ES2215093T3 - Derivados de 3-tiazol-4-il-pirrolidina como inhibidores de la fosfodiesterasa especifica de amp. - Google Patents

Abstract

Compuesto que tiene como fórmula **(Fórmula)** donde R1 es alquilo C1-C6, alquilo puente, aralquilo, cicloalquilo, un heterociclo saturado de 5 ó 6 lados, C1-3 alquileno cicloalquilo, propargil aril- o heteroaril sustituido, alilo aril- o heteroaril sustituido, o halocicloalquilo; R2 es hidrógeno, metilo o metilo halo-sustituido;R3 se elige dentro del grupo formado por C(=O)OR7, C(=O)R7, C(=NH)NR8R9, C(=O)NR8R9, C1-C6alquilo, alquilo puente, cicloalquilo, haloalquilo, halocicloalquilo, C1-C3alquileno cicloalquilo, un heterociclo saturado de 5 ó 6 lados, arilo, heteroarilo, heteroaril-SO2, aralquilo, alcarilo, heteroaralquilo, heteroalcarilo, C1~3alquilenoC(=O)OR7, C(=O)C1~3alquilenoC(=O)OR7, C1~3alquileno heteroarilo, C(=O) C(=O)OR7, C(=O) C1~3alquilenoC(=O)OR7, C(=O) C1~3alquilenoNHC(=O)OR7, C(=O)C1~3 alquilenoNH2 y NH2C(=O) OR7. R4 es hidrógeno, C1-C6alquilo, haloalquilo, cicloalquilo, arilo, C(=O)R7, OR8, NR8R9, o SR8. R5 hidrógeno, C1-C6alquilo, haloalquilo, cicloalquilo o arilo; R7 seelige dentro del grupo formado por cicloalquilo, C1-C6alquilo ramificado y no ramificado, heteroarilo, arilo, un heterociclo, aralquilo, y R7 se sustituye opcionalmente por uno o más OR8, NR8R9 o SR8; y R8 y R9, iguales o diferentes, se eligen dentro del grupo formado por hidrógeno, C1-C6alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, alcarilo, heteroaralquilo, heteroalcarilo y aralquilo, o R8 y R9 se toman juntos para formar un anillo de 4 a 7 lados; R10 es hidrógeno, alquilo, haloalquilo, cicloalquilo, arilo, C(=O)alquilo, C(=O)cicloalquilo, C(=O)arilo, C(=O) Oalquilo, C(=O)Ocicloalquilo, C(=O) arilo, CH2OH, CH2Oalquilo, CHO, CN, NO2, o SO2R11; y R11 es alquilo, cicloalquilo, trifluormetilo, arilo, aralquilo, o NR8R9.

Description

Derivados de 3-tiazol-4-il-pirrolidina como inhibidores de la fosfodiesterasa específica de AMP.

La presente invención se refiere a una serie de compuestos que son inhibidores potentes y selectivos de la fosfodiesterasa específica de adenosina 3', 5'-monofosfato cíclico (PDE específica de cAMP). En particular, la presente invención se refiere a una serie de nuevos compuestos de tiazol, que resultan útiles para inhibir la función de la PDE específica de cAMP, en particular, PDE4, así como métodos para la fabricación de los mismos, composiciones farmacéuticas que contienen los mismos, y su utilización como agentes terapéuticos, como por ejemplo en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y otras enfermedades con niveles elevados de citoquinas y mediadores proinflamatorios.

La inflamación crónica es una complicación patológica multifactorial caracterizada por la activación de múltiples tipos de células inflamatorias, en particular células de linaje linfoide, (inclusive linfocitos T) y linaje mieloide (inclusive granulocitos, macrófagos y monocitos). Los mediadores proinflamatorios, incluidos las citoquinas, como el factor de necrosis tumoral (TNF) y la interleucina-1 (IL-1) son producidos por estas células activadas. Por consiguiente, todo agente que suprima la activación de estas células, o su producción de citoquinas proinflamatorias, resultaría útil en el tratamiento terapéutico de patologías inflamatorias y otras enfermedades con elevados niveles de citoquinas.

El monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) es un segundo mensajero que actúa como mediador en las respuestas biológicas de las células a una amplia gama de estímulos extracelulares. Si el agonista adecuado se une a receptores específicos de la superficie celular, se activa la adenilato ciclasa para convertir el trifosfato de adenosina (ATP) en cAMP. Se afirma en la teoría que las acciones de cAMP inducidas por agonistas dentro de la célula son medidas predominantemente por la acción de las proteíno quinasas dependientes de cAMP. Las acciones intracelulares de cAMP terminan con un transporte del nucleótido al exterior de la célula o por clivaje enzimático por nucleótido fosfodiesterasas cíclicas (PDEs), que hidrolizan el enlace 3'-fosfodiéster para formar 5'-adenosina monofosfato (5'-AMP). 5'-AMP es un metabolito inactivo. Las estructuras de cAMP y 5'-AMP se ilustran a continuación.

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Los niveles elevados de cAMP en células de linaje linfoide y mieloide humano se asocian a la supresión de la activación celular. La familia de enzimas intracelulares de PDEs, por consiguiente, regula el nivel de cAMP en las células. PDE4 es un isotipo PDE predominante en estas células y contribuye en gran medida a la degradación de cAMP. Por consiguiente, la inhibición de la función PDE evitaría la conversión de cAMP en el metabolito inactivo 5'-AMP y, por consiguiente mantendría niveles de cAMP más elevado y por lo tanto suprimiría la activación celular (véase Beavo et al., "Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action" (Nucleótido fosfodiesterasas cíclicas: Estructura, Regulación y Acción Farmacológica) Wiley and Sons, Chichester, pp.3-14, (1990)), Torphy et al., Drug News and Perspectives, 6, pp. 203-214 (1993); Giembycz et al., Clin. Exp. Allergy, 22, pp.- 337-344 (1992)).

En particular, los inhibidores de PDE4 como rolipram han mostrado que inhiben la producción de TNF\alpha y que inhiben parcialmente la liberación de IL-1\beta por monocitos (véase Semmler et al., Int. J. Immunopharmacol., 15, pp. 409413, (1993); Molnar-Kimber et al., Mediators of Inflamation, (Mediadores de inflamación) 1 pp. 411-417, (1992)). Se ha visto también que los inhibidores de PDE4 inhiben la producción de radicales superóxidos de los leucocitos polimorfonucleares humanos (véase Verghese et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 21 (Suppl. 2) S61 (1989); Nelson et al., J. Allergy Immunol., 86, pp. 801-808, (1990)); inhiben la liberación de aminas vasoactivas y prostanoides de basofílos humanos (véase Peachell et al., J. Immunol., 148, pp. 25032510, (1992)); inhiben el aumento brusco del consumo de oxígeno (respiratory bursts) en los eosinófilos (véase Dent et al., J. Pharmacol., 103, pp. 1339-1346, (1991)); e inhiben la activación de los linfocitos T humanos (véase Robicsek et al., Biochem. Pharmacol., 42, pp. 869-877, (1991)).

La activación de células inflamatorias y la producción excesiva o no regulada de citoquina (por ejemplo TNF\alpha e IL-1\beta) están implicadas en las enfermedades y trastornos alérgicos, autoinmunitarios e inflamatorios tales como la artritis reumatoide, la osteoartritis, la artritis gotosa, la espondilitis, la oftalmopatia asociada con la tiroides, la enfermedad de Behcet, la septicemia, el shock séptico, el shock endotóxico, la septicemia gram negativa, la septicemia gram positiva, el síndrome de shock tóxico, el asma, la bronquitis crónica, el síndrome disneico agudo del adulto, la enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, como por ejemplo la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la silicosis, la sarcoidosis pulmonar, el traumatismo de revascularización del miocardio, cerebro y extremidades, la fibrosis, fibrosis cística, formación queloide, formación cicatricial, aterosclerosis, trastornos por rechazo de transplante, como el rechazo injerto-contra-huésped y rechazo del aloinjerto, glomerulonefritis crónica, lupus, enfermedad inflamatoria del intestino, como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, afección linfocítica proliferativa, como la leucemia y las dermatosis inflamatorias, como la dermatitis atópica, la psoriasis y la urticaria.

Otras afecciones caracterizadas por niveles elevados de citoquina pueden ser las lesiones cerebrales debidas a un trauma moderado (véase Dhillon et al., J. Neurotrauma, 12, pp. 1035-1043 (1995); Suttorp et al., J. Clin. Invest., 91, pp.1421-1428 (1993)), cardiomiopatias, como insuficiencia cardiaca congestiva (véase Bristow et al., Circulation, 97, pp. 1340-1341 (1998)), caquexia, caquexia secundaria a infección o tumores malignos, caquexia secundaria al síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) ARC (complejo relacionado con el SIDA), mialgias febriles debidas a infección, malaria cerebral, osteoporosis y enfermedades de resorción ósea, formación queloide, formación de tejido cicatricial y pirexia.

En particular, se ha comprobado que el TNF\alpha desempeña un papel con respecto al síndrome de inmunodeficiencia humana adquirida (SIDA). El SIDA es el resultado de la infección de linfocitos T con virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Si bien el VIH infecta también y se mantiene en células del linaje mieloide, el TNF, según se ha comprobado, incrementa la infección por VIH en células linfocíticas T y monocíticas (véase Poli et al., Proc. Ntal. Acad. Sci. USA, 87, pp. 782-785, (1990)).

Diversas propiedades del TNF\alpha, tales como la estimulación de colagenasas, la estimulación de la angiogénesis in vivo, la estimulación de la resorción ósea y una aptitud para aumentar la adherencia de células tumorales al endotelio son compatibles con el papel del TNF en el desarrollo y la extensión metastásica del cáncer en el huésped. El TNF\alpha se ha visto recientemente implicado en la promoción del crecimiento y la metástasis de células tumorales (véase Orosz et al., J. Exp. Med., 177, pp. 1391-1398, (1993)).

La PDE4 tiene una amplia distribución hística. Hay por lo menos cuatro genes de PDE4, cuyas múltiples transcripciones de cualquier gen determinado pueden producir diversas proteínas diferentes que comparten sitios catalíticos idénticos. La identidad de amino ácido entre los cuatro sitios catalíticos posibles es superior al 85%. Su sensibilidad compartida a los inhibidores y su semejanza cinética refleja el aspecto funcional de este nivel de identidad de amino ácido. Se dice en la teoría que la función de estas proteínas de PDE4 expresadas alternativamente permite un mecanismo mediante el cual una célula puede localizar de forma diferenciada estas enzimas intracelularmente y/o regular la eficacia catalítica por medio de una modificación post-traduccional. Todo tipo de célula dado que expresa la enzima PDE4 suele expresar más de uno de los cuatro genes posibles que codifican estas proteínas.

