ES2214474T3 - Aumento de la expresion mediante orientacion genica en secuencias endogenas de tipo retrovirus. - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONAN METODOS PARA LA IDENTIFICACION Y USO DE SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO ENDOGENAS, PARA RECOMBINACION HOMOLOGA E INTEGRACION A ALCANZAR DE SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO HETEROLOGO. ESTOS METODOS SON UTILES PARA LA INTRODUCCION DEL ACIDO NUCLEICO DENTRO DE CELULAS O TEJIDO PARA TERAPIA DE GENES, O PARA LA PREPARACION DE ANIMAL TRANSGENICO. TAMBIEN SE FACILITAN METODOS PARA REFORZAR LA PRODUCCION DE GENES DE INTERES, DE LAS LINEAS DE CULTIVO DE CELULAS RECOMBINANTES.

Description

Aumento de la expresión mediante orientación génica en secuencias endógenas de tipo retrovirus.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a líneas y métodos de cultivo de células recombinantes, en particular a la identificación y el uso en los mismos de secuencias de ácido nucleico endógeno, para la recombinación homóloga y la integración orientada de secuencias de ácido nucleico heterólogo. Esta invención se refiere también a la introducción terapéutica de secuencias de ácido nucleico en células o en tejido, en particular mediante la integración orientada por medio de la recombinación homóloga; esta introducción es útil para la terapia génica o para la creación de animales transgénicos.

La terapia génica consiste en la introducción de ácido nucleico en una célula o tejido, bien sea in vivo o ex vivo. En algunos casos, se pretende que el ácido nucleico reemplace (o actúe en lugar de) un gen endógeno funcionalmente deficiente, para conferir al anfitrión la capacidad de producir un polipéptido terapéutico, para provocar la represión de un producto génico indeseable, o para estimular una respuesta inmunitaria. Se conocen métodos para introducir ácido nucleico en células in vitro, o en dichas células o tejidos ex vivo, e incluyen la inserción de ADN o ARN desnudos, por ejemplo mediante inyección en el tejido, el empleo de técnicas tales como la electroporación, la presencia de ácido nucleico en liposomas o en otros vehículos, el empleo de un vector tal como un virus, retrovirus, fago, plásmido, etc., y la reintroducción en un tejido de una célula modificada ex vivo, para transcribir y expresar ácido nucleico heterólogo.

Otros investigadores han creado animales transgénicos que transcriben y expresan ácido nucleico heterólogo. Estos animales han sido producidos transfectando con ácido nucleico heterólogo células germinales, células somáticas, o embriones, implantando adecuadamente las células transfectadas, y permitiendo a las células madurar para dar animales adultos que contienen el ADN heterólogo, o permitiéndolas integrarse de manera estable en los mismos. Un porcentaje reproducible de estos animales transcriben y expresan el ácido nucleico heterólogo como proteína que puede ser identificada en tejidos, inclusive la sangre o el suero. En la patente de EE.UU. número 4,396,601 se describen métodos para producir animales transgénicos.

La recombinación implica la apertura y la nueva unión entrecruzada de cadenas de ácido nucleico dentro de secuencias homólogas. Se ha descrito en la bibliografía la recombinación intramolecular (recombinación entre secuencias homólogas presentes en una única molécula de ácido nucleico). Por ejemplo, se ha demostrado que se produce recombinación intramolecular entre secuencias de ADN dispuestas en tándem, idénticas, homólogas y parcialmente homólogas.

"Recombinación intermolecular" es la expresión utilizada para describir la recombinación entre dos moléculas de ácido nucleico diferentes, por ejemplo entre dos cromosomas homólogos durante la meiosis, o bien entre genomas víricos diferentes presentes en la misma célula infectada. Se ha demostrado la recombinación intermolecular en diversos virus animales, y se ha utilizado este proceso para generar vectores con destino a la clonación y expresión de secuencias de ADN heterólogo. Tipicamente se usa el virus como vector de clonación infeccioso.

Se ha demostrado que, tras su introducción en células de mamíferos, algunas moléculas de ADN se recombinan entre sí a través de regiones homólogas compartidas. Véase, por ejemplo, Thomas y otros, Cell 44:419-428 (1986) y Zheng y otros, Nature 344:170 (1990). Esta integración de ADN heterólogo en células de mamífero en cultivo presenta numerosas aplicaciones potenciales, entre otras la investigación, el desarrollo de vacunas, y la terapia génica.

La recombinación que emplea tecnología antisentido ha sido utilizada con anterioridad para inhibir la expresión de productos génicos específicos en líneas celulares de mamífero (Kadi y otros, Science 243:1354-1356 [1989]; Khoka y otros, Science 243:947-950 [1989]; Izant y otros, Science 229:345-352 [1985]) que incluyen algunos retrovirus; (von Ruden y otros, J. Virol. 63:677-382 [1989]; Chang y otros, J. Virol. 61:921-924 [1987]), pero no todos los intentos han sido satisfactorios (Kerr y otros, Eur. J. Biochem. 175:65-73 [1988]). La estructura secundaria del ADN endógeno objetivo puede influir en la susceptibilidad hacia la inhibición antisentido. Actualmente se cree que la inhibición antisentido, para ser eficaz, requiere un exceso de ARN antisentido en comparación con el mARN codificador.

En la actualidad se emplean diversos métodos para introducir y amplificar ácido nucleico extraño (heterólogo) en células cultivadas, con fines de investigación y también para producir en gran cantidad proteínas de interés para aplicaciones farmacéuticas. Aunque con los años se ha acumulado un amplio conocimiento sobre vectores plásmidos de expresión optimizada y sus componentes reguladores individuales, poco se sabe acerca de los mecanismos, limitaciones y obstáculos relacionados con la integración satisfactoria del ADN del donante en el ADN cromosómico de las células anfitrionas receptoras. En cultivos de células eucariotas, a pesar de los esfuerzos realizados para optimizar los vectores de expresión, típicamente sólo un porcentaje bastante pequeño de líneas celulares clonales establecidas después de la transfección con ADN heterólogo de donante expresan realmente el gen de interés. De estas líneas celulares que expresan el gen de interés a menudo sólo un pequeño porcentaje expresan la proteína de interés a niveles satisfactorios.

Es posible que factores inherentes a la célula anfitrión y a su genoma influyan en el nivel de expresión de la proteína de interés. Es posible que una de las variables que afecten a los niveles de expresión sea el sitio de integración del ADN del donante en el ADN cromosómico del anfitrión. Por ejemplo, se puede producir la integración del ADN de donante en zonas que no sean transcripcionalmente activas, o bien en zonas no codificadoras del ADN del anfitrión (ADN que está representado por secuencias muy repetitivas y moderadamente repetitivas que no parecen codificar ningún producto, y que posiblemente tengan funciones sólo estructurales). Es posible que la integración del ADN de donante en estas regiones no dé como resultado niveles adecuados de proteínas nucleares reguladoras que sean necesarias para conseguir niveles de transcripción elevados. Por tanto, la integración de ADN de plásmido o de donante en estas regiones puede dar como resultado la ausencia de expresión del gen de interés o bien su expresión a bajo nivel.

Los investigadores que trabajan en este campo han contemplado la cuestión de cómo conseguir que el ADN que se incorpora se integre en sitios dentro de los cromosomas donde las tasas de transcripción sean elevadas. Para ello, los investigadores han utilizado procedimientos de selección específicos y la recombinación de secuencias de ácido nucleico homólogas a secuencias presentes en el ADN genómico de la célula anfitrión, con el fin de lograr la "integración orientada" en lugar de la integración al azar; véase por ejemplo Zheng y otros, más arriba. Sólo se ha informado de éxitos parciales; en general, se ha observado integración orientada sólo en aproximadamente 1 de cada 1000 ocasiones, mientras que la mayoría de las líneas celulares recombinantes establecidas presentan el ADN del donante integrado en lugares al azar.

Se sabe que las células eucariotas contienen secuencias endógenas que son transcritas con tasas elevadas, y están presentes en un número de copias relativamente elevado, generalmente de 2 a 20 veces, y en ocasiones más de 20 veces, y se encuentran transcripciones de algunas secuencias con cientos de copias. Algunas de estas secuencias están dispersadas por todo el genoma del anfitrión, en más de un cromosoma.

