ES2235240T3

ES2235240T3 - Producto alimenticio congelado que contiene proteina anticongelante termoestable.

Info

Publication number: ES2235240T3
Application number: ES97930515T
Authority: ES
Inventors: Peter John Lillford; Andrew John Mcarthur; Christopher Michael Sidebottom; Peter Wilding
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-04
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2017-07-04
Also published as: SK282279B6; GB2315752A; SK8999A3; DK0918863T3; ATE287451T1; PT918863E; US6156880A; ZA976473B; DE19732135C2; US6090917A; EP0918863A1; JP4243663B2; US6162789A; PA8434401A1; FR2751657B1; AR008409A1; ZA976477B; EP0918863B1; IL127652A0; GB2315752A8

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE RECUPERACION DE AFPS A PARTIR DE FUENTES NATURALES. DICHO PROCEDIMIENTO COMPRENDE LAS SIGUIENTES FASES: A) AISLAR UN AFP QUE CONTENGA JUGO DE LA FUENTE NATURAL; B) TERMOTRATAR LA FUENTE NATURAL DE AFP QUE CONTIENE JUGO, HASTA UNA TEMPERATURA DE AL MENOS 60 °C; C) ELIMINAR LA FRACCION INSOLUBLE.

Description

Producto alimenticio congelado que contiene proteína anticongelante termoestable.

Campo técnico de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para el aislamiento de proteínas anticongelantes (AFPs) y producto alimenticio congelado que contienen AFPs.

Antecedentes de la invención

Las proteínas anticongelantes (AFPs) se han sugerido para mejorar la tolerancia a la congelación de productos alimenticios.

Para el propósito de la invención, el término AFP tiene el significado tal y como se conoce en la técnica, particularmente aquellas proteínas que muestran la actividad de inhibir el crecimiento de cristales de hielo. Véase por ejemplo el documento US 5.118.792.

El documento WO 90/13571 describe péptidos anticongelantes producidos químicamente o mediante técnicas de ADN recombinante. Las AFPs se pueden usar adecuadamente en productos alimenticios. El ejemplo 3B muestra formas de cristales de hielo modificadas si se congela una mezcla de agua-hielo en una membrana en combinación con 0,1% en peso de AFP.

El documento WO 92/22581 describe AFPs de plantas que se pueden usar para controlar la forma de cristales de hielo en helados. Este documento también describe un procedimiento para extraer una composición de polipéptido de espacios extracelulares de plantas al infiltrar hojas con un medio de extracción sin romper las plantas.

El documento WO 94/03617 describe la producción de AFPs de levadura y su posible uso en helados. El documento WO 96/11586 describe AFPs de pescado producidos por microbios.

Varias bibliografías también hacen mención del aislamiento y/o uso de proteínas vegetales para crioprotección. Las proteínas crioprotectoras tienen una función en la protección de las membranas vegetales contra el daño por congelación. Estas proteínas, sin embargo, no poseen propiedades de inhibición de la recristalización y, por lo tanto, no están incluidas dentro de las AFPs de los términos.

Hincha en Journal of Plant Physiology, 1992, 140, 236-240 describe el aislamiento de proteínas crioprotectoras del repollo.

Volger en Biochimica et Biiophysica Acta, 412 (1975), 335-349 describe el aislamiento de proteínas de hojas crioprotectoras de la espinaca.

Boothe en Plant Physiol (1995), 108: 759-803 describe el aislamiento de proteínas de Brassica napus. De nuevo, se cree que estas proteínas son proteínas crioprotectoras en lugar de AFPs.

Neven en Plant Molecular Biology 21: 291-305, 1993 describe la caracterización del ADN de una proteína crioprotectora de espinaca.

Salzman en Abstracts and Reviews of the 18th Annual Meeting of the ASEV/Eastern Section in Am. J. Enol. Vitic., Vol. 44, nº4, 1993 describe la presencia de polipéptidos estables en ebullición en brotes de Vitis. Aunque las proteínas son análogas a los péptidos anticongelantes de pescado, son proteínas crioprotectoras y no AFPs.

Lin en Biochemical and Biophysical Research Communication, Vol. 183, nº 3, 1992, páginas 1103-1108 y en Lin, Plant Physiology (1992) 99, 519-525 describe el polipéptido crioprotector de 15 kDa de Arabidopsis Hakaira.

Houde en The Plant Journal (1995) 8(4), 583-593 menciona proteínas crioprotectoras de trigo.

Además - como se ilustra en el ejemplo VIII - los extractos de repollo, espinaca, Brassica napus y Arabidopsis no tienen proteínas de inhibición de la recristalización después del calentamiento.

Hasta ahora, sin embargo el uso de AFPs no se ha aplicado a productos alimenticios comercialmente disponibles. Una razón de esto son los elevados costes y el complicado procedimiento para obtener AFPs. Otra razón es que las AFPs que hasta ahora se han sugerido para uso en productos alimenticios congelados no se pueden incorporar en la mezcla de formulación estándar, porque tienden a desestabilizarse durante el procesamiento especialmente durante la etapa de pasteurización. Se cree que esta desestabilización es provocada por la desnaturalización de las AFPs; esto es un efecto muy conocido observado comúnmente para péptidos y proteínas.

La presente invención se dirige a proporcionar soluciones a estos problemas.