Los investigadores han mostrado un interés considerable por el uso de los inhibidores de PDE4 como agentes antiinflamatorios. Los datos anteriores indican que la inhibición de PDE4 tiene efectos beneficios sobre una diversidad de células inflamatorias, tales como los monocitos, los macrófagos, las células T de linaje Th-1 y los granulocitos. La síntesis y/o liberación de muchos mediadores proinflamatorios, tales como las citoquinas, mediadores lípidos, superóxido y aminas biogénicas tales como la histamina, se ven atenuadas en estas células por la acción de los inhibidores de PDE4. Los inhibidores de PDE4 afectan también otras funciones celulares, inclusive la proliferación de células T, la transmigración de granulocitos en respuesta a sustancias quimiotóxicas y la integridad de las uniones de células endoteliales dentro de la vasculatura.

Se ha informado del diseño, síntesis y selección/detección de diversos inhibidores de PDE4. Las metilxantinas, tales como la cafeína y teofilina fueron los primeros inhibidores de PDE descubiertos, si bien estos compuestos no son selectivos con respecto a la PDE que se inhibe. El fármaco Rolipram, un agente antidepresivo fue uno de los primeros inhibidores específicos de PDE4 del que se tiene información. El Rolipram, que tiene la siguiente fórmula estructural, tiene, según el informe, una Concentración Inhibidora de 50% (IC_{50}) de aproximadamente 200 nM (nanomolar) con respecto a la inhibición de PDE4 del recombinante humano.

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Los investigadores han seguido buscando inhibidores de PDE4 que sean más selectivos con respecto a la inhibición de PDE4, que tengan un IC_{50} inferior al del Rolipram y que eviten los efectos secundarios no deseables del sistema nervioso central (SNC), como por ejemplo las arcadas, los vómitos y la sedación asociados con la administración de Rolipram. En la patente US 5.665.754 de Feldman et al., se describe una clase de compuestos. Los compuestos descritos en la misma son pirrolidinas sustituidas, que tienen una estructura similar al Rolipram. Un compuesto particular, que tiene como fórmula estructural (I), tiene un IC_{50} con respecto a PDE4 de recombinante humano de aproximadamente 2 nM. En la medida en que se observó una separación favorable del efecto secundario emético respecto de la eficacia, estos compuestos no mostraron una reducción de los efectos no deseables en el SNC.

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Además, varias compañías están realizando ahora pruebas clínicas de otros inhibidores de la PDE4. No obstante, permanecen sin resolver los problemas relativos a la eficacia y a los efectos secundarios negativos, tales como la emesis y los trastornos del sistema nervioso central.

Por consiguiente, los compuestos que inhiben selectivamente la PDE4 y que reducen o eliminan los efectos secundarios negativos sobre el SNC, asociados con anteriores inhibidores de PDE4, resultarían útiles en el tratamiento de enfermedades alérgicas e inflamatorias, y otras enfermedades asociadas con una producción excesiva o no regulada de citoquinas, como el TNF. Además, los inhibidores selectivos de PDE4 serían útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas con niveles elevados de cAMP o función PDE4 en un tejido particular específico.

La presente invención se refiere a inhibidores potentes y selectivos de PDE4 útiles en el tratamiento de enfermedades y afecciones, en las que se considera beneficiosa la inhibición de la actividad de PDE4. Los presentes inhibidores de PDE4 reducen inesperadamente o eliminan los efectos secundarios negativos sobre el SNC asociados con los anteriores inhibidores de PDE4.

En particular, la presente invención se centra en compuestos que tienen como fórmula estructural (II):

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donde R^{1} es alquilo inferior, alquilo puente (por ejemplo norbornil), aralquilo (por ejemplo indanil), cicloalquilo, un heterociclo saturado de 5 ó 6 lados (por ejemplo 3-tetrahidrofurilo), C_{1-3} alquileno cicloalquilo (por ejemplo ciclo pentil metilo), propargil aril- o heteroaril sustituido (por ejemplo -CH_{2}CH\equivC-C_{6}H_{5} ), alilo aril- o heteroaril sustituido (por ejemplo -CH_{2}CH=CH-C_{6}H_{5} ) o alocicloalquilo (por ejemplo, fluor ciclo pentilo);

R^{2} es hidrógeno, metilo o metilo halo-sustituido, por ejemplo, CHF_{2};

1R^{3} se elige dentro del grupo formado por C(=O)OR^{7}, C(=O)R^{7}, C(=NH)NR^{8}R^{9}, C(=O)NR^{8}R^{9}, alquilo inferior, alquilo puente, cicloalquilo, haloalquilo, halocicloalquilo, C_{1-3} alquileno cicloalquilo, un heterociclo saturado de 5 ó 6 lados, arilo, heteroarilo, heteroarilSO_{2} aralquilo, alcarilo, heteroaralquilo, heteroalcarilo, C_{1-3} alquileno C(=O)OR^{7}, C(=O)C_{1-3} alquileno C(=O)OR^{7}, C_{1-3} alquileno heteroarilo, C(=O)C(=O)OR^{7}, C(=O)C_{1-3} alquileno C(=O)OR^{7}, C(=O)C_{1-3} alquileno NHC(=O)OR^{7}, C(=O)C_{1-3} alquileno NH_{2} y NH_{2} C(=O)OR^{7}.

R^{4} es hidrógeno, alquilo inferior, haloalquilo, cicloalquilo, arilo, C(=O)R^{7}, OR^{8}, NR^{8}R^{9}, o SR^{8}.

R^{5} hidrógeno, alquilo inferior, haloalquilo, cicloalquilo o arilo;

R^{7} se elige dentro del grupo formado por cicloalquilo, alquilo inferior ramificado y no ramificado, heteroarilo, arilo, un heteroarilo, aralquilo, y R^{7} se sustituye opcionalmente por uno o más OR^{8}, NR^{8}R^{9} o SR^{8};

R^{8} y R^{9}, iguales o diferentes, se eligen dentro del grupo formado por hidrógeno, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, alcarilo, heteroaralquilo, heteroalcarilo y aralquilo, o R^{8} y R^{9} se toman juntos para formar un anillo de 4 a 7 lados;

R^{10} es hidrógeno, alquilo, haloalquilo, cicloalquilo, arilo, C(=O) alquilo, C(=O) cicloalquilo, C(=O) arilo, C(=O) Oalquilo, C(=O)Ocicloalquilo, C(=O)arilo, CH_{2}OH, CH_{2}Oalquilo, CHO, CN, NO_{2}, o SO_{2}R^{11}; y

R^{11} es alquilo, cicloalquilo, trifluormetilo, arilo, aralquilo, o NR^{8}R^{9}.

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen uno o más de los compuestos de fórmula estructural (II), a la utilización de los compuestos y composiciones que contienen los compuestos en el tratamiento de una enfermedad o trastorno, y a métodos de preparación de compuestos e intermediarios que intervienen en la síntesis de los compuestos de fórmula estructural (II).

La presente invención también se refiere a la utilización de un compuesto de fórmula estructural (II) o una composición que contiene un compuesto de fórmula estructural (II), para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero que tiene una enfermedad en la que la inhibición de la PDE4 resulta beneficiosa, para la modulación de niveles de cAMP en un mamífero, la reducción de niveles de TNF\alpha en un mamífero, la supresión de la activación de células inflamatorias en un mamífero y la inhibición de la función de PDE4 en un mamífero.

La presente invención se refiere a compuestos que tienen como fórmula estructural (II):

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donde R^{1} es un alquilo inferior, alquilo puente (por ejemplo norbornil), aralquilo (por ejemplo indanil), cicloalquilo, un heterociclo saturado de 5 ó 6 lados (por ejemplo 3-tetrahidrofuril), C_{1-3} alquilencicloalquilo (por ejemplo ciclo pentil metilo) propargil aril- o heteroaril- sustituido (es decir, -CH_{2}\equivC-C_{6}H_{5}), alilo aril- o heteroaril sustituido (por ejemplo, -CH_{2}CH=CH-C_{6}H_{5}), o halocicloalquilo (por ejemplo, fluor ciclo pentilo);

R^{2} es hidrógeno, metilo o metilo halo-sustituido, por ejemplo, CHF_{2};

R^{3} se elige dentro del grupo formado por C(=O)OR^{7}, C(=O)R^{7}, C(=NH)NR^{8}R^{9}, C(=O)NR^{8}R^{9}, alquilo inferior, alquilo puente, cicloalquilo, haloalquilo, halocicloalquilo, C_{1-3} alquileno cicloalquilo, un heterociclo saturado de 5 ó 6 lados, arilo, heteroarilo, heteroarilSO_{2}, aralquilo, alcarilo, heteroaralquilo, heteroalcarilo, C_{1-3} alquileno C(=O)OR^{7}, C(=O)C_{1-3} alquileno C(=O)OR^{7}, C_{1-3} alquileno heteroarilo, C(=O)C(=O)OR^{7}, C(=O)C_{1-3} alquileno C(=O)OR^{7}, C(=O)C_{1-3} alquileno NHC(=O)OR^{7}, C(=O)C_{1-3} alquileno NH_{2} y NH_{2} C(=O)OR^{7}.

R^{4} es hidrógeno, alquilo inferior, haloalquilo, cicloalquilo, arilo, C(=O) R^{7}, OR^{8}, NR^{8}R^{9}, o SR^{8}.

R^{5} es hidrógeno, alquilo inferior, haloalquilo, cicloalquilo o arilo;

R^{7} se elige dentro del grupo formado por cicloalquilo, alquilo inferior ramificado y no ramificado, heteroarilo, arilo, un heterociclo, aralquilo, y R^{7} se sustituye opcionalmente por uno o más OR^{8}, NR^{8}R^{9} o SR^{8}; y

R^{8} y R^{9}, iguales o diferentes, se eligen dentro del grupo formado por hidrógeno, alquilo inferior, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, alcarilo, heteroaralquilo, heteroalcarilo y aralquilo, o R^{8} y R^{9} se toman juntos para formar un anillo de 4 a 7 lados;

R^{10} es hidrógeno, alquilo, haloalquilo, cicloalquilo, arilo, C(=O)alquilo, C(=O)cicloalquilo, C(=O)arilo, C(=O)Oalquilo, C(=O)Ocicloalquilo, C(=O)arilo, CH_{2}OH, CH_{2}Oalquilo, CHO, CN, NO_{2}, o SO_{2}R^{11}; y

R^{11} es alquilo, cicloalquilo, trifluormetilo, arilo, aralquilo, o NR^{8}R^{9}.

Un compuesto de fórmula estructural (II) se puede utilizar solo, es decir puro o en una composición que contiene además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un compuesto de fórmula estructural (II) también se puede administrar junto con un segundo agente terapéuticamente activo, por ejemplo, un segundo agente terapéutico antiinflamatorio, como un agente capaz de tomar como diana al TNF\alpha.

