ES2215631T3 - Hemihidrato de 16alfa-bromoepiandrosterona. - Google Patents

Hemihidrato de 16alfa-bromoepiandrosterona.

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ES2215631T3
ES2215631T3 ES00918365T ES00918365T ES2215631T3 ES 2215631 T3 ES2215631 T3 ES 2215631T3 ES 00918365 T ES00918365 T ES 00918365T ES 00918365 T ES00918365 T ES 00918365T ES 2215631 T3 ES2215631 T3 ES 2215631T3
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James Martin Frincke
Luis Daniel De Carvalho Dos Anjos
William Heggie
Patrick T. Prendergast
Christopher L. Reading
Krupakar Paul Thadikonda
Russell Neil Vernon
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Abstract

Hemihidrato de 16a-bromo-3beta/-hidroxi-5alfa-androstan-17-ona, caracterizado por uno o más de (1) comienzo de un endotermo de absorción como se mide por análisis de calorimetría diferencial de barrido de aproximadamente 100ºC ñ 2ºC, (2) dos bandas de absorción de carbonilo a aproximadamente 1741 cm- 1 y 1750 cm- 1 como se mide por espectroscopia de absorción en el infrarrojo por transformada de Fourier, (3) un contenido de agua de aproximadamente 2, 4% p/p a aproximadamente 2, 6% p/p como se mide por titulación por Karl Fisher y (4) 1, 2, 3 o más de los picos de XRD en los valores Theta de aproximadamente 17, 8º ñ 0, 2º, 23, 8º ñ 0, 2º, 24, 2º ñ 0, 2º, 26, 9º - 27, 2 º ñ 0, 2º, 28, 6 º ñ 0, 2º, 30, 1 º ñ 0, 2º y 32, 2 ñ 0, 2º Theta, donde los picos de XRD se determinan usando radiación Cu-K .

Description

Hemihidrato de 16\alpha-bromoepiandrosterona.
Antecedentes de la invención
La invención se refiere al hemihidrato de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona (16\alpha-bromoepiandrosterona o de aquí en adelante "BrEA") segúnla reivindicación 1; a una composición que comprende el hemihidrato de BrEA según la reivindicación 5; a un método para preparar el hemihidrato de BrEA según la reivindicación 9; al uso del hemihidrato de BrEA según la reivindicación 14; y al hemihidrato de BrEA para uso como un medicamento según la reivindicación 56. Los esteroides son útiles para una serie de aplicaciones terapéuticas y no terapéuticas, incluyendo su uso como inmunomoduladores. La presente invención se refiere también a métodos para preparar los compuestos, composiciones y formulaciones.
Han sido descritos la BrEA y su preparación a partir del compuesto esteroide 3\beta-hidroxiandrost-5-en-17-ona (deshidroepiandrosterona o "DHEA") (véase por ejemplo, J. Org. Chem. 1962 27: 2937-2938). Han sido descritos los métodos para preparar DHEA y otros esteroides y sus propiedades biológicas, véase por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 2833793, 2911418, 3148198, 3471480, 3976691, 4268441, 4427649, 4542129, 4666898, 4956355, 5001119, 5043165, 5077284, 5028631, 5110810, 5157031, 5162198, 5175154, 5277907, 5292730, 5296481, 5372996, 5387583, 5407684, 5424463, 5461042, 5478566, 5506223, 5518725, 5527788, 5527789, 5532230, 5559107, 5562910, 5583126, 5585371, 5587369, 5591736, 5593981, 5610150, 5635496, 5641766, 5641768, 5656621, 5660835, 5686438, 5696106, 5700793, 5707983, 5709878, 5710143, 5714481, 5728688, 5736537, 5744462, 5753237, 5756482, 5776921, 5776923, 5780460, 5795880, 5798347, 5798348, 5804576, 5807848, 5807849, 5811418, 5824313, 5824668, 5824671, 5827841, 5837269, 5837700, 5843932, 58466963, 5859000, 5872114 y 5872147; las patentes alemanas números 2035738 y 2705917; la publicación PCT números WO 95/21617, WO 97/48367, WO 98/05338, WO 98/50040, WO 98/50041, WO 98/58650; la publicación europea número 0020029; Ben-David, et al., Proc. Soc. Expt. Biol. Med. 1967 125: 1136-1140. Coleman et al., Diabetes 1982 31: 830, Oertel, et al., J. Steroid Biochem. 1972 3: 493-496, Pashko, et al., Carcinogenesis 1981 2: 717-721, Schwartz et al., Nutr. Cancer 1981 3: 46-53; Dyner et al., J. Acquired Immune Deficiency Syndromes 1993 6: 459-465; A. A. Afanasil and Y. A. Titov, Total Steroid Synthesis, Plenum Press, New York, 1970, véase por ejemplo, p 1-304.
