ES2213355T3

ES2213355T3 - Cocteles de inmunotoxinas para el tratamiento de enfermedades de origen inmunologico.

Info

Publication number: ES2213355T3
Application number: ES99910879T
Authority: ES
Inventors: Ypke Vincentius Johannes Maria Van Oosterhout; Janny Elisabeth Van Emst
Original assignee: IMMUNOTOKO BV
Current assignee: IMMUNOTOKO BV
Priority date: 1998-03-23
Filing date: 1999-03-19
Publication date: 2004-08-16
Anticipated expiration: 2019-03-19
Also published as: WO1999048534A1; AU2964099A; EP0945139A1; DE69913508D1; ATE255908T1; EP1066058A1; NZ507171A; DE69913508T2; EP1066058B1; CA2325439A1

Abstract

Utilización de un compuesto que comprende una mezcla de, como mínimo, una primera molécula que reconoce específicamente CD3 y, como mínimo, una segunda molécula que reconoce específicamente CD7, de manera que, como mínimo, una de las moléculas de reconocimiento específico está dotada de una fracción tóxica, en la preparación de un medicamento para la supresión o eliminación "in vivo" de células T mal direccionadas, super-reactivas o malignas y/o células NK, para el tratamiento de enfermedad de Injerto con respecto a Hospedante, rechazos de Injertos, leucemias por células T, linfomas por células T u otras enfermedades malignas positivas a CD3 y/o CD7, enfermedades autoinmunes o enfermedades inmunes infecciosas tales como infección HIV.

Description

Cócteles de inmunotoxinas para el tratamiento de enfermedades de origen inmunológico.

La presente invención se refiere al sector de enfermedades relacionadas con el sistema inmunológico, en particular se refiere a nuevos medios y métodos para el tratamiento de estas enfermedades. Más particularmente, la invención da a conocer nuevos medios para eliminar o reducir poblaciones de células no deseadas CD3 y/o CD7 positivas.

De manera típica, la presente invención es aplicable al sector de transplante de tuétano de hueso alogenéico.

El transplante de tuétano de hueso alogenéico (BMT) es un método mundialmente aceptado para tratar una serie de graves enfermedades tales como leucemia, síndrome mielo-displásico, deficiencia de tuétano de hueso, inmunodeficiencia, enfermedades de almacenamiento y hemoglobinopatías (1-6). Para un buen injerto, el tuétano de hueso debe contener un mínimo de células T (7-10). Estas células pueden conferir también ventajas, dado que contribuyen al llamado efecto de injerto contra leucemia que comporta la eliminación de células malignas residuales (11-13). No obstante, las células cedentes T pueden reaccionar con tejidos normales del hospedante, provocando enfermedad de injerto contra hospedante (GVHD) que tiene como resultado daños graves en la piel, hígado y conducto gastrointestinal (2,14-16). Cuando se presenta esta enfermedad dentro de los tres primeros meses después de BMT, se clasifica como GVHD aguda, y cuando se desarrolla en una etapa posterior se designa como GVHD crónica. La gravedad de los síntomas clínicos se expresa en cuatro grados, de los que el grado I hace referencia a GVHD mínimo, y el grado IV a la forma más grave que es habitualmente mortal y comporta epidermiolisis, fallo hepático y diarrea grave (14).

La incidencia y severidad de GVHD se puede disminuir por agotamiento de las células T del injerto. En el University Hospital Nijmegen, el 98% de los linfocitos son agotados del injerto utilizando centrifugación en contraflujo (17). No obstante, a pesar del agotamiento de la mayor parte de células T, se puede presentar todavía GVHD. La incidencia anual de grado 11 por GVHD IV en la University Hospital Nijmegen es de 6 de un total de receptores de transplantes de tuétano de hueso alogenéico. GVHD se presenta a escala mundial en 30-70% de los receptores HLA y contribuye a la muerte en 20-40% de los afectados (2,18). Incluso en el caso de que el paciente sobreviva al GVHD grave, esto tiene como resultado discapacidades duraderas y morbididad que conduce a repetidas admisiones en hospitales. El desarrollo del tratamiento alternativo efectivo para GVHD tendrá, por lo tanto, un impacto muy importante tanto en la supervivencia como en la calidad de vida de los receptores de BMT alogenéico.

El tratamiento actual es habitualmente el que se describe.

Se administra por vía intravenosa ciclosporina como inmunoprofiláctico, desde un día antes del transplante hacia adelante (3 mg/kg/d durante 15 días, y posteriormente 2 mg/kg/d). Tan pronto como el paciente puede tomar medicamentos orales, se administra ciclosporina por vía oral (6 mg/kg/d). Si el paciente desarrolla GVHD, se administra como terapia de primera línea corticosteroides (prednisona: 1 mg/kg/d). En el caso de que el paciente no responda a esta terapia dentro de 48 horas, o si GVHD es progresiva dentro de 24 horas, se administran como segunda línea de terapia altas dosis de metilprednisolona (Solumedrol 4 x 250 mg/día). Cuando fallan las altas dosis de metilprednisolona, los pacientes son habitualmente tratados con Leucotak (a-IL2-receptor MoAb) (19). Si bien se aprecian respuestas en algunos casos durante la administración de Leukotac, GVHD recurre normalmente una vez se discontinua el tratamiento. GVHD será, eventualmente, mortal para el 90% de los pacientes que no responden a la segunda línea de terapia dentro de 3-5 días.

La presente invención da a conocer nuevos medios y métodos para tratar, entre otras, GVHD utilizando moléculas que reconocen específicamente receptores en las células a eliminar. En una serie de realizaciones preferentes, como mínimo, una de dichas moléculas se acoplará a una fracción tóxica. Estas moléculas reciben frecuentemente la designación de inmunotoxinas.

Una inmunotoxina (IT) es un conjugado, por ejemplo, de un anticuerpo monoclonal (MoAb), usualmente desarrollado en un ratón, acoplado a una potente toxina tal como la cadena A de la potente toxina de la planta ricina (RTA) (figura 1).

El mecanismo de acción de la IT se muestra en la figura 2. La fracción MoAb se une en primer lugar, específicamente, a un antígeno expresado en las células que se tienen que eliminar, después de lo cual se internaliza el complejo completo antígeno-IT. Una vez dentro de la célula, el enlace entre el MoAb y la toxina es interrumpido liberando de esta manera toxinas libres al citoplasma, donde inhibe la síntesis de proteínas de manera irreversible por una reacción catalítica que culmina en la muerte de la célula. Dado que la fracción de toxina es incapaz de entrar en la célula de forma autónoma y es inactiva fuera de la célula, las IT son solamente peligrosas para las células que expresan el antígeno diana específico y son capaces de internalizar el complejo IT.

Desde su introducción en 1979, las IT han sido utilizadas para tratar una serie de enfermedades incluyendo tumores sólidos y difusos, desórdenes inmunológicos e infecciones víricas. En el Departamento de Hematología de la University Hospital Nijmegen, las IT han sido investigadas desde 1984 dentro del marco de los transplantes de tuétano de hueso para eliminar células malignas T/B de injertos autólogos de tuétano de hueso y células T normales de injertos de tuétano de hueso alogenéicos (21-31).

