ES2214489T3 - Metodo para la separacion analitica de virus. - Google Patents

Metodo para la separacion analitica de virus.

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Abstract

EL PROCEDIMIENTO PERMITE LA COMPROBACION Y/O CUANTIFICACION ANALITICA POBRE DE PERTURBACIONES DE VIRUS O PARTICULAS VIRALES (ANALITO) EN UNA MATRIZ DE MUESTRA LIQUIDA CONTENIENDO COMPONENTES SECUNDARIOS ORGANICOS O INORGANICOS, EN PARTICULAR PARTES DE PROTEINA Y/O NUCLEOTIDOS Y/O OTROS VIRUS. PARA ESTE OBJETIVO SE SEPARAN LOS VIRUS O LAS PARTICULAS VIRALES DE LAS PORCIONES DE PROTEINA Y/O NUCLEOTIDOS EN LA MATRIZ DE MUESTRA DE FORMA ELECTROFORETICA CAPILAR Y AL MISMO TIEMPO DE REGISTRA EL ELECTROCEROGRAMA CORRESPONDIENTE. LAS FRACCIONES COORDINADAS CON EL ANALITO PUEDEN SER IDENTIFICADAS COMO PUNTOS DE VIRUS EN EL ELECTROCEROGRAMA MEDIANTE VALORACION ELECTROSCOPICA DE INTENSIDAD MAXIMA CARACTERISTICA APROXIMADA. PARA LA MEJOR IDENTIFICACION PUEDE SER AÑADIDA A LA MATRIZ DE MUESTRA UNA MUESTRA DE REFERENCIA DE UN VIRUS CONOCIDO O UNA PARTICULA VIRAL CONOCIDA.

Description

Método para la separación analítica de virus.
La invención se refiere a un método para la detección analítica no destructiva y/o la cuantificación de virus o partículas víricas (analitos) en una matriz de muestra líquida conteniendo compuestos orgánicos o inorgánicos secundarios concretamente parte de proteínas y/o nucleótidos y/o otros virus.
Se conocen métodos inmunológicos basados en interacciones especificas antfgeno-anticuerpo. Los numerosos métodos aplicados, Vg. ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay), reacción de unión a complemento, SNT (Serum Neutralisation Test) y anticuerpos marcados por fluorescencia SE diferencian únicamente en el método de detección.
El problema de estos métodos radica en la elevada especificidad de la reacción de detección respecto a la región inmunogénica del virus. Tampoco es posible distinguir entre la actividad antigénica de la partícula vírica y la de la proteína inmunorreactiva. A la inversa, también pueden obtenerse resultados positivas falsos o reactividades
cruzadas.
La actividad especifica de los virus se mide habitualmente basándose en los dos efectos siguientes.
a) Identificación de un efecto patogénico específico del virus sobre las células blanco.
Se puede mencionar aquí a titulo de ejemplo la inspección ocular de una población de células infectadas en relación con su citopatogenicidad, hemoaglutinación o hemoadsorción.
b) Por ejemplo, se puede medir una reacción enzimática especifica de virus en retrovirus, por medio de la actividad de la transcriptasa inversa.
El problema reside en este caso en el escaso poder de cuantificación y la incertidumbre sobre la importancia de los sistemas de ensayo para el poder de transferencia al huésped natural.
Los métodos de biología molecular pueden resumirse del modo siguiente.
a) En diagnósticos mediante sondas, las secuencias de nucleótidos víricos se identifican por hibridación con sondas de genes introducidas específicamente.
b) Los genes víricos se identifican mediante una muestra con un corte específico producido mediante enzimas de restricción.
c) Los virus se identifican mediante la amplificación de secuencias específicas de genes (PCR).
d) Los genes víricos se identifican por secuenciación de nucleótidos.
Estos métodos engloban la máxima información para la identificación de un virus. Sin embargo, resultan relativamente costosos, laboriosos y no muy adecuados para la cuantificación. Por otra parte, estas técnicas analíticas describen el genotipo en vez del fenotipo del virus.
El patrón de proteínas específico del virus puede identificarse por separación mediante diversas técnicas de electroforesis y cromatografía. Adicionalmente pueden reconocerse las proteínas inmunogénicas por métodos inmunológicos (inmunoblot). Los virus tienen que estar muy limpios antes de su corte (costes añadidos de purificación) para poder clasificar las bandas de proteínas. Los virus que ya están desnaturalizados también pueden presentar el modelo 
\hbox{correcto.}
La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación relativamente nueva, en la que la muestra a analizar se separa en un capilar situado en un campo eléctrico de alta tensión, debido a velocidades de migración diferentes. La detección tiene lugar directamente en el capilar con ayuda de detectores ópticos [1]. El ámbito de aplicación de la CE es muy amplio, extendiéndose desde el análisis de iones, la separación de enantiomeros, el análisis de proteínas y de nucleótidos, hasta la separación de partículas y virus [2]. Hasta la fecha se han estudiado mediante esta técnica, sobre todo moléculas individuales o partículas homogéneas estables desde un punto de vista mecánico. Por ejemplo, en [3] se describe la separación de partículas de lipoproteína recombinante por electroforesis capilar. En [10] se describe la separación de un virus por electroforesis capilar.
