ES2237943T3 - Vectores de expresion que contienen un punto caliente para aumentar la expresion de proteinas recombinantes en celulas transfectadas. - Google Patents

Abstract

Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por: (a) la molécula de ácido nucleico que se contiene en el Número de Depósito ATCC 203153; (b) un fragmento de la SEC. Nº ID: 1, en el que dicho fragmento es capaz de incrementar la expresión de una proteína recombinante de interés cuando el mencionado fragmento de ácido nucleico se incorpora en un vector de expresión; (c) las secuencias de ácido nucleico que son idénticas en al menos un 80% en secuencia de nucleótido a la (a) ó (b), en la que dichas secuencias de ácido nucleico son capaces de incrementar la expresión de una proteína recombinante de interés cuando dichas secuencias de ácido nucleico se incorporan en un vector de expresión; y el complemente de una cualquiera de (a) a (c).

Description

Vectores de expresión que contienen un punto caliente para aumentar la expresión de proteínas recombinantes en células transfectadas.

Antecedentes de la invención

El desarrollo de sistemas de expresión para la producción de proteínas recombinantes es importante para proporcionar una fuente de una proteína dada para investigación o uso terapéutico. Se han desarrollado sistemas de expresión tanto para células eucariotas como E. coli como para células eucariotas, que incluyen tanto levadura como células de mamífero. La expresión en células de mamífero, por ejemplo células de ovario de hámster chino (o "CHO"), se prefieren a menudo para la fabricación de proteínas terapéuticas, ya que es más posible que las modificaciones post-traducción en este tipo de sistemas de expresión se parezcan a las que se encuentran en las células humanas que expresan proteínas que el tipo de modificaciones post-traducción que se producen en los sistemas de expresión microbianos (procariotas).

La transcripción de genes eucariotas se regula mediante una serie de elementos reguladores operadores cis- y trans- (Dillon y col.,(1993) Trends Genet. 9:134). Dos de los elementos cis mejor caracterizados son los promotores y potenciadores. Los promotores son secuencias de ADN en 5' inmediatamente a la secuencia de codificación del gen, y abarca múltiples emplazamientos de enlace para operar los factores de transcripción que actúan en trans, formando el equipo base de transcripción. Los potenciadotes están compuestos también por múltiples emplazamientos de enlace para operar factores de transcripción que actúan en trans, pero se pueden encontrar tanto aguas arriba como aguas abajo de las secuencias de codificación, e incluso en el interior de intrones. Estos elementos pueden también actuar en forma independiente de la orientación. Las actividades de los promotores y potenciadotes pueden detectarse en los sistemas de expresión no estacionaria, y contienen elementos que pueden ser o no específicos del tejido.

Otra categoría de elementos reguladores cis-operadores son los que se cree que regulan la estructura de la cromatina, incluyendo las regiones de control del locus ("LCR") (Grosveld y col., (1987) Cell 51:975), regiones de enlace con la matriz ("MAR") (Phi-Van y col., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:2302), regiones de enlace con el armazón proteico ("SAR") (Gasser & Laemmli (1987) Trends Genet. 3:16), elementos aislantes (Kellum & Schedl (1991) Cell 64:941) y asociados con la matriz nuclear (Bode J y col., (1992) Science 255:195). Los MAR y SAR son similares a los potenciadores en que son capaces de actuar a largas distancias pero son únicos en que sus efectos solo se pueden detectar en líneas celulares transformadas estables o en animales transgénicos. Los LCR son también distintos de los potenciadores en que son dependientes de la posición y orientación, y son activos de forma específica del tejido.

Los plásmidos de expresión recombinante que comprenden un gen de interés que codifica todo o parte de una porción de una proteína deseada se usan de forma rutinaria para generar células CHO estables, o transfectomas, que expresan la proteína recombinante deseada. Estos plásmidos recombinantes se integran de forma aleatoria en el genoma del huésped, produciendo proteínas recombinantes. Sin embargo, la frecuencia de transfectomas que transportan el gen recombinante integrado de forma estable que sean capaz de expresar una proteína recombinante deseada en niveles elevados es bastante baja. Normalmente, deben seleccionarse un número elevado de transfectomas de mamíferos transfectados de forma estable para identificar los clones que expresen las proteínas recombinantes en niveles elevados. Se cree generalmente que esto es debido a los efectos del entorno genómico (puntos calientes de recombinación) y del número de copias del plásmido, especialmente a la luz del elevado tamaño del genoma de mamífero y el hecho de que solo el 0,1% del ADN genómico contiene secuencias activas desde el punto de vista de la transcripción. (Little (1993) Nature 366:204). Es altamente infrecuente que la tecnología actual de la integración aleatoria de plásmido en el genoma de las células CHO de cómo resultado la inserción de un gen recombinante en un punto caliente de transfección capaz de una amplificación del gen que lleve a niveles elevados de expresión del gen.

Se han descrito secuencias que incrementan la expresión de una proteína recombinante (Morris, A., y col., Expression augmenting elements (EASE) for eukaryotic expression systems: WO 97/25420). Un incremento en la frecuencia de líneas celulares que expresen niveles altos de genes recombinantes produciría un juego de transfectomas que expresen proteínas entre los que elegir. Esta tarea puede llevarse a cabo generando plásmidos recombinantes homólogos dirigidos a un punto caliente de transcripción y diseñando un procedimiento para seleccionar los mencionados transfectomas.

Resumen de la invención

Se describen nuevas secuencias reguladores de la transcripción, a las que se denomina en el presente documento como HIRPE (Punto caliente para la expresión aumentada de proteína recombinante), que facilitan la expresión aumentada de proteínas recombinantes en células huésped de mamífero. Una forma de realización preferida es un HIRPE que se obtuvo a partir de ADN genómico de células de CHO.

La presente invención describe un HIRPE procedente de un locus genómico en el genoma de CHO que es capaz de una expresión del gen recombinante elevada. Estos loci contienen elementos de secuencia que definen el origen de la replicación, la amplificación del gen y los MAR en el genoma de un mamífero. En una forma de realización de la invención más preferida, los HIRPE se seleccionan del grupo que consiste de: (a) ADN que comprende nucleótidos del 1 al 5006 de la SEC. Nº ID: 1; (b) fragmentos de la SEC. Nº ID: 1 que tienen actividad HIRPE; (c) secuencias de nucleótido complementarias a las (a) y/o (b); (d) secuencias de nucleótido que son al menos aproximadamente el 80%, de forma más preferible aproximadamente el 90%, y de forma más preferible aproximadamente el 95% idénticas a la secuencia de nucleótido de (a), (b) y/o (c) y que presentan actividad HIRPE; y (e) combinaciones de las secuencias de los ácidos nucleicos anteriores que presentan actividad HIRPE.

