JPS6225980A - 担体及び固定化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 常温、常圧の条件で種々の反応を触媒する酵素は微生物
中の酵素、あるいは抽出した酵素の形で利用されている
。

本発明は、この酵素を固定化して有効に利用するのに特
に有用な担体及びこれに酵素を固定化してなる固定化酵
素に関する。

（従来の技術） 酵素を利用した反応は常温常圧で反応が進行しその酵素
に特異的な基質のみとしか反応しないため種々の反応に
応用されているが、一般的に酵素は水可溶性であり一回
反応に利用したのち目的生成物からその酵素を取り除く
必要があり、その工程で酵素は失活してしまう。従って
、次に反応するときは新たに酵素を加えなければならな
い欠点を有している。

酵素を使い捨てではなく繰り返して有効に使用する方法
あるいは酵素反応を連続的に行う方法として種々の酵素
固定化方法が考案され例えば吸着法、担体結合法あるい
はゲル包括法によって酵素を水不溶性担体に吸着、共有
結合ないし包括させる方法等が知られている。

（発明が解決しようとする問題点） このうち酵素を水不溶性担体に吸着固定する吸着法によ
る場合は比較的弱い結合（水素結合、疎水結合、イオン
結合）によって保持されているため酵素の固定化あるい
は基質との反応に際しては高温、強酸、強アルカリなど
の処理は避けねばならない。

これらの方法により酵素を水不溶性担体に固定化した固
定化酵素は基質濃度やイオン強度に影響され、基質濃度
又はイオン強度が高くなると酵素が水不溶性担体がら脱
離しゃすくおのずと基質濃度又はイオン強度を高くでき
ず、また活性の持続が短かく安定性も低い欠点を有して
いる。又、これら欠点を補うためジアルデヒド等の蛋白
質架橋試薬により酵素を架橋処理することによって酵素
の脱離を防止しようとする試みがなされている（％開昭
５７−３６９８６）が、使用する試薬濃度が低すぎると
架橋が充分おこなわれないため酵素の脱離を防止し得す
、またその濃度が高いと酵素の失活が激しく架橋反応の
設定条件が難かしいという欠点を有する。又、吸着法及
び高分子担体の格子中に包括するゲル包括法は固定化の
際の失活は少なく初期の活性は高いが、その後のｐＨや
緩衝液等の外部環境によって酵素の脱離が多く安定性に
乏しいという欠点を有している。

を用いて水酸基を活性化後、酵素と反応させる方法等の
共有結合法がある。共有結合法は担体と酵素が共有結合
によって強く結合しているため高濃度の基質溶液及び塩
類溶液によって酵素が脱離することが少ないが、イオン
結合に比べて酵素を結合させる際の反応条件の設定が難
かしく操作も複雑であり、場合によっては酵素活性の低
下を来たすという欠点がある。

このように、従来公知の方法で得られる固定化酵素はそ
の製法の点で又はその使用上の点で欠点を有している。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、前記欠点を解決すべく鋭意研究を重ねた
結果、水不溶性の弱塩基性アニオン交換体のアニオン交
換基にエピノ・ロヒドリンを反応させてエポキシ基を導
入した後、酵素溶液を作用させるという簡単な操作によ
り得られる固定化酵素は、酵素と担体が強固に結合して
おり、高い基質濃度やイオン強度においても酵素が脱離
せず、その結果、酵素活性が長期間に亘って安定である
ことを見い出し本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、 １、水不溶性の弱塩基性アニオン交換体の交換基にエピ
ハロヒドリンを反応させることにより得られる担体。

２、水不溶性の弱塩基性アニオン交換体の交換基ニエピ
ハロヒドリンを反応させて得られる担体に酵素を固定化
してなる固定化酵素。

に関するものである。

本発明の担体及び固定化酵素は簡単に、例えば次のよう
にして製造することができる。

即ち、水不溶性の弱塩基性アニオン交換体にエピハロヒ
ドリンを水中に分散あるいは溶解した状態で又はアセト
ン、アルコール等の親水性溶媒あるいはこれと水の混合
液に溶解した状態で又はエーテル、トルエン等の溶媒に
溶解した状態で作用させるとエピノ・ロヒドリンが交換
基と反応しエポキシ基が弱塩基性アニオン交換体に導入
される。このようにして得られるエポキシ基を含有する
担体に酵素水溶液を作用させると容易に共有結合した固
定化酵素が得られる。

