ES2214743T3 - Combinacion de citocinas con actividad neurotrofica. - Google Patents
Combinacion de citocinas con actividad neurotrofica.Info
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Abstract
Una composición farmacéutica con actividad neurotrófica que comprende una cantidad biológicamente activa de al menos una combinación de TGF- y NGF o NT o CNTF o FGF o EGF o GDF, o derivados o partes funcionalmente activos de los mismos, y opcionalmente un vehículo y/o un diluyente farmacéuticamente aceptable.
Description
Combinación de citocinas con actividad
neurotrófica.
La presente invención trata de una composición
farmacéutica con actividad neurotrófica para el tratamiento de
trastornos periféricos y/o del SNC en mamíferos.
La GDF-5 es una molécula análoga
a la proteína morfogenética ósea que, al igual que otros miembros de
la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta
(TGF-\beta) y ha sido implicada en funciones
neurotróficas. Por ejemplo, se ha demostrado que el
TGF-\beta1, -\beta2 y -\beta3, así como la
activina A, las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) -2, -4, -6,
-7, -12, los análogos de factores neurotróficos derivados de líneas
celulares gliales (análogos de GDNF) y la GDF-5,
favorecen la supervivencia in vitro de neuronas
dopaminérgicas mesencefálicas mediante diversos mecanismos. El
GDNF también actúa sobre un amplio espectro de neuronas
periféricas.
El descubrimiento del GDNF como un factor
neurotrófico de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas fue un
hito en la investigación de nuevas moléculas que podían ser
importantes en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas,
tales como, por ejemplo, la enfermedad de Parkinson. La importancia
del GDNF está adicionalmente subrayada por su eficacia en numerosos
modelos animales de EP, incluyendo primates no humanos, su expresión
ubicua en neuronas del SNC y su creciente espectro de poblaciones de
neuronas sensibles. El GDNF señaliza a través del receptor de
tirosin-cinasa c-ret en cooperatividad con un
receptor \alpha unido a PGI, el GDNFR-\alpha.
El GDNF es un miembro de la superfamilia
TGF-\beta, siendo su pariente más cercano la
neurturina. Unas mutaciones dirigidas del GDNF o de los genes
c-Ret han indicado que el GDNF es esencialmente
necesario para el desarrollo del riñón, importantes porciones del
sistema nervioso entérico y los ganglios simpáticos cervicales
superiores. Sin embargo, el GDNF no colabora en la supervivencia de
la mayoría de las neuronas periféricas en cultivos disociados de
baja densidad y medios definidos. Todos los experimentos de
seguimiento en los que se ha mostrado que el GDNF favorece la
supervivencia de neuronas autónomas periféricas enriquecidas y
neuronas sensoriales se realizaron usando suero a lo largo de todo
el periodo de cultivo. Adicionalmente, se estableció el efecto
dopaminotrófico del GDNF en un sistema de cultivo extremadamente
complejo, donde su efecto más destacado no se hizo evidente hasta
el día 7 de cultivo.
Los TGF-\beta son citocinas
ampliamente distribuidas y de actuación contextual, con importantes
papeles en el desarrollo y control del ciclo celular. Los
TGF-\beta se han implicado en la regulación de la
supervivencia de neuronas, por ejemplo, de motoneuronas, neuronas
sensoriales y neuronas dopaminérgicas mesencefálicas. Debería
apreciarse, no obstante, que el TGF-\beta no
muestra efectos, o son periféricos, sobre cultivos de neuronas muy
enriquecidos libres de suero, como por ejemplo, neuronas
sensoriales.
El documento
WO-A-9711965 describe un
procedimiento para tratar las lesiones o degeneraciones de las
neuronas colínicas prosencefálicas basales mediante la
administración de GDNF solo o en combinación con un segundo agente
terapéutico tal como NGF, BDNF, NT-3,
NT-4/5, bFGF o CNTF. El documento
WO-A-9719694 describe un
procedimiento para tratar las lesiones o degeneraciones de las
neuronas retinianas mediante la administración de GDNF solo o en
combinación con BDNF, NT-3, NT-4/5,
NT-6, ILGF, FGF-5 o
TGF-\beta. El documento
EP-A-0454400 describe que el
TGF-\beta solo o en combinación con CSF aumenta el
número de granulocitos y monocitos/macrófagos en mamíferos.