Los vectores de expresión que comprenden los nuevos HIRPE son capaces de transformar células CHO para incrementar la expresión de proteínas recombinantes. De esta forma, otra forma de realización de la invención es un vector de expresión que comprende un HIRPE. En una forma de realización preferida, el vector de expresión comprende además un promotor / potenciador eucariota que induce la expresión de todo o parte de una proteína de interés. Se pueden usar dos o más vectores de expresión para transfectar una célula (por ejemplo, una célula CHO) en la que cada vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica polipéptidos diferentes que se ensamblan (cuando se expresan) para formar una proteína deseada. En una forma de realización más preferida, el vector de expresión comprende un plásmido, en el que un primer exón codifica un gen de interés y un segundo exón codifica un marcador seleccionable dominante amplificable. Un marcador preferido es la dihidrofolato reductasa ("DHFR"); otros marcadores amplificables son también adecuados para uso en los vectores de expresión de la invención.

Las células huésped de mamífero pueden transformarse con un vector de expresión de la presente invención para producir niveles elevados de proteína recombinante. De acuerdo con ello, otra forma de realización de la invención proporciona una célula huésped de mamífero transformada con un vector de expresión de la presente invención. Quedan también dentro del alcance de la presente invención células huésped de mamífero transformadas con dos vectores de expresión, en la cada uno de los dos mencionados vectores de expresión codifica una subunidad de polipéptido que cuando se expresan a la vez se ensamblan en una proteína deseada con actividad biológica. En una forma de realización más preferida, las células huésped son células CHO.

La invención proporciona también un procedimiento para obtener una proteína recombinante, que comprende transformar una célula huésped con un vector de expresión de la presente invención, cultivar la célula huésped transformada en condiciones que promuevan la expresión de la proteína, y recuperar la proteína. En una aplicación preferida de la invención, las células huésped transformadas se seleccionan en dos etapas de selección, la primera para seleccionar las células que expresen el marcador amplificable dominante, y la segunda etapa para niveles elevados de expresión y/o amplificación del gen marcador, así como del gen de interés. En una forma de realización preferida, la proteína recombinante comprende CTLA4-Ig o una variante de la misma, tal como una variante de sustitución, adición o borrado de la secuencia de aminoácidos para producir formas diferentes de una molécula CTLA4-Ig. Para una extensa revisión de CTLA4 y de las proteínas de fusión de CTLA4 (por ejemplo, CTLA4-Ig), ver el documento WO 93/00431,

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la clonación del emplazamiento de integración de CTLA4-Ig en la línea celular que expresa CTLA4-Ig, denominada en el presente documento como línea celular "P". La Figura 1A muestra un Southern blot en el que un fragmento EcoRI de 5,5 kb representa el cromosoma nativo tanto en el huésped DG44 como en las líneas celulares CHO P. Las bandas de 8,0 kb y 10,0 kb de la fila 2 representan las regiones laterales izquierda y derecha reordenadas, respectivamente. La Figura 1B muestra que los fragmentos de EcoRI clonados que contienen las regiones lateral izquierda (fila 1) y lateral derecha (fila 2) del emplazamiento de integración en la línea celular P migran conjuntamente con el ADN genómico digerido de EcoRI procedente de la línea celular P.

La Figura 2 representa la organización molecular del emplazamiento de integración CTLA4-Ig en la línea celular P. Muestra una secuencia genómica idéntica de 5,0 kb que flanquea ambos extremos del gen CTLA4-Ig; una secuencia conservada rica en A-T, una secuencia similar a un MAR (regiones asociadas a la matriz); y una secuencia parecida a Alu.

La Figura 3 muestra un diagrama esquemático de un vector de recombinación insercional homólogo, pTV(I).

La Figura 4 muestra un diagrama esquemático del vector de recombinación de sustitución homólogo pTV(R).

La Figura 5 muestra un análisis mediante Southern blot que confirma la integración específica del emplazamiento en transfectomas que contienen el vector de recombinación insercional, pTV(I).

La Figura 6 muestra un análisis mediante Southern blot que confirma la diana específica del emplazamiento en transfectomas que contienen el vector de recombinación de sustitución , pTV(R). La transferencia muestra una banda de 3,5 kb en los 5 clones que sugiere que el vector de sustitución hace diana en un locus genómico similar.

La Figura 7 muestra una representación diagrama de los fragmentos LFR y RFR según se analizan mediante análisis Southern blot y cartografía mediante enzimas de restricción.

La Figura 8 muestra el efecto de la secuencia conservada rica en A-T sobre la expresión del gen recombinante. La figura proporciona la expresión de CTLA4-Ig en \mug/ml a partir de los cuatro transfectomas superiores que pueden contener la secuencia de ácido nucleico de longitud completa de 5,0 kb; 1,6 kb de secuencia de ácido nucleico (que incluye la secuencia conservada rica en A-T); o una región de 1,4 kb que no incluye la secuencia conservada rica en A-T.

La Figura 9 muestra los oligonucleótidos usados para obtener la HIRPE de la presente invención.

La Figura 10 muestra que la HIRPE de la presente invención mejora la expresión de CTLA4-Ig.

La Figura 11 muestra que los vectores de inserción y sustitución producen resultados similares.

Descripción detallada de la invención

Los solicitantes han aislado e identificados nuevos elementos de secuencia que pueden mejorar la expresión de proteínas indicadoras de dos a diez veces en bibliotecas celulares estables cuando se insertan en un vector de expresión. Denominamos a estos nuevos elementos de secuencia como HIRPE (punto caliente para la expresión aumentada de proteína recombinante).

Se ha depositado un clon de ADN que contiene una molécula de ácido nucleico de la presente invención en la American Type Culture Collection ("ATCC") (10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209) el 25 de agosto de 1998, con el número de depósito / acceso 203153. Los depósitos a los que se refiere el presente documento se mantendrán bajo los términos del Tratado de Budapest acerca del reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a efectos del Procedimiento de Patentes. Se proporciona este depósito meramente a conveniencia de los expertos en la técnica, y no es una admisión en la que se requiera un depósito bajo 35 U.S.C. \NAK112. La secuencia de polinucleótidos contenida en el material depositado se incorpora en el presente documento como referencia, y es controlante en cualquier caso de conflicto con cualquiera de las secuencias del presente documento. Se necesita licencia para fabricar, usar o comercializar los materiales depositados, y no se proporciona licencia mediante la presente.

La presente invención se refiere a la identificación de un emplazamiento de integración de una proteína recombinante en el genoma de una célula huésped CHO, y a la construcción de vectores de recombinación homólogos para conseguir una expresión del gen recombinante elevada en células CHO. De forma más particular, la presente invención se refiere a la identificación de un emplazamiento de integración CTLA4-Ig en el genoma huésped del CHO DG44.

La actividad HIRPE se ha identificado en las regiones laterales de ambos extremos de un gen que codifica una proteína de interés. Como se explica con más detalle más adelante, las regiones laterales se separaron y secuenciaron para determinar la nueva secuencia HIRPE que se describe en el presente documento. Los cebadores de ADN usados para obtener la secuencia HIRPE están detallados (Figura 9). La nueva secuencia HIRPE de la presente invención comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico (SEC. Nº ID: 1):

1

2

3

4

De forma adicional, la presente invención abarca fragmentos de la SEC. Nº ID: 1 que muestran también actividad HIRPE. Un ejemplo preferido de un fragmento útil en la presente invención es una secuencia de 1,6 kb que comprende los nucleótidos del 3059 al 4709 de la SEC. Nº ID: 1.