Sorprendentemente se ha descubierto que las AFPs se pueden aislar de fuentes naturales como plantas aclimatadas al frío por medio de un nuevo procedimiento relativamente sencillo. Este procedimiento conduce por primera vez a la identificación de las AFPs que se pueden incorporar convenientemente a una mezcla para la preparación de productos congelados antes de la pasteurización de éstos.

Por consiguiente en un primer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la recuperación de AFPs de fuentes naturales, implicando dicho procedimiento las etapas de

a): aislar un jugo que contiene AFP a partir de la fuente natural;

b): tratar térmicamente la fuente natural del jugo que contiene AFP a una temperatura de al menos 60ºC:

c): retirar la fracción insoluble.

La etapa c del procedimiento anterior tendrá lugar normalmente tras las etapas a y b. Las etapas a y b se pueden realizar en cualquier orden deseado, por ejemplo la etapa a seguida de la etapa b (en ese caso el jugo rico en AFP se calentará) o la etapa b seguida de la etapa a (en ese caso la fuente natural se calentará) o la etapa a y b simultánea-
mente.

Sorprendentemente hemos descubierto que el procedimiento de aislamiento de la invención tiene varias ven-
tajas.

En primer lugar al usar el procedimiento ya no es necesario evitar la ruptura de la fuente natural como plantas como se requiere en el procedimiento según el documento WO 92/22581. Esto aumenta inmediatamente de manera significativa la aplicabilidad comercial del procedimiento, por ejemplo en comparación con el documento WO 92/22581, porque los elevados costes de inversión para el procesamiento específico ya no son necesarios.

También al usar las temperaturas elevadas parece posible extraer a partir de un gran grupo de péptidos presentes en las fuentes naturales una nueva selección de AFPs muy activas a partir del material natural, incluyendo dichas AFPs péptidos que son muy activos con respecto a las propiedades de inhibición de la recristalización en hielo.

En tercer lugar, contrariamente a lo esperado, el uso de temperaturas elevadas no desnaturaliza todo el material proteínico, sino que sólo parece desnaturalizar algunas de las proteínas, mientras que el resto de AFPs tienen una estabilidad de temperatura aumentada. Esto hace posible incluir las AFPs aisladas en composiciones que necesitan ser sometidas a mayores temperaturas por ejemplo una etapa de pasteurización. Esto es especialmente sorprendente, porque por ejemplo las AFPs del documento WO 92/22581 parecen no ser estables en condiciones de calentamiento (véase el ejemplo VI).

El procedimiento de la invención incluye en la etapa b el calentamiento de la fuente natural del jugo rico en AFP hasta una temperatura de más de 60ºC. Preferiblemente la temperatura está entre 60 y 110ºC, más preferiblemente entre 80 y 105ºC. La etapa de calentamiento tiene lugar después del aislamiento del jugo rico en proteínas (etapa a) o antes del aislamiento del jugo rico en proteínas. Se puede usar cualquier modo adecuado para calentar el jugo, por ejemplo calentamiento convencional o por microondas, calentar opcionalmente con un medio de extracción añadido, inyección de vapor etc.

Si se usa un medio de extracción, se usa preferiblemente en pequeños volúmenes para evitar la dilución innecesaria de la fracción de AFP. Se puede usar cualquier medio de extracción adecuado, aunque el uso de agua es especialmente preferido. Si se desea, se pueden añadir aditivos al agua antes de usarla como medio de extracción. Más preferiblemente, se usa sin embargo agua sustancialmente libre de aditivos.

El procedimiento de la invención se puede aplicar a cualquier fuente natural de AFPs termoestables. Incluidos en esta lista se encuentran plantas, peces, insectos y microorganismos. Se pueden usar especies de origen natural o especies que se han obtenido a través de modificación genética. Por ejemplo se pueden modificar genéticamente organismos o plantas para expresar AFPs y las AFPs se pueden aislar entonces de acuerdo con la presente invención. De este modo se pueden obtener AFPs que tienen al menos 80%, más preferiblemente más del 95%, y lo más preferido el 100% de homología con las AFPs obtenidas directamente de fuentes naturales. Con el propósito de la invención las proteínas que poseen este elevado nivel de homología también están incluidas dentro de las AFPs de los términos. Además estas plantas o microorganismos transformados capaces de expresar genes que codifican las AFPs también están incluidos dentro del alcance de la invención.

Las técnicas de manipulación genética se pueden usar para producir las AFPs termoestables descritas en la invención. Una célula u organismo huésped apropiado sería transformado por una construcción genética que codifica el polipéptido termoestable deseado. La secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido termoestable se puede insertar dentro de un vector de expresión adecuado que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de un modo que se expresarán en las condiciones apropiadas (por ejemplo en la orientación apropiada y un correcto marco de lectura y con las secuencias de expresión y secuencias diana adecuadas). Los procedimientos requeridos para construir estos vectores de expresión son muy conocidos por los expertos en la materia.

Se pueden utilizar varios sistemas de expresión para expresar la secuencia de codificación del polipéptido termoestable. Éstos incluyen, pero no se limitan a, sistemas de celulares de bacterias, levaduras, insectos, sistemas de cultivos celulares vegetales y plantas todos transformados con los vectores de expresión adecuados.

Se puede transformar una gran variedad de plantas y sistemas celulares vegetales con las construcciones de ácidos nucleicos de los polipéptidos aislados en el extracto termoestable. Las realizaciones preferidas incluirían, pero no están limitadas a, maíz, tomate, tabaco, zanahorias, fresas, semilla de colza y remolacha azucarera.