Con frecuencia se emplean en la investigación y en la producción de proteínas de interés células de ovario de hámster chino (CHO) cultivadas. En todas las células CHO se aprecian partículas similares a retrovirus cuando se observan mediante microscopía electrónica de transmisión secciones delgadas de células. Se observan de manera consistente dos tipos de partículas: partículas tipo A intracitoplásmicas asociadas frecuentemente con centriolos, y partículas tipo C con forma de yemas de plantas {Donahue, P.R. y otros, J. Virol. 62: 722-731 [1988]; Lieber, M.M., Science 182:56-58 [1973]; Lubiniecki, Develop.Biol.Standards 70:187-191 [1989]; Lubiniecki y otros, Develop.Biol.Standards 60:141-146 [1985]; Manley, K.F. J.Gen.Virol. 39:505-517 [1987]; Tihon, C., Nat.New Biol. 224:227-231 [1973]}. Nunca se ha detectado infección ni transmisión a otras células {los mismos anteriores y Hojman, F.R., Develop.Biol. 70:195-202 [1990]}. A pesar de su naturaleza aparentemente no infecciosa, el origen de las partículas similares a retrovirus observadas tiene interés ya que se emplean células CHO recombinantes como sustratos para la producción de biofármacos destinados al uso humano {Collen, D., J.Pharm.Exp. 231:146-152 [1984]; Patzer, E.J., BioTechnology 4:630-636 [1986]; Egrie, J.C., Prog.Clin.Biol. 191:339-350 [1985]}. Puesto que se ha demostrado que existe actividad de transcriptasa inversa, indicativa de potencial actividad biológica, asociada con partículas similares a retrovirus en líneas celulares recombinantes, ha aumentado la preocupación acerca de la transmisión potencial de virus a receptores de productos
biofarmacéuticos.

Se ha hallado que en estas células están presentes familias de tales secuencias con un elevado número de copias: están presentes secuencias similares a IAP a un nivel de aproximadamente 500 a 1000 copias por genoma, y secuencias de tipo C a un nivel de aproximadamente 100-300 copias por genoma (Anderson y otros, J. Virology 64:2021-203 (1990); Wurm y otros, Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses, página 71990 (compilado por Spier y otros, Butterworths (1990)); Anderson y otros, Virology 181:305 (1991)).

Es un objeto de la esta invención proporcionar métodos para incrementar la transcripción de genes de interés en cultivos de células eucarióticas. Es un objeto adicional de esta invención proporcionar métodos para introducir ácido nucleico en células o tejido de un animal, in vitro, in vivo o ex vivo.

Es otro objeto de esta invención proporcionar métodos para integrar de manera específica ácido nucleico heterólogo en una célula eucariota anfitrión, dando como resultado dichos métodos rendimientos incrementados de un gen de interés.

Es un objeto adicional de esta invención utilizar secuencias de ácido nucleico que son endógenas en una célula anfitrión, para incrementar la expresión de genes de interés.

Sumario de la invención

Se consiguen los objetos de esta invención proporcionando métodos para obtener células animales que presentan una expresión incrementada de un gen heterólogo, los cuales comprenden: 1) obtener una célula animal que presente una primera secuencia de ácido nucleico endógeno similar a retrovirus; e introducir en dicha célula una segunda secuencia de ácido nucleico homóloga a dicha secuencia de ácido nucleico endógeno similar a retrovirus, y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifique un gen
heterólogo.

En algunos aspectos de esta invención, la segunda y tercera secuencias de ácido nucleico son introducidas en la célula anfitrión a través de un vector plásmido. Se prefiere que la tercera secuencia de ácido nucleico, que codifica el gen heterólogo, esté bajo el control de secuencias de control de transcripción, mientras que no es preciso que la segunda secuencia lo esté.

En ciertas realizaciones, la secuencia similar a retrovirus es incapaz de formar virus infecciosos. Es deseable emplear secuencias similares a retrovirus que sean defectuosas en su forma nativa, aunque también se las puede hacer no infecciosas a través de manipulaciones recombinantes.

En algunas realizaciones preferidas, la célula anfitrión es una célula CHO, y la secuencia de ácido nucleico endógeno similar a retrovirus está seleccionada del grupo compuesto por ácido nucleico que codifica partículas intracitoplásmicas de tipo A, ácido nucleico que codifica partículas intracitoplásmicas de tipo B, o ácido nucleico que codifica partículas intracitoplásmicas de tipo C.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el gen heterólogo es introducido en la célula huésped en un número de copias mayor que el número de copias con que es introducida la segunda secuencia de ácido nucleico.

Para conseguir rendimientos muy incrementados, se prefiere que la primera secuencia de ácido nucleico endógeno esté presente en el genoma de la célula anfitrión en al menos dos copias, con preferencia de 2 a 20 copias, más preferentemente de 20 a 100 copias, y muy preferentemente más de 100 copias. Para conseguir rendimientos muy incrementados, también se prefiere que la primera secuencia de ácido nucleico endógeno esté dispersada por el genoma de la célula, preferentemente en al menos dos cromosomas diferentes.

Se prevé que el ácido nucleico sea introducido en la célula anfitrión en forma de doble filamento o como monofilamento.

Los métodos para identificar secuencias de ácido nucleico endógeno candidatas adecuadas para el uso dentro de los métodos antes descritos, incluyen el ensayo discriminante rápido en busca de una secuencia de ácido nucleico que sea endógena en una célula eucariota y que esté transcrita en al menos dos copias, y preferentemente dispersada dentro del genoma de la célula anfitrión. Actualmente se prefiere que las copias estén presentes en cromosomas diferentes, o bien en locus diferentes del mismo cromosoma, o bien en el mismo cromosoma, pero separados entre sí por al menos 100.000 pares de bases.

También se prefiere que estas secuencias endógenas estén presentes en regiones transcripcionalmente activas del genoma de la célula anfitrión. Mediante métodos comunes, y sin excesiva experimentación, se pueden construir sondas polinucleotídicas para determinar el nivel de transcripción del ADN endógeno en células.

En algunas realizaciones se prefiere el empleo de secuencias endógenas que estén multiplicadas hasta un número de copias considerable, y que estén también distribuidas de una manera casi uniforme por el genoma. Aunque en este momento no se conocen con precisión los mecanismos exactos, el autor de la presente invención sugiere que, al emplear estos criterios de selección, el ADN introducido que entra en la célula sólo tendría que "recorrer" distancias cortas para alcanzar sus lugares objetivo, y por tanto se encontraría favorecida la integración en el interior de estas secuencias endógenas o en la proximidad de las mismas, dentro del genoma de la célula anfitrión, y así se obtendrían como consecuencia las elevadas tasas de transcripción descritas en la presente memoria.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1-1 muestra un mapa de restricción de una secuencia de partícula IAP que ha sido aislada del genoma de CHO como un fragmento de ADN genómico (EcoRI - Sal I) de 2,9 kb de longitud. La figura muestra también un subfragmento de 0,4 kb de este ADN. El fragmento de 0,4 kb (Aha II - Pst I) representa parte de la secuencia 5' LTR del ADN similar a IAP "de longitud completa" de mayor tamaño, con 2,9 kb. Dicho ADN similar a IAP "de longitud completa", de 2,9 kb, se extiende desde un sitio EcoRI aproximadamente 400 pares de bases antes del 5' LTR, hasta un sitio Sal I dentro del 3' LTR. Este ADN similar a retrovirus presenta una deleción interna de 4,5 kb, que separa una parte importante del "genoma del virus".

La Figura 1-2 muestra un mapa de un fragmento de 6,6 kb que representa aproximadamente 70% del genoma completo de una partícula de retrovirus de tipo C. Se han empleado aproximadamente 450 pares de bases situadas antes del 5' LTR, que se extienden hasta un sitio Sal I situado 2 kb antes del 3' LTR. También se ha utilizado en las transfecciones un fragmento interno Pst I-Pst I, de 1,7 kb, que incluye el 5' LTR.

La Figura 2 muestra el número de colonias seleccionadas en co-transfecciones que contienen secuencias retrovíricas IAP y que carecen de las mismas, respectivamente.

La Figura 3 muestra el número de clones resistentes a MTX generados por co-transfección del plásmido DHFR con un vector de control pUC o bien secuencias retrovíricas de tipo C.

La Figura 4-1 muestra los niveles de expresión de clones celulares elegidos al azar, tras la selección en medio GHT-menos.

La Figura 4-2 muestra el número de clones celulares que expresan más de 500 ng/ml de CD4IgG.

La Figura 4.3 muestra los niveles de expresión superiores a 1000 ng/ml en clones celulares elegidos al azar tras co-transfecciones con plásmido DHFR que contiene o que carece de secuencia de 2,9 kb similar a retrovirus IAP, en dos orientaciones.

