ES2214406T3 - Proteinas anticongelantes, su produccion y uso. - Google Patents

Abstract

Una proteína anticongelante que tiene un peso molecular de entre 25 y 33 kDa, que se puede derivar del liquen Nephroma arcticum, teniendo dicha proteína anticongelante una secuencia de aminoácidos parte de la cual presenta un solape de al menos 80% con la secuencia L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T. Teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos parte de la cual presenta un solape de al menos 90% con la secuencia L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A- A-A-T. Teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T.

Description

Proteínas anticongelantes, su producción y uso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas anticongelantes y a procedimientos para su producción y uso. Más específicamente, se refiere a la obtención de proteínas anticongelantes de un organismo que no se ha usado anteriormente para este fin; a las nuevas proteínas derivadas de él y al uso de tales proteínas para controlar procesos de congelación, especialmente en la producción de alimentos congelados, y a los alimentos obtenidos de esta manera.

Antecedentes de la invención

Las denominadas "proteínas anticongelantes" (AFPs) tiene la propiedad de modificar el crecimiento de cristales de hielo. Se diferencian en su acción de los agentes anticongelantes iónicos más simples tales como la sal común. Por ejemplo, las soluciones acuosas de AFP típicamente tienen un punto de congelación que es más bajo que su punto de fusión (histéresis). Inhiben la recristalización. Parece que ayudan a los organismos a sobrevivir a temperaturas en torno al punto de congelación del agua y, consecuentemente, se encuentran en varios tipos diferentes de organismos. Sus propiedades les confieren una gama de usos potenciales: en particular, en alimentos que se comen estando congelados, por inhibir la recristalización y mantener una textura uniforme. En alimentos que se congelan sólo para conservación, los AFPs pueden inhibir la recristalización durante la congelación, almacenamiento, transporte y descongelación, conservándose así la textura del alimento por reducirse la lesión celular y minimizarse la pérdida de nutrientes al reducirse el goteo (véase Griffith, M. y Vanya Ewart, K., Biotechnology Advances, 13, págs. 375-402.

Son conocidas varias fuentes de AFPs: la más ampliamente reconocida son los peces y plantas. Algunas bacterias presentan propiedades anticongelentes (véase Griffith y otros, referencia anterior pág. 382): en algunos pocos casos, se ha dado cuenta de que se han aislado proteínas anticongelantes de bacterias (véase, por ejemplo, Xu H., Griffith M, Patten CL. y otros, Can. J. Microbiol 44: (1) 64-73, enero de 1998).

Dadas las ventajas para un organismo de su resistencia a la congelación, puede considerarse sorprendente que las proteínas anticongelentes no estén distribuidas más ampliamente en la naturaleza y que no se puedan encontrar más fácilmente.

Un inconveniente del uso de nuevas AFPs en alimentos congelados es la necesidad de estar seguros de que tales AFPs son seguras y aceptables para el consumidor. Los consumidores requieren, con razón, que se garantice que los alimentos que comen son seguros. También pueden tener fuetes preferencias a favor o en contra de tipos particulares de material: por ejemplo, a favor de materiales "naturales" u "orgánicos" y en contra de "aditivo", "productos químicos" o "materiales modificados genéticamente (GM)". Los fabricantes de productos alimentarios ignoran, peligrosamente, tales preferencias.

Consecuentemente, hay demanda de AFPs efectivas que sean, o que pueda considerarse que son, "naturales". Si tales materiales derivan de fuentes que históricamente han sido consumidas por el ser humano, hay credibilidad razonable de que, muy probablemente, son seguros. Esto puede reducir la necesidad de ensayos extensos y caros de toxicidad.

Se ha dado cuenta con anterioridad de que los líquenes contienen proteínas anticongelantes. En particular, son conocidas AFPs de Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinacea, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica y Usnea subfloridana. (documento WO 98/04148). Además, se ha propuesto el uso de tales AFPs en confituras heladas. (documento WO 98/04148).

En el documento WO 99/37673 se describe una AFP que puede derivarse de un liquen, que tiene un peso molecular de 20 a 28 kDa y una secuencia N-terminal de aminoácidos que presenta un solape de al menos 80% con A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L.

Hay, sin embargo, varios inconvenientes para usar como ingredientes en productos alimentarios AFPs obtenidos a partir de líquenes. No todos los líquenes presentan actividad de AFP. De los que la presentan, no todos han sido consumidos con regularidad por el hombre. Usualmente, no es posible propagar los líquenes a escala comercial y muchos están disponibles en el ambiente sólo en cantidades muy pequeñas. Así, no es obvio buscar afanosamente una fuente de AFPs entre los líquenes. Sin embargo, se abordó esta investigación, que condujo a la presente invención.

En la espera de encontrar nuevas AFPs, se seleccionaron para ensayar cuatro líquenes candidato que crecen salvajes en Noruega. Eran Cetraria islandica, Nephroma arcticum (familia Nephromatoceae Peltigerales), Umbilicaria hyperborea (familia Umbilicariaceae) y Platismatia glauca. Éstos están entre los muchos líquenes que crecen en gran cantidad en los bosques de Noruega: cada uno de ellos se recogió en cantidades de 100 gramos o más.

Cetraria islandica es la especie de liquen que más frecuentemente se usa como alimento. Ha sido denominado "Brodmose" (musgo de pan). Durante los siglos XVIII y XIX, el gobierno noruego animó a la gente a usar más líquenes en los hogares. Se usó C. islandica mayormente cuando se congelaba la cosecha y durante las guerras. Se ha usado también, más recientemente, en la segunda guerra mundial. También se ha usado como alimento la esp. Umbilicaria, que tiene el nombre de "geitbrod" ("pan de cabra"). También se han usado como alimento Cetraria nivalis, esp. Cladonia y Peltigera aphtosa.

El Nephroma arcticum también se ha usado como alimento, aunque no tan frecuentemente como C. islandica; tradicionalmente se ha usado como medicina frente a enfermedades de la piel. N. arcticum es un líquen foliáceo con talos relativamente grandes y gruesos. La superficie de arriba es amarillo-verdosa o verde cuando está húmeda, y de color de paja o gris-verdeso cuando está seca. La superficie de abajo es parda y blanca hacia los bordes.

Esta especie crece principalmente en rocas a la sombra o sobre el suelo. Es una especie boreal/alpina distribuida principalmente en la zona alpina baja. Es una especie circunpolar que se encuentra en América, Asia (incluido Japón) y Europa. Es muy rara en Gran Bretaña. Se encuentra sobre todo en Noruega, excepto en la costa occidental del sur de Noruega, aunque con frecuancia se encuentra en muy pequeña cantidad en cada localidad. No se conoce que hasta el momento se haya investigado detalladamente su abundancia. No es una especie protegida en Noruega ni es probable que llegue a serlo.

Puesto que los talos de Nephroma arcticum son grandes y gruesos, es relativamente fácil enjuagarlos. Por tanto, es fácil obtener muestras limpias. En algunas localidades, el liquen cubre gran parte del suelo. Por tanto, cuando se encuentra una localidad así, se puede recolectar el liquen rápidamente.

