ES2286006T3 - Prevencion del rechazo cronico a transplante mediante combinacion de inmunotoxinas y bloqueadores de la coestimulacion. - Google Patents

Abstract

Uso de una combinación de a) una inmunotoxina para reducir la población de células T del receptor y b) un bloqueador de la coestimulación para reducir una respuesta de anticuerpo específico del injerto. para preparar un medicamento para prevenir el rechazo crónico de un injerto en un receptor.

Description

Prevención del rechazo crónico a trasplante mediante combinación de inmunotoxinas y bloqueadores de la coestimulación.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de unas inmunotoxinas en asociación con un bloqueador de la coestimulación como medio para la prevención del rechazo crónico inmunomediado de un trasplante. Más concretamente, la presente invención se refiere al bloqueo del ligando de CD40 (CD 154) y CD28 en asociación con inmunotoxina para prevenir el rechazo.

Antecedentes de la técnica

Las células T activadas juegan un papel importante en la respuesta inmune a los antígenos mediante la regulación de las células inmunes incluyendo las células B, única fuente de Ab in vivo. La ruta principal para activar las células T in vivo es la interacción entre el complejo receptor de célula T (TCR) y sus respectivos Ag-MHC, presentados por células presentadoras de antígeno (APC). El Ag unido a TCR inicia una cascada de reacciones intracelulares que produce la liberación de citoquinas y el aumento de la expresión de las moléculas de superficie. Las citoquinas de las células T activan una variedad de células, incluyendo macrófagos y células B, mediante la unión a receptores específicos sobre esas células. Además de la unión Ag-TCR, otras moléculas sobre las células T (i.e., CD154 y CD28) se unen a sus equivalentes sobre APC (i.e., CD40 y B7, respectivamente) provocando la generación de señales reguladoras intracelulares no solo en células T sino también en APC. En realidad, se ha demostrado que dichas interacciones influyen profundamente en la función de las células inmunes y, a su vez, en la respuesta inmune a antígenos (Schwartz, R.H. (1996); Boussiotis et al. (1994); Lenschow et al., (1992)).

El rechazo crónico a injerto se caracteriza por una pérdida insidiosamente progresiva de la función de los órganos injertados. Este tipo de rechazo es lento y empieza muchos meses o incluso años después del transplante. Aunque el papel de Ab en el rechazo crónico no está claro ya que se encuentran Ab para antígenos del donante en algunos pero no en todos los pacientes, los anticuerpos dirigidos de donantes han sido implicados totalmente como causa que contribuye al rechazo crónico (Sayegh y Turka (1998)). Es probable que la presencia de Ab anti-injerto acelere el proceso de rechazo mediante su unión al endotelioy a su vez, causando el daño celular mediante la fijación de complemento y/o la mediación de citotoxicidad dependiente de célula (ADCC). Los mediadores liberados de las células endoteliales lesionadas podrían atraer una variedad de células hacia el endotelio vascular lesionado produciendo una mayor destrucción del tejido. El incremento en la expresión de varias moléculas de adhesión sobre el endotelio lesionado y sobre las células que se acumulan ayuda a localizar células infiltrantes en el lugar de la herida. En consecuencia, se recubre el endotelio dañado con una capa de plaquetas y fibrinay eventualmente con células proliferantes. El resultado final es una lesión proliferativa en los vasos que progresa hacia la fibrosis y la oclusión.

Las estrategias inmunosupresoras anti-células T no previenen el rechazo crónico ni la lesión del injerto mediado por anticuerpos. Aunque se ha demostrado previamente en el modelo renal de aloinjerto del mono rhesus que una toxina asociada al anticuerpo anti-CD3 (IT) promueve de manera sustancial la supervivencia del aloinjerto, la mayoría de receptores desarrollan rechazo crónico con características de lesión de origen inmune. Esto puede ser debido al hecho de que la disminución significativa de células T debida a IT requiere 48 horas, un periodo de tiempo que podría permitir que las células T activasen las células B. De este modo, el rechazo crónico mediado por anticuerpos resulta ser uno de los mayores problemas en el trasplante clínico de órganos, por lo tanto todavía se necesitan procedimientos para prevenir este rechazo crónico mediado por anticuerpos.

Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona el uso de una combinación como se define en la reivindicación 1 para prevenir el rechazo crónico de un injerto en un receptor. Esto se consigue administrando una inmunotoxina al receptor, reduciéndose de ese modo la población de células T del receptor y administrando al receptor un bloqueador de la coestimulación, reduciéndose de ese modo la respuesta del anticuerpo específica del injerto. La inmunotoxina utilizada en el presente invento puede ser una inmunotoxina anti-célula T bivalente dirigida al epítopo CD3. La combinación para su uso en la presente invención puede comprender además un segundo bloqueador de la coestimulación, para una mayor reducción de la respuesta del anticuerpo específica del injerto. De este modo, los bloqueadores de la coestimulación utilizados en la presente invención pueden incluir un bloqueador de la vía CD40:CD154 (por ejemplo, 5C8) y/o un bloqueador de la vía B7:CD28 (por ejemplo, CTLA4-Ig). También se proporciona la prevención del rechazo crónico de un injerto en un receptor, que comprende además la administración al receptor de un agente inmunosupresor. Un procedimiento para la prevención del rechazo crónico comprende la monitorización del receptor para un indicador del último rechazo agudo y la administración al receptor de una inmunotoxina que muestra el indicador del último rechazo agudo, reduciéndose así la población de células T en el receptor.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona el uso de una combinación como se define en la reivindicación 1 para la prevención del rechazo crónico de un injerto en un receptor. Esto se consigue administrando una inmunotoxina al receptor, reduciéndose así la población de células T del receptor y administrando un bloqueador de la coestimulación al receptor, reduciéndose de ese modo una respuesta del anticuerpo específica del injerto. La administración de inmunotoxina para prevenir el rechazo agudo del injerto necesita hasta 48 horas para destruir los linfocitos T; sin embargo, la participación de células T auxiliares y la activación de las células B ocurren en las primeras 48 horas y llevan al hospedador a una respuesta con anticuerpos anti-donante. Durante este periodo de activación, los bloqueadores de la coestimulación evitan la sensibilización de las células B y previenen el rechazo tardío mediado por anticuerpos. El presente uso previene el rechazo crónico de un injerto por parte del receptor induciendo tolerancia inmune en el receptor. Se consigue la tolerancia inmune sin necesidad de administrar al receptor células donantes, tales como células de la médula espinal o esplenocitos del donante.

"Coestimulación" se refiere a la activación de células T no específica de antígeno, que ocurre en paralelo con la estimulación específica del antígeno. Muchas moléculas de las células T sirven como receptoras de señales coestimulantes, incluyendo, por ejemplo, CD28, CTLAa-4 y el ligando de CD40. CD28 tiene dos ligandos conocidos, B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86), que se expresan en las células presentadoras de antígeno activado. CTLAa-4 se une también a B7-1 y a B7-2 pero, a diferencia de CD28, pone fin a la respuesta inmune. La vía CD40:CD154 juega también un papel en la coestimulación de las células T. Un ejemplo de ligando de CD40 es el CD154, que se expresa en las células T activadas por CD4. La estimulación de CD40 promueve la producción de anticuerpos por parte de las células B, induce la expresión de las moléculas de adhesión y de las citoquinas que activan las células T, e induce la expresión de B7 por parte de las células que presentan el antígeno. En ausencia de la coestimulación, una célula T que entra en contacto con un antígeno no produce cantidades apreciables de citoquinas y no se divide. De este modo la célula T en ausencia de coestimulación se vuelve insensible a la estimulación y experimenta la muerte celular programada.

Ya que las células T activadas regulan la función de otras células inmunes, la insensibilidad de las células T influirá en la respuesta inmune sobre varios antígenos. La interacción CD154-CD40 regula la producción de anticuerpos a partir de las células B, la única fuente de anticuerpos in vivo. Por lo tanto, el bloqueador de la coestimulación, cuando se da a un receptor de injerto en combinación con una IT anti-célula T, influye en la sensibilidad de las células inmunes con respecto al estímulo.

El bloqueador de la coestimulación utilizado en la presente invención puede bloquear la vía de CD40:CD154. Más específicamente, el bloqueador de la vía CD40:CD154 puede ser un anti-CD154, incluyendo, por ejemplo, 5C8, que, previamente, ha sido descrito con detalle (Lederman, Yellin, Krichevsky et al. (1992); Lederman, Yellin, Inghirami et al. (1992)). Ha sido humanizado posteriormente 5C8 y está disponible comercialmente (Biogen). Se pueden utilizar otros anticuerpos de CD40:CD154.

Alternativamente, el bloqueador de la coestimulación de la presente invención puede bloquear la vía B7:CD28. Más específicamente, el bloqueador de la vía B7:CD28 puede unirse a B7 y bloquear la unión de B7 con CD28. Más específicamente, el bloqueador de la vía B7:CD28 es CTLA4-Ig, el cual ha sido descrito previamente (Lin et al. (1993); Sayegh MH et al. (1997); Pearson et al. (1997)). CTLA4-Ig está disponible comercialmente (e.g., Bristol-Meyers, Squib, Repligen Corp.). Otros bloqueadores de la vía B7:CD28 incluyen, por ejemplo, anti-CD80 y anti-CD86, disponibles en Genetics Institut.

