ES2214136A1 - Nuevo metodo de inmovilizacion de enzimas y otras bio-macromoleculas sobre soportes activados con grupos epoxido conteniendo grupos ionizados en el brazo espaciador que une cada grupo epoxido a la superficie del soporte. - Google Patents
Nuevo metodo de inmovilizacion de enzimas y otras bio-macromoleculas sobre soportes activados con grupos epoxido conteniendo grupos ionizados en el brazo espaciador que une cada grupo epoxido a la superficie del soporte.Info
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Abstract
Nuevo método de inmovilización de enzimas y otras bio- macromoléculas sobre soportes activados con grupos epóxido conteniendo grupos ionizados en el brazo espaciador que une cada grupo epóxido a la superficie del soporte. El proceso de inmovilización de enzimas y proteínas sobre este tipo de soporte tiene lugar en dos etapas consecutivas: a.- una primera adsorción fónica muy rápida de la enzima sobre el soporte ionizado en condiciones experimentales muy suaves y b.- la inmovilización covalente multipuntual intensa entre la enzima previamente adsorbida y una muy alta densidad de grupos epóxido presentes en el soporte. Las principales características prácticas de este nuevo método de inmovilización son: la inmovilización muy rápida de grandes cantidades de enzima en condiciones experimentales muy suaves, la posibilidad de conseguir la estabilización de las enzimas inmovilizadas por inmovilización covalente multipuntual al soporte, la no utilización de ningún reactivo inestable ni tóxico durante o después de la inmovilización, etc.
Description
Nuevo método de inmovilización de enzimas y otras
bio-macromoléculas sobre soportes activados con
grupos epóxido conteniendo grupos ionizados en el brazo espaciador
que une cada grupo epóxido a la superficie del soporte.
La presente invención se refiere al área de la
inmovilización de enzimas industriales y otras biomacromoléculas
para su utilización como catalizadores o biosensores en áreas como
la química analítica, química fina, tecnología de alimentos,
química farmacéutica, etc. En particular, se refiere a la
utilización de nuevos soportes epóxidos en los que cada uno de
ellos tiene un brazo espaciador de carácter iónico para realizar
dichas inmovilizaciones, como una alternativa ventajosa con
respecto a los grupos epóxido monofuncionales convencionalmente
utilizados y a cualquier otro método de inmovilización.
Los soportes activados con grupos epóxido reúnen
una serie de características que los convierten en una de las
mejores opciones para la inmovilización industrial de enzimas.
Entre ellas, podemos destacar:
1.- Los soportes epóxido se activan durante el
proceso de preparación del sólido, de forma que llegan al cliente
listos para usar sin ningún tratamiento previo.
2.- Los grupos epóxido son muy estables a pH
neutro incluso en presencia de agua, por lo que pueden ser
producidos en una compañía muy alejada de la que finalmente los va
a utilizar, pueden almacenarse de forma sencilla, etc.
3.- Los grupos epóxido pueden reaccionar con
grupos amino, grupos tiol o grupos hidroxilo de la superficie de la
proteína, originando enlaces covalentes muy robustos (amino
secundario, tioeter o éter) sin necesidad de requerir una
estabilización posterior, e introduciendo una modificación química
mínima en la proteína.
4.- Tras los procesos de inmovilización, es muy
sencillo bloquear los grupos epóxido remanentes, evitando
reacciones incontroladas entre la proteína y el soporte y alterando
las propiedades físicas del soporte de la forma deseada.
Por otro lado, los grupos epóxido podrían ser muy
útiles para conseguir la estabilización de enzimas por unión
covalente multipuntual ya que:
.- Su estabilidad permite reacciones largas entre
la enzima ya inmovilizada y los grupos epóxido del soporte, incluso
a pH alcalino.
.- Pueden implicarse grupos de la superficie de
la proteína muy diferentes
.- No existen grandes impedimentos estéricos para
la reacción entre los grupos de la proteína y los grupos
epóxido.
.- Están separados por brazos de tamaño moderado
del soporte, de forma que son útiles para incrementar la rigidez de
las proteínas
Sin embargo, los grupos epóxido no son muy
reactivos con las proteínas. La inmovilización se efectúa en dos
etapas, una primera adsorción física "rápida" de la proteína
seguida por la unión covalente "intramolecular" entre la enzima
y los grupos epóxido del soporte.