本発明に用いる水不溶性の弱塩基性アニオン交換体とし
ては種々のものが使用でき特に限定されない。例えば、
交換基として１級、２級又は３級アミン基を有する種々
のイオン交換体が使用できる。

これらの例としてはアミノ基；メチルアミノ基、エチル
アミノ基、ヒドロキシアルキルアミン基、アミノアルキ
ルアミノ基等の２級アミノ基；ジメチルアミノ基、ジエ
チルアミノ基、ビスヒドロキシエチルアミノ基等の３級
アミン基が挙げられる。

イオン交換体としては水不溶性の弱塩基性６一 アニオン交換体であれば種々の形体、用途、物質が使用
でき、例えば０）イオン交換樹脂、（２）イオン交換ゲ
ルクロマトグラフィ用樹脂、（３）イオン交換膜又はイ
オン交換繊維、（４）エマルジョン、（５）無機系担体
、（６）カチオン性天然多糖類等があげられる。

更に具体的には（］）イオン交換樹脂（弱塩基性アニオ
ン交換樹脂）としては、例えば商品名アンバーライトＩ
　ＲＡ−３５，−４，５，−６８゜−９３，−９４，−
９９（ロームアンドハース社製）、商品名ダウエックス
−６６、−ＷＧＲ−２（ダウケミカル社製）、商品名ダ
イヤイオンＷへ−１０、−１１，−２０，−２１，−３
０（三菱化成工業社製）等がある。

（２）イオン交換ゲルクロマトグラフィ用樹脂としては
ジエチルアミン基等のジアルキルアミノ基等を有するゲ
ルクロマトグラフィ用樹脂が挙げられ、例えば商品名Ｄ
ＥＡＥ　）ヨバール６’５０Ｍ　（東洋曹達社製）、商
品名ＤＥＡＥセファデックスＡ−２５，−５０，ＤＥＡ
Ｅ−セファローズＣＬ−６Ｂ、ＤＥＡＥ−セファセル（
ファルマシアファインケミカルズ社製）等がある。

（３）イオン交換膜又はイオン交換繊維としては弱塩基
性アニオン交換基を持つ膜であればいずれでもよく、例
えばＤ　Ｅ　Ａ、Ｅ−セルロースペーパー等がある。

（４）エマルジョンとしては、例えばジアルキルアミノ
アルキル（メタ）アクリレートを単独で、又はこれと共
重合可能なエチレン系不飽和単量体とを任意の割合で混
合しエマルジョン重合より得られた重合体等が挙げられ
、通常、水溶媒中でポリオキシエチレンアルキルフェニ
ルエーテル等の乳化剤存在下で通常のラジカル重合法よ
り得られ乳化剤は透析等の処理により除くことができる
。

（５）無機系担体としては多孔性ガラスあるいはシリカ
ゲル等があり、担体表面に例えば１級、２級又は３級ア
ミノ基を有するシランカップリング試薬を作用させるこ
とによりアミン基等の弱塩基性アニオン交換基を導入し
、弱塩基性担体としたもの等が挙げられる。

（６）カチオン性天然多糖類としては例えばキトサン等
が挙げられる。

本発明に用いるエピハロヒドリンとしては例えばエピク
ロルヒドリン、エピブロムヒドリン、エビヨードヒドリ
ンが挙げられ特に経済性からもエピクロルヒドリンが好
ましい。

エピハロヒドリンと弱塩基性アニオン交換体の交換基と
の反応は、単に弱塩基性アニオン交換体とエピハロヒド
リンを含む溶液又は分散液とを混合するだけでよい。反
応温度は特に限定されず、弱塩基性アニオン交換体がこ
われない温度ならかまわないが、特に０〜５０°Ｃが好
ましい。