Los resultados clínicos publicados hasta el momento proceden principalmente de estudios de Fase I/II. Las toxicidades habitualmente observadas en Fase I limitadoras de la dosis de las RTA-IT son síndrome de fuga vascular (VLS) y mialgias. Estos efectos secundarios, debido a los efectos de "espectador" de la toxina, se mostraron transitorias y cesaron, en general, poco tiempo después de cesar la administración de la inmunotoxina (32). Dos pruebas distintas demostraron la toxicidad debida a reactividad cruzada de la parte MoAb con tejidos no deseados (33,34). En ambos casos, las IT dirigidas contra carcinoma de ovario y carcinoma de seno, respectivamente, reaccionaron de forma cruzada con tejidos neurales, resultando en neurotoxicidad grave. Estas observaciones acentúan la importancia de extenso rastreo preclínico para determinar la reactividad cruzada con tejidos normales. Una característica común en la mayor parte de pruebas clínicas era el desarrollo de anticuerpos humanos contra MoAb y la parte de toxina de IT (32). Estas respuestas humorales inmunes no estaban asociadas con una toxicidad incrementada ni reacciones alérgicas, sino que disminuyeron la media vida del suero de la IT. No obstante, se apreciaron respuestas clínicas incluso enfrente de anticuerpo anti IT (35-37).

La eficacia del tratamiento con las IT, tal como se ha observado en las pruebas de fase I, ha desmostrado que está fuertemente influenciada por la accesibilidad de las células objetivo. Hasta el momento, el tratamiento de tumores sólidos ha mostrado poco éxito, mientras que el tratamiento de desórdenes tales como linfomas y ciertas enfermedades inmunológicas ha tenido como resultado respuestas parciales y completas en 12-75% de los casos (38). Estos resultados son notables teniendo en cuenta el hecho de que el tratamiento de cáncer con >90% de los medicamentos actualmente disponibles produce menos del 5% de respuestas parciales y completas en pruebas de fase I (38).

Por lo tanto, la presente invención da a conocer la utilización de un compuesto farmacéutico para eliminar o reducir el número de células CD3 no deseadas y/o CD7 positivas, comprendiendo la mezcla de, como mínimo, una primera molécula que específicamente reconoce CD3 o CD7 y, como mínimo, una segunda molécula que reconoce específicamente otro receptor de ligando asociado a la superficie de dichas células no deseadas, de manera que, como mínimo, una de las moléculas con reconocimiento específico está dotado de una fracción tóxica. Se define un compuesto farmacéutico como cualquier compuesto que puede ser administrado a un individuo como dosis simple o como un régimen de dosis por cualquier ruta viable, preferentemente por administración intravenosa, conteniendo opcionalmente vehículos usuales para administración y/o componentes de tratamiento regular de la enfermedad inmunitaria relevante. Las células no deseadas son cualesquiera células que comprenden CD3 y/o CD7 (y desde luego, muchas otras) moléculas asociadas con la superficie de la célula, cuyas células están involucradas en los estados patológicos de los individuos. De manera típica, estas células son células T o células NK u otras células que desempeñan un papel en GvH o en el rechazo de aloinjertos. También se pueden eliminar o reducir células aberrantes (células T de leucemias o linfomas, por ejemplo) comprendiendo CD3 y/o CD7 (preferentemente ambas), de acuerdo con la presente invención.

Una molécula que reconoce específicamente CD3 o CD7 u otro receptor de ligandos es un término bien comprendido en esta técnica. Significa cualquier molécula que tiene una afinidad de unión relativamente elevada y especificidad para CD3, CD7 o el receptor. Puede ser típicamente un ligando para un receptor o un anticuerpo para CD3, CD7 u otro receptor (se define el receptor como cualquier molécula capaz de interacción específica), cuyo anticuerpo puede ser truncado o humanizado o alterado en cualquier otra forma sin perder su especificidad (estas alteraciones se definen en esta descripción como derivadas y/o fragmentos). Las fracciones tóxicas son básicamente cualquier tipo de moléculas y la totalidad de las mismas, que conducen a toxicidad para la célula objetivo de manera directa o indirecta, incluyendo por lo tanto, sin que ello sirva de limitación, lectinas, ricina, abrina, toxina PE, toxina de difteria, radio-isótopos, medicamentos citostáticos tales como adriamicina, agentes inductores de apoptosis y sustancias de conversión de promedicamentos junto con promedicamentos tales como timidina quinasa y una combinación de ganciclovir. Es preferente la ricina A, preferentemente deglicosilada (a efectos de impedir la unión de la ricina A a receptores de carbohidratos expresados por células del hígado, es preferente la ricina A (dgRTA) (20) deglicosilada). En realizaciones de promedicamentos, típicamente una de las moléculas que reconoce específicamente CD3 o CD7 o un receptor se puede preveer con el agente de conversión y el otro con el promedicamento. No obstante, CD3 no tiene necesidad de acoplarse a una fracción tóxica para tener efecto, puesto que bloquea la interacción del receptor de célula T con APC. Ésta es una de las ventajas de la presente invención que no aparecen en la técnica anterior.

Tal como se ha indicado anteriormente, es preferible que ambos CD3 y CD7 actúen de objetivo por moléculas de unión específica para las mismas. Este cóctel se ha demostrado en estudios clínicos preliminares, en una realización en la que la fracción tóxica está unida a ambas moléculas específicamente de unión, que son ambas anticuerpos. Un efecto sorprendente de este cóctel es que, si bien en algunos casos de GvH tiene lugar la repetición, esta repetición pasa a ser tratable con corticosteroides con bajas dosis, lo cual no era posible en primera instancia con GvH. Por lo tanto, una combinación de este tipo es otra realización preferente de la presente invención. La invención proporciona, por lo tanto, un compuesto farmacéutico, tal como se ha descrito anteriormente, de manera que dicha primera molécula reconoce específicamente CD3 y dicha segunda molécula reconoce específicamente CD7.

La fracción tóxica puede ser acoplada a la molécula de unión específica de cualquier modo, por ejemplo realizando una proteína de fusión por medios recombinantes, incluyendo de manera típica un lugar de corte de proteasa entre molécula de unión y fracción tóxica (proteína), pero para mayor facilidad de fabricación y libertad de elección en fracciones tóxicas se prefiere el acoplamiento químico, opcionalmente con un enlace sensible a ácido. (Después de la internalización, un conjugado típico pasa a través de una lisosoma).

La invención da a conocer también la utilización de un compuesto farmacéutico de acuerdo con el cual, como mínimo, se disponen con fracciones tóxicas dos moléculas que reconocen específicamente diferentes receptores, que pueden ser fracciones tóxicas iguales o distintas. Existe una desventaja importante en la utilización de diferentes fracciones tóxicas cuando los efectos secundarios de las fracciones son distintos, porque entonces se pueden administrar dosis más elevadas. De manera típica, los compuestos farmacéuticos, de acuerdo con la invención, pueden comprender, además, como mínimo, otra molécula adicional que reconoce específicamente CD5, CD2, CD4, CD8 o un receptor IL-2, que también puede estar acoplado a una fracción tóxica. Esto puede proporcionar una mayor eficacia, pero también se puede utilizar para proporcionar una mayor especificidad para grupos de células, también en combinación, por ejemplo, con regímenes de promedicamentos.

Es preferible que cuando la molécula que reconoce específicamente CD3 es un anticuerpo, que el anticuerpo sea de clase IgG gamma-2B, porque este anticuerpo no fija complemento humano ni une receptores Fc humanos y, por lo tanto, no induce la liberación de citoquinas por las células T objetivo. Por lo tanto, la presente invención da a conocer en otra realización un compuesto farmacéutico en el que dicha primera molécula es un anticuerpo gamma 2B IgG o derivado del mismo, que reconoce CD3.