Por ello, los soportes comerciales que se
utilizan para inmovilizar enzimas (p.ej. Eupergit, Sepabeads) son
de naturaleza moderadamente hidrofóbica y recomiendan la
inmovilización de las proteínas a elevada fuerza fónica para forzar
la adsorción hidrofóbica de las proteínas sobre el soporte, para a
continuación producirse la reacción covalente (ver figura 1). Este
tipo de inmovilización ha sido empleado con éxito en muchos casos,
pero presenta una serie de limitaciones:
.- No todas las proteínas pueden exponerse a
elevada fuerza iónica sin que se inactiven o precipiten.
.- El soporte debe de tener una naturaleza
hidrofóbica, y se ha descrito que esto puede tener efectos
inestabilizantes o inactivantes de las enzimas.
.- La enzima se orientará sobre el soporte por la
zona donde tenga más bolsillos hidrofóbicos, pudiendo ser ésta
adecuada o no para conseguir los mayores valores de actividad,
estabilidad, etc.
Una primera solución a este problema surgió con
el empleo de soportes epóxido-heterofuncionales,
en los que se modificaba una pequeña cantidad de grupos epóxido con
distintos grupos capaces de adsorber proteínas (etilendiamina,
iminodiacético,
m-amino-fenilborónico, quelatos
metálicos, etc). Aunque este tipo de soportes permitía inmovilizar
enzimas en distintas condiciones, no requería que el soporte fuera
hidrofóbico y permitía inmovilizar una enzima mediante diferentes
orientaciones, sin embargo, no permitía simultáneamente tener
elevada velocidad de adsorción y de unión covalente, ya que los
grupos adsorbentes se introducían destruyendo parte de los grupos
epóxido. Esto originaba que no se lograran velocidades grandes de
inmovilización, y que las posibilidades de la unión covalente
multipuntual se vieran disminuidas (figura 2).
La presente invención trata de encontrar
soluciones a las limitaciones de los métodos actualmente existentes
en el mercado o en la literatura científica para la utilización de
soportes activados con grupos epóxido, fundamentalmente en cuanto a
la limitación de las condiciones experimentales (ahora debe de
realizarse a alta fuerza fónica) y a la naturaleza del soporte
(ahora debe de ser de naturaleza hidrofóbica).
En esta patente reivindicamos el uso de un nuevo
tipo de grupos amino con un grupo epóxido sobre él como una mejor
opción para inmovilizar proteínas. De esta forma, no hay
competencia entre grupos adsorbentes y grupos para la unión
covalente y se puede maximizar ambas velocidades (figura 3). Además,
al éster todos los grupos epóxido sobre los grupos amino y a la
misma distancia del soporte, no habrá impedimentos para la unión
covalente multipuntual de la enzima sobre el soporte. Al ser una
interacción iónica, la adsorción se realizará a baja fuerza fónica,
siendo la presencia en la proteína de interés de zonas con carga
negativa en las condiciones de inmovilización la única restricción a
la posibilidad de uso de esta estrategia.
Finalmente, este tipo de grupos evita la
restricción en cuanto a la naturaleza del soporte, que puede ser
totalmente inerte. En cualquier caso, los soportes activados con
este tipo de grupos tendrán una superficie mucho más hidrofílica
por su propia naturaleza iónica. Además, la orientación de la
proteína con respecto al soporte podrá ser diferente a la
conseguida con los soportes hidrofóbicos convencionales, por lo que
la inmovilización de una enzima sobre ambos soportes podrá originar
derivados enzimáticos con diferente actividad y/o estabilidad.
Esto abre nuevas posibilidades de inmovilizar
enzimas industriales a soportes epóxido (uno de los más adecuados
para este fin como discutimos anteriormente).
Figura 4. Cinética de Inmovilización de
beta-galactosidasa de A.oryzae sobre
soportes epoxi-agarosa (A) y
amino-epoxi-agarosa (B) a diferentes
fuerzas iónicas. (rombos) sobrenadante de la suspensión de
inmovilización en fosfato de sodio 1M (círculos) sobrenadante de la
suspensión de inmovilización en fosfato de sodio 5 mM.