Tal y como se usa en el presente documento, "rechazo" se refiere a un rechazo inmunológico del órgano transplantado por parte del hospedador. El "rechazo crónico" de un injerto, generalmente ocurre meses o años después del transplante, ocurre más a menudo por lo menos seis meses después del transplante y se caracteriza histológicamente (por ejemplo, basado en la biopsia del injerto) por características tales como la fibrosis intersticial, la hiperplasia intersticial, un estrechamiento arteriolar y el daño isquémico en el órgano transplantado. Además, signos histológicos de rechazo crónico de un transplante de riñón incluyen la reduplicación y el engrosamiento de la membrana basal glomerular. Los signos clínicos del rechazo crónico incluyen una disfunción gradualmente progresiva del injerto. Por ejemplo, en un individuo con un transplante de riñón, un aumento gradual de los niveles de creatinina en sangre indicaría un rechazo crónico. Los niveles normales de creatinina en suero son menores de 2,0 mg/dl y más habitualmente de 0,5 a 1,5 mg/dl. La disfunción del injerto renal se evidencia por el aumento de aproximadamente el doble de los niveles basales de creatinina. La presencia del anticuerpo anti-donante y el aumento de los niveles de anticuerpos anti-donante podrían indicar también la disfunción del injerto. Un experto en la materia reconocería otros indicadores histológicos e indicadores clínicos del rechazo crónico. Los mecanismos aloantígeno dependientes y aloantígeno independientes podrían mediar en el rechazo crónico.

Por "reducir una respuesta del anticuerpo específico del injerto" se entiende disminuir o eliminar los anticuerpos anti-donantes del receptor del injerto. Se puede valorar una reducción en una respuesta de anticuerpo específico del injerto mediante la medición de los niveles circulantes de anticuerpos antidonantes. Preferentemente, se caracterizaría la reducción en la respuesta del anticuerpo específico del injerto mediante un nivel del aloanticuerpo en el hospedador del transplante de menos de aproximadamente el 50% de los niveles de control. Más preferentemente, los niveles de aloanticuerpo estarán por debajo de aproximadamente 40%, 30%, 20%, 10% o 5% del control. Aún más preferentemente, la reducción en la respuesta del anticuerpo específico del transplante sería una eliminación de la respuesta del aloanticuerpo de manera que no estuviera presente ningún anticuerpo anti-donante en el hospedador.

Por "reducir la población de células T del receptor" se entiende una reducción transitoria de las células T del receptor en sangre y en los ganglios linfáticos. Preferentemente, la inmunotoxina reduce transitoriamente las células T del receptor en sangre y en los ganglios linfáticos en por lo menos una unidad logarítmica.

Además se proporciona el uso de la presente invención, donde el injerto es alogénico. El receptor puede ser un mamífero y más específicamente un primate. Preferentemente, el receptor primate es un humano.

En el presente uso, el injerto puede provenir tanto de un donante vivo como de un donante muerto. Preferentemente se selecciona el injerto a partir de un grupo que consiste en riñón, pulmón, corazón, hígado, páncreas o piel. El injerto puede ser un órgano entero o parte de él. De este modo, por ejemplo, el transplante pancreático puede ser de células de islotes pancreáticos.

La combinación que se usa en la presente invención puede además comprender además un segundo bloqueador de la coestimulación, para reducir más la respuesta del anticuerpo específico del injerto. Si el primer bloqueador de la coestimulación bloquea la vía CD40:CD154, el segundo bloqueador preferentemente bloquea la vía B7:CD28. El bloqueador de la vía B7:CD28 puede ser, por ejemplo, CTLA4-Ig. CTLA4-Ig se une a B7-1 y a B7-2, bloqueándose de este modo la interacción de B7 con CD28 en las células T. Así, se pueden utilizar dos bloqueadores de la coestimulación para reducir más la respuesta del anticuerpo específico del injerto.

Realizaciones alternativas de la presente invención incluyen el uso de diferentes regímenes de tratamiento. Un régimen de tratamiento corto está en un grupo de realizaciones, en el que se administra la inmunotoxina y los bloqueadores de la coestimulación durante el periodo posterior al transplante y después se interrumpe. En otro grupo de realizaciones, la administración de los bloqueadores de la coestimulación, no se interrumpe según el régimen de tratamiento corto, sino que se prolonga a intervalos regulares. En un grupo final de realizaciones, se repiten unas series de administraciones de inmunotoxinas después del régimen de tratamiento corto o durante el tratamiento continuo con bloqueadores de la coestimulación.

De acuerdo con el uso de la presente invención, se administra la inmunotoxina por lo menos tres veces. Preferentemente, se administra la inmunotoxina por lo menos el día del transplante y en los dos días inmediatamente después del transplante. Se administra por lo menos una vez el bloqueador de la coestimulación o la combinación de bloqueadores, preferentemente el día del transplante. Se puede administrar el bloqueador de la coestimulación o la combinación de bloqueadores por lo menos en los tres días sucesivos dentro de la primera semana después del transplante, o cualquier otro día durante dos semanas. Alternativamente, se puede continuar el tratamiento con el bloqueador de la coestimulación, e.g., con administraciones en cualquier otro día, semanal o mensualmente durante la vida del receptor del injerto.

Se entiende que la activación tardía de las células B puede ocurrir si las células T se recuperan y se multiplican (seguido de la muerte por IT), o si, con el tiempo, las células T escapan del bloqueo de la coestimulación, por esta razón necesitan una administración continua de 5C8, CTLA4-Ig o de una combinación de ambos. De este modo, se podrían administrar los bloqueadores mensualmente después del tratamiento original o en series de tratamientos como prevención. Alternativamente, se pueden administrar dosis "tardías" de bloqueador de la coestimulación para rescatar los injertos de un rechazo crónico si los títulos del anticuerpo antidonante crecen o si se manifiestan otros indicadores del rechazo crónico en tiempos posteriores. De este modo, la presente invención proporciona un procedimiento que comprende además el bloqueo de la coestimulación durante por lo menos una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas, seis semanas, siete semanas, ocho semanas, nueve semanas, diez semanas, once semanas, doce semanas, o más. Se puede administrar el bloqueador de la coestimulación cualquier otro día, semanal o mensualmente. Se puede administrar el bloqueador adicional de la coestimulación inmediatamente después de un primer tratamiento o de series de tratamientos o puede posponerse hasta que aumenten los títulos del anticuerpo antidonante o se manifiesten otros indicadores del rechazo crónico. Un experto en la materia sabría que se podría administrar el bloqueador de la coestimulación a intervalos regulares después del régimen de tratamiento original. Por ejemplo ya que el 5C8 tiene una vida media de aproximadamente 35 días, se podría redosificar mensualmente para mantener el bloqueo de la coestimulación. Se pueden determinar regímenes utilizando otros bloqueadores de la coestimulación usando criterios similares.

Los regímenes de tratamiento pueden incluir la administración del bloqueador de la coestimulación, por ejemplo, CTLA4-Ig o 5C8, en combinación con el tratamiento de tres días para la IT. Se puede administrar el bloqueador de la coestimulación o la combinación de los bloqueadores como un tratamiento breve de una semana o más. Se incluyen los siguientes ejemplos de regímenes de tratamiento:

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Régimen 1:

IT los días 0, 1, 2 (0,2 mg/kg) + 5C8 los días 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 28 (20 mg/kg/día);

Régimen 2:

IT los días 0, 1, 2 (0,2 mg/kg) + 5C8 los días 0, 2, 4, 6 (20 mg/kg/día);

Régimen 3:

IT los días 0, 1, 2 (0,2 mg/kg) + CTLA4-Ig los días 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 28 (20 mg/kg/dosis);

Régimen 4:

IT los días 0, 1, 2 (0,2 mg/kg) + CTLA4-Ig los días 0, 2, 4, 6 (20 mg/kg/dosis);

Régimen 5:

IT los días 0, 1, 2 (0,2 mg/kg) + 5C8 los días 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 28 (20 mg/kg) + CTLA4-Ig los días 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 28 ( 20 mg/kg/dosis); y

Régimen 6:

IT los días 0, 1, 2 (0,2 mg/kg) + 5D8 los días 0, 2, 4, 6 (20 mg/kg/dosis) + CTLA4-Ig los días 0, 2, 4, 6 (20 mg/kg/dosis).

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Un experto en la materia sabría que se podrían disminuir las dosis de IT, 5C8, CTLA4-Ig de una manera escalonada. Por ejemplo, si aparecen signos de riesgo serio de infección (tales como infección por citomegalovirus, fiebre, hipotensión, o infección fúngica o bacteriana), de enfermedad linfoproliferativa, o de cualquier otra enfermedad maligna, se podrían disminuir las dosis. De manera similar, si disminuyen los niveles de CD4, medidos por citometría de flujo o por otros métodos, entonces se podrían disminuir las dosis. De este modo, se podría disminuir la dosis de IT a 0,19; 0,18; 0,17; 0,16; 0,15; 0,14; 0,13; 0,12; 0,11; 0,10 ó 0,05 mg/kg. La dosis de 5C8 o CTLA4-Ig podría disminuir a 15, 10, 5, 2 ó 1 mg/kg/dosis.