La Figura 4-4 muestra los intervalos de expresión para CD4IgG de clones celulares elegidos al azar, tras co-transfección con plásmidos de expresión DHFR que contienen o que carecen de ADN de 2,9 kb similar a retrovirus IAP, procedente de células CHO, y un vector de expresión para CD4IgG.

La Figura 5 muestra el análisis de expresión de rtPA en clones aislados seleccionados con MTX 30 nm.

Descripción detallada

Las partículas similares a retrovirus de tipo C, son partículas que semejan formar yemas, con morfología y características inmunológicas similares a retrovirus, que han sido descritas en general en la bibliografía que se ha citado antes. Se excluyen específicamente de esta definición las partículas de tipo A asociadas frecuentemente con centríolos. Se definen las secuencias de ácido nucleico de retrovirus de tipo C como secuencias que codifican dichas partículas, y que permiten múltiples interrupciones de secuencias codificadoras potenciales.

En la presente memoria se define la homología con respecto a cualquier secuencia endógena como el porcentaje de restos presentes en la secuencia candidata que son idénticos a los restos de la secuencia endógena tal como ha sido publicada en la bibliografía o ha sido identificada por el investigador, después de alinear las secuencias e introducir separaciones, si se precisan, para conseguir el máximo porcentaje de homología. Cuando la secuencia candidata es homóloga a una secuencia endógena, con preferencia pero no necesariamente tiene al menos \sim60% de homología con la secuencia endógena.

En la presente memoria se define un elemento "exógeno" como extraño a la célula, o bien homólogo a la célula pero en una posición dentro de la célula anfitrión en la cual no se encuentra de ordinario. En la presente memoria se define un elemento "endógeno" como nativo de la célula. Se define una "secuencia de ácido nucleico endógeno" como una secuencia de ácido nucleico que es endógena a la célula.

Están comprendidas dentro de la presente memoria composiciones de ácido nucleico que sean complementarias (antisentido) a secuencias endógenas. Se pretende que en la práctica de esta invención se emplee ADN de filamento único y de doble filamento. Se hallan dentro del alcance de esta invención este ADN complementario, así como transcripciones de ARN complementarios, y fragmentos de dichas secuencias de ADN y de ARN complementarias que conservan especificidad de hibridación respecto a la secuencia endógena utilizada.

Se emplean fusiones de secuencias de señal para dirigir de manera más expeditiva la secreción del gen de interés. Una señal heteróloga puede reemplazar a la señal de la partícula nativa, y cuando se reconoce la fusión resultante, es decir, es procesada y escindida por la célula anfitrión, se segrega la partícula similar a retrovirus. Se seleccionan las señales basándose en la célula anfitrión pretendida, y las mismas pueden incluir secuencias bacterianas, de levadura, de mamíferos y víricas. La señal nativa o bien la señal de la glicoproteína gD del herpes son adecuadas para el uso en los sistemas de expresión de mamíferos.

El ácido nucleico que codifica las secuencias endógenas o los genes heterólogos de esta invención es sintetizado por métodos in vitro, o bien se obtiene fácilmente a partir de bibliotecas de cADN. Los medios para la creación sintética del ADN, sea manualmente o por medio de un aparato automatizado, son conocidos en general para cualquiera que posea una pericia ordinaria en la técnica, en particular a la vista de las enseñanzas contenidas en la presente memoria. Como ejemplos del estado actual de la técnica en relación con la síntesis de polinucleótidos, se hará referencia a Maniatis y otros, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1984), y a Horvath y otros, An Automated DNA Synthesizer Employing Deoxynucleoside 3'-Phosphoramidites, Methods in Enzymology 154: 313-326, 1987.

Se prevé que se identificarán secuencias deseables de ácido nucleico endógeno para cada célula anfitrión. Un método para tal identificación implica el análisis de transcripciones génicas codificadas por el genoma de la célula anfitrión, buscando en particular secuencias que estén presentes en un número de al menos 2 copias, preferentemente 2-20 copias, más preferentemente 20-100 copias, e incluso más preferentemente más de 100 copias. En algunas realizaciones, la distribución de las copias de la secuencia endógena quedará determinada también mediante el empleo de métodos conocidos tales como la tinción fluorescente. Se prefiere que la secuencia endógena esté presente en más de un cromosoma eucariótico. En ciertas realizaciones, y dependiendo del nivel deseado de rendimiento del gen de interés, se elegirá la secuencia endógena sobre la base de su número de copias y su dispersión genómica.

Las secuencias endógenas útiles en la práctica de esta invención incluyen secuencias retrovíricas (que incluyen a su vez secuencias retrovíricas de tipo A, B, C y D), y secuencias similares a retrovirus (que incluyen secuencias similares a retrovirus IAP y tipo C). También se emplean en la práctica de esta invención fragmentos de estas secuencias endógenas. La secuencia endógena objetivo puede ser funcional o no funcional dentro de la célula anfitrión. La selección de las secuencias endógenas de esta invención para evitar un impacto negativo indeseable sobre el crecimiento o la viabilidad celular es rutinaria dentro de la técnica.

Para obtener ADN que codifique la secuencia endógena a partir de fuentes distintas de una fuente publicada, si se conoce la secuencia de ADN de cualquier fuente, sólo se precisa llevar a cabo un ensayo discriminante de hibridación con ADN marcado que codifique la partícula o fragmentos de la misma (usualmente más de aproximadamente 20 pares de bases, y de ordinario aproximadamente 50 pares de bases), a fin de detectar clones que contengan secuencias homólogas en las bibliotecas de cADN del animal particular, seguidas del análisis de los clones mediante enzimas de restricción y determinación de la secuencia de ácido nucleico, a fin de identificar los clones de longitud completa. Si no existen en la biblioteca clones de longitud completa, entonces se recuperan fragmentos apropiados a partir de los diversos clones, y se ligan en sitios de restricción comunes a los fragmentos, para ensamblar un clon de longitud completa. El ADN que codifica partículas similares a retrovirus, procedente de otra especie animal, es obtenido sondeando bibliotecas de estas especies con las secuencias de hámster, o bien sintetizando in vitro los genes. Mediante el empleo de procedimientos de hibridación de rutina análogos se puede obtener ADN para otras partículas similares a retrovirus que posean una secuencia conocida.

El ácido nucleico que sea homólogo con las secuencias de ácido nucleico endógeno será obtenido por los métodos que se han descrito antes.

La identificación del ADN genómico para la secuencia endógena es una simple cuestión de sondear una biblioteca genómica particular con el cADN o fragmentos del mismo, que hayan sido marcados con un grupo detectable, por ejemplo fósforo radiactivo, y recuperar el clon o los clones que contengan los genes. Si fuese necesario, se ensamblan "a mano" las piezas del gen completo. Típicamente, estas sondas no codifican secuencias con menos de 60% de homología con respecto a la secuencia endógena, y su longitud abarca de aproximadamente 10 pares de bases a 100 pares de bases.

Se puede emplear la tecnología de ADN híbrido para conseguir la expresión. Se puede determinar el mapa de restricción de la secuencia de ADN, y definirse sitios adecuados para la escisión. De esta manera se puede cortar la secuencia e introducirla en un vector que tenga las regiones de control, las regiones moduladoras de la transcripción, y las señales regulatorias, adecuadas. Tras conseguir la expresión, se puede recuperar el producto génico de interés, y purificarlo posteriormente.

En general se emplean procariotas para clonar las secuencias de ADN durante la construcción de vectores útiles en la invención. Por ejemplo, la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC nº 31446) es particularmente útil. Otras cepas microbianas que se pueden utilizar incluyen E. coli B y E. coli X1776 (ATCC nº 31357). Estos ejemplos son ilustrativos y no limitantes. De manera alternativa, son adecuados métodos de clonación in vitro, por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa.

Los productos génicos de esta invención son expresados directamente en el cultivo de células recombinantes como un metionil-análogo N-terminal, o bien como una fusión con un polipéptido heterólogo, preferentemente una secuencia de señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la partícula o porción. Por ejemplo, al construir un vector de expresión secretor procariótico para un producto génico, se emplea la señal con anfitriones que reconocen dicha señal. Cuando la guía de secreción es "reconocida" por el anfitrión, la peptidasa de señal del anfitrión es capaz de escindir una fusión del polipéptido guía fusionada en su extremo C-terminal al producto maduro deseado. Para procariotas anfitriones que no procesen la señal nativa, se sustituye la señal por una señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de las guías de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o enterotoxina II estable frente al calor. Para la secreción en levaduras, se puede sustituir la señal nativa por la guía de la invertasa de la levadura, del factor alfa o de la fosfatasa ácida. En la expresión en células de mamífero la señal nativa es satisfactoria, aunque son adecuadas otras señales de proteínas secretoras de mamífero, al igual que las guías secretoras víricas, por ejemplo la señal gD del herpes simple.