Sumario de la invención

La invención proporciona proteínas anticongelantes (AFPs) que se pueden derivar del liquen Nephroma articum, en particular las que tienen una secuencia de aminoácidos del término N de L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T.

También se proporcionan AFPs que tienen una secuencia de aminoácidos con un alto grado de similitud con la secuencia anterior o versiones modificadas de ella.

La invención abarca también las secuencias nucleicas que codifican tales proteínas y vectores que comprenden tales secuencias.

La invención proporciona además un procedimiento para preparar AFPs, que comprende extraer la proteína AFP del liquen Nephroma articum, su uso en el procesamiento de alimentos y composiciones alimentarias que las contienen.

Tal como se usa aquí, el término "proteína anticongelante" (AFP) significa una proteína, que puede ser una proteína modificada, que es capaz de inhibir el crecimiento de cristales de hielo (véase, por ejemplo, patente U.S. nº. 5.118.792). Consecuentemente, "actividad de AFP" es la capacidad de una proteína de inhibir el crecimiento de cristales de hielo. Esto se puede demostrar, por ejemplo, usando un "ensayo de cubreobjetos" (véase, por ejemplo, Smallwood y otros, Biochem. J., 340, 385-391).

Una proteína que es "capaz de ser derivada de" un organismo especificado es una proteína que es codificada por un gen que está presente naturalmente en ese organismo; la proteína puede derivarse por extracción del propio organismo o por expresión heteróloga de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína en un alojante adecuado.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de una proteína con una potente actividad de AFP en una fuente conocida de alimento para el hombre. La extracción de la proteína de la fuente da una AFP efectiva que probablemente es sana porque procede de una fuente de alimento, y que puede considerarse "natural" por los consumidores.

Específicamente, la invención comprende nuevas proteínas obtenibles de Nephroma arcticum que tienen propiedades anticongelantes. Hasta ahora los inventores han identificado una proteína anticongelante principal y se ha determinado en parte su secuencia. La invención abarca también otras proteínas que pueden contribuir a la actividad anticongelante en esta especie de liquen.

La AFP principal aislada de Nephroma arcticum tiene un peso molecular aparente, determinado por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, de aproximadamente 29 kDa, (aunque, dadas las limitaciones de la técnica, hay un margen probable de error de \pm 4 kDa sobre este valor). Se ha determinado que la secuencia N-terminal de aminoácidos de esta proteína es:

L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T

Parece que hay alguna heterogeneidad de secuencia en las posiciones 8 (forma principal 8 con E como variante menor) y 13 (forma principal V con S como variante menor). Una búsqueda de similitud frente a bases de datos de secuencias de péptidos no identificó polipéptidos conocidos con una homología significativa con esta secuencia.

La invención incluye específicamente esta proteína, sea obtenida directamente de Nephroma arcticum o sea obtenida por expresión de una secuencia de DNA que la codifica en un organismo genéticamente modificado.

También están incluidas en la invención proteínas, cualquier que sea su origen, que presentan un alto grado de similitud de secuencia con la secuencia dada antes. A los fines de la invención, todas las proteínas que presentan actividad de AFP y que tienen una secuencia de aminoácidos de la que una parte presenta un solape de como mínimo 80% con la secuencia anterior están incluidas en el ámbito. Se prefiere más un solape de como mínimo 90%, lo más preferido es que el solape sea de 95% como mínimo; por ejemplo, las secuencias que difieren de la anterior en no más de 1 ó 2 residuos en al parte apropiada de sus secuencias.

A los fines de la invención, el grado de solape de dos secuencias (parciales) de aminoácidos pueden calcularse como sigue: (a) se alinean las dos secuencias y se cuenta el número de residuos que son idénticos y aparecen en el mismo orden (X); (b) se cuenta (1 punto) cada cambio, supresión o inserción de un aminoácido y se calcula el total de tales cambios, supresiones o inserciones (Y); y se calcula el grado de solape como

\frac{X}{X + Y} \ x \ 100%

Se apreciará que, cuando la proteína similar tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una extensión N-terminal, las secuencias de aminoácidos que arrancan del extremo N-terminal pueden no ser en sí similares en un 80%. No obstante, tales proteínas forman parte de la invención con tal de que al menos una parte de la secuencia de aminoácidos tenga un solape de como mínimo 80% con la secuencia anterior.

También está incluida en el ámbito de la invención cualquier versión modificada de las proteínas antes descritas, con tal de que la modificación no afecte significativamente a la actividad de AFP (como se puede ver, por ejemplo, en un ensayo de cubreobjetos) de la mencionada proteína modificada. Por ejemplo, están incluidas las proteínas glicosiladas.

La invención incluye además secuencias de ácidos nucleicos que codifican las nuevas proteínas de la invención. La secuencia de DNA de la AFP principal, que se ha secuenciado ya parcialmente, puede clonarse y caracterizarse usando métodos bien conocidos en la técnica; un método adecuado se indica en el Ejemplo 11. Las secuencias de DNA que codifican otras AFPs que pueden estar presentes pueden derivarse análogamente una vez que se han obtenido secuencias parciales de proteínas.

También están incluidos en el ámbito de la invención vectores que comprenden una secuencia de DNA que codifica una AFP de acuerdo con la invención.

Para algunas aplicaciones puede ser posible recoger suficiente Nephroma arcticum de la naturaleza sin dañar el ambiente. De hecho, los inventores han visto que algunos líquenes se han cosechado ya comercialmente para uso como alimento para renos. La invención proporciona, por tanto, un procedimiento para la producción de un material que contiene una AFP, procedimiento que comprende recoger el liquen, Nephroma arcticum, del campo y recuperar de él un extracto que presenta actividad de AFP.

La aplicabilidad de este procedimiento a escala industrial depende claramente de la disponibilidad del liquen, y es un rasgo importante de la invención que los inventores han inspeccionado las montañas del centro de Noruega y han encontrado que el Nephroma arcticum es abundante y, por tanto, puede recogerse en cantidad suficiente para usarlo como aditivo en productos alimentarios procesados. Los inventores han encontrado nuevas localidades ricas en esta especie y han llegado a la conclusión de que el Nephroma arcticum es muy común en estas montañas. Es interesante hacer notar que los datos del museo herbario noruego son escasos y pueden dar la impresión de que esa especie no es muy abundante. Esto refleja una falta de investigación, más que la distribución real del liquen. Sin embargo, un problema con las localidades de montaña es que, en estas zonas, el liquen tiene una forma de crecimiento que hace difícil su recogida. Crece muy estrechamente pegado al suelo y el musgo y los talos son más pequeños que en las localidades de tierras bajas. Por tanto, probablemente, la mejor estrategia para la recolección es buscar localidades ricas en el liquen por debajo de la línea de bosques.

Los métodos para preparar extractos de proteína en bruto a partir de los microorganismos y para la purificación parcial o completa de proteínas con actividades específicas partiendo de tales extractos son muy bien conocidos en la técnica. En el Ejemplo 9 se da un método adecuado para aislar un preparado muy puro de una AFP principal de N. arcticum, usando una combinación de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y filtración en gel. Para aplicación en la preparación de alimentos, no sería necesario un grado tan alto de purificación. Sin embargo, puede ser deseable una purificación parcial, por ejemplo para eliminar proteasas que de otra forma pueden degradar la AFP con el tiempo.