También se proporciona el uso de una combinación como se define arriba para prevenir el rechazo crónico de un injerto en el receptor, que además comprende un agente inmunosupresor. Preferentemente, se selecciona el agente inmunosupresor del grupo que consiste en ciclosporinas (e.g., ciclosporina A), ciclofilinas, micofelonato mofetil, tacrolimo, azatioprina y esteroide (e.g., metilprednisolona) y cualquier combinación de ellos, u otros inmunosupresores conocidos en la materia. Así, un procedimiento puede incluir la administración de un compuesto inmunosupresor antes, durante, o después de los pasos con la inmunotoxina y el bloqueador de la coestimulación. Algunos de estos inmunosupresores tienen mayores efectos sobre la liberación de citoquinas durante el periodo pretransplante que podrían ayudar en la inducción del estado de tolerancia.

Otra realización de la invención implica el uso posterior de una inmunotoxina para rescatar un injerto de un rechazo tardío agudo. De este modo, la presente invención proporciona un procedimiento para invertir un rechazo agudo tardío de un injerto por parte del receptor que tiene un injerto que ha sobrevivido durante un largo periodo de tiempo. El procedimiento exige utilizar el procedimiento de prevención del rechazo crónico como se describe en el presente documento y además comprende monitorizar el receptor con un indicador de rechazo agudo tardío y administrar una inmunotoxina al receptor que muestra el indicador del rechazo agudo tardío, reduciéndose de ese modo la población de células T del receptor. Así, cuando aparecen signos de un rechazo agudo, se puede administrar un segundo tratamiento corto de inmunotoxinas. Por ejemplo, se pueden administrar tres dosis de inmunotoxina para una dosis total de 0,2 mg/kg, cuando aparecen signos de rechazo agudo. Opcionalmente, el tratamiento posterior con inmunotoxina se puede acompañar con un segundo tratamiento con bloqueadores de la coestimulación o con un tratamiento continuo con bloqueadores de la coestimulación.

"Rechazo agudo" como se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno que, predominantemente, está mediado por linfocitos T y que, generalmente, ocurre en horas, días, semanas, o meses después del transplante, más a menudo sucede alrededor de los primeros seis meses después del transplante. El rechazo agudo se caracteriza histológicamente por una infiltración prominente de linfocitos. Se ve la infiltración de linfocitos, por ejemplo, en los túbulos renales (i.e., tubulitis) de un riñón transplantado y en los conductos biliares de un hígado transplantado. Otro signo histológico del rechazo agudo es la arteritis. Los signos clínicos de un rechazo agudo incluirían signos de una rápida disminución de la función del injerto. Por ejemplo, un aumento sostenido de creatinina en suero podría asociarse con un rechazo agudo de un transplante de riñón. Aumentos sostenidos en los títulos del anticuerpo antidonante podrían asociarse también a un rechazo agudo. Un experto en la materia reconocería otros indicadores clínicos de rechazo agudo.

"Rechazo agudo tardío" como se usa en el presente documento incluye un rechazo agudo en cualquier momento durante o después del tratamiento con inmunotoxina o con bloqueadores de la coestimulación. De este modo, el "rechazo agudo tardío" puede incluir una respuesta aguda en, aproximadamente, 3 días, 5 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 14 semanas, 16 semanas, 5 meses, 6 meses, o más después del transplante.

La inmunotoxina puede ser una inmunotoxina bivalente anti-células T. Se ha descrito la inmunotoxina con anterioridad en las patentes U.S. Nos. 5.167.956 y 5.725.857 y en la PCT WO 98/39425 y PCT WO 98/39363. Se puede dirigir la inmunotoxina al epítopo de CD3. Más específicamente, la inmunotoxina bivalente anti-células T puede comprender una porción tóxica y una porción diana dirigidas al epítopo de CD3_{\varepsilon} de célula T. La porción tóxica puede ser una toxina de la difteria. De este modo, la inmunotoxina bivalente anti-célula T puede ser UCHT1-CRM9. Más específicamente, la inmunotoxina bivalente anti-célula T puede ser una proteína de fusión de una cadena manipulada genéticamente que comprende un dominio amino terminal de toxina basada en DT fusionado a un dominio sFv (VL-engarce-VH donde el engarce es (Gly4Ser)3 separado por un segundo engarce y fusionado a un segundo dominio de sFv idéntico. El segundo engarce puede ser (Gly4Ser)3 o (Gly4Ser)5. Alternativamente, la proteína de fusión de una cadena manipulada genéticamente puede ser monovalente con la condición de que se elijan con cuidado el engarce y la secuencia VL y VH para proporcionar una afinidad que oscile entre \pm 0,5 unidades logarítmicas de la afinidad del anticuerpo parental.

La inmunotoxina bivalente unida por disulfuro puede tener componentes idénticos. Alternativamente, los componentes pueden no ser idénticos solamente a una porción de toxina para minimizar el impedimento estérico de los dominios de unión del antígeno. La inmunotoxina bivalente anti-célula T puede ser un dímero disulfuro de dos proteínas monovalentes de fusión de una cadena manipuladas genéticamente que se dimerizan a través de la región bisagra de IgG1 o el dominio de \muCH2 de IgM. El dímero puede ser un homodímero que comprende dos unidades monovalentes de DT390-sFv-H-\gammaCH3, dimerizado con disulfuro a través de los residuos sencillos o dobles de cisteína en H, la región bisagra. El dímero puede ser alternativamente un heterodímero que comprende una unidad monovalente de DT390-sFv-H-\gammaCH3, dimerizado con disulfuro a través de los residuos sencillos o dobles de cisteína en H a una unidad monovalente de sFv-H-\gammaCH3. Se puede conseguir la dimerización in vivo mediante la expresión en un sistema de expresión eucariota modificado para la resistencia a toxina mediante una mutación de EF2. Ejemplos son las células mutadas de CHO, células Ss9 de insecto, o levaduras mutadas. Alternativamente, se puede conseguir la dimerización in vitro a partir de especies monovalentes que se producen en sistemas de expresión procariotas mediante el uso de reacciones de intercambio de disulfuro utilizando sistemas de oxidación de disulfuro adecuados tales como el ácido ditiobisnitrobenzoico usado para generar intermedios mixtos de disulfuro.

La porción de la toxina puede ser un mutante del sitio de unión de la toxina de la difteria. La inmunotoxina puede comprender una porción de una toxina mutante (e.g. toxina DT o toxina ETA) unida a la porción de la región variable de cadena sencilla (sc) del anticuerpo (porción diana). De este modo, la invención utiliza una inmunotoxina que tiene la porción de anticuerpo producida por recombinación unida (acoplada) a una porción de toxina producida por recombinación y una inmunotoxina de fusión (donde se producen ambos dominios de toxina y anticuerpo a partir de una construcción recombinante). Puesto que la solicitud proporciona la información necesaria relacionada con la disposición de los dominios de la toxina y del anticuerpo y las subregiones dentro de ellos, se reconocerá que se puede utilizar cualquier procedimiento de acoplamiento químico o de recombinación de ADN para producir una inmunotoxina. De este modo, la referencia a una toxina de fusión o a una toxina acoplada no es necesariamente limitante.

La porción de anticuerpo recorre preferentemente la vía anti-CD3. La inmunotoxina puede ser monovalente, pero ahora se prefieren las porciones de anticuerpo bivalentes desde que se descubrió que aumentan la destrucción celular de aproximadamente 3 a 15 veces. La inmunotoxina puede ser una proteína de fusión producida por recombinación. Se puede hacer una inmunotoxina mediante la unión química de tioéter a los sitios únicos de un anticuerpo bivalente producido por recombinación (porción diana) y una porción de la toxina mutante producida por recombinación. La porción diana de la inmunotoxina puede comprender regiones \muCH2, \gammaCH3 y \muCH4 humanas y regiones VL y VH de anticuerpos Ig provenientes de la murina. Estas regiones pueden provenir del UCHT1 de anticuerpo de manera que la porción de anticuerpo es scUCHT1, que es un anticuerpo CD3\varepsilon de cadena sencilla que tiene regiones \muCH2, \gammaCH3 y \muCH4 humanas y regiones variables de ratón. Se cree que estos son los primeros ejemplos de anticuerpos anti-CD3 sc. Se describen en el presente documento numerosas porciones de toxina DT mutantes, por ejemplo DT390 o extensiones de DT390 hasta DT530. Así, la invención proporciona scUCHT1-DT390 a modo de ejemplo específico de inmunotoxina. Se diseñan y se construyen derivados de esta inmunotoxina como se describe en el presente
documento.

Se puede estabilizar la inmunotoxina bivalente manipulada genéticamente utilizada en la presente invención con respecto a la iniciación de la bivalencia y la unión disulfuro mediante los dominios de Ig interactivos de \muCH2 de IgM o \gammaCH3 de IgG1 humanas o cualquier otro dominio interactivo similar de Ig.