Los productos génicos de esta invención pueden ser expresados en cualquier célula anfitrión, pero preferentemente son sintetizados en anfitriones mamíferos. No obstante, también se emplean para la expresión células anfitrión de procariotas, hongos, levaduras, insectos y similares. Son procariotas ilustrativos las cepas adecuadas para la clonación, así como E. coli W3110 (F^{-},\lambda^{-}, prototrófica, ATCC nº 27325), otras enterobacterias tales como Serratia marcescans, bacilos y diversas pseudomonas. Preferentemente, la célula anfitrión debe segregar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas.

Típicamente se transforman los anfitriones de expresión con ADN que codifica el híbrido que ha sido ligado a un vector de expresión. Estos vectores portan ordinariamente un sitio de replicación (aunque esto no es necesario cuando se va a producir la integración cromosómica). Los vectores de expresión incluyen también secuencias de marcador que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas, tal como se discutirá con mayor detalle más adelante. Por ejemplo, E. coli es transformada típicamente empleando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (Bolívar y otros, Gene 2:95 [1977]). pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y a tetraciclina, y por tanto proporciona un medio fácil para identificar a las células transformadas, sea para la clonación o para la expresión. En la situación óptima, los vectores de expresión contendrán también secuencias que sean útiles para el control de la transcripción y de la traducción, por ejemplo promotores y secuencias Shine-Dalgarno (para procariotas) o promotores e intensificadores (para células de mamífero). Los promotores pueden ser inducibles, pero no es necesario que lo sean. Aunque es concebible que los vectores de expresión no necesiten ningún control de expresión, secuencias replicativas ni genes de selección, su ausencia puede dificultar la identificación de transformantes, y la consecución de un alto nivel de expresión de partículas.

Los promotores adecuados para el uso con anfitriones procarióticos incluyen, de manera ilustrativa, los sistemas de promotor de \beta-lactamasa y de lactosa (Chang y otros, Nature, 275: 615 [1978]; y Goeddel y otros, Nature, 281: 544 [1979]), fosfatasa alcalina, el sistema de promotor de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acid Res. 8: 4057 [1980] y publicación de solicitud de patente europea nº 36.776), y promotores híbridos tales como el promotor tac (H. de Boer y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21 - 25 [1983]). No obstante, son adecuados otros promotores bacterianos funcionales. Sus secuencias nucleotídicas son generalmente conocidas, permitiendo así a un especialista en la técnica ligarlas de manera operativa a ADN que codifique el LHR (Siebenlist y otros, Cell 20: 269 [1980]) empleando linkers o adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para uso en sistemas bacterianos contendrán también una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) ligada de manera operativa al ADN que codifica la partícula de retrovirus tipo C.

Además de los procariotas, son satisfactorios microbios eucariotas tales como levaduras u hongos filamentosos. Saccharomyces cerevisiae es el microorganismo eucariótico más comúnmente utilizado, aunque se encuentran comúnmente disponibles otras cepas. El plásmido YRp7 es un vector de expresión satisfactorio en la levadura (Stinchcomb y otros, Nature 282: 39 [1979]; Kingsman y otros, Gene 7: 141 [1979], Tschemper y otros, Gene 10: 157 [1980]). Este plásmido contiene ya el gen trp 1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carezca de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo ATCC nº 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85: 12 [1977]). La presencia de la lesión trp 1 como una característica del genoma de la célula de levadura anfitrión proporciona así un entorno eficaz para detectar la transformación a través del crecimiento en ausencia de triptófano.

Las secuencias promotoras adecuadas para ser empleadas con anfitriones de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato-cinasa (Hitzeman y otros, J. Biol. Chem 255: 2073 [1980]) u otras enzimas glicolíticas (Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 [1968]; y Holland, Biochemistry 17: 4900 [1978]), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato-dehidrogenasa, hexocinasa, piruvato-decarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato-isomerasa, 3-fosfoglicerato-mutasa, piruvato-cinasa, triosafosfato-isomerasa, fosfoglucosa-isomerasa, y glucocinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que presentan la ventaja adicional de una transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones de promotor para la alcohol-deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato-dehidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. En R. Hitzeman y otros, publicación de patente europea nº 73.657A, se describen con más detalle vectores y promotores adecuados para la expresión en levaduras.

Se conocen secuencias de control de expresión para eucariotas. Es deseable que el gen de interés esté bajo el control de elementos de control de la transcripción, mientras que la secuencia endógena introducida en la célula anfitrión con el gen de interés no necesita estarlo. Virtualmente todos los genes eucariotas poseen una región rica en AT situada aproximadamente 25 a 30 bases por delante del lugar donde se inicia la transcripción. Otra secuencia que se encuentra 70 a 80 bases por delante del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CXCAAT en donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos se encuentra una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poli-A al extremo 3' de la secuencia codificadora. Todas estas secuencias están insertadas en vectores de expresión de mamíferos.

De diversas fuentes se obtienen fácilmente promotores adecuados para controlar la transcripción de vectores a células anfitrión de mamíferos, por ejemplo de los genomas de virus tales como el virus de polioma, SV40, adenovirus, MMV (inducible por esteroides), retrovirus (por ejemplo el LTR de HIV), virus de la hepatitis B, y muy preferentemente citomegalovirus, o bien de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo el promotor de beta-actina. Los promotores temprano y tardío de SV40 son obtenidos convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que contiene también el origen vírico de la replicación de SV40 (Fiers y otros, Nature 273: 113 [1978]). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E (Greenaway, P.J. y otros, Gene 18: 355-360 [1982]).

La transcripción de un ADN que codifica los genes de interés de esta invención se ve incrementada por la inserción de una secuencia intensificadora dentro del vector. Los intensificadores son elementos de ADN que actúan en cis, usualmente con aproximadamente 10-300 pares de bases, y que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los intensificadores son relativamente independientes de la orientación y de la posición, y se han encontrado en sentido 5' (Laimins, L. y otros, PNAS 78: 993 [1981]) y en sentido 3' (Lusky, M.L. y otros, Mol. Cell Bio. 3: 1108 [1983]) respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji, J.L. y otros, Cell 33: 729 [1983]), así como dentro de la secuencia codificadora misma (Osborne, T.F. y otros, Mol. Cell Bio. 4: 1293 [1984]). Son conocidas ahora muchas secuencias intensificadoras procedentes de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). No obstante, típicamente se usará un intensificador procedente de un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el intensificador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pares de bases 100-270), el intensificador de promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, e intensificadores de adenovirus.

Los vectores de expresión empleados en células anfitrión eucariotas (de levaduras, de hongos, de insecto, de planta, de animal, humanas, o bien células nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la terminación de la transcripción, que pueden afectar a la expresión del mARN. Estas regiones son transcritas como segmentos poliadenilados en la porción no traducida del mARN que codifica la partícula. Las regiones 3' no traducidas incluyen también sitios de terminación de la transcripción.

Los vectores de expresión pueden contener un gen de selección, denominado también un marcador seleccionable. Son ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero la dihidrofolato-reductasa (DHFR), la timidina--cinasa (TK) o la neomicina. Cuando se transfieren satisfactoriamente estos marcadores seleccionables a una célula anfitrión de mamífero, la célula anfitrión de mamífero transformada es capaz de sobrevivir si se la somete a presión selectiva. Existen dos categorías distintas, ampliamente utilizadas, de regímenes selectivos. La primera está basada en el metabolismo de la célula y en el empleo de una línea celular mutante que carezca de la capacidad para crecer independiente de un medio suplementado. Son dos ejemplos las células CHO DHFR' y las células LTK' de ratón. Estas células carecen de capacidad para crecer sin la adición de nutrientes tales como la timidina o la hipoxantina. Puesto que estas células carecen de ciertos genes necesarios para disponer de una ruta completa de síntesis de nucleótidos, no pueden sobrevivir a menos que se les suministren en un medio suplementado los nucleótidos faltantes. Una alternativa a suplementar los medios es introducir un gen DHFR o TK intacto en células que carecen de los genes respectivos, alterando así sus requisitos de crecimiento. Las células individuales que no han sido transformadas con el gen DHFR o TK no serán capaces de sobrevivir en medios no suplementados.

