ES2213996T3 - Uso de himenialdisina o sus derivados en la fabricacion de medicamentos. - Google Patents

Abstract

El uso de himenialdisina o sus derivados de la fórmula 1 en la cual R1 y R2, idénticos o diferentes, representan H o Br, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en la fabricación de un medicamento para usar en las enfermedades neurodegenerativas que implican la desregulación de las cinasas dependientes de ciclina, GSK-3a y cinasa caseína 1.

Description

Uso de himenialdisina o sus derivados en la fabricación de medicamentos.

La invención se refiere al uso de himenialdisina o sus derivados en la fabricación de medicamentos capaces de bloquear la división celular o la transducción intracelular de las señales.

Más en particular se refiere al uso de himenialdisina (denominada en lo sucesivo HD), o sus derivados, en la fabricación de inhibidores de las cinasas proteína.

Las cinasas proteína están implicadas en la regulación celular, en particular en la fosforilación de proteínas.

Las proteínas cinasa dependientes de ciclina (CDKs en forma abreviada) están implicadas en el control del ciclo celular (CDK1, 2, 3, 4, 6 y 7), en la apoptosis de timocitos (CDK2), en funciones neuronales (CDK5), en el control de la transcripción (CDK7, 8 y 9) (en [1,2,3] se revisa la lista de referencias que se incluyen al final de la descripción). En los tejidos nerviosos la CDK5/p35 fosforila las proteínas tau asociadas a los microtúbulos y MAP-1 B, a la cinasa Pak1 y a las subunidades de neurofilamentos. En pocos años se ha desarrollado un despistaje intensivo para identificar una serie de inhibidores químicos de las CDKs, como olomoucina, roscovitina, purvalanol, flavopiridol, indirrubinas o paulonas. Algunos de estos compuestos muestran una notable selectividad y eficiencia. Muchos han cristalizado simultáneamente con CDK2 y sus interacciones con el bolsillo de unión del ATP de la cinasa se han analizado minuciosamente (revisión en [4]).

También se ha descrito que la HD inhibe las cinasas proteína C (WO 93 16703 y WO 95 31462).

Se ha demostrado ahora que dicho compuesto, y sus derivados, son inhibidores potentes y selectivos de las CDKs 1, 2 y 5 y de otras dos cinasas proteína mayores implicadas en la fosforilación de proteínas, por ejemplo, la cinasa sintasa de glucógeno 3-\beta (GSK-3\beta y en forma abreviada) y la cinasa caseína 1.

La invención se refiere por tanto al uso de himenialdisina o sus derivados de la fórmula I

1

en la cual R^{1} y R^{2}, idénticos o diferentes, representan H o Br, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en la fabricación de un medicamento para usar en enfermedades neurodegenerativas que implican la la desrregulación de las cinasas dependientes de ciclina, GSK-3\beta y cinasa caseína 1.

El término "derivados", tal como se usa en la especificación, contiene las sales definidas anteriormente.

En un uso preferido, el compuesto es 4-(2-amino-4-oxo-2-imidazolin-5-ilideno)-4,5,6,7-tetrahidropirrolo(2,3-c)azepin-8-ona, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

En otro uso preferido, el compuesto es 4-(2-amino-4-oxo-2-imidazolin-5-ilideno)-2-bromo-4,5,6,7-tetrahidropirrolo(2,3-c)azepin-8-ona, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Como se observa con otros inhibidores de las CDKs, la HD y sus derivados actúan compitiendo con el ATP. Interaccionan con el bolsillo de unión del ATP a través de tres enlaces hidrógeno con los residuos Glu-81 y Leu-83 de CDK2.

Los derivados de himenialdisina capaces de formar enlaces hidrógeno con los residuos Glu-81 y Leu-83 de CDK2 también forman parte de la invención.

Como se ha mencionado anteriormente, dichos compuestos inhiben fuertemente la CDK1, CDK2, CDK5, GSK-3\beta y la cinasa caseína 1.

Los experimentos in vivo en varios modelos han demostrado que la HD y sus derivados inhiben la CDK5/p35 como se demuestra por la ausencia de fosforilación o regulación negativa de la cinasa Pak1 en las neuronas corticales de la rata E18.

También inhiben la GSK-3\beta in vivo, tal como se demuestra por la inhibición de la fosforilación MAP-1 B en un locus específico de la GSK-3\beta. También bloquean la fosforilación in vivo de la proteína tau de unión a microtúbulos en los loci en los que se hiperfosforila por GSK-3\beta y CDK5/p35 en la enfermedad de Alzheimer.

Al actuar sobre dichas cinasas, que representan las principales cinasas implicadas en la hiperfosforilación de los sustratos implicados en las enfermedades neurodegenerativas, dichos compuestos tienen un gran interés para la fabricación de medicamentos para el tratamiento y la prevención de las afecciones correspondientes.

En consecuencia, la invención se refiere al uso de HD y sus derivados para la fabricación de medicamentos útiles para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas.

Dichos medicamentos se pueden usar para el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Alzheimer. Se puede mencionar la atrofia de múltiples sistemas, otros trastornos neuronales, como la enfermedad de Parkinson, o la atrofia muscular espinal canina hereditaria en los perros.

También se mencionarán la prevención y el tratamiento de la diabetes, así como el tratamiento o la prevención antiinflamatoria o del cáncer.

Los compuestos de la fórmula I se puede aislar de invertebrados marinos [5].

Se ha encontrado HD en especies de esponjas marinas que pertenecen a las familias Agelasidae, Axinellidae y Halichondriidae. Estos animales contienen varias sustancias que están claramente relacionadas desde el punto de vista metabólico con HD (figura 1).

La adición de ácidos farmacéuticamente aceptables forma sales de compuestos de la fórmula I con ácidos orgánicos o inorgánicos según los métodos habituales.

Los ácidos adecuados son los ácidos acético, ascórbico, maleico, fosfórico, salicílico y tartárico.

Los medicamentos incluyen una cantidad eficaz de los compuestos mencionados anteriormente junto a un vehículo farmacológicamente aceptable.

Dicho vehículo puede ser sólido o líquido, dependiendo de la forma de administración.

Los medicamentos se pueden administrar en varias formas: por vía parenteral, rectal, tópica, transdérmica u oral. Más en particular, se administran por vía oral o inyectable.

Para la administración por vía oral se pueden usar rombos, comprimidos, píldoras, tabletas, cápsulas, gotas, jarabes, suspensiones o emulsiones. Estas composiciones contienen para obtener el mayor beneficio 100 a 1000 mg del principio activo por unidad de dosis, preferiblemente 300 a 600 mg.

Otras formas de administración son las soluciones inyectables para uso por vía intravenosa, subcutánea o intramuscular, formuladas en soluciones estériles o esterilizables. También pueden ser suspensiones o emulsiones.

Estas formas inyectables contienen 100 a 1000 mg de un compuesto de la fórmula I o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, preferiblemente 300 a 600 mg, por unidad de dosis.

A modo de indicación, la posología que se puede usar en un paciente que necesite este tratamiento se corresponde con las dosis siguientes: por ejemplo, 100 a 1000 mg/día se administran de esta manera al paciente de 1 a 4 veces al día para el tratamiento de los trastornos neurodegenerativos.

La invención también se refiere a reactivos biológicos cuyos principios activos consisten en los compuestos de la fórmula I tal como se han definido anteriormente.

Estos reactivos se pueden usar como referencias o estándares en estudios de división celular y mecanismos de fosforilación. Otras características y ventajas de la invención se describen en los ejemplos que se indican a continuación con referencia a las figuras 1 a 13, en las cuales:

- La figura 1 representa la estructura de himenialdisina y metabolitos relacionados aislados a partir de esponjas marinas.

- La figura 2 muestra la actividad de la CDK1/cinasa ciclina B en presencia de concentraciones crecientes de HD y análogas.

- La figura 3 muestra la autorradiografía obtenida con una presenilina-MBP proteína de fusión fosforilada in vitro con cinasa caseína 1 en presencia de concentraciones crecientes de HD y separadas por electroforesis en SDS-PAGE.