En la presente invención, la porción de la toxina conserva su función tóxica y su función de translocación de la membrana al citosol en cantidades completas. La pérdida de la función de unión localizada en el dominio de unión del receptor de la proteína de la toxina disminuye la toxicidad sistémica, reduciéndose la unión a células no diana. De esta manera, se puede administrar la inmunotoxina con seguridad. La función de recorrido que normalmente es proporcionada por la función de unión de la toxina, es suministrada por el anticuerpo diana, por ejemplo, anti-CD3. La vía de recorrido esencial es (1) localización de hendiduras recubiertas para la endocitosis, (2) escape de la ruta lisosomal y (3) regreso a la membrana plasmática.

La porción de la toxina de la DT mutante puede ser un mutante truncado, tal como DT 390, extensiones de DT390 hasta DT530, u otros mutantes truncados, así como una toxina de longitud completa con mutaciones puntuales o CRM9 (clonado en C. ulcerans), proteínas de fusión scUCHT1 con DTM1 y DT483. Se ha clonado y expresado DT390 en E. coli. El dominio de la toxina puede ser CRM9 (DT535, S525F) más una segunda mutación atenuadora proveniente del grupo: F530A, K516E, K516Ay514A, V523A, N524A). La porción de anticuerpo puede ser scUCHT1 u otro anticuerpo anti-CD3 que tenga el recorrido y otras características descritas con detalle en el presente documento. De este modo, un ejemplo de inmunotoxina para su uso en presentes procedimientos es la inmunotoxina de proteína de fusión DT390sSvUCHT1. Las inmunotoxinas descritas se pueden utilizar en la invención.

La inmunotoxina o sus componentes se pueden expresar en el citosol BL21DE3 E. coli utilizando las cepas TrxB a temperaturas de 15ºC a 25ºC. Alternativamente, la inmunotoxina o sus componentes se pueden expresar en líneas de células eucariotas (tales como CHO), líneas de células de insecto (tales como Ss9) y líneas de células de levadura (tales como Pichia pastoris) con la condición de que se eliminen los sitios de glicosilación de la toxina en los residuos 16 y 235 y las células se hayan mutado para resistir la ADP-ribosilación catalizada por la toxina, mediante una sustitución de Gly por Arg 2 residuos del extremo carboxilo del aminoácido diftamida modificado. En el caso de células de insecto se puede proporcionar este mutante EF-2 en el mismo vector de baculovirus suministrando el gen de la inmunotoxina ya que los dos promotores tardíos están disponibles en baculovirus.

Se pueden producir inmunotoxinas recombinantes a partir del anticuerpo sc bivalente recombinante o del anticuerpo bivalente cistrónico recombinante y toxinas mutantes por recombinación cada una conteniendo un solo residuo de cisteína desemparejada. Una ventaja de de este procedimiento es que las toxinas son fáciles de producir y sus bacterias nativas las pliegan correctamente mientras los anticuerpos se producen y se pliegan mejor en células eucariotas. Además, esto da diferencias en las preferencias de codificación entre eucariotas y procariotas que pueden ser molestas con algunas de las proteínas de fusión de la inmunotoxina.

Los principios generales para la producción de las presentes inmunotoxinas bivalentes recombinantes anti-células T son:

1.

Se escoge la unión disulfuro que hace de puente entre las dos cadenas monovalentes a partir de un dominio Ig natural, por ejemplo a partir de \muCH2 (C337 de los residuos 228-340 o la región bisagra de \gammaIgG, C226 o C229 o ambos residuos 216-238 [con C220P]).

2.

Se facilita la suficiente interacción no covalente suficiente entre las cadenas monovalentes incluyendo dominios que tienen interacciones de alta afinidad y contactos de solución o cristalográficos cercanos, tales como \muCH2, \muCH4 (residuos 447-576) o \muCH3 (residuos 376-446). Estas interacciones no covalentes favorecen el pliegue correcto para la formación de la unión disulfuro entre cadenas.

3.

Para las inmunotoxinas de fusión se escoge la orientación del anticuerpo con respecto a la toxina de manera que el dominio catalítico de la porción tóxica se convierte en una entidad libre cuando sufre proteólisis en su sitio de procesamiento natural bajo condiciones reductoras. De este modo, en la IT basada en ETA, la porción de toxina está en la terminación carboxilo y, en la IT de fusión basada en DT, la porción de toxina basada en DT está en la terminación amino de la proteína de fusión.

4.

Para inmunotoxinas acopladas químicamente, se inserta una sola cisteína en el dominio de unión de la toxina. Se manipula genéticamente el anticuerpo para que tenga solamente una cisteína libre por cadena que se proyecta en el disolvente lejos de los contactos entre cadenas tales como \muCH3 414, \muCH4 575 o la adición de \gammaCH3 a C447. La estructura del cristal indica que esta región es altamente accesible al disolvente. Los excesos de cisteína libre se convierten en alanina. Alternativamente, se puede añadir una cisteína C terminal a \gammaCH3 seguida directamente por una etiqueta de histidina para la purificación, \gammaCH3 (His)6Cys.

5.

Se mutan las toxinas en sus dominios de unión mediante mutaciones puntuales, inserciones o deleciones, habiendo una reducción de por lo menos 1000 veces en la actividad de unión respecto a las naturales y están libres de defectos de translocación.

6.

Los mutantes del sitio de unión de la toxina, si no son capaces de hacer un proceso proteolítico a pH neutro, se modifican en la región procesadora para conseguir este resultado.

Además se puede modificar un mutante del sitio de unión (CRM9) de los residuos 1-535 de la toxina de la difteria de longitud completa utilizando el sistema de enumeración descrito por Kaczorek et al. (1983) S525F; (Shen et al. (1994)) para un acoplamiento químico, cambiando un residuo en el dominio de unión (residuos 379-535) por cisteína. Ahora los residuos preferidos son aquellos con áreas expuestas a disolvente superiores al 38%. Estos residuos son K516, V518, D519, H520, T521, V523, K526, F530, E532, K534 y S535 (Shen et al. (1994)). De todos estos, se prefieren K516 y F530 ya que es probable que bloqueen cualquier actividad de unión residual (Shen et al (1994)). Sin embargo, se aumentará el acoplamiento máximo del nuevo residuo de cisteína debido a la mayor superficie expuesta a disolvente y a la proximidad de un residuo cargado positivamente (que tiene el efecto de disminuir el pKa de la cisteína-SH). Estos residuos están en D519 y S535 de manera que estos son ahora los preferidos de la lista anterior de posibilidades.

Se puede producir un mutante doble de DT que contiene la mutación S525F de CRM9 más una sustitución adicional dentro del bucle del sitio de unión 514-525 expuesto para introducir un sitio de acoplamiento para cisteína por ejemplo T521C en Corynebacterium ulcerans precedido por el promotor CRM9 y una secuencia señal. Se hace un mutante doble en Corynebacterium ulcerans mediante la recombinación entre el plásmido que produce la proteína de fusión del anticuerpo-CRM9 y el ADN del mutante generado por PCR con un codón de parada en 526 (mutagénesis del plásmido abierto). Alternativamente, se pueden producir mutantes dobles atenuadores de la toxina de difteria en BL21DE3 TrxB de E. coli mediante mutagénesis por PCR sin utilizar una secuencia señal. Se pueden utilizar estos CRM9-C para formar construcciones específicas de anticuerpo bivalente a través de tioéter con toxina mutante añadiendo un exceso de bismaleimidohexano en CRM9-Cs y acoplando el anticuerpo bivalente de cadena sencilla que contiene una cisteína libre en cualquier extremo del dominio \muCH4 o del dominio \gammaCH3 (ver Nº serie 081739.703).

Se consiguen estas y otras mutaciones mediante la mutagénesis basada en la PCR de plásmidos discontinuos ("gapped vectors") (Muhlrad et al. (1992)) utilizando el recién diseñado vector lanzadera \gammaCE96 de E. coli/C. ulcerans que contiene la construcción del doble mutante DT S508F S525F o una proteína de fusión con CRM9 en el COOH terminal que tiene la toxicidad reducida debido al dominio de la proteína con el COOH terminal añadido (Madshus et al. (1991)).