Inmovilizaciones fueron llevadas a cabo a pH 7 y 20°C.
Figura 5. Cursos de inmovilización de
Beta-galactosidas de A. niger sobre soportes
EC-EP- Sepabeads (A) y
EC-HFA-Sepabeads (B) a diferentes
fuerzas iónicas: (círculos) 5 mM (cuadrados) 50 mM (triángulos) 100
mM (rombos) 1000 mM de fosfato de sodio. La enzima se inmovilizó a
pH 7.0 y 20°C.
Figura 6. Estabilidad térmica de
Beta-galactosidasa de Thermus sp.
(triángulos) enzima soluble (cuadrados)
EC-EP3-Sepabeads (círculos)
Sepabeads EC-HFA. Cursos de inactivación de las
enzimas soluble e inmovilizadas se llevaron a cabo en Buffer novo a
pH 6,5 and 70°C.
Figura 7. Estabilidad térmica de Invertasa de
levadura (triángulos) Enzima soluble (cuadrados)
EC-EP3 Sepabeads (círculos)
EC-HFA2-Sepabeads. Cursos de
inactivación de las enzimas soluble e inmovilizada fueron llevados a
cabo en buffer acetato 50 mM, pH 5.5 y 55°C.
Figura 8. Cursos de inmovilización de lipasa de
Candida rugosa sobre soportes
EC-EP-Sepabeads (A) y
EC-HFA-Sepabeads (B). (cuadrados)
Actividad enzimática en la suspensión (círculos) Actividad
enzimática en el sobrenadante.
Figura 9. Cursos de inmovilización de
Glucoamilasa de A.niger sobre soportes
EC-EP-Sepabeads (A) y
EC-HFA-Sepabeads (B). (cuadrados)
Actividad enzimática en la suspensión (círculos) Actividad
enzimática en el sobrenadante.
Se prepararon soportes amino epóxido agarosa 6%
(6 BCL) por incubación de agarosa aminada (con 40 micromoles de
etilendiamina) con epiclorhidrina o con
1-4-butanodioldiglicidil-eter.
Estos soportes amino-epóxido se compararon en la
inmovilización de la beta-galactosidasa de
Aspergillus oryzae con soportes epóxido agarosa comerciales
(Figura 4). Mientras que los grupos epóxido monofuncionales no
inmovilizaban la beta-galactosidasa ni a alta ni a
baja fuerza iónica (la agarosa es inerte y no adsorbe la proteína),
por el contrario, la agarosa activada con grupos
amino-epóxido era capaz de inmovilizar la enzima a
pH 7, aumentando la velocidad de inmovilización cuando la fuerza
iónica descendía. Después de 24 h, lavados con alta fuerza iónica
de derivados de la enzima inmovilizada no liberaban enzima al
medio, mostrando que la enzima había sido unida covalentemente
al
soporte.
soporte.
La Figura 5 muestra como la enzima se inmoviliza
sobre soportes epóxido monofuncionales solo a elevada fuerza iónica
y de forma relativamente lenta. Además, la enzima se inactiva casi
totalmente al inmovilizarse.
Sin embargo, en los soportes activados con grupos
amino epóxido, la enzima se inmoviliza a baja fuerza iónica. De
hecho, la enzima resulta inmovilizada de forma muy rápida (en tan
solo unos pocos minutos), y mantiene intacta su actividad. Estos
derivados podían hidrolizar más del 99% de soluciones de lactosa al
5% a pH 4.5 y 30°C.
Nuevamente la enzima tan sólo se podía
inmovilizar sobre soportes monofuncionales a elevada fuerza fónica,
incluso a 1 M de fosfato sódico se inmovilizaba tan solo el 60% de
la enzima. Soportes activados con el nuevo grupo
amino-epóxido inmovilizaban el 100% en tan solo unos
minutos a 5 mM de fosfato sódico. La enzima inmovilizada sobre
ambas preparaciones mantenía el 100% de la actividad.
Tras bloquear los grupos epóxido remanentes por
incubación a pH 8.5 con 3 M de glicina, se comprobó que el derivado
realizado sobre los soportes amino epóxidos eran mucho más estables
que los realizados sobre los soporte epóxido monofuncionales
(Figura 6) aunque ambos eran más estables que la enzima soluble.