Los compuestos de fórmula estructural (II) se pueden utilizar para modular niveles de cAMP en un mamífero, reducir niveles de TNF\alpha en un mamífero, suprimir la activación celular inflamatoria en un mamífero, inhibir la función PDE4 en un mamífero y tratar enfermedades que padece un mamífero, en las que la inhibición de PDE4 resulta beneficiosa.

El término "alquilo" tal como se utiliza aquí, solo o en combinación, incluye cadena recta y cadena ramificada, grupos de hidrocarburo saturados, puente, que contienen de 1 a 16 átomos de carbono. El término "alquilo inferior" se define aquí como un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono (C_{1}-C_{6}). Como ejemplos de grupos alquilo inferiores se pueden citar, sin que esto suponga limitación: metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, isobutilo, n-butilo, neopentilo, n-hexilo y similares. El término "alquinilo" se refiere a un grupo alquilo no saturado que contiene un enlace triple carbono-carbono.

El término "alquilo puente" se define aquí como un grupo hidrocarburo biciclíco o policíclico C_{6}-C_{16}, por ejemplo norborilo, adamantilo, biciclo [2.2.2]-octilo, biciclo [2.2.1]heptilo, biciclo [3.2.1] octilo, o decahidronaftilo.

El término "alilo" se define aquí como CH_{2}=CH-CH_{2}-, opcionalmente sustituido, por ejemplo alquilo o arilo sustituido.

El término "propargilo" se define aquí como CH\equivCH-CH_{2}- opcionalmente sustituido, por ejemplo alquilo o aril sustituido.

El término "cicloalquilo", según se define aquí, incluye grupos hidrocarburos cíclicos C_{3}-C_{7}. Como ejemplos de grupos cicloalquilo se pueden citar, sin que esto suponga limitación: ciclopropilo, ciclobutilo, ciclohexilo, y ciclopentilo.

El término "alquileno" se refiere a un grupo alquilo que tiene un sustituyente. Por ejemplo el término "C_{1-3} alquilen cicloalquilo" se refiere a un grupo alquilo que contiene de 1 a 3 átomos de carbono, y sustituido por un grupo cicloalquilo.

El término "haloalquilo" se define aquí como un grupo alquilo sustituido por uno o más halo sustituyentes, fluor, cloro, bromo, yodo, o combinaciones de los mismos. De forma similar, "halo cicloalquilo" se define como grupo cicloalquilo que tiene uno o más halo sustituyentes.

El término "arilo" solo o en combinación, se define aquí como grupo aromático monociclíco o policíclico, de preferencia un grupo aromático monociclíco o biciclíco, por ejemplo fenilo o naftilo, que puede ser sustituido o no sustituido, por ejemplo por uno o más, y en particular de uno a tres, sustituyentes elegidos entre: halo, alquilo, hidroxi, hidroxialquilo, alcoxi, ariloxi, aralcoxi, alcoxialquilo, ariloxialquilo, aralcoxialquilo, haloalquilo, nitro, amino, alquilamino, acilamino, alquiltio, alquilsulfinilo y alquilsulfonido. Como ejemplo de grupos arilo se pueden citar: fenilo, naftilo, tetranidronaftilo, 2-clorofenilo, 3-clorofenilo, 4-clorofenilo, 2-metilfenilo, 4-metoxifenilo, 3-trifluormetilfenilo, 4-nitrofenilo y similares.

El término "heteroarilo" se define aquí como un sistema anular monociclíco o biciclíco que contiene uno o dos anillos aromáticos y contiene por lo menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre en un anillo aromático, y que puede ser no sustituido o sustituido, por ejemplo, por uno o más, y en particular uno a tres, sustituyentes como halo, alquilo, hidroxi, hidroxialquilo, alcoxi, ariloxi, aralcoxi, alcoxialquilo, ariloxialquilo, aralcoxialquilo, haloalquilo, nitro, amino, alquilamino, acilamino, alquiltio, alquilsulfinilo y alquisulfonilo. Como ejemplos de grupos heteroarilo se pueden citar: tienilo furilo, piridilo, oxazolilo, quinolilo, isoquinolilo, indolilo, triazolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, imidizolilo, benzotiazolilo, pirazinilo, pirimidinilo, tiazolilo y tiadiazolilo.

El término "aralquilo" se define aquí como un grupo alquilo definido anteriormente, en el que uno de los átomos de hidrógeno es sustituido por un grupo arilo, tal como se define aquí, como por ejemplo un grupo fenilo que tiene opcionalmente uno o más sustituyentes, por ejemplo, halo, alquilo, alcoxi y similares. Un ejemplo de grupo aralquilo es el grupo bencilo.

El término "alcarilo" se define aquí como grupo arilo definido anteriormente, en el que uno de los átomos de hidrógeno se sustituye por un grupo alquilo, cicloalquilo, haloalquilo o halocicloalquilo.

Los términos "heteroaralquilo" y "heteroalcarilo" se definen de forma similar al término "aralquilo" y "alcarilo"; no obstante, el grupo arilo se sustituye por un grupo heteroarilo según lo definido anteriormente.

El término "heterociclo" se define aquí como un anillo no aromático de 5 ó 6 lados, opcionalmente sustituido, que tiene uno o más heteroátomos elegidos entre: oxígeno, nitrógeno y azufre, presentes en el anillo. Como ejemplos no limitativos se pueden citar: tetrahidrofuranos, piperidina, piperacina, sulfolano, morfolano, tetrahidropirano, dioxano y similares.

El término "halógeno" o "halo" según se define aquí incluye fluor, cloro, bromo y yodo.

Los términos "alcoxi", "ariloxi", y "aralcoxi" se definen como -OR, donde R es alquilo, arilo y aralquilo, respectivamente.

El término "alcoxialquilo" se define como un grupo alcoxi añadido a un grupo alquilo. Los términos "ariloxialquilo" y " aralcoxialquilo" se definen de forma similar como un grupo ariloxi, araicoxi añadido a un grupo alquilo.

El término "hidroxi" se define como -OH.

El término "hidroxialquilo" se define corno grupo hidroxi añadido a un grupo alquilo.

El término "amino" se define como -NH_{2}.

El término "alquilamino" se define como -NH_{2}, donde por lo menos un R es alquilo y el segundo R es alquilo o hidrógeno.

El término "acilamino" se define como RC(=O)N, donde R es alquilo y arilo. El término "nitro" se define como -NO_{2}.

El término "alquiltio" se define como -SR, donde R es alquilo.

El término "alquilsulfinilo" se define como R-SO_{2} donde R es alquilo.

El término "alquilsulfonilo" se define como R-SO_{3} donde R es alquilo.

En realizaciones preferidas, R^{5} es hidrógeno, R^{7} es metilo, R^{2} es metilo o difluormetilo, R^{4} se elige dentro del grupo formado por hidrógeno, metilo, trifluormetilo, ciclopropilo, acetilo, etinilo, benzoilo, fenilo y NR^{8}R^{9}, donde R^{8} y R^{9}, independientemente, son hidrógeno, alquilo inferior o cicloalquilo o se toman juntos para formar un anillo de 5 ó 6 lados. R^{1} se elige dentro del grupo formado por

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R^{3} es seleccionado dentro del grupo formado por

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En las realizaciones más preferidas, R^{1} se elige dentro del grupo formado por ciclopentilo, tetrahidrofurilo, indanilo, norbornilo, fenetilo y fenilbutilo; R^{2} se eligen dentro del grupo formado por metilo y difluormetilo; R^{3} se elige dentro del grupo formado por CO_{2}CH_{3}, C(=O)CH_{2}OH, C(=O)CH(CH_{3})-OH, C(=O)C(CH_{3})_{2}OH y

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R^{4} es NR^{8}R^{9}; R^{5} es hidrógeno, R^{7} es metilo; R^{8} y R^{9}, independientemente, se eligen dentro del grupo formado por hidrógeno y alquilo inferior o se toman juntos para formar un anillo de 5 ó 6 lados; R^{10} es hidrógeno.

La presente invención incluye todos los estereoisómeros e isómeros geométricos posibles, de compuestos de fórmula estructural (II) e incluye no solamente compuestos racémicos sino también los isómeros ópticamente activos. Si se desea un compuesto de fórmula estructural (II) como simple enantiómero, se puede obtener por resolución del producto final o por síntesis estereospecifica de material de partida isoméricamente puro o utilizando un reactivo auxiliar quiral, por ejemplo véase Z. Ma et al., Tetrahedron: Asymmetry, 8 (6), páginas 883-888 (1997). Se puede lograr la resolución del producto final, un material intermedio o de partida con cualquier método adecuado conocido en el estado de la técnica. Además, en situaciones en las que son posibles tautómeros de los compuestos de fórmula estructural (II), la presente invención incluye todas las formas tautaméricas de los compuestos. Según se demuestra a continuación, los estereoisómeros específicos presentan una aptitud excepcional para inhibir la PDE4 sin manifestar los efectos secundarios negativos sobre el SNC que suelen asociarse a los inhibidores de PDE4.

En particular, se acepta generalmente que los sistemas biológicos pueden presentar actividades muy sensibles con respecto a la naturaleza estereoquímica absoluta de los compuestos (véase E. J. Ariens, Medicinal Research Reviews, 6:451-466 (1996); E. J. Ariens, Medicinal Research Reviews, 7:367-387 (1987); K. W. Fowler, Handbook of Stereoisomers: Therapeutic Drugs (Manual de stereoisómeros: Fármacos Terapéuticos) CRC Press, Edited by Donald P. Smith, pp. 35-63 (1989); and S.C. Stinson, Chemical and Engineering News, 75:38-70 (1997).

Por ejemplo, el rolipram es un inhibidor estereoespecífico de PDE4 que contiene un centro quiral. El (-)-enantiómero de rolipram tiene una potencia farmacológica superior (+)-enantiómero, que podría estar relacionada con su acción antidepresiva potencial. Schultz et al., NaunynSchmiedebergs's Arch Pharmacol, 333:23-30 (1986). Además el metabolismo de rolipram parece estereoespecífico con el (+)-enantiómero que presenta una tasa de liberación más rápida que el (-)-enantiómero. Krause et al., Xenobiotica, 18:561-571 (1998). Finalmente, una observación reciente indica que el (-)-enantiómero de rolipram (R-rolipram) es aproximadamente 10 veces más emético que el (+)-enantiómero (S-rolipram). A. Robichaud et al., Neuropharmacology, 38:289-297 (1999). Esta observación no se compagina fácilmente con diferencias en la disposición del animal de prueba a isómeros de rolipram y la aptitud del rolipram para inhibir la enzima PDE4. Los compuestos de la presente invención pueden tener tres centros quirales. Según se indica a continuación, los compuestos de una orientación estereoquímica específica presentan actividad farmacológica y actividad inhibidora de PDE4 similar aunque toxicidad y potencial emético alterado sobre el SNC.