Lo vectores de expresión que comprenden la secuencia aislada de 5,0 kb (SEC. Nº ID: 1) y los fragmentos más cortos de la misma son capaces de transformar células CHO y dar como resultado elevados niveles de expresión de proteína. El HIRPE nuevo presente es útil para mejorar la expresión de una proteína recombinante dirigida por una región de promotor / potenciador a la que está enlazada.

Más aún, pueden identificarse fragmentos adicionales de la de la SEC. Nº ID: 1 que presentan actividad HIRPE, así como otras secuencias conservadas HIRPE similares procedentes de otros tipos de células o de otros emplazamientos de integración en células transformadas. Además, es conocido en la técnica que el procesado posterior de fragmentos de ADN preparados mediante digestión con enzimas de restricción puede dar como resultado la eliminación de nucleótidos adicionales de los extremos de los fragmentos.

Pueden desarrollarse también otras combinación de segmentos de la SEC. Nº ID: 1, por ejemplo, secuencias que incluyen copias múltiples de todo o parte de la SEC. Nº ID: 1. Dichas combinaciones pueden enlazarse de forma contigua, u ordenarse, para proporcionar una separación óptima de los fragmentos. Quedan adicionalmente dentro del alcance de la presente invención los vectores de expresión que comprenden la secuencia de la SEC. Nº ID: 1 ordenada con secuencias de inserción en la misma, (por ejemplo, inserción de un gen que codifica una proteína seleccionada en un determinado emplazamiento deseado en la SEC. Nº ID: 1).

El HIRPE descrito en el presente documento fue aislado a partir de células CHO. Se espera que existan secuencias homólogas que incrementen la expresión de proteína en células procedentes de otras especies de mamíferos, así como en líneas celulares derivadas de otros tipos de tejidos, y pueden aislarse mediante técnicas que son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, hibridación interespecies o técnicas basadas en la PCR. Además, se pueden hacer cambios en la secuencia de nucleótidos que se presenta en la SEC. Nº ID: 1 o en los nucleótidos 3050 a 4676 de la SEC. Nº ID: 1 mediante direccionamiento del emplazamiento o técnicas de mutagénesis aleatoria que son conocidas en la técnica. Las variantes resultantes de HIRPE se pueden ensayar para actividad HIRPE tal como se describe en el presente documento. Los ADN que son al menos de aproximadamente el 80%, de forma más preferible aproximadamente del 90%, y de forma más preferible aproximadamente del 95% idénticos en su secuencia de nucleótidos a la SEC. Nº ID: 1, o fragmentos de los mismos, que tengan actividad HIRPE, se pueden aislar con experimentos de rutina y se espera que tengan actividad HIRPE. Para fragmentos de la SEC. Nº ID: 1, el porcentaje de identidad hace referencia a la porción de la secuencia nativa de referencia que se encuentra en el fragmento. De acuerdo con ello, los homólogos de la secuencia HIRPE descrita y variantes de la misma quedan también comprendidos en la presente
invención.

Los vectores de expresión recombinantes incluyen fragmentos sintéticos o fragmentos de ADN derivados de ADNc que codifican una proteína, enlazados de forma operativa con elementos reguladores de transcripción o traducción derivados de genes de mamífero, virus o insectos. Dichos elementos reguladores pueden incluir un promotor de transcripción, una secuencia que codifica un ARNm adecuado para enlace en emplazamientos de ribosomas, y secuencias que controlen la finalización de la transcripción y traducción. Los vectores de expresión de mamíferos pueden también comprender elementos no transcritos tales como el origen de la replicación, un promotor y potenciador adecuados ligados con el gen a expresar, otras secuencias laterales no transcritas 5' ó 3', secuencias 5' ó 3' no traducidas, tales como los emplazamientos de enlace necesarios del ribosoma, un emplazamiento de poliadenilación, emplazamientos de empalmes donantes y aceptores, y secuencias de finalización de la transcripción. También se puede incorporar un origen de replicación que confieren la capacidad de replicarse en un huésped, y un gen seleccionable para facilitar el reconocimiento de transformantes.

Las regiones de ADN están ligadas de forma operativa cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, un promotor está ligado de forma operativa con una secuencia de codificación si controla la transcripción de la secuencia; o un emplazamiento de enlace en un ribosoma está ligado de forma operativa con una secuencia de codificación si ésta se coloca de forma que permita la traducción. Las secuencias de control de transcripción y traducción en los vectores de expresión usados en células transformadas son conocidas en la técnica.

Las células huésped transformadas son células que se han transformado o transfectado con vectores de expresión constituidos usando técnicas de ADN recombinante, y que contienen secuencias que codifican todo o parte de proteínas recombinantes. Las proteínas expresada se segregan de forma preferible en el cultivo celular sobrenadante, dependiendo del ADN seleccionado, pero pueden depositarse en la membrana de la célula. Se pueden emplear diferentes sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar proteína recombinante, todos ellos bien conocidos en la técnica, tales como las líneas COS de células de riñón de mono, células CHO, células HeLa, y líneas celulares BHK.

Una línea celular comúnmente usada es la línea celular DHFR^{-} CHO, que es auxótrofa para la glicina, timidita e hipoxantina, y que se puede transformar en el fenotipo DHFR^{+} usando un ADNc DHFR como marcador dominante amplificable. Una de estas líneas celulares DHFR^{-} CHO conocidas es DKXB11 (Urlaub y col., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216). Otras líneas celulares desarrolladas para la selección específica o esquemas de amplificación serán también útiles con el nuevo HIRPE de la presente invención.

Son conocidos en la técnica diferentes protocolos de transformación, y están revisados, por ejemplo, en Kaufman et. al., (1988) Meth. Enzymology 185:537. El protocolo de transformación elegido dependerá del tipo de célula huésped y de la naturaleza del gen de interés, y puede seleccionarse con experimentación de rutina. Las necesidades básicas de un protocolo de este tipo es en primer lugar introducir un ADN que codifique una proteína de interés en una célula huésped adecuada, y a continuación identificar y aislar las células huésped que hayan incorporado el ADN que codifica la proteína de interés de forma estable y expresable. Pueden encontrarse ejemplos de procedimientos útiles para introducir un ADN que codifica una proteína de interés en Wigler y col., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; Schaffner (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2163; Potter et.al, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161; y Shigekawa (1988) BioTechniques 6:742.

Un procedimiento para amplificar el gen de interés es también deseable para la expresión de la proteína recombinante, e implica típicamente el uso de un marcador de selección. La resistencia a los fármacos citotóxicos es la característica más frecuentemente usada como marcador de selección, y puede ser el resultado bien de un rasgo dominante (es decir, se puede usar de forma independiente al tipo de célula huésped), o bien un rasgo recesivo (es decir, útil en un tipo concreto de célula huésped que sea deficiente en alguna actividad para la que se selecciona. Son adecuados varios marcadores amplificables para uso en la presente invención (por ejemplo, como se describe en Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)). Entre los marcadores de selección adecuados para la amplificación de genes en células de mamíferos resistentes a fármacos se incluyen resistencia DHFR-MTX (metotrexato) (Alt y col., (1978) J. Biol. Chem. 253:1357; Wigler et. al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567), y otros marcadores conocidos en la técnica (como los que se revisan, por ejemplo, en Kaufman y col., (1988) Meth. Enzymology 185:537).