Cuando se desea usar la AFP en un producto alimentario, el procedimiento de extracción se debe adaptar para usar sólo productos químicos no tóxicos. Un procedimiento así se describe en el Ejemplo 6, aunque también podrían usarse otros procedimientos. Es importante hacer constar que, antes de usar tal preparación de AFP en alimentos congelados, es necesario confirmar que el preparado realmente no es tóxico. Existen laboratorios toxicológicos especializados que realizan tal trabajo usando técnicas bien conocidas por expertos en el campo.

La invención proporciona también un procedimiento para producir un material con actividad de AFP, procedimiento que comprende cultivar un organismo que contiene una secuencia de ADN que codifica una nueva proteína de acuerdo con la invención, bajo el control de elementos reguladores de genea adecuados y en condiciones en las que se sintetiza la proteína, y recuperar del cultivo un extracto que exhibe actividad de AFP. Este organismo puede ser uno de los organismos componentes de Nephroma arcticum, en el que el gen que codifica la AFP se presenta naturalmente, o puede ser un organismo diferente que se ha modificado genéticamente para producir la AFP.

El liquen consta de dos o más organismos que viven en biosíntesis. La micobionta es un hongo y la fotobionta es una alga o una cianobacteria. En algunos casos, incluida la Nephromas arcticum, el hongo vive en simbiosis con la alga y la cianobacteria al mismo tiempo. La fotobionta proporciona energía de la fotosíntesis.

Es posible cultivar los organismos componentes de un liquen tal como Nephromas arcticum. En particular, es posible cultivar los organismos componentes individuales: se puede producir un cultivo del componente alga y un cultivo del componente bacteriano. El cultivo que produce la mayor parte de AFP puede determinarse usando el ensayo estándar de AFP. Tales cultivos podrían usarse luego como fuente comercial de AFP. Este enfoque tendría la ventaja de que, por una parte, no tendría consecuencias ambientales puesto que no se quitaría del campo el N. arcticum y, por otra parte, no está implicada tecnología de modificación genética (GM). Esto es potencialmente importante puesto que algunos consumidores no quieren que sus alimentos contengan aditivos o ingredientes que se han producido por tecnología de modificación genética. En el Ejemplo 12 se enseña cómo cultivar los organismos componentes.

Una estrategia alternativa sería cultivar un organismo genéticamente transformado que comprenda una secuencia de DNA codificadora de una proteína anticongelante de acuerdo con la invención, secuencia que estaría bajo control de un promotor de gen adaptado para que produjera una proteína anticongelante en el organismo transformado. La secuencia de DNA que codifica la proteína anticongelante puede insertarse en un vactor de expresión que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traslación a la proteína deseada en condiciones apropiadas, incluida la apropiada orientación de la secuencia, el marco de lectura correcto y diana y secuencias de expresión adecuadas. Los métodos para hacer vectores de expresión adecuados y para usarlos con el fin de transformar muchos tipos diferentes de organismos son bien conocidos en la técnica.

En principio, se puede modificar cualquier organismo para producir de esta manera la proteína deseada, por ejemplo, bacterias, levaduras, plantas, o células de plantas, insectos o animales. Los organismos transformados genéticamente, adecuados para efectuar el procedimiento de la presente invención, forman otro aspecto más de la invención.

Entre las ventajas de usar un organismo genéticamente transformado para producir la AFP podrían incluirse manipulación más fácil y crecimiento más rápido del organismo, así como, potencialmente, rendimientos mucho más altos. La extracción y la purificación parcial o completa pueden ser también más fáciles, especialmente si se dispone que la AFP sea secretada en el medio de cultivo. Una ventaja adicional de la secreción es que, al menos con algunos organismos alojantes, los niveles de proteasa que se acumulan son, usualmente, bajos, de manera que se puede intensificar la estabilidad de la AFP.

Los métodos adecuados para preparar un extracto que contiene proteína de tales organismos cultivados son bien conocidos en la técnica; las etapas adecuadas para refinar parcial o totalmente la AFP de tal extracto serían similares a las usadas para extraerla del propio extracto de N. arcticum, según se ha descrito aquí antes.

También se posible proporcionar organismos genéticamente transformados, adaptados para producir las AFPs de la invención, que son en sí útiles a causa de su acrecida resistencia a la congelación. En particular, esto se aplica a plantas: que pueden ser cereales tales como trigo o maíz; o dicotiledóneas tales como soja, tomate o lechuga. Tales plantas forman también parte de esta invención.

Las AFPs de acuerdo con la invención pueden usarse convenientemente en varios productos, preferiblemente en productos alimentarios que están congelados o destinados a ser congelados. Son ejemplos de tales productos alimentarios: productos alimentarios congelados tales como vegetales, salsas, sopas, bocadillos, productos lácteos y pastelería congelada, término en el que se incluyen aquí sorbetes, granizados, purés de fruta congelados y dulces congelados que contienen leche, tales como helados, yogures congelados o natillas congeladas, sorbetes y leche helada. Los productos alimentarios preferidos son vegetales congelados y pastelería congelada, por ejemplo, helados, sorbetes. Si se usan mezclas en seco o concentrados, la concentración puede ser más alta para asegurar que el nivel en el producto final congelado esté dentro del intervalo deseado.

Es posible determinar una cantidad adecuada de una solución que contiene AFP para añadir a un comestible, usando un ensayo de inhibición de la recristalización (IR) que se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 7. El ensayo IR es cuantitativo, pero dura bastante tiempo y requiere un equipo especial. Jarman y otros (documento WO 99/37782) han descrito con anterioridad un ensayo para medir la inhibición a la recristalización de hielo. Para la mayoría de aplicaciones, los inventores han encontrado que los niveles preferidos de AFP son de 0,00005-0,3%, en particular, de 0,0001-0,2% en peso de producto final.

Al preparar un producto alimentario, no es necesario añadir la AFP en forma muy pura: puede añadirse como una composición que contiene la AFP, por ejemplo un extracto de un organismo que produce la AFP. Sin embargo, como se ha discutido antes, la purificación parcial puede ser ventajosa, por ejemplo para eliminar proteasas.

Las confituras heladas de acuerdo con la invención se pueden producir por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Preferiblemente, todos los ingredientes de la formulación se mezclan conjuntamente en su totalidad a temperatura ambiente o superior a ella antes de congelar. El nivel de sólidos en el postre helado (por ejemplo, azúcar, grasa, agente saboreador) se ajusta adecuadamente para que por lo menos sea de 3% y, normalmente, para que esté en el intervalo de 10% a 70%, en particular de 40% a 70% del producto final.

Los ejemplos siguientes se presentan sólo a fines ilustrativos.

Ejemplo 1 Recogida de líquenes y envío a los laboratorios para investigación

Las muestras de liquen usadas en los ejemplos se recogieron en ambiente subalpino.

Los líquenes seleccionados se recogieron a mano y se conservaron en bolsas de papel durante el transporte al laboratorio. En el laboratorio, las bolsas de papel se pusieron en una habitación refrigerada a +5ºC para almacenamiento antes de enjuagar los líquenes.