Se producen y se purifican las toxinas mutadas de manera análoga a la toxina de partida excepto que se introducen niveles bajos de agente reductor (equivalente a 2 mM de betamercaptoetanol) en la purificación para proteger el grupo -SH introducido desemparejado. Se consigue el acoplamiento químico del tioéter a una única cisteína desemparejada dentro de la construcción bivalente de anticuerpo en el residuo 414 del dominio \gammaCH3 o en el residuo 575 del dominio \muCH4 cuando se incluye este dominio. En este caso se muta el dominio \gammaCH3 a C414A para proporcionar solamente un único sitio de acoplamiento. Una ventaja de la inclusión de \muCH4 es el aumento de la estabilidad del anticuerpo bivalente. Una desventaja es que el dominio extra aumenta el tamaño y por lo tanto reduce la eficacia de la secreción durante la producción del anticuerpo. La ventaja de la terminación con el dominio \gammaCH3 es que, en otra variante, se puede añadir la etiqueta His6 de la purificación a cualquiera de \muCH2 COOH o \gammaCH3 COOH terminal para facilitar la purificación del anticuerpo. Otra variante es utilizar la región de bisagra \gamma para formar el disulfuro entre cadenas y acoplarlo mediante un \gammaCH3 o \muCH4. Esta variante tiene la ventaja de ser más pequeña en tamaño y coloca la porción de la toxina más cerca de los dominios de unión del epítopo CD3, que podría aumentar la eficiencia de translocación en la membrana de la toxina. Se puede incluir una etiqueta His en el carboxilo terminal como ayuda para la purificación. Se concentra SH-CRM9 hasta 10 mg/ml en PBS a pH 8,5 y se hace reaccionar con un exceso molar de 15 veces de bismaleimidohexano (BMH) (Pierce, Rockford, IL). Se elimina el exceso de BMH pasándolo sobre una columna pequeña de G25F (Pharmacia, Piscataway, NJ). Ahora se añade aproximadamente 5 mg/ml de la toxina derivada de la maleimida a 10 mg/ml de anticuerpo bivalente scUCHT1 bivalente a temperatura ambiente. Después de una hora se separa el conjugado de los productos de partida no reactivos mediante HPLC de exclusión por tamaño en una columna MODcol de 5,08 cm por 25,4 cm (2 pulgadas por 10 pulgadas) rellenada con resina Zorbax (DuPont) GF250 6 micron (para la producción a gran escala). Se acoplan también derivados de ETA60EF61cys161 al anticuerpo bivalente scUCHT1 mediante el mismo procedimiento.

Se pueden utilizar en la invención inmunotoxinas de fusión bivalentes anti-células T basadas en DT, donde el dominio de la toxina (en el presente también referido como "porción de la toxina" o "tox") es cualquiera mutante de longitud completa S525F (CRM9) o truncada en 390 o 486 (conjuntamente Tox) y se puede seleccionar la secuencia de dominios de los amino terminales de izquierda a derecha a partir de los siguientes y podrían incluir etiquetas de purificación de His C terminales o amino terminales: VL y VH son los dominios variables ligero y pesado del anticuerpo UCHT1 anti-CD3 o de cualquier otro anticuerpo anti-CD3. H es la bisagra de IgG1 humana.

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\quad

Proteína de fusión bivalente de cadena sencilla: Tox, VL, L, VH, L, VL, L, VH;

\quad

Proteína de fusión univalente de cadena sencilla homodimerizada vía \muCH2337 Cys: (Tox, VL, L, VH, \muCH2)2;

\quad

Proteína de fusión univalente de cadena sencilla homodimerizada vía H 226/229 Cys: (Tox, VL, L, VH, H, \gammaCH3)2;

\quad

Proteína de fusión univalente de cadena sencilla heterodimerizada vía \muCH2 337 Cys: (Tox, VL, L, VH, \muCH2 VL, L, VH \muCH2);

\quad

Proteína de fusión univalente de cadena sencilla heterodimerizada vía H 226/229 Cys: (Tox, VL, L, VH, H, \gammaCH3 VL, L, VH, H, \gammaCH3);

\quad

Proteína de fusión sFv-SH homodimerizada vía H 226/229 Cys unida químicamente mediante una bis maleimida (R) a un CRM9 derivatizado con SH o un CRM9 que contiene una cisteína C terminal manipulada genéticamente (Tox): VL, L, VH, \gammaCH3, His6, Cys-S-R-S-Tox.

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Se pueden utilizar otros tipos de porciones de toxinas proteicas en las inmunotoxinas anti-células T para la inducción de la tolerancia. Todo lo que se requiere es poder conseguir 1-2 unidades logarítmicas de destrucción de células T en sangre y en los compartimentos del nódulo linfático sin una toxicidad sistémica indebida. Esto requiere, a su vez, que el epítopo de recorrido haga la ruta en paralelo con la vía de intoxicación de la toxina y que los mutantes con sitios de unión estén disponibles o que las toxinas truncadas en sus dominios de unión estén disponibles para reducir 1000 veces la capacidad de unión de la toxina comparada con las toxinas naturales sin comprometer la eficacia de translocación de la toxina (ver patente U.S. No. 5.167.956 publicada el 1 de diciembre de 1992). Además cuando se usa el direccionamiento mediante anticuerpos, se requieren normalmente los anticuerpos bivalentes bajo condiciones in vivo para conseguir la suficiente destrucción de células debido a la menor afinidad, de 3 a 15 veces, de los anticuerpos monovalentes. Sin embargo, el procedimiento de unir la toxina a un anticuerpo bivalente ya sea como proteína de fusión de cadena única o a través de sitios de acoplamiento específicos manipulados genéticamente no debería interferir con la eficacia de translocación. Esto podría ocurrir debido al mayor tamaño de muchos de los anticuerpos bivalentes en comparación con los anticuerpos scFv monovalentes a menos que no se tenga precaución de que el dominio catalítico de la toxina pueda conseguir la translocación libre. Esto se consigue, para las inmunotoxinas basadas en DT, utilizando los mutantes de los sitios de unión basados en DT donde la porción del anticuerpo de la proteína de fusión está contigua al COOH terminal de la cadena de unión de la toxina como se describe arriba. Esto permite la cadena catalítica transloque tan pronto como se reduzca el bucle disulfuro que empalma con los residuos 193/194 de los sitios que procesan proteolíticamente las Arg/Ser. La mayoría de las células diana son capaces de llevar a cabo este proceso y cuando se usa CRM9 químicamente acoplado, la tripsina lleva a cabo el proceso antes de
acoplarse.

Si la porción tóxica se basa en la toxina de la difteria de longitud completa, puede incluir las siguientes mutaciones:

S525F, K530C

S525F, K516C

S525F, D519C

S525F, S535C

Se puede esperar que las construcciones anticuerpo-toxina utilizadas en esta invención sean efectivas como inmunotoxinas porque se conocen los parámetros pertinentes. La siguiente discusión sobre parámetros es pertinente para el uso de la inmunotoxina en la inducción de la tolerancia. Se han determinado y usado las constantes pertinentes de unión, número de receptores e índices de translocación para los humanos. Se han descrito los valores de unión para anti-CD3-CRM9 para células diana y no diana in vitro e índices de translocación para anti-CD3-CRM9 conjugado a células diana y no diana in vitro (Greenfield et al. (1987); Johnson et al. (1988); Johnson et al. (1989); Neville et al. (1989)). El factor que limita el índice de translocación para células diana in vitro se expone como sigue: se transloca un conjugado anti-CD3-CRM9 a 10^{-11}M en aproximadamente un 75% de las células diana presentes cuando se midió la inhibición de la síntesis de la proteína en aproximadamente el 75% de las células con 20 horas. Se completa la inhibición de la proteína en aquellas células donde el conjugado ha traslocado.

Los parámetros determinados en estudios in vivo con ratones desnudos incluyen lo siguiente: carga tumoral, descrita como una masa constante igual a 0,1% del peso corporal; el número de receptores y la variación del número de receptores; "margen terapéutico favorable" definido como la comparación de eficacia de 3 unidades logarítmicas de destrucción de células diana in vivo a 0,5 MLD (dosis letal mínima) con un tratamiento establecido de 0,5 MLD de inmunotoxina equivalente a una dosis de radiación de 500-600 cGy.

Los parámetros determinados in vitro permitieron el éxito en el estudio con ratón desnudo in vivo. Se podría predecir la ablación de células T y la inmunosupresión exitosa en monos a partir del estudio con ratones por ser equivalente a la carga local de células T en un mono u hombre. Utilizando los mismos parámetros, un científico experto en la materia puede hacer con confianza una predicción exitosa en humanos, porque se ha demostrado previamente que estos parámetros tienen éxito predecible.

La mayoría de los sueros humanos contienen anticuerpos neutralizantes anti-DT desde la inmunización en la infancia. Para compensar esto se puede aumentar convenientemente la dosis terapéutica de anti-CD3-CRM9 sin afectar el margen terapéutico. Alternativamente, mutantes de DT no tóxicos reaccionan con el antisuero neutralizante (p.e., CRM197) que se puede administrar conjuntamente con la inmunotoxina. Ver U.S. Patente No. 5.725.857.

Se pueden utilizar a la vez en el presente procedimiento cualquiera, de uno, dos o más de estas terapias adicionales. De esta manera, la invención incluye por lo menos los siguientes métodos para prevenir el rechazo de un injerto en un receptor: (1) IT y un bloqueador de la coestimulación, por ejemplo, un anti-CD154 o un bloqueador de la interacción B7/CD28; (2) IT y más de un bloqueador de la coestimulación, por ejemplo, un anti-CD154 y un bloqueador de la interacción B7/CD28; (3) IT y uno o más bloqueadores de la coestimulación y un fármaco inmunosupresor o una combinación de fármacos inmunosupresores. Se puede administrar el tratamiento adicional antes, durante o después de la administración de la inmunotoxina. Se pueden administrar al receptor tratamientos adicionales diferentes en tiempos diferentes o al mismo tiempo en relación al transplante o a la administración de la inmunotoxina.

Ya que se puede administrar el inmunosupresor antes de la inmunotoxina y/u otros tratamientos, se puede utilizar el presente método en un paciente que ha sufrido un transplante de órgano y está con un régimen inmunosupresor. Esto presenta una oportunidad significativa para reducir o eliminar la terapia inmunosupresora tradicional y sus efectos secundarios negativos bien documentados. También, como se describe abajo, el tratamiento con inmunosupresores antes del transplante podría ser útil en transplantes xenogénicos o provenientes de cadáveres. En tal situación de tratamiento pretransplante con inmunosupresores, se puede retrasar la administración de la inmunotoxina hasta siete o más días después del transplante.