Se pretende que los siguientes ejemplos sean ilustrativos de una forma de realización de la presente invención, y no limitan en forma alguna el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Identificación del HIRPE de la presente invención

La línea celular P de CHO es una línea celular que expresa altos niveles de la proteína CTLA4-Ig. Esta línea celular se seleccionó usando el procedimiento más preferido para producir líneas celulares de mamífero que implica la integración aleatoria. El plásmido de expresión en el mamífero usado para generar la línea celular P es un plásmido pADNC3 modificado (disponible de Invitrogen, Inc.). El gen DHFR se diseñó en este vector para actuar como marcador de selección dominante. La expresión del cassette del gen recombinante en este plásmido se impulsa mediante el promotor CMV y la secuencia de poliadenilación BGzH. El análisis del ADN genómico de la línea celular P sugiere que la línea celular tiene copias múltiples del plásmido de ADN integrado de forma estable. Esta amplificación del plásmido de ADN dio como resultado la amplificación conjunta del ADN que codifica el gen CTLA4-Ig que conduce a una línea celular que expresa CTLA4-Ig de manera elevada.

Los que sean expertos en la técnica de generar transfectomas de CHO usando vectores de integración aleatorios comprenderán que los vectores que contienen un gen DHFR como marcador de selección se tienen que integrar en un punto caliente de transcripción, y amplificar con éxito el número de copias del gen con el fin de generar una línea celular muy expresiva. El porcentaje de células transfectadas que amplifican el gen de forma suficiente es esperadamente bajo, puesto que la evidencia de la bibliografía sugiere que los loci genómicos capaces de la amplificación del gen en genoma de mamíferos sor raros (Robbins (1981) Cell 23:29); McArthur (1991) J. Biol. Chem. 266:6000). Los locus genómicos adyacentes al emplazamiento de integración del plásmido CTLA4-Ig en la línea celular P representan uno de los únicos loci con los elementos necesarios para la amplificación del gen con un elevada actividad de transcripción.

La construcción de vectores de recombinación homólogos para liberar genes recombinantes en los locus genómicos adyacentes al del CTLA4-Ig en las células CHO requiere la clonación del ADN genómico lateral procedente de la línea celular P, e insertar el fragmento clonado en un vector de expresión eucariota apropiado, usando procedimientos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Yarnold y col., (1994) Cancer Research 54:506; Adair (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4574; Smith y col., (1989) J. Mol Bio. 213:415). Esta tarea se llevó a cabo cartografiando en primer lugar el emplazamiento de los fragmentos de ADN generado con EcoRI que flanquean el emplazamiento de integración, seguido de la construcción de una librería genómica de CHO en E. coli, y el aislamiento de los plásmidos de ADN individuales que contienen los fragmentos genómicos.

Un análisis Southern blot facilitó la cartografía del emplazamiento de integración CTLA4-Ig en las células CHO (Figura 7). Los solicitantes emplearon una estrategia denominada "paseo de ADN", usando el análisis Southern blot para analizar el emplazamiento de integración en la línea celular CHO P. El procedimiento del paseo de ADN emplea una secuencia de un plásmido de ADN conocido para caracterizar el ADN genómico de CHO desconocido que flanquea la secuencia del plásmido. Para analizar el emplazamiento de integración CTLA4-Ig, se digirieron aproximadamente diez microgramos del ADN genómico de CHO con 100 unidades del enzima de restricción EcoRI (New England Biolabs). El ADN genómico digerido con restricción se sometió a electroforesis en gel de agarosa sobre geles de agarosa al 0,7% a 15 voltios durante 12 horas. Este procedimiento resolvió el ADN por tamaño molecular con el ADN de mayor peso molecular en la parte superior.

El ADN genómico embebido en los geles de agarosa se desnaturalizó en NaOH 0,4 M durante aproximadamente 30 minutos, y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 micrómetros (Boehinger and Mannaheim) durante 90 minutos usando un trasferidor de vacío (Bio-Rad). El filtro transferido se neutralizó en tampón 2 x SSPE, y el ADN se entrecruzó con la membrana usando un equipo de entrecruzamiento UV (Stratagene, en el punto de ajuste C3 durante 20 segundos). La sonda de hibridación de 1,2 kb usada en el Southern blot fue un fragmento PCR que fue marcado con digoxigenina mediante un kit de marcado Boehringer Mannheim. El fragmento PCR se derivó del gen de la beta-lactamasa bacteriana, y se preparó usando los siguientes cebadores oligonucleótidos: cebador directo:

GGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC, (SEC. Nº ID: 14); cebador inverso;

CGGTCAGCCTTGCCTTGTTGTAG, (SEC. Nº ID: 3).

El ADN marcado con digoxigenina se detectó usando un kit de detección por quimioluminiscencia (Boehringer Mannheim). El filtro de nitrocelulosa con el ADN genómico se hibridó con cinco microlitros de la sonda de hibridación en 5 ml de tampón de hibridación Eazy (Boehringer Mannheim) durante 16 horas a 68ºC. El filtro se lavó dos veces en 2 x SSC a 65ºC durante 30 minutos y el filtro se desarrolló mediante el kit de detección por quimioluminiscencia (Boehringer Mannheim) durante 5 minutos. Este análisis Southern blot reveló una región lateral izquierda de CHO de 7,5 kb ("LFR") que se hibridó con la sonda de beta-lactamasa. La cartografía de restricción del fragmento de 7,5 kb reveló que contenía un plásmido de ADN de 2,5 kb con el gen de la beta lactamasa y un ADN genómico CHO. De forma similar, el ADN genómico procedente de CHO digerido mediante EcoR I en Southern blots se sondeó con ADN de plásmido que contenía el gen de 0,9 kb CTLA4-Ig como sonda de hibridación, generada a partir de una reacción PCR (cebadores de PCR: cebador directo GCATCTCCAGGCAAAGCCACTGAGGTCCG (SEC. Nº ID: 4); cebador inverso CACGGAGCATGAGAAGACGTTCCCCTGCTG (SEC. Nº ID: 5)). La preparación de la sonda de hibridación marada con digeoxigenina y las condiciones de hibridación fueron exactamente idénticas a las anteriormente descritas. Sin embargo, puesto que la sonda de hibridación usada para estudiar las regiones laterales derechas se derivan del gen CTLA4-Ig (en lugar del gen de la beta lactamasa), el análisis Southern blot reveló una banda de ADN en la región lateral derecha de 10,0 kb ("RFR"). Este fragmento de ADN híbrido contiene 5,0 kb de un plásmido de ADN (CTLA4-Ig y gen dhfr) y otro de 5,0 kb de CHO de ADN genómico (Figura 7).