Los líquenes se enjuagaron primeramente con agua corriente. Después de esto, se enjuagaron los liquenes y se escogieron a mano estando húmedos. Después de la enjuagadura, los líquenes se chorrearon con nitrógeno líquido y se pasaron a un congelador (-80ºC), en el que se mantuvieron en bolsas de papel dentro de cajas de cartón hasta que se enviaron al Reino Unido en recipientes de Styrofoam con hielo seco. Todos los líquenes se enjugaron y se congelaron en nitrógeno líquido antes de 36 horas después de haberse recogido.

Ejemplo 2 Ensayo de la actividad de AFP en dos líquenes comestibles (Nephroma arcticum y Cetraria islandica) Homogeneización del tejido del liquen

El tejido congelado, que se había almacenado a -80ºC, se molió a polvo fino en nitrógeno líquido con mortero y mano que habían sido enfriados previamente a -20ºC. El polvo se pasó a otros mortero con mano y se homogeneizó más en un volumen igual de tampón A (Tris 0,2 M, EDTA 10 mM; ascorbato 20 mM; pH 7,8; 30% de sacarosa p/p).Se centrifugó el homogeneizado (centrifugadora Jouan 14 de banco arriba) a 14.000 rpm durante 4 min y el material sobrenadante se mantuvo en hielo antes de usarlo.

Determinación de la actividad de AFP usando el ensayo de cubreobjetos

La actividad de AFP se determinó usando un "ensayo de cubreobjetos" modificado (Smallwood y otros, Isolation and characterisation of a novel antifreeze protein from carrot (Daucus carota), Biochem. J., 340, 385-391. Se pasaron 4 \mul de la solución que se estaba investigando a un portaobjetos circular de 13 mm, limpio, marcado apropiadamente. Encima de la gota de la solución se puso un segundo cubreobjetos y se presionaron conjuntamente ambos portas entre el dedo índice y el pulgar para formar un sandwich. El sandwich se dejó caer en un baño de heptano mantenido a -80ºC en una caja de hielo seco. Cuando se habían preparado todos los sandwich, se pasaron desde el baño de heptano a -80ºC a la cámara de observación que contenía heptano a -6ºC usando unas tenacillas previamente enfriadas en hielo seco. Al pasarlas a la temperatura de -6ºC, se podía ver que los sandwich pasaban de ser transparentes a tener un aspecto opaco. Se observaron los cristales de hielo usando un objetivo de 20x en un microscopio Optiphot (Nikon) y se registraron las imágenes después de incubar durante 60 min a -6ºC, para lo que se usó una cámara de vídeo y un sistema de análisis de imagen (LUCIA, Nikon).

Para análisis semicuantitativo, se ensayaron diluciones seriales 1:2 del material sobrenadante con el fin de determinar la dilución más baja a la que se podía detectar el reducido tamaño de los cristales de hielo. El ensayo Bio-Rad de proteínas se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante con una curva patrón de BSA para determinar el contenido en proteína del material sobrenadante.

Resultados

Se prepararon extractos de Nephroma arcticum y Cetraria islandica y se ensayaron en cuanto a la actividad de AFP. El Nephroma arcticum dio actividad de AFP positiva. El Cetraria islandica dio actividad de AFP negativa. El liquen Nephroma arcticum reveló una significativa actividad de AFP. Diluciones seriales de 1:2 de la muestra de Nephroma arcticum revelaron que la actividad de AFP era aún detectable a niveles de proteína total de 0,1 mg/ml.

Ejemplo 3 Ensayo de la actividad de AFP en tres líquenes abundantes (Nephroma arcticum, Umbilicaria hyperborea y Palmatia glauca) Extracción de la proteína

Los tres líquenes, Nephroma arcticum (familia Nephromatoceae Peltigerales), Umbilicaria hyperborea (familia Umbilicariaceae) y Palmatia glauca se recolectaron durante el invierno en Noruega y se almacenaron a -80ºC.

Se dejaron caer los tejidos de liquen en nitrógeno líquido e inmediatamente se molieron en morteros separados mientras que se añadía regularmente nitrógeno líquido.

Los extactos de proteína en bruto se prepararon agitando los tejidos de liquen molidos (250 g de Nephroma arcticum, 128 g de Umbilicaria hyperborea y 100 g de Plasmatia glauca) con "tampón de extracción" de Tris 50 mM/ HCl (750 ml, 550 ml y 550 ml, respectivamente) en matraces de vidrio durante 30 min a 4ºC. Un litro de "tampón de extracción" contenía 1 botella de una mezcla inhibidora de proteasas de uso general, de Sigma. La mezcla inhibidora de proteasas de uso general contenía fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo (AEBSF), aprotinina, bestatina, trans-epoxisuccinil-L-leucil-amido (4-guanidino) butano (E-64), leupeptina y EDTA sódico.

Los extractos de proteína en bruto se homogeneizaron en una mezcladora comercial Waring durante 5 min y se filtraron a través de Miracloth, de Calbiochem. Los tres extractos de líquenes en bruto se liofilizaron durante la noche usando el aparato Virtis Freezamobile 25EL y se almacenaron a -20ºC.

Ensayo de cubreobjetos

11 mg de extracto en bruto liofilizado (Nephroma arcticum, Umbilicaria hyperborea y Plasmatia glauca) se pusieron en suspensión en 500 ml de agua ultrapura en tubos Eppendorf y se centrifugó durante 5 min a 13.000 rpm en una microcentrifugadora (MSE Micro Centaur). Se retuvieron los sobrenadantes y se ensayaron partes alícuotas de 50 ml de cada extracto en cuanto a su estabilidad durante 2 min a 95ºC en un aparato Eppendorf Thermomixer 5436. Los dos extractos (tratado por calor y no tratado) se ensayaron inmediatamente en cuanto a la actividad de AFP usando una versión del ensayo de cubreobjetos que se detalla más adelante. (Más información sobre el ensayo usado la dan Byass y otros, Unilever, documento WO 9804148).

Las muestras para el ensayo de cubreobjetos se mezclaron con un volumen igual de sacarosa al 60%, obteniéndose una concentración final de 30% de sacarosa. Partes alícuotas pequeñas (5 \mul) de la muestra a ensayar se prensaron entre dos cubreobjetos de microscopio. Éstos se enfriaron rápidamente pasándolos a un baño de hielo seco/trimetilpentano (-70ºC) y luego se pasaron a un baño de trimetilpentano a -6ºC. La actividad de AFP se estimó en términos semicuantitativos de acuerdo con el sistema de puntuación que se da seguidamente.

Puntuación del cubreobjetos	Morfologías observadas de los cristales
+++++	Cristales muy pequeños, muy densos
++++	\begin{minipage}[t]{110mm} Cristales pequeños, no densos; o pequeños, totalmente densos, con algunos cristales de tamaño medio\end{minipage}
+++	\begin{minipage}[t]{110mm} Cristales no densos de tamaño medio-grande; o de tamaño pequeño-medio, no densos\end{minipage}
++	Cristales medios o grandes con algunos cristales de tamaño pequeño
+	\begin{minipage}[t]{110mm} Cristales discretos redondos, grandes, (por ejemplo, control con 30% de sacarosa)\end{minipage}

Resultados

Muestra de ensayo	Puntuación del cubreobjetos
Nephroma arcticum	+++++
Umbilicaria hyperborea	++
Platismatia glauca	++
Control negativo	+
(sólo 30% de sacarosa)

Los resultados revelan que, de los tres líquenes ensayados, Nephroma arcticum produce, con mucho, la mayor actividad de AFP.