Preferiblemente la AFP se deriva de plantas (esto significa que la AFP se obtiene directamente de la planta como fuente natural o las AFPs que tienen un gran grado de homología con estas AFPs se producen transgénicamente en otros organismos). Se puede usar cualquier planta que contiene AFPs termoestables, sin embargo preferiblemente son plantas de origen natural (o sus versiones genéticamente modificadas) que son capaces de crecer en condiciones frías tales que contienen AFPs. Es especialmente preferido el uso de centeno de invierno, hierbas perennes y ciperáceas. Otras plantas adecuadas pueden venir por ejemplo del grupo de plantas leñosas, cereales de invierno etc.

Especialmente y de manera preferida las AFPs termoestables se derivan de Acer saccharoides, Bambú, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis y Agrostis tenuis, Festuca contracta y Poa annua.

El jugo rico en AFP se puede separar de su origen por cualquier procedimiento conveniente por ejemplo prensado, filtración, homogenización, extracción etc. Preferiblemente la fuente natural de la AFP como el material vegetal se hace pequeños trozos o se lleva a una mezcla antes de que recoger la fracción rica en proteínas, por ejemplo mediante filtración. Esta maceración se puede hacer mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo en un mezclador. Estará dentro de la capacidad de una persona experta dividir el material en una forma tal que la recolección del jugo rico en proteínas pueda tener lugar fácilmente.

Tras recolectar y calentar (en el orden deseado) la fracción de proteínas, se puede tratar entonces la muestra resultante que contiene AFP mediante cualquier procedimiento conveniente para eliminar la fracción insoluble y retener la fracción líquida rica en AFP. La fracción insoluble se puede eliminar por ejemplo mediante filtración, precipitación etc. El líquido rico en AFP puede entonces ventajosamente procesarse más aun para concentrar o aislar las AFPs o para introducirlas en una forma adecuada para uso adicional. Los ejemplos de los procedimientos adecuados se secan para obtener un polvo o pasta, se concentran más aun para obtener un concentrado de AFP, se cromatografían para separar las AFPs del medio de extracción etc. De nuevo estará dentro de la capacidad de la persona experta determinar los medios y condiciones adecuadas para el aislamiento apropiado.

Para algunas fuentes naturales las AFPs obtenidas mediante los procedimientos anteriores pueden estar formadas por una mezcla de dos o más AFPs diferentes. Si se desea estas AFPs se pueden separar mediante cualquier procedimiento convencional por ejemplo cromatografía u otros procedimientos basados en las diferencias en propiedades físicas/químicas como el peso molecular.

También se puede determinar si se desea la composición de aminoácidos y la secuencia de las AFPs aisladas. Se puede usar cualquier procedimiento adecuado para determinar éstas. Los ejemplos de los procedimientos adecuados se describen en los ejemplos. También se puede determinar si se desea la secuencia de ácidos nucleicos que codifica las AFPs. El vector que contiene una secuencia de ácidos nucleicos capaz de codificar los aminoácidos también se incluye dentro del alcance de la invención.

Basándose en la información anterior también es posible modificar genéticamente otras fuentes naturales de modo que produzcan las AFPs ventajosas tal como se identifican anteriormente. Los ejemplos de las AFPs adecuadas se describen en los ejemplos.

Se ha descubierto que las AFPs obtenidas mediante el procedimiento anterior tienen una capacidad aumentada para resistir el tratamiento térmico. Se cree que dichas AFPs nunca antes han sido aisladas. Como se describe anteriormente esta resistencia térmica aumentada resulta particularmente de interés para uso en productos alimenticios que experimentan una etapa de calentamiento, por ejemplo pasteurización.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a AFPs que tienen una estabilidad térmica como se evidencia al no presentar reducción significativa en las propiedades de inhibición de la recristalización tras el tratamiento térmico durante una hora a 80ºC o 10 minutos a 100ºC. Una prueba adecuada para determinar las propiedades de inhibición de la recristalización en hielo se describe en los ejemplos e implica la rápida congelación a -40ºC seguido de almacenamiento durante una hora a -6ºC. Preferiblemente las AFPs que se someten a esta prueba después del tratamiento térmico dan como resultado un tamaño de partícula de cristal de hielo que es menos de 5 \mum más grande que el tamaño de cristal de hielo de una muestra con la misma AFP que no fue tratada térmicamente. Preferiblemente la diferencia es menos de 3 \mum, más preferiblemente menos de 1 \mum.

Preferiblemente se eligen esas AFPs que tienen propiedades de inhibición de la recristalización en hielo significativas. Una prueba adecuada para determinar las propiedades de inhibición de la recristalización se indica en el ejemplo VI. Preferiblemente las AFPs de acuerdo con la invención proporcionan un tamaño de partícula de hielo tras un ensayo de inhibición de la recristalización en hielo - como se describe en los ejemplos - de 15 \mum o menos, más preferible entre 5 y 15 \mum.

Las AFPs se pueden usar convenientemente en productos alimenticios, preferiblemente en productos que se congelan o se pretenden congelar. Es especialmente preferido el uso de AFPs en productos que se calientan por ejemplo mediante pasteurización o esterilización antes de congelar. Es especialmente preferido el uso en productos de confitería congelados.

Los ejemplos de dichos productos son: mezclas de productos de confitería congelados como mezclas de helado y mezclas de sorbete que se pretenden pasteurizar antes de congelar. Dichas mezclas se almacenan normalmente a temperatura ambiente. Las formas de producto adecuadas son por ejemplo: una mezcla en polvo que se envasa por ejemplo en una bolsa o en sobres. Siendo dicha mezcla capaz de formar la base del producto alimenticio congelado por ejemplo tras la adición de agua y opcionalmente otros ingredientes y - opcional - aireación.