Ha sido descrito el uso de DHEA y otros esteroides en diferentes aplicaciones, por ejemplo, en la modulación de las respuestas inmunitarias, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 5869090, 5863910, 5856340, 5824668, 5804576, 5753237, 5714481, 5709878, 5407684, 5206008, 5077284, 4978532, 4898694, 4542129, 3711606 y 3710795. La patente de Estados Unidos 4956355 y la publicación PCT número WO 97/48367, han descrito el uso de BrEA y ciertos compuestos esteroides para tratar ciertas infecciones víricas o bacterianas tales como la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana ("HIV").
Se han descrito diferentes efectos biológicos y/o conversiones metabólicas de los compuestos esteroides, por ejemplo, Batta et al. J. Biol. Chem. 1986 25: 127-133, Belli et al., Liver 1991 11: 162-169, Bhattacharjee et al., Anal. Biochem. 1992 201: 233-236, Blake et al., Int. J. Peptide Protein Res. 1982 20: 97-101, 1986 25: 127-133, Bonaventura. Am. J. Obstet. Gynecol. 1978 131: 403-409, Bucala et al., J. Steroid Biochem. 1986 25: 127-133, Carey et al., Biochem. 1981 20: 3637-3648, Chen et al., Carcinogenesis 1999 20: 249-254, Chen et al., Carcinogenesis 1998 19: 2187-2193, Chow et al., Antisense Res. Dev. 1994 4: 81-86, Citro et al., Dis. Colon Rectum 1994 37 (2 Suppl): S127-S132, Cleary. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1991 196: 8-16, Cleary, Int J. Biochem. 1990 22: 205-210, Crawford et al., Lab. Invest. 1994 71: 42-51, Danenberg et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1992 36: 2275-2279, Dotzlaw et al., Cancer Res. 1999 59: 529-532, Falany et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1994 48: 369-375, Faredin et al., J. Investigative Dermatol. 1969 52: 357-361, Galigniana et al., Mol. Pharmacol. 1999 55: 317-323, Goto et al., J. Chromatogr. 1983 276: 289-300, Grenot Biochem. 1992 31: 7609-7621, Hofbauer et al., Life Sci. 1999 64: 671-679, Huijghebaert et al., J. Lipid Res. 1986 27: 742-752, Hurd et al., Oncogene 1999 18: 1067-1072. Lida et al., J. Lipid Res. 1995 36: 628-638, Jellinck et al., Steroids 1967 10: 329-346, Jonsson et al., J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 1995 20: 394-402, Kalimi et al., Mol.. Cell. Biochem. 1994 131: 99-108, Kramer et al., J. Biol. Chem. 1994 269: 10621-10627, LaRochelle et al., Steroids 1984 43: 209-217, Liao et al., Carcínogenesis 1998 19: 2173-2180, Lillienau et al., J. Clin. Invest. 1992 89: 420-431, Loria, Psychoneuroendocrinology 1997 22: S103-S108, Luscher et al., Mol. Immunol. 1983 20: 1099-1105, Manna et al., J. Biol. Chem. 1999 274: 5909-5918, Marschall et al., J. Biol. Chem. 1989 264: 12989-12993, Medh et al., Cancer Res. 1998 15: 3684-3693. Mohan et al., Steroids 1992 57: 244-247, Munoz de Toro et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1998 67: 333-339, Padgett et al., J. Neuroimmunol. 