弱塩基性アニオン交換体に反応させるエピハロヒドリン
は弱塩基性アニオン交換体のイオン交換容量（Ｍｅｑ／
ｍｌ）の０．２５当量以上反応させるのが好ましく、と
りわけ０．７５〜１．０当量が好ましいが、反応時にエ
ピノ・ロヒドリンは過剰量使用することができる。未反
９一 応のエピハロヒドリンは多量の水で充分洗浄することに
より除かれる。またメタノール、アセトン等の親水性溶
媒を用いてもよく親水性溶媒を用いた場合は少量の使用
でエビ・・ロヒドリンを除くことができ更に水洗するこ
とにより親水性溶媒も容易に除くことができる。

本発明の固定化酵素は例えばバッチ法あるいはカラム法
により下記の如く製造することができる。即ちバッチ法
による場合は、上記のようにしてエポキシ基が導入され
た弱塩基性アニオン交換体を水に懸濁又は浸して酵素溶
液を加え適当な温度例えば４〜５０℃にて数時間振とう
等によるかくはんをつづけ反応させることにより製造さ
れる。次いで適当な緩衝液（例えばリン酸緩衝液）にて
充分洗浄し未反応の不純蛋白や色素等を除去する。

更に濃厚塩類（例えば１モル食塩）を含有する緩衝液に
て数回振とう等による洗浄を繰り返してイオン結合等の
弱い結合で吸着されている酵素を除去し回定化酵素を精
製する。

またカラム法による場合は、エポキシ基が導入された弱
塩基性アニオン交換体を水に懸濁又は浸してカラムに詰
めこれに酵素溶液を適当な速さで流下させ、適当な温度
（例えば４〜５０°Ｃ）にて反応させることにより製造
される。次いで適当な緩衝液にて充分洗浄し、更に濃厚
塩類を含有する緩衝液をカラムの上部または下部より連
節させ固定化酵素を精製する。

精製された固定化酵素は酵素反応において酵素の脱離が
なく更に酵素活性も高く長期間の反応に耐え、また酵素
の脱離がないため酵素反応後の反応生成物の精製に際し
、除蛋白等の工程の必要がない等の特徴を有する。

本発明の固定化酵素において、酵素は特に制限されず種
々の酵素を用いることができる。

例えば、アミノアシラーゼ、プレオマイシン不活化酵素
、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、インベルターゼ、ウ
レアーゼ、ウロキナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ
、トリフシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、
ペニシリンアミダーゼ、リパーゼ、ホスファターゼのよ
うな加水分解酵素、グルコースオキシダーゼ、グルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ、カタラーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、グル
コン酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、フェニ
ルアラニンアンモニアアーゼ、グルタミン酸デカルボキ
シラーゼ、アスパルターゼのような脱離酵素、グルコー
スイソメラーゼ、グルタミン酸ラセマーゼのような異性
化酵素、クルタミン酸−ビルピン酸アミントランスフェ
ラーゼ、グルタミン酸−オキザロ酢酸アミントランスフ
ェラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、ピルビン酸キ
ナーゼ、クレアチンホスホキナーゼのような転移酵素を
あげる事ができる。

（実施例） 実施例１．１０ｍ１のアンバーライトＩＲＡ−６８（総
交換容量１．６Ｍｅｑ／ｍ１以上の弱塩基性陰イオン交
換樹脂、ロームアントノ・−ス社梨）を蒸留水で洗浄後
、１．５ｇのエピクロルヒドリンを２０ｍ１の含水メタ
ノール（メタノール：水＝１：１．以下含水メタノール
と略す）に溶解したものを加え３７℃で１５時間振とう
した。反応後の含水メタノール中にはガスクロマトグラ
フィーによる分析の結果エピクロルヒドリンは検出され
なかった。エポキシ化されたアンバーライトＩＲＡ−６
８に３０ｍ１のメタノールを加えよく振とうし３回繰り
返して洗浄した。次いで蒸留水で同様操作を５回繰り返
しメタノールを除去した。次に６００■のアミノアシラ
ーゼ（１８０００ｕ／ｇ天野渠薬社裂）を２０ｍ１のＭ
／１５１７ン酸緩衝液（ｐ）］＝７．２）に溶解したも
のをこれに加え、３７℃、４時間振とうし固定化アミノ
アシラーゼ剤を得た。