Por consiguiente, los compuestos preferidos de la presente invención tienen como fórmula estructural (III):

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Los compuestos de fórmula estructural (III) son inhibidores potentes y selectivos de PDE4 y no manifiestan los efectos negativos sobre el SNC ni el potencial emético demostrado por los estereoisómeros de un compuesto d fórmula estructural (III).

Los compuestos de fórmula estructural (II) que contienen mitades acídicas pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con cationes adecuados. Como cationes adecuados farmacéuticamente aceptables se pueden mencionar cationes de metal alcalino (por ejemplo sodio o potasio) y cationes de metal alcalino térreo (por ejemplo calcio o magnesio). Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula estructural (II) que contienen un centro básico, son sales de adición de ácido formadas con ácidos farmacéuticamente aceptables. Como ejemplos, se pueden citar los hidrocloruros, hidrobromuros, sulfatos o bisulfatos, fosfatos o hidrógenos fosfatos, acetatos, benzoatos, succinatos, fumaratos, maleatos, lactatos, citratos, tartratos, gluconatos, metanosulfonatos, bencenosulfonatos, y sales de ptoluenosulfonatos. A la luz de lo anterior, toda referencia a compuestos de la presente invención que se haga aquí incluirá compuestos de fórmula estructural (II), así como sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Los compuestos de la presente invención pueden administrarse terapéuticamente químicamente solos aunque es preferible administrar compuestos de fórmula estructural (II) como composición o formulación farmacéutica. Por lo tanto, la presente invención presenta además formulaciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula estructural (II), junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos y/o profilácticos. Los vehículos son "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación y no deletéreos para el receptor de los mismos.

En particular, un inhibidor selectivo de PDE4 de la presente invención resulta útil solo o en combinación con un segundo agente terapéutico antiinflamatorio, por ejemplo, un agente terapéutico centrado en TNF\alpha, como ENBREL® o REMICADE®, que resultan útiles en el tratamiento de la artritis reumatoide. Asimismo, la utilidad terapéutica del antagonismo IL-1 también se ha observado en modelos animales para artritis reumatoide.

Por consiguiente, se piensa que el antagonismo IL-1, en combinación con la inhibición PDE4, que atenúa el TNF\alpha, puede ser eficaz.

Los presentes inhibidores de PDE4 resultan útiles en el tratamiento de una diversidad de enfermedades alérgicas, autoinmunitarias e inflamatorias.

El término "tratamiento" incluye la prevención, la reducción, la interrupción o la reversión de la progresión de la gravedad de la enfermedad o de los síntomas que se están tratando. Como tal, el término "tratamiento" incluye la administración terapéutica y/o profiláctica médica, según el caso. En particular, la inflamación es una respuesta protectora localizada, provocada por la lesión o destrucción de tejidos, que sirve para destruir, diluir o secuestrar el agente perjudicial y el tejido lesionado. El término "enfermedad inflamatoria" tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier enfermedad en la cual una respuesta inflamatoria excesiva o no regulada conduce a uno síntomas inflamatorios excesivos, daños en el tejido huésped o pérdida de función hística. Además, el término "enfermedad autoinmunitaria" tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier tipo de trastornos en el cual la lesión hística está asociada con respuestas humorales o celulares a los propios constituyentes del cuerpo. El término "enfermedad alérgica" tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier síntoma, daño hístico o pérdida de función hística resultante de la alergia. El término "enfermedad artrítica" tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquiera de una gran familia de enfermedades que se caracterizan por lesiones inflamatorias de las articulaciones atribuibles a una diversidad de etiologías. El término "dermatitis" tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquiera de las enfermedades de una gran familia de afecciones de la piel que se caracterizan por la inflamación de la piel atribuible a una diversidad de etiologías. El término "rechazo de transplante" tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier reacción inmunológica dirigida contra tejido injertado (inclusive órgano y célula (por ejemplo médula ósea), caracterizada por la pérdida de función de los tejidos injertados y circundantes, dolor, hinchazón, leucocitosis y trombocitopenia.

La presente invención también describe la fabricación de un medicamento que se utiliza para modular los niveles de cAMP en un mamífero, así como un método de tratamiento de enfermedades caracterizadas por elevados niveles de citoquina.

El término "citoquina" tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier polipéptido secretado que afecta las funciones de otras células y que modula las interacciones entre células en la respuesta inmunológica o inflamatoria. Las citoquinas incluyen, sin que esto suponga limitación, monoquinas, linfoquinas y quimioquinas independientemente de las células que las producen. Por ejemplo, se suele decir que una monoquina ha sido producida y secretada por un monocito; sin embargo, hay muchas más células que producen monoquinas, como linfocitos naturales, fibroblastos, basofilos, neutrófilos, células endoteliales, astrositos del cerebro, células estromales de la médula ósea, queratinocitos epidérmicos y linfocitos B. Se suele decir que las linfoquinas han sido producidas por linfocitos. Como ejemplos de citoquinas se pueden mencionar, sin que esto suponga limitación, la interleucina-1 (IL-1) interleucina-6 (IL-6), factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha) y factor de necrosis tumoral beta (TNF\beta).

La presente invención describe además la fabricación de un medicamento que se utiliza para reducir los niveles de TNF en un mamífero, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula estructural (II) al mamífero. El término "que reduce los niveles de TNF" tal como se utiliza aquí, significa:

a) reducción de los niveles excesivos de TNF en un mamífero a niveles normales o por debajo de los niveles normales mediante la inhibición de la liberación in vivo de TNF por todas las células, inclusive, sin que esto suponga limitación, monocitos o macrófagos; o

b) la inducción de una reducción, a nivel de traducción o transcripción, de niveles excesivos in vivo de TNF en un mamífero a niveles normales o por debajo de los normales; o

c) la inducción a una reducción, por inhibición de la síntesis directa de TNF como evento post-traduccional.

Además, los compuestos de la presente invención resultan útiles para suprimir la activación celular inflamatoria. El término "activación celular inflamatoria" tal como se utiliza aquí, se refiere a la inducción por medio de un estímulo (que incluye, sin que esto suponga limitación, citoquinas, antígenos o auto-anticuerpos) de una respuesta celular proliferativa, la producción de mediadores solubles (inclusive, sin que esto suponga limitación, citoquinas, radicales de oxígeno, enzimas, prostanoides o aminas vasoactivas), o expresión superficial celular de nuevos o mayores números de mediadores (inclusive, sin que esto suponga limitación, antígenos de gran histocompatibilidad o moléculas de adhesión celular) en células inflamatorias (inclusive, sin que esto suponga limitación, monocitos, macrófagos, linfocitos T, linfocitos B, granulocitos, leucocitos polimorfonucleares, células cebadas, basofílos, eosinófilos, células dendríticas y células endoteliales). Las personas expertas se daráncuenta de que la activación de uno o de una combinación de estos fenotipos en estas células puede contribuir a la iniciación, perpetuación o exacerbación de una enfermedad inflamatoria.

Los compuestos de la presente invención resultan también útiles para producir la relajación de los músculos lisos de las vías respiratorias, la broncodilatación y para evitar la broncoconstricción.

Los compuestos de la presente invención resultan por lo tanto útiles en el tratamiento de enfermedades como artritis (como artritis reumatoide), osteoartritis, artritis gotosa, espondilitis, oftalmopatia asociada con la tiroides, enfermedad de Behcet, septicemia, shock séptico, shock endotóxico, septicemia gram negativo, septicemia gram positivo, síndrome de shock tóxico, asma, bronquitis crónica, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, conjuntivitis vernal, granuloma eosinofílico, síndrome disneico agudo del adulto, (ARDS), enfermedad inflamatoria pulmonar crónica (como enfermedad pulmonar obstructiva crónica), silicosis, sarcoidosis pulmonar, traumatismo de revascularización del miocardio, el cerebro y las extremidades, lesiones en el cerebro o en médula espinal causadas por trauma menor, fibrosis inclusive, fibrosis cística, formación queloide, formación de tejido cicatricial, aterosclerosis, enfermedades autoinmunológicas, como lupus eritematosus sistémico (SLE), y trastornos de rechazo de transplante (por ejemplo reacción injerto-contra-huésped (GvH) y rechazo de aloinjerto), glomerulonefritis crónica, enfermedades inflamatorias del intestino, como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, enfermedades linfocíticas proliferativas como las leucemia (por ejemplo leucemia linfocítica crónica; CLL) (véase Mentz et al., Blood 88 pp. 2172-2182 (1996)), y dermatosis inflamatorias como dermatitis atópica, psoriasis o urticaria.

Otros ejemplos de estas enfermedades o de afecciones relacionadas son las cardiomiopatías, como la insuficiencia cardiaca congestiva, pirexia, caquexia secundaria a infección o tumor maligno, caquexia secundaria a síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), ARC, (complejo relacionado con el SIDA), malaria cerebral, osteoporosis y enfermedades de resorción ósea, así como fiebre y mialgias debidas a infección. Además, los compuestos de la presente invención resultan útiles en el tratamiento de diabetes insipidus y trastornos del sistema nervioso central, como la depresión o la demencia multi-infarto.

Los compuestos de la presente invención también tienen utilidad fuera de las acciones normalmente conocidas como terapéuticas. Por ejemplo, los presentes compuestos pueden funcionar como conservadores de transplantes de órganos (véase Pinsky et al., J. Clin. Invest., 92, pp. 2994-3002 (1993)) también.

Los inhibidores selectivos de PDE4 también pueden ser útiles en el tratamiento de la disfunción eréctil, especialmente la impotencia vasculogénica (Doherty, Jr. et al. U.S. Patent nº. 6.127.363), diabetes insipidus (Kidney Int., 37, p. 362, (1990); Kidney Int., 35, p. 494, (1989)) y los trastornos del sistema nervioso central, tales como demencia multiinfarto (Nicholson, Psychopharmacology, 101, p.147 (1990)), depresión (Eckman et al., Curr. Ther. Res., 43, p. 291 (1998)), ansiedad y respuestas al estrés (Neuropharmacology, 38, p. 1831 (1991)), isquemia cerebral (Eur. J. Pharmacol., 272, p. 107 (1995)), disquinesia tardía (J. Clin. Pharmacol., 16, p. 304 (1976)), enfermedad de Parkinson (véase Neurology, 25, p. 722 (1975); Clin. Exp. Pharmacol, Physiol., 26, p. 421 (1999)), y síndrome premenstrual. Con respecto a la depresión, los inhibidores selectivos de PDE4 muestran eficacia en una variedad de modelos animales de depresión tales como "desesperación conductual" o tests Porsolt (Eur. J. Pharmacol., 47, p. 379 (1978); Eur. J. Pharmacol., 57, p. 431 (1979); Antidepressants: neurochemical, behavioral and Clinical prospectives, Enna, Malick, and Richelson, eds. Rayen Press, p. 121 (1991)); y el "tail suspension test" (Psychopharmacology, 85, p. 367 (1985)). Los resultados recientes de la investigación muestra que el tratamiento crónico in vivo mediante una variedad de antidepresivos aumentan la expresión derivada del cerebro de la PDE4 (J. Neuroscience, 19, p. 610 (1990)). Por consiguiente, se puede utilizar un inhibidor selectivo de PDE4 solo o junto con un segundo agente terapéutico en un tratamiento para las cuatro clases más importantes de antidepresivos: procedimientos electroconvulsivos, inhibidores de monoamina oxidasa e inhibidores selectivos de reabsorción de serotonina o norepinefrina. Los inhibidores selectivos de PDE4 también pueden ser útiles en aplicaciones que modulan la actividad broncodilatadora mediante una acción directa sobre las células del músculo liso bronquial para el tratamiento del asma.