La segunda categoría de regímenes selectivos es la selección dominante, que hace referencia a un esquema de selección utilizado en cualquier tipo celular y que no requiere el empleo de una línea celular mutante. Estos esquemas utilizan típicamente un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Las células que son transformadas satisfactoriamente con un gen heterólogo expresan una proteína que confiere resistencia a fármacos, y por tanto supervivencia al régimen de selección. Los ejemplos de esta selección dominante emplean las los fármacos neomicina (Southern y otros, J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 [1982]), ácido micofenólico (Mulligan y otros, Science 209: 1422 [1980]) o higromicina (Sugden y otros, Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 [1985]). Los tres ejemplos antes citados emplean genes bacterianos bajo control eucariótico para conferir resistencia al fármaco apropiado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina, respectivamente.

Las células anfitrión eucarióticas adecuadas para expresar los genes utilizados en esta invención incluyen línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embriónico humano (293 o células 293 subclonadas respecto al crecimiento en cultivo en suspensión, Graham, F.L. y otros, J. Gen. Virol. 36:59 [1977]); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células DHFR de ovario de hámster chino (CHO, Urlaub y Chasin, PNAS (USA) 77: 4216, [1980]); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23: 243-251 [1980]); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); y células TRI (Mather, J.P. y otros, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 [1982]).

La construcción de vectores adecuados que contengan las secuencias codificantes y de control deseadas emplea técnicas de ligación habituales. Se escinden plásmidos aislados o fragmentos de ADN, se modifican según se precise, y se ligan de nuevo en la forma deseada, para proporcionar los plásmidos requeridos.

Para el análisis con vistas a confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, se emplean las mezclas de ligación para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31446) y a través de la resistencia a ampicilina o a tetraciclina, según convenga, se seleccionan los transformantes satisfactorios. Se preparan plásmidos a partir de los transformantes, se analizan por restricción y/o se determina su secuencia por el método de Messing y otros, Nucleic Acids Res. 9:309 (1981), o bien por el método de Maxam y otros, Methods in Enzymology 65: 499 (1980).

Se transforman células anfitrión con los vectores de expresión de esta invención y se las cultiva en medios nutrientes convencionales modificados convenientemente para inducir promotores, seleccionar transformantes, o multiplicar los genes codificados por las secuencias deseadas. Las células anfitrión empleadas para llevar a la práctica esta invención pueden ser cultivadas en diversos medios. Pueden ser adecuados para cultivar las células anfitrión medios comercialmente disponibles tales como medio de Ham F10 (Sigma), medio esencial mínimo (en inglés Minimal Essential Medium [MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y medio de Eagle modificado por Dulbecco ([DME], Sigma). Además, se pueden emplear como medios de cultivo para las células anfitrión cualquiera de los medios descritos por Ham y Wallace (Meth. Enz. 58: 44 [1979]), Barnes y Sato (Anal. Biochem. 102:255 [1980]), la patente de EE.UU. 4,767,704, la patente de EE.UU. 4,657,866, el documento WO 90/03430, el documento WO 87/00195, el documento Re. de patente de EE.UU. 30,985, la patente de EE.UU. 4,927,762, o bien la patente de EE.UU. 4,560,655. Se puede suplementar cualquiera de estos medios, según se precise, con hormonas u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, de calcio, de magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como gentamicina), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el orden de micromoles), y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se pueden incluir, a concentraciones adecuadas, cualesquiera otros suplementos necesarios. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las previamente utilizadas con la célula anfitrión seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el especialista ordinario en la técnica.

Las células anfitrión a las cuales se hace referencia en esta memoria descriptiva comprenden células de un cultivo in vitro, así como células que se encuentran en el interior de un animal anfitrión.

El término "transformar" significa introducir ADN en un organismo de manera tal que el ADN sea replicable, bien como un elemento extracromosómico, o bien mediante integración cromosómica. Salvo que se indique otra cosa, el método aquí empleado para transformar las células anfitrión es el método de Graham, F. y van der Eb, A., Virology 52: 456-457 (1973). No obstante, se pueden emplear también otros métodos para introducir ADN en células, por ejemplo mediante la inyección nuclear o mediante la fusión de protoplastos. Si se emplean células procarióticas o células que contienen construcciones de pared celular sustanciales, el método preferido para la transfección es el tratamiento con calcio que emplea cloruro cálcico, tal como ha sido descrito por Cohen, F.N. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69: 21110 (1972).

"Transfectar" significa introducir ADN en una célula anfitrión, se exprese o no a la postre cualquier secuencia codificante. El especialista ordinario en la técnica conoce numerosos métodos de transfección, por ejemplo CaPO_{4} y electroporación. La transformación de la célula anfitrión es el indicio de una transfección satisfactoria.

Las siglas "RCP" (reacción en cadena de la polimerasa) hacen referencia a una técnica en la cual se multiplica un fragmento de ADN. En condiciones apropiadas se hibridan cebadores oligonucleotídicos que se corresponden con los extremos 3' y 5' (verificación de filamentos de sentido y antisentido) del segmento de ADN que ha de ser multiplicado, y se emplea la enzima Taq polimerasa, o bien una enzima equivalente, para sintetizar copias del ADN situado entre los cebadores.

Se prevé además que la práctica de esta invención pueda implicar métodos de producción recombinante que utilicen métodos de control introducidos en células que ya contienen ADN que codifique el producto deseado, actualmente en uso dentro del sector. Por ejemplo, se inserta un potente elemento promotor/intensificador, un supresor, o bien un elemento modulador de transcripción exógeno, en el genoma de la célula anfitrión pretendida, en la proximidad y con la orientación suficientes para influir en la transcripción del ADN que codifica la partícula deseada; el elemento no codifica la partícula de esta invención, pero el ADN está presente en el genoma de la célula anfitrión. A continuación se realizan ensayos discriminantes en busca de células que fabriquen el producto deseado, o bien niveles de expresión incrementados o disminuidos, según se desee.

De los cultivos celulares recombinantes se recupera el producto génico y se purifica mediante métodos conocidos, que incluyen la precipitación con sulfato amónico o con etanol, la extracción con ácido, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía sobre fosfocelulosa, la cromatografía de inmunoafinidad, la cromatografía sobre hidroxiapatito, y la cromatografía sobre lectina.

En una muestra se pueden medir directamente la multiplicación y/o la expresión génicas, por ejemplo, mediante transferencia y tinción Southern convencional o bien mediante tinción de puntos (análisis del ADN) empleando una sonda adecuadamente marcada, y basándose en las secuencias proporcionadas en la presente memoria. Se pueden emplear diversas marcas, muy comúnmente radionúclidos, en particular ^{32}P. Sin embargo, también se pueden utilizar otras técnicas, por ejemplo nucleótidos modificados con biotina, para ser introducidos en un polinucleótido. Así, la biotina sirve como lugar de unión a avidina o a anticuerpos, que pueden estar marcados con diversas marcas, tales como radionúclidos, agentes fluorescentes, enzimas, o similares. De manera alternativa, se pueden emplear anticuerpos que puedan reconocer dúplices específicos, que incluyen dúplices de ADN, dúplices de ARN y dúplices de híbridos ADN-ARN, o dúplices ADN-proteína. A su vez, los anticuerpos pueden estar marcados, y se puede llevar a cabo un ensayo en el cual se fija el dúplex a una superficie, de manera que tras la formación de dúplices sobre la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpo unido al dúplex.

De manera alternativa, se puede medir la expresión génica mediante la transferencia y tinción Northern, a fin de cuantificar la transcripción de mARN (Thomas (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201-5205), tinciones de puntos, e hibridación in situ, o bien mediante métodos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de cortes de tejido y el análisis de cultivos celulares, o bien fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico.

Con técnicas inmunohistoquímicas de tinción se prepara una muestra de células, de manera típica mediante deshidratación y fijación, seguida por reacción con anticuerpos marcados específicos para el producto génico acoplado, siendo las marcas detectables visualmente, por ejemplo marcas enzimáticas, marcas fluorescentes, marcas luminiscentes, y similares. Hsu y otros (1980), Am. J. Clin. Path. 75: 734-738 describen una técnica de tinción particularmente sensible, adecuada para ser usada en la presente invención.

Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el análisis de muestras de fluidos pueden ser monoclonales o policlonales. De manera conveniente, se pueden preparar los anticuerpos contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN de interés. A continuación se pueden emplear estos genes como inmunógenos para preparar anticuerpos por técnicas bien conocidas. De manera alternativa se pueden aislar el producto génico natural y/o porciones del mismo, y emplearse como inmunógenos.

Aunque las líneas de células CHO son particularmente apropiadas para la aplicación de estos métodos, dichos métodos son empleados de manera rutinaria con cualquier célula anfitrión descrita en lo que antecede.