- La figura 3 muestra la autorradiografía obtenida con una presenilina-MBP proteína de fusión fosforilada in vitro con cinasa caseína 1 en presencia de concentraciones crecientes de HD y separadas por electroforesis en SDS-PAGE.

- La figura 4A representa la inhibición por HD de la fosforilación Pak1 por CDK5/p35 in vitro e in vivo (la figura 4A muestra el nivel de la fosforilación H4 después de una electroforesis en SDS-PAGE del sustrato, y la figura 4B las transferencias Western que muestran las cantidades de Pak1 y p35).

- La figura 5A muestra la autorradiografía de r-htau fosforilada in vitro con GSK-3\beta en presencia de concentraciones crecientes de HD y separadas por electroforesis en SDS-PAGE, y la figura 5B los resultados de la inmunotransferencia obtenidos por reacción con varios anticuerpos y preparados de htau23, expuestos o no expuestos a los inhibidores de las CDKs in vivo.

- La figura 6A muestra los datos cinéticos de las determinaciones de la actividad de las cinasas proteína CDK1/
ciclina B en diferentes concentraciones de HD, y la figura 6B muestra los resultados obtenidos cuando se expone la CDK1/ciclina B inmovilizada a HD y la transferencia Western con anticiclina B y anticuerpos anti-PSTAIRE.

- La figura 7 muestra una visión en tres dimensiones del mapa de densidad de electrones de HD formando un complejo con CDK2.

- La figura 8A muestra un diagrama en tres dimensiones de la estructura refinada de la HD en el bolsillo de unión del ATP de CDK2 y la figura 8B la ilustración esquemática de las interacciones entre CDK2 y HD.

- La figura 9 muestra visiones en tres dimensiones de la comparación entre la unión de HD-CDK2 con la de otros ligandos CDK2.

- La figura 10 muestra los resultados obtenidos por una tinción de inmunofluorescencia doble de las proteínas de unión GAP-43 y MAP-1 B-P dependiendo de las concentraciones de HD (A-H) y los resultados de la transferencia Western con lisados celulares en respuesta al aumento de las dosis de HD.

- La figura 11 muestra el efecto de HD en el crecimiento de las células HT 29-18-C1.

- Las figuras 12 y 13 muestran los efectos celulares de HD con la parada en fase S (figura 12) y en la transición G2/M (figura 13).

I/ Material y métodos - Productos químicos y reactivos

Ortovanadato sódico, EGTA, EDTA, RNAse A, Mops, \beta-glicerofosfato, fenilfosfato, fluoruro sódico, glutatión-agarosa, ditiotreitol (DTT), albúmina sérica bovina (BSA), nitrofenilfosfato, leupeptina, aprotinina, microcistina, pepstatina, inhibidor de la tripsina de soja, benzamidina, histona H1 (tipo 111-S), proteína básica de mielina y caseína se obtuvieron en Sigma Chemicals [\gamma-^{32}P]-ATP (PB 168) en Amersham.

El péptido GS-1 (YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQSpEDEEE) se obtuvo mediante síntesis.

Himenialdisina se aisló tal como se ha descrito previamente [6,7] y se disolvió en una solución madre 10-50 mM en dimetilsulfóxido (DMSO). Se diluyó hasta 5-10 mM en Me_{2}SO inmediatamente antes de usarse en tampones acuosos. La concentración final de DMSO en la mezcla de reacción fue menor del 1% (v/v).

Axinohidantoína [7], el complejo himenialdisina-platino, diacetilhimenialdisina, diacetii-debromohimenialdisina, dibromofakelestatina [6], agelastatina A [8], dibromoageliferina, clatrodina, himenidina y dibromocantarelina [9] se prepararon en el laboratorio. Agelongina [10], dispacamida B [11], esceptrina [12], oroidina [13] y estevensina (odilina) [14,9] se purificaron a partir de especies de Agelas.

La proteína GST del retinoblastoma se expresó en bacterias y se purificó en cuentas de glutatión-Sepharose, tal como se ha descrito previamente [15]. Las cuentas de p9^{CKShs1}-Sepharose se prepararon tal como se ha descrito previamente [16].

- Tampones

Tampón de homogenización: (\beta-glicerofosfato 60 mM, p-mtrofenilfosfato 15 mM, Mops (pH 7,2) 25 mM, EGTA 15 mM, MgCl_{2} 15 mM, DTT 1 mM, vanadato sódico 1 mM, NaF 1 mM, fenilfosfato 1 mM, leupeptina 10 \mug/ml, aprotinina 10 \muglml, inhibidor de la tripsina de soja 10 \mug/ml y benzamidina 100 \muM.

Tampón A: MgCl_{2} 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, Tris-HCl 25 mM pH 7,5, heparina 50 \mug/ml.

Tampón C: Tampón de homogenización pero con EGTA 5 mM, sin NaF y sin inhibidores de proteasa.

Tampón de lisis hipotónico (TLH): Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 120 mM, glicerol al 10%, Nonidet-P40 al 1%, DTT 5 mM, EGTA 1 mM, NaF 20 mM, ortovanadato 1 mM, microcistina 5 \muM y 100 \mug/ml de cada uno de los siguientes productos: leupeptina, aprotinina y pepstatina.

Solución salina tamponada con Tris-Tween-20 (TBST): Tris 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0.1%. Tampón STM: Tris-HCl 10 mM pH 8,0, sacarosa 0,25 M, MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM e inhibidores de proteasa y fosfatasa [17].

- Preparaciones y determinaciones de cinasas

Las actividades de las cinasas se determinaron en el tampón A o C (a menos que se indique lo contrario), a 30°C. con una concentración final de ATP de 15 \muM. Los valores del blanco se restaron y las actividades se calcularon como pmoles de fosfato incorporados durante una incubación de 10 minutos (expresados habitualmente como % de la actividad máxima, es decir, sin inhibidores). Los controles se realizaron con diluciones apropiadas de Me_{2}SO. En algunos casos, se determinó la fosforilación del substrato mediante autorradiografía después de electroforesis en SDS-PAGE. Los valores de la CI_{50} se estimaron a partir de las curvas de dosis-respuesta.

La CDK1/ciclina B se extrajo en el tampón de homogenización a partir de oocitos de la estrella de mar (Marthasterias glacialis) en fase M y se purificó mediante cromatografía de afinidad en cuentas de p9^{CKShs1}-Sepharose, a partir de la cual se eluyó mediante p9^{CKShs1} libre, tal como se ha descrito [15,16]. La actividad de la cinasa se determinó en el tampón C, con 1 mg/ml de histona H1, en presencia de ATP 15 \muM [\gamma-^{32}P] (3.000 Ci/mmol; 1 mCi/ml) en un volumen final de 30 \mul. Después de 10 minutos de incubación a 30°C se sembraron alícuotas de 25 \mul del sobrenadante en piezas de 2,5 x 3 cm de papel de fosfocelulosa Whatman P81, y 20 segundos más tarde se lavaron los filtros cinco veces (al menos durante 5 minutos cada vez) en una solución de 10 ml de ácido fosfórico/litro de agua. Los filtros húmedos se contaron en presencia de 1 ml de líquido de centelleo ACS (Amersham).

La GSK-3\beta se purificó a partir de músculo de conejo o se expresó y purificó en células Sf9 de insecto [18]. Se valoró después de una dilución 11100 en 1 mg de BSA/ml de DTT 10 mM, con 5 \mul del péptido GS-1 40 \muM como sustrato, en el tampón A, en presencia de ATP 15 \muM [\gamma-^{32}] (3.000 Ci/mmol; 1 mCi/ml) en un volumen final de 30 \mul. Después de 30 minutos de incubación a 30°C, se sembraron alícuotas de 25 \mul del sobrenadante en papeles de fosfocelulosa P81 y se trataron como se ha descrito anteriormente.

La CDK5/p25 se reconstituyó mezclando cantidades iguales de CDK5 recombinante y p25 expresadas en E. coli como proteínas de fusión GST (Glutatión-S-transferasa) y se purificaron por cromatografía de afinidad en glutatión-agarosa (p25 es una versión truncada del activador CDK5). Su actividad se determinó en el tampón C como se ha descrito en el caso de CDK1/ciclina B.