1998 84: 61, Padgett et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1995 774: 323, Padgett et al., J. Immunol. 1994 153: 1544-1552, Pashko et al., Carcinogenesis 1984 5: 463-466, Pashko et al., Carcinogenesis 1981 2: 717, Petrylak et al., J. Clin. Oncology 1999 17: 958-967, Podesta et al.. Steroids 1996 61: 622-626, Regelson et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 1994 719: 564, Schmassmann et al., Gastroenterology 1993 104: 1171-1181, Schmassmann et al. Hepatology 1990 11: 989-996, Schreiber et al., Lancet 353: 459-461, Schreiber, Neth. J. Med. 1998 53: S24-31, Schwartz et al., Cancer Res. 1988 48: 4817. Shahidi et al., Bíochem. Biophys. Res. Commun. 1999 254: 559-565, Steer et al., Ann. Rheum. Dis. 1998 57: 732-737, Suzuki et al., Steroids 1998 63: 672-677, Suzuki et al., Steroids 1996 61: 296-301, Swaan et al., Bioconjugate Chem. 1997 8: 520-525, Tang et al., Anticancer Drug Res. 1998 13: 815-824, Thomas et al., J. Steroid Biochem. 1986 25: 103-108, Utsumi et al., Cancer Res. 1999 59: 377-381, Vanden Heuvel. J. Nutr. 1999 129(2S Suppl.): 575S-580S, Wang et al., Endocrinology 1998 139: 3903-3912, Wong et al. J. Biol. Chem. 1999 274: 5443-5453, Xie et al., Endocrinology 1999 140: 219-227, Yen et al. Lipids 1977 12: 409-413. Zackheim et al., Arch. Dermatology 1998 134: 949-954, Zhang et al. Biochim. Biophys. Acta 1991 1096: 179-186, Zhu et al., Carcinogenesis 1988 19: 2101-2106.
Las composiciones que contienen BrEA que se usaron para dispensar el compuesto a células o extractos de células usualmente incluían una significativa cantidad de agua. Tales composiciones contenían disolventes tales como dioxano o dimetilsulfóxido ("DMSO") que contenían agua, o una solución acuosa de ciclodextrina para facilitar la dispensación del compuesto a las células, véase por ejemplo, J. Pharmacol Exp. Ther. 1998, 285: 876-83, Cancer Res. 1986 46: 3389-95, Carcinogenesis 1985 6: 333-35, Carcinogenesis 1981 2: 717-721, Carcinogenesis 1981 2: 683-86. Tales composiciones se dispensan típicamente a los animales por inyección o a las células en cultivo de tejidos por adición al medio de cultivo celular. La publicación europea número EP 429 187 describe formulaciones que contienen DHEA o BrEA y polivinilpirrolidona y polivinilpirrolidona reticulada. Algunas de estas composiciones pueden tener propiedades no deseadas o subóptimas. Por ejemplo, los disolventes tales como dioxano, DMSO o cloroformo, generalmente no son excipientes parenterales preferidos ni adecuados, particularmente para uso humano. Se necesitan formulaciones que contienen BrEA o esteroides relacionados y que tienen mejores propiedades, por ejemplo, menor toxicidad, mejor estabilidad química o características deseables para una síntesis a gran escala.