Un ejemplo de un esquema de administración de la inmunotoxina y del inmunosupresor para pacientes que reciben transplantes de órganos es el siguiente:

día-24 a 0 horas estar con tratamiento inmunosupresor;

día 0:

operación de transplante;

día 0:

inmediatamente después del transplante administrar la primera dosis de inmunotoxina;

día 1:

segunda dosis de inmunotoxina;

día 2:

tercera y última dosis de inmunotoxina.

El tratamiento inmunosupresor debería acabar en el día 3 o extenderse hasta el día 14. El tratamiento inmunosupresor es también efectivo si se empieza en el momento del transplante y puede continuar hasta dos semanas después del transplante. Se pueden proporcionar los bloqueadores de la coestimulación, como se ha descrito arriba, conjuntamente con el régimen de arriba para IT y para los inmunosupresores.

Las dosis preferidas de inmunotoxina ahora son aquellas suficientes para disminuir los niveles de células T en sangre periférica en un 80%, preferentemente en un 90% (o especialmente preferible en un 95% o más) respecto a los niveles anteriores a la inyección. Esto debería requerir niveles mg/kg para humanos similares a aquellos para monos (e. g. 0,05 mg/kg hasta 0,3 mg/kg peso corporal), cuyos estudios sobre toxicidad indican que deberían ser bien tolerados por los humanos. De este modo, se puede administrar la inmunotoxina para reducir la población de células T con seguridad.

Tal y como se usa en la memoria y en las reivindicaciones, "un" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el que se use.

Se describe la presente invención con más detalle en los siguientes ejemplos que se proponen únicamente como ilustrativos ya que numerosas modificaciones y variaciones en ellos serán evidentes para aquellos expertos en la materia.

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Ejemplos Ejemplo 1 Inmunotoxina Combinada y Bloqueador de la Coestimulación

Animales. Se obtienen monos rhesus consanguíneos machos o hembras (Macaca Mullata) de 2,5-3,5 kg de University of Wisconsin Primate Center (Madison, Wi), de LABS (Yemassee, SC) y de otras fuentes. Se seleccionan las combinaciones de receptores y donantes como también un tercer grupo de animales en base a disparidad de MHC de clase I y clase II determinadas por electroforesis 1D-IEF en gel y por análisis PCR-DGGE y en base a MLR unidireccional. Los animales son seronegativos para el virus de inmunodeficiencia de mono, el virus de leucemia/linfoma de células T de mono, virus del herpes B y retrovirus de mono. Los monos son también seronegativos para el anticuerpo anti-toxina de la difteria.

Cirugía y cuidado de los animales. Los transplantes renales heterotópicos se hacen utilizando el riñón izquierdo del donante. Inmediatamente después del transplante, el receptor sufre una nefrectomía nativa. Se puede monitorizar la función del injerto midiendo semanalmente los niveles séricos de creatinina. Se determina el rechazo por un aumento de creatinina en suero de > 8 mg/dl, por ausencia de problemas técnicos en la autopsia (pérdida de orina, obstrucción) y por confirmación histológica. Se hace una biopsia con aguja fina con anestesia general cada mes o cada 6 meses. Se analizan histológicamente las biopsias, por inmunohistoquíminca y por análisis RT-PCR utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. (Ver, e.g., Molecular Cloning, eds. Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989); Armstrong et al. (1998)). Se puede determinar la tolerancia específica del donante en animales de larga supervivencia mediante la aceptación de un injerto de piel y el rechazo del injerto de piel de un tercer grupo cuando se injertaron a los animales 5-6 meses después del transplante de riñón como se ha descrito previamente (Knechtle et al. 1997). Se definen como animales no tolerantes aquellos animales en los que la pérdida del aloinjerto renal y/o del injerto de piel del donante se debe al rechazo.

Inmunosupresión. El anticuerpo FN18 se conjuga químicamente con CRM9 y se purifica como se ha descrito previamente para crear una inmunotoxina anti-CD3-IT (Neville et al. (1992)). Empezando el día del transplante, el receptor recibe una dosis total de inmunotoxina anti-CD3-IT de 0,2 mg/kg de peso corporal en tres dosis iguales en tres días consecutivos. Los animales a los que se da la inmunosupresión por inducción, reciben también metilprednisolona (250 mg p.o.) en los días 0, 1 y 2.

Monitorización de la reducción y repoblación de células T. Para preparar la sangre completa para la citometría de flujo, se eliminan los glóbulos rojos de toda la sangre mediante tratamiento con tampón de lisis ACK (0,15 M NH_{4}Cl, 1,0 mM KHCO_{3}, 0,1 mM Na_{2} EDTA, a pH 7,3) antes de la tinción. Se preparan las células de los ganglios linfáticos mediante emaceración y pasándolos a través de una malla fina de acero inoxidable. Se tiñen 1 x 105 células utilizando protocolos estándares para una variedad de marcadores de superficie celular que incluyen CD2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD16, CD45RA y anticuerpos de isótopos control. Se hace una citometría de flujo tricolor tiñendo las células con biotina anti-CD3 junto con anticuerpos marcados con FITC y PE y seguido de una incubación con PE-Cy5 estreptavidina (Waggoner et al. (1993)). Entonces, inmediatamente, se someten las células a citometría de flujo otra vez o se fijan en paraformaldehído al 1%. Se hace la citometría de flujo utilizando un solo láser en un FACSCAN de Bectin Dickenson. Se recoge un mínimo de 10.000 eventos.

MLR. Se aísla PBMC en Ficoll-Hypaque (Sigma) y se lava tres veces en RPMI/10% FCS. Se usa PBMC tanto fresco como criopreservado hasta la fecha del ensayo. Se obtiene una población respuesta agotada en monocitos mediante el paso de las células sobre una G-10 de Sephedex (Thomas et al. (1991)). Se colocan 100 \mul de células estimuladoras y 100 \mul de células reactivas (cada 05. x 106 células/ml) en placas de cultivo de 96 pocillos con base redonda. En los días 3, 5 y 7, se cosechan las placas y se cuentan después de marcarlas con 2,5 \muCi/pocillo de 3H-timidina.

CTL LDA. Se aísla PBMC como se describe en los procedimientos para MLR. Se diluye en serie el PBMC de respuesta no adherente, se distribuyen 12 ó 24 duplicados de pocillo de cada concentración de células de respuesta en placas de 96 pocillos de fondo en U, junto con el donante irradiado con 5 x 104 (3.000 rad) o una tercera parte de linfocitos estimuladores. Se establece la LDA para CTL en RPMI más 5% de FCS + 5% de autosuero con 25 U/ml de rIL-2 humano purificado (Collaborative Research, Bedford, MA) y un periodo de cultivo de 7-10 días. Para determinar la actividad de CTL después del periodo de cultivo, se hace un ensayo estándar de liberación de cromo durante 4 horas. Brevemente, los linfoblastos diana estimulados con PHA/IL2 se marcan con CR 51 y se añaden a los pocillos con una densidad de 1 x 104 células por pocillo. Los pocillos se puntuaron como positivos cuando el Cr 51 liberado fue > de 3SD por encima de la media de la liberación espontánea.

Estadísticas. Se calcula la frecuencia de CTLp utilizando el procedimiento de máxima probabilidad como el perfilado por Derry y Millar (1982). Se llevan a cabo las comparaciones apareadas de la frecuencia de CTLp, el índice de estimulación y la respuesta relativa así como la comparación de los valores antes del transplante de los animales tolerantes versus los no tolerantes para estas medidas, utilizando el test de la t de Student. Se usa el test exacto de Fisher para determinar cualquier asociación entre la probabilidad de pérdida de CTLp o respuesta MLR y la probabilidad de que llegue a ser tolerante. Los animales que han tenido que ser sacrificados por razones diferentes a la pérdida del injerto por rechazo, serán excluidos de los análisis estadísticos. Se analizan los datos de supervivencia del injerto utilizando el modelo de Weibull como se ha descrito previamente (Van Houwelingen
et al. (1995)).

Los grupos control consisten de monos que han recibido IT solo, 5C8 solo o CTLA4-Ig. En los grupos experimentales, se administra a los monos CTLA4-Ig o 5C8 en combinación con un tratamiento de 3 días con IT. La combinación de inmunotoxina y 5C8 y/o CTLA4 se administra de dos maneras diferentes: en un grupo experimental como un tratamiento breve de 1 semana (grupo 2) y en el segundo experimento como un protocolo largo de 4 semanas (grupo 3). Se utilizan diez monos en cada grupo con propósitos estadísticos, se describen abajo:

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Grupo 1:

IT solo, días 0, 1, 2 (0,2 mg/kg)

Grupo 2:

IT días 0, 1, 2 (0,2 mg/kg) + 5C8 días 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 28 (20 mg/kg/día)

Grupo 3:

5C8 solo días 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 28 (20 mg/kg/dosis)

Grupo 4:

CTLA4-Ig solo días 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 28 (20 mg/kg/dosis)

Grupo 5:

IT días 0, 1, 2 (0,2 mg/kg) + CTLA4-Ig días 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 28 (20 mg/kg/dosis)

Grupo 6:

5C8 días 0, 1, 2 (0,2 mg/kg)

Grupo 7:

IT días 0, 1, 2 (0,2 mg/kg) + 5C8 días 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 28 (20 mg/kg) + CTLA4-Ig días 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 28 (20 mg/kg/dosis)

Grupo 8:

controles no tratados (n=4; 1 por año)

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La tasa técnica de error es de aproximadamente 1/12 (n=5).