Así, en este ejemplo los nuevos grupos permiten
mayores rendimientos de inmovilización y estabilidad final del
derivado. Estos derivados podían hidrolizar más del 99% de
soluciones de lactosa al 5% a pH 5-7 a temperaturas
entre 30 y 80ºC.
Nuevamente, la enzima solo se inmovilizó solo
sobre soportes epóxido monofuncionales a elevada fuerza iónica (1 M
de fosfato sódico), alcanzando un rendimiento de inmovilización del
62% de la enzima ofrecida al soporte. Soportes activados con el
nuevo grupo amino-epóxido inmovilizaban el 100% de
la invertasa a tiempos cortos (menos de 1 hora) y a una
concentración de 5 mM de fosfato sódico.
Tras bloquear los grupos epóxido remanentes por
incubación a pH 8.5 con 3 M de glicina, se comprobó que el derivado
realizado sobre los soportes amino epóxidos eran mucho más estables
que los realizados sobre los soporte epóxido monofuncionales
\hbox{(Figura 7),} aunque ambos eran más estables que la
enzima soluble.
Así, en este ejemplo los nuevos grupos permiten
mayores rendimientos de inmovilización y estabilidad final del
derivado.
Estos derivados podían hidrolizar más del 99% de
soluciones de sacarosa al 50% a pH 5-7 a
temperatura entre 30 y 65ºC.
La lipasa de C.rugosa se inmovilizó sobre
soportes epóxido monofuncionales a elevada fuerza fónica (1 M de
fosfato sódico), alcanzando a 3 horas un rendimiento de
inmovilización del 90%. Sin embargo, se recuperó solo un 22% de la
actividad en la suspensión enzimática. Mientras que con soportes
activados con el nuevo grupo amino-epóxido se
inmovilizaba el 90% de la lipasa en un tiempo de 15 minutos, con
una recuperación del 75% de la actividad remanente en la suspensión
enzimática. (Figura 8).
La enzima se inmovilizó sobre soportes epóxido
monofuncionales a elevada fuerza iónica (1 M de fosfato sódico),
alcanzando un rendimiento de inmovilización del 85% de la enzima
ofrecida al soporte a las 24 horas. Soportes activados con el nuevo
grupo amino-epóxido inmovilizaban el 100% de la
glucoamilasa a tiempos cortos (menos de 1 hora) y a una
concentración de 5 mM de fosfato sódico. (Figura 9). Además, en
ambos casos la recuperación de actividad fue de alrededor del 80%
de la actividad inmovilizada en los soportes.
Estos derivados podían hidrolizar más del 99% de
soluciones de dextrinas o maltosa al 50% a pH 5-7 a
temperatura entre 30 y 65ºC.
Claims (10)
1. Un método de inmovilización de enzimas y otras
bio-macromoléculas sobre soportes activados con
grupos epóxido conteniendo grupos ionizados en el brazo espaciador
que une cada grupo epóxido a la superficie del soporte. Este proceso
de inmovilización esta caracterizado porque ocurre en dos
etapas secuenciales: una adsorción física muy rápida de la enzima
sobre el soporte ionizado y una posterior inmovilización covalente
entre la enzima adsorbida y los grupos epóxido del soporte.
2. Un método de inmovilización de enzimas y otras
bio-macromoléculas según reivindicación 1
caracterizado porque el soporte activado contiene uno o
varios grupos con carga positiva en el brazo espaciador que une cada
grupo epóxido a la superficie del soporte. Por ejemplo, grupos
aminos primarios, grupos amino secundario, grupos amino terciarios,
grupos amino cuaternario, grupos guanidino o cualquier otro grupo
funcional con características físicas similares.
3. Un método de inmovilización de enzimas y otras
bio-macromoléculas según reivindicación 2
caracterizado porque el soporte activado se prepara a partir
de soportes que contienen cualquier tipo de grupo funcional, cercano
a la superficie del soporte, que sea capaz de reaccionar con grupos
amino. Estos soportes se modifican inicialmente con una diamina
(p.e.etilendiamina) y posteriormente con butanodiol diglicidil
éter. Los grupos iniciales presentes en el soporte pueden ser
epóxidos, cianatos, imidocarbonatos, aldehídos, ésteres de
N-hidroxisucinimida o cualquier otro grupo funcional
con reactividad química similar.