Otro ejemplo de una mezcla adecuada podría ser una mezcla líquida (opcionalmente aireada) que se puede congelar, si fuera necesario, tras la adición de más componentes y más aireación opcional.

La ventaja evidente de las mezclas anteriormente mencionadas es que la presencia del ingrediente de AFP hace que las mezclas se puedan congelar en condiciones de reposo, por ejemplo en un congelador de tienda o doméstico sin la formación de formas de cristales de hielo inaceptables y por lo tanto con una textura diferente a los productos normalmente obtenidos mediante congelación en reposo.

Muy convenientemente estas mezclas se pueden envasar en recipientes cerrados (por ejemplo tetrabrik, bolsas, cajas, recipientes plásticos etc). Para envases unitarios el tamaño será generalmente entre 10 y 1000 g. Para envases múltiples pueden ser adecuados tamaños de hasta 500 kg. Generalmente el tamaño del envase será entre 10 g y
5000 g.

Como se indicó anteriormente los productos preferidos en los que se usan AFPs son productos de confitería congelados como helados o sorbetes. Preferiblemente el nivel de AFPs está entre 0,0001 y 0,5% en peso en función del producto final. Si se usan concentrados o mezclas secas, la concentración puede ser mayor para asegurar que el nivel en el producto congelado final está dentro de los intervalos anteriores.

Se ha descubierto sorprendentemente que las composiciones de la invención pueden contener cantidades muy bajas de AFPs aunque siguen siendo de gran calidad.

Se ha descubierto sorprendentemente que el nivel de AFPs puede ser tan bajo como entre 0,1 y 50 ppm mientras siga proporcionando las propiedades de recristalización adecuadas y tolerancia de temperatura en productos de confitería congelados. Aunque los solicitantes no desean de ningún modo estar comprometidos por ninguna teoría, la razón de esto puede ser que la interacción entre los sólidos del dulce congelado y las AFPs proporciona un mecanismo excelente para inhibir el crecimiento del cristal. Más convenientemente el nivel de AFP está entre 1 y 40 ppm, especialmente preferido entre 2 y 10 ppm.

Con el propósito de la invención el término producto de confitería congelado incluye dulces congelados que contienen leche como helado, yogur congelado, sorbete, helado de leche y natillas congeladas, helado granizado y purés de fruta congelados. Para algunas aplicaciones el uso en productos alimenticios fermentados es menos preferido.

Preferiblemente el nivel de los sólidos en el dulce congelado (por ejemplo azúcar, grasa, aroma etc) es mayor del 4% en peso, por ejemplo mayor del 30% en peso, más preferiblemente entre 40 y 70% en peso.

Los productos de confitería congelados según la invención se pueden producir por cualquier procedimiento adecuado para la producción de dulces congelados. Especialmente y de manera preferida sin embargo todos los ingredientes de la formulación se mezclan completamente antes de la pasteurización y antes de que comience el procedimiento de congelación. El procedimiento de congelación puede implicar convenientemente una etapa de endurecimiento, por ejemplo a una temperatura de -34,4ºC (-30 Fahrenheit) o inferior.

Ejemplo I Aislamiento de AFPs al recoger primero el jugo seguido de tratamiento térmico y aislamiento de la AFP

El centeno de invierno (variedad Halo) se cortó en enero (la temperatura media en ese mes fue 3,5ºC asegurando la apropiada aclimatación en frío de las plantas). El tejido se transportó rápidamente dentro del laboratorio para manejo adicional y se lavó a fondo con agua para eliminar la suciedad.

400 g de centeno cortado se homogenizaron a temperatura ambiente en un mezclador Waring con 800 g de agua hasta que el tejido de las hojas se rompió completamente. Se recogió el jugo rico en AFP al filtrar a través de 4 capas de muselina.

El jugo rico en AFP se sometió entonces a un tratamiento térmico al hervir el jugo durante 10 minutos. Esto provocó la precipitación de la proteína mientras la AFP para uso de acuerdo con la invención permaneció en la solución. Se separó el sobrenadante del precipitado al centrifugar a 15.000 g durante 20 minutos o mediante filtración adicional a través de muselina.

Las AFPs se pueden aislar del sobrenadante mediante liofilización.

Con fines de control se puede obtener un extracto apoplástico (extracto extracelular) de centeno de invierno de la manera siguiente: se cortaron las hojas de plantas de centeno aclimatadas al frío de 30 días en longitudes de 3 cm y se lavaron a fondo en agua destilada para eliminar cualquier contenido celular. Las partes de las hojas se secaron con golpecitos en una toalla de papel y se sumergieron totalmente en un medio de extracción de AEDT 5 mM, ácido ascórbico 10 mM, ácido caproico 2 mM, benzamidina 2 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM. Entonces fueron infiltradas en vacío en un matraz Buchner durante 60 minutos, tiempo tras el cual las hojas se retiraron y se secaron completamente con golpecitos. Se dispusieron entonces longitudinalmente en un cuerpo de jeringa plástico cortado y se centrifugaron suavemente a 2000 X g durante 30 minutos. El extracto apoplástico se recogió en un tubo eppendorf por debajo de la jeringa.