La CDK2/ciclina A, la CDK2/ciclina E, la CDK3/ciclina E, la CDK4lciclina D1, la CDK6/ciclina D2, erk1 y erk2 marcado con His, las isoformas de las cinasas proteína C, la subunidad catalítica de las cinasas proteína dependientes de cAMP, las cinasas proteína dependientes de cGMP, la cinasa de la cadena ligera de la miosina, las cinasas caseína 1 y 2, ASK-y (un homólogo vegetal de GSK-3), el dominio de cinasa tirosina del receptor de insulina (CIRK-41), c-raf, MAPKK, la cinasa N-terminal c-jun (obtenida de Promega), la cinasa c-src y la cinasa v-abl se determinaron tal como se ha descrito [15].

- Electroforesis y transferencia Western

Las proteínas unidas a las cuentas de p9^{CKSns1}-Sepharose (CDK1/ciclina B de estrella de mar) se desnaturalizaron con tampón de muestra Laemmli 2X. Las muestras se analizaron en geles de SDS-poliacrilamida al 10%. Las proteínas se transfirieron desde el gel a una hoja de nitrocelulosa de 0,1 pm en un sistema milliblot-SDE (Millipore) durante 30 minutos a 2,5 mA/cm^{2} en tampón de transferencia. Posteriormente, el filtro se bloqueó con leche baja en grasa al 5% en TBST durante 1 hora. El filtro se lavó a continuación con TBST y se incubó durante 1 hora con los primeros anticuerpos (anti-PSTAIRE, 1:2000; anticiclina B, 1:1000). Después de 4 lavados (1 X 20 minutos, 3 X 5 minutos) con TBST, la hoja de nitrocelulosa se trató durante 1 hora con anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa de rábano diluidos en TBST (1:1000). El filtro se lavó a continuación 5 veces (1 X 20 minutos, 4 X 5 minutos) con TBST y se analizó por quimioluminescencia potenciada con reactivos de detección ECL e hiperfilm MP.

- Preparación de los cristales de CDK2/HD

La CDK2 humana se purificó y cristalizó tal como se ha descrito previamente [19]. Para prevenir el agrietamiento de los cristales se utilizó un procedimiento que implica la reticulación química. Los cristales se sumergieron primero en una solución que contiene ATP 0,5 mM y MgCl_{2} 1 mM durante 2 horas, después se reticularon con glutaraldehído al 0,1% durante 1 hora a 4°C. Después de un lavado exhaustivo los cristales se transfirieron a una solución de inhibidor en HEPES 0,2 M, etilenglicol al 5% y DMSO al 1%. Este protocolo permitía que los cristales se sumergieran en concentraciones del inhibidor hasta 0,5 mM durante varios días sin mostrar daño alguno.

- Determinación de la estructura cristalina de CDK2/HD

Los datos de difracción de rayos X hasta una resolución de 2,1 A se obtuvieron en un solo cristal de CDK2/HD usando un sistema de detección con placa de imagen R-Axis II montado en un generador Rigaku con rotación del ánodo. Los datos se recogieron a 120 K para prevenir el daño por radiación de los cristales. Inmediatamente antes de la congelación el cristal se transfirió a una solución crioprotectora que contenía etilenglicol al 25%. La congelación rápida se consiguió en un chorro de nitrógeno seco usando un criodispositivo de Molecular Structure Corporation. La congelación alteró ligeramente las dimensiones de la célula unitaria y aumentó la diseminación del mosaico de 0,2° a 0,6°. La reticulación no alteró significativamente por sí misma las características de difracción. Los datos de intensidad se procesaron utilizando los programas DENZO y SCALEPACK [20]. Para obtener el grupo final de las amplitudes del factor de la estructura se usó el programa TRUNCATE, tal como se ha introducido en la serie CCP4 [21]. En la Tabla 3 se muestra un resumen de las estadísticas del procesamiento de datos. El refinamiento del complejo CDK2/HD comenzó a partir de las coordenadas del modelo CDK2/ATP muy refinado. Todos los pasos del refinamiento se realizaron usando el programa X- PLOR [22]. Para reorientar y reposicionar satisfactoriamente la molécula de CDK2 en la célula unitaria del cristal congelado fue necesario utilizar la sustitución molecular seguida por el refinamiento rígido del cuerpo. El modelo se refinó aún más usando varias tandas de minimización de la energía de gradiente conjugada. Después de esta etapa, la densidad clara de los electrones, calculada a partir de los mapas de Fourier 2F_{o},-F_{c} y F_{o}-F_{c}, indicó el modo de unión del inhibidor de himenialdisina. Las coordenadas iniciales y los términos de la limitación geométrica de himenialdisina se obtuvieron a partir de la estructura molecular pequeña de Mattia y cols. [23]. El modelo de refinamiento de CDK2/HD se buscó a continuación con varias tandas de minimización de la energía limitada de rayos X y por la dinámica molecular, alternadas ambas con la construcción del modelo. Hacia el final del refinamiento se añadieron al modelo varias moléculas de agua y algunas moléculas de etilenglicol. La estereoquímica del modelo CDK2/HD se verificó usando el programa informático PROCHECK [24].

- Fosforilación de presenilina-2 in vitro

El gran bucle hidrofílico de presenilina-2 que se encuentra entre los dominios de transmembrana 6 y 7 se expresó en E. coli como una proteína de fusión de la proteína de unión presenilina-bucle 2-maltosa (MBP) [25]. Después de purificarla con una cromatografia de afinidad la presenilina-2-MBP se usó como sustrato de la CK1. Después de una incubación de 30 minutos en presencia de varias concentraciones de HD se interrumpió la reacción de la cinasa añadiendo el tampón de muestra Laernmli. MBP-presenilina-2 se separó por electroforesis en SDS-PAGE y su nivel de fosforilación se visualizó por autorradiografía.

- Fosforilación Pak1 in vitro e in vivo por CDK5/p35 Fosforilación Pak1 in vitro

La CDK5/p35 se obtuvo por precipitación inmune a partir de cortezas de rata P02 usando el anticuerpo Santa Cruz C-terminal (400 \mug de proteínas totales por determinación de cinasa). El precipitado inmune se dividió en alícuotas iguales y las determinaciones de cinasa se realizaron utilizando GST-Pak1 K299 como sustrato. Se añadió a las cuentas roscovitina, HD o DMSO inmediatamente antes de la determinación de la cinasa, tal como se ha descrito [17]. La fosforilación se monitorizó por autorradiografía.

Fosforilación Pak1 in vivo

La HD se añadió a neuronas cultivadas procedentes de cortezas de embriones de rata E18 cuando los cultivos tenían 4 días de antigüedad. Como control se usó DMSO hasta el volumen máximo del fármaco utilizado (7,5 \mul). El fármaco se dejó actuar sobre las células durante 1 hora. Las células se lisaron a continuación en hielo en tampón STM y la fracción de membrana se aisló con STM que contenía NP-40 al 0,5% [17].

Las inmunoprecipitaciones de Pak1 se realizaron usando un anticuerpo policlonal específico, seguido por determinaciones de cinasa usando la histona H4 como sustrato. La cantidad de fosforilación de H4, que refleja el nivel de actividad Pak1, se determinó midiendo la intensidad de las bandas en la película de autorradiografía y cuantificando con el programa de adquisición de imágenes NIH.

Como controles de carga se realizaron transferencias Western Pak1 y p35. La cantidad de esta última proteína aumenta con el nivel de inhibición de la cinasa CDK5/p35.