Así, el problema técnico subyacente en la
presente invención es proporcionar un nuevo sistema con actividad
neurotrófica mejorada para el tratamiento de trastornos periféricos
y/o del SNC en mamíferos.
La solución al anterior problema técnico se
consigue mediante las realizaciones descritas en las
reivindicaciones.
En particular, la presente invención trata de una
composición farmacéutica con una actividad neurotrófica que
comprende una cantidad biológicamente activa de al menos una
combinación de TGF-\beta y NGF o NT o CNTF o FGF o
EGF o GDF, o una combinación de TGF-\alpha y
GDF-5 o derivados o partes funcionalmente activos
de los mismos, y opcionalmente un vehículo y/o un diluyente
farmacéuticamente aceptable. El término
"TGF-\beta" incluye
TGF-\beta1, TGF-\beta2 y
TGF-\beta3. Los términos "derivado
funcionalmente activo" y "parte funcionalmente activa" se
refieren a compuestos proteicos que muestran al menos parte de la
función biológica de la citocina respectiva. Las citocinas usadas
en la composición farmacéutica según la presente invención pueden
elegirse del grupo consistente en GDF tales como
GDF-5, GDF-6, GDF-7,
GDF-8 Y GDF-9, TGF tales como
TGF-\alpha o TGF-\beta, por
ejemplo, TGF-\beta1, TGF-\beta2
o TGF-\beta3, NGF, neurotrofinas tales como
NT-3 o NT-4, EGF, CNTF y FGF tales
como FGF-2.
Las realizaciones preferibles de la composición
farmacéutica de la presente invención comprenden las siguientes
combinaciones: TGF-\beta y FGF-2 o
CNTF o NT-3 o NGF.
Como un hecho sorprendente, si está presente al
menos una de TGF-\beta o GDF-5 en
la composición farmacéutica definida anteriormente, puede observarse
un efecto sinérgico que da como resultado una actividad
neurotrófica aumentada.
La composición farmacéutica según la presente
invención puede usarse para el tratamiento de trastornos periféricos
y/o del SNC en mamíferos, preferiblemente en el hombre, tales como
la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, ELA u otra
demencia, otros trastornos neurodegenerativos del sistema nervioso
central y neuropatías periféricas, incluyendo los causados por
diabetes, cisplatino, u otras enfermedades genéticas o adquiridas
de los nervios periféricos.
Las figuras muestran:
Fig. 1: supervivencia de neuronas DRG E8
cultivadas durante 48 horas en presencia de diversos factores
tróficos a concentraciones saturantes, con o sin la adición de
GDF-5, a una concentración constante de 20 ng/ml.
Los valores representan las medias + SEM de al menos dos
experimentos independientes con determinaciones por triplicado.
Fig. 2: efecto del TGF-\beta
endógeno neutralizante en cultivos de neuronas mesencefálicas.
Número de neuronas TH-inmunoreactivas supervivientes
de los cultivos mesencefálicos (E14/DIV8) después de 8 días de
cultivo tratadas con FGF-2 (10 ng/ml),
sólo medio (control), en presencia o ausencia de
anticuerpos neutralizantes de TGF-\beta1/-\beta2/-\beta3 (10 \mug/ml). Los datos se dan como media \pm SEM (n=3), los valores de P son ***P<0,001 para el aumento de la supervivencia comparado con los cultivos de control, y +P<0,05 o +++P<0,001 para la disminución de la supervivencia subsiguiente al tratamiento con anticuerpos.
sólo medio (control), en presencia o ausencia de
anticuerpos neutralizantes de TGF-\beta1/-\beta2/-\beta3 (10 \mug/ml). Los datos se dan como media \pm SEM (n=3), los valores de P son ***P<0,001 para el aumento de la supervivencia comparado con los cultivos de control, y +P<0,05 o +++P<0,001 para la disminución de la supervivencia subsiguiente al tratamiento con anticuerpos.