Ejemplo II Aislamiento de AFPs al calentar primero la fuente natural, seguido del aislamiento del jugo rico en AFP y aislamiento de la AFP

Se cortó tejido herbáceo mezclado (Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis) en enero (la temperatura media en ese mes fue 3,5ºC asegurando la apropiada aclimatación en frío de las plantas). El tejido herbáceo se transportó rápidamente dentro del laboratorio para manejo adicional y se lavó a fondo con agua para eliminar la suciedad.

Se pusieron 500 g de hierbas cortadas en un horno microondas de 650 vatios y se calentaron a máxima potencia durante 5 minutos, por lo cual la temperatura se elevó de 85 a 100ºC. Las hierbas cortadas se enfriaron entonces a temperatura ambiente.

Alternativamente las hierbas cortadas se mezclan con 500 g de agua a ebullición y la mezcla se recalienta a 100ºC seguido de ebullición durante 10 minutos con agitación y entonces se deja enfriar a 60ºC.

Después de la etapa de calentamiento el jugo rico en AFP se separó de las hierbas cortadas mediante filtración. La masa se agitó continuamente durante 5 minutos en presencia de un volumen igual de agua y entonces se exprimió a través de 3 capas de muselina.

El sobrenadante se puede liofilizar para eliminar el agua seguido de almacenamiento. Alternativamente el sobrenadante se puede congelar para almacenar.

Ejemplo III

Una pre-mezcla líquida para preparar helado se fabricó al mezclar:

Ingrediente	% en peso
Leche desnatada en polvo	11,390
Sacarosa	3,410
Maltodextrina (MD40)	4,000
Goma de algarrobilla	0,072
Jarabe de maíz 63DE	20,705
Goma guar	0,048
Genulacta L100	0,020
Mantequilla	9,015
Avicel RC581	0,240
Gelatina	0,140
Monoglicérido (palmitato)	0,450
Vanillina	0,010
AFP (del ejemplo I*)	0,100 o nada (control)
Agua	resto

* Nota: la AFP se añade como solución de AFP concentrada usando algo del agua añadida como diluyente, el porcentaje se refiere a la cantidad de AFP.

Esta mezcla se puede pasteurizar convenientemente a 85ºC durante 15 segundos y almacenar enfriada en una lata.

Las mezclas se pueden usar en la preparación de un helado al batir con un mezclador doméstico convencional hasta un exceso de aproximadamente el 100%, seguido de congelación estática en un congelador doméstico. La composición según la invención tiene una textura marcadamente mejor que la muestra de control.

Se obtienen resultados muy buenos al usar la AFP del ejemplo II en lugar de la AFP del ejemplo I.

Ejemplo IV

Una pre-mezcla líquida para preparar helado se preparó al mezclar:

Ingrediente	% en peso
Leche desnatada en polvo	10,00
Sacarosa	13,00
Maltodextrina (MD40)	4,00
Goma de algarrobilla	0,14
Mantequilla líquida	8,00
Monoglicérido (palmitato)	0,30
Vanillina	0,01
AFP (del ejemplo I*)	0,01 o nada (control)
Agua	resto

* Nota: la AFP se añada como solución de AFP concentrada en algo del agua, el porcentaje se refiere a la cantidad de AFP.

Los ingredientes se mezclaron a temperatura ambiente seguido de pasteurización durante 60 segundos a 89ºC. La mezcla se rellenó asépticamente en envases de 500 ml, se selló y se almacenó a temperaturas ambiente.

La mezcla se puede usar en la preparación de un helado al batir con un mezclador doméstico convencional hasta un exceso de aproximadamente el 70%, seguido de congelación en condiciones estáticas en un congelador doméstico.

Después de dos meses de almacenamiento la composición según la invención tuvo una textura marcadamente mejor que la muestra de control.

Ejemplo V

Se repitió el ejemplo IV, pero ahora la mezcla de helado se preparó hasta un exceso del 70% antes de rellenar asépticamente y sellar.

El producto resultante se puede almacenar a temperatura ambiente y se puede producir un helado al poner la mezcla en un congelador doméstico y congelar en condiciones estáticas.

Ejemplo VI

Las propiedades de inhibición de la recristalización en hielo de las AFPs se pueden determinar de la manera siguiente:

Una muestra de un producto que contiene AFP se ajustó a un nivel de sacarosa del 30% en peso (Si el nivel de partida de la muestra era más del 30% esto se hizo por dilución, si el nivel de partida fue inferior se añadió sacarosa hasta el nivel del 30%).

Se puso una gota de 3 \mul de la muestra en un cubreobjetos de 22 mm. Se puso entonces un cubreobjetos de 16 mm de diámetro en la parte superior y se puso un peso de 200 g sobre la muestra para asegurar un espesor uniforme en el portaobjetos. Los bordes del cubreobjetos se sellaron con barniz de uñas transparente.

El portaobjetos se puso en una platina de microscopio de temperatura controlada Linkham THM 600. La platina se enfrió rápidamente (50ºC por minuto) hasta -40ºC para producir una gran población de pequeños cristales. La temperatura de la platina se aumentó entonces rápidamente (50ºC por minuto) hasta -6ºC y se mantuvo a esta tempera-
tura.

La fase de hielo se observó a -6ºC usando un microscopio Leica Aristoplan. Se usaron condiciones de luz polarizada junto con una placa Lambda para mejorar el contraste de los cristales de hielo. El estado de la fase de hielo (tamaño de los cristales de hielo) se registró mediante una fotomicrografía de 35 mm a T=0 y T=1 hora.