Las dosis utilizadas son administradas en la descripción detallada. Los límites de dosis de inmunotoxinas en regímenes tales como los de la invención dependen típicamente de la inmunotoxina, tanto por el hecho de la especificidad y afinidad de las moléculas de unión específicas, como también a causa de las dosis toleradas de modo distinto para diferentes medicamentos. Expresados en equivalentes de ricina A deglicosilada los límites se encontrarán, en general, dentro de, como mínimo, 25 microgramos por metro cuadrado de superficie corporal (un adulto humano de 80 kg tiene típicamente una superficie de 2 metros cuadrados), preferentemente 100 microgramos de ricina A por metro cuadrado de superficie corporal. Éste es un límite inferior de lo que se puede administrar en una o varias dosis a lo largo de uno o varios días de tratamiento. De modo general, la dosis total de equivalentes de ricina A no debe ser superior a 25 mg por metro cuadrado de superficie corporal.

De manera típica, los compuestos según la invención se utilizarán para la preparación de un medicamento para el tratamiento de injertos contra enfermedades de hospedante, rechazos de injertos, leucemias de células T, linfomas de células T u otras enfermedades CD3 y/o CD7 positivas, enfermedades autoinmunes o enfermedades inmunes infecciosas tales como infección HIV. Tal como se ha indicado anteriormente, en GvHD y en rechazo de injertos se aprecia un efecto típico en el hecho de que después del tratamiento con un compuesto según la invención, la recidiva es tratable con bajas dosis de corticosteroides.

Este régimen es, por lo tanto, parte de la invención.

Por lo tanto, la presente invención da a conocer también un equipo o "kit" de compuestos farmacéuticos para el tratamiento de la enfermedad de injerto con respecto a hospedante y/o rechazo de injerto que comprende un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, y un compuesto farmacéutico que comprende, como mínimo, un corticosteroide. La invención conduce a una reducción en el número de la población de células no deseadas hasta, como mínimo, 20% la cantidad original, usualmente incluso 5% o menos. De manera típica, este número sigue bajo durante un período de tiempo prolongado en contraste con lo que se consigue con regímenes, según la técnica anterior. El compuesto del ejemplo no solamente se dirige a células T, sino también a células NK lo cual es otra ventaja de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

La justificación de utilizar IT para el tratamiento de GVHD es que estos conjugados pueden ser utilizados para una erradicación eficaz y específica de células T inmunocompetentes responsables de la enfermedad. Con esta perspectiva, las IT pueden ser más efectivas y pueden causar menos efectos secundarios que los reactivos inmunosupresores de manera amplia, tal como ciclosporina y corticosteroides. En 1990, Byers y otros informaron de una prueba clínica de Fase I, en la que administraron por vía intravenosa un anti-CD5 RTA-IT (Xomazyme-CD5) para tratar GVHD resistente a los corticosteroides (39). Los resultados iniciales fueron muy prometedores correspondiendo las enfermedades de la piel, gastrointestinales y del hígado a 73, 45, y 28% de casos, respectivamente (39). No obstante, otras pruebas clínicas más recientes han demostrado que el Xomazyme CD5 no era más efectivo que otros tratamientos alternativos (18). Como consecuencia, se abandonó el desarrollo adicional de Xomazyme-CD5.

Animados por el éxito inicial del tratamiento basado en IT de GVHD, los inventores se propusieron desarrollar IT alternativas con superior actividad anti células T. A efectos de lograr este objetivo, los inventores conjugaron RTA a un panel de MoAb que reacciona con antígenos que se expresan (casi) exclusivamente en células T, es decir, los antígenos CD3, CD5 y CD7 de diferenciación de células T, y han ensayado cada uno de ellos en cuanto a su actividad anti células T. De este estudio preclínico, se demuestra que un cóctel de SPV-T3a-RTA (CD3-IT) y WT1-RTA (CD7-IT) tiene el mayor potencial de tratamiento de pacientes con GVHD grave y que esta mezcla proporciona:

-: Citotoxicidad sinérgica, por el hecho de que la incubación simultánea de la mitad de dosis individual efectiva de SPV-T3a-RTA y WT1-RTA es más efectiva en la eliminación de células T que las IT solas (incluyendo CD5-IT).

-: Amplio mecanismo de acción, en el que la unión de SPV-T3a al complejo receptor de células T/CD3 tiene como resultado un efecto inmunosupresor aditivo al bloquear el reconocimiento por las células T del cedente de los antígenos del paciente extraño. Este efecto es independiente de la acción de la ricina A. Además, para la unión de este CD3-MoAb específico no estimula a las células T a producir citoquinas que, de otro modo, aumentarían la gravedad de GVHD.

-: Reactividad de amplio espectro por el cual WT1-RTA reacciona también contra células NK. Estos linfocitos se ha indicado que aumenta la gravedad de GVHD especialmente en la última fase de la enfermedad.

Se ha descrito anteriormente que la utilización de combinaciones de IT puede aumentar fuertemente la eficacia de la eliminación de células objetivo. La ventaja más evidente con respecto al tratamiento de IT única es que un número menor de células subjetivo serán antígeno negativas múltiples que las antígeno-negativas individuales. Además, las células que expresan niveles sustanciales de todos los antígenos objetivo se pueden cargar con IT en una medida mayor. Cuando la IT respectiva sigue una ruta intracelular diferente, el cambio de terapia de escape se puede reducir adicionalmente. Con respecto a la utilización de IT células anti T, los informes que se dirigen a la combinación o cóctel se han enfocado hasta el momento en aplicaciones in vitro, incluyendo la purga de injertos de tuétano de hueso. Para un aspecto de la presente invención, los inventores indican que una mezcla de mAb SPV-T3a (CD3, IgG2b) murino y WT1 (CD7, IgG1), conjugados ambos a dgA, forma una combinación superior para la eliminación o supresión de células T no deseadas (por ejemplo, superreactivas, mal dirigidas, o malignas) y/o células NK. Esta combinación específica permite conseguir importantes ventajas que superan la sinergia "común" observada con las combinaciones más o menos "al azar" de las IT células anti T.

Algunos aspectos que definen las características superiores de esta combinación específica se describirán a continuación:

(A) La unión de antígeno de un CD3 o un receptor de células T (TCR) mAb tiene como resultado, como mínimo, un bloqueo parcial y modulación (internalización u ocultación) del complejo CD3/TCR impidiendo de esta manera la aloactivación de los linfocitos T (página 1, apéndice III).

(B) La unión de un CD3 o un TCR mAb tiene como resultado, como mínimo, una apoptosis parcial mediada por Fas de una fracción significativa de T linfocitos activados, de acuerdo con un mecanismo descrito como muerte celular inducida por activación (AICD) (ver también página 2, apéndice III).

Estos dos mecanismos efectores, que son independientes de una toxina conjugada, son de vital importancia cuando intervienen en una situación aguda que amenaza la vida, tal como GVHD refractaria. El bloqueo y modulación temporal de CD3/TCR, así como la naturaleza limitada (AICD) de estos efectos, comprometen solamente las ventajas de realizar un "exterminador real" del mAb por conjugación del mismo a una toxina. Una razón por la que los inventores escogieron SPV-T3a como CD3 mAb es que el SPV-T3a es de isotipo IgG2b y se ha demostrado que no induce liberación de citoquinas por las células T aisladas de la mayor parte de población humana examinada. Como consecuencia, el riesgo del llamado "síndrome de liberación de citoquinas", que complica gravemente el desorden inmunológico a tratar, se reduce fuertemente.