Se evalúan líneas celulares en cuanto a expresión de secuencias endógenas y en cuanto a la expresión del gen de interés. La detección de la expresión se puede realizar mediante inmunoensayo en busca de proteínas estructurales, mediante ensayo enzimático en busca de la actividad de transcriptasa inversa, mediante análisis de hibridación, transferencia y tinción (en inglés "blot") en busca de transcripciones de ARN, y examinando mediante microscopio electrónico cortes de células en busca de la presencia de productos génicos.

En otras realizaciones, se aíslan subclones con alto nivel de expresor mediante un cribado comparativo de rutina, tal como se ha descrito antes. Por ejemplo, se evalúan subclones de células parentales en cuanto a la expresión de secuencias de ARN mediante análisis de hibridación, transferencia y tinción, utilizando sondas consistentes en fragmentos de las secuencias de ácido nucleico del gen de interés. Líneas celulares transfectadas diferentes pueden variar significativamente en su nivel de expresión génica, y se prevé que también pueda producirse esta variación en subclones sin transfectar.

La invención contempla también esquemas de selección alternativos. Se pueden emplear muchos esquemas de selección directa dirigidos a los productos génicos. Una realización implica la incubación de una célula anfitrión en presencia de anticuerpos proteicos y complemento. El anticuerpo y el complemento lisan las líneas celulares que poseen expresor, y dejan sobrevivir sólo a las células que carecen de expresor. Puede requerirse algo de experimentación rutinaria con concentraciones de anticuerpo para seleccionar células con alto nivel de expresor en caso de que no existan células carentes de expresor en la población inicial.

Una segunda aproximación que emplea el clasificador de células activado por fluorescencia (siglas inglesas FACS), permite flexibilidad en la selección de células con alto y con bajo contenido de expresor. Se tiñen células anfitrión empleando anticuerpo primario anti-producto génico, y un segundo anticuerpo conjugado con fluoresceína. Las células con alto nivel de expresor presentan elevada fluorescencia, y las células con bajo contenido de expresor presentan escasa fluorescencia. Se utiliza la clasificación física de las células individuales mediante un aparato FACS, y de acuerdo con la intensidad de fluorescencia, para enriquecer una población de células que expresan niveles elevados del gen de interés. Rondas múltiples de clasificación FACS mejoran el procedimiento de selección. Una vez obtenida una población con alto nivel de expresión, se propagan subclones y se analizan de manera más rigurosa en cuanto a expresión génica, tal como se ha bosquejado anteriormente para el protocolo de cribado comparativo.

Deseablemente, las secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias endógenas y los genes de interés de esta invención están incorporadas en una célula anfitrión en más de una copia. Se ha encontrado que introduciendo ácido nucleico homólogo con respecto al ácido nucleico endógeno, a niveles de aproximadamente 5 a 10 \mug de ADN por célula, se obtienen resultados deseables. Para aquellas realizaciones en donde se deseen niveles de expresión mejorados, se puede aumentar considerablemente esta cantidad de ácido nucleico, por ejemplo en un factor de 10 ó 20 veces la cantidad antes citada, o en una cantidad cualquiera que sea suficiente para proporcionar el resultado deseado.

Esta invención abarca también la introducción de ácido nucleico en una célula o tejido de un animal, sea in vitro, in vivo o ex vivo. En algunos casos el ácido nucleico está destinado a reemplazar (o a actuar en lugar de) un gen endógeno funcionalmente deficiente, para conferir al anfitrión la capacidad de producir un polipéptido terapéutico, para efectuar la represión de un producto génico indeseado, o para estimular una respuesta inmunitaria. Los métodos para introducir ácido nucleico en dichas células o tejidos incluyen métodos para introducir in vitro ácido nucleico que han sido discutidos antes, y que incluyen también la inserción de ADN o ARN desnudos (por ejemplo mediante inyección del ácido nucleico en un tejido), la reintroducción en un tejido de una célula modificada ex vivo a fin de transcribir y expresar ácido nucleico heterólogo, el suministro de ácido nucleico en liposomas u otro vehículo, el uso de un vector tal como un virus, retrovirus, fago, plásmido, etc., o bien técnicas tales como la electroporación. En el artículo de Barsoum, DNA and Cell Biology, 9 (4):293-300 (1990), se discuten métodos de electroporación in vitro. Se puede utilizar la electroporación in vivo o ex vivo, por ejemplo inyectando el ácido nucleico deseado en un tejido, y aplicando después corriente - mediante electrodos u otro equipo adecuado - al tejido objetivo. También son adecuados para la práctica de esta invención otros métodos conocidos para introducir ácido nucleico en células o tejidos.

Esta invención abarca animales transgénicos que transcriben y expresan ácido nucleico heterólogo. Estos animales han sido producidos transfectando con ácido nucleico heterólogo células germinales, células somáticas o embriones, de acuerdo con los métodos de esta invención, y empleando secuencias endógenas para lograr la recombinación homóloga y la introducción de secuencias heterólogas. Las células o embriones modificados son implantados de manera adecuada y se deja que maduren para formar animales adultos que contienen el ADN heterólogo, o bien se permite que se integren de manera estable en los mismos. Un porcentaje reproducible de estos animales transcribe y expresa el ácido nucleico heterólogo como proteína que puede ser identificada en tejidos que incluyen la sangre o el suero. Los métodos para producir animales transgénicos están descritos en la patente de EE.UU. número 4,396,601.

La formulación y el modo de administración para el empleo in vitro serán determinados mediante los criterios experimentales antes descritos. Normalmente se emplearán formulaciones acuosas que sean compatibles con el medio de cultivo o de perfusión.

El ácido nucleico destinado a ser introducido en tejidos o en células, tanto in vivo como ex vivo, y las células o tejidos modificados, pueden ser formulados para ser administrados por vía parenteral en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, emulsión), asociados con un vehículo farmacéuticamente aceptable para la administración por vía parenteral. Estos vehículos son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos. Son ejemplos de tales vehículos agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y albúmina sérica humana al 5%. También se pueden emplear vehículos no acuosos tales como aceites fijos y oleato de etilo. Se pueden emplear liposomas como vehículos. El vehículo puede contener cantidades secundarias de aditivos tales como sustancias que incrementan la isotonía y la estabilidad química, por ejemplo tampones y conservantes.

Las células o tejidos de esta invención utilizados en terapia son formulados, y sus dosis son establecidas, de una manera consistente con la práctica médica correcta, teniendo en cuenta el trastorno que ha de ser tratado, el estado del paciente particular, el lugar de administración de la célula o tejido, el método de administración, y otros factores que son conocidos para los facultativos. Las células o tejidos son preparados para la administración de la manera que se ha descrito antes.

Se entiende que la aplicación de las enseñanzas de la presente invención a un problema o situación específicos se hallarán dentro de las capacidades de un especialista ordinario en la técnica, a la luz de las enseñanzas contenidas en la presente memoria. A continuación se ofrecen ejemplos de productos de la presente invención y métodos representativos para su aislamiento, uso y fabricación, pero no deben ser considerados como limitantes de la invención.

Ejemplos

La siguiente información de materiales y métodos se aplica a todos los ejemplos que siguen.

Células y cultivos celulares. Se hicieron crecer células de ovario de hámster chino DHFR menos, establecidas originalmente por Urlaub y Chasin, PNAS 77:4216-4220 (1980), en medio de cultivo celular basado en DMEM/Ham F12 estándar (Gibco), que había sido modificado en cuanto a su composición y la concentración de diversos aminoácidos. Este medio contiene los componentes glicina, hipoxantina y timidina, a fin de superar la deficiencia respecto a DHFR que presentas estas células ("medio modificado alfa").

Uno o dos días antes de la transfección se tripsinizaron las células, y se sembraron en placas de 60 mm a una densidad que permitiese aproximadamente 50%-70% de confluencia el día de la transfección.

Se llevaron a cabo las transfecciones con 5 \mug de ADN de plásmido purificado con CsCl_{2} (total), mezclando juntos dos o tres plásmidos en proporciones molares definidas, tal como se especifica en el ejemplo particular, uno de los cuales contenía el casette de expresión DHFR. El procedimiento utilizado era una modificación del método descrito por Graham y van der Eb, Virology 52: 456-457 (1973). En pocas palabras, se transfectaron células mediante la adición del precipitado de ADN con fosfato cálcico. Se dejó el precipitado durante 4 horas con las células. Después se cambió el medio por medio reciente, no selectivo, y se incubó a 37ºC. Al cabo de 48 horas se tripsinizaron las células y se distribuyeron en placas de 100 mm en medio selectivo que contenía suero fetal de bovino dializado, y que carecía de los componentes glicina, hipoxantina y timidina. En algunos experimentos se añadió metotrexato (MTX) al medio, a concentraciones que abarcaban desde 30 nM hasta 1000 nM, tal como se indicará. Se incubaron las células a 37ºC durante las 2 a 4 semanas siguientes, y se cambió el medio cada 3 ó 4 días hasta que surgieron colonias.