Ejemplo 4 Aumento de escala de la preparación de extractos que contienen AFP de Nephroma arcticum

8,94 g de extracto de Nephroma arcticum liofilizado (preparado como se ha descrito en el Ejemplo 3 bajo "extracción de proteína") se pusieron en suspensión en 70 ml de agua pura enfriada con agua-hielo y se agitaron durante 20 min a 4ºC. El extracto en bruto se centrifugó durante 20 min a 8.000 rpm en una centrifugadora Sorval, usando un rotor GSA. Se filtró el material sobrenadante usando una unidad de esterilización por filtración Nalgene de 0,8 \mum y seguidamente una unidad de esterilización por filtración de 0,2 \mum. El extracto pardo de Nephroma articum se repartió en partes alícuotas en tubos de plástico y se almacenó congelado hasta que fue requerido.

Ejemplo 5 Investigación de la estabilidad al calor de AFP extraída de Nephroma arcticum

Si una AFP se ha de usar como ingrediente alimentario en un producto comestible que se pasteuriza durante su manufactura, es importante que la AFP sea estable a las temperaturas que probablemente se usarán. En este ejemplo, se investiga la estabilidad al calor de AFP extraída de Nephroma arcticum.

Se analizó la concentración total de proteína en el extracto que contenía AFP (preparado como en el Ejemplo 3), usando el kit con reactivos del ensayo de BCA (suministrado por Pierce). Se encontró que el extracto tenía un contenido total de proteína de aproximadamente 5,8 mg/ml. Se diluyó una pequeña muestra de este extracto de manera que tuviera una concentración final de proteína de 2 mg/ml y luego se pusieron en cada uno de 5 tubos Eppendorf 16 \mul del extracto diluido. Cuatro de los tubos se pusieron en un Thermomixer Eppendorf a 95ºC. Cada tubo se sometió al tratamiento térmico durante diferentes tiempos: 1, 2, 5 ó 10 minutos. El quinto tubo se usó como control y no se sometió a tratamiento por calor. Después del calentamiento, las muestras se pusieron inmediatamente sobre hielo y se analizó su actividad de AFP usando el ensayo del cubreobjetos.

Actividades del cubreobjetos con extracto de 2 mg/ml de Nephroma arcticum

Material	Puntuación del cubreobjetos
Extracto de Nephroma arcticum, no calentado	+++++
Extracto de Nephroma arcticum, calentado durante 1 min	+++++
Extracto de Nephroma arcticum, calentado durante 2 min	+++
Extracto de Nephroma arcticum, calentado durante 5 min	++
Extracto de Nephroma arcticum, calentado durante 10 min	++

Como la AFP extraída de Nephroma arcticum puede sobrevivir después de calentamiento a 95ºC, es adecuada para uso en productos alimentarios que se pasteurizan durante su manufactura. Por ejemplo, un helado "mixto" se pasteurizaría típicamente por mantenimiento a 82ºC durante 25 segundos antes de enfriarlo y congelarlo. Los resultados demuestran que la AFP extraída de Nephroma arcticum podría sobrevivir a este proceso de pasteurización.

Ejemplo 6 Preparación de AFP de Nephroma arcticum por un procedimiento que es adecuado (sometido a ensayo toxicológico) para inclusión en alimentos congelados Toma de muestras

Se hicieron de la misma forma dos preparaciones separadas y se juntaron los extractos para obtener el extracto final. Se usaron 29 g (Extracto 1) y 35 g (Extracto 2) de tejido, respectivamente. El tejido usado era N. arcticum recogido por uno de los inventores (Rolv Lundheim) en Noruega durante las temporadas de invierno de 1999/2000, se envió (en hielo seco) a los laboratorios del RU y se almacenó a -70ºC hasta que se usó.

Tampones usados

El tampón de extracción estaba constituido por Tris 200 mM-HCl (Fisher Chemicals), ascorbato 20 mM (ascorbato sódico, Sigma), EDTA 10 mM (sal disódica, Sigma) a pH 7,8.

El tampón de diálisis era Tris 50 mM-HCl, EDTA 3 mM a pH 7,5

Extracción

El tejido de N. arcticum se molió a polvo fino en nitrógeno líquido usando mortero y mano. El material molido se puso en un matraz con 180 ml de tampón de extracción frío y se agitó sobre hielo durante 30 min. El extracto resultante se filtró a través de muselina. Se volvió a moler el material sólido usando mortero y mano y un pequeño volumen de tampón adicional (extracto 1, 40 ml; extracto 2, 80 ml). El resultado de esta segunda extracción se filtró también a través de muselina. El filtrado combinado de las dos etapas era el extracto en bruto (extracto 1, aprox. 140 ml; extracto 2 aprox. 200 ml).

Purificación

El extracto en bruto se calentó en un baño de agua a 60ºC sometido a sacudidas. Cuando la temperatura del extrato alcanzó los 60ºC, se incubó durante 15 min. El extracto se enfrió luego sobre hielo, antes de centrifugación, durante 20 min a 15.000 rpm en una centrifugadora Sorvall RV-5B con un rotor SS34 enfriado a 4ºC. Como el material sobrenadante no se había clarificado totalmente después de esta centrifugación, se volvió a centrifugar en tubos limpios a la misma velocidad.

El extracto se dializó luego usando un tubo de diálisis Spectra/Por con un corte del peso molecular de 6.000-8.000 D. El tampón de diálisis es el descrito antes. El volumen del tampón era de 2 l (extracto 1) o 3 l (extracto 3) y se cambió el tampón tres veces en un período de aproximadamente 18 horas. La diálisis se realizó a 4ºC.

Concentración

El extracto dializado se retuvo en el tubo de diálisis y se puso en una caja sandwich. La muestra se cubrió con PEG (polietilenglicol 17, 500, Fluka). La muestra se mantuvo a 4ºC mientras que se reducía el volumen. Después de aproximadamente 2 días en el baño de PEG, el volumen de los extractos era de 35 ml (extracto 1 ) y 30 ml (extracto 2). Después de concentrar los extractos, se centrifugaron nuevamente a 15.000 rpm y se filtraron a través de unidades de filtración de jeringa primero de 0,45 \mum y luego de 0,22 \mum.

Preparación y caracterización del extracto final

Se combinaron los dos extractos preparados como se ha descrito y se combinaron y se repartieron en cantidades de 5 ml antes de congelarlos a -20ºC. Éste fue el extracto proporcionado para un ensayo de RI y los ensayos de refrescos (véase Ejemplo 7).

Se determinó la actividad de AFP del extracto con el ensayo del cubreobjetos. Se obtuvieron los resultados siguientes (la puntuación se ha hecho como se describe en el Ejemplo 2). Los resultados revelan que el extracto final puede diluirse 100 veces y seguir teniendo actividad en el ensayo del cubreobjetos.

	Dilución	Puntuación
	1/2	+++++
	1/10	++++/+++++
	1/50	++++
	1/100	++/+++

El pH medido del extracto era 6,9.