Basándose en análisis Southern blot, se usó ADN genómico procedente de la línea celular P de CHO para clonar los fragmentos genómicos laterales de 7,5 y 10,0 kb. Se aisló ADN genómico procedente de CHO a partir de 1 x 10^{8} células de CHO que crecieron en 200 ml de medio libre de suero PFCHO. Tras centrifugación, el residuo celular se procesó para aislar el ADN genómico usando un kit de extracción de ADN (Stratagene Inc.). Este procedimiento produjo 10 miligramos de ADN genómico total.

Para enriquecer el ADN genómico procedente de CHO digerido con EcoRI que contenía la secuencia genómica lateral, se digirió un miligramo de ADN genómico con 1000 unidades del enzima EcoRI (New England Biolabs #101S - 20 unidades/microlitro) a 37ºC. durante 6 horas. La digestión con EcoRI se terminó mediante extracción con fenol y precipitación con etanol. El residuo de etanol se redisolvió en 200 microlitros de agua y se sometió a electroforesis en lecho de agarosa en tampón Tris-Acetato a voltaje constante voltaje (50V) (unidad de electroforesis Life Technologies, Modelo 250). El ADN genómico separado por tamaños fue enriquecido en ADN entre los intervalos de pesos moleculares de 6,0-12,0 kb, y se sacó del gel usando un kit para extracción en gel QIAEX (Qiagen Inc#20021). Este procedimiento produjo 26 microgramos de fragmentos de ADN procedentes de CHO digeridos por tamaños mediante EcoRI.

Un microgramo de ADN genómico con los extremos EcoRI se insertó en un plásmido bacteriano (pSTKN) digerido de forma similar que contenía el gen de la kanamicina fosfotransferasa, que confiere resistencia al antibiótico kanamicina. Se usó la ligasa T4 ADN (New England Biolabs) para ligar los ADN genómico y del plásmido para generar la librería genómica de CHO. El ADN genómico ligado procedente de CHO se transformó en el interior de E. coli (XL1 Blue MRF' Stratagene Inc., #200230) usando un equipo de electroporación (Bio-Rad #), generando la librería genómica de CHO en E. coli.

Para clonar la región lateral izquierda de 7,5 kb se aprovechó la presencia de un gen de la beta lactamasa que confería resistencia al antibiótico ampicilina. Las células de E. coli que contenían la biblioteca genómica se seleccionaron directamente para los clones resistentes a ambos antibióticos (amp^{R} y Kn^{R}); el gen amp^{R} estaba proporcionado por el fragmento LFR mientras que el plásmido bacteriano (pSTKN) proporcionó el gen Kn^{R}. Este procedimiento produjo ocho clones bacterianos resistentes a ambos antibióticos. Un análisis rápido del ADN del plásmido de ADN procedente de estos clones esperados produjo plásmidos con un fragmento EcoRI de 7,5 kb según se esperaba, indicando la presencia del fragmento LFR.

La clonación de la región lateral derecha de 10,0 kb implicó técnicas de biología molecular convencional de hibridación en colonias usando un gen CTLA4-Ig (ADN) marcado con P^{32}como sonda de hibridación. El procedimiento de hibridación en colonias se describe en el Molecular Cloning Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory). La sonda de hibridación con el gen específico CTLA4-Ig marcado radiactivamente (\ding{36} P^{32}dCTP) se preparó usando un kit de traducción Nick procedente de Amersham Life Sciences (#N5000). Se seleccionaron aproximadamente un millón de clones de E. coli para aislar seis posibles clones que contenían el fragmento de 10,0 kb. Una nueva selección de los posibles clones en una segunda vuelta de la hibridación de colonias generó únicamente dos positivos. El plásmido de ADN procedente de los dos posibles clones se aisló mediante aislamiento del plásmido de ADN con minilisato (tal como se describe en Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)). Ambos clones generaron el esperado fragmento de EcoRI de 10,0 kb, indicando la clonación con éxito del fragmento RFR.

La comparación de un modelo de digestión con enzimas de restricción de los clones genómicos de 7,5 kb y 10,0 kb reveló bandas de ADN de tamaño común que invocaban la duplicación del ADN genómico en el emplazamiento de la integración del plásmido. Esto se confirmó mediante análisis de la secuencia de ADN usando un secuenciador automático (Applied Biosystems-PRISM 310 Genetic Analyzer). Estos dos resultados sugieren que las secuencias laterales derecha e izquierda son idénticas, y aparecen mediante duplicación del ADN en el emplazamiento de integración (Figura 2). Estas secuencias se denominan en el presente documento como FGS (secuencias genómicas laterales).

El análisis de la secuencia de ADN del ADN genómico de 5,0 kb reveló varias características únicas. Una búsqueda de homologías de ADN mediante el programa de análisis de datos de secuencia de ADN GCG Wisconsin sugirió que la secuencia representa un punto caliente de transcripción. El FGS clonado contenía una secuencia constante de ADN similar a la Secuencia Autónoma de Consenso (SRS) que se encuentra en células de levadura y de CHO. (Sohn y col., (1996) Journal de Bacteriology 78(15):4420; Mark y col., (1990) J. Mol. Biol. 211:19). Igualmente, la FGS contenía secuencias conservadas similares a las MAR encontradas de forma habitual en puntos calientes de transcripción (Harmutt y col., (1995) Biochemistry 34:4108). Con esta información de que el ADN clonado es un punto caliente de transcripción para las células CHO, procederemos a construir vectores de recombinación homólogos.

Se piensa que la integración de ADN exógeno en el genoma de un mamífero se produce más frecuentemente mediante un procedimiento que esta asociado con la rotura del ADN en emplazamientos aleatorios en el genoma diana. Recientemente se han propuesto modelos para la amplificación de genes endógenos, así como la amplificación de ADN heterólogo transfectado. Un componente de estos modelos es implicar la duplicación invertida de gran tamaño en los emplazamientos de integración como primera etapa en la amplificación de genes (Heartlein M. W., et. al., (1988) Nucleic Acid Research 17(4):1697-1716; Passananti C., et. al., (1987) EMBO J. 6:1697-1703). Un componente esencial de este modelo es la integración del plásmido de ADN en un elemento repetitivo rico en A-T en el genoma huésped como prerrequisito para la formación de repeticiones invertidas y posterior amplificación del gen.

La presencia de duplicaciones invertidas en el emplazamiento de integración CTLA4-Ig en la línea celular P, y la presencia de tres elementos repetitivos diferentes en la secuencia HIRPE están de acuerdo con el modelo propuesto. La presencia de elementos repetitivos en la secuencia HIRPE en un vector de recombinación homólogo insercional podría facilitar la incorporación de la repetición invertida y la amplificación del gen necesaria para una expresión elevada.

Ejemplo 2 Vectores de recombinación

La recombinación homóloga se considera una herramienta poderosa para la manipulación genética en levaduras que permite la integración de un gen específico en un emplazamiento preciso y la expresión del gen de interés (Orr-Weaver, T. L., et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78(10):6354-8). Sin embargo, la aplicación potencial de la tecnología de recombinación homóloga en células de mamífero cultivadas queda superada por sucesos ilegítimos de recombinación y la falta de técnicas de selección apropiadas. La inserción homóloga de un gen recombinante en un punto caliente permite estudiar el aumento de frecuencia de líneas celulares que expresan grandes cantidades de proteínas recombinantes. Este concepto ha sido descrito en una publicación anterior como ejemplo de cómo generar un sistema de expresión de anticuerpos por recombinación homóloga para células de murina (Gregory y col., WO 95/17516).