Análisis de transfecciones y evaluación de los niveles de expresión para los genes deseados. Algunas transfecciones fueron analizadas al cabo de 2 a 4 semanas en medio selectivo contando el número de colonias por placa. Esto se realizó lavando las placas con agua, y añadiendo después 2 ml por placa de una solución de PBS y etanol (1:1) que contenía 2% de azul de metileno. Se decantó el tinte al cabo de 2 minutos, y se eliminó el tinte residual lavando con agua. Se contó el número de colonias por placa utilizando un lector de placas conectado a vídeo (Artek).

Se analizaron los niveles de expresión de clones celulares individuales tras la expansión de los clones individuales a líneas celulares en placas de 6 pocillos. Se analizó el sobrenadante de los cultivos celulares tras la exposición durante 6 días a medio fresco, exento de suero (aproximadamente 8 x 10^{5} c/pocillo). Se emplearon inmunoensayos ligados a enzima para evaluar la expresión de las proteínas de interés segregadas (en estos ejemplos, activador de plasminógeno tisular recombinante (rtPA), y un anticuerpo híbrido (CD4IgG).

Secuencias de ADN endógeno, similar a retrovirus, procedentes de células CHO. Las secuencias retrovíricas empleadas en las transfecciones son miembros de dos tipos diferentes de familias de secuencias dentro del genoma de CHO. Una de las secuencias está relacionada con las secuencias IAP del hámster sirio - denominada en lo sucesivo familia I de secuencias IAP. Se ha aislado esta secuencia del genoma de CHO en forma de un fragmento de ADN genómico (EcoRI-Sal I) de 2,9 kilobases de longitud. También se ha utilizado un subfragmento de 0,4 kilobases de este ADN. El fragmento de 0,4 kilobases (Aha II-Pst I) representa parte de la secuencia 5' LTR del ADN similar a IAP de "longitud completa" de mayor tamaño, con 2,9 kilobases. Dicho ADN similar a IAP de "longitud completa" de 2,9 kilobases se extiende desde un sitio EcoRI aproximadamente 400 pares de bases hacia arriba del 5' LTR hasta un sitio Sal I dentro del 3' LTR. Este ADN similar a retrovirus posee una deleción interna de 4,5 kilobases que separa una parte importante del "genoma vírico" (Figura 1-1). Se ha estimado que el número de copias de esta familia de secuencias se sitúa en el intervalo de 100 a 300 por genoma haploide, Anderson y otros, J. Virology 64:2021-2032 (1990).

El segundo tipo de secuencias parecidas a retrovirus aisladas del genoma de CHO pertenece a una familia de secuencias que presentan homologías con virus de mamíferos de tipo C, Anderson y otros, J. Virology 181:305-311 (1991). De esta familia de secuencias se utilizó un fragmento de 6,6 kilobases que representa aproximadamente 70% de un genoma de retrovirus completo, 450 pares de bases hacia arriba del 5' LTR hasta un sitio Sal 1 situado 2 kb hacia arriba del 3' LTR. También se utilizó en las transfecciones un fragmento Pstl-Pstl interno, de 1,7 kb, que incluía el 5' LTR (Figura 1-2). Se ha estimado que la abundancia de esta familia de secuencias en el genoma CHO es también aproximadamente 100 - 300 copias por haploide.

Para la co-transfección se insertaron las secuencias de tipo IAp y de tipo C en vectores basados en pUC, o bien fueron incorporadas en el vector de expresión DHFR.

Ejemplo 1 Eficacia de transfección incrementada en co-transfecciones con plásmido DHFR y plásmidos que contienen ADN de retrovirus similares a IAP, procedente de células CHO

Se llevaron a cabo tres co-transfecciones en paralelo:

a) la transfección testigo se realizó con una proporción 1:9 entre el vector de expresión DHFR y un vector de expresión para CD4IgG.

b) se realizó otra transfección testigo con una proporción 1:1:8 entre el mismo vector de expresión DHFR, el vector de expresión CD4IgG, y un vector PUC.

c) la tercera transfección fue realizada con una relación molar 1:1:8 entre el mismo vector de expresión DHFR, el vector de expresión CD4IgG, y el vector PUC que contenía una inserción de 2,9 kb de una secuencia similar a retrovirus IAP.

Primeramente se sometió a selección un conjunto de placas en medio GHT-menos durante unas 2 semanas, hasta que se apreciaron visualmente colonias viables y saludables. Se tiñeron las colonias de la manera que se ha descrito antes, y se contaron. Se sometieron a selección un segundo, tercer y cuarto conjunto de placas en medio GHT-menos que contenía MTX a concentraciones 100 nM, 300 nM y 1.000 nM. El resultado está representado en la Figura 2, la cual muestra el número de colonias seleccionadas en co-transfecciones que contienen secuencias retrovíricas IAP y en co-transfecciones que carecen de las mismas.

En comparación con las dos transfecciones testigo a) y b), la transfección que contenía el ADN retrovírico produjo el mayor número de colonias, tanto en la selección en medio GHT-menos como en el medio que había sido suplementado con MTX. En esta parte del experimento, el efecto de la secuencia retrovírica era muy evidente: a concentraciones de MTX 200, 500 y 1.000 nM, respectivamente, sobrevivieron al procedimiento de selección 150, 26 y 9 colonias, mientras que en el caso del testigo 1, sólo dos colonias crecieron en MTX 200 nM y ninguna a concentraciones superiores. En el experimento testigo 2, 10 colonias crecieron con MTX 200 nM, y de nuevo ninguna a concentraciones superiores. El número ligeramente mayor de colonias que superaron la selección GHT en el caso del testigo 2 en comparación con el testigo 1 puede ser explicado por el empleo de un gran exceso de vector de expresión CD4IgG (10 veces) en este caso. En el testigo 2 se empleó una proporción de sólo 1:1 entre el vector de expresión DHFR y el vector CD4IgG. Por tanto, una fuerza contraselectiva debida a elevados niveles de expresión del ADN co-transfectado pudieron haber influenciado el resultado del experimento.

En general, se halló que la eficacia de la transfección resultó incrementada en gran medida cuando el fragmento de 2,9 kb de la secuencia similar a IAP fue co-transfectado junto con el plásmido de selección DHFR. Esto resulta más evidente en los casos más rigurosos, en los cuales se aplicó la selección a través de la adición de MTX al medio de cultivo celular. Sólo clones que expresasen niveles bastante elevados de la enzima DHFR podrían superar esta fase de selección.

Ejemplo 2 Eficacia de transfección incrementada en co-transfecciones con vector de expresión DHFR y plásmidos que contienen ADN retrovírico de tipo C, procedente de células CHO

En este ejemplo se co-transfectó en células CHO el plásmido que contenía DHFR junto con un plásmido que contenía o carecía de secuencias retrovíricas de tipo C. Se compararon dos secuencias retrovíricas de tipo C: un fragmento genómico de 6,6 kb de un clon provírico que contenía la secuencia 5' LTR y aproximadamente 60% de un genoma "de tipo C completo", o bien un fragmento subclonado de 1,7 kb que carecía de la porción distal del 5' LTR, y que cubría sólo aproximadamente 20% de un genoma de tipo C completo. Se insertaron ambas secuencias en pUC215. Como transfección testigo se utilizó el vector pUC215 (menos las secuencias retrovíricas).

Se midió de dos maneras la influencia de las secuencias retrovíricas de tipo C sobre las frecuencias de transfección. Inicialmente se contaron las colonias presentes tras la selección en medio GHT-menos. Estas representaban las frecuencias de transfección globales. No se observó diferencia entre los vectores que contenían tipo C y el vector pUC215 testigo. Sin embargo, cuando se combinaron las placas de colonias GHT-menos y se les sometió a selección con concentraciones de MTX 500 nM y 1 mM, se generaron significativamente más colonias por placa de 10 cm cuando los vectores contenían los fragmentos retrovíricos de 6,8 kb o de 1,7 kb (Figura 3). La secuencia retrovírica de 6,8 kb generó 3,6 veces más colonias con MTX 500 nM que el testigo, y produjo 4,4 veces más colonias al nivel de MTX 1 mM. De manera análoga, la secuencia retrovírica más corta dio como resultado un incremento moderado de 1,6 y 1,7 veces más colonias que el testigo a los dos niveles de MTX.