- Fosforilación MAP-IB in vivo por GSK-3 e inmunohistoquímica

Las células granulares cerebelosas se aislaron de ratones recién nacidos y se purificaron según el método de Hallen [26] usando gradientes de Percoll. Las células se sembraron en placas recubiertas con poli-D-lisina (100 \mug/ml) y laminina (50 \muglml) y crecieron en medio sin suero durante 1 día, tratándose a continuación los cultivos con HD (1-100 \muM) durante 20 h. Los cultivos se fijaron con formaldehído al 4% en PBS y se almacenaron en PBS a 4°C. Las células se permeabilizaron con metanol al 100% y se incubaron con anticuerpos primarios frente a GAP-43 y MAP-1B-P (SMI-31, Afinito) toda la noche a 4°C. Se usaron los anticuerpos secundarios conjugados FIAC y Texas Red (Vector). Para el análisis de transferencia Western, las células se lisaron en el tampón de muestra y se analizaron mediante una electroforesis en SDS-PAGE al 8%. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron con un anticuerpo frente a MAP-1B-P (SMI-31) diluido en la solución de bloqueo (Tween-20 al 0,1% y leche descremada en polvo al 3% en TBS) durante 2 h a temperatura ambiente. Se usaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Amersham) y las proteínas se visualizaron con un sistema ECL (Pierce). Las transferencias se escanearon usando un escáner de lecho plano (UMAX Astra 1200S).

- Fosforilación tau in vitro e in vivo

Células y virus. Las células Sf9 (InVitrogen, San Diego, CA) crecieron 27°C en un cultivo monocapa en medio de Grace (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) suplementado con suero fetal bovino al 10% y 50 \mug de gentamicina/ml y 2,5 \mug de anfotericina/ml. BaculoGold se obtuvo en PharMingen (San Diego, CA) y el pVL1392 en InVitrogen.

Transfección tau. El gen de htau23, la isoforma tau más corta en el hombre [27] se escindió del vector de expresión bacteriano pNG2 [28] con Xbal y BamHI, y se insertó en el vector de transferencia baculovirus pVL1392 cortado con las mismas endonucleasas de restricción. El sistema BaculoGold se usó para construir el vector que contiene el baculovirus tau. El BaculoGold DNA es un tipo de baculovirus modificado que contiene una supresión letal. La transfección simultánea del BaculoGold DNA con un vector de transferencia baculovirus complementario rescató la supresión letal de este virus de ADN y reconstituyó partículas viables del mismo que transportaban la secuencia de codificación htau23. El plásmido de ADN usado para la transfección se purificó usando cartuchos QIAGEN (Hilden, Alernania). Las células Sf9 crecidas en monocapas (2x10^{6} células en una placa de cultivo celular de 60 mm) se transfectaron simultáneamente con el baculovirus de ADN (0,5 \mug de BaculoGold ADN) y con derivados del vector de pVL1392 (2 \mug) usando el método de precipitación simultánea con fosfato cálcico. La presencia de la proteína recombinante se examinó en las células infectadas 5 días después de la infección mediante electroforesis en SDS-PAGE y transferencia Western.

Fosforilación tau en las células Sf9

Para determinar los efectos de los inhibidores de la cinasa sobre la fosforilación tau, las células Sf9 infectadas con baculovirus que expresan htau23 se trataron a las 36 h tras la infección con HD 50 \muM o flavopiridol durante 5 h antes de ser cosechadas. Para obtener las muestras tau de control con una fosforilación potenciada, las células Sf9 que expresan htau23 se trataron con ácido okadaico 0,2 \muM durante 5 h antes de la cosecha.

Transferencia Western tau

Las células Sf9 se infectaron con virus recombinante con un MOI de 1-5. Los lisados de células se prepararon en tampón de lisis hipotónico (HLB). Después de 15 minutos de centrifugación a 16.000 g, el sobrenadante se recuperó y su concentración de NaCI se aumentó hasta 500 mM. A continuación se hizo hervir durante 10 minutos y se volvió a centrifugar a 16.000 g durante 15 minutos. Las proteínas (3 \mug) se separaron por electroforesis en SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF y se efectuó la transferencia Western con los siguientes anticuerpos: AT-8 (1:2000), AT-180 (1:1000), AT-100 (1:500), PHF-1 (1:600) y el anticuerpo policlonal anti-tau K9JA.

La fosforilación tau in vitro se realizó usando GSK-3\beta purificada y tau-32 recombinante como sustrato. Después de una incubación de 30 minutos en presencia de varias concentraciones de HD, en las condiciones de determinación de GSK-38 descritas anteriormente, la reacción de la cinasa se detuvo añadiendo el tampón de muestra Laemmli. Las proteínas tau se separaron por electroforesis en SDS-PAGE y su nivel de fosforilación se visualizó por autorradiografía.

II/ Resultados \bullet Selectividad de himenialdisina en la inhibición de la cinasa

Las actividades enzimáticas se determinaron tal como se describe en la sección de Procedimientos experimentales, en presencia de concentraciones crecientes de HD. Las CI_{50} se calcularon a partir de las curvas de dosis-respuesta. -, sin efecto en la dosis más alta estudiada (entre paréntesis). Los resultados se muestran en la Tabla 1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

2

En presencia de ATP 15 \muM se encontró que HD inhibe CDK1/ciclina B, CDK2/ciclina A, CDK2/ciclina E, CDK3/ciclina E y CDK5/p35 con unas CI_{50} de 22, 70, 40, 100 y 28 nM, respectivamente (Tabla 1). Como se observa con olomoucina [29], roscovitina [15], indirrubina-3'-monoxima [30], kenpaulona [31] y, al contrario que flavopiridol [32], HD tuvo un efecto limitado sobre CDK4/ciclina D1 y CDK6/ciclina D2 (CI_{50} de 600 y 700 nM, respectivamente).

HD se probó a continuación en varias cinasas altamente purificadas (Tabla 1). Las actividades de la cinasa se estudiaron con los sustratos apropiados (histona H1, caseína, proteína básica de mielina, péptidos,... etc.), con ATP 15 \muM (concentración elegida por razones prácticas: comparación con artículos publicados previamente; la alta especificidad del ATP y en presencia de concentraciones crecientes de HD. Los valores de la CI_{50} también se presentan en la Tabla 1. La mayoría de las cinasas probadas se inhibieron mal o no se inhibieron (CI_{50} > l \muM). Sin embargo, dos cinasas, la cinasa sintasa de glucógeno-3\beta (GSK-3\beta) y cinasa caseína 1 (CK1) fueron muy sensibles a HD (CI_{50} de 10 y 35 nM, respectivamente).

\bullet Inhibición de CDK1/ciclina B por análogos de HD

La CDK1/ciclina B se estudió tal como se describe en la sección de Procedimientos experimentales en presencia de concentraciones crecientes de HD y sus análogos. La actividad se presenta como el % de la actividad máxima, es decir, medida en ausencia de inhibidores. Los resultados se muestran en la figura 2.

\bullet Determinación in vitro de las cinasas sensibles a HD con sustratos relevantes

Las cinasas sensibles a HD también se estudiaron in vitro con sustratos relevantes desde el punto de vista fisiológico: un fragmento de presenilina-2 [25] para cinasa caseína 1, Pak1 [17] para CDK5/p35, el sustrato IRS-1 del receptor de insulina [33] o tau para GSK-3\beta. Los resultados se muestran en las figuras 3-5.

La figura 3 muestra el efecto inhibidor de HD sobre la fosforilación de presenilina-2 mediante la cinasa caseína 1 in vitro. Una proteína de fusión expresada por bacterias entre presenilina-2 y la proteína de unión a maltosa (PS-2.MBP) se fosforiló in vitro con la cinasa caseína 1 en presencia de concentraciones crecientes de HD y se separó por electroforesis en SDS-PAGE, seguida por autorradiografía.

La figura 4 muestra el efecto inhibidor de HD en la fosforilación Pak1 por CDK5/p35 in vitro e in vivo. Las neuronas corticales de embriones de rata se expusieron a varias concentraciones de HD durante 1 h. A continuación se procedió a la precipitación inmune de Pak1 y se midió su actividad de cinasa hacia la histona H4. El panel superior muestra el nivel de fosforilación H4 después de la electroforesis en SDS-PAGE del sustrato. Los números corresponden a la cuantificación de la autorradiografía. Las transferencias Western muestran las cantidades de Pak1 (panel inferior) y de p35, con un aumento de las concentraciones de p35 como consecuencia de la inhibición de CDK5. La figura 5 muestra el efecto inhibidor de la fosforilación mediante la fosforilación tau por GSK-3\beta in vitro e in vivo.