Fig. 3: el TGF-\beta endógeno
neutralizante reduce los efectos favorecedores de la supervivencia
del CNTF y del FGF-2 sobre neuronas GC de pollo. Los
cultivos se trataron sólo con CNTF (A) o FGF-2
(B)
(-\bullet-) a las concentraciones indicadas, o en combinación con anticuerpos neutralizantes (-\blacksquare-) de TGF-\beta1, -\beta2, -\beta3 (1 \mug/ml). Los datos se dan como media
\pm SEM (n=3). Los valores de P son *P<0,05; **P<0,01 para la disminución de la supervivencia en la combinación de factor de crecimiento más anti-TGF-\beta, comparados con el tratamiento con factor de crecimiento solo.
(-\bullet-) a las concentraciones indicadas, o en combinación con anticuerpos neutralizantes (-\blacksquare-) de TGF-\beta1, -\beta2, -\beta3 (1 \mug/ml). Los datos se dan como media
\pm SEM (n=3). Los valores de P son *P<0,05; **P<0,01 para la disminución de la supervivencia en la combinación de factor de crecimiento más anti-TGF-\beta, comparados con el tratamiento con factor de crecimiento solo.
Fig. 4: el TGF-\beta induce
sensibilidad en las neuronas GC de pollo ante CNTF, NGF y
NT-3. los cultivos se trataron con (A) CNTF (5 ó 0,3
ng/ml), onco-estatina M, LIF, IL-6
(a 10 ng/ml), o (B) NGF, NT-3, NT-4
en ausencia o presencia de TGF-\beta (2,5 ng/ml).
Los datos se dan como porcentaje supervivencia de la meseta de CNTF
como medias \pm SEM (n=3). *P<0,05, **P<0,01 para el aumento
de la supervivencia en la combinación con
TGF-\beta3, comparados con el correspondiente
tratamiento con factor de crecimiento solo.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención:
Los factores de crecimiento
TGP-\beta1 y -\beta3, el factor de crecimiento
transformante a y TGF-\alpha, también muestran los
efectos sinérgicos o aditivos cuando se añaden junto con
GDF-5 a cualquier concentración ensayada (Fig.
1).
Se sabe que el factor de crecimiento de
fibroblastos (FGF-2) actúa como un factor
neurotrófico en las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo
anterior. Los estudios iniciales sugirieron que el efecto
neurotrófico ejercido por FGF-2 es fundamentalmente
indirecto, y está mediado por los ganglios mesencefálicos (Engele
and Bohn, J. Neurosci. 11 (1991), 3070-3078). Como
se sabe que el TGF-\beta es un producto de las
células astrogliales, se ensayó si los anticuerpos neutralizantes
de TGF-\beta podían suprimir el efecto
neurotrófico de FGF-2 en neuronas cultivadas
derivadas de la base del mesencéfalo embrionario. La Figura 2
muestra que el tratamiento de las neuronas cultivadas con
FGF-2 (10 ng/ml) produjo un aumento de 1,7 veces en
la supervivencia de las células, comparado con el control negativo
(sólo medio). Por el contrario, la adición de anticuerpos
específicos para TGF-\beta1/-\beta2/ -\beta3
suprimió completamente el efecto favorecedor de la supervivencia de
FGF-2. Estos datos demuestran que el efecto
neurotrófico de FGF-2 sobre neuronas dopaminérgicas
del mesencéfalo anterior está mediado por
TGF-\beta.
El TGF-\beta fue capaz de
actuar sinérgicamente con FGF-2 y CNTF sobre el
control de la supervivencia de neuronas ganglionares ciliares (GC)
de pollo. Se empleó un anticuerpo que reconocía las isoformas de
TGF-\beta -\beta1/-\beta2/-\beta3 para
inmunoneutralizar el TGF-\beta en cultivos de
neuronas GC tratadas con CNTF o FGF-2,
respectivamente (Fig. 3). La neutralización del
TGF-\beta redujo la supervivencia de las neuronas
mediada por CNTF o FGF-2 en un 40 hasta un 60%.
Estos datos indican que el TGF-\beta liberado
desde neuronas GC cultivadas actúa sinérgicamente con factores
neurotróficos exógenos para asegurar la supervivencia de la
neurona.
El CNTF comparte el receptor y los componentes de
traducción de señales con miembros de una familia de citocinas
neuropoyéticas, que incluyen el factor inhibidor de la leucemia
(LIF), la oncostatina M (OSM) y la interleucina-6
(IL-6) (Stahl and Yanco-poulos, J.
