.
Las partículas marcadas con fluorescente acopladas a anticuerpos antiVIH se acumularán en el lugar de captura en proporción a la cantidad de antígeno VIH de la muestra de prueba común a ambos VIH-1 y VIH-2.

Claims (12)

1. Un dispositivo analítico para determinar la presencia o una cantidad de un analito en una muestra de prueba incluyendo, en combinación:
una capa base;
una red de estructuras que tiene una anchura media del orden de 1 \mum a 1 mm y una altura del orden de 1 \mum a 1 mm que surge de dicha capa base, teniendo cada una de dichas estructuras una superficie que proporciona reactivo inmovilizado, dicho reactivo inmovilizado unido covalentemente o no covalentemente a dicha superficie de dicha estructura, siendo dicho reactivo inmovilizado capaz de unir un elemento seleccionado del grupo que consta de analito, análogo de analito, elemento auxiliar de unión, y reactivo marcado; y
una pluralidad de canales que tienen una anchura media del orden de 0,02 \mum a 20 \mum y una profundidad del orden de 1 \mum a 1 mm junto a dichas estructuras, donde dicha muestra de prueba conteniendo dicho analito, análogo de analito, elemento auxiliar de unión, o reactivo marcado fluye a través de dichos canales, difundiéndose dicho analito, análogo de analito, elemento auxiliar de unión, o reactivo marcado a lo ancho de dichos canales uniéndose a dicho reactivo inmovilizado,
caracterizado porque las estructuras están dispuestas en filas a lo ancho del dispositivo y son de forma similar, seleccionándose dichas formas a partir del grupo que consta de diamantes, hexágonos, octágonos, rectángulos, cuadrados, círculos, semicírculos, triángulos y elipses.
2. El dispositivo analítico de la reivindicación 1, donde dicho analito se selecciona a partir del grupo que consta de antígeno, secuencia de nucleótidos, lectina, o avidina y dicho reactivo inmovilizado se selecciona a partir del grupo que consta de anticuerpo, secuencia de nucleótidos complementaria, hidrato de carbono o biotina.
3. El dispositivo analítico de la reivindicación 1, donde dichas estructuras se hacen con copolímeros, mezclas, laminados, láminas metalizadas, películas metalizadas o metales depositados sobre un material seleccionado del grupo que consta de:
poliolefinas, poliésteres, polímeros conteniendo estireno, policarbonato, polímeros acrílicos, polímeros conteniendo cloro, homopolímeros y copolímeros de acetal, celulósicos y sus ésteres, nitrato de celulosa, polímeros conteniendo flúor, poliamidas, poliimidas, polieteretercetonas, polímeros conteniendo azufre, poliuretanos, polímeros conteniendo silicio, vidrio, y materiales cerámicos.
4. El dispositivo analítico de la reivindicación 1, donde dicha red de estructuras están escalonadas con relación a la dirección de flujo de muestra de prueba.
5. El dispositivo analítico de la reivindicación 1, incluyendo además un separador tratado con un agente aglutinante de glóbulos rojos.
6. El dispositivo analítico de la reivindicación 1, donde dicha red de estructuras tienen múltiples reactivos inmovilizados para analizar múltiples analitos en dicha muestra de prueba.
7. El dispositivo analítico de la reivindicación 1, incluyendo además una cámara para la adición de muestra, teniendo dicha cámara una pluralidad de recorridos para transportar dicha muestra de prueba desde dicha cámara, conduciendo cada uno de dichos recorridos a una red de dichas estructuras.
8. El dispositivo analítico de la reivindicación 1, donde dicho reactivo inmovilizado es capaz de unir un elemento en dicha muestra de prueba seleccionado a partir del grupo que consta de analito, analito analógico y un elemento auxiliar de unión, incluyendo además dicho dispositivo un reactivo marcado incluyendo un elemento de unión específico conjugado a un marcador detectable, siendo dicho marcador detectable capaz de producir una señal en dicho reactivo inmovilizado, indicando dicha señal la presencia o cantidad de dicho analito en dicha muestra de prueba.
9. El dispositivo analítico de la reivindicación 1, incluyendo además un orificio de entrada y un agujero de ventilación.
10. Un método para determinar la presencia o una cantidad de un analito en una muestra de prueba empleando un dispositivo analítico incluyendo, en combinación:
una capa base;
un orificio de entrada y un agujero de ventilación;
una red de estructuras que tiene una anchura media del orden de 1 \mum a 1 mm y una altura del orden de 1 \mum a 1 mm que surgen de dicha capa base, teniendo cada una de dichas estructuras una superficie que proporciona reactivo inmovilizado, dicho reactivo inmovilizado unido covalentemente o no covalentemente a dicha superficie de dicha estructura, siendo dicho reactivo inmovilizado capaz de unir un elemento seleccionado del grupo que consta de analito, análogo de analito, elemento auxiliar de unión, y reactivo marcado; y
una pluralidad de canales que tienen una anchura media del orden de 0,02 \mum a 20 \mum y una profundidad del orden de 1 \mum a 1 mm junto a dichas estructuras;
incluyendo dicho método añadir dicha muestra de prueba a dicho orificio de entrada, transportando dicha pluralidad de canales dicha muestra de prueba desde dicho orificio de entrada a dicha red de estructuras;
entrando dicha muestra de prueba en dichos canales, difundiéndose dicho analito a lo ancho de dichos canales donde dicho analito está unido a dicho reactivo inmovilizado; y
detectar dicho analito a través de un sistema de detección de analito que incluye un elemento de unión específico conjugado a un marcador detectable, siendo dicho marcador detectable capaz de producir una señal en dicho reactivo inmovilizado,
caracterizado porque las estructuras están dispuestas en filas a lo ancho del dispositivo y son de forma similar, seleccionándose dichas formas a partir del grupo que consta de diamantes, hexágonos, octágonos, rectángulos, cuadrados, círculos, semicírculos, triángulos y elipses.
11. El método de la reivindicación 10, donde dicho reactivo inmovilizado es un material policatiónico capaz de unir un elemento auxiliar de unión que es un material polianiónico acoplado a un elemento de unión específico de analito, incluyendo además dicho método el paso de combinar dicho elemento auxiliar de unión con dicha muestra de prueba donde dicho elemento de unión específico de analito une dicho analito antes de añadir dicha muestra de prueba a dicho orificio de entrada.
12. Un método de fabricar un dispositivo analítico de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 a partir de un maestro, seleccionándose dicho método a partir del grupo que consta de acción láser, LIGA, micromaquinado, fotolitografía, ataque de iones reactivos, fresado por haz de iones, gofrado, electroformación, electrochapado, moldeo por inyección, moldeo por compresión, fundición o moldeo por inyección y reacción.
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