Para la detección sensible por fluorescencia se utilizan con éxito para el DMA y el RNA, reactivos de tinción de unión a DNA/RNA [4, 5]. Estas tinciones muestran en selectividades algo distintas para los nucleótidos de cadena simple y los de cadena doble, o máximos distintos de fluorescencia para RNA y DNA. Así, por ejemplo, el anaranjado de acridina muestra un máximo de emisión de fluorescencia a 520 nm para DNA y a 650 nm para RNA. La detección por fluorescencia en la CE se describe asimismo, casi exclusivamente para DNA bicatenario [6].
En la bibliografía se han descrito numerosos métodos para la determinación de constantes de unión en las interacciones proteína-ligando mediante la utilización de CE [7, 8]. Los métodos se basan en un desplazamiento del tiempo de migración durante la interacción o en modificaciones del área del pico de un componente interactuante. Esto puede ponerse en practica experimentalmente mediante los siguientes procedimientos.
1.
Los componentes interactuantes se incuban antes de la separación por CE y los complejos formados se separan de los componentes individuales utilizando CE.
2.
Un componente interactuante se introduce en el tampón CE y se mide el desplazamiento en el tiempo de migración del otro componente (electroforesis capilar de afinidad).
El primer método tiene la ventaja de ser económico en material y variable en cuanto a la elección de los componentes participantes, por lo que es el que se ha estudiado principalmente.
La invención tiene por objeto la mejora de la investigación analítica de virus, de modo que se puedan identificar y/o cuantificar de modo rápido y precise en una matriz de muestra liquida conteniendo compuestos orgánicos o inorgánicos secundarios, particularmente mitades de proteínas y/o nucleótidos.
El objeto se consigue de acuerdo con la invención utilizando un método, en el que los virus o las partículas víricas se separan de las mitades de proteínas y/o nucleótidos en la matriz de muestra mediante electroforesis capilar y al mismo tiempo se registra el electroferograma asociado con el proceso y se identifican las fracciones asignada a los analitos corno picos correspondientes a virus en el electroferograma mediante la interpretación espectroscópica con ayuda de máximos característicos utilizando colorantes de unión a RNA/DNA, identificables por espectroscopia, para teñir E virus o las partículas víricas.
Las partículas víricas son por definición virus activos y virus inactivados, así come partículas modificadas, bien químicamente, mediante biología molecular o mediante enzimas, que deben considerarse de tipo vírico debido a las propiedades de si superficie o por su composición estructural. Los virus (partículas víricas) pueden contener DMA o RNA, de cadena doble o simple y pueden presentar envoltura o no La separación no depende del tamaño del virus; los viroides o viriones también pueden caracterizarse con este procedimiento.
Los virus pueden identificarse directamente a partir de cualquier matriz de muestra Vg. de material biológico (suero, orina, células, plasma, sobrenadante de células humor acuoso, saliva, etc.) o a partir de formulaciones no biológicas (agua medicamentos, muestras de tierra, etc.). Mediante la utilización de colorantes fluorescentes en combinación con detección por fluorescencia puede alcanzarse una sensibilidad particularmente elevada.
Para la identificación es conveniente añadir a la matriz de muestra una muestra de referencia de un virus conocido o de una partícula vírica conocida.
Otra mejora consiste en incubar el virus o la particular vírica con anticuerpos específicos, que produzcan un desplazamiento del tiempo de migración electroforética o una modificación en el pico característico del virus.
Mediante el nuevo método puede supervisarse y controlarse favorablemente la producción de virus durante la fabricación de vacunas.
Otra aplicación muy importante reside en la posibilidad de diagnostico directo de virus en materiales biológicos, particularmente en los humores corporales.
La utilización del método según la invención aporta las siguientes ventajas.
En comparación con las técnicas analíticas actuales, la separación de las partículas víricas por electroforesis capilar es superior por la sencilla preparación de las muestras, los cortos tiempos de análisis, la posibilidad de una cuantificación exacta, la posibilidad de automatización, la posibilidad de estandarización y por la calidad añadida de la información, ya que es la primera vez que pueden identificarse y cuantificarse virus intactos sin un análisis cualitativo.
Estas ventajas tienen repercusiones particularmente ventajosas:
a)
En el Control de Procesos
b)
La utilización de este método permite por primera vez, además de supervisar el proceso, controlarlo durante la fabricación de vacunas, debido a la rapidez del análisis y a que este es cuantitativo.
b)
En Control de Productos
Mediante este procedimiento es posible gestionar por primera vez la garantía de calidad del producto final utilizando un método estandarizado, desde el momento de la formulación, hasta la supervisión de la estabilidad de almacenamiento y de las condiciones de transporte.
c)
En el Diagnostico de virus
La utilización de este método permite por primera vez detectar e identificar directamente virus. Esto tiene gran importancia para supervisar el producto durante la producción de virus y para garantizar la ausencia de virus en materiales biológicos.
d) En la Supervisión de Terapias
Cuando se utilizan fármacos antivíricos puede supervisarse directamente el resultado de la terapia.
e)
En la Identificación de Virus
Debido a las distintas propiedades electroforéticas de los virus y a la detectabilidad especifica en el capilar, pueden identificarse virus conocidos y determinarse virus desconocidos. De este modo también pueden identificarse paralelamente varios virus (cepas de virus) distintos.
A continuación se describe, con ayuda de ejemplos y mediante la utilización de curvas, el procedimiento que permite separar virus y partículas víricas por electroforesis capilar, identificarlas y cuantificarlas directamente mediante la nueva técnica analítica.
Breve descripción de las figuras
Las Figs. 1 (a y b): ilustran un electroferograma capilar de una muestra de referencia inactivada de fiebre aftosa, detección a 210\pm8 nm (a) y 257\pm8 nm (b). La seria correspondiente al virus puede identificarse por su incremento en la detección a 257 nm.