Neuroibiol. 25 (1994), 1454-1466). Como se muestra
en la Figura 4A, el TGF-\beta aumentó claramente
la eficacia de una concentración de CNTF no saturante, en términos
de favorecer la supervivencia de las neuronas GC. Los OSM, LIF e
IL-6 no apoyaron a las neuronas GC, y la adición de
un TGF-\beta adicional no aumentó los efectos de
estas citocinas más allá de los niveles basales. Las neurotrofinas
no son factores tróficos establecidos para las neuronas GC
(Collins, Brain Res. 467 (1988), 111-116). Sin
embargo, en combinación con TGF-\beta, tanto NGF
como NT-3 favorecieron la supervivencia a un
35-40% de la meseta de CNTF (Fig. 4B). Aunque la
expresión de los receptores trkA, que permiten la señalización de
NGF y NT-3 sobre las neuronas GC, aún no ha se ha
demostrado, los datos presentados indican que el
TGF-\beta puede cooperar en la señalización de las
neuronas GC mediada por receptores de neurotrofinas.
CMF: disolución salina equilibrada de Hank libre
de Ca^{+2}/Mg^{+2}, DMEM: medio de Eagle modificado con
Dulbecco, y PSN fueron adquiridos en Gibco. La
poli-L-ornitina, laminina, A23187,
carbacol y verapamilo se adquirieron en Sigma, la albúmina sérica
bovina (ASB) en Serva (Heidetberg, Alemania) y
PIPLC en Boehringer Mannheim (Alemania).
PIPLC en Boehringer Mannheim (Alemania).
El suero de caballo (SC) se adquirió en Gibco,
los lotes de suero vacuno fetal (SVF) 1 y 2 en PAA, los lotes de SVF
3 y 4 en Euro y los lotes de SVF 5 y 6 en PAN.
Los factores de crecimiento se obtuvieron en
Boehringer Mannheim (NGF, NGF 2,5 S y LIF recombinante humano (rh)),
IC Chemikalien (CNTF recombinante de rata (rr), GDNF rh, Oncostatina
M (OSM) rh, IL-6 rh, NT-3 rh y
NT-4 rh. El GDF-5 se produjo según
se describe (Krieglstein y col., J. Neurosci. Res.,
42(5), (1995), 724-732). El
FGF-2 rh para los experimentos según la Fig. 2 se
obtuvo de Progen, y para el resto de experimentos, de IC
Chemikalien. Los factores liofilizados se resuspendieron en medio
de cultivo (véase a continuación) para dar una concentración final
de 1 \mug/ml, y se almacenaron en alícuotas de
50-100 \mul a -70ºC hasta su uso.
El anticuerpo neutralizante de
TGF-\beta1,2,3 se adquirió en Genzyme, y el de
GDNF en Santa Cruz Biotechnology.
Los conjugados de anticuerpos en agarosa de
TGF-\beta1 y de GDNF eran de Santa Cruz
Biotechnology. El anticuerpo \alpha-ratón
conjugado de peroxidasa se adquirió en Sigma.
Animales para los experimentos según la Fig.
1
Los huevos blancos fertilizados de pollo de
Livorno se obtuvieron de un aviario local, y se incubaron en una
cámara de huevos humidificada a 37,8ºC.
Animales para los experimentos según la Fig.
2-4
Los huevos blancos fertilizados de pollo de
Livorno se obtuvieron de un aviario local, y se incubaron en una
cámara de huevos humidificada a 38ºC hasta E8.
Cultivos celulares para los experimentos según la
Fig. 1.
Se diseccionaron, se liberaron de raíces
nerviosas y tejido conectivo y se recogieron en CMF ganglios
ciliares (GC), de raíces dorsales (GRD) y simpáticos (GS) de
embrión de pollo en los días embrionarios 8, 10 y 12. Los ganglios
se incubaron en tripsina (ICN), se lavaron y se disociaron mediante
trituración usando pipetas Pasteur pulidas al fuego. Los cultivos
se prepararon en placas de microtitulación de 96 pocillos (Costar,
A/2), se precubrieron con
poli-L-ornitina y laminina a una
densidad de 1.200-1.500 céls./pocillo en DMEM
suplementado con aditivos N1, ASB al 0,25% y PSN al 0,1% (DME/N1),
y se incubaron a 37ºC en una estufa de incubación con CO_{2} al
5%.