Ejemplo 3 Los niveles de expresión de clones celulares elegidos al azar, resultantes de transfecciones que contenían un ADN similar a retrovirus IAP de 2,9 kb, pero no uno de 0,4 kb, son mejores en comparación con transfecciones testigo

En este experimento se emplearon tres tipos de vectores de expresión DHFR:

a) un vector de expresión DHFR normal (testigo)

b) un vector de expresión DHFR que contenía una inserción de 2,9 kb de longitud de secuencia IAP, que representaba un genoma de retrovirus de longitud casi completa, con dos LTRs, pero que carecía de una gran región dentro del "genoma vírico".

c) un vector de expresión DHFR que contenía un fragmento de 0,4 kb derivado de la misma secuencia IAP, que representaba sólo una parte del extremo izquierdo del "genoma vírico".

Estos vectores de expresión DHFR fueron co-transfectados en proporción molar 1:10 con un vector de expresión para CD4IgG. Se clonaron colonias elegidas al azar, se expandieron hasta líneas celulares individuales, y se analizaron en cuanto a su expresión de CD4IgG empleando un ELISA para CD4IgG.

El procedimiento de selección posterior a la transfección fue realizado sólo con medio GHT-menos. En dos experimentos separados se clonaron 48 colonias (24 en cada experimento), y se expandieron a líneas celulares individuales para cada caso. Al no haber diferencias significativas en los resultados obtenidos cuando se analizó el mismo tipo de transfecciones de los dos experimentos, se evaluaron juntos los datos (Figura 4-1). En ambos experimentos, cuando se empleó la secuencia retrovírica de 2,9 kb de longitud (b), se obtuvo una frecuencia muy superior de clones celulares que expresaban el gen secundario de interés (CD4IgG) a altos niveles. El número de clones celulares que expresaban menos de 250 ng/ml fue inferior en la transfección con la inserción larga de ADN de retrovirus IAP. Un porcentaje superior de clones pertenecientes al grupo que poseía la inserción IAP larga mostró buena expresión de CD4IgG. Este resultado indica también que no existía diferencia en los niveles de expresión cuando se insertó una secuencia corta de ADN de IAP en el vector de expresión DHFR (Figura 4-1).

En la Figura 4-2 se muestra el porcentaje de clones celulares que expresaban al nivel de expresión aceptable de más de 500 ng/ml. Resulta evidente que en el caso de la inserción IAP de mayor tamaño se halló una frecuencia muy superior de buenos expresores.

En otro experimento de este tipo se evaluó el efecto de la orientación de la inserción de ADN retrovírico de 2,9 kb en el vector de expresión DHFR. Para ello se realizaron tres transfecciones de la manera antes indicada. En este experimento se emplearon cuatro tipos de vectores de expresión DHFR:

a) un vector de expresión DHFR normal (testigo más) (para inserciones con orientación más)

b) un vector de expresión DHFR normal (testigo menos) (para inserciones con orientación menos). La diferencia entre los dos plásmidos DHFR testigos es la orientación de un corto sitio de clonación múltiple de 35 pares de bases.

c) un vector de expresión DHFR que contenía la inserción de secuencia IAP de 2,9 kb de longitud, con orientación "más".

d) un vector de expresión DHFR que contenía la inserción de secuencia IAP de 2,9 kb de longitud, con orientación "menos".

Estos vectores de expresión DHFR fueron co-transfectados en proporción molar 1:10 con un vector de expresión para CD4IgG. Se clonaron 24 colonias de cada caso, elegidas al azar, se expandieron hasta líneas celulares individuales, y se analizaron en cuanto a su expresión de CD4IgG empleando un ELISA para CD4IgG.

En la Figura 4-3 se muestra el porcentaje de líneas celulares que expresaban CD4IgG a niveles superiores a 1.000 ng/ml.

Resulta evidente a partir de estos datos que la orientación de la secuencia de IAP no desempeña un papel en los niveles de expresión conseguidos en clones elegidos al azar. En el gráfico que sigue, se indican los títulos determinados individualmente para todos los clones analizados. En la Figura 4-4 se han combinado los datos de las dos orientaciones de los plásmidos DHFR testigo y de los plásmidos DHFR-IAP, y se presentan juntos.

Ejemplo 4 Niveles de expresión incrementados para rTPA (activador de plasminógeno tisular recombinante) de clones celulares elegidos al azar resultantes de co-transfecciones con un plásmido de expresión DHFR que contiene un fragmento de ADN de 2,9 kb, similar a retrovirus IAP, procedente de células CHO

Se midió la influencia de las secuencias IAP sobre la co-transfección con un gen de rtPA. Se emplearon dos plásmidos de expresión DHFR. Uno contenía los 2,9 kb de ADN similar a retrovirus IAP (IAP-DHFR), y el otro carecía de ello (DHFR-testigo). Se co-transfectó un vector de expresión rtPA separado. El plásmido de expresión rtPA fue incluido en la mezcla de co-transfección en un exceso molar décuple. Se evaluó el número de clones resistentes a MTX, así como el nivel de expresión génica de rtPA.

Después de la selección inicial GHT-menos, había aproximadamente 50% más colonias en las placas IAP-DHFR que en las placas DHFR testigo. Esto indica una frecuencia de transfección superior para el plásmido que contiene secuencias retrovíricas. Se midió el título de rtPA de estas placas iniciales cuando las mismas llegaron a ser confluentes. La población de células IAP-DHFR producía 15% más rtPA que las células testigo en medios selectivos GHT-menos, pero se produjo un incremento de 720% en la producción de rtPA por parte de una población de células IAP-DHFR seleccionadas en medio que contenía MTX 30 nM.

Se aislaron al azar clones individuales de las transfecciones con IAP-DHFR y de las transfecciones testigo, a partir de las placas de MTX 30 nM, y se evaluó su producción de rtPA. En la Figura 5 se muestran los perfiles de expresión. 36 de los 48 clones (un 75%) de la transfección testigo no expresaban niveles de rtPA detectables, mientras que sólo 12 de los 35 clones (un 34%) de la transfección IAP-DHFR se encontraban por debajo de los niveles de detección. El nivel de expresión de rtPA de 450 ng/ml y superior era significativamente mejor para los clones procedentes de la transfección con IAP-DHFR, 23%, comparado con sólo 4% para la situación testigo.

Claims (10)

1. Un método para obtener células animales que presentan una expresión incrementada de un gen heterólogo, que comprende:

a.

tomar una célula animal aislada que presenta una primera secuencia de ácido nucleico endógeno similar a retrovirus;

b.

introducir en dicha célula una segunda secuencia de ácido nucleico homóloga a dicha secuencia de ácido nucleico endógeno similar a retrovirus y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un gen heterólogo.

2. El método según la reivindicación 1, en el cual dicha secuencia de ácido nucleico endógeno similar a retrovirus es incapaz de formar virus infecciosos.

3. El método según la reivindicación 1, en el cual dicha tercera secuencia de ácido nucleico está bajo el control de secuencias de control de la transcripción.

4. El método según la reivindicación 1, en el cual dicha célula animal es una célula de ovario de hámster chino.

5. El método según la reivindicación 1, en el cual dicha célula animal es una célula de ovario de hámster chino y dicha secuencia de ácido nucleico endógeno similar a retrovirus está seleccionada del grupo compuesto por ácido nucleico que codifica partículas intracitoplasmáticas de tipo A, de tipo B o de tipo C.

6. El método según la reivindicación 1, en el cual dicha tercera secuencia de ácido nucleico es introducida en dicha célula en un número de copias mayor que el número de copias con que es introducida dicha segunda secuencia de ácido nucleico.

7. El método según la reivindicación 1, en el cual dicha primera secuencia de ácido nucleico endógeno está presente en el genoma de la célula en más de dos copias, estando además dicha primera secuencia de ácido nucleico dispersada por el genoma de la célula.

8. El método según la reivindicación 1, en el cual dicha primera secuencia de ácido nucleico endógeno está presente en un número de copias superior a 10 dentro del genoma de la célula.

9. El método según la reivindicación 1, en el cual dicha primera secuencia de ácido nucleico está situada en al menos dos cromosomas diferentes de la célula.

10. El método según la reivindicación 1, en el cual dicha segunda secuencia de ácido nucleico es introducida en dicha célula como un filamento único.