得られた固定化アミノアシラーゼ剤をカラムに詰め、５
０ｍ１のＭ／１５リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）を自然
流下させ未反応のアミノアシラ−ゼを除去した。更に５
０ｍ１の２ＭＮａＣｌを含有するＭ／１５１Ｊン酸緩衝
液を同様な操作で流出させイオン結合等で吸着されてい
る未反応アミノアシラーゼ及び色素等を除去し精製した
。

実施例２．１０ｍ１のダイヤイオｙ　ＷＡ　−３０（総
交換容量１．５　Ｍｅｑ／ｍ１以上のスチレン系弱塩基
性陰イオン交換樹脂、三菱化成工業社製）を蒸留水で洗
浄後、１．３８８ｇのエピクロルヒドリンを含水メタノ
ールに溶解したものを加え３７℃、１５時間振とうし実
施例〕と同様にして固定化アミノアミラーゼ剤を精製し
た。

実施例３．１．７ｇのＤＥＡＥセファデックス八−２へ
（総交換容量３．５　Ｍｅｑ　／　ｇ以上の弱塩基性陰
イオン交換担体ファルマシアファインケミカルズ社製）
を３０ｍ１のＭ／１５１Ｊン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）
に膨潤させ２．０ｇのエピブロムヒドリンを加え３７℃
、１５時間振とうし実施例１と同様にして固定化アミノ
アシラーゼ剤を精製した。

比較例１．１０ｍ１のアンバーライトＩＲＡ−６８を蒸
留水で洗浄後、６００■のアミノアシラーゼを２０ｍ１
のＭ／１５・リン酸緩衝液ＣｐＨ＝７．２）に溶解して
加え、３７℃、４時間振とうし実施例１と同様にして固
定化アミノアシラーゼ剤を精製した。

比較例２．１０ｍ１のダイヤイオンＷＡ−３０を蒸留水
で洗浄後、比較例１と同様にして固定化アミノアシラー
ゼ剤を精製した。

比較例３．１．７ｇのＤＥＡＥセファデックスＡ−２５
を３０ｍ１のＭ／１５リン酸緩衝液（ｐＩ−１＝　７．
２　）に膨潤させ比較例１と同様にして固定化アミノア
シラーゼ剤を精製した。

試験例１．　２ｍ＋の固定化アミノアシラーゼ剤を１０
ｍ１のキャップ付き試験管に採取し４　ｍｌの０．０５
モルのＮ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニン水溶液（
ｐＨ＝７．２．５×１０　モルＣｏ　　含有）を加え反
応温度３７℃、反応時間６０分にて振とうしながら酵素
反応をおこない、生成するＬ−フェニルアラニンを定量
し反応率を求めた。また固定化アミノアシラーゼ剤を繰
り返し用いて同じ反応を繰り返し行い、３回目、３０回
目、６０回目、９０回目における酵素活性を求めた。本
発明の固定化アミノアシラーゼ剤と従来の技術による固
定化アミノアシラーゼ剤の結果は下記の如くで試験例２
．２ｍｌの固定化アミノアシラーゼ剤を１０ｍ１のキャ
ップ付き試験管に採取し４　ｍｌの０．０５モルＮ−ア
セチル−ＤＬ−メチオニン水溶液ＣｐＨ＝７．２．５×
１０　モルＣｏ　含有）を加え反応温度３７°Ｃ１反応
時間６０分にて振とうしながら酵素反応をおこない、生
成するＬ−メチオニンを定量し反応率を求めた。

固定化アミノアシラーゼ剤を繰り返し用いて同じ反応を
繰り返し行い、３回目、３０回目、６０回目、９０回目
における酵素活性を求めた。本発明の固定化アミノアシ
ラーゼ剤と従来の技術による固定化アミノアシラーゼ剤
の結果は下記の如くであった。

試験例３．　２ｍｌの固定化アミノアシラーゼ剤を１０
ｍ１のキャップ付き試験管に採取し４　ｍｌの０．０５
モルＮ−アセチル−ＤＬ−バリン水溶液（ｐｌＥ−１＝
７．２．５×１０　モルＣｏ　含有）を加え反応温度３
７°Ｃ１反応時間６０分にて振とうしながら酵素反応を
おこない、生成するＬ−バリンを定量し反応率を求めた
。また固定化アミノアシラーゼ剤を繰り返し用いて同じ
反応を繰り返し行い、３回目、３０回目、６０回目、９
０回目における酵素活性を求めた。本発明の固定化アミ
ノアシラーゼ剤と従来の技術による固定化アミノアシラ
ーゼ剤の結果は下記の如くであった。