En los momentos adecuados (GC: 24h, GRD: 48 h,
GS: 72h) los cultivos se fijaron mediante la adición de
glutardialdehído al 2,5% en salino tamponado con fosfato (PBS). El
número de neuronas supervivientes se determinó por recuento directo
del 30% del área superficial, usando microscopía de contraste de
fases.
Las líneas celulares B49, 3T3 y COS se hicieron
crecer en FCS/DMEM al 10% con PSN al 1%, y la línea celular BHK se
preparó en DMEM/F 12 con FCS al 5% y PSN al 1% en matraces de
cultivo de plástico.
El medio condicionado de estas diferentes líneas
celulares se recogió, y se almacenaron alícuotas a -80ºC, y después
se prepararon para un bioensayo MLEC para determinar la actividad
del TGF-\beta.
A 1 ml del tampón de estimulación, con o sin
aditivos, de las células cromafines, se añadieron 10 \mul de
conjugado de anticuerpos en agarosa y se incubaron a 4ºC hasta el
día siguiente mezclándolos. El sedimento se lavó con PBS y después
se resuspendió en 50 \mul de tampón de electroforesis para
muestras, y se hirvió durante 2 minutos. Las muestras se separaron
mediante electroforesis en gel PAA-SDS al 12,5% y
se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Hybond, Amersham).
La membrana de nitrocelulosa se bloqueó con leche en polvo baja en
grasas al 3%/ASB al 0,1% en salino tamponado con Tris (TBS, pH
7,3), se incubó con anticuerpos primarios (1:200 en ASB/TBS al
0,1%) hasta el día siguiente a 4ºC, seguido de un anticuerpo
secundario de conjugado de peroxidasa (1:2.000 en ABS/TBS al 0,1%).
Finalmente la membrana se desarrolló usando como sistema detector
la quimioluminiscencia aumentada de Amersham (ECL).
La determinación de la actividad de los
TGF-\beta se realizó usando el bioensayo de
células epiteliales de pulmón de visón (MLEC) (Abe y col.,
Anal. Biochem. 216 (1994), 276-284) (amablemente
proporcionado por el Dr. Rifkin, New York University, Nueva York,
EE.UU.). Los cultivos de MLEC transfectados se prepararon en una
placa de microtitulación de 96 pocillos (Costar) a una densidad de
1,6 x 10^{4} céls./pocillo en DMEM (alta glucosa) con FCS al 10%
y geneticina (250 \mug/ml), y se dejaron adherir durante 3 h a
37ºC en una estufa de incubación con CO_{2} al 5%. Entonces el
medio se reemplazó por
100 \mul de muestra de ensayo DME/N1 (activado con HCl) y se incubó hasta el día siguiente a 37ºC en una estufa de incubación con CO_{2} al 5%. Las células se lavaron dos veces con PBS y se lisaron usando 100 \mul de tampón de lisis (Promega) durante 2-3 h a temperatura ambiente. Para determinar la actividad TGF-\beta se transfirieron 80 \mul de los lisados a un tubo de ensayo y se analizaron usando un Luminómetro (Lumat, Berthold/Alemania) mediante inyecciones de 100 \mul de reactivo luciferaza (Promega). Se informó de la actividad de la luciferaza relativa a las unidades de luz (RLU), y todos los ensayos se realizaron por triplicado.
100 \mul de muestra de ensayo DME/N1 (activado con HCl) y se incubó hasta el día siguiente a 37ºC en una estufa de incubación con CO_{2} al 5%. Las células se lavaron dos veces con PBS y se lisaron usando 100 \mul de tampón de lisis (Promega) durante 2-3 h a temperatura ambiente. Para determinar la actividad TGF-\beta se transfirieron 80 \mul de los lisados a un tubo de ensayo y se analizaron usando un Luminómetro (Lumat, Berthold/Alemania) mediante inyecciones de 100 \mul de reactivo luciferaza (Promega). Se informó de la actividad de la luciferaza relativa a las unidades de luz (RLU), y todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Se realizaron comparaciones estadísticas con
ANOVA de un sentido, incluido en el programa informático
MicroCalOrigin. Las diferencias se consideraron estadísticamente
significativas a *P<0,05, **P<0,005 y ***P<0,0005.