(C) La presencia de CD7-IT en el cóctel de IT es esencial, a parte por la anteriormente designada sinergia "común" (ver también página 3, apéndice III), porque amplia la reactividad del espectro del cóctel IT. El antígeno CD7 es expresado también en células NK que, de acuerdo con ello, forman asimismo un objetivo para este cóctel específico de IT (ver también página 4, apéndice III). La significación de ello viene reforzada por el concepto de los inventores, modificado con respecto a los procesos que subyacen en GVHD. Según el punto de vista de los inventores, las células NK juegan un papel claro en la patofisiología de GVHD, particularmente en la fase eferente de la enfermedad.

2.4 Historia clínica de los componentes del cóctel IT

SPV-T3a: SPV-T3a es un IgG2b MoAb de ratón dirigido contra el antígeno de diferenciación de células T humanas CD3(40).

La terapia por anticuerpo anti-CD3 se asocia frecuentemente con el síndrome de liberación de citoquina provocado por la unión al complejo receptor de células T/CD3 (41-44). Una de las ventajas importantes de SPV-T3a es que este MoAb específico no induce la liberación de citoquinas a causa de su isotipo IgG2b (45, 46).

En el Departamento de Hematología del University Hospital Nijmegen, parte del tuétano de hueso obtenido a partir de donantes no relacionados con comprobación HLA se trata corrientemente ex vivo con un cóctel de SPV-T3a-RTA y WT1-RTA a efectos de eliminar células T inmunocompetentes. Los pacientes que recibieron el transplante de este tuétano de hueso mostraron una reconstitución hematopoiética normal sin signos de toxicidad (n = 3, no se muestran datos).

WT1: MoAb WT1 es un MoAb de ratón de isotipo IgG2a dirigido contra el antígeno CD7 de diferenciación de células T humanas (47, 48).

En el Departamento de Nefrología del University Hospital Nijmegen, tres pacientes que recibieron transplante de riñón han sido tratados con WT1 a efectos de tratar un rechazo agudo. La administración de WT1 no conjugado se demostró seguro y no resultó en reacciones alérgicas ni en toxicidades graves (Dr W Tax, comunicación personal). No se pudo observar eficacia clínica.

WT1 ha sido conjugado a dgRTA y administrado a monos rhesus para comprobar su adecuación para utilización en la terapia de meningitis leucémica (49). La conclusión más importante de este estudio era que WT1-dgRTA se puede administrar de manera segura intratecalmente a monos rhesus y podía ser un buen candidato para el tratamiento de leucemia CNS T-linfoblástica.

En el Departamento de Hematología del University Hospital Nijmegen, se utiliza WT1-RTA desde 1986 para el purgado ex vivo de BM autólogo de pacientes que sufren de leucemia de células T/linfoma de alto riesgo, a efectos de eliminar células malignas residuales. Después del purgado, no se retrasó el injerto neutrófilo ni la reconstitución inmunológica (n = 20) (25).

Elemento de enlace cruzado SMPT: Los MoAb se conjugan a dgRTA utilizando el elemento de enlace cruzado químico SMPT (figura 3). El elemento de enlace cruzado contiene un enlace disulfuro que es importante para la disociación intracelular de MoAb y dgRTA (necesariamente para toxicidad, ver figura 2).

El SMPT es un llamado "enlazador cruzado de segunda generación", caracterizado por tener un enlace disulfuro impedido (debido a la presencia del anillo fenilo). Esto hace el enlazador SMPT menos susceptible a reducción extracelular por tioles presentes en los tejidos y sangre, y, por lo tanto, resulta en una vida medio prolongada del suero en el IT. Thorpe y otros demostraron en un modelo de tumor de ratón in vivo que, utilizando SPMT en vez del enlazador de primera generación SPDP, se mejora fuertemente el efecto antitumor de sus IT basados en dgRTA (20). Amlot y otros llevaron a cabo un seguimiento de fase I, en el que estudiaron el tratamiento de linfoma maligno por administración antivenosa de IT (RFB4[IgG]-dgRTA) (50) conjugado de SMPT. Debido a la larga vida media del suero de 7,8 horas, las concentraciones terapéuticas de suero se pueden mantener entre las infusiones administradas a intervalos de 48 horas.

dgRTA: Los IT basados en RTA primitivas consistían en un MoAb conjugado a RTA nativo. Los oligosacáridos presentes en el RTA nativo resultaron en eliminación hepática rápida y hepatotoxicidad in vivo (20, 51). Se ha enfocado este problema en las IT de segunda generación que utilizan RTA deglicosilado (dgRTA) o ricina A recombinante no glicosilada (rRTA) (52, 53).

Vitetta y sus colegas han informado de la administración de IT basados en dgRTA a pacientes con linfoma de Hodgkin de células B refractario. Comprobaron dos constructos distintos. En el primero, la fracción Fab' de MoAb RFB4 (anti-CD22) fue conjugada a dgRTA (50). En el último constructo, utilizaron la molécula completa de RFB4 (54).

Los IT fueron administrados por infusiones intravenosas de 4 horas administradas a intervalos de 48 horas. La dosis de Fase I limitadora de toxicidades incluía edema pulmonar, afasia expresiva, y rabdomiolisis con fallo renal agudo. Otros efectos secundarios incluían hipoalbuminemia, aumento de peso, fiebre, taquicardia, disminución de voltaje del electrocardiograma, mialgias, anorexia, y náusea. La dosis máxima tolerada (MTD) era de 75 mg/m^{2} para Fab'-dgRTA y 32 mg/m^{2} para IgG-dgRTA, que se demostró que estaba inversamente relacionada a la vida media del suero (86 minutos y 7,8 horas, respectivamente). Las dos formas de dgRTA-IT no mostraron diferencias significativas en las respuestas clínicas (respuestas parcial y completa en 45% de los pacientes recibiendo > 50% del MTD), en inmunogenicidad o en efectos secundarios tóxicos. A causa de su coste más bajo, se seleccionó IgG-dgRTA IT para su desarrollo posterior.

Los descubrimientos más importantes realizados por los inventores de estos estudios son: a) el MTD de las dgRTA-IT depende principalmente de la magnitud de la dosis individual y no de la dosis acumulativa. Cuando se administra RFB4(IgG)-dgRTA a intervalos de 48 horas con dosis de 8 mg/m^{2} o menos, se observaron solamente toxicidades de grados I o II. Se consideraron seguras de manera continuada dosis totales de 32 mg/m^{2} RFB4(IgG)-dgRTA. Como consecuencia del valor relativamente prolongado de T1/2, las concentraciones terapéuticas en suero (\sim 1,8 \mug/ml) se pudieron mantener durante las infusiones y entre las mismas; b) Los efectos secundarios de la administración de las dgRTA-IT eran relativamente modestos y consistían, de modo predominante, en VLS y mialgia. No se observó hepatotoxicidad y sólo toxicidad BM mínima. c) No se trataron los pacientes con enfermedades pulmonares a causa del peligro de que el VLS contribuyera a aumentar la insuficiencia pulmonar.

Los pacientes recibieron cuatro dosis de cóctel de IT administrado por vía intravenosa en infusiones de 4 horas a intervalos de 48 horas. Si no se observa respuesta clínica y no hay toxicidades graves (grado III o IV), el estudio se continúa con el nivel de dosis de proteína más alto siguiente.