Sin embargo, la presente invención se diferencia de lo que se conoce en la técnica por su aplicabilidad más amplia a todos los genes recombinantes, la elección del locus genómico de CHO, la capacidad para amplificar de forma consistente los genes recombinantes clonados y en la generación de una duplicación genómica en el emplazamiento de integración del plásmido.

Tal como se ha descrito anteriormente, los vectores de recombinación homólogos son vectores de expresión eucariotas que contienen los elementos necesarios para la transcripción y traducción de genes a proteínas. Los vectores de recombinación homólogos descritos en el presente documento son vectores rediseñados derivados del vector pADNc3 (Invitrogen Inc.) que contienen el gen DHFR como marcador de selección dominante. Este vector de expresión puede introducirse en las células huésped de CHO DG44 y DUKXB11 deficientes en el enzima dihidrofolato reductasa, y se seleccionan los transfectomas frente al fondo complementando la función del gen DHFR (el metabolismo del metotrexato en células de ovario de hámster chino mutante carecen de la dihidrofolato reductasa (Joannon P., y col., (1987) Biochem-Pharmacol. 36(7):1091; Urlaub y col., (1980) Proc. natl. Acad. Sci. USA 77:4216).

El vector de recombinación insercional homólogo, marcado como pTV(I) contiene la secuencia completa del ADN genómico clonado de 5,0 kb del HIRPE (SEC. Nº ID: 1) (Figura 3). Este fragmento genómico se reconstruyó con un emplazamiento de restricción Not I en el extremo 5' y un extremo ciego (romo) en 3', y se clonó en un vector de expresión pADNc/DHFR/CTLA4-Ig que se hubo digerido previamente con emplazamientos de restricción compatibles. El vector homólogo resultante pTV(I) contenía el ADN genómico procedente de CHO en el extremo 5' del gen recombinante CTLA4-Ig (Figura 3). El plásmido de ADN se purificó usando el Midi-Plasmid Isolation Kit que comercializa QUIAGEN Inc. El plásmido pTV(I) se linealizó con el enzima de restricción EcoR I y se electroincorporó en las células CHO DG44.

Tras un corto periodo de recuperación (72 horas) en medio PFCHO (JRH Biosciences, suero libre de proteínas #14602-79P) que contenía nucleósidos (hipoxantina 16 \mug/ml y timidina 0,2 \mug/ml), las células se sometieron a selección en medio PFCHO sin nucleósidos y en un medio que contenía suero fetal bovino dializado al 5% con metotrexato 20 nM. Las células se distribuyeron en diez placas de 96 pocillos (960 pocillos). Después de un periodo de incubación de tres semanas, aproximadamente 120 transfectomas dieron positivo para la expresión de CTLA4-Ig en un ELISA. Seis clones (5%) generaron títulos de proteína primaria CTLA4-Ig mayores de cinco microgramos/ml (Tabla I). Los seis mejores clones se expandieron en frascos para cultivo de tejidos T-75, y el ADN genómico procedente de CHO se preparó para análisis Southern blot usando un kit para aislamiento de ADN genómico que comercializa Stratagene Inc.

Los vectores de expresión convencionales, (por ejemplo, pADNc3/Neo^{R} y pADNc/dhfr) produjeron transfectomas con títulos de proteína CTLA4-Ig mayores de 5 microgramos/ml (\mug/ml). Se eligió que los transfectomas que produjeron más de 5 \mug/ml habían incorporado con éxito la secuencia HIRPE y que presentaban expresión aumentada. Puesto que 5 \mug/ml es el mayor título de proteína que se puede conseguir con un vector de expresión convencional, cualquier transfectoma que exprese más de 5 \mug/m de una proteína deseada, por ejemplo, proteína CTLA4-Ig, en título primario se considera significativo y un "incremento" en la expresión.

TABLA I

5

Los seis clones de la Tabla I anterior representan los mejores transfectomas productores de CTLA4-Ig generados mediante el uso de un vector de inserción diana pTV(I). Los seis clones de la Tabla I contenían el ADN genómico de 5,0 kb. Los cuatro clones en negrita indicaron que el ADN genómico procedente de dichos clones se analizaron mediante Southern blot. Los clones 2C5 y 2F2 (sin negrita) no se analizaron mediante Southern blot. ND indica "No determinado", y se ha usado para indicar los clones que no se han analizado mediante Southern blot.

En nuestras transfecciones de control usando (pADNc/dhfr) no encontramos ningún transfectoma que exprese títulos CTLA4-Ig de 5 \mug/ml o más. Los vectores de integración aleatorios que poseíamos produjeron 1/1000 transfectomas que expresaban la proteína deseada, esto es, CTLA4-Ig con títulos de 5 \mug/ml; en función de este número, se puede predecir que la frecuencia de altos productores usando vectores de integración aleatorios es de aproximadamente 1/1000 (0,1%). Los datos que se presentan en el presente documento demuestran que los vectores de recombinación homólogos que comprenden el HIRPE de la presente invención, en comparación con los vectores de control convencionales, incrementan la frecuencia de obtención de transfectomas con elevado título de proteína recombinante del 0,1% (controles) al 5%. Esto representa un incremento de cincuenta veces en la frecuencia de obtención de una producción elevada sobre los vectores de integración aleatorios.

Se usó el análisis Southern blot para investigar el emplazamiento de integración del plásmido pTV(I) en cuatro transfectomas independientes. El ADN genómico procedente de los transfectomas se analizó para: (a) modelos de bandas de ADN similares entre clones, sugiriendo dianas específicas del emplazamiento; y (b) la presencia del modelo de tres bandas como evidencia de la formación de repeticiones invertidas en el emplazamiento de integración. El ADN genómico se preparó a partir de cuatro transfectomas diferentes usando el kit de aislado para ADN genómico de Stratagene, Inc. Aproximadamente diez microgramos de ADN genómico procedente de CHO se digirieron con el enzima de restricción Kpn I durante 12 horas a 37ºC. El ADN genómico digerido con Kpn I se separó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,7% a 15 V durante 16 horas. El ADN genómico embebido en el gel se desnaturalizó con NaOH 0,4M y se transfirió a un filtro de nitrocelulosa de 0,45 micrómetros usando un transferidor de vacío Bio-Rad.