Las respuestas inmunitarias de los mamíferos a las infecciones u otras enfermedades se caracterizan a menudo por respuestas mediadas por diferentes poblaciones de células efectoras. En algunas situaciones, las células ayudadoras T denominadas Th1 en el sistema murino, facilitan las funciones efectoras inmunitarias que están típicamente dominadas por respuestas mediadas por las células. En otros casos, las células ayudadoras T denominadas células Th2 facilitan las funciones efectoras inmunitarias que están típicamente dominadas por respuestas humorales. Se necesita usualmente una vigorosa respuesta Th1 para eliminar las infecciones o para retardar el progreso de una infección. Cuando la respuesta inmunitaria de un sujeto es desviada hacia una respuesta tipo Th2 o es dominada por una respuesta tipo Th2, las citoquinas asociadas con la respuesta Th2 tienden a deprimir la capacidad del sistema inmunitario para producir una vigorosa respuesta Th1 al mismo tiempo. Generalmente también lo inverso es cierto. Cuando las respuestas inmunitarias de los mamíferos empiezan a dar como resultado un aumento de la respuesta Th2, la respuesta Th1 para la misma enfermedad tiende a debilitarse. Las respuestas Th1 débiles se pueden asociar con el progreso de algunas infecciones u otras enfermedades, véase por ejemplo, M. Clerici and G. M. Shearer, Immunol. Today 14: 107-111, 1993; M. Clerici and G. M. Shearer, Immunol. Today 15: 575-581. 1994. La invención proporciona compuestos y composiciones útiles para mejorar las respuestas inmunitarias Th1.
Adicionalmente, el documento WO 98/475116 A1 describe un método para mejorar la respuesta inmunitaria Th1 protectora cuando se usan compuestos 17-cetoesteroidales como agentes antivirales, antibacterianos, anti-micoplasma, o anti-parásitos intracelulares, entre los que la 16 \alpha-bromoepiandrosterona es un compuesto preferido.
Objetivos de la invención
Las composiciones, formulaciones, usos o métodos de la invención cumplen uno o más de los siguientes objetivos.
Un objetivo de la invención es proporcionar nuevos compuestos esteroides o análogos que son adecuados para uso terapéutico y otras aplicaciones, tales como inmunomoduladores. Los objetivos de la invención incluyen además proporcionar el hemihidrato de BrEA (BrEA_{2} \cdot H_{2}O), composiciones que comprenden hemihidrato de BrEA y métodos para su preparación y uso. Otro objetivo de la invención es proporcionar composiciones y formulaciones líquidas que comprenden uno o más compuestos de la fórmula 1, y que comprenden aproximadamente 3% (v/v) o menos de agua. Otro objetivo es proporcionar composiciones que se pueden usar como intermedios para preparar formulaciones farmacéuticas humanas y veterinarias que contienen uno o más compuestos de la fórmula 1. Otro objetivo es proporcionar métodos de administración intermitente para dispensar un compuesto de la fórmula 1 a un sujeto para mejorar las respuestas inmunitarias Th1. Objetivos adicionales son proporcionar métodos para modular la inmunidad innata o para mejorar las respuestas inmunitarias Th1 en un sujeto mediante la administración al sujeto de uno o más compuestos de la fórmula 1, tal como BrEA. Otros objetivos son proporcionar métodos para inhibir la replicación de patógenos por ejemplo, la replicación viral en un sujeto administrando al sujeto uno o más compuestos de la fórmula 1 tal como BrEA. Los objetivos de la invención incluyen proporcionar compuestos de la fórmula 1 o formulaciones útiles para mejorar uno o más síntomas de un estado patológico asociado con la inmunodepresión o con deficientes respuestas inmunitarias Th1. Otros objetivos son proporcionar métodos para preparar y usar composiciones y formulaciones que comprenden uno o más compuestos de la fórmula 1.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un espectro FTIR (infrarrojo por transformada de Fourier), obtenido por el método <197> de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP), del hemihidrato de BrEA que fue preparado por precipitación de BrEA a partir de etanol y agua. La Figura 2 es un espectro FTIR obtenido por el método <197> de la USP de BrEA anhidra que fue preparada por precipitación de BrEA a partir de metanol anhidro. La Figura 3 presenta un endotermo DSC del hemihidrato de BrEA que fue preparado por precipitación de BrEA a partir de etanol y agua. La Figura 4 presenta un endotermo DSC de BrEA anhidra que fue preparada por precipitación de BrEA a partir de metanol anhidro. La Figura 5 es un espectro XRD (difracción de rayos X en polvo) del hemihidrato de BrEA que fue preparado por precipitación de BrEA a partir de etanol y agua. La Figura 6 es un espectro FTIR, obtenido por el método <197> de la USP, del hemihidrato de BrEA que fue preparado por precipitación de BrEA a partir de acetona y agua.