4.0 Población de pacientes

Los pacientes han recibido terapia de corticosteroides con dosis elevada de 2ª línea (metilprednisolona 1000 mg/d), como mínimo, durante tres días sin disminución de la gravedad de GVHD.

Los pacientes se han EXCLUIDO de participar en el estudio si:

1.: El paciente tiene un historial significativo o pruebas actuales de enfermedad intrapulmonar.

2.: El paciente tiene historial de alergia a inmunoglobulinas de ratón o ricina.

3.: El paciente tiene altos niveles circulantes de anticuerpos anti-ratón humanos (HAMA).

5.0 Tratamiento 5.1 Información farmacológica

El cóctel de IT fue preparado en el Departamento de Hematología bajo supervisión del Departamento de Farmacia Clínica del University Hospital Nijmegen. El cóctel de IT se almacena a -80ºC a 1 mg/ml en 0,15 M NaCl, en lotes de 5 y 20 mg. Antes de la infusión, el cóctel de IT se filtrará a través de un filtro de 0,22 \mum y es diluido hasta un volumen final de 100 ml en una solución salina normal. El ID_{50} contra la línea Jurkat de células T se toma como norma para la actividad biológica cuando se evalúa la cantidad de diferentes lotes del cóctel de IT.

5.2 Administración de inmunotoxinas

Las inmunotoxinas son administradas por intermedio de un catéter venoso central. Antes de la terapia, los pacientes reciben una prueba intravenosa realizada con 200 \mug de cóctel de IT. La terapia se empieza solamente en ausencia de reacciones anafilactoides. El cóctel de IT es administrado en cuatro dosis a intervalos de 48 horas. La justificación de ello es proporcionar la totalidad al cóctel de IT antes de que se pueda esperar la aparición de cualquier respuesta a anticuerpos (usualmente no antes de 10 a 14 días después de la administración de Ig xenogénico).

El paciente es tratado inicialmente con dos dosis subsiguientes de 2 mg/m^{2}. A este nivel de dosis no se observan efectos secundarios. En ausencia de toxicidades de grado III o IV, la dosis se aumentará a 4 mg/m^{2} en caso necesario.

5.3 Normas para la modificación de la dosis

Las toxicidades relacionadas con la administración de inmunotoxina son evaluadas como grado I (suave), II (moderado), III (grave) o IV (amenaza de muerte) basándose en las normas de la Organización Mundial para la Salud (OMS) (Apéndice V). Se debe dedicar especial atención al síndrome de fuga vascular (VLS). Los síntomas físicos de VLS son pérdida de peso, edema periférico, disminución de la presión sanguínea, hipoalbuminemia, y pequeñas efusiones pleurales.

Dosis consecutivas administradas al mismo paciente: La infusión de la segunda, tercera y cuarta dosis a cualquier nivel de dosificación depende de la toxicidad conseguida después de la infusión previa:

Toxicidad grado I: sin cambio en la desviación prevista.

Toxicidad grado II: retraso de 24 horas en la dosificación, administrando la dosis siguiente si mejora la toxicidad.

Toxicidad grado III: se suspenderá la dosis siguiente de inmunotoxina y se administrará solamente si los parámetros tóxicos han mejorado (se puede considerar la reducción a la mitad de la dosis).

Toxicidad grado IV: sin dosis adicional.

Escalado de la dosis: La progresión de un nivel de dosis al siguiente debe tener lugar solamente después de:

- el paciente o pacientes del grupo tratado con la dosis anterior han recibido cuatro dosis de cóctel de IT y han sido observados durante, como mínimo, 48 horas después de la última dosis, y

- no se ha alcanzado la toxicidad limitadora de dosis.

Toxicidad limitadora de dosis: La toxicidad limitadora de dosis se define como la aparición de reacciones adversas de grado III o IV en un paciente individual. Si dos pacientes experimentan una toxicidad de grado III o si se presenta toxicidad de grado IV en un solo paciente, se introducirán otros tres pacientes a este nivel de dosis. Si ninguno de estos pacientes adicionales muestra toxicidad de grado III o IV, se continuará nuevamente la administración al nivel de dosis inmediato superior. Si aparece toxicidad de grado IV en dos pacientes a una dosis determinada, los pacientes siguientes serán tratados con la dosis anterior que se considerará una dosis tolerable máxima (MTD).

5.4 Medicación simultánea y tratamiento

Los agentes inmunosupresores utilizados para profilaxis y tratamiento inicial se pueden mantener sin cambios en toda la terapia de inmunotoxinas.

6.1 Estudios de pretratamiento

Antes de la entrada en el estudio, el paciente es sometido a un examen general que consiste en historial médico, examen físico con especial énfasis en GVHD aguda, medición de saturación de oxígeno, electrocardiograma (ECG), y rayos X del tórax. Las mediciones de laboratorio incluirán Na+, K+, Cl-, HCO_{3}-, urea, creatina, bilirrubina, glucosa, AP, ASAT (GOT), ALAT (GPT), gGT, LDH, proteína total además de electroforesis, leucocitos además de diferenciación, células rojas, hemoglobina, hematocrito, trombocitos.

El paciente es ensayado en cuanto a respuestas anti-ratón humano y anti-ricina (HAMA/HARA), y niveles en suero de IL-2, TNF- y IFN-g. Además, se llevan a cabo un ensayo cuantitativo alorreactivo células T-cooperadoras/células T citotóxicas precursoras (ver Apéndice I).

6.1 Estudios de seguimiento

Se lleva a cabo examen físico diario completo durante la administración del cóctel de IT hasta 2 días después de la última dosis y, a continuación, semanalmente. Se analiza la sangre diariamente para Na+, K+, Cl-, HCO3-, urea, creatina, glucosa, albúmina, leucocitos además de diferenciación, células rojas, hemoglobina, hematocrito y trombocitos. Cada dos días para bilirrubina, AP, ASAT, (GOT), ALAT (GPT), gGT, LDH, proteínas totales más electroforesis (ver Apéndice I).

Se comprueban los signos vitales (presión sanguínea, pulso, frecuencia de respiración y temperatura) cada 15 minutos durante la 1ª hora después de la infusión, cada 30 minutos durante la 2ª hasta la 4ª horas después de la infusión, y desde entonces cada hora hasta las ocho horas después de la infusión. Además, se evalúan los signos vitales diariamente durante la administración del cóctel IT hasta 2 días después de la última dosis y a continuación semanalmente.

Farmacocinética y eliminación de las IT: Se recogen muestras de sangre a las 0, 1, 3, 4, 8, 12, 24, y 48 horas después de cada infusión. Las concentraciones de suero de SPV-T3a-dgRTA y WT1-dgRTA se determinan cuantitativamente en un ensayo sensitivo e inmuno-radiométrico específico de mAb-isotipo (IRMA). De estos resultados se calculan las medias vidas del suero individual de los dos utilizando análisis de regresión de mínimos cuadrados no lineal.

Medición de repuestas humorales: A efectos de examinar las respuestas HAMA y HARA, se recogen muestras de suero un día antes de la inyección y después, semanalmente después de la primera infusión hasta que el paciente sale del estudio. Se determina la concentración de HAMA y HARA en un ensayo radiométrico sensitivo.