Los compuestos y composiciones farmacéuticas adecuados que se utilizan en la presente invención incluyen aquellos en los que el ingrediente activo se administra a un mamífero en una cantidad eficaz para lograr el objeto deseado. Más específicamente, una "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad eficaz para evitar el desarrollo o para aliviar los síntomas existentes del paciente que se está tratando. La determinación de las cantidades eficaces es algo que conocen las personas expertas en la materia, particularmente a la vista de las descripciones detalladas aquí facilitadas.

El término "mamífero" tal como se utiliza aquí, se refiere a machos y hembras y comprende seres humanos, animales domésticos (por ejemplo gatos, perros), ganado (por ejemplo vacas y bueyes, caballos, cerdos) y animales salvajes (por ejemplo primates, gatos grandes, ejemplares de zoológico).

Una "dosis terapéuticamente eficaz" es la cantidad de compuesto que permite lograr el efecto deseado. La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos compuestos se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos normalizados en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar el LD_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y el ED_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice terapéutico que se expresa como la razón entre LD_{50} y ED_{50}. Se prefieren los compuestos que presentan índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos se pueden utilizar para formular una gama de dosificación que se utiliza en los seres humanos. La dosificación de estos compuestos se encuentra de preferencia dentro de una gama de concentraciones circulantes que incluye el ED_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de esta gama según la forma de dosificación empleada, y la vía de administración utilizada.

La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden ser elegidas por el médico a la vista del estado del paciente. La cantidad e intervalo de dosificación se puede ajustar individualmente para proporcionar niveles de plasma de la mitad activa suficientes para mantener los efectos terapéuticos.

Como podrán apreciar las personas expertas en la materia, toda referencia aquí a tratamiento se extiende a la profilaxis, así como al tratamiento de enfermedades o síntomas establecidos. Se observará también que la cantidad de compuesto de la invención necesaria que se utiliza en el tratamiento varia según la naturaleza de la enfermedad que se va a tratar y con la edad y el estado del paciente y queda determinada en última instancia por el médico o veterinario que atiende. Por lo general sin embargo las dosis empleadas en tratamientos para seres humanos adultos suelen ser de 0,001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg al día. La dosis deseada se puede administrar convenientemente de una sola vez, o como dosis múltiples administradas a intervalos adecuados, por ejemplo en forma de dos, tres, cuatro o más sub-dosis al día. En la práctica, el médico determina el régimen de dosificación más adecuado para un paciente determinado y la dosificación varia con la edad, el peso y la respuesta del paciente particular. Las dosificaciones antes citadas constituyen un ejemplo del caso medio si bien pueden darse casos individuales en los que convienen dosis más elevadas o más reducidas que se encuentran también dentro del ámbito de la presente invención.

Las formulaciones de la presente invención se pueden administrar de forma standard para el tratamiento de las enfermedades indicadas, por ejemplo por vía oral, parenteral, transmucosal (por ejemplo sublingual o administración global), tópica, transdérmica, rectal, por inhalación (por ejemplo nasal o profunda inhalación pulmonar). La administración parenteral incluye, si bien no se limita a ello, la intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intratecal e intraarticular. La administración parenteral también se puede realizar utilizando una técnica de alta presión como POWDERJECT^{TM}

Para la administración bucal, la composición puede tener forma de comprimidos o pastillas para chupar formulados del modo convencional. Por ejemplo, los comprimidos y cápsulas para la administración oral pueden contener excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes (por ejemplo jarabe, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto, mucílago de almidón o polivinilpirrolidona), agentes de relleno (por ejemplo lactosa, azúcar, microcristalino, celulosa, almidón-maíz, fosfato cálcico o sorbitol), lubricantes (por ejemplo magnesio, estearato, ácido esteárico, talco, polietilen glicol o sílice), desintegrantes (por ejemplo fécula de patata o glicolato de almidón sodio) o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato sódico). Los comprimidos pueden ir revestidos según métodos bien conocidos en el estado de la técnica.

Por otra parte, los compuestos de la presente invención se pueden incorporar en preparaciones orales líquidas tales como suspensiones acuosas u oleas, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires, por ejemplo las formulaciones que contienen estos compuestos pueden presentarse como producto seco que se diluye con agua u otro vehículo adecuado antes de su utilización. Estas preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales como agentes de suspensión tales como sorbitol, jarabe, metilcelulosa, glucosa/jarabe de azúcar, gelatina, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetil celulosa, estearato de aluminio en gel y grasas comestibles hidrogenadas; agentes emulsionantes, como lecitina, sorbitan monooleato o acacia; vehículos no acuosos (que pueden contener aceites comestibles), tales como el aceite de almendra, aceite de coco fraccionado, ésteres oleosos, propilen glicol y etil alcohol; y conservantes tales como metilo o propil p-hidro-xibenzoato y ácido sórbico.

Estas preparaciones también se pueden formular como supositorios, que contienen por ejemplo bases de supositorio convencionales tales como mantequilla de cacao u otros glicéridos. Las composiciones para la inhalación se suelen presentar en forma de solución, suspensión o emulsión que se puede administrar como polvo seco o en forma de aerosol utilizando un propulsor convencional como diclorodifluormetano, triclorodifluormetano. Las formulaciones tópicas y transcutaneas habituales comprenden vehículos acuosos y no acuosos convencionales tales como gotas para los ojos, cremas, ungüento, lociones y pastas o en forma de emplasto medicinal, parche o membrana.

Además, las composiciones de la presente invención se pueden formular para su administración parenteral por inyección o infusión continua. Las formulaciones para la inyección pueden tener la forma de suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, el ingrediente activo puede tener forma de polvo para diluirlo con un vehículo adecuado (por ejemplo agua esterilizada, sin pirógenos) antes de su utilización.

Una composición según la presente invención también se puede formular como preparado de liberación lenta. Las formulaciones de actuación larga se pueden administrar por implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por consiguiente, los compuestos de la invención se pueden formular con materiales polímeros o hidrófobos adecuados (por ejemplo una emulsión en un aceite aceptable), resinas intercambiadoras de iones o como derivados escasamente solubles (por ejemplo una sal escasamente soluble).

Para el uso veterinario, se administra un compuesto de fórmula (II), o sales no tóxicas del mismo como formulación convenientemente aceptable según la práctica veterinaria normal. El veterinario puede determinar fácilmente el régimen de dosificación y la vía de administración más adecuada para un animal particular.

Por consiguiente, la invención proporciona en un segundo aspecto una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (II), junto con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo. Se ofrece además con la presente invención un proceso de preparación de una composición farmacéutico que comprende un compuesto de fórmula (II), proceso que comprende la mezcla de un proceso fórmula (II), junto con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo.

Más abajo, se da un ejemplo específico, no limitativo, de un compuesto de fórmula estructural (II), cuya síntesis se realizó según el procedimiento indicado a continuación.

Por lo general, los compuestos de fórmula estructural (II) se pueden preparar según el siguiente esquema sintético. En el esquema descrito a continuación, se entiende en el estado de la técnica que se pueden utilizar grupos protectores siempre que sea necesario de acuerdo con los principios generales de la química sintética. Estos grupos protectores se eliminan en las etapas finales de la síntesis en condiciones básicas, ácidas o hidrogenolíticas que resultarán fácilmente reconocibles por los expertos. Utilizando una manipulación y una protección adecuada, de funcionalidades químicas, se puede realizar la síntesis de compuestos de fórmula estructural (II) no expuesta de forma específica aquí, con métodos análogos a los esquemas explicados a continuación.

A no ser que se indique otra cosa, todos los materiales iniciales se obtuvieron de proveedores comerciales y se utilizaron sin purificación ulterior. Todas las reacciones y fracciones de cromatografía se analizaron por cromatografía de capa fina sobre placas de gel de sílice de 250-mm y se visualizaron con luz UV (ultravioleta) o colorante I_{2} (yodo). Los productos y los intermedios se purificaron por cromatografía flash o HPLC de fase de inversión.

Los compuestos de fórmula estructural (II) se pueden preparar, por ejemplo, tal como se indica en el siguiente ejemplo 1. Los expertos en la materia conocen también otras vías sintéticas. El siguiente esquema de reacción proporciona un compuesto de fórmula estructural (II) donde R^{1} y R^{2}, es decir, ciclopentilo y CH_{3} son determinados por los materiales de partida. La selección propia de otros materiales de partida o la realización de reacciones de conversión en intermediarios y ejemplos proporcionan compuestos de formular estructural general (II) que tienen otros sustituyentes de R^{1} a R^{11}. El siguiente ejemplo se ofrece a modo de ilustración y no se tiene que interpretar como limitación.

Ejemplo 1 Preparación de (3S,4R)-4-(3-ciclo pentiloxi-4-metoxifenil)-3-metil-3-(2-metil amino tiazol-4-il)pirrolidina-1-ácido carboxílico metil éster

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Se añade a una solución de 1-metil-2-tiourea (0,038 g, 0,418 mmol) en metanol (1 mL), a 50ºC, una solución de (3S,4R)-3-(2-bromoetanoil)-4-(3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil)-3-metil-pirrolidona-1-ácido carboxílico metil éster (0,19 g, 0,42 mmol) en metanol (1 mL). La temperatura se subió hasta 70ºC y se sometió a reflujo durante 2 horas. La mezcla de reacción se concentró entonces bajo presión reducida y se disolvió en agua de acetonitrilo (CH_{3}CN-H_{2}O) (1 mL) para su purificación por HPLC en una columna C18 (Luna 10 \mu, C18, 250x10 mm). La elusión gradiente de 50-100% de acetonitrilo-agua (0,05% TFA) dio el producto mencionado en forma de polvo blanco tras la liofilización (91 mg, 49%).