Generalmente esta prueba se puede aplicar a cualquier composición adecuada que comprende AFP y agua. Generalmente el nivel de AFP en dicha composición de prueba no es muy crítico y puede estar por ejemplo entre 0,0001 y 0,5% en peso, más preferiblemente entre 0,0005 y 0,1% en peso, lo más preferido entre 0,001 y 0,05% en peso, por ejemplo 0,01% en peso.

Se puede usar cualquier composición adecuada que comprende AFP y agua para llevar a cabo la prueba. Generalmente, sin embargo, no será necesario obtener la AFP en forma purificada. Para aplicaciones prácticas normalmente sería suficiente preparar un extracto líquido o jugo de material natural, en el que este extracto o jugo se puede analizar entonces.

Este procedimiento se puede aplicar por ejemplo a los extractos que contienen AFP como los obtenidos en el ejemplo I o II, con o sin una etapa de concentración.

Se midieron las propiedades de inhibición de la recristalización de varias muestras. Las muestras se obtuvieron del centeno que se recolectó en varios momentos durante el año. Los jugos de AFP obtenidos tras la extracción y calentados de acuerdo al ejemplo I se midieron para ver sus propiedades de recristalización al igual que antes. Como centeno de comparación se usó uno que se cultivó en invernadero (a temperaturas que normalmente no inducen la formación de AFP).

Se midieron los siguientes tamaños de cristales

Muestra	Tamaño del cristal tras 1 hora (\mum)
Control	25
Muestra de diciembre	17
Muestra de enero	10
Muestra de febrero	15
Muestra de marzo	18
Muestra de abril	18
Muestra de mayo	25

Estas medidas muestran que para una buena actividad de las AFP las plantas deben recolectarse durante los meses de invierno por ejemplo diciembre-abril. Son especialmente preferidas las muestras capaces de proporcionar tamaños de cristal de hielo de 15 \mum o menos. En este caso esto se puede conseguir al recolectar las plantas en enero o febrero.

Se hicieron las mismas medidas en las muestras de AFP de enero en las que se trataron térmicamente (1 hora a 60ºC). No se observó una reducción significativa en las propiedades de recristalización.

Como comparación se usó el extracto apoplástico del ejemplo I. Éste dio como resultado un tamaño de cristal de hielo final después de 1 hora de 11,1 \mum; después del tratamiento térmico mediante ebullición durante 10 minutos a 100ºC la prueba dio como resultado después de 1 hora un tamaño de cristal de 16,8 \mum. Este ejemplo muestra que el extracto apoplástico del centeno de invierno no es termoestable.

Ejemplo VII

El extracto de hierba no tratado térmicamente de hierba recolectada en enero se obtuvo de Silsoe (Reino Unido). El extracto se centrifugó durante 1 hora para eliminar tierra y restos insolubles de la manera siguiente, Centrifugadora: Sorvall RC3C, Rotor: H6000A, Temperatura: +5ºC, Velocidad del Rotor: 5000 rpm (7268 g).

Se liofilizó una muestra del extracto para determinar su contenido en sólidos totales. Se descubrió que éste era 11,48 mg/ml. El extracto seco se rehidrató entonces con una solución de sacarosa al 30% a su concentración de sólidos totales original. Se prepararon varias soluciones al diluir el extracto según fuera necesario con solución de sacarosa al 30%.

La actividad anticongelante se midió usando el ensayo del ejemplo VI.

Las fotografías a T=0 y T=1 hora de los ensayos de inhibición de recristalización tuvieron sus tamaños de cristal de hielo medio medidos usando el analizador Zeiss TGA 10. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla siguiente.

1

Estos resultados muestran la variación en el tamaño del cristal final y el cambio en el tamaño de cristal de hielo durante 1 hora a -6ºC para las distintas diluciones de extracto de hierba. Puede observarse que el nivel de sólidos en el extracto de hierba puede variarse en un amplio intervalo mientras aun se obtienen buenas propiedades de inhibición de la recristalización. Preferiblemente se eligen esas concentraciones que dan como resultado un tamaño de cristal de hielo después de 1 hora de 15 micrómetros o menos.

Se hizo una prueba similar con extracto de hierba que había sido sometido a tratamiento térmico (10 minutos a 100ºC). No se observó un deterioro significativo de las propiedades de inhibición de la recristalización.

Además los extractos de hierba del ejemplo II se analizaron usando la misma prueba de inhibición de la recristalización. Se obtuvieron los siguientes resultados:

Tratamiento térmico	Tamaño del cristal en \mum
	T=0	T=1
60ºC 1 hora	9,6	11,1
Ebullición 10 minutos	9,8	11,3

Estos resultados muestran que incluso después de calentar el extracto de la hierba aclimatada en frío mantuvo la capacidad de inhibir el crecimiento de cristales de hielo.

Ejemplo VIII

Varias plantas que contienen AFP se recolectaron en enero. Los extractos se obtuvieron al moler tejido fresco, por ejemplo raíces, tallos, brotes u hojas con una mano de almirez y un mortero (enfriados a 4ºC) en un volumen igual de tampón A (AEDT 10 mM, ácido ascórbico 20 mM, tamponado con Tris hasta pH 7,4) mantenido en hielo. Los homogeneizados se filtran a través de una o más capas de muselina y se mantienen en hielo antes de un uso adicional.

Los extractos se sometieron a la prueba de inhibición de la recristalización del ejemplo VI antes de calentar a 60ºC durante 1 hora y ebullición durante 10 minutos.