Control inmunológico: Se toman muestras de sangre a días alternos durante la administración del cóctel de IT hasta 2 días después de la última dosis y, a continuación, semanalmente para control inmunológico. Se aíslan las PBL y se evalúan en cuanto a composición por citometría de flujo utilizando anticuerpos que reaccionan específicamente con los subconjuntos de células T, células B, monocito/macrófagos, y células NK. Los sueros son recogidos para determinar niveles de IL-2, TNF-a y IFN-g mediante equipos de ensayo inmunoabsorbente relacionado con enzimas de tipo comercial (ELISA).

La actividad proliverativa y citotóxica de las PBL alorreactivas se comprueba cada 2 días después de la última dosis, utilizando ensayos estándar de células T cooperadoras y precursor citotóxico T, respectivamente.

Clasificación y evaluación de GVHD y respuestas clínicas

Se evalúa GVHD diariamente durante la administración del cóctel de IT hasta 2 días después de la última dosis y después semanalmente, hasta que el paciente sale del estudio. Cada sistema de órganos es evaluado en grados 1 a 4 aGVHD de acuerdo con los criterios de Glucksberg y otros (Apéndice II): la piel por la extensión superficial con inflamación, tracto gastrointestinal por el volumen de diarrea, y el hígado por niveles de bilirrubina de suero. Los pacientes reciben también una calificación general de aGVHD basado en la gravedad de afectación de órganos (Apéndice II).

Las respuestas a la terapia se definen del modo siguiente:

-: respuesta completa (CR): desaparición de síntomas en todos los sistemas de órganos;

-: respuesta parcial (PR): mejora de órgano ^{3}1, sin empeoramiento en otros órganos.

-: respuesta mixta (MR): mejora de órgano ^{3}1, con empeoramiento en otro órgano ^{3}1.

-: enfermedad estable: no hay cambios significativos en ningún sistema de órgano.

-: enfermedad progresiva (PD): avance en el sistema de órgano ^{3}1 sin mejora en ningún órgano.

La duración de la respuesta se define como el período comprendido desde la fecha en que se registró la respuesta en primer lugar, hasta la fecha en la que se observó enfermedad progresiva subsiguiente.

Resultados

Estudios de toxicidad animal y estudios pre-clínicos.

Estudios de toxicidad animal y estudios pre-clínicos se resumen en el Apéndice III.

Estudio clínico

Los resultados del estudio clínico se indican en el Apéndice IV.

Materiales y métodos Preparación de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales que se dan a conocer se prepararon utilizando tecnología de hibridoma, bien conocida en esta técnica. Las etapas de selección para seleccionar inmunoglobinas con las características que se han descrito anteriormente son bien conocidas en la técnica y pueden incluir cromatografía de afinidad y similares.

Preparación de fragmentos F(ab')2

Se prepararon fragmentos F(ab')_{2} de anticuerpos utilizando el "equipo de preparación de F(ab')_{2}" (Pierce, Rockford, IL), de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. De modo breve, se incubaron anticuerpos con pepsina inmovilizada a pH 4,2 (tampón acetato sódico 20 mM) durante 4, y 16 horas, respectivamente. Las moléculas de IgG sin digerir y los fragmentos Fc fueron eliminados por cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa. Los fragmentos restantes menores de 30 kD fueron eliminados por medio de un concentrador centripep-30 (Amicon, Beverly, MA). La pureza de los fragmentos F(ab')_{2} fue determinada por SDS-PAGE, que reveló una contaminación de menos de 1% con fragmentos IgG o Fc intactos (no se muestran datos).

Preparación de IT

Se conjugaron anticuerpos en una relación 1 a 1 (m/m) a ricina A deglicosilada (dgA, Inland Laboratories, Austin, Texas) utilizando un enlazador cruzado SMPT (Pierce, Rockford, IL), de acuerdo con el método descrito por Ghetie y otros. (Ghetie V y otros. La preparación en gran escala de GLP de inmunotoxinas conteniendo cadena de ricina A deglicosilada y un enlace disulfuro impedido . J Immunol Methods 1991, 142:223-30).

Los anticuerpos fueron conjugados a ricina A (amablemente proporcionada por Dr. F.K. Jansen; Centre de Recherches Clin Midy, Montpellier, Francia) utilizando N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP; Pharmacia) o SMPT, tal como se ha descrito. (Las proporciones de conjugación de ricina A a mAb se estimaron por medición de la absorbancia a 280 nm y RIA, y se determinaron del orden de 0,8 a 1,2. La conservación de actividad de unión de anticuerpo después de la conjugación fue evaluada por FCM.

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TABLA 1

Niveles de dosis:
	Dosificación de cóctel IT (mg/m^{2})
# Pacientes	d1	d3	d5	d7	Total
1	2	2	4	4	12
2	4	4	4	4	16
2	8	8	8	8	32
2	10	10	10	10	40

APÉNDICE 1

Diagrama de estudio de cóctel IT (resumen de exigencias del estudio)

2

\small\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}{150mm} 1: Los signos vitales son comprobados
cada 15 minutos durante la primera hora después de la inyección,
cada 30 minutos durante la segunda hasta la cuarta horas, y a
continuación cada hora hasta 8 horas después de la
inyección.\end{minipage} \cr  2: El panel de bioquímica de
preestudio comprende Na+, K+, Cl-, HCO _{3} \cr
 \begin{minipage}{150mm} - urea, creatina, bilirrubina, glucosa,
AP, ASAT (GOT), ALAT (GPT),  \gamma GT, LDH, y proteínas totales más
electroforesis.\end{minipage} \cr  Durante el estudio de
seguimiento, se analizará la sangre para Na+, K+, Cl-, HCO _{3} \cr
 \begin{minipage}{150mm} - urea, creatina, glucosa, y albúmina.
Además, cada dos ensayos se añade bilirrubina, AP, ASAT (GOT), ALAT
(GPT),  \gamma GT, LDH, y proteínas totales más
electroforesis.\end{minipage} \cr  \begin{minipage}{150mm}
3: El panel de hematología comprende leucocitos más diferenciación,
células rojas, hemoglobina, hematocito,
trombocitos.\end{minipage} \cr  4: A continuar semanalmente
hasta que los números de WBC hayan vuelto a valores normales.\cr
 \begin{minipage}{150mm} 5: Se obtienen muestras de sangre
venosa preinyección y 1, 3, 4, 8, 12, 24 y 48 horas después de cada
inyección. Además, se toma una muestra a las 72 horas después de la
última inyección.\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}{150mm} 6: El panel de citometría de flujo
comprende los marcadores CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD14, CD19 y
CD56.\end{minipage} \cr  7: Se ensaya el suelo para niveles de
IL  -  2, TNF  -   \alpha  y
IFN  -   \gamma .\cr  8: Se continuará mensualmente
cuando se observen
respuestas.``\cr}

\newpage

Apéndice II

Manifestación de enfermedad aguda de injerto con respecto a hospedante

(Glucksberg y otros, Transplantation 1974, 18:295-304)

Piel

: grado 1: erupción maculo-papular extendida a menos de 25% de la superficie corporal

: grado 2: erupción maculo-papular extendida a menos de 25-50% de la superficie corporal

: grado 3: eritroma generalizada

Hígado

: grado 1: bilirrubina 34-50 \mumol/l

: grado 2: bilirrubina 51-100 \mumol/l

: grado 3: bilirrubina 101-254 \mumol/l

: grado 4: ^{3}255 \mumol/l

Intestino

: grado 1: 500 a 1000 ml evacuación/día

: grado 2: 1001 a 1500 ml evacuación/día

: grado 3: 1501 a 2000 ml evacuación/día

: grado 4: >2000 ml evacuación/día

Gravedad general de aGVHD

: grado 1: piel: 1/2; intestino: 0; hígado 1

: grado 2: piel: 1/2/3/; intestino 1/2 y/o hígado 1/2 algunas veces asociado con fiebre