次に牛肝臓より抽出したプレオマイシン不活化酵素の同
定化の例を示す。

実施例４゜ 新鮮な牛肝臓２０ｇを１００ｍ１の１／１５モルリン酸
緩衝液（ｐＨ＝７．２）とホモジェネートし、１５．０
０　Ｏｒｐｍにて３０分遠心分離し、上清を集めプレオ
マイシン不活化酵素液とする。別に同緩衝液にて平衝化
したＤＥＡＥセファデックスＡ−２５（ファルマシアフ
ァインケミカルズ社製）　２０　ｍｌに実施例１と同様
にしてエピクロルヒドリン３．Ｏｇを反応させ、未反応
ニブクロルヒドリンを除去し、プレオマイシン不活化酵
素液１００ｍ１を加え、３７°Ｃにて４時間ゆっくり振
とうし、固定化した。

これを保温ジャケット付きカラムに充填し、］／１５モ
ルリン酸緩衝液１００ｍ１．２Ｎ−ＮａＣ１を含む同緩
衝液４００　ｍｌ、更に同緩衝液２００　ｍｌにて洗浄
し、未反応あるいは吸着した酵素を洗い出した。

ジャケットに３７℃の温水を流し、基質としてプレオマ
イシンＢ２の１％同緩衝液溶液を２、５　ｍｌ　／時間
の流速で連続的に流した。

２ケ月間連続運転してプレオマイシンＢ２の加水分解率
は約８０％に低下し、その平均加水分解率は９５，６％
であった。

比較例４゜ 実施例４でエピクロルヒドリンを作用させない以外実施
例４と同様に操作し、４日間にてプレオマイシンＢ２の
加水分解率は８０％に低下した。

実施例５゜ 多孔質ガラスＣＰＧ−１０（２０〜８０メツシユ、５５
０　Ａ、エレクトロ・ヌクレオニックス社袋）８ｇに１
０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランＫＢＥ−９
０３（信越シリコーン社製）１６０ｍｌを加え、６Ｎ−
塩酸にてｐＨ＝　５．５に調整し、７５°Ｃにて２時間
振とう後、戸別し、水洗して乾燥器にて１２０°Ｃ１２
時間熱処理する。得られたアミノプロピルガラスを実施
例４と同様にエピクロルヒドリンと反応させ、プレオマ
イシン不活化酵素を固定し、酵素反応を行ったところ同
様の結果を得た。

比較例５゜ 実施例５でエピクロルヒドリンを作用させない以外実施
例５と同様に操作し、１０日間にてプレオマイシンＢ２
の加水分解率は８０％に低下した。

（発明の効果） 本発明においては、イオン結合法及び共有結合法による
従来り固定化酵素の欠点を解決し、水不溶性の弱塩基性
アニオン交換体の交換基にエピハロヒドリンを反応させ
て得た担体を用いることにより、イオン結合法と同様の
操作で酵素と担体とを共有結合で結合させることが可能
となった。

従って、本発明によればイオン結合法と同様の簡単な操
作により水不溶性の弱塩基性アニオン交換体から強固な
共有結合を持つ固定化酵素が得られ、その酵素活性も高
く、また高い基質濃度も使用可能となり、酵素の脱離−
２１＝ もなくその耐久性も非常に長いため長期間の使用が可能
となった。

又、本発明によれば弱塩基性アニオン交換体を用いるこ
とによりエビノ・ロヒドリンによる反応が極めて容易に
進み、更に、弱塩基性アニオン交換体を用いることによ
り酵素の固定化が短時間で極めて容易に行われ、従って
本発明の担体及び固定化酵素は簡単な手段で製造可能で
ある。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）水不溶性の弱塩基性アニオン交換体の交換基にエ
   ピハロヒドリンを反応させることにより得られる担体。
2. （２）水不溶性の弱塩基性アニオン交換体の交換基にエ
   ピハロヒドリンを反応させて得られる担体に酵素を固定
   化してなる固定化酵素。