La Fig. 2: ilustra un espectro DAD del virus inactivado de la fiebre aftosa de la Fig. 1.
Las Figs 3 (a y b): ilustran un electroferograma capilar de un concentrado inactivado de fiebre aftosa. Detección a 210\pm8 nm (a) y 257\pm8 nm (b). El virus esta indicado con una flecha.
Las Figs. 4 (a y b): ilustran una comparación de las separaciones CE de las muestras de referencia inactiva (a) y activa (b) de fiebre aftosa. Detección a 257 nm.
La Fig. 5: ilustra la separación CE del virus tenido, inactivado de fiebre aftosa de la Fig. 1. Detección a 257\pm8 nm. La serial a 3.8 min podría deberse a un exceso de bromuro de etidio procedente de la incubación. La serial correspondiente al virus no se desplazo por causa de la tinción (comparar con la Fig. 1).
La Fig. 6: ilustra los espectros DAD de bromuro de etidio (a) y del virus tenido, inactivado de la fiebre aftosa (b) de la Fig. 5. De este modo pudo verificarse el éxito de la tinción del virus. La serial correspondiente al virus también se especificó de este modo.
La Fig. 7: ilustra la separación por CE del concentrado tenido (YOYO), inactive de fiebre aftosa de la Fig. 3 utilizando detección LIF. De la mezcla de complejo (Fig. 3) solo sigue siendo detectable el virus, que se detecta con una sensibilidad claramente superior.
Las Figs. 8 (a y b): ilustran una comparación de separaciones mediante CE de virus inactive de dermatitis pustulosa contagiosa ovina antes (a) y después de la incubación utilizando un MAB específico de dermatitis pustulosa contagiosa ovina (b). El virus se tino con YOYO y se detecto mediante LIF.
Las Figs. 9 (a y b): ilustran separaciones por CE del núcleo del virus de dermatitis pustulosa contagiosa ovina después de la tinción con YOYO, detección a 257 nm (a y detección LIF (b). Los distintos tiempos de migración son consecuencia de la: distintas condiciones de separación.
La Fig. 10: ilustra el espectro DAD del núcleo del virus de dermatitis pustulosa contagiosa ovina con YOYO intercalado de la Fig. 9. La intercalación produjo un máximo de absorción en la región de excitación del láser de argón del detector LIF (495 nm).
Las Figs. 11 (a y b): muestran una comparación de los tiempos relativas de migración de fiebre aftosa On (a) y fiebre aftosa Oi_{m} (b) sin MAB (bandas oscuras) después de incubación con diferentes MAB de Oi anti-fiebre aftosa (bandas claras).
Descripción general del método
La muestra objeto de análisis se introduce en forma liquida (solución, suspensión) en un capilar previamente lavado con el tampón de separación o relleno con un sistema tampón. El transporte del flujo esta asegurado en ambos extremes del capilar por contacto directo, o a través de un tampón conductor, y se crea un campo eléctrico e el capilar mediante la aplicación de una corriente de alto voltaje. Los virus se separar por efecto del campo eléctrico. La identificación directa de los virus en el capilar se realiza por detección de absorción UV a una o varias longitudes de onda. Dado que los virus se componen de proteínas y de nucleótidos, la detección especifica de los virus es posible mediante detección a 256-260 nm (máximo de absorción para nucleótidos) y 210, 280 nm (absorción de proteínas). Cuando los virus son muy grandes la dispersión de la luz impide la identificación directa por absorción UV (cf. ejemplo 2.3). Sin embargo, en caso de virus conocidos puede utilizarse la dispersión de la luz para la identificación y la cuantificación. El tampón de separación contenido en el capilar se ajusta para la separación y la estabilidad del virus (valor de pH, concentración fónica, detergentes, aditivos). El aparato necesario es cualquier dispositivo de CE dotado de un detector óptico. La muestra puede introducirse en el capilar de modo electrocinético, hidrodinámico o por inyección en vacío o mediante aplicación de presión. No existen limitaciones respecto al capilar (capilar de sílice fundida), revestido o no, Teflón o cualquier otro material orgánico o inorgánico). El diámetro del capilar tampoco influye en la separación, estando este únicamente limitado por las condiciones de la electroforesis (transporte de flujo, capacidad de detección, disipación de calor).
Ejemplos 1. Separación e identificación directa de virus de fiebre aftosa
Los virus de la fiebre aftosa pertenecen al grupo de los Picornavirus y presentan una estructura con superficie icosaédrica formada a partir de cuatro proteínas viricas. El diámetro aproximado es de 25 nm. En el interior hay un RNA de cadena sencilla con una longitud aproximada de 5000 bases.
La tabla 1 resume la propagación y la separación de los virus.