: grado 3 piel: 2/3/4; intestino 2/3/4 y/o hígado 2/4 frecuentemente asociado con fiebre

: grado 4: similar a grado 3 pero síntomas constitucionales extremos

Inhibición de aloactivación por spv-t3a no conjugado Método

Se analizó la aloactivación en un cultivo mixto de linfocitos (MLC). Se llevó a cabo MLC con linfocitos de sangre periférica "responder" (PBL) mezclados en una proporción uno a uno con PBL "estimulador" irradiado. Se llevaron a cabo cultivos por triplicado (5x10^{4} células/pocillo) en placas de microtitulación con fondo en U en 150 \mul de medio de cultivo a 37ºC y 5% CO_{2}. Antes de la iniciación del MLC o a días distintos después de la misma se añadió SPV-T3a (10^{-8} M) o un anticuerpo de control conjugado de isotipo irrelevante al medio de cultivo. Después de 72 horas de cultivo, se marcaron placas con [^{3}H]timidina (0,4 \muCi/pocillo) para 4 horas. A continuación, se determinó la proliferación de células "responder" al recoger el ADN utilizando un recogedor de células y contando la radioactividad incorporada. La proliferación fue expresada como porcentaje del control no tratado.

Resultados

3

La aloactivación fue completamente bloqueada cuando se añadió SPV-T3a directamente después de la iniciación del MLC. Cuando se aplazó la adición de SPV-T3a a uno o varios días después de la iniciación, este efecto cesó de modo gradual. Después de cuatro días, la adición de SPV-T3a no tuvo efecto o proliferación. El anticuerpo de control conjugado de isotipo irrelevante no influyó la aloactivación en ningún momento. Trasladados a la situación in vivo estos resultados demuestran que el SPV-T3a no conjugado es capaz de facilitar un efecto inmunosupresor directo e importante al impedir la aloestimulación continuada de linfocitos T. Para la supresión o eliminación de linfocitos T ya estimulados, el SPV-T3a depende de otro mecanismo generador o efector, designado como muerte celular inducida por activación (AICD) (Apéndice III, pg 2), o necesita ser conjugado a una toxina (Apéndice III, pg 3).

Muerte celular inducida por activación por SPV-T3a sin conjugar Método

Se ensayó in vitro la reducción de la citotoxicidad mediada por TCR después de tratamiento por IT utilizando un clon de célula T citotóxico (clon CTL) reconociendo el EBV péptido EBNA3C presentado en HLA-B44. La actividad CLT fue ensayada por lisis de una línea celular linfoblastoide transformada por EBV cargada con ^{51}Cr (EBV-LCL) que se originó del mismo individuo. El clon CTL fue tratado durante 24 horas con SPV-T3a, se lavó y se evaluó directamente o después de cuatro días de incubación adicional en medio de cultivo. El período prolongado de incubación de cuatro días fue incorporado, puesto que durante este tiempo el clon de CTL restablece su expresión normal del complejo TCR/CD3 (que es bloqueado y/o modulado directamente después de incubación con SPV-T3a.

Resultados

4

Directamente después del tratamiento (día 1), la incubación con mAb SPV-T3a (10^{-8}M) nativo tuvo como resultado una reducción modesta de la citotoxicidad CTL. El análisis con citometría de flujo reveló que este efecto era producido predominantemente por el bloqueo y modulación del complejo TCR/CD3 debido a la unión de SPV-T3a. Después de cuatro días de incubación prolongada, el clon CTL recuperó su expresión normal TCR/CD3, pero la citotoxicidad CTL se redujo adicionalmente a 18% del control sin tratar (día 5). En este momento, el análisis con citómetro de flujo reveló que la mayor parte de las células CTL habían muerto debido a apoptosis, de acuerdo con el mecanismo descrito como "muerte celular inducida por activación" (AICD). Trasladado a la situación in vivo esto significa que el SPV-T3a sin conjugar es capaz de suministrar un importante efecto inmunosupresor al eliminar una fracción significativa de los linfocitos T activados. La eficacia de SPV-T3a se acentuará adicionalmente cuando se conjuga con ricina A similar a toxina (Apéndice III, pg 3).

Sinergia común de cóctel IT de SPV-T3a-DGA & WT1-dgA Método

PBL con estimulación de PHA se sometió a tratamiento con 10^{-8}M IT durante 24 horas a 37ºC, se lavó, y se cultivó durante otros cuatro días a 37º en un medio de cultivo libre de IT (para posibilitar que las IT muestren su toxicidad plena). Después de este período de retraso, las células fueron incubadas con 2 \mug/ml de iodo propidio (PI) (Molecular Probes, Junction City, OR) y 2 \mug/ml de calceína AM (Calc) (Molecular Probes) durante 1 hora a RT (temperatura ambiente). Las muestras fueron analizadas a continuación en un citómetro de flujo Coulter Epics Elite (Coulter) dotado de un láser de iones de Argon de 40 mW funcionando a 15 mW. Se utilizó un filtro de paso largo de 610 nm para medición de PI fluorescencia, un filtro de paso banda de 525/30 para Calc fluorescencia. El solape de los espectros de emisión de PI y Calc se pudo ajustar por compensación electrónica utilizando muestras de marcado único. Las muestras fueron analizadas por triplicado utilizando un mínimo de 10.000 células. Las células viables fueron identificadas como PI negativas y Calc Positivas. Antes del análisis FCM, se añadió una cantidad fija de gránulos inertes (comprobación ADN, Coulter) (10^{5} gránulos/ml) para posibilitar el cálculo del número de células sobrevivientes. La reducción de PBL se relacionó con la fracción viable del control sin tratar.

Resultados

Tratamiento	Factor de reducción de PBL
- SPV-T3a-dgA	100
- WT1-dgA	87
- SPV-T3a-dgA y WT1-dgA	1770
(media dosis de cada uno)

Debido a la "sinergia común del cóctel de IT" IT SPV-T3a-dgA y WT1-dgA se mostraron mucho más efectivas en combinación (media dosis de cada uno) que IT en solitario.

Reducción de la actividad de células "natural killer" por WT1-dgRTA Método

Se aislaron células mononucleares de sangre a partir de sangre periférica por centrifugación Ficoll y se incubaron con 10^{-8} M mAb o IT con una concentración de 1x10^{6}/ml durante 24 horas. A continuación las células fueron lavadas y analizadas en cuanto a actividad de células NK después de cuatro días adicionales de incubación sin IT (este período es esencial para que las IT muestren su eficacia plena). Durante el experimento, se añadieron 50 unidades/ml de IL_{2} recombinante al medio de cultivo para incrementar la actividad de las células NK. Para análisis de la actividad NK, se diluyeron células en serie y se incubaron con un número fijo de k562 blastos marcados con ^{51}Cr (10^{4}/100 \mul) para conseguir un efector con proporciones objetivo de 10:1, 3,3:1, 1,1:1, y 0,37:1. Después de 3,5 horas de incubación a 37ºC, las mezclas de células fueron centrifugadas y se midió la radioactividad. La actividad NK fue expresada como porcentaje máximo de liberación de ^{51}Cr determinado con K562 blastos marcados con ^{51}Cr tratados con saponina. Ambos fueron corregidos en cuanto a liberación espontánea de ^{51}Cr determinada con K562 blastos marcados con ^{51}Cr incubados solamente con medio de cultivo.