La figura 5A muestra los resultados de los siguientes experimentos: la proteína tau recombinante humana expresada por bacterias fue fosforilada in vitro con GSK-3\beta en presencia de concentraciones crecientes de HD y se separó por electroforesis en SDS-PAGE, seguida por autorradiografía.

En los experimentos cuyos resultados se muestran en la figura 5B, las células Sf9 que expresan htau23 se dejaron sin tratamiento (-) o expuestas a ácido okadaico (OA), himenialdisina (HD) o fiavopiridol (FL) durante 5 h. Los lisados celulares (3 \mug de htau23) se separaron mediante electroforesis en SDS-PAGE, se tiñeron con azul de Coomassie o se procedió a la transferencia inmune con varios anticuerpos: K9JA (un pan-anticuerpo frente a tau) reconoce todos los preparados que contienen tau: AT8, AT180 y PHF1 son específicos de los diferentes motivos fosforilados de SP o TP; AT100 reconoce la tau fosforilada en T212 y S214, una reacción muy específica de la tau del Alzheimer.

La sensibilidad de las cinasas hacia HD se mantuvo bastante comparable a la sensibilidad de las mismas cinasas valoradas con sustratos más artificiales.

\bullet Inhibición de CDK1 CDK5 GSK-3\beta y CK1 mediante análogos de himenialdisina

Se probaron algunos compuestos naturales relacionados con la HD aislados a partir de esponjas marinas y algunos análogos de HD modificados sintéticamente sobre CDK1/ciclina B, CDK5/p35, GSK-3\beta y CK1. Los resultados se muestran en la figura 2 y en la Tabla 2. Los números se refieren a las estructuras que se muestran en la figura 1. Las actividades enzimáticas se estudiaron tal como se describe en la sección de Procedimientos experimentales, en presencia de concentraciones crecientes de HD. Las CI_{50} se calcularon a partir de las curvas de dosis-respuesta. Cuando no se observó ningún efecto inhibidor (-), se indica entre paréntesis la concentración más alta probada.

TABLA 2

4

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 HD seguía siendo el compuesto más activo. Es interesante que la
dibromocantarelina (10) mostró un efecto\cr  inhibidor significativo
hacia GSK-3 \beta  (CI _{50}  de 3  \mu M).
Himenidina (13) fue selectiva para
CDK5.\cr}

\bullet Himenialdisina es un ínhibídor competitivo de la unión de ATP

Para investigar el mecanismo de acción de la HD se realizaron experimentos cinéticos variando tanto los niveles de ATP como las concentraciones de HD (figura 6A). Se efectuó un trazado recíproco doble de los datos cinéticos de los análisis de la actividad de las cinasas proteína CDK1/ciclina B en diferentes concentraciones de himenialdisina. Las actividades enzimáticas se estudiaron tal como se describe en la sección de Procedimientos experimentales. Resultados que se muestran en la figura 6A: trazado primario de 1/v frente a 1/ATP. Las concentraciones de ATP en la mezcla de la reacción variaron desde 0,05 a 0,25 mM, la concentración de histona H1 se mantuvo constante en 0,7 mg/ml. El gráfico del recuadro muestra los nuevos trazados secundarios de las pendientes frente a la concentración de los trazados primarios. La constante de inhibición aparente (Ki) está indicada por la flecha. Resultados que se muestran en la figura 6B: himenialdisina no libera ciclina B a partir de CDK1. La CDK1/ciclina B inmovilizada en p9^{CKShs1}-sepharose se expuso a HD durante 30 minutos, se lavó y se analizó por transferencia Western con anticuerpos anticiclina B y anti-PSTAIRE.

Los datos demuestran que HD actúa como un inhibidor competitivo de ATP. La linealidad de los nuevos trazados de la pendiente frente a la concentración de HD cualifica a la HD como un inhibidor lineal (figura 6A, recuadro). La constante de inhibición aparente (Ki) fue de 50 nM. HD no actúa desplazando la ciclina B de la CDK1 (figura 6B): la CDK1/ciclina B inmovilizada sobre p^{CKSns1}-sepharose se expuso a concentraciones altas de HD; las cuentas se lavaron exhaustivamente antes del análisis por transferencia Western. Ambas subunidades aún eran detectables juntas.

\bullet Estructura cristalina del complejo CDK2/Himenialdisina

La estructura de un cristal de CDK2 sumergido en HD se determinó y refinó con una resolución de 2,1 \ring{A}. El tratamiento con un agente reticulante antes de la inmersión fue necesario para prevenir que el cristal se agrietase. Los detalles de determinación de la estructura se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3

5

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 * \+ R _{sym}  =  \Sigma I I(h)-< 1(h)>
1/ \Sigma  I(h), con I(h), intensidad observada y
<I(h)  intensidad media de la reflexión\cr  \+ h en todas
las mediciones de I(h).\cr  ** \+ R _{factor}  =
 \Sigma F _{0}  - F _{c}  1/ \Sigma  (F _{0} ), tomándose las sumas
a lo largo de todas las reflexiones con un punto de corte\cr  \+
F/ \sigma (F)> 1.\cr   \ding{61}  \+ R _{libre}  =
R _{factor}  para el 10% de los datos, que no se incluyeron durante
el refinamiento cristalográfico.\cr  # \+ Valores B = Media de los
valores B para todos los átomos distintos de
hidrógeno.\cr}

El modelo final consiste en 274 residuos de aminoácidos, una HD ligada, 85 moléculas de disolvente y cuatro moléculas de etilenglicol, con un factor R cristalográfico de 19,2% (R_{libre} del 26,7%) y una buena geometría. Los residuos 36-44 y 149-163 de CDK2, que forman parte de dos bucles altamente flexibles, se dejaron fuera del modelo final debido a su densidad de electrones débil o nula. Todos los residuos no glicina del modelo de CDK2 tienen unos ángulos de torsión de la cadena principal que quedan dentro de las regiones energéticamente favorables del trazado de Ramachandran [26], excepto en el caso de dos residuos, Glu-73 y Arg-126, que tienen conformaciones de su esqueleto que quedan inmediatamente fuera de la región "adicional permitida" en el espacio \phi -\psi.

En la figura 7 se muestra una visión en tres dimensiones de la densidad de electrones de HD. La HD podría localizarse sin dudas en un mapa de diferencias de Fourier, lo que confirma que este inhibidor también se une en el bolsillo de unión del ATP (figura 7A). En las figuras 7B y 8 se muestra una representación esquemática de las interacciones que se producen en el locus de unión.

La figura 7A es un diagrama en tres dimensiones que muestra la estructura refinada de HD en el bolsillo de unión del ATP de CDK2. Los enlaces hidrógeno deducidos se muestran como líneas finas de puntos.

La figura 7B es una ilustración esquemática de las interacciones entre CDK2 y HD. Los contactos de la cadena lateral de la proteína están indicados por las líneas que unen con el cuadro de residuos respectivos, mientras que las interacciones con los átomos de la cadena principal se muestran como líneas hacia el átomo específico de la cadena principal. Los contactos de Van der Waals están indicados por líneas de puntos y los enlaces de hidrógeno por líneas discontinuas.