Se usó amplificación PCR para generar dos sondas de hibridación de 200 bp y 500 bp, respectivamente, procedentes de diferentes regiones del ADN genómico de 5,0 kb. La sonda de hibridación de 200 bp se generó usando los cebadores de PCR CTAGCCTGCCTCACAAGCTTG (SEC. Nº ID: 6) y GAGTCAGCCTGAGATACATAG (SEC. Nº ID: 7). De manera similar, la sonda de hibridación de 500 bp se generó usando los cebadores de PCR GCATTT
CAGCATGGTTGGCTAGC (SEC. Nº ID: 8) y GGACTTCATGTCTTCTCTCCTGC (SEC. Nº ID: 9). Tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, las sondas de hibridación contienen UTP marcado con digoxigenina (Boehringer Mannheim) y se detectaron mediante un kit de detección por quimioluminiscencia (Boehringer Mannheim). Las dos sondas de hibridación se mezclaron en volúmenes iguales, y se hibridaron en nitrocelulosa usando condiciones de hibridación similares a las descritas (Ejemplo 1). El análisis Southern blot del ADN genómico de la línea celular pariente P digerida con EcoRI e hibridada con la mezcla de sondas de hibridación (200 bp y 500 bp) generó tres bandas de ADN EcoRI. Estos resultados sugieren que dos de las bandas EcoRI son el resultado de la formación de repeticiones invertidas en el emplazamiento de integración, y la tercera banda es el homologo genómico no perturbado. Los que sean expertos en la técnica pueden usar el modelo de tres bandas de ADN como marcador de referencia para analizar otros transfectomas generados usando el mismo vector de expresión para poner en evidencia la integración específica del emplazamiento.

El análisis mediante Southern blot del ADN genómico procedente de los cuatro primeros productores que contienen el vector pTV(I) (IA1, 3C2, 3C11 y 6B8) digerido con EcoRI generaron un modelo de tres bandas que es común a los cuatro clones analizados. La presencia del modelo de tres bandas en los nuevos transfectomas es consistente con la formación de una repetición invertida en el emplazamiento de integración del plásmido. Segundo, la presencia del modelo de tres bandas del mismo tamaño en estos transfectomas sugiere que los vectores de recombinación homólogos hacen blanco de forma independiente en un emplazamiento idéntico del genoma del CHO, generando expresión del gen altamente recombinante (Figura 5). El análisis Southern blot sugiere además que el HIRPE de 5,0 kb contiene secuencias conservadas que inducen la formación de repeticiones invertidas y amplificación del gen que llevan a una expresión elevada.

La integración aleatoria del plásmido es el procedimiento preferido de integración en células CHO (>99 %). Los sucesos de recombinación homólogos en células CHO son responsables de menos del 0,1-0,3%. (Thomas y col., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:615). Los sucesos de recombinación aleatorios por lo general no requieren demasiado ADN, y podrían usar potencialmente todo el plásmido de ADN (incluyendo el ADN genómico de 5,0 kb) como sustrato. Si se produce tal suceso, el vector de expresión pTV(I) puede integrarse en un emplazamiento distinto del emplazamiento homólogo. En la presente solicitud, el análisis Southern blot sugiere que el nuevo vector de los solicitantes, frente a la superación de probabilidades, se integra en la mayoría de clones de alta producción en un único emplazamiento genómico en células CHO.

Para confirmar de forma independiente que el plásmido pTV(I) genera de forma consistente transfectomas de CHO con títulos elevados de proteína recombinante se llevó a cabo una segunda transfección del plásmido pTV(I) en la línea celular CHO DG44, Los resultados de la segunda transfección se presentan en la Tabla II siguiente. Los resultados de la segunda transfección confirman que el vector pTV(I) genera de forma consistente transfectomas con elevados títulos de proteína recombinante mediante integración en un locus preferido. Los clones en negrita de la Tabla II indican que se analizaron a continuación mediante Southern blots para demostrar integración específica del emplazamiento. "ND" indica no estudiado.

TABLA II

6

Cuando secuenciamos el ADN genómico de 5,0 kb encontramos una secuencia conservada rica en A-T que estaba enriquecida en A-T en un 70%, que no se puedo amplificar mediante reacción de PCR usando dTTP marcado con digeoxigenina (trifosfato de deoxinucleósido), posiblemente debido a impedimento estérico. De forma coincidente, los genes de expresión elevada en los genomas de mamíferos contienen elementos actuantes cis en los que predomina el enriquecimiento A-T (Mehta (1996) J. Biol. Chem. 271(52):33616). Esto llevó a la evaluación de la secuencia conservada rica en A-T en el ADN genómico procedente de CHO de 5,0 kb como el elemento actuante cis, aumentando la expresión del gen recombinante aguas abajo. Construimos dos vectores de inserción isogénicos pTV(I)/1,6, (que comprenden los nucleótidos 3050 hasta el 4676 de la SEC. Nº ID: 1) y pTV(I)/1,4 (que comprenden los nucleótidos 3050 hasta el 4485 de la SEC. Nº ID: 1) usando amplificación PCR y clonando el producto deseado en el vector que contiene el gen CTLA4-Ig como gen de ensayo (proteína deseada) y el gen DHFR como el marcador de selección positivo. Como se describe en el presente documento el vector pTV(I)/1,4 que comprende 1435 nucleótidos procedentes del ADN genómico de 5,0 kb se generó usando los cebadores de PCR AGCCTATCTCCATTCGTCA (SEC. Nº ID: 10) y CCGCCGAATTCATGTCTGTGTTCCTGTTAGTG (SEC. Nº ID: 11). El vector pTV(I)/1,6 (que comprende 1626 nucleótidos procedentes del ADN genómico de 5,0 kb) se generó en una reacción PCR con los cebadores de PCR AGCCTATCTCCATTCGTCA (SEC. Nº ID: 12) y CCGCCGAATTCAACCACATGGTGGCTCACAA (SEC. Nº ID: 13). Los fragmentos derivados con PCR se clonaron en el mismo vector de expresión anteriormente descrito que contiene el gen indicador CTLA4-Ig y el marcador de selección dhfr. Estos dos nuevos vectores tienen el mismo extremo 5' ya que se generan mediante el cebador común hacia delante, mientras que el extremo 3' del HIRPE de 1,4 kb es aproximadamente unas 200 bp más corto que el HIRPE de 1,6 kb. Después de la transformación de las células CHO DG44, ambos vectores generaron aproximadamente 120 transfectomas que fueron positivos para la expresión de la proteína CTLA4-Ig en un ELISA. (Symington y col., (1993) J. Immunol. 150(4):1286). Sin embargo, cuando se compararon los títulos de CTLA4-Ig procedentes de los cuatro productores superiores de clones de cada clase, los transfectomas que contenían el vector pTV(I)/1,6 expresaron aproximadamente cuatro veces más títulos de proteína CTLA4-Ig, mientras que los transfectomas que contenían el vector (pTV(1,4)) no mejoraron de manera significativa la expresión de la proteína CTLA4-Ig (ver la Figura 8). A partir de estos resultados se concluyó que la secuencia conservada rica en A-T de 200 bp en el ADN genómico de 5,0 kb actúa como un elemento actuador cis aumentando la expresión del gen recombinante en las células CHO.