^{1}H NMR (300 MHz, CDCl_{3}) \delta (ppm): 11.84 (s, 1H, NH) 6.95-6.70 (m, 3H, aromático), 6.14 (m, 1H, aromático), 4.87-4.82 (br. m, 1H), 3.97-3.5 (m, 4H), 3.84 (s, 3H, OCH_{3}), 3.78 (s, 3H, OCH_{3}), 3.40-3.36 (m, 1H), 3.05 (s, 3H, NCH_{3}), 2.0-1.6 (m, 8H, ciclopentilo) 1.07 (s, 3H, CH_{3}).

Los compuestos de fórmula estructural (II) se probaron para conocer su aptitud para inhibir la PDE4. La aptitud de un compuesto para inhibir la actividad de la PDE4 está relacionada con el valor IC_{50} del compuesto, es decir la concentración de inhibidor necesario para la inhibición del 50% de la actividad enzimática. El valor IC_{50} de compuestos de fórmula estructural (II) se determinó utilizando recombinante humano PDE4.

Los compuestos de la presente invención suelen presentar un valor IC_{50} respecto del recombinante humano PDE4 de menos de 100 \muM, y de preferencia menos de 50 \muM, aproximadamente, y todavía mejor, menos de 50 \muM aproximadamente. Los compuestos de la presente invención suelen tener un valor IC_{50} respecto del recombinante humano PDE4 de menos de aproximadamente 5 \muM y muchas veces, menos de 1 \muM aproximadamente. Para aprovechar plenamente la ventaja de la presente invención, un inhibidor PDE4 presente tiene un IC_{50} de aproximadamente 0,05 \muM a aproximadamente 15 \muM.

Los valores IC_{50} de los compuestos se determinaron a partir de las curvas de concentración-respuesta, utilizando normalmente concentraciones que oscilan entre 0,1 pM a 500 \muM. Las pruebas con respecto a otras enzimas PDE utilizando metodologías standard, tales como las que se describen en Loughney et al., J. Biol. Chem., 271, pp. 796-806 (1996), mostraron también que los compuestos de la presente invención son altamente selectivos para la enzima PDE4 específica de cAMP.

La producción de recombinante humano PDEs y las determinaciones de IC_{50} se pueden realizar utilizando métodos bien conocidos en el estado de la técnica. A continuación se describen unos métodos, a modo de ejemplo.

Expresión de PDEs humano Expresión en células de Spodoptera fugiperda (Sf9) infectadas con baculovirus

Los plásmidos de transferencia de baculovirus se construyeron utilizando pBlueBacIII (Invitrogen) o pFastBac (BRL-Gibco). La estructura de todos los plasmidos se verificó secuenciando a través de las uniones de vector y secuenciando plenamente todas las regiones generadas por PCR. El plásmido pBB-PDE1A3/6 contenía el marco de lectura abierto completo de PDE1A3 (Loughney et al., J. Biol. Chem., 271, pp. 796-806 (1996), en pBlueBaclll. El plásmido Hcam3aBB contenía el marco de lectura abierto completo de PDE1C3 (Loughney et al., (1996) en pBlueBacIII. El plásmido pBB-PDE3A contenía el marco de lectura abierto completo de PDE3A (Meacci et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 89, pp. 3721-3725 (1992) en pBlueBacIII.

Las estirpes de virus recombinante se produjeron utilizando el sistema MaxBax (Invitrogen) o el sistema FastBAc (Gibco-BRL) según los protocolos del fabricante. En ambos casos, la expresión del recombinante humano PDEs en los viruses resultantes fue impulsada desde el promotor polihedron viral. Cuando se utilizó el sistema MaxBac®, se purificó dos veces en placa el virus con el fin de asegurarse de que ningún virus de tipo natural (occ+) contaminaba la preparación. La expresión de la proteína se realizó del siguiente modo. Se cultivaron células Sf9 a 27ºC en medio de cultivo de insecto Grace (Gibco-BRL) complementado con suero bovino fetal 10%, 0,33% TC yeastolato, 0,33% de hidrolizado de lactalbúmina, 4,2 mM NaHCO_{3}, 10 \mug/mL de gentamicina, 100 unidades/mL de penicilina y 100 \mug/mL de estreptomicina. Las células de crecimiento exponencial se infectaron con un multiplicidad de aproximadamente 2 a 3 partículas víricas por célula y se incubaron durante 48 hoas. Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron con medio de Grace no complementado y se congelaron rápidamente para su almacenamiento.

Expresión en Saccharomyces cerevisiae (levadura)

Se realizó la producción recombinante de PDE1B, PDE2, PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE4D, PDE5 y PDE7 humano, de forma similar a la descrita en el ejemplo 7 de la patente US nº. 5.702.936, con la salvedad de que el vector de transformación de levadura empleado, derivado del plasmido básico ADH2 descrito en Price et al., Methods in Enzymology, 185, pp. 308-318 (1990), incorporaba secuencias de promotor y terminador ADH2 de levadura y el huésped Saccharomyces cerevisiae era la estirpe deficiente en proteasa BJ2-54 depositada el 31 de agosto de 1998 en la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, número de acceso ATCC 74465. Las células huésped transformadas se cultivaron en un medio 2X SC-leu, pH 6.2, con metales traza y vitaminas. 24 horas después, se añadió glicerol que contenía un medio YEP hasta una concentración final de 2X YET/3% glicerol. Aproximadamente 24 horas después, se recolectaron células, se lavaron y almacenaron a -70ºC.

Preparaciones de fosfodiesterasa humana Determinaciones de la actividad de la fosfodiesterasa

La actividad de las fosfodiesterasa de las preparaciones se determinó del siguiente modo. Se realizaron análisis de PDE utilizando una técnica de separación de carbón vegetal, prácticamente en la forma descrita en Loughney et al.(1996). En esta prueba, la actividad de PDE convierte [32P]5'-AMP o [32P] cGMP en el correspondiente [32P]5'-AMP o [32P]5'-GMP en proporción a la magnitud de la actividad de PDE presente. Se convirtió ulteriormente, cuantitativamente, [32P]5'-AMP o [32P]5'-GMP en [32P]fosfato libre y adenosina o guanosina no marcada mediante la acción de 5'nucleotidasa de veneno de serpiente. Por lo tanto, la cantidad de [32P]fosfato liberado es proporcional a la actividad enzimática. La prueba se realizó a 30ºC en 100 \muL de mezcla de reacción que contenía (concentración final) 40 mM Tris HCl (pH 8.0), 1 \muM ZnSO_{4} 5 mM MgCl_{2} y 0,1 mg/mL de albúmina de suero bovino (BSA). Alternativamente, en pruebas de evaluación de la actividad específica de PDE1, las mezclas de incubación incorporaban además la utilización de 0,1 mM CaCl_{2} y 10 \mug/mL de calmodulina. La enzima PDE estaba presente en cantidades que producían <30% hidrólisis total de substrato (condiciones de prueba lineal). La prueba se inició añadiendo substrato (1 mM [32P]cAMP o cGMP), y se incubó la mezcla durante 12 minutos. Se añadieron entonces setenta y cinco (75) \mug de veneno de Crotalus atrox venom y se prosiguió con la incubación durante 3 minutos (15 minutos en total). Se interrumpió la reacción añadiendo 200 \mul de carbón vegetal activado (25 mg/mL de suspensión en 0,1 M NaH_{2}PO_{4} pH 4). Después de centrifugación (750 X g durante 3 min) para sedimentar el carbón vegetal, se tomó una muestra del sobrenadante para determinar la radioactividad en un contador de centelleo y se calculó la actividad de PDE.

Se realizaron análisis del inhibidor de forma similar al método descrito en Loughney et al., J. Biol. Chem., 271, pp. 796-806 (1996), con la salvedad de que se utilizaron cGMP y cAMP, y las concentraciones de substratos se mantuvieron por debajo de 32 nM, lo cual es muy inferior al Km de los PDEs sometidos a prueba.

Preparaciones de PDE4A humano, 4B, 4C, 4D Preparación de PDE4A a partir de S. cerevisiae

Se descongelaron células de levadura (50 g de levadura estirpe YI26 que albergaba HDUN1.46) a temperatura ambiente, mezclando con 50 mL de Lysis Buffer (50 mM MOPS pH 7.5, 10 \muM ZnSO_{4}, 2 mM MgCl_{2}, 14.2 mM 2-mercapto-etanol, 5 \mug/mL de pepstatina, leupeptina, aprotinina respectivamente, 20 \mug/mL de inhibidores I y II de calpaina respectivamente y 2 mM de benzamidina HCl). Se desgajaron (lisaron) células en una celda de presión Francesa® (SLM-Aminco®, Spectronic Instruments) a 10ºC. El extracto se centrifugó en un rotor Beckman JA-10 a 9.000 rpm durante 22 minutos a 4ºC. Se quitó el sobrenadante y se centrifugó en un rotor Beckman TI45 a 36.000 rpm durante 45 minutos a 4ºC.

Se precipitó la PDE4A del sobrenadante a alta velocidad añadiendo sulfato de amonio sólido (0,26 g/mL sobrenadante) mientras se removía en un baño de hielo y se mantenía el pH entre 7.0 y 7.5. Las proteínas precipitadas que contenían PDE4A se recolectaron por centrifugación en un rotor Beckman JA-10 a 9.000 rpm durante 22 minutos. Se procedió a una nueva suspensión del precipitado en 50 mL MgCl_{2} de Buffer G (50 mM MOPS pH 7.5, 10 \muM ZnSO_{4} 5 mM MgCl_{2}, 100 mM NaCl, 14,2 mM 2-mercapto-etanol, 2 mM benzamidina HCl, 5 \mug/mL de leupeptina, pepstatina y aprotinina respectivamente, y 20 \mug/mL de inhibidores I y II de calpaina respectivamente) y se hizo pasar a través de un filtro de 0,45 \mum.

La muestra resuspendida (50 a 100 mL) se cargó sobre una columna 5 X 100 cm de Pharmacia SEPHACRYL® S-300 equilibrada en Buffer G. La actividad enzimática se eluyó a un caudal unitario de 2 mL/min y se guardó en reserva para su ulterior fraccionamiento.

La PDE4A aislada en la cromatografía de filtración de gel se aplicó a una columna 1,6 X 20 cm de Agarosa Sigma Cibacron Blue - tipo 300 (10 mL), se equilibró en Buffer A (50 mM MOPS pH 7.5, 10 \muM ZnSO_{4}, 5 mM MgCl_{2}, 14,2 mM 2-mercaptoetanol, y 100 mM de benzamidina HCl). La columna se lavó sucesivamente con 50 a 100 mL de Buffer A, 20 a 30 mL de Buffer A que contenía 20 mM 5'-AMP, 50 a 100 mL de Buffer A que contenía 1,5 NaCl y 10 a 20 mL de Buffer C (50mM Tris HCl pH 8, 10 \muM ZnSO_{4}, 14,2 mM 2-mercaptoetanol, y 2 mM de benzamidina HCl). La enzima se eluyó con 20 a 30 mL de Buffer C que contenía 20 mM cAMP.