4. Un método de inmovilización de enzimas y otras
bio-macromoléculas según reivindicación 1
caracterizado porque el soporte activado contiene uno o
varios grupos con carga negativa en el brazo espaciador que une cada
grupo epóxido a la superficie del soporte. Por ejemplo, grupos
carboxilo, grupos fosfato, grupos sulfato o cualquier otro grupo
funcional con propiedades físicas similares.
5. Un método de inmovilización de enzimas y otras
bio-macromoléculas según reivindicación 1
caracterizados porque los soportes utilizados son resinas
epoxi-acrílicas, geles de agarosa, vidrio poroso,
sílice porosa, celulosa o cualquier otro tipo de soporte útil para
la inmovilización de enzimas.
6. Un método de inmovilización de enzimas y otras
bio-macromoléculas según reivindicación 1
caracterizado porque la inmovilización se realiza a baja
fuerza iónica (entre 0 y 500 mM), a pH comprendido entre 3 y 11
(preferentemente a pH 7.0), a temperaturas comprendidas entre 4 y
80°C (dependiendo de la estabilidad térmica de la enzima a
inmovilizar) y durante un prolongado tiempo de inmovilización para
fomentar la unión covalente multipuntual entre la enzima adsorbida
y los grupos epóxido del soporte (por ejemplo entre 30 minutos a 7
días).
7. Un método de inmovilización de enzimas y
bio-macromoléculas según reivindicación 1
caracterizado porque el proceso de inmovilización se realiza
en presencia de polioles, detergentes, aditivos, inhibidores de las
enzimas, etc. con objeto de conservar la estabilidad de la enzima
soluble durante el proceso de inmovilización y evitar
simultáneamente fenómenos de agregación indeseables.
8. Un método de inmovilización de enzimas y otras
bio-macromoléculas según reivindicación 1
caracterizado por un tratamiento final físico o químico del
derivado inmovilizado con diferentes compuestos hidrofílicos
(etilendiamina, lisina, glicina, ácido aspártico,
polietrilendiamina, dextrano sulfato etc.) con objeto de modificar
la interacción enzima-soporte y de modificar el
micro-ambiente que rodea todas y cada una de las
moléculas de enzima inmovilizada.
9. Un método de inmovilización de enzimas y otras
bio-macromoléculas según reivindicación 1
caracterizado porque las enzimas inmovilizadas son la
beta-galactosidasa de Aspergillus oryzae, la
beta-galactosidasa de Thermus sp T2, la
invertasa de levadura de panadería, la glucoamilasa de
Asperigullus niger, la lipasa de Candida rugosa, la
lipasa de Candida antarctica (fracción B) y cualquier otra
proteína glicosilada o no glicosilada y que posea cualquier valor
de su punto iso-eléctrico.
10. Un método de inmovilización de enzimas y
otras bio-macromoléculas según reivindicación 1
caraterizado porque los derivados inmovilizados preparados
se pueden utilizar en cualquier proceso enzimático de interés
industrial.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| ES200300428A ES2214136B1 (es) | 2003-02-21 | 2003-02-21 | Nuevo metodo de inmovilizacion de enzimas y otras bio-macromoleculas sobre soportes activados con grupos epoxido conteniendo grupos ionizados en el brazo espaciador que une cada grupo epoxido a la superficie del soporte. |
| PCT/ES2004/070009 WO2004074471A1 (es) | 2003-02-21 | 2004-02-20 | Inmovilización de bio-macromoléculas sobre soportes activados con grupos epóxido. |
Applications Claiming Priority (1)
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| ES200300428A ES2214136B1 (es) | 2003-02-21 | 2003-02-21 | Nuevo metodo de inmovilizacion de enzimas y otras bio-macromoleculas sobre soportes activados con grupos epoxido conteniendo grupos ionizados en el brazo espaciador que une cada grupo epoxido a la superficie del soporte. |
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| ES2214136B1 ES2214136B1 (es) | 2007-05-16 |
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