La concentración en proteína del extracto se estimó usando el ensayo de proteínas con Coomasie Plus-200 de Pierce en la versión de protocolo estándar de placa de micropocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración total de proteína del extracto final se estimó que era de aprox. 1 mg/ml.

Ejemplo 7 Determinación de la cantidad de AFP a añadir a un producto comestible Ensayo de inhibición de la recristalización (RI)

Una solución que contenía AFP de Nephroma arcticum (preparada como en el Ejemplo 6) se ajustó a un nivel de sacarosa de 30% en peso con cristales de sacarosa. Se puso una gota de 3 \mul sobre un portaobjetos de 22 mm.

Encima se puso un cubreobjetos de 16 mm de diámetro y se puso sobre la muestra un peso de 200 g para asegurar un espesor uniforme de la hoja. Se sellaron los bordes del cubreobjetos con un barniz claro de uñas. La hoja se puso en la platina de temperatura controlada de microscopio THM 600. La platina se enfrió rápidamente (50ºC/min) a
-40ºC para producir una gran población de pequeños cristales. La temperatura de la platina se elevó luego rápidamente (50ºC/min) a -6,0ºC y se mantuvo a esta temperatura. Se observó la fase hielo a -6ºC usando un microscopio Leitz Ortholux II. Se usaron condiciones de luz polarizada con placa lambda para intensificar el contraste de los cristales de hielo. Se registraron imágenes a T=0 y T=60 min y se analizaron usando software de análisis de imagen (AnalySIS, Soft-Imaging Software, GmbH, D48153, Münster, Hammerstrasse, 89, Alemania). El crecimiento de los cristales se analizó como sigue.

El tamaño medio de una población de cristales de hielo de un momento particular se determinó tomando una imagen de la población (usando el equipo mencionado antes) y seleccionando luego una región de la imagen que contenía al menos 200 cristales de hielo. Se determinó el diámetro mayor de cada cristal trazando en torno a él y calculando el diámetro mayor, usando el software de análisis de imagen.

Cada experimento de RI se realizó tres veces (por tanto, se analizaron las imágenes de al menos 600 cristales de hielo). Los datos de la tabla registran el crecimiento medio de cristales de hielo (esto es, la diferencia del diámetro medio del cristal de hielo al tiempo 0 y después de 60 min). Los límites de confianza se calcularon para un nivel de confianza de la media de 95%.

Se hicieron varias diluciones de una preparación de AFP de Nephroma arcticum con el fin de saber cuánto se podía diluir la muestra y lograr todavía una inhibición efectiva de la recristalización del hielo. En términos prácticos, se considera una preparación de AFP o una dilución de una preparación de AFP para alcanzar una inhibición efectiva de la recristalización de hielo si una muestra de la mencionada dilución o preparación da por resultado un crecimiento de cristales de hielo en el ensayo de RI de 3 \mum o menos.

Resultados del ensayo

Se determinó el crecimiento medio de cristales analizando las imágenes de 1200 cristales.

Dilución de la preparación de AFP	Crecimiento de cristales, media \mum	Límites de confianza
1 en 10	1,09	\pm 0,17
1 en 20	2,01	\pm 0,25
1 en 50	3,67	\pm 0,48
1 en 100	4,79	\pm 0,62
1 en 200	6,84	\pm 0,62

Los resultados demuestran que la preparación se puede diluir 20 veces y seguir teniendo una inhibición efectiva de la recristalización de hielo. Por tanto, se usó esta preparación con una dilución de 1 en 20 (= 5%) en prototipos de alimentos congelados como se presenta en el Ejemplo 8.

Ejemplo 8 Aplicación de AFP de líquen en un refresco

Se hicieron dos premezclas líquidas para la preparación de un refresco:

(A) 20% de sacarosa + 0,2% de pulpa de semilla de algarrobo (LBG) (control negativo; no de acuerdo con la invención).

20% de sacarosa + 0,1% de semilla de algarrobo en agua que contiene AFP de Nephroma arcticum. La AFP' se había diluido en la premezcla a una concentración que daría un valor de RI de aproximadamente 2 \mum. En este caso, esto era una dilución de 1 en 20 o de 0 5%. (véase el Ejemplo 7 para datos de RI).

Por tanto, la premezcla B tenía la composición siguiente:

Ingrediente:	% en peso
Sacarosa	20,00
LBG	0,2
Preparación de AFP (en tampón acuoso)	5,00
Agua	74,80

Determinación de la dureza Vickers

Se prepararon barras cuboides (10 mm x 55 mm x 95 mm) de cada composición (A y B) como sigue. Cada composición se congeló a -3,5ºC en una heladora Gelato Chef 2000 (Magimix UK Ltd). La mezcla se pasó a moldes de caucho de silicona cuyas dimensiones interiores eran 10 mm x 55 mm x 95 mm previamente enfriados a -30ºC. La preparación se enfrió luego a -30ºC antes de desmoldear y almacenar a -25ºC y luego se determinó la dureza Vickers.

El ensayo de dureza Vickers es un ensayo de penetración que implica forzar a presión un penetrador con forma de pirámide sobre la superficie del material y registrar la fuerza aplicada como función del desplazamiento de la punta. La fuerza y el desplazamiento se miden durante el ciclo de carga y descarga de penetración. El ensayo se describe en Handbook of Plastics Test Materials, Ed. R.P. Brown, edit. George Godwin Limited, The Builder Group, 1-3 Pemberton Row, Fleet Street, Londres, 1981. La geometría de la pirámide del ensayo de dureza Vickers es una norma ingenieril (BSi 427, 1990). Tiene un ángulo en el ápice de la punta de 136º. La dureza se determina como:

H_{v} = \frac{F_{mx}}{A}

ecuación en la que H_{V} es la dureza Vickers, F_{max} es la fuerza máxima aplicada (véase figura 2) y A es la superficie proyectada de la huella de penetración en la superficie del material. La superficie A se determina suponiendo que la huella tiene la misma geometría que el penetrador que la forma, esto es, una pirámide Vickers y, por tanto, la superficie proyectada se puede determinar a partir de la profundidad de penetración representada como d_{i} en la figura 3.

A = 24,5 d_{i}^{2}

Resultados del ensayo de dureza

Se hicieron tres bloques congelados de cada mezcla. De cada mezcla congelada se hizo un total de 8 lecturas de la dureza. (Las 8 penetraciones se distribuyeron entre los 3 bloques de manera que se acomodara cualquier variación de un bloque a otro en los resultados).

Datos de la dureza (Mpa)

Mezcla congelada	Dureza (media de 8 lecturas)	Desviación estándar
Sacarosa + LBG	1,03	0,32
Sacarosa +LBG + AFP	2,75	0,78

Los resultados revelan que la AFP de liquen puede modificar significativamente la textura de un alimento congelado. En esta formulación particular (que se típica de un sorbete helado) y usando esta concentración particular de AFP, se produce una textura más dura.

Ejemplo 9 Purificación de AFP para análisis del N-terminal

Para lograr una secuencia N-terminal precisa, se necesita preparar una muestra muy pura. Seguidamente se da un método para preparar esta muestra. Es importante notar que normalmente no sería necesario preparar una muestra tan pura para uso como aditivo para alimentos.