El pico de actividad PDE se agrupó (pooled), y se precipitó con sulfato de amonio (0,33 g/mL reserva (pool) de enzimas) para quitar el exceso de nucleótido cíclico. Las proteínas precipitadas se resuspendieron en Buffer X (25 mM MOPS pH 7.5, 5 \muM ZnSO_{4} 50 mM NaCl, 1 mM DTT y 1 mM de benzamidina HCl), y se desaló por filtración de gel sobre una columna Pharmacia PD-10® según instrucciones del fabricante. La enzima se congeló rápidamente en un baño de hielo seco/etanol, y se almacenó a -70ºC.

Las preparaciones resultantes eran puras en aproximadamente >80% según SDS-PAGE. Estas preparaciones tenían actividades específicas de 10 a 40 \mumol aproximadamente de cAMP hidrolizado por minuto por miligramo de proteína.

Preparación de PDE4B de S. cerevisiae

Se descongelaron células de levadura (150 g de levadura estirpe Y123 que albergaba HDUN2.32) mezclando con 100 mL de perlas de vidrio (0,5 mM, lavado en ácido) y 150 mL Lysis Buffer (50 mM MOPS pH 7.2, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM DTT, 2 mM benzamidina HCl, 5 \mug/mL de pepstatina, leupeptina, aprotinina respectivamente, inhibidores I y II de calpaina) a temperatura ambiente. La mezcla se enfrió a 4ºC, se llevó a un Bead-Beater®, y las células se sometieron a lisis mezclando rápidamente en 6 ciclos de 30 segundos cada uno. El homogenado se centrifugó durante 22 minutos en una centrífuga Beckman J2-21M utilizando un rotor JA-10 a 9.000 rpm y 4ºC. El sobrenadante se recuperó y se centrifugó en una ultracentrifugadora Beckman XL-80 utilizando un rotor TI45 a 36.000 rpm durante 45 minutos a 4ºC. El sobrenadante se recuperó y se precipitó la PDE4B añadiendo sulfato de amonio sólido (0,26 g/mL de sobrenadante) agitando en un baño de hielo y manteniendo el pH entre 7.0 y 7.5. Esta mezcla se centrifugó entonces durante 22 minutos en una centrifugadora Beckman J2 utilizando un rotor JA-10 a 9.000 rpm (12.000 X g). Se descartó el sobrenadante y se disolvió el nódulo en 200 mL de Buffer A (50 mM MOPS pH 7.5, 5 mM MgCl_{2}, 1 mM DTT, 1 mm de benzamidina HCl, y 5 \mug/mL de leupeptina, pepstatina y aprotinina respectivamente). El pH y la conductividad se corrigieron a 7.5 y 15-20 mS respectivamente.

La muestra resuspendida se cargó sobre una columna 1,6 X 200 cm (25 mL) de Agarosa Sigma Cibacron Blue - tipo 300 equilibrada en Buffer A. La muestra se hizo pasar a través de la columna de 4 a 6 veces en un período de 12 horas. La columna se lavó sucesivamente con 125 a 250 mL de Buffer A, 125 a 250 mL de Buffer A que contenía 1,5 M NaCl, y 25 a 50 mL de Buffer A. La enzima se eluyó con 50 a 75 mL de Buffer E (50 mM Tris HCl pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM DTT, 2 mM benzamidina de HCl, y 20 mM cAMP) y 50 a 75 mL de Buffer E que contenía 1 M NaCl. El pico de actividad de PDE se agrupó, y se precipitó con sulfato de amonio (0,4 g/mL reservorio de enzimas) para quitar el exceso de nucleótido cíclico. Las proteínas precipitadas se resuspendieron en Buffer X (25 mM MOPS pH 7.5, 5 \muM ZnSO_{4} 50 mM NaCl, 1 mM DTT y 1 mM de benzamidina HCl), y se desaló por filtración de gel sobre una columna Pharmacia PD-10® según instrucciones del fabricante. El reservorio de enzimas se dializó durante la noche con respecto a Buffer X que contenía 50% de glicerol. Esta enzima se enfrió rápidamente en un baño de hielo seco/etanol, y se almacenó a -70ºC.

Las preparaciones resultantes eran aproximadamente >90% puro por SDS-PAGE. Estas preparaciones tenían actividades específicas de 10 a 50 \mumol cAMP hidrolizado por minuto por miligramo de proteína.

Preparación de PDE4C de S. cerevisiae

Se descongelaron células de levadura (150 g de levadura estirpe YI30 que albergaba HDUN3.48) mezclando con 100 mL de perlas de vidrio (0,5 mM, lavado en ácido) y 150 mL Lysis Buffer (50 mM MOPS pH 7.2, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM DTT, 2 mM benzamidina HCl, 5 \mug/mL de pepstatina, leupeptina, aprotinina respectivamente, inhibidores I y II de calpaina) a temperatura ambiente. La mezcla se enfrió a 4ºC, se llevó a un Bead-Beater®, y las células se sometieron a lisis mezclando rápidamente en 6 ciclos de 30 segundos cada uno. El homogenado se centrifugó durante 22 minutos en una centrífuga Beckman J2-21M utilizando un rotor JA-10 a 9.000 rpm y 4ºC. El sobrenadante se recuperó y se centrifugó en una ultracentrifugadora Beckman XL-80 utilizando un rotor TI45 a 36.000 rpm durante 45 minutos a 4ºC.

El sobrenadante se recuperó y se precipitó la PDE4C añadiendo sulfato de amonio sólido (0,26 g/mL de sobrenadante) agitando en un baño de hielo y manteniendo el pH entre 7.0 y 7.5. Esta mezcla se centrifugó entonces durante 22 minutos en una centrifugadora Beckman J2 utilizando un rotor JA-10 a 9.000 rpm (12.000 X g). Se descartó el sobrenadante y se disolvió el nódulo en 200 mL de Buffer A (50 mM MOPS pH 7.5, 5 mM MgCl_{2}, 1 mM DTT, 2 mm de benzamidina HCl, y 5 ng/mL de leupeptina, pepstatina y aprotinina). El pH y la conductividad se corrigieron a 7.5 y 15-20 mS respectivamente.

La muestra resuspendida se cargó sobre una columna 1,6 X 200 cm (25 mL) de Agarosa Sigma Cibacron Blue - tipo 300 equilibrada en Buffer A. La muestra se hizo pasar a través de la columna de 4 a 6 veces en un período de 12 horas. La columna se lavó sucesivamente con 125 a 250 mL de Buffer A, 125 a 250 mL de Buffer A que contenía 1,5 M NaCl, y 25 a 50 mL de Buffer A. La enzima se eluyó con 50 a 75 mL de Buffer E (50 mM Tris HCl pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM DTT, 2 mM benzamidina de HCl, y 20 mM cAMP) y 50 a 75 mL de Buffer E que contenía 1 M NaCl. El pico de actividad de PDE se agrupó, y se precipitó con sulfato de amonio (0,4 g/mL reservorio de enzimas) para quitar el exceso de nucleótido cíclico. Las proteínas precipitadas se resuspendieron en Buffer X (25 mM MOPS pH 7.5, 5 \muM ZnSO_{4} 50 mM NaCl, 1 mM DTT y 1 mM de benzamidina HCl), y se desaló por filtración de gel sobre una columna Pharmacia PD-10® según instrucciones del fabricante. El reservorio de enzimas se dializó durante la noche con respecto a Buffer X que contenía 50% de glicerol. Esta enzima se enfrió rápidamente en un baño de hielo seco/etanol, y se almacenó a -70ºC.

Las preparaciones resultantes eran aproximadamente >80% puro por SDS-PAGE. Estas preparaciones tenían actividades específicas de 10 a 20 \mumol cAMP hidrolizado por minuto por miligramo de proteína.

Preparación de PDE4D de S. cerevisiae

Se descongelaron células de levadura (100 g de levadura estirpe YI29 que albergaba HDUN4.11) mezclando con 150 mL de perlas de vidrio (0,5 mM, lavado en ácido) y 150 mL Lysis Buffer (50 mM MOPS pH 7.2, 10 \muM ZnSO_{4}, 2 nM MgCl_{2}, 14,2 nM 2-mercaptoetanol, 2 mM benzamidina HCl, 5 \mug/mL de pepstatina, leupeptina, aprotinina respectivamente, inhibidores I y II de calpaina) a temperatura ambiente. La mezcla se enfrió a 4ºC, se llevó a un Bead-Beater®, y las células se sometieron a lisis mezclando rápidamente en 6 ciclos de 30 segundos cada uno. El homogenado se centrifugó durante 22 minutos en una centrifugadora Beckman J2-21M utilizando un rotor JA-10 a 9.000 rpm y 4ºC. El sobrenadante se recuperó y se centrifugó en una ultracentrifugadora Beckman XL-80 utilizando un rotor TI45 a 36.000 rpm durante 45 minutos a 4ºC. El sobrenadante se recuperó y se precipitó la PDE4D añadiendo sulfato de amonio sólido (0,33 g/mL de sobrenadante) agitando en un baño de hielo y manteniendo el pH entre 7.0 y 7.5. Treinta minutos después, esta mezcla se centrifugó durante 22 minutos en una centrifugadora Beckman J2 utilizando un rotor JA-10 a 9.000 rpm (12.000 X g). Se descartó el sobrenadante y se disolvió el nódulo en 100 mL de Buffer A (50 mM MOPS pH 7.5, 10 \muM ZnSO_{4}, 5 mM MgCl_{2}, 14.2 nM 2-mercaptoetanol, 100 mM de benzamidina HCl, y 5 \mug/mL de inhibidor I y II de leupeptina, pepstatina aprotinina y calpaina respectivamente). El pH y la conductividad se corrigieron a 7.5 y 15-20 mS respectivamente.

A un caudal de 0,67 mL/min, la muestra resuspendida se cargó sobre una columna 1,6 X 20 cm (10 mL) de Agarosa Sigma Cibacron Blue - tipo 300 equilibrada en Buffer A. La columna se lavó sucesivamente con 50 a 100 mL de Buffer A que contenía 20 nM 5'-AMP, 50 a 100 mL de Buffer A que contenía 1,5 M NaCl, y entonces 10 a 10 mL de Buffer C (50 nM Tris HCl pH 8, 10 uM ZnSO_{4}, 14,2 mM 2-mercaptoetanol, 2 nM benzamidina HCl). La enzima se eluyó con 20 a 30 mL de Buffer C que contenía 20 mM cAMP.