El sistema pirroloazepina de doble anillo de la HD llena un bolsillo hidrofóbico superficial formado por Ile-10, Val-18, Ala-31, Val-64, Phe-80, y Leu-134, estableciendo varios contactos de Van der Waals con los átomos de la cadena lateral en estos residuos. Además, se forman tres enlaces hidrógeno con el esqueleto de CDK2, entre el átomo N1 del anillo pirrol y el oxígeno carbonilo de Leu-83, entre el oxígeno carbonilo O1 del anillo azepina y la amida del esqueleto de Leu-83, y entre la amida N2 del anillo azepina y el oxígeno carbonilo de Glu-81. El átomo de bromo unido al anillo pirrolo de HD señala hacia el exterior del bolsillo de unión del ATP, donde está parcialmente expuesto al disolvente pero también se envuelve frente a los oxígenos carbonilo de la cadena principal de Ile-10 e Hís-84, y las cadenas laterales de He-10 y Leu-134. La unión del sistema de anillo guanidina de la HD implica algunos contactos de Van der Waals, principalmente con la cadena lateral de Val-18, además de un enlace de directo de hidrógeno y dos mediados por agua. El enlace directo de hidrógeno se forma entre el grupo amino N5 de la guanidina y un oxígeno de la cadena lateral de Asp-145. Los dos enlaces hidrógeno mediados por agua se encuentran entre el O2 de HD y la cadena principal NH de Asp-145, y entre el N5 de HD y el carbonilo de la cadena principal de Gin-131. La comparación con las estructuras de la apo-CDK2 y CDK2/ATP revela un gran movimiento de Asp-145 cuando se une a HD, constituye en una desviación de 1 \ring{A} del átomo de C\alpha, y una rotación de la cadena lateral de aproximadamente 90° alrededor del enlace de C\alpha-C\beta lejos del anillo guanidina de la HD. Todos los demás residuos que entran en contacto con el inhibidor tienen conformaciones muy similares a las observadas en las estructuras apo-CDK2 y CDK2/ATP.

\bullet Comparación de CDK2/Himenialdisina con otros complejos CDK2/inhibidor

Para proporcionar una base estructural para entender la potencia de la HD, la estructura del complejo CDK2/HD se comparó con las estructuras de CDK2 que ha formado el complejo con ATP, estaurosporina, flavopiridol y con los análogos de purina olomoucina, roscovitina y purvalanol, así como con la estructura del complejo ciclina A/CDK2/ATP. Las visiones en tres dimensiones que muestran esta comparación se muestran en la figura 9.

La figura 9A muestra la superposición HD (enlaces negros) en el ATP (enlaces blancos) en la apo-CDK2 y en el ATP (enlaces amarillos) en la ciclina A-CDK2.

La figura 9B muestra la superposición de HD en olomoucina (blanco) y purvalanol.

La figura 9C muestra la superposición de HD en flavopíridol. Los átomos del esqueleto de CDK2 de los residuos 81-84, y la cadena lateral de Asp-145 en el complejo CDK2/HD se muestran en la representación de bolas y varillas con los enlaces negros. Los mismos residuos del complejo superpuesto CDK2-ligando se muestran como enlaces. En A), los enlaces finos se refieren a la apoenzima y los enlaces gruesos a los dímeros de ciclina A-CDK2.

El sistema de doble anillo hidrofóbico de HD se une aproximadamente en la misma posición en CDK2 que el anillo purina de ATP en el complejo CDK2/ATP, similar a las posiciones de los sistemas de doble anillo en los otros complejos CDK2/inhibidor (figura 9). Aunque la orientación de los distintos sistemas de doble anillo varía significativamente entre los diferentes inhibidores, está limitada por la necesidad de proporcionar la forma óptima complementaria al bolsillo de unión superficial de ATP-purina mientras que se permite la formación de varios enlaces hidrógeno con el esqueleto de los residuos 81-83 en la conexión cruzada en CDK2. Las interacciones de unión al hidrógeno en el complejo CDK2/HD parecen ser las más favorables entre todos los complejos CDK2/inhibidor estudiados hasta la fecha. Los enlaces hidrógeno entre N2 y el oxígeno del péptido de Glu-81, y entre O1 y la amida del péptido de Leu-83 se parecen estrechamente a los que se encuentran entre la base de adenina de ATP y la CDK2 y los que hay en los complejos CDK2/inhibidor con estaurosporina y flavopiridol. El tercer enlace hidrógeno en el complejo CDK2/HD con el carbonilo de la cadena principal de Leu-83 está ausente en estos complejos y se puede observar únicamente en los complejos con los tres inhibidores con base de purina olomoucina, roscovitina y purvalanol. Como la HD, estos tres últimos inhibidores también forman tres enlaces hidrógeno con la conexión cruzada pero su interacción con el oxígeno del péptido Glu-81 es mucho más débil, lo que implica un extraño enlace hidrógeno C-H- - -O con el átomo ácido de C8 del anillo purina.

El átomo de bromo de HD se une cerca de una región en CDK2 que en los otros complejos CDK2/inhibidor está ocupada por un grupo bencilo. La unión de un grupo hidrofóbico en esta región, donde se puede envolver frente a las cadenas laterales de Ile-10, Phe-82 y el esqueleto de los residuos 82-84, es importante para aumentar la especificidad de los inhibidores de CDK2. Aunque el bromo de HD no puede proporcionar el mismo número de interacciones que el anillo bencilo, es probable que la presencia de este átomo en la HD contribuya significativamente a su afinidad y especificidad de unión hacia la CDK2, como se puede ver a partir de las actividades inhibidoras de varios análogos de HD en la Tabla 2 y en la figura 2.

También es interesante la región de la CDK2 ocupada por el anillo guanidina de la HD. Una superposición con los otros complejos CDK2/inhibidor muestra que sólo los inhibidores de flavopiridol y estaurosporina tienen grupos unidos en esta región de la CDK2, que en parte se superpone con el bolsillo en el que se une el \alpha-fosfato del ATP. La comparación de la estructura del complejo CDK2/HD con la del complejo de CDK2/flavopiridol [34] revela un número de similitudes llamativas entre los modos de unión de estos inhibidores estructuralmente diversos. El oxígeno carbonilo O2 de HD se localiza cerca de la posición del grupo hidroxilo O7 del flavopiridol, que deriva del anillo benzopirano unido en el bolsillo de unión de ATP-purina. En ambos inhibidores los átomos de oxígeno construyen un enlace hidrógeno mediado por agua con la amida de la cadena principal de Asp-145. Además, el grupo amino N5 en el anillo guanidina de HD se localiza cerca de la posición del grupo amino de carga positiva del anillo piperidinilo en el complejo CDK2/flavopiridol. Ambos átomos se encuentran a una distancia del enlace hidrógeno con el carboxilato de la cadena lateral de Asp-145. La interacción energéticamente favorable entre el grupo amino de carga positiva del flavopiridol y el carboxilato de carga negativa de Asp-145 tendría una contribución importante a la fuerza de unión de este inhibidor con la CDK2. Parece posible una interacción similar en el complejo CDK2/HD, como sucede en las condiciones fisiológicas en las que es probable que el anillo guanidina esté protonado, al menos en parte, en N3, lo que aporta una carga positiva (parcial) deslocalizada entre N3, C11, N4 y N5. También se conserva el movimiento de Asp-145 en ambos complejos CDK2/inhibidor. También se ve en la estructura indirrubina-5-sulfonato/CDK2. Asp-145 forma parte del motivo DFG conservado que se encuentra en la mayoría de las cinasas proteína. Aunque significativamente diferentes de las del complejo CDK2/ATP, la posición y conformación de Asp-145 en ambos complejos CDK2/inhibidor son, en realidad, muy similares a las del complejo ciclina A/CDK2/ATP, funcionalmente más relevante (figura 9A).

\bullet Inhibición de la fosforilación de presenilina in vitro

También se investigaron los efectos de HD en la fosforilación in vitro e in vivo de varios sustratos proteicos relevantes para la enfermedad de Alzheimer. El gran bucle hidrofílico de presenilina-2 entre los dominios de transmembrana 6 y 7 es un sustrato para ambas cinasas caseína 1 y 2 in vitro; este dominio se fosforila in vivo [25]. Usando una proteína de fusión presenilina-2-MBP como sustrato in vitro para CK1 se observó una inhibición dependiente de la dosis de la fosforilación de presenilina-2 mediante HD (figura 3). La MBP sola no se fosforila por CK1.