TABLA 1 Separación de virus de fiebre aftosa
Propagación del virus Células en suspensión BHK-21 en cultivos de fermentación de hasta 1,5000 l,
recogida de virus después de la lisis celular
Purificación preliminar Clorificación preliminar de la suspensión de virus en bruto por centrifugación
continua a baja velocidad
In activación Etilenimina (in situ a partir de bromoetilenamina y NaOH)
Preparación del concentrado Precipitación mediante PEG y nueva suspensión en 1/100 del volumen original
Purificación de muestras Centrifugación en gradiente de densidad de CsCI para referencia la separación
de partículas 146S (virus enteros e 6 inactivos)
Ejemplo 1.1 Identificación de un virus inactivado de fiebre aftosa
Se separo una muestra de referencia (cf. tabla 1) (100 ug/ml) por electroforesis; capilar en un aparato de electroforesis capilar de la empresa Hewlett-Packarc (tipo ^{30}HPCE). Las condiciones de medición se resumen en la tabla 2. En la Fig 1 se muestra el electroferograma asociado. La marcada serial a 6,9 min aparece claramente en la transición de 210 a 257 nm. El espectro UV de esta serial se registro directamente a partir de la Fig. 1 mediante un conjunto detector de diodos (DAD). El máximo registrado a 256 nm es característico de los nucleótidos, mientras que el máximo intense de onda corta y la caída gradual a 300 nm solo se explica por porciones de proteínas adicionales (Fig. 2). E espectro UV medido en el capilar fue idéntico al espectro UV del virus separada y, por tanto, pudo utilizarse para la identificación directa de la serial correspondiente al virus. Ninguno de los componentes secundarios de la Fig. 1 mostró un espectro UV similar y, por tanto, tampoco representaba ninguna partícula vírica intacta.
TABLA 2 Condiciones de medición para la identificación directa de muestras de referencia de fiebre aftosa mediante CE
Capilar: Capilar de sílice fundido, 75 urn de diámetro interno, 64,5 cm. de longitud, 56 cm.
hasta el detector.
Tensión: 20 kV
Tampón: Tris (25 mmolar) glicina (192 mmolar) pH 8,5
Temperatura: 25ºC
Detección: DAD 190-600 nm, Xi 210\pm8 mm, X_{2} 257\pm8 mm
Inyección: Presión (20 seg x 5 x 10^{3} Pa)
Lavado del capilar 1 NaOH (0.1 N, 1 min., 5 x 10^{4} Pa)
previo a la inyección: 2 Tampón (3 min, 5 x 10^{4} Pa)
Ejemplo 1.2 Separación e identificación del virus inactivado de fiebre aftosa a partir de una matriz de muestra del complejo
El virus inactivado pudo identificarse directamente (Fig. 3, condiciones de medición en la tabla 3) en el concentrado (cf. tabla 1). Como era de esperar apareció un electroferograma del complejo a 210 nm. El ruido de fondo biológico fue claramente mas bajo entre 210 y 257 nm y la serial que destacaba fuertemente indicaba un contenido importante de nucleótidos. La serial correspondiente al virus (flecha) se pudo identificar mediante el espectro UV y por inyección conjunta utilizando la correspondiente muestra de referencia (no representada en la Figura). En el ejemplo 2.2 se muestra una identificación mas sencilla y directa.
TABLA 3 Condiciones de medición para la identificación directa por espectroscopia UV de virus de fiebre aftosa a partir de concentrados brutos
Capilar: Capilar de sílice fundido, 50 urn de diámetro interno, 64,5 cm de longitud, 56 cm
hasta el detector
Tensión: 20 kV
Tampón: Tris (25 mmolar) glicina (292 mmolar) dodecilsulfato sodico (50 mmolar), pH 8,5
Temperatura: 25ºC
Detección: DAD 190-600 nm, A,i 210\pm8 mm, X_{2} 257\pm8 mm
Inyección: Presión (20 seg x 5 x 10^{3} Pa)
Lavado del capilar 1. NaOH (o,1 N, 1 min, 5 x 10^{4} Pa)
previo a la inyección: 2. Tampón (3 min, 5 x 10^{4} Pa)
Ejemplo 1.3 Separación e identificación de virus active de fiebre aftosa
Se purificaron muestras de referencia del material video antes y después de la inactivación (cf. tabla 1). La actividad del virus se observe por titración en cultivos de células BHK (valoración>10^{7} KID_{SO}). Ambas muestras (activa e inactiva) se ajustaron a la misma cantidad de partículas 146S y se separaron con un aparato de electroforesis capilar Perkin Elmer (tipo ABI 270 A-HT) (condiciones de medición en la tabla 4). La detección a 257 nm mostró electroferogramas comparables para ambos preparados (Fig. 4). Los virus active e inactive no pudieron separarse mediante CE. Tampoco cabía esperar cambios en la condición de carga de la superficie, de importancia fundamental para la separación CE, ya que el reactivo de in activación reacciona preferentemente en el interior del virus de la fiebre aftosa.
TABLA 4 Condiciones de medición para la separación mediante CE de muestras de referencia de virus actives de fiebre aftosa
Capilar: Capilar de sílice fundido, 50 urn de diámetro interno, 72 cm de longitud, 51 cm
hasta el detector
Voltaje: 20 kV
Tampón: Tris (25 mmolar) glicina (192 mmolar) pH 8,5
Temperatura: 35ºC
Detección: UV 257 nm
Inyección: Vacío (5 seg x 17 x 10^{3} Pa)
Lavado del capilar 1. NaOH (0.1 N, 1 min, 68 x 10^{3} Pa)
previo a la inyección: 2. Tampón (3 min, 68 x 10^{3} Pa)
Los ejemplos 1.1 - 1.3 muestran claramente la idoneidad de esta nueva técnica analítica para la identificación directa de virus actives y partículas víricas inactivadas (muestras inactivadas). Incluso las matrices de muestra de complejo, que se dan Vg. en el concentrado, no interfieren con la separación. En este case resulta muy ventajoso el alto rendimiento de separación de la electroforesis capilar y la buena compatibilidad de la técnica analítica con la matriz, que esta libre de material de separación en fase sólida. El nuevo método universal podría demostrarse con éxito y utilizarse mediante estos ejemplos. Los virus pueden detectarse e identificarse directamente mediante esta nueva técnica analítica.