Se produjeron cultivos disociados de ganglios de
raíces dorsales de embrión de pollo (GRD) según han descrito
detalladamente Krieglstein y Unsicker (Dev. Brain. Rees. 93 (1996),
10-17). Brevemente, los GRD se diseccionaron en
disolución salina equilibrada de Hank libre de Ca^{+2}/Mg^{+2}
(CMF). Tras la incubación en tripsina al 0,08% (BioWhittaker)
durante 15 min, los ganglios se disociaron mediante trituración
suave usando pipetas Pasteur pulidas al fuego. Las células en
suspensión (proporción neuronas/no neuronas de 1:2) se sembraron en
placas de microtitulación de 96 pocillos cubiertas con
poliornitina-laminina (A/2 Costar) a una densidad de
1.200 céls./pocillo. Los factores de crecimiento se aplicaron en el
momento de cultivar en las placas Petri en un volumen final de 50
\mul de medio de Eagle modificado con Dulbecco suplementado con
albúmina sérica bovina al 0,25%, aditivos N1 (Bottenstein y
col., Exp. Cell Res. 125 (1980), 183-190) y 100
U/ml de penicilina. Como control positivo se usó factor de
crecimiento nervioso (NGF) a la concentración saturante de 10
ng/ml. Tras 48 h de incubación a 37ºC en una atmósfera humidificada
que contenía CO_{2} al 5%, los cultivos se fijaron con
glutaraldehído al 2,5% en salino tamponado con fosfato (PBS). Las
células neuronales se identificaron por su brillo de fase y las
morfologías de sus axones, y se contaron dentro del 30% del área
superficial total usando microscopía de contraste de fases. Todos
los experimentos se realizaron al menos por triplicado en dos
experimentos independientes. Los datos se presentaron como la media
\pm SEM. Se realizaron comparaciones estadísticas con la prueba
doble de la t de Student, ANOVA y el programa informático
MicrocalOrigin. Las diferencias se consideraron estadísticamente
significativas a *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001.
Se realizó una adrenomedulectomía en ratas macho
adultas Hanover-Wistar. Las neuronas preganglionares
de la médula espinal que inervan las células cromafines de la
médula adrenal se identificaron mediante marcaje retrógado con Fast
Blue o Fluoro-Oro (FO). Los factores (1 \mug cada
uno) se impregnaron con espuma de gel (Spongostan, Ferrosan,
Soeburg, Dinamarca) antes de su implantación en glándulas adrenales
medulectomizadas unilateralmente. El número de neuronas
preganglionares marcadas con FO se determinó mediante recuentos
celulares de series completas de secciones longitudinales a lo
largo de los segmentos T7-T10 de la médula espinal
cuatro semanas después de la cirugía. Sólo se contaron las neuronas
con brillo fluorescente que contenían un núcleo claramente visible.
El número total se corrigió ante posibles recuentos dobles según la
fórmula de Abercombie. El número de neuronas preganglionares de la
médula adrenal que sobrevivió en animales con operaciones simuladas
y en el lado no lesionado se estableció en el 100%. Los datos se dan
como valores medios \pm SEM, y la significación estadística de
las diferencias entre los grupos se determinó mediante la prueba de
la t de Student.
Se realizaron hibridaciones in situ sobre
cortes en parafina de la médula espinal torácica esencialmente como
se describe en Arumäe y col. (J. Cell Biol.
122 (1993), 1053-1065). Las sondas derivaban de GFR\alpha-1 de rata, nucleótidos 294-1039, y de cRet de ratón, nucleótidos 2534-3217. Tras la hibridación todas las secciones se bañaron y expusieron durante
2-3 semanas, se contratiñeron con hemotoxilina, se secaron con aire y se incluyeron en DPX. No se detectó señal alguna de hibridación con las sondas en orientación sentido.
122 (1993), 1053-1065). Las sondas derivaban de GFR\alpha-1 de rata, nucleótidos 294-1039, y de cRet de ratón, nucleótidos 2534-3217. Tras la hibridación todas las secciones se bañaron y expusieron durante
2-3 semanas, se contratiñeron con hemotoxilina, se secaron con aire y se incluyeron en DPX. No se detectó señal alguna de hibridación con las sondas en orientación sentido.