Las siguientes plantas contenían AFPs termoestables como se evidenció mediante el mantenimiento de las propiedades de inhibición de la recristalización: Acer saccharoides, Bambú, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis y Agrostis tenuis, Festuca contracta y Poa annua.

Las siguientes plantas no contuvieron AFPs termoestables: repollo, espinaca, Brassia napus y Arabinopsis.

Ejemplo IX

La actividad de histéresis térmica de las AFPs se puede analizar de la manera siguiente:

Se pusieron muestras de 1 ml en Eppendorfs en un baño de agua caliente y se calentaron durante 1 hora a 60ºC. Las propiedades de histéresis térmica de la muestra se midieron de la manera siguiente:

El producto fundido se pone en un portaobjetos (Camlab Cambridge, longitud de recorrido 0,1 mm). Los extremos del portaobjetos se sellan con vaselina.

Se introduce hielo en la muestra usando un pulverizador refrigerante. El portaobjetos se sumergió entonces en un baño de etanol de temperatura regulada a -0,1º. Tras 5 minutos de equilibrio la muestra se comprueba. Si el hielo se funde completamente la temperatura del baño se disminuye en etapas de 0,1ºC seguido de equilibrio. Estas etapas se repitieron hasta que se alcanzó una temperatura donde existe una pequeña cantidad de cristales de hielo en la muestra. Tras el equilibrio a esa temperatura, la temperatura del baño se disminuyó en etapas de 0,01ºC por minuto. La temperatura de congelación de la muestra se registra como la temperatura a la que comienza la propagación del hielo a partir de los cristales equilibrados.

La temperatura de fusión de la muestra se determina entonces al elevar la temperatura partiendo de la temperatura de congelación en etapas de 0,01ºC por minuto hasta que se funden todos los cristales de hielo. Esta temperatura es la temperatura de fusión de la mezcla.

La histéresis térmica de la muestra es la diferencia entre la temperatura de fusión y la temperatura de congelación.

Este procedimiento de prueba se realiza en una primera muestra (antes del tratamiento térmico) y en una segunda muestra después del tratamiento térmico, seguido de enfriamiento.

Similarmente la estabilidad térmica se puede determinar mediante la prueba anterior en la que la muestra hierve en agua durante 30 segundos seguido por la determinación de la histéresis térmica. Se midió la histéresis térmica de varias muestras.

Las muestras se obtuvieron de centeno de invierno que se recolectó en varios momentos durante el año. Los jugos de AFP obtenidos tras la extracción y calentados de acuerdo con el ejemplo I se midieron para ver su histéresis térmica al igual que en el ejemplo VI. Como centeno de invierno de comparación se usó uno que se cultivó en invernadero (a temperaturas que normalmente no inducen la formación de AFP).

Se midieron las siguientes histéresis térmicas

Muestra	Histéresis térmica (ºC)
Control	0,04
Muestra de diciembre	0,18
Muestra de enero	0,21
Muestra de febrero	0,17
Muestra de marzo	0,15
Muestra de abril	0,12
Muestra de mayo	0,05

Estas medidas muestran que para una buena actividad de las AFP las plantas deben recolectarse durante los meses de invierno por ejemplo diciembre-marzo.

Se realizaron las mismas medidas en las muestras de AFP de enero que se trataron térmicamente (1 hora a 60ºC). No se observó una reducción significativa en la histéresis térmica.

Ejemplo X Determinación de la secuencia de aminoácidos de AFPs

El extracto de hierba termoestable del ejemplo II se concentró aproximadamente diez veces usando una cámara de ultrafiltración Amicon con una membrana de corte de 10kDa. El concentrado resultante se cargó en una columna de intercambio aniónico Mono Q (Pharmacia) HR 5/5 FPLC. La compactación a la columna fue en un tampón de Tris/HCl 50 mM a pH 8,5 y la fracción activa de RI eluyó con un gradiente lineal de NaCl hasta una concentración final de 0,5 M en el mismo tampón Tris a pH 8,5. La cromatografía se llevó a cabo a una velocidad de flujo de 1 ml min^{-1} y se recogieron fracciones de 1 ml y se analizaron para ver la actividad de inhibición de la recristalización (como en el ejemplo IX).

Las fracciones activas se combinaron y se concentraron hasta un volumen de 0,05 ml en un concentrador centrífugo centricon PM10 (Amicon) que centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos en un rotor Sorvall SS 34 (8 x 50 ml). El concentrado se cargó en una columna de filtración en gel Superdex 75 PC 3.2/30 que opera en un sistema de microseparación SMART (Pharmacia). La columna se eluyó con tampón Tris/HCl 50 mM a pH 8,5 a una velocidad de flujo de 1 ml min^{-1}. Se recogieron fracciones de 0,05 ml después de que la muestra se cargó hasta un volumen total de 3,5 ml. Las fracciones se analizaron para ver la actividad de inhibición de la recristalización (como en el ejemplo IX) y las fracciones más activas se sometieron a separación en un gel SDS PAGE y electrodesecación antes de la secuenciación N terminal.