El área del pico correspondiente a la serial del virus guarda relación con la cantidad del virus, por lo cual es apto para la cuantificación directa de la concentración de este. El ejemplo del virus de la fiebre aftosa indicaba que la absorción UV podía utilizarse para la identificación directa de la serial correspondiente al virus. En el caso de virus muy grandes la difracción de la luz impide la identificación directa por absorción UV. Además, el limite de detección para los virus que absorben radiación UV es del orden de microgramos por mililitro (>10^{6} partículas/ml) y por tanto inadecuado a efectos prácticos en muchos cases. En la sección siguiente se exponen métodos de detección especifica para este tipo de virus.
2. Identificación de virus mediante la utilización de un sistema específico de detección de RNA & DMA basado en colorantes de unión a DNA/RNA
A continuación se describe el modo de utilización de colorantes de unión a DNA/RNA para la tinción directa de virus. En una extensión del método de separación de virus y partículas víricas expuesto en la Sección 1 se describe también en primer lugar la facilidad de localización de la serial, o la mera posibilidad de localización de la serial por vez primera, particularmente en sistemas de complejo, y en segundo lugar el modo de conseguir una especificación mas exacta y, sobre todo, un incremento extraordinario de la sensibilidad mediante la detección por fluorescencia.
Los virus tenidos de este modo pueden separarse de otros componentes que contienen DNA/RNA mediante CE. Esto permite identificar directamente el virus marcado. Puede conseguirse una especificación mas del virus a través de IE selectividad de los colorantes correspondientes al DNA o al RNA, de cadena doble o de cadena simple respectivamente. Los virus con y sin envoltura también pueden diferenciarse basándose en la diferente velocidad de paso de los colorantes a través de las membranas.
Debido a la incorporación múltiple de colorantes (fragmentos de un total de 10 a 20 bases), la detección por fluorescencia produce un aumento extraordinario de la sensibilidad. Así, estadísticamente se incorporan hasta 15.000 moléculas de colorante, cada una de las cuales contribuye a la serial por fluorescencia. Mediante un simple calculo se llega a la conclusión de que el límite de detección por fluorescencia para determinados virus es inferior a una partícula.
De este modo, por primera vez se separan virus tenidos mediante CE, se identificar con ayuda de la absorción característica de radiación UV y se detectan por fluorescencia con una sensibilidad alta. Mediante la utilización de procedimientos basados empíricamente en los ejemplos 1.1 - 1.3. Se tiñeron virus de fiebre aftosa con colorantes de unión a DNA/RNA y se analizaron mediante detección por CE y DAD. Los máximos de absorción de onda larga de los virus teñidos corresponden en una primera aproximación a los máximos de absorción del RNA o DNA tenidos libres.
Descripción General del Proceso de Tinción
La muestra objeto del análisis:
a)
se incuba con el colorante de unión a DNA/RNA y a continuación se separa y analiza según el método descrito en la Sección 1, o bien
c)
se añade el colorante de unión a DNA/RNA al tampón de separación y el virus se tiñe en el capilar durante la separación. El virus con el DNA/RNA marcado por el colorante puede detectarse por la absorción UVA/IS especifica o por la extinción y emisión especifica de la fluorescencia.
Ejemplos
Aquí se exponen a modo de ejemplo dos de los numerosos métodos de detección por tinción satisfactoriamente utilizados con diferentes virus y colorantes.
En primer lugar se describe la separación, identificación y detección de alta sensibilidad de virus de fiebre aftosa tenidos.
Al teñir con los colorantes de unión a DNA/RNA se desplaza el espectro de absorción de onda corta y aparece una absorción adicional en la zona visible. Por tanto, por primera vez es posible utilizar la absorción UV para detectar el éxito de la separación de los virus tenidos, pudiendo además identificarse el virus independientemente mediante su espectro de absorción característico.
Otro factor de complicación reside en que los virus de la fiebre aftosa contienen RNA de cadena simple, mientras que los reactivos de tinción han sido desarrollados para DNA de cadena doble. No obstante, las investigaciones preliminares indican que el DNA y el RNA libres de cadena simple también pueden teñirse y detectarse mediante CE, si bien en menor grado.
Ejemplo 2.1 Separación e identificación de virus tenidos de fiebre aftosa mediante detección UV
La muestra de referencia del virus de fiebre aftosa del ejemplo 1.1 (300 ug/ml) conteniendo 10 ug/ml de bromuro de etidio (vease, Vg., R.P. Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc. 1992) se incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente y a continuación se estudio con ayuda de CE (las condiciones se exponen en la tabla 2). Se detectaron dos señales (Fig. 5). Los espectros UVA/IS en la CE están representados en la Fig. 6. La serial a 3,8 min indicaba un exceso de bromuro de etidio en la incubación (confirmado asimismo por inyección conjunta). El pico a 6,9 min indicaba máximos de absorción a 200, 257 (intense) y 510 nm (débil). El desplazamiento para la onda larga del máximo de absorción visible correspondiente al bromuro de etidio libre (495 to 510 nm) es característico de la intercalación con bases de ácidos nucleicos. La posición de la serial correspondiente al virus en el electroferograma prácticamente no se desplazo por la adición de bromuro de etidio (cf. Fig 1 y 5).
El ejemplo del bromuro de etidio ha permitido demostrar con éxito la separación e identificación de virus teñidos.