\bullet Inhibición in vitro e in vivo de la fosforilación Pak1 por CDK5/p35 neurona

Entre los sustratos fisiológicos de CDK5/p35 se encuentra la cinasa neuronal Pak1 [17]. Tanto Pak1 como p35 se asocian a la Rac, una pequeña GTPasa de la familia Rho. La fosforilación de Pak1 mediante CDK5/p35 da lugar a una inhibición de la actividad de cinasa de Pak1. Roscovitina inhibe la CDK5/p35 y la regulación negativa resultante de Pak1 tanto in vitro como in vivo. Estos experimentos se repitieron con HD (figura 4). Primero se procedió a la precipitación inmune de CDK5/p35 a partir de las cortezas de rata P02 y su actividad de cinasa hacia GST-Pak1 K299 (mutante Pak1 muerto por cinasa) en presencia de HD, roscovitina o DMSO se determinó como [17]. Se observó una inhibición dependiente de la dosis de CDK5 mediante HD (CI_{50} entre 10 y 100 nM) (figura 4A). A continuación se realizaron experimentos ín vivo usando neuronas cultivadas obtenidas a partir de cortezas de embriones de rata E18 (figura 4B). La HD se añadió cuando los cultivos tenían una antigüedad de 4 días y se dejó sobre las células durante 1 hora. El DMSO se usó como control. Las células se lisaron a continuación sobre hielo en tampón STM y la fracción de membrana aislada [17]. A continuación se procedió a la precipitación inmune de Pak1 y se analizó usando histona H4. La cantidad de fosforilación de H4, mediada por la intensidad de las bandas en la película de la autorradiografía, se cuantificó con el programa de adquisición de imágenes NIH. Como controles de la carga se realizaron las transferencias Western anti-Pak1 y anti-p35. Tal como se ha demostrado previamente [35], aumenta la cantidad de p35 con el alcance de inhibición de la cinasa CDK5/p35. Se observó un incremento de la actividad de Pak1, compatible con una inhibición de la actividad de CDK5 endógena (figura 4B).

\bullet HD inhibe la fosforilación MAP-1B por GSK-3 en neuronas granulares cerebelosas

GSK-3\beta se inhibe tanto por WNT-7a como por litio en las neuronas celulares granulares cerebelosas [49,50]. WNT-7a y litio inducen el remodelado axonal y la pérdida de una forma fosforilada de MAP-1 B, una proteína asociada al microtúbulo implicada en el crecimiento exocéntrico axonal. Como la GSK-3\beta fosforila la MAP-1 B en un lugar reconocido por el anticuerpo SM 1-31, la inhibición de GSK-3R mediante WNT o litio da lugar a la pérdida de una MAP-1 B o MAP-1 B-P fosforilada. Para examinar el efecto de HD en la morfología neuronal y en la fosforilación MAP-1B las células granulares cerebelosas se cultivaron con distintas concentraciones de HD.

Los resultados se muestran en la figura 10. La tinción doble por inmunofluorescencia para GAP-43 y MAP-1B-P muestra que MAP-1B-P se encuentra a lo largo del axón (A y B). El tratamiento durante 20 h con HD 10 \muM no tiene un efecto evidente sobre la morfología celular (C) o la MAP-1B-P (D). Las flechas indican las mismas células. El tratamiento con HD 50 \muM induce la diseminación axonal, el acortamiento del axón (E) y la pérdida de la MAP-1B-P de los procesos axonales (F). Las flechas indican las mismas células. El tratamiento con HD 100 \muM provoca un cambio más espectacular en la morfología celular con la diseminación y ramificación a lo largo del axón, un número aumentado de filopodia y el acortamiento del axón (G). La MAP-1B-P se pierde de la mayoría de los procesos axonales (H). Las flechas indican los axones en los que se pierde la MAP-1B-P. Barra = 20 \muM.

El análisis de transferencia Western de los lisados celulares muestra un descenso gradual de la MAP-1B-P en respuesta a las dosis crecientes de HD (I).

En las células control con procesos largos y muy poca filopodia (figura 10A), la MAP-1B-P se encuentra a lo largo de todo el axón (figura 10B). Con concentraciones bajas (1 \muM, 10 \muM, 25 \muM) no tuvo ningún efecto notable sobre la morfología de las células (figura 10C) o la distribución de la MAP-1B-P (figura 10D). Sin embargo, el tratamiento con HD 50 \muM indujo la diseminación y ramificación axonal y el acortamiento de la longitud del axón (figura 10E), con la pérdida concomitante de la MAP-1B-P de la mayoría de los procesos axonales (figura 10F). El tratamiento de los cultivos con HD 100 \muM provocó un cambio más espectacular en la morfología celular caracterizada por una ramificación y diseminación más extensas, y se observó el acortamiento de la longitud del axón y un aumento del número de filopodia (figura 10G), junto a la pérdida de la MAP-1B-P de los procesos (figura 10H). El remodelado axonal observado se asoció a la pérdida de microtúbulos estables en las áreas diseminadas de los axones. La HD induce la pérdida de la MAP-1B-P de forma dependiente de la dosis según se determina por la transferencia Western (figura 10I). Este efecto es similar al observado durante el tratamiento con litio o con WNT-7a [37]. Como se demostró que HD inhibía la GSK-3\beta directamente, dichos resultados indican que la pérdida de la MAP-1B-P y el remodelado axonal inducido por la HD es consecuencia de la inhibición de la GSK-3\beta en las neuronas cultivadas.

\bullet Inhibición de fosforilación tau por GSK-3 in vivo e in vitro

La proteína tau de unión a microtúbulos es el sustrato de varias cinasas, como la GSK-3\beta y la CDK5/p35. La proteína tau recombinante humana expresada por bacterias se fosforiló en realidad in vitro mediante GSK-3\beta y esta fosforilación se inhibió de forma dependiente de la dosis mediante HD, con una CI_{50} alrededor de 33 nM (figura 5A). A continuación se investigó el efecto de HD sobre la fosforilación ir, vivo de la proteína tau23 humana expresada en las células Sf9 (figura 5B). Las células se dejaron sin tratamiento (-) o se expusieron a ácido okadaico 0,2 \muM (OA), HD 50 \muM o flavopiridol 50 \muM (FL), un inhibidor de la CDK que también inhibe la GSK30. La Htau23 se separó por electroforesis en SDS-PAGE seguida por la inmunotransferencia con varios anticuerpos. K9JA (un pananticuerpo frente a tau) reconoce todos los preparados que contienen tau. AT8, AT180 y PHF1 son específicos de diferentes motivos SP o TP fosforilados, respectivamente Ser202 y Thr205, Thr231 y Ser235 y Ser396 y Ser404 (corno se numeran en htau40, la isoforma tau humana de mayor longitud). La AT100 reconoce la tau fosforilada en T212 y S214; esta reacción es altamente específica de la proteína tau del Alzheimer pero también se produce en las células Sf9, siempre que ambos loci estén fosforilados. La desaparición de la señal AT100 después del tratamiento con HD o flavopiridol indica que ambos cornpuestos son capaces de inhibir la actividad de tipo GSK-3\beta en las células Sf9.

III/ Fabricación de inhibidores de CDK1,2,5, GSK-3\beta y cinasa caseína - Formulación líquida

Se prepara una suspensión o solución de HD añadiendo 100 a 1000 mg de HD a un vehículo líquido, como etanol, glicerina, un disolvente no acuoso como polietilenglicol, aceites o agua con un agente suspensor, un conservante, un saborizante o un colorante, ajustándose la cantidad del vehículo líquido para obtener la concentración requerida del principio activo.

- Comprimido

El derivado 2 bromo HD se incorpora a un vehículo, como estearato de magnesio, almidón, lactosa, sacarosa o celulosa, y se comprime.

Las cantidades respectivas se eligen dependiendo de la concentración deseada del principio activo.

IV/ Estudio de los efectos celulares de HD Métodos Despistaje in vitro orientado a la enfermedad NCI

Se cultivaron sesenta líneas celulares tumorales humanas con 9 tipos tumorales (Boyd y Paull, 1995) durante 24 h antes de una exposición continua de 48 h a roscovitina 0,01-100 \muM. Para estimar la citotoxicidad se utilizó una determinación de la proteína sulforrodaminina B.