Las fracciones activas del Superdex 75 se absorbieron en tampón de carga de gel (Tris/HCl 50 mM, pH 6,8, 10% de glicerol, ditiotreitol 10 mM, SDS al 2%) y entonces se separaron en un gel de poliacrilamida al 10% que sigue al procedimiento Laemmli. Tras la electroforesis el gel se puso en medio de una lámina de membrana Problott (Perkin Elmer) humedecida en metanol y se electrodesecó a 20 voltios durante 16 horas en tampón de ácido 3(ciclo-hexilamino)-1-propano sulfónico (CAPS) 10 mM (pH 11,0) que contiene metanol al 10%. Tras desecar, la membrana se lavó brevemente con metanol y luego con agua milli Q (Millipore) y las proteínas de unión se visualizaron con una solución de azul brillante coomassie al 0,1% (p/v).

Se visualizaron dos bandas de proteínas de pesos moleculares aparentes de 25 kDa y 35 kDa mediante el teñido con coomassie. La proteína de 35 kDa parece correlacionarse estrechamente en particular con las fracciones de RI más activo. Las dos bandas se separaron mediante incisión con una hoja de bisturí y se secuenciaron. Un área sin teñir de la membrana que corresponde a un peso molecular aparente de 65 - 75 kDa también se sometió a secuenciación ya que el teñido plateado de geles de las fracciones más activas había mostrado previamente una banda de proteínas a este peso molecular.

Las tres áreas de membrana separadas mediante incisión se secuenciaron al cargarlas en una unidad de secuenciación Blott y se determinó la secuencia al usar ciclos de reacción y conversión como describe el fabricante (Perkin-Elmer). Los listados de secuencia N terminales se dan a continuación.

La AFP de 25 kDa comprende una secuencia desde el N terminal sustancialmente homóloga a:

: ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X-ILE-VAL-PRO-THR

La AFP de 35 kDa comprende una secuencia desde el N terminal sustancialmente homóloga a:

: ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO

La AFP de 65 - 70 kDa comprende una secuencia desde el N terminal sustancialmente homóloga a:

: X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR

En cada secuencia X denota uno desconocido que puede ser cualquier aminoácido encontrado en las proteínas vegetales. Para el fin de la invención el término sustancialmente homólogo se refiere a al menos 80% de solapamiento en aminoácidos, más preferible más del 90%, lo más preferido entre 95 y 100%.

Claims

1. Una proteína anticongelante (AFP), obtenible a partir de plantas, que tiene una estabilidad térmica como se evidencia al no presentar una reducción significativa en las propiedades de inhibición de la recristalización en hielo, como se evidencia en que el tamaño del cristal de hielo de una composición de la AFP tratada térmicamente en agua tras una rápida congelación a -40ºC seguido de almacenamiento durante una hora a -6ºC es menos de 5 \mum más grande que el tamaño de cristal de hielo de la misma AFP que no está tratada térmicamente, tras el tratamiento térmico durante una hora a 60ºC, una hora a 80ºC o 10 minutos a 100ºC.

2. Una AFP según la reivindicación 1, en la que el tamaño del cristal de hielo de una composición de la AFP en agua tras una rápida congelación hasta -40ºC seguido de almacenamiento a -6ºC durante 1 hora es de 15 \mum o menos.

3. Una AFP según la reivindicación 1 que tiene un peso molecular de 25 kDa y que tiene una secuencia de aminoácidos N terminal más del 90% homóloga a:

en la que X denota cualquier aminoácido encontrado en plantas.

4. Una AFP según la reivindicación 1 que tiene un peso molecular de 35 kDa y que tiene una secuencia de aminoácidos N terminal más del 90% homóloga a:

: ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO;

en la que X denota cualquier aminoácido encontrado en plantas.

5. Una AFP según la reivindicación 1 que tiene un peso molecular de 65 - 75 kDa y que tiene una secuencia de aminoácidos N terminal más del 90% homóloga a:

: X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR;

en la que X denota cualquier aminoácido encontrado en plantas.

6. Un vector que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una AFP de las reivindicaciones 3, 4 y/o 5.

7. Un organismo transformado modificado genéticamente para comprender un vector según la reivindicación 6 y que expresa una AFP de la reivindicación 3, 4 y/o 5, con la condición de que los humanos están específicamente excluidos.

8. Un producto de confitería congelado que comprende entre 0,0001 y 0,5% en peso de la AFP según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9. Una pre-mezcla adecuada para la producción de un producto de confitería congelado según la reivindicación 8, que comprende la AFP de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Un procedimiento para la preparación de un producto de confitería congelado que comprende la preparación de un mezcla de formulación que comprende entre 0,0001 y 0,5% en peso de una AFP, teniendo dicha AFP una estabilidad térmica como se evidencia al no presentar una reducción significativa en las propiedades de inhibición de la recristalización en hielo, como se evidencia ya que el tamaño del cristal de hielo de una composición de la AFP tratada térmicamente en agua tras una rápida congelación a -40ºC seguido de almacenamiento durante una hora a -6ºC es menos de 5 \mum más grande que el tamaño de cristal de hielo de la misma AFP que no fue tratada térmicamente, tras el tratamiento térmico durante una hora a 60ºC, una hora a 80ºC o 10 minutos a 100ºC; seguido de la congelación de la mezcla en condiciones estáticas.

11. Un procedimiento para la recuperación de AFPs según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 a partir de una fuente natural, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

I.a: aislar un jugo que contiene AFP a partir de la fuente natural y entonces tratar térmicamente el jugo a una temperatura de al menos 60ºC; o

I.b: tratar térmicamente la fuente natural hasta una temperatura de al menos 60ºC seguido del aislamiento de un jugo que contiene AFP de dicha fuente natural; y

II.: retirar la fracción insoluble.

en el que la etapa I.a o I.b tiene lugar antes de la etapa II.