Extracción de AFP

Se molieron a polvo fino 8,6 g de tejido de liquen limpio, seco, en nitrógeno líquido en un mortero con mano enfriado previamente. El polvo se homogeneizó en una proporción 1:1 en tampón A (Tris 0,2 M, EDTA 10 mM, ascorbato 10 mM, pH 7,8). El homogeneizado se puso en un tubo Falcon de 50 ml y se sonicó sobre hielo durante 15 min antes de pasarlo a tubos Eppendorf de 1,5 ml y centrifugar a 4ºC durante 4 min a 14.000 rpm Se recogió el material sobrenadante y se mantuvo sobre hielo. Se volvieron a someter los pelets en 4 ml de tampón A y el material sobrenadante se añadió al material sobrenadante obtenido antes. El material sobrenadante combinado se clarificó por centrifugación durante 10 min a 14.000 rpm y 4ºC, se desaló en una columna de desalado HiTrap (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante a tampón B (Tris 50 mM-HCl, pH 7,5.)

Cromatografía de intercambio iónico

Se filtró (microfiltro de 0,2 \mum) la muestra desalada y se aplicaron 1,5 ml a una columna de 6 ml Mono Q de intercambio aniónico, preequilibrada en el mismo tampón, a un caudal de 1 ml/min. Se controló la conductividad y la OD del eluido y se recogieron fracciones de 2 ml. Cuando la OD volvió a la línea de base, se aplicó un gradiente de NaCl 0-0,5 M. La actividad anticongelante eluyó a aproximadamente NaCl 0,2 M (según el ensayo del cubreobjetos).

Cromatografía de afinidad

Se combinaron las fracciones activas de intercambio aniónico y se concentraron (por diálisis en compuesto de polietilenglicol "PEG" a 4ºC). La muestra concentrada se aplicó a una columna Concanavalin A (ConA) de 28 ml (Pharmacia) que se había equilibrado en tres volúmenes de la columna de tampón C [solución salina tamponada con Tris (TBS-Tris 20 mM/HCl), NaCl 0,5 M, pH 7,4); CaCl_{2} 1 mM; MnCl_{2} 1 mM] y se lavó en 2 volúmenes de la columna de tampón C. La actividad se eluyó con aproximadamente 3 volúmenes de columna de tampón D (TBS, \alpha-D-manopiranósido de metilo 100 mM). El caudal era de 2 ml/min y se recogieron fracciones de 2 ml en todo el tiempo. Se combinaron las fracciones activas, se concentraron y se aplicaron a una columna de filtración en gel según se describe seguidamente.

Cromatografía de filtración en gel

Se concentraron 10 veces las fracciones activas en concentradores Millipore con corte a 30 kDa y se determinó la actividad anticongelante del filtrado y el retenido. Se combinaron los filtrados y se concentró más (10 veces); se filtraron 22 \mul y se cargaron en una columna de penetración en gel Superdex 75 en el sistema SMART de Pharmacia que se había preequilibrado en tampón B (Tris 50 mM/HCl, pH 7,5). El caudal era de 40 \mul/min y se recogieron fracciones de 50 \mul. Se combinaron las fracciones activas después de la etapa de filtración en gel, se concentraron y se usaron para el análisis del terminal N según se describe en el Ejemplo 10.

Conclusión

Durante el protocolo de puriifcación expuesto antes, se usó electroforesis en gel (SDS-PAGE con tinción con plata) para identificar la AFP. La técnica identificó de forma consistente una banda teñida negativamente a 29 kDa que se copurificaba con la actividad de AFP (juzgado según el ensayo del cubreobjetos). Por tanto, se sabía que esta proteína era la AFP y era esta banda la que estaba secuenciada como N-terminal según se describe en el Ejemplo 10.

Ejemplo 10 Determinación de la secuencia N-terminal de la AFP derivada de Nephroma arcticum

Se aplicaron 90 \mul de muestra de AFP de N-arcticum purificada, (preparada como se ha descrito en el Ejemplo 9), a cuatro bandas adyacentes y separadas por SDS-PAGE antes de transferir como mancha sobre membrana de PVDF. La membrana había sido empapada en metanol y el tampón de transferencia usado era CAPS 10 mM, pH 11, más 10% de metanol. La membrana se tiñó con tintura de Ponceau y se marcaron bandas relevantes con una aguja antes de eliminar la tintura con agua. La membrana se secó al aire y se almacenó. La secuenciación se hizo usando un secuenciador de proteínas Procise® 492 (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia N-terminal obtenida se presenta seguidamente. Los inventores creen que esta secuencia es nueva y singular a la AFP que es objeto de esta invención.

Secuencia N-terminal según se describe en el Ejemplo 10 (SEQ. ID nº. 1)

1 L	10 F
2 V	11 G
3 I	12 V
4 G	13 V (S)
5 S	14 A
6 T	15 A
7 A	16 A
8 Q (E)	17 T
9 N

Ejemplo 11 Producción de AFP en un organismo genéticamente modificado

Con el fin de producir la AFP de Nehphroma arcticum en un organismo alojante más conveniente comercialmente, se clona el gen de AFP y se expresa en el sistema alojante escogido. Son conocidos sistemas GM de expresión basados en bacterias, levaduras, plantas, células de plantas, células de insectos y células de animales; por lo general, se prefieren los basados en bacterias, levaduras y plantas. Se indica seguidamente cómo clonar el gen de AFP de Nehphroma arcticum.

Clonación del gen de AFP de Nephroma arcticum

El término N de la AFP de Nephroma arcticum se da en el Ejemplo 10. Una vez que se conocida esta secuencia, se puede clonar el gen entero de AFP -sin hacer cualquier otra etapa inventiva- usando técnicas estándar para clonar genes eucarióticos, que son bien conocidas en la técnica. Seguidamente se da una descripción de este procedimiento.

Para los eucariotes, hay varios enfoques que se pueden seguir para clonar genes cuyas secuencia N-terminal de aminoácidos es conocida. Todos los genes eucarióticos tienen una cola poli A y se usa esta información para clonar. Una primera etapa típica sería obtener una muestra de Nephroma arcticum que hubiera sido expuesta a un tiempo frío durante un prolongado período (y, por tanto, que hubiera sido inducida a producir AFP). A esto sigue el aislamiento de RNA poli A de la mencionada muestra usando kits de reactivos estándar que se venden para este fin y siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, el RNA poli A se podría aislar de un cultivo que produjera AFP de un organismo componente del liquen. En este caso, las células cultivadas se someterían a un choque frío para inducir a las células a producir AFP. Esto puede lograrse poniendo un matraz con las células sobre hielo. Una vez que se ha aislado RNA poli A, se puede hacer DNA complementario usando la transcriptasa inversa de la enzima. Para esta etapa son adquiriblles kits estándar. Se puede usar directamente cDNA de una cadena en la reacción en cadena de polimerasa (PCR), o DNA de doble cadena hecha y usada en PCR o para hacer una biblioteca de cDNA.