Ejemplo 2.2 Detección por fluorescencia del virus de fiebre aftosa tenido
Tras diluir la muestra de concentrado de fiebre aftosa del ejemplo 1.2 con el tampón de separación en una proporción 1:15 (tabla 5) se incubo con tetrayoduro de 1,1'-(4.4,7.7-tetrametil-4,7-diazaundecametilen)bis-4-[3-metil-2,3-dihidrometil(benzo-1,3-oxazol)-2-metiliden]-quinolinio (YOYO) (1 umolar) durante 30 minutos a temperatura ambiente y a continuación se midió mediante CE (condiciones de medición en la tabla 5). El concentrado mostró una única serial (Fig. 7). La fluorescencia inherente de YOYO era tan baja que ya no se podía detectar YOYO libre por fluorescencia. El resto de señales del concentrado no eran visibles en esta detección especifica de nucleótidos (compárese la detección UV de la muestra idéntica de la Fig. 3). El desplazamiento brusco en el tiempo de migración se produjo debido a las distintas longitudes del capilar y las distintas intensidades de campo (cf. Tabla 3 y Tabla 5).
TABLA 5 Condiciones de medición para la separación por CE utilizando detección por fluorescencia de muestras de referencia de fiebre aftosa, utilizando CE
Capilar: Capilar de sílice fundida, 50 um de diámetro interno, 40 cm de longitud, 40 cm
hasta el detector
Tensión: 20 kV
Tampón: Tris (25 mmolar) glicina (192 mmolar) dodecilsulfato sódico (50 mmolar), pH 8,5
Temperatura: 25ºC
Detección: LIF (argón) EX 488, EM 520 nm, ganancia 100
Inyección: Presión (10 seg x 10^{3} Pa)
Lavado del capilar 1. NaOH (0.1 N, 1 min, 5 x 10^{4} Pa)
previo a la inyección: 2. Tampón (3 min, 5 x 10^{4} Pa)
Ejemplo 2.3 Separación e identificación de virus de dermatitis pustulosa contagiosa ovina mediante detección por fluorescencia
El virus de la dermatitis pustulosa contagiosa ovina pertenece al grupo de los virus Parapox. El virus esta constituido por un DMA bicatenario con aprox. 140.000 pares de bases, empaquetado junto con un gran numero de enzimas por un revestimiento de proteína (nucleo) y otro revestimiento de lipoproteína. Por esta razón se trata de un tipo de virus denominado virus con envoltura. La partícula vírica tiene forma de ladrillo de tamaño aproximado de 400x200x200 nm, por lo que se trata de uno de los virus mas grandes. En virtud de la estructura superficial y el tamaño tan diferente en comparación con el virus de la fiebre aftosa, el presente ejemplo debe demostrar la amplitud de la aplicación del nuevo método.
El virus se separo del modo siguiente (tabla 6):
TABLA 6 Separación del virus de dermatitis pustulosa contagiosa ovina
Propagación del virus: Células monocapa BK-clon 3 A en recipientes apilados; recogida de 150 l de
virus después de la lisis celular
Purificación preliminar Clarificación preliminar de la suspensión de virus en bruto por centrifugación
continua a baja velocidad
Inactivación (3-propiolactona
Segunda fase de purificación Centrifugación continua a baja velocidad
Purificación de muestras Centrifugación por gradiente de densidad en tartrato sódico para la separación
de referencia: de la banda del virus
La identificación espectroscópica directa por UV queda excluida debido al tamaño del virus, puesto que en un virus de este tamaño, la luz en el UV se dispersa. Por otra parte, la muestra de dermatitis pustulosa contagiosa ovina presenta una concentración demasiado baja para la detección UV, incluso después de la segunda etapa de purificación (tabla 6). Por tanto, el virus solo puede identificarse mediante detección por fluorescencia.
Baypamun® (un modulador inmunológico comercial de la empresa Bayer AG a base de virus inactivados de dermatitis pustulosa contagiosa ovina) se incubo con YOYO (1 umolar) durante 30 minutos a temperatura ambiente y a continuación se separo mediante CE (condiciones de medición en la tabla 5, pero con Tris/borato, 100 mmolar, pH 8,5 como tampón de separación). A 2,73 min el exceso de YOYO esta representado por un pico sumamente pequeño (Fig. 8a). A 9,46 min pudo aislarse el virus de dermatitis pustulosa contagiosa ovina y detectarse como serial individual. Los picos adicionales que aparecen son debidos, probablemente, a la matriz de muestra, ya que en esta zona del electroferograma fue posible medir por UV una absorción ancha. Los picos siempre aparecen durante dicha medición. No obstante, la posición de los picos no es reproducible.
De este modo ha sido posible identificar mediante detección por fluorescencia un virus con envoltura extraordinariamente grande. En el ejemplo 3.2 se describe otra identificación de la serial.
Ejemplo 2.4 Separación e identificación del núcleo del virus de dermatitis pustulosa contagiosa ovina
Como ya se ha indicado en la introducción del ejemplo 2.3, el tamaño y la concentración de virus de la dermatitis pustulosa contagiosa ovina no permiten la detección directa por UV. Además, dado que se trata de un virus con envoltura, debería intentarse estudiar el revestimiento proteínico interno que incluye el DNA (núcleo).