Claims (15)
1. Una composición farmacéutica con actividad
neurotrófica que comprende una cantidad biológicamente activa de al
menos una combinación de TGF-\beta y NGF o NT o
CNTF o FGF o EGF o GDF, o derivados o partes funcionalmente activos
de los mismos, y opcionalmente un vehículo y/o un diluyente
farmacéuticamente aceptable.
2. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1, que comprende TGF-\beta y
FGF-2.
3. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1, que comprende TGF-\beta y
CNTF.
4. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1, que comprende TGF-\beta y
NT-3.
5. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1, que comprende TGF-\beta y
NGF.
6. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1, que comprende TGF-\beta y
GDF-5.
7. Una composición farmacéutica con actividad
neurotrófica que comprende una cantidad biológicamente activa de al
menos una combinación de TGF-\alpha y
GDF-5.
8. Uso de cantidades biológicamente activas de al
menos dos citocinas o derivados o partes funcionalmente activos de
los mismos, y opcionalmente un vehículo y/o un diluyente
farmacéuticamente aceptable, para la preparación de una composición
farmacéutica para el tratamiento de trastornos periféricos y/o del
SNC en mamíferos, en el que las al menos dos citocinas comprenden
una combinación de TGF-\beta y GDNF o NGF o NT o
CNTF o FGF o EGF o GDF, o una combinación de
TGF-\alpha y GDF-5.
9. El uso según la reivindicación 8, en el que la
composición farmacéutica comprende GDNF y
TGF-\beta.
10. El uso según la reivindicación 8, en el que
la composición farmacéutica comprende TGF-\beta y
FGF-2.
11. El uso según la reivindicación 8, en el que
la composición farmacéutica comprende TGF-\beta y
CNTF.
12. El uso según la reivindicación 8, en el que
la composición farmacéutica comprende TGF-\beta y
NT-3.
13. El uso según la reivindicación 8, en el que
la composición farmacéutica comprende TGF-\beta y
NGF.
14. El uso según la reivindicación 8, en el que
la composición farmacéutica comprende TGF-\beta y
GDF-5.
15. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 14, en el que el trastorno del SNC es la
enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, ELA u otra
demencia, otros trastornos neurodegenerativos del sistema nervioso
central y neuropatías periféricas, incluyendo los causados por
diabetes, cisplatino, u otras enfermedades genéticas o adquiridas
de los nervios periféricos.
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| WO2004011497A1 (en) | 2002-07-31 | 2004-02-05 | Stem Cell Therapeutics Inc. | Method of enhancing neural stem cell proliferation, differentiation, and survival using pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (pacap) |
| WO2005077404A1 (en) | 2004-02-13 | 2005-08-25 | Stem Cell Therapeutics Corp. | Use of luteinizing hormone (lh) and chorionic gonadotropin (hcg) for proliferation of neural stem cells and neurogenesis |
| US20060069008A1 (en) * | 2004-09-28 | 2006-03-30 | Sanjay Mistry | Treatment of neurological deficits in the striatum or substanta nigra pars compacta |
| US20060269525A1 (en) * | 2005-05-25 | 2006-11-30 | Sean Lilienfeld | Co-grafts for treating Parkinson's disease |
| WO2007002512A2 (en) * | 2005-06-23 | 2007-01-04 | Tissuegene, Inc. | Neuroprotective effective compound |
| US7534765B2 (en) | 2005-09-27 | 2009-05-19 | Stem Cell Therapeutics Corp. | Pregnancy-induced oligodendrocyte precursor cell proliferation regulated by prolactin |
| ES2382464T3 (es) * | 2005-11-18 | 2012-06-08 | Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh | Mutantes de factor del crecimiento de actividad elevada |
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| WO2007127803A2 (en) * | 2006-04-25 | 2007-11-08 | The Regents Of The University Of California | Administration of growth factors for the treatment of cns disorders |
| US20070259031A1 (en) * | 2006-04-26 | 2007-11-08 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for convection enhanced delivery of high molecular weight neurotherapeutics |
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| WO2010093925A2 (en) * | 2009-02-12 | 2010-08-19 | Stryker Corporation | PERIPHERAL ADMINISTRATION OF PROTEINS INCLUDING TGF-β SUPERFAMILY MEMBERS FOR TREATMENT OF SYSTEMIC DISORDERS AND DISEASE |
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Family Cites Families (6)
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|---|---|---|---|---|
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