En la PCR, el DNA se usa como molde en la reacción. La PCR requiere dos cebadores. Un cebador se designa para la secuencia N-terminal conocida de aminoácidos y, muy probablemente, se degenera correspondiendo a la degeneración inherente al uso de codón. Un ejemplo de una secuencia de cebador para la secuencia N-terminal de aminoácidos TAQNFGVVA es:

[SEQ. ID nº. 2]ACI GCI CAR AAY TTY GGI GTI GTI GC

en la que I = inosina, R = A, Y = C o T.

Además de este ejemplo, una persona experta en la técnica podría diseñar otros cebadores que se podrían designar para diferentes regiones de la secuencia N-terminal de aminoácidos (como se da en el Ejemplo 10). Además, personas expertas en la técnica prefieren, frecuentemente, usar varios cebadores para la secuencia N-terminal en un experimento de clonación.

El segundo cebador usado es una secuencia dT de nucleótidos que se unirá a la cola poli A en el extremo 3' del clon. La reacción PCR que usan estos cebadores dará por resultado una banda que se puede aislar y clonar en un vector adecuado usando metodologías estándar. El inserto de vector se secuencia luego y el DNA se traslada a su correspondiente secuencia de aminoácidos para poner de manifiesto la secuencia N-terminal obtenida de Nephroma arcticum. Clonando la secuencia de DNA en un vector de expresión, se puede producir AFP y ensayarlo para demostrar que tiene las mismas propiedades que la AFP aislada directamente de Nephroma.

Una vía de clonación alternativa es usar el cDNA para hacer una biblioteca en un vector adecuado. Esta librería se puede explorar luego para el gen de codifica la proteína de Nephroma. Por ejemplo, se puede hacer un cebador degenerado para la secuencia N-terminal de aminoácidos según se ha descrito antes y marcarlo de alguna manera usando radiactividad. Este cebador se puede usar luego para explorar la librería, puesto que se unirá a su cadena complementaria presente en la biblioteca. El clon identificado se puede secuenciar luego como se ha descrito antes. También se puede hacer un anticuerpo a la proteína AFP purificada de Nephroma y usarlo para explorar la librería si se ha hecho en un vector de expresión. De nuevo, se puede secuenciar el clon como se ha descrito
antes.

Ejemplo 12 Producción de AFP por cultivo de organismos obtenidos de Nephroma arcticum

Se hicieron crecer separadamente hongos de liquen en condiciones de laboratorio. Esto requiere un medio de crecimiento que proporcione los nutrientes que normalmente obtiene el gen de fotobionta, y también oligoelementos que el liquen obtiene del ambiente. El hongo puede crecer en medio líquido o sobre la superficie de agar que contiene el medio de crecimiento adecuado. El hongo puede crecer también sobre suelo esterilizado (Stocker-Worgotter, E. y Turk R., 1991, Lichenologist. 23, 127-138).

Se cortan ascocarpios (el cuerpo sexual que fructifica) de los talos de liquen y se lavan en solución salina tamponada con fosfato según lo describen Bubrick y Galun (1986, Lichenologist 18, 47-49). Los ascorpios se fijan luego a la parte de arriba de placas Petri que contienen un medio de crecimiento adecuado (Bishcoff, H.W. y Bold H.C., 1963. Publicación nº. 6318 de la Universidad de Texas, Physiological Studies 4, 1-95). Se liberarán las esporas y caerán al medio de crecimiento. Después de que las esporas germinen, se pueden pasar al medio líquido pequeños bloque de agar (Ahmadjian, V. 1993. The Lichen Symbiosis. John Wiley and Sons, Inc. New York). Dan ejemplos de medios de crecimiento adecuados Stocker-Worgotter, E. y Turk R. 1991 (Lichenologist 23, 127-138).

También se pueden obtener cultivos de hongos de talos fragmentados como lo describe Yamamoto Y. (1990, disertación para PhD, Universidad de Kyoto), con la modificación de Stocker-Worgotter (1995, Canadian Journal of Botany 74 (supl. 1) págs. 579-589).

La fotobionta de liquen se puede cultivar de forma similar. Para obtener cultivos axénicos, se raspan fragmentos pequeños de talo, se eliminan las células de alga bajo un microscopio de disección mediante una micropipeta y se pasan a un medio de crecimiento adecuado (Ahmadjian, V, 1973. En The Lichens, V. Ahmadjian y M.E. Hale, eds., Academic Press, New York, págs. 653-659). Las células de alga pueden crecer en medio líquido y medio sólido (agar). Para una descripción detallada de métodos y medios de cultivo, véase Ahmadjian 1993. El Nephroma arcticum comprende una alga del género Coccomyxa (Peveling, E. y Galun, M, 1976, New Phytol. 77, 713) y una cianobacteria del género Nostoc (Wetmore, C.M., 1960. Publicación de Mus. Mich. State Univ., Biol. Ser 1, 369). La cianobacteria del género Nostoc y la alga del género Coccomyxa se pueden obtener de colecciones de cultivos tales como la American Type Culture Collection. Estos organismos no eran originarios de Nephroma arcticum, pero el trabajo realizado con estos cultivos proporcionó información sobre medios de crecimiento adecuados para cultivar tales organismos. Las cianobacterias del género Nostoc y las que se obtuvieron de líquenes han sido cultivadas por varios investigadores (Ahmadjian 1993).

Claims (16)

1. Una proteína anticongelante que tiene un peso molecular de entre 25 y 33 kDa, que se puede derivar del liquen Nephroma arcticum, teniendo dicha proteína anticongelante una secuencia de aminoácidos parte de la cual presenta un solape de al menos 80% con la secuencia L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T.

2. Una proteína anticongelante de acuerdo con la reivindicación 1, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos parte de la cual presenta un solape de al menos 90% con la secuencia L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T.

3. Una proteína anticongelante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T.

4. Una proteína anticongelante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, teniendo dicha proteína al menos una modificación covalente.

5. Una proteína anticongelante de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la modificación es glicosilación.

6. Una secuencia nucleica que codifica una proteína anticongelante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Un procedimiento para producir una proteína anticongelante (AFP) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, procedimiento que comprende las etapas de:

(i) cosechar Nephroma arcticum del campo;

(ii) preparar un extracto que contiene proteína del material de la etapa (i), extracto que exhibe actividad de AFP.

9. Un procedimiento para producir una proteína anticongelante (AFP) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, procedimiento que comprende las etapas de:

(i) cultivar un organismo que contiene una secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 7, bajo el control de elementos adecuados de regulación de genes y bajo condiciones en las que se sintetiza la proteína, y

(ii) recuperar del cultivo un extracto que exhibe actividad de AFP.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el organismo es uno de los organismos constitutivos de Nephroma arcticum.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el organismo contiene la secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 6 como consecuencia de una modificación genética.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la proteína anticongelente está dirigida a ser secretada en el medio de cultivo.

13. Un organismo no humano genéticamente modificado, que contiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.

14. Un extracto que contiene proteína que exhibe actividad de AFP, preparado por cualquiera de los procedimientos de las reivindicaciones 8 a 12, extracto que es adecuado para su uso como aditivo para alimentos.

15. Un producto alimentario que contiene una proteína anticongelante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

16. Un producto alimentario de acuerdo con la reivindicación 15, producto alimentario que es un producto confituras heladas.