Se elimino la membrana lipoproteínica del Baypamun según un procedimiento modificado (9) por agitación con NP-40 (1%, 1 hora, 37ºC.) y se aglomero el núcleo por centrifugación de gradiente de densidad (sacarosa 36%, PBS 150 m molar, 225.000 g, 1 hora). La muestra así concentrada se incubo con YOYO (concentración 1 umolar) durante 30 minutos a temperatura ambiente y se midió por CE utilizando DAD (condiciones de medición en la tabla 2). El electroferograma a 257 nm (Fig. 9a) mostró una banda ancha a 4,5 min, que pudo identificarse como exceso de YOYO. De las tres señales intensas entre 6,4 y 6,8 min solo la ultima mostró el máximo de absorción a 495 nm característico de la intercalación de YOYO (Fig. 10). La muestra idéntica se estudio a continuación mas a fondo mediante detección LIF. Las condiciones de medición corresponden a las de la tabla 5, exceptuando que se prescindió de dodecilsulfato sódico en el tampón de separación (mismo tampón que en la detección UV). El tiempo total de migración se desplazo claramente debido al cambio de capilar y a la modificación de la intensidad de campo en comparación con la medición UV (Fig. 9). El YOYO en exceso se pudo identificar como un pico minúsculo a 1,9 min. De las tres señales UV solo pudo detectarse la correspondiente al producto teñido (el núcleo). Además, se consiguió un aumento de sensibilidad en un factor de 10^{4} en comparación con la detección UV del núcleo sin teñir.
Mediante estos estudios ha podido demostrarse, que no solo pueden identificarse directamente virus completos (con envoltura o sin ella), sino también partículas víricas modificadas, que pueden prepararse a partir de virus con envoltura por eliminación de la membrana lipoproteínica.
En la siguiente Sección se describe la consecución de otra mejora, conseguida gracias a una especificación adicional de las señales correspondientes al virus.
3. Especificación adicional de las partículas víricas mediante interacciones con anticuerpos durante (en) la separación por electroforesis capilar
Se han realizado investigaciones sobre el modo de diferenciar con claridad virus conocidos mediante anticuerpos específicos (MAB). Aquí se dispone de toda la diferenciación inmunológica de virus establecida en combinación directa con la separación de virus en CE.
Descripción general del método
La muestra objeto de análisis:
a)
se incuba con el anticuerpo (MAB, antisueros, mezclas de anticuerpos, anticuerpos marcados) y se separan y analizan conforme a los métodos descritos anteriormente, o bien
b)
se añaden los anticuerpos (MAB, antisueros, mezclas de anticuerpos, anticuerpos marcados) al tampón de separación y se separa y analiza el virus según una electroforesis capilar de afinidad teniendo en cuenta los métodos descritos anteriormente.
La interacción especifica del anticuerpo (anticuerpos) con el virus puede detectarse mediante un desplazamiento del tiempo de migración o por una reducción de la intensidad de la serial correspondiente al virus.
Ejemplos
En los siguientes ejemplos se incubo el virus objeto de estudio con anticuerpos específicos y a continuación se separo utilizando CE. La estabilidad del enlace anticuerpo-antígeno es lo suficientemente sólida como para superar la separación en disolventes no desnaturantes y permanecer el complejo intacto.
En consecuencia es posible medir la diferencia de tiempo de migración entre el virus libre y el complejo virus-anticuerpo de diferentes series de separación.
Ejemplo 3.1 Especificación de la serial correspondiente al virus de la dermatitis pustulosa contagiosa ovina mediante desplazamiento del tiempo de migración utilizando anticuerpos monoclonales
La muestra de dermatitis pusturlosa contagiosa ovina del ejemplo 2.3 después de la incubación con el colorante se mezclo adicionalmente con un anticuerpo de virus de dermatitis pustulosa contagiosa ovina (MAB) (2 ug/ml) y se incubo durante otros 30 minutos a temperatura ambiente. Las condiciones de medición fueron idénticas a las del ejemplo 2.3. La Fig. Bb ilustra el electroferograma. Este solo difiere del electroferograma del virus libre en la posición de la serial correspondiente al virus (Fig. 8). La serial de fluorescencia del virus de dermatitis pustulosa contagiosa ovina se desplazo de 9,46 min a 9,34 min debido al enlace del MAB; el desplazamiento pudo reproducirse. Debido al tamaño del virus no era de esperar un desplazamiento mayor. La extensión del ámbito de aplicación del presente método pudo demostrarse mediante este ensayo, por estar este virus entre los de mayor tamaño en general. El desplazamiento de la serial demuestra que la serial de fluorescencia procede de hecho del virus y, cuando el MAB tiene la especificidad suficiente, también puede asignarse la serial al virus de la dermatitis pustulosa contagiosa ovina. En el ejemplo siguiente se expone como puede obtenerse un desplazamiento claramente superior en el caso de virus mas pequeños.