El pico de actividad de PDE se agrupó, y se precipitó con sulfato de amonio (0,4 g/mL reservorio de enzimas) para quitar el exceso de nucleótido cíclico. Las proteínas precipitadas se resuspendieron en Buffer X (25 mM MOPS pH 7.2, 5 \muM ZnSO_{4} 50 mM NaCl, 1 mM DTT y 1 mM de benzamidina HCl), y se desaló por filtración de gel sobre una columna Pharmacia PD-10® según instrucciones del fabricante. El reservorio de enzimas se dializó durante la noche con respecto a Buffer X que contenía 50% de glicerol. Este preparado enzimático se enfrió rápidamente en un baño de hielo seco/etanol, y se almacenó a -70ºC.

Las preparaciones resultantes eran aproximadamente >80% puro por SDS-PAGE. Estas preparaciones tenían actividades específicas de 20 a 50 \mumol cAMP hidrolizado por minuto por miligramo de proteína.

Ejemplo nº.	Peso molecular	PDE4 IC_{50} (nM)
1	445,58	4,731.1

Los datos presentados anteriormente muestran que los presentes compuestos son inhibidores potentes de PDE4, por ejemplo los compuestos tienen un IC_{50} vs. recombinante humano PDE4 de aproximadamente 0,05 \muM a aproximadamente 15 \muM. Los compuestos preferidos tienen un IC_{50} de aproximadamente 100 \muM o menos, los compuestos especialmente preferidos tienen un IC_{50} de aproximadamente 50 \muM o menos.

Los compuestos de la presente invención resultan útiles para inhibir selectivamente la actividad de PDE4 en un mamífero, sin presentar los efectos negativos sobre el SNC y los eméticos asociados con los anteriores inhibidores de PDE4.

Claims (39)

1. Compuesto que tiene como fórmula

28

donde R^{1} es alquilo C_{1}-C_{6}, alquilo puente, aralquilo, cicloalquilo, un heterociclo saturado de 5 ó 6 lados, C_{1-3} alquileno cicloalquilo, propargil aril- o heteroaril sustituido, alilo aril- o heteroaril sustituido, o halocicloalquilo;

R^{2} es hidrógeno, metilo o metilo halo-sustituido;

R^{3} se elige dentro del grupo formado por C(=O)OR^{7}, C(=O)R^{7}, C(=NH)NR^{8}R^{9}, C(=O)NR^{8}R^{9}, C_{1}-C_{6}alquilo, alquilo puente, cicloalquilo, haloalquilo, halocicloalquilo, C_{1}-C_{3}alquileno cicloalquilo, un heterociclo saturado de 5 ó 6 lados, arilo, heteroarilo, heteroaril-SO_{2}, aralquilo, alcarilo, heteroaralquilo, heteroalcarilo, C_{1-3}alquilenoC(=O)OR^{7}, C(=O)C_{1-3}alquilenoC(=O)OR^{7}, C_{1-3}alquileno heteroarilo, C(=O) C(=O)OR^{7}, C(=O) C_{1-3}alquilenoC(=O)OR^{7}, C(=O)C_{1-3}alquilenoNHC(=O)OR^{7}, C(=O)C_{1-3} alquilenoNH_{2} y NH_{2}C(=O) OR^{7}.

R^{4} es hidrógeno, C_{1}-C_{6}alquilo, haloalquilo, cicloalquilo, arilo, C(=O)R^{7}, OR^{8}, NR^{8}R^{9}, o SR^{8}.

R^{5} hidrógeno, C_{1}-C_{6}alquilo, haloalquilo, cicloalquilo o arilo;

R^{7} se elige dentro del grupo formado por cicloalquilo, C_{1}-C_{6}alquilo ramificado y no ramificado, heteroarilo, arilo, un heterociclo, aralquilo, y R^{7} se sustituye opcionalmente por uno o más OR^{8}, NR^{8}R^{9} o SR^{8}; y

R^{8} y R^{9}, iguales o diferentes, se eligen dentro del grupo formado por hidrógeno, C_{1}-C_{6}alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, alcarilo, heteroaralquilo, heteroalcarilo y aralquilo, o R^{8} y R^{9} se toman juntos para formar un anillo de 4 a 7 lados;

R^{10} es hidrógeno, alquilo, haloalquilo, cicloalquilo, arilo, C(=O)alquilo, C(=O)cicloalquilo, C(=O)arilo, C(=O) Oalquilo, C(=O)Ocicloalquilo, C(=O) arilo, CH_{2}OH, CH_{2}Oalquilo, CHO, CN, NO_{2}, o SO_{2}R^{11}; y

R^{11} es alquilo, cicloalquilo, trifluormetilo, arilo, aralquilo, o NR^{8}R^{9}.

2. El compuesto de la reivindicación 1 tiene como estructura:

29

3. El compuesto según la reivindicación 1 ó 2 donde R^{1} se elige dentro del grupo formado por:

30

31

32

33

34

35

36

37

y

38

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde R^{1} es metilo o difluormetilo.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R^{3} se elige dentro del grupo formado por C(=O)OR^{7}, aralquilo, alcarilo, heteroaralquilo, heteroalcarilo, C_{1}-C_{6}, alquilo, cicloalquilo heteroarilo, un heterociclo saturado de 5 ó 6 lados y arilo.

6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R^{3} se elige dentro del grupo formado por:

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

y

52

7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde R^{4} se elige dentro del grupo formado por hidrógeno, metilo, trifluormetilo, ciclopropilo, acetilo, etinilo benzoilo, fenilo, y NR^{8}R^{9}, donde R^{8} y R^{9} son independiente mente, hidrógeno, C_{1}-C_{6}alquilo o cicloalquilo, o R^{8} y R^{9} forman un anillo de 5 ó 6 lados.

8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde R^{5} es hidrógeno.

9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde R^{7} es C_{1}-C_{6}alquilo.

10. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde R^{8} y R^{9}, independientemente, son hidrógeno, o C_{1}-C_{6} alquilo, o se toman juntos para tomar un anillo de 5 ó 6 lados.

11. El compuesto de la reivindicación 1, donde R^{1} se elige dentro del grupo formado por ciclopentilo, tetrahidrofurilo, indanilo, norbornilo, fenetilo, y fenilbutilo; R^{2} se elige dentro del grupo formado por metilo y difluormetilo;

R^{3} se elige dentro del grupo formado por CO_{2}CH_{3}, C(=O)CH_{2}OH, C(=O)CH(CH_{3})-OH, C(=O)C(CH_{3})_{2}OH, y

53

R^{4} es NR^{8}R^{9}; R^{5} es hidrógeno; R^{7} es metilo, R^{8} y R^{9}, independientemente, se eligen dentro del grupo formado por hidrógeno y C_{1}-C_{6} alquilo o se toman juntos para formar un anillo de 5 ó 6 lados; y R^{10} es hidrógeno.

12. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que tiene como fórmula:

54

13. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que tiene un IC_{50} vs. recombinante humano PDE4 de 0,05 \muM a 15 \muM.

14. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que tiene un IC_{50} vs. recombinante humano PDE4 de 100 x 10^{-6} M o menos.

15. El compuesto de la reivindicación 14, que tiene un IC_{50} vs. recombinante humano PDE4 de 50 x 10^{-6} M o menos.

16. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Una composición farmacéutica según la reivindicación 16 que comprende un segundo agente terapéutico antiinflamatorio.

18. La composición de la reivindicación 17, en la que el segundo agente terapéutico antiinflamatorio es capaz de tomar como diana a TNF\alpha.

19. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, que se utiliza en un método de tratamiento.

20. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero, en cuyo estado la inhibición de un PDE específico de cAMP presenta beneficio terapéutico.

21. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para la fabricación de un medicamento para la modulación de niveles de cAMP en un mamífero.

22. La utilización de la reivindicación 20, en la que el estado es una afección alérgica, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad artrítica, o dermatitis.

23. La utilización de la reivindicación 20, en la que el estado es artritis reumatoide, osteoartritis, artritis gotosa o espondilitis.

24. La utilización de la reivindicación 20, en la que el estado es oftalmopatía asociada con tiroides, enfermedad de Behcet, septicemia, shock séptico, shock endotóxico, septicemia gram negativa, septicemia gram positiva, síndrome de shock tóxico, conjuntivitis alérgica, conjuntivitis vernal o granuloma eosinófilo.

25. La utilización de la reivindicación 20, donde la enfermedad es asma, bronquitis crónica, rinitis alérgica, síndrome disneico agudo del adulto, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, silicosis o sarcoidosis pulmonar.

26. La utilización de la reivindicación 20, donde la enfermedad es un traumatismo de revascularización del miocardio, cerebro o extremidades, como una lesión en el cerebro o la médula espinal causada por trauma.

27. La utilización de la reivindicación 20, donde la enfermedad es una fibrosis, formación queloide o formación de tejido cicatricial.

28. La utilización de la reivindicación 20, donde la enfermedad es lupus eritematosus sistémico, trastorno por rechazo de trasplante, reacción injerto-contra-huésped o rechazo de aloinjerto.

29. La utilización de la reivindicación 20, donde la enfermedad es glomerulonefritis crónica, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Krohn o colitis ulcerosas.

30. La utilización de la reivindicación 20, donde la enfermedad es una afección linfocítica proliferativa o leucemia.

31. La utilización de la reivindicación 20, donde la enfermedad es una dermatosis inflamatoria, dermatitis atópica, psoriasis o urticaria.

32. La utilización de la reivindicación 20, donde la enfermedad es una cardiomiopatia, insuficiencia cardiaca congestiva, aterosclerosis, pirexia, caquexia, caquexia secundaria a infección o tumor maligno, caquexia secundaria a síndrome de inmunodeficiencia adquirida, ARC, malaria cerebral, osteoporosis, afección de resorción ósea, fiebre y mialgias debida a infección, disfunción eréctil, diabetes insipidus, trastorno del sistema nervioso central, depresión o demencia multi-infarto, respuesta a ansiedad o estrés, isquemia cerebral, disquinesia tardía, enfermedad de Parkinson o síndrome premenstrual.

33. La utilización de la reivindicación 20, donde el mamífero muestra una respuesta emética mínima.

34. La utilización de la reivindicación 20, donde el mamífero no presenta respuesta emética alguna.

35. La utilización de la reivindicación 20, donde el mamífero presenta efectos secundarios negativos mínimos sobre el sistema nervioso central.

36. La utilización de la reivindicación 20, donde el mamífero carece de efectos secundarios negativos sobre el sistema nervioso central.

37. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para la fabricación de un medicamento para reducir los niveles de TNF en un mamífero.

38. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para la fabricación de un medicamento para suprimir la activación celular inflamatoria en un mamífero.

39. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para la fabricación de un medicamento para inhibir la función PDE4 en un mamífero.