Captación de timidina. Las células HT29-18-C1 se cultivaron en una placa de 24 pocillos con una densidad celular de 2.105 células/500 \mul de medio/pocillo. Las células subconfluentes se aclararon y colocaron en medio libre de suero durante 48 h para su deprivación y sincronización. La interrupción de la parada del crecimiento se efectuó por adición de suero al 5% en presencia de HD. A continuación se añadieron 2 \muCi de metil-3H timidina (actividad específica: 50 Ci/mMol) (ICN Biornedical) a cada pocillo durante las últimas 4 h de un periodo de tratamiento de 24 h. Las células se lavaron a continuación con PBS y se trataron con ácido tricloroacético frío al 5% durante 45 minutos a 4°C. Las células se aclararon con agua y se solubilizaron con NaOH 0,3 M durante 1 h a 37°C. La radiactividad se midió con un contador beta Beckman. Cultivo celular y tratamientos. HT29-18-C1, un subclon de la línea celular de adenocarcinoma de colon humano HT29 se cultivó en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (Gibco-BRL) suplementado con FCS al 10%, L-glutamina 2 mM (Eurobio) y 50 mg/ml de gentamicina (Gibco-BRL) a 37°C, con CO_{2} al 10%. Las células se sincronizaron mediante la deprivación de suero durante 48 h. A continuación se interrumpió la parada de crecimiento mediante la adición de suero fetal bovino (FCS) al 5%. La HD, preparada en DMSO, se añadió inmediatamente al medio durante 24 h y con concentraciones finales entre 0 y 80 \muM. En algunos experimentos se añadió HD 22 h después de la adición de suero durante otro periodo adicional de 24 h. En otros experimentos se añadió HD a células no sincronizadas. Las células se lavaron a continuación y se cultivaron en un medio con FCS al 5% y se contaron o analizaron mediante FACS en distintos tiempos.

Recuentos celulares y citometría de flujo del ciclo celular. Las células se contaron con un hemocitómetro. La distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo. Las células adherentes (1.10^{6}) se trataron con tripsina y se fijaron en etanol en frío al 70% durante 4 h. Las células fijadas se lavaron con PBS, se incubaron con 5 \mug de RNAsa A (Sigma Chemicals) por ml y se tiñeron con 25 \mug/ml de yodo propidio (Aldrich) durante 1 h a 37°C. Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo FACScan usando el programa cellFit Software (Becton Dickinson Immunocytometry Systems).

Resultados Efectos celulares de himenialdisina: inhibición de la proliferación

Se estudió el efecto de HD (0,01-100 \muM; exposición de 48 h) en un despistaje in vitro orientado a la enfermedad NCI, es decir, con 60 líneas celulares tumorales humanas con 9 tipos tumorales (leucemia, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de colon, cáncer del sistema nervioso central, melanoma, cáncer de ovario, cáncer renal, cáncer de próstata y cáncer de mama). Todas las líneas mostraron una sensibilidad similar a la HD. La CI_{50} media fue de 15,1 \muM (roscovitina: 16 \muM (Meijer y cols., 1997); olomoucina: 60,3 \muM (Abraham y cols., 1995)). No se observó correlación entre la sensibilidad de las líneas celulares a roscovitina y la presencia de p53 de tipo salvaje o mutado.

Propiedades de las células

Inhibidor de la proliferación celular

6

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Efectos celulares de himenialdisina: parada en fase S y en la transición G2/M Himenialdisina inhibe el crecimiento de HT29-18-CI

Las células HT29-18-CI se sincronizaron en GI mediante deprivación de suero. Se añadió FCS al 5% en el tiempo 0 y las células se trataron simultáneamente (o) o no (o) con la exposición a HD 10 \muM durante 24 h y después se cultivaron en medio con FCS al 5%. El número de células se determinó cada 12 h durante un periodo de 72 h utilizando un hemocitómetro. La cinética de la inhibición del crecimiento se muestra en la figura 9A. El tratamiento con HD dio lugar a una importante inhibición del crecimiento, tal como se ve por la reducción del incremento del número celular en el periodo de 72 h comparado con los controles. Las células tratadas con suero (tiempo 0) se expusieron a concentraciones diferentes de HD y se contaron después de 24 h. Los resultados se muestran en la figura 9B. El número de células no estimuladas con suero (*) se indica como comparación. El efecto inhibidor dependió de la dosis de HD, con una CI_{50} de 5 \muM (figura 9B). La exclusión con colorante azul de tripano indicó una escasa toxicidad asociada con HD en concentraciones de 10 \muM y 80 \muM en 24 h (viabilidad > 95% y 90%, respectivamente). Este efecto antiproliferativo de HD parece ser reversible. De hecho, las células comenzaron lentamente a proliferar de nuevo después de 72 h de cultivo.

Himenialdisina causa la parada en fase S

Los resultados sobre la distribución del ciclo celular de las células tratadas con HD se muestran en la figura 10A. Las células HT29-18-C1 se mantuvieron con ayuno de suero durante 48 h; se añadió suero al 5% a continuación (tiempo 0) y las células se trataron simultáneamente o no con HD 5 \muM o 40 \muM durante las siguientes 24 h. Las células se fijaron a continuación y su estado de fase de ciclo celular se determinó por análisis FACscan según se describe en la sección de Procedimientos experimentales. Los números indican el % de células que se encuentran en las distintas fases del ciclo celular. La figura 10B muestra la cinética de acumulación en fase S de las células tratadas con HD. El suero se añadió en el tiempo 0 a las células HT29-18-C1 con ayuno de suero que simultáneamente recibieron tratamiento o no con HD 10 \muM durante las siguientes 24 h. La distribución del ciclo celular se analizó cada 24 h durante un periodo de 72 h.

Un análisis más breve de las células activadas por fluorescencia (FACs) reveló que el tratamiento con HD provoca la acumulación de células en fase S en relación con las células no tratadas. En ausencia de HD las células estimuladas con suero proceden rápidamente a entrar en la fase G2/M (figura 10A). Por el contrario, las células tratadas con HD no continúan hacia la fase G2/M después de la estimulación con suero, sino que se mantienen paradas en la fase S.

El efecto de HD en la distribución del ciclo celular del cultivo de HT29-18-C1 se investigó también a lo largo del tiempo (figura 10B). Las células sincronizadas se introdujeron en un medio con FCS al 5% en presencia o ausencia de HD 10 \muM durante 24 h. Las células se cultivaron a continuación en un medio con FCS al 5% durante otras 48 h. Coincidiendo con los recuentos celulares, se observó que la HD inhibe la proliferación celular a lo largo de 72 h de cultivo celular con una acumulación de células en fase S (figura 10B).

Himenialdisina provoca una parada en G2/M

En otro tipo de experimentos, las células HT29-18-C1 se mantuvieron con ayuno de suero durante 48 h. Se añadió suero al 5% en el tiempo 0 y HD 10 \muM 22 h más tarde. La distribución del ciclo celular se determinó 14 h después, es decir, 36 h después de la estimulación con suero, mediante análisis FACscan tal como se describe en la sección de Procedimientos experimentales. En este caso, las células tenían una posibilidad de entrar en la fase S y el tratamiento con HD provocó la acumulación de células en fase G2/M (figura 11).

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Claims (7)

1. El uso de himenialdisina o sus derivados de la fórmula 1

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en la cual R1 y R2, idénticos o diferentes, representan H o Br, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en la fabricación de un medicamento para usar en las enfermedades neurodegenerativas que implican la desregulación de las cinasas dependientes de ciclina, GSK-3\beta y cinasa caseína 1.

2. El uso según la reivindicación 1, en el cual el compuesto es 4-(2-amino-4-oxo-2-imidazolin-5-ilideno)-4,5,6,7-tetrahidropirrolo(2,3-c)azepin-8-ona, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

3. El uso según la reivindicación 1, en el cual el compuesto es 4-(2-amino-4-oxo-2-imidazolin-5-ilideno)-2-bromo-4,5,6,7-tetrahidropirrolo(2,3-c)azepin-8-ona, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la prevención y el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas.

5. El uso según la reivindicación 4, para la prevención y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

6. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual dichos medicamentos se preparan para una administración por vía oral.

7. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual dichos medicamentos se preparan para una administración por una vía inyectable.