Se dan unas dosis "finales" de bloqueador de la coestimulación si los títulos del anticuerpo anti-donante llegan hasta último momento. Mensualmente se llevan a cabo biopsias del riñón transplantado a la mitad de los receptores y ninguna a la otra mitad, porque los datos preliminares sugieren que las biopsias podrían influir en el resultado del injerto, puede que por la inducción de una inflamación inespecífica en el injerto. Se evaluarán todas las biopsias mediante H&E y tinción en plata para valorar la arquitectura glomerular. Se evaluará el fenotipo de las células infiltrantes del injerto (GIC) por inmunocitoquímica utilizando anticuerpos específicos para células T (CD2, CD3, CD4, CD8) y células B (CD20) así como también marcadores para macrófagos y células NK. Además, se llevará a cabo el análisis de muerte celular (muerte celular programada/apoptosis versus citotoxicidad activa) entre las GIC. Se incluirán técnicas inmunocitoquímicas para analizar las proteínas relacionadas con el gránulo de células citotóxicas (perforina, granzima B, TlA-1) y se marcarán al final para analizar la apoptosis. (Ver e.g., Gavrieli et al. (1993); Wijsman et al. (1993); Li et al. (1995); Tomusciolo et al. (1995); Negoescu et al. (1996)).

\newpage

Ejemplo 2 Ensayos de Especificidad de la Inmunotoxina Combinada y Bloqueador de la Coestimulación In Vivo e In Vitro

Inmunización con el antígeno polisacárido de neumococo y de tétanos y medición de la respuesta humoral subsiguiente. Se inmunizan los monos vía intramuscular con toxoide tetánico adsorbido sobre aluminio o con antígeno polisacárido de neumococo, un mes antes del transplante, en el momento del transplante, una semana después y dos meses después del transplante. Se extrae sangre de los animales una semana antes de la inmunización y durante las primeras 4 semanas después de la inmunización. Se mide en el suero IgG y IgM anti-tétanos o anti-neumococo mediante ELISA (ver abajo).

ELISA para anti-mIgG, toxina de la difteria, toxoide tetánico y antígeno polisacárido de neumococo. Se cubren placas de ELISA de 96 pocillos con fondo plano durante la noche a 4ºC con 25 ml del antígeno apropiado (3 mg/ml). Después se bloquean las placas con PBS/2% BSA y se lavan, se le añade a cada pocillo 25 ml de suero diluido. Después de la incubación durante una hora a temperatura ambiente, se lavan las placasy se añade a cada placa IgM o IgG de cabra anti humana conjugada con peroxidasa de rábano apropiadamente diluida. Una vez más, después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, se le añade sustrato, después de añadirles la solución de parada, la placa está preparada para el lector de placa de ELISA automático. Se determina el titulo como la dilución con la lectura de absorbancia menor del 50% de la lectura máxima.

Cada una de ellas, inmunotoxina, anti-CD154 y CTLA4-Ig, tienen una vida media relativamente larga y no son específicas (i. e. no discriminan entre específico del aloinjerto y células inmunes inespecíficas). De este modo, se calcula el efecto de la combinación de la inmunotoxina con el bloqueador de la coestimulación para determinar si cualquier insensibilidad resultante o tolerancia es universal o específica del aloinjerto y si dicha insensibilidad es de larga duración. Dicho de otra manera, se puede calcular la respuesta a la infección por parte de los animales tratados.

Se puede estudiar, en cada grupo de monos del Ejemplo 1, la respuesta inmune a un antígeno de la proteína habitualmente estudiado, es decir el antígeno del tétanos. Se pueden valorar tanto la respuesta inmune primarias como secundaria, inmunizando los monos de la siguiente manera: 2 monos pueden recibir su inmunización primaria 1 mes antes del transplante, se pueden inmunizar 2 monos el día del transplante, se pueden inmunizar 2 monos 1 mes después del transplantey se inmunizan 2 monos 3 meses después del transplante. Se pueden valorar en cada mono, tanto la respuesta inmune primaria a la inmunización contra el tétanos como la respuesta secundaria a la dosis de refuerzo del antígeno del tétanos. Así se puede valorar la capacidad de los monos a responder frente a un antígeno no relacionado con el aloinjerto, tal como una infección, mientras estén en tratamiento con bloqueadores de la coestimulación.

Se puede utilizar un antígeno independiente de la célula T, a saber el antígeno polisacárido de neumococo, de modo similar al descrito para el antígeno del tétanos, para determinar la respuesta de los monos a un antígeno independiente de células T. Se puede utilizar un calendario de inmunización con antígeno polisacárido de neumococo análogo al descrito arriba. Dicho antígeno es un estímulo poco potente del sistema inmune pero es también una medida importante de la capacidad de los monos de responder frente a una infección.

Como en una correlación de la respuesta aloinmune in vitro, se pueden testar todos los monos transplantados para sus sensibilidades de MLC y de CTL tanto hacia los linfocitos del donante o hacia dos o más monos no relacionados del tercer grupo. El propósito de este experimento es determinar la especificidad del protocolo inmunosupresor y valorar como este puede cambiar con el tiempo. Estos ensayos se pueden llevar a cabo antes del transplantey en los meses 1, 3, 6 y 12 después del transplante.

Ejemplo 3 Insensibilidad Específica del Donante como resultado de la Inmunotoxina Combinada y del Bloqueador de la Coestimulación

Detección de IgG anti-donante. Se detectan los anticuerpos anti-donantes (IgM o IgG) mediante citometría de flujo. Se recoge suero del receptor antes del transplante, semanalmente durante el primer mes y después mensualmente. Se almacenan un mínimo de 3 alícuotas de 200 \muml cada una a -85ºC hasta el ensayo. Brevemente, se incuban en hielo 50 \mul de suero diluido de receptor (empezando en 1:10) con 50 \mul del donante o PBL del tercer grupo (2 x 107 células/ml). Después de 30 minutos de incubación, se lavan las células dos veces con PBS/1%FCS. Entonces se incuban las células en 100 \mul de PBS/1%FCS que contiene un anticuerpo policlonal IgG de cabra anti-humana conjugada con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratorios Inc), diluido 1:50 durante 30 minutos. Se vuelven a lavar las células dos veces y se analizan mediante citometría de flujo FACSCAN (Becton-Dickenson). Se determinarán las especificidades de los anticuerpos anti-células T (Clase I) y anti-células B (Clase I y Clase II) mediante tinción dual de las células con anti-CD3 o anti-CD20 (Ohkawa et al. (1995)).

Ensayo de Citólisis mediada por Anticuerpo-Complemento (ACC). Se puede llevar a cabo ACC como se ha descrito previamente (Derry et al. (1982)). Las células diana son blastos ("blasts") de donante marcados con Cr51 y blastos ConA del tercer grupo en RPMI/10% FCS. Se incuban 10 ml de células diana (1 x 106/ml) con 20 ml de suero diluido por triplicado durante 45 minutos en placas de 96 pocillos de fondo redondo a temperatura ambiente. Se añade complemento de conejo, diluido 1:8, en cada pocillo (20 ml). Se incuban las placas durante 45 minutos a 37ºC. Luego se añaden 100 ml de medio frío a cada pocillo, se cultivan las placas y el sobrenadante se cultiva en filtros de Skatron (Skatron, Sterling VA). Los controles incluyen las lisis espontáneas (sin el complemento añadido) y lisis máximas (2% TritonX-100). Se calcula entonces el porcentaje de Cr51 específico liberado.

Uno de los ensayos más rigurosos sobre insensibilidad específica del donante in vivo es el injerto de piel de un receptor supuestamente tolerante con piel de donante o del tercer grupo. Los monos del Ejemplo 1 pueden sufrir injertos de piel de donante o del tercer grupo 200 días después del transplante para determinar, con el tiempo, la insensibilidad específica del donante y si se puede romper la insensibilidad hacia un aloinjerto renal por exposición a un injerto de piel que proviene del mismo donante.

Se puede medir la IgG anti-donante en todos los monos transplantados con el pretransplante como base de referencia temporal y otra vez cada semana durante el primer mes y mensualmente después. Bajo el bloqueo de la coestimulación, la síntesis del anticuerpo anti-donante está infrarregulada. Se pueden utilizar dos aproximaciones para identificar los anticuerpos anti-donantes: (1) se medirán los anticuerpos de las células mononucleares anti-donantes (principalmente contra los antígenos MHC) y (2) se pueden aislar células del riñón a partir de las biopsias del riñón del donante y se utiliza la prueba de Western blot para identificar los anticuerpos contra las células del riñón.