Ejemplo 3.2 Especificación de la serial correspondiente al virus de la fiebre aftosa mediante desplazamiento del tiempo de migración utilizando anticuerpos monoclonales
La muestra de referencia del ejemplo 1.1 (100 ug/ml), que corresponde a la cepa de virus OK, (Or Kaufbeuren) conocida en la bibliografía, se mezclo con distintos MAB (1-10 ug/ml) de virus de fiebre aftosa Oi y se incubo con ácido antraquinono-1-sulfónico como patron interno (2 ug/ml) durante 30 minutos a temperatura ambiente y midio en las condiciones indicadas en la tabla 2. Los tiempos relativas de migración (t_{mf}) de las muestras incubadas se compararon con el tmr del virus puro, muestras del cual se prepararon del mismo modo y en las mismas condiciones de medición (Fig. 11a). Las bandas oscuras muestran el t_{mr} del virus puro y las bandas claras muestran el t_{m}, de los virus incubados con anticuerpos. Los distintos MAB se registran en abscisas y se midieron de izquierda a derecha en la secuencia. En las bandas oscuras se aprecia una ligera caída inicial del t_{mr}, que puede atribuirse a un capilar no totalmente equilibrado. Se pudo observar un desplazamiento algo marcado del t_{mr} para los anticuerpos 24, 37, 48 y 99. De este modo se pudo asignar la muestra de referencia investigada desde el punto de vista serológico a la cepa Oi. La magnitud del desplazamiento no representa una medida directa de la afinidad del MAB. El desplazamiento viene determinado por el comportamiento de migración y por el numero de anticuerpos enlazados. Todos los MAB de acción positiva mostraron un desplazamiento del t_{mr} entre 0,05 y 0,13. El anticuerpo 75 no produjo un desplazamiento apreciable del t_{mr} y, por tanto, la identificación del virus mediante este anticuerpo no pudo demostrarse. Es posible que los tiempos de migración del MAB 75 y de la cepa del virus de fiebre aftosa OK, fueran demasiado parecidos, o bien que el MAB 75 no reconoce esta cepa del virus.
Con objeto de comprobar el enlace entre el MAB y la cepa de fiebre aftosa Oi_{k}, se incubaron los mismos anticuerpos con cepa de fiebre aftosa Oi_{m} bajo idénticas condiciones y se midieron comparativamente (O_{1m} (Oi-Manisa) es otra cepa de virus conocida en la bibliografía). En este caso también se aprecia la caída inicial del t_{mr} en las bandas oscuras. Tras incubación con los MAB (bandas claras) solo el MAB 75 mostró un desplazamiento importante de 0,10. Según esto, este MAB reconoce claramente la cepa de fiebre aftosa O_{1m}. Dado que las cepas de fiebre aftosa O_{1m} y O_{1k} se detectaron a un t_{mr} muy similar, se excluye el no reconocimiento de la cepa de fiebre aftosa OK, debido a tiempos de migración similares del virus y del complejo virus-MAB. De este modo ha podido confirmarse el MAB 75 como anticuerpo de la cepa del virus de fiebre aftosa O_{1m} mientras que todos los demás MAB solamente reconocen la cepa del virus de fiebre aftosa O_{1k}. El resto de los MAB desplazan la cepa del virus de fiebre aftosa O_{1m} como máximo en 0,02, lo cual debe considerarse no específico en comparación con la Fig. 11a.
Las mediciones arriba descritas demuestran claramente que los virus y las partículas víricas (virus inactivados, núcleos) pueden analizarse y detectarse directamente mediante la utilización del método que acaba de desarrollarse. Incluso las matrices de muestras del complejo (concentrado bruto de fiebre aftosa, Baypamun) no interfieren con el análisis. Ha podido demostrarse la extensión del ámbito de aplicación de este método para virus muy diferentes, mediante los ejemplos de virus pequeños de tipo Picornavirus (fiebre aftosa), el virus de dermatitis pustulosa contagiosa ovina, con un gran revestimiento, y el núcleo de los mismos. Los virus han podido detectarse específicamente mediante reactivos de tinción específicos para nucleótidos, tanto por radiación UV como por fluorescencia. Con relación a esto, han podido observarse aumentos enormes de sensibilidad. Los virus o partículas víricas pueden detectarse específicamente por formación de complejos con anticuerpos. El reconocimiento con anticuerpos ha podido documentarse incluso en presencia de reactivos de tinción. De este modo se aporta un repertorio analítico completo para la identificación general de componentes víricos en matrices de complejos. Por todo ello, este método tiene un potencial de utilización considerable, tanto para el control de procesos como para el diagnostico de virus.
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Claims (7)

1. Método para la detección o cuantificación no destructiva de virus o partículas víricas en una matriz de muestra liquida conteniendo componentes secundarios orgánicos o inorgánicos, partes de proteínas, nucleótidos u otros virus, por el cual
a)
se separan los virus o las partículas viricas de los fragmentos de proteínas y/o los nucleótidos en los fluidos corporales mediante un sistema de electroforesis capilar y se registran en un electroferograma y
b)
se identifican las fracciones como picos correspondientes a los virus mediante la interpretación de los datos del electroferograma, habiéndose teñido los virus o las partículas víricas con un reactive de unión a RNA/DNA, permitiendo la identificación espectroscópica.
2. Método según la reivindicación 1, que comprende una etapa mas de incubación del virus o de las partículas víricas con reactivos de unión a RNA/DNA antes de la separación por electroforesis.
3. Método según la reivindicación 1, que comprende una etapa mas de adición del reactive de unión a RNA/DNA al tampón de separación, con la consiguiente tinción del virus o de las partículas víricas en el capilar durante la separación por electroforesis.
4. Método según las reivindicaciones 1-3, que comprende una etapa mas de adición de una muestra de referencia de un virus conocido o de una partícula vírica conocida al fluido corporal para la identificación de las fracciones.
5. Método según las reivindicaciones 1-4, que comprende una etapa mas de incubación del virus o de las partículas víricas con anticuerpos específicos, con el consiguiente desplazamiento del tiempo de migración electroforético o variación en la serial correspondiente al virus.
6. Método según las reivindicaciones 1-5, caracterizado por permitir la supervisión y control de virus durante la fabricación de vacunas.
7. Método según las reivindicaciones 1-5, caracterizado por permitir el diagnostico de virus en tejidos biológicos, concretamente en fluidos corporales.
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