La siguiente descripción detalla las ventajas de los vectores de sustitución homólogos y la construcción de un vector de sustitución pTV(R) que contiene el ADN genómico de 5,0 kb. La recombinación homóloga entre los ADN introducido y cromosómico usando vectores de sustitución se usa ampliamente para introducir ADN extraño en células de mamífero. Existen muchas variables que tienen influencia sobre la recombinación homóloga en células CHO incluyendo, pero sin limitarse a, locus genéticos, la cantidad de secuencia homóloga, y el cassette de selección positivo. Aunque los vectores de sustitución tienen una frecuencia 5-10 veces inferior de recombinación homóloga, tienen la ventaja de una integración estable del inserto (gen recombinante), mientras que las secuencias del plásmido extraño se ejercen durante el suceso de recombinación. Esto contrasta con el vector de inserción (pTV(I)) en el que se inserta la secuencia completa del plásmido. Además, se prefieren los vectores de sustitución debido a los procedimientos de enriquecimiento aceptados generalmente para integración específica del emplazamiento aplicable al vector de sustitución (Hasty y col., (1991) Mol. Cell. Bio. 11:4509). Finalmente, el vector de sustitución, junto con el gen HSV-tk proporciona el procedimiento de enriquecimiento más habitual usado para aislar los transfectomas resultantes de la recombinación homóloga Zheing y col., (1990) Nature 344:170).

El análogo de nucleósido aciclovir mata selectivamente las células de mamífero que expresan el gen de HSV-timidina kinasa ("HSV-tk"). El HSV-tk convierte el aciclovir en una forma fosforilada que es tóxica para la célula. Como resultado, sólo aquellas células que expresan HSV-tk mueren, y no las células CHO normales. El gen HSV-tk está estratégicamente colocado en el vector de sustitución en una región que borra el gen HSV-tk tras la recombinación homóloga, mientras que otros sucesos de recombinación (integración aleatoria) retiene el gen. Como resultado, los transfectomas que resultan de los sucesos de recombinación homóloga sobreviven a la selección con aciclovir mientras que otras clases de transfectomas mueren (Evrard y col., (1996) Cell.. Biol. Toxicol. 12(4-6):345).

El vector pTV(R) contiene un ADN genómico de 1,6 kb que contiene la región rica en A-T en el extremo 5' de la cassette de expresión del CTLA4-Ig y el fragmento genómico lateral de 2,2 kb en el extremo 3' del marcador de selección DHFR (Figura 4). La clonación del ADN genómico en dos partes se lleva a cabo diseñando nuevos emplazamientos de restricción usando la reacción en cadena de la polimerasa, un procedimiento fácilmente evidente para aquellos expertos en la técnica del ADN recombinante. Se diseña el vector de sustitución para segregar el gen HSV-tk en los transfectomas resultantes de la recombinación homóloga, mientas que los recombinantes ilegítimos que contienen el gen HSV-tk activo se matan selectivamente mediante el inhibidor aciclovir, y permiten de forma selectiva que pueden crecer los clones resultantes de un emplazamiento de recombinación específico (Pfizer y col., (1987) Am. J. Cancer 40:114; Davidson y col., (1981) Virology 113:9).

La estrategia del enriquecimiento selectivo en recombinantes específicos del emplazamiento produjo los resultados esperados, y el 10% de todos los transfectomas generados usando el vector de sustitución sobrevivieron a la selección. La electroporación del pTV(R) en la línea celular CHO DG44 generó 860 transfectomas que sobrevivieron a la primera ronda de selección con metotrexato 20 nM. Sin embargo, después de la segunda selección con aciclovir 1,0 mM, únicamente sobrevivieron 94 transfectomas (10%). Los transfectomas supervivientes de la doble selección se habían producido mediante sucesos de recombinación específica del emplazamiento. Los 94 transfectomas se seleccionaron para los títulos de proteína CTLA4-Ig. Los seis primeros transfectomas con los títulos de proteína CTLA4-Ig más elevados se presentan en la Tabla III siguiente:

TABLA III

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El ADN genómico procedente de los seis transfectomas (es decir, IC9, 2B11, 3D5, 4F4, 5C4, y 6F1) se preparó mediante los procedimientos anteriormente descritos. El ADN genómico se digirió con el enzima de restricción Bsp 1201 y se sometió a análisis Southern blot usando las sondas de hibridación de 200 bp y 500 bp generadas mediante PCR que se han descrito en la sección anterior. La electroforesis en gel de agarosa y las condiciones de hibridación incluyendo las condiciones de lavado fueron idénticas a las condiciones anteriormente descritas. El modelo de bandas de ADN procedente de los seis clones analizados reveló modelos de dos bandas idénticos con bandas de 3,5 kb y 2,7 kb, respectivamente (Figura 6). A partir de estos resultados, se infirió que la banda de ADN de 2,7 kb representa el homólogo genómico no perturbado, mientras que el ADN de 3,5 kb es una banda híbrida que contiene el ADN genómico y del plásmido que representan el emplazamiento de integración en el genoma de CHO. La presencia de un fragmento híbrido de 3,5 kb común a los seis transfectomas analizados indica que los vectores de sustitución homólogos se integran de forma selectiva en un emplazamiento específico del genoma de CHO. Además, la producción de proteína permaneció alta tras reducir el número de transfectomas generados usando el gen HSV-tk en los vectores de sustitución que comprenden el gen HIRPE de la presente invención (SEC. Nº ID: 1), o un fragmento del mismo (nucleótidos 3050 hasta 4676 de la SEC. Nº ID: 1.

Lo anteriormente descrito demuestra que la presente invención proporciona una forma única y fiable de incrementar la expresión de proteínas recombinantes. Usando la secuencia HIRPE (SEC. Nº ID: 1) mostrada por los inventores, o un fragmento de la SEC. Nº ID: 1 que presente actividad HIRPE (de forma preferible, el fragmento que se muestra en la SEC. Nº ID: 2), alguien que sea experto en la técnica puede no sólo incrementar el porcentaje de células que se transfectan con éxito, sino también incrementar la expresión en aquellas células transfectadas.

Aunque la presente invención se ha descrito en cierto detalle mediante ilustración y ejemplo a efectos de claridad y comprensión, será evidente que pueden realizarse algunos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

1. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por:

(a)

la molécula de ácido nucleico que se contiene en el Número de Depósito ATCC 203153;

(b)

un fragmento de la SEC. Nº ID: 1, en el que dicho fragmento es capaz de incrementar la expresión de una proteína recombinante de interés cuando el mencionado fragmento de ácido nucleico se incorpora en un vector de expresión;

(c)

las secuencias de ácido nucleico que son idénticas en al menos un 80% en secuencia de nucleótido a la (a) ó (b), en la que dichas secuencias de ácido nucleico son capaces de incrementar la expresión de una proteína recombinante de interés cuando dichas secuencias de ácido nucleico se incorporan en un vector de expresión;

y el complemente de una cualquiera de (a) a (c).

2. Un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. El vector de expresión de la reivindicación 2 que comprende además un marcador seleccionable.

4. El vector de expresión de la reivindicación 2 ó 3 que comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica todo o parte de una proteína de interés.

5. El vector de expresión de la reivindicación 4 en el que la mencionada proteína de interés es CTLA4-Ig, o una variante de la misma.

6. Una célula huésped transformada con el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

7. La célula de la reivindicación 6 que es una célula de CHO.

8. Un procedimiento para obtener una proteína recombinante que comprende cultivar una célula huésped transformada de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7 en condiciones que promuevan la expresión de dicha proteína, y recuperar la proteína.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la mencionada proteína es una molécula de CTLA4-Ig.

10. El uso de un oligonucleótido como se muestra en la Figura 9 para obtener la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1.