Referencia Ejemplo 4

Recuperación del Rechazo Agudo del Aloinjerto Tratado con Inmunotoxina y Bloqueador de la Coestimulación

Se puede utilizar el modelo de aloinjerto renal de mono para determinar si los fallos (i.e. rechazo agudo del aloinjerto) con inmunotoxina combinada y bloqueador de la coestimulación se pueden recuperar con éxito. Se puede utilizar la inmunotoxina como una potente terapia anti-células T para recuperar los aloinjertos. Los monos tratados con cualquier combinación de inmunotoxina y bloqueadores de la coestimulación que desarrollan un aumento en la creatinina sérica y tienen evidencia de un rechazo agudo determinada por biopsia pueden tratarse con tres dosis de IT como terapia de recuperación. Se pueden utilizar el seguimiento de las creatininas, los exámenes clínicos, las biopsias para valorar si el rechazo agudo ha revertido y si los monos toleran dicha terapia.

Cuando los monos tratados con 5C8 y/o CTLA4-Ig desarrollan un rechazo agudo, la mayoría de ellos lo hacen durante los primeros 200 días. Se sospecha de un rechazo si la creatinina alcanza los 2,5 mg/dl y se confirma mediante histología de la biopsia. Se pueden tratar los monos que se encuentran dentro de estos parámetros con IT (0,2 mg/kg dosis total) para revertir el rechazo. Los criterios para considerar el éxito de la recuperación serían la inversión del aumento de la creatinina sérica y el retorno a sus valores basales, la desaparición histológica de tubulitis y otras características del rechazo agudo y la ausencia de efectos adversos serios del tratamiento.

Referencia Ejemplo 5

Estudios en Humanos Utilizando Inmunotoxina Combinada y Bloqueador de la Coestimulación

Ya que los resultados en monos muestran que 5C8 por si solo tiene una eficacia significativa en la prevención del rechazo agudo del aloinjerto, se puede usar en humanos siguiendo el transplante renal primario a partir de cadáveres. Las dosis utilizadas pueden ser aquellas identificadas en los estudios clínicos actuales en fase I con 5C8 en pacientes con púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), una enfermedad autoinmune o en un estudio propuesto en fase I para pacientes con una enfermedad renal de naturaleza autoinmune (sin transplante). Estos dos estudios en fase I con 5C8 hacen que no sea necesario planear un estudio separado de fase I para el transplante de riñón humano, especialmente desde que no se espera que las cinéticas de la depuración del anticuerpo sean sustancialmente diferentes en pacientes con fallo renal.

En los estudios en fase II, se puede suprimir la ciclosporina o la prednisona de la terapia inmunosupresora de mantenimiento. Se pueden incluir cincuenta pacientes en un estudio abierto, no randomizado, no controlado para evaluar la seguridad y la eficacia de 5C8 en la prevención del rechazo agudo y del rechazo crónico. Se puede utilizar 5C8 como agente inductor en combinación con la terapia inmunosupresora de mantenimiento que consiste en prednisona o micofenolato o ciclosporina y micofenolato. Se puede utilizar una sola dosis de 5C8 y se administra el medicamento los días 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 y 28.

El seguimiento del paciente puede incluir un estudio hematológico (hemoglobina, índices RBC, WBC con diferencial y recuento de plaquetas) y un análisis químico que incluya electrolitos, creatinina, BUN, INR, PTT, enzimas hepáticos, LDH, amilasa y ácido úrico. Se pueden llevar cabo estos estudios como base de referencia antes de la primera dosis y en los días 1, 2, 3 y 4 siguientes a la dosis inicial y entonces en las semanas 1, 2, 3 y 4 después del transplante y después a los 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 9 meses y 12 meses. Un seguimiento adicional puede incluir un ionograma urinario, EKG, rayos X del tórax como una predosificación básica de referencia y en 1 semana, 1 mes, 6 meses y 12 meses. Se puede llevar a cabo un examen físico al inicio y al final del estudio. Se puede hacer el seguimiento de cada paciente durante 12 meses. Un seguimiento adicional puede incluir citometría de flujo para evaluar los niveles de CD3, CD4, CD8, CD20 y CD154. Se pueden medir estos semanalmente durante el primer mes y después en los meses 2, 3, 4, 6, 9 y 12. Se puede incluir la pérdida de peso como efecto colateral adverso esperado. Se hace un seguimiento de los resultados que incluyen rechazo agudo y crónico, infección, tumor, función del injerto como los reflejados por la creatinina sérica y BUN, supervivencia del injerto y supervivencia del paciente.

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Debido al poder de prevención del rechazo crónico por parte de 5C8, se pueden llevar a cabo biopsias a los dos años en todos los individuos y analizar evidencias histológicas de cambios prematuros del rechazo crónico tales como la glomerulopatía del injerto, engrosamiento arterial, reduplicación de la membrana basal glomerular, atrofia tubular y fibrosis intersticial. Además, se puede llevar a cabo el análisis de citoquinas de las células que se infiltran en el injerto para determinar si están presentes las citoquinas que predicen el rechazo crónico. Con la finalidad de valorar si el rechazo crónico es incipiente y como criterios histológicos indirectos de valoración para el rechazo crónico, se pueden someter las biopsias a extracción de ARN y análisis por PCR de la expresión de las citoquinas. Específicamente, se pueden medir el recambio del receptor de la célula T (CD3g), IL-2, 6, 8 y TNFa en especímenes biopsiados desde que estos marcadores se relacionan con proteinuria, fibrosis, atrofia tubular en resultados descritos por (Kirk et al. (American Society of Transplant Physicians, 1997)). (Kirk et al. (Hum. Immunol. 1995), Kirk et al. (Transplantation 1997)) Ellos desarrollaron esta metodología. Se pueden procesar estas muestras clínicas de biopsias para extraer ARN y hacer ADNc y se pueden medir las citoquinas.

Aunque se ha descrito el presente proceso con referencia a detalles específicos de ciertas realizaciones del mismo, no se tiene la intención de que dichos detalles deberían considerarse como limitaciones sobre el ámbito de la invención excepto cómo y hasta qué punto se incluyen en las reivindicaciones adjuntas.

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Claims (24)

1. Uso de una combinación de

a)

una inmunotoxina para reducir la población de células T del receptor y

b)

un bloqueador de la coestimulación para reducir una respuesta de anticuerpo específico del injerto.

para preparar un medicamento para prevenir el rechazo crónico de un injerto en un receptor.

2. Uso de la reivindicación 1, en el que el injerto es alogénico.

3. Uso de la reivindicación 1, en el que el receptor es un mamífero.

4. Uso de la reivindicación 3, en el que el mamífero es un primate.

5. Uso de la reivindicación 4, en el que el primate es un humano.

6. Uso de la reivindicación 1, en el que la inmunotoxina reduce de manera transitoria las células T en la sangre y en los ganglios linfáticos del individuo en por lo menos una unidad log.

7. Uso de la reivindicación 1, en el que la inmunotoxina es una inmunotoxina bivalente anti-célula T dirigida contra el epítopo CD3.

8. Uso de la reivindicación 7, en el que la inmunotoxina bivalente anti-célula T comprende una porción de una toxina y una porción diana dirigida contra el epítopo CD3\varepsilon.

9. Uso de la reivindicación 8, en el que la porción de una toxina es una toxina de la difteria.

10. Uso de la reivindicación 9, en el que la inmunotoxina bivalente anti-célula T es UCHT1-CRM9.

11. Uso de la reivindicación 1, en el que el injerto proviene de un donante vivo.

12. Uso de la reivindicación 1, en el que el injerto proviene de un donante muerto.

13. Uso de la reivindicación 1, en el que el injerto se selecciona del grupo que consiste en injertos de riñón, de hígado, de corazón, de páncreas, de pulmón y de piel.

14. Uso de la reivindicación 1, en el que el bloqueador de la coestimulación bloquea la vía CD40:CD154.

15. Uso de la reivindicación 14, en el que el bloqueador de la vía CD40:CD154 es un anti-CD154.

16. Uso de la reivindicación 15, en el que el anti-CD154 es 5C8.

17. Uso de la reivindicación 14, en el que la combinación comprende además un segundo bloqueador de la coestimulación para reducir adicionalmente la respuesta del anticuerpo específico del injerto.

18. Uso de la reivindicación 17, en el que el segundo bloqueador de la coestimulación bloquea la vía B7:CD28.

19. Uso de la reivindicación 18, en el que se usa el bloqueador de la vía B7:CD28 para unirse a B7 y para bloquear la unión de B7 con CD28.

20. Uso de la reivindicación 19, en el que el bloqueador de la vía B7:CD28 es CTLA4-Ig.

21. Uso de la reivindicación 1, en el que se usa el bloqueador de la coestimulación para bloquear la vía B7:CD28.

22. Uso de la reivindicación 21, en el que el bloqueador de la vía B7:CD28 es CTLA4-Ig.

23. Uso de la reivindicación 1, en el que la combinación además comprende un agente inmunosupresor.

24. Uso de la reivindicación 23, en el que el agente se selecciona del grupo que consiste en ciclosporina, micofenolato mofetil, tacrolimus, azatioprinay esteroide y cualquier combinación de ellos.