Resultados

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La incubación con cantidades saturantes de mAb SPV-T3a (10\mug/ml) no tuvo efecto sobre la actividad de las células NK ni lo tuvo el tratamiento con SPV-T3a-dgA (10^{-8} M). Después de cuatro días de la incubación con WT1-dgA, por el contrario, la actividad NK se redujo claramente a 8% del control sin tratamiento. WT1 sin conjugar ni el control IT conjugado con isótopo, influyeron en la actividad de las células NK. Traducido a la situación "in vivo", ello significa que la incorporación de WT1-dgA en el cóctel de IT no resulta solamente en la "sinergia común del cóctel de IT" (Apéndice III, página 3), sino que amplía la reactividad del espectro. Esto es de vital importancia dado que, si bien se inicia por CTL, la GVHD se cree que se agrava por células "espectador" estimuladas por citoquina menos específicas tales como monocitos y células NK/LAK.

Estudios de toxicidad en animales A. Determinación LD50 con ratones Balb/C

- cóctel IT: 25-45 mg/kg

- RFB4-dgA (basado en literatura): 14 mg/kg

B. Administración a monos Java

- Aumento de los niveles CK después de infusión

- Sin otras toxicidades agudas

Determinación de LD50

Supervivencia de ratones Balb/C después de administración intravenosa del cóctel de IT
Dosis (\mug/ratón)	Tiempo de muerte	Supervivencia después de 2 semanas
770 (n = 4)	día 0, día 9, día 9	25%
385 (n = 3)	-	100%
193 (n = 4)	-	100%
96 (n = 4)	-	100%

cambio de porcentaje en peso después de la administración

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Estudio clínico piloto

- En un centro, sin reducción al azar, marcado abierto, estudio con dosis crecientes (objetivo de tratamiento 5-7 pacientes)

- Cuatro dosis intravenosas con intervalos de 48 horas:

	Dosis de cóctel IT (mg/m^{2})
# pacientes	d1	d3	d5	d7	Total
1	2	2	4	4	12
2	4	4	4	4	164
2	8	8	8	8	32
2	10	10	10	10	40

- Evaluación: farmacocinética, toxicidades, anticuerpos anti-ratón humanos y anticuerpos anti-ricina humanos (HAMA y HARA), respuestas biológica y clínica

Primer paciente, características

- Varón 60 años, Mieloma Múltiple

- Transplante fraterno

- GVHD de piel, intestino e hígado (grado general IV)

- Complicación: fallo de múltiples órganos

- cóctel IT: 2 dosis 2 mg/m^{2}, 1 de 4 mg/m^{2}

- Falleció siete días después de la primera infusión

Primer paciente, toxicidades

- Fugas capilares suaves, sin ganancia de peso

- Sin incremento de niveles CK

- Sin toxicidad aguda adicional

- Sin HAMA/HARA

Primer paciente, respuesta clínica

- Piel: mejora empezando en el día 5

- Hígado: estable (estado desfavorable)

- Tracto gastrointestinal: no interpretable (morfina)

Primer paciente, respuesta biológica

- Reducción impresionante de células T/NK circulantes (CD2^{+}5^{+} y CD2^{+}, respectivamente)

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- Durante la primera infusión de 4 horas: disminución a 17%

- Disminución gradual adicional hasta 1% en el día 7

- Mecanismo dual: basado en mAb (rápido) y basado en dgA (duradero)

Segundo paciente, características

- Varón 34 años, CML

- Cedente conjugado no relacionado

- Grado 4 GVHD de la piel

- Cóctel IT: 2 dosis 2 mg/m^{2}, 2 de 4 mg/m^{2}

Segundo paciente, toxicidades

- No se pudo observar toxicidad aguda

- Sin HAMA/HARA

Segundo paciente, respuestas

- Respuesta notable (completa) empezando en el día 5

- Duración \sim1,5 meses

- Recidiva de GVHD I-II

- Responde a bajas dosis de corticosteroides

- Falleció 8 meses después del tratamiento debido a una infección

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El análisis microscópico de las biopsias de piel del segundo paciente tomadas justamente antes de (A), y dos semanas después de (B), tratamiento con cóctel de IT. El aspecto de la piel antes de tratamiento es típico para GVHD (A) grave. Existe una infiltración masiva de linfocitos, que se localizan principalmente alrededor de los vasos sanguíneos y de la zona de unión de la dermis (lado inferior) y de la epidermis (lado superior). La membrana basal de la epidermis es destruida, dando como resultado que la epidermis llega a la dermis. Después de dos semanas de tratamiento, se observó una espectacular mejora clínica de la piel. Esto fue reflejado por el análisis microscópico (B): no habían signos restantes de infiltración de linfocitos, la piel se encontraba cerca de la dermis, y la membrana basal había recuperado su configuración natural bien organizada.

Tercer paciente, características

- Varón 47 años, MDS

- Donante HLA idéntico

- Grado 3/4 de GVHD del intestino

- Cóctel de IT: 4 dosis de 4 mg/m^{2}

Tercer paciente, toxicidades

- Aumento de la temperatura corporal durante las infusiones

- Sin otras toxicidades agudas

- Sin HAMA/HARA

Respuestas del tercer paciente

- Reducción de linfocitos

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- Disminución del volumen de deposiciones

- Endoscopio: fuerte mejora de los tejidos de intestino

Conclusiones del estudio piloto

- El cóctel de IT es bien tolerado, sin toxicidades agudas graves

- Importante respuesta biológica y clínica en ausencia de toxicidades agudas graves

- El cóctel de IT constituye una herramienta eficaz para supresión o eliminación "in vivo" de células T malignas mal dirigidas o super-reactivas y/o células NK

Claims

1. Utilización de un compuesto que comprende una mezcla de, como mínimo, una primera molécula que reconoce específicamente CD3 y, como mínimo, una segunda molécula que reconoce específicamente CD7, de manera que, como mínimo, una de las moléculas de reconocimiento específico está dotada de una fracción tóxica, en la preparación de un medicamento para la supresión o eliminación "in vivo" de células T mal direccionadas, super-reactivas o malignas y/o células NK, para el tratamiento de enfermedad de Injerto con respecto a Hospedante, rechazos de Injertos, leucemias por células T, linfomas por células T u otras enfermedades malignas positivas a CD3 y/o CD7, enfermedades autoinmunes o enfermedades inmunes infecciosas tales como infección HIV.

2. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicha primera molécula y la segunda molécula están dotadas de una fracción tóxica.

3. Utilización, según la reivindicación 1 ó 2, en la que dichas primera y/o segunda moléculas son un anticuerpo, o un fragmento o un derivado de la misma.

4. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicha mezcla comprende, como mínimo, otra molécula que reconoce específicamente CD5, CD2, CD4, CD8 ó un receptor IL-2.

5. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicha primera molécula es un anticuerpo gamma2B IgG o un derivado del mismo, que reconoce CD3.

6. Equipo de compuestos farmacéuticos para tratamiento de enfermedades de Injerto con respecto a Hospedante y/o rechazo de injerto, comprendiendo un corticosteroide y una mezcla, como mínimo, de una primera molécula que reconoce específicamente CD3 y, como mínimo, una segunda molécula que reconoce específicamente CD7, de manera que, como mínimo, una de las moléculas de reconocimiento específico está dotada de una fracción tóxica.