Sumario de la invención
De acuerdo con los objetivos, la invención proporciona hemihidrato de BrEA
1
que se caracteriza opcionalmente con relación a una o más propiedades físicas tales como su punto de fusión, espectro de absorción en el infrarrojo o su espectro de difracción de rayos X en polvo.
Las realizaciones relacionadas incluyen hemihidrato de BrEA y uno o más excipientes adecuados para uso farmacéutico humano o para uso veterinario. Otra realización relacionada es un método para preparar el hemihidrato de BrEA que comprende precipitar BrEA de una solución que comprende etanol y agua.
La BrEA está incluida en un compuesto según la fórmula 1
2
y uno o más excipientes líquidos no acuosos, y la composición comprende menos de aproximadamente 3% v/v de agua, y en la que,
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{10} son independientemente -H, -OR^{PR}, -SR^{PR}, -N(R^{PR})_{2}, -O-Si-(R^{13})_{3}, -CN, -NO_{2}, un éster, un tioéster, un fosfoéster, un fosfotioéster, un fosfonoéster, un fosfinoéster, un éster sulfito, un éster sulfato, una amida, un aminoácido, un péptido, un éter, un tioéter, un grupo acilo, un grupo tioacilo, un carbonato, un carbamato, un tioacetal, un halógeno, un grupo alquilo opcionalmente sustituido, un grupo alquenilo opcionalmente sustituido, un grupo alquinilo opcionalmente sustituido, un resto arilo opcionalmente sustituido, un resto heteroarilo opcionalmente sustituido, un monosacárido opcionalmente sustituido, un oligosacárido opcionalmente sustituido, un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleótido, un polímero, o,
uno más de R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, R^{10}, R^{15}, R^{17} y R^{18} son =O ó =S y el átomo de hidrógeno que está unido al mismo átomo de carbono está ausente.
Las realizaciones incluyen formulaciones líquidas que comprenden BrEA, uno o más excipientes y menos de aproximadamente 3% v/v de agua, y en las que la formulación está opcionalmente dispuesta en recipientes que excluyen el agua.
Otra realización es un método que comprende la administración intermitente de BrEA a un sujeto que tiene una afección patológica, tal como una infección viral o parasitaria.
Una realización adicional es un método para modular la inmunidad innata de un sujeto, las respuestas inmunitarias Th1 o las respuestas inmunitarias Th2 que comprende administrar BrEA a un sujeto.
Otras realizaciones son como se describen en la memoria descriptiva incluyendo las realizaciones numeradas adjuntas y las reivindicaciones.
Descripción detallada de la invención Definiciones
Como se usan aquí y a menos que se indique otra cosa o venga implicado por el contexto, los siguientes términos tienen los significados definidos aquí.
Una "formulación de la invención" o "formulación" significa una composición de la invención que se puede administrar parenteralmente a un ser humano o a un animal sin manipulaciones adicionales que cambien las proporciones de los ingredientes o ingrediente que están presentes. Las formulaciones son adecuadas para aplicaciones humanas o veterinarias.
Una "composición de la invención" es una composición, que es un intermedio que se puede usar para preparar las formulaciones de la invención, esto es, para preparar una formulación se necesita un cambio o cambios en un ingrediente(s) o en sus cantidades. Por tanto, las composiciones de la invención incluyen composiciones en las que se requiere un tratamiento adicional antes de convertirse en una formulación, por ejemplo, la mezcla o adición de una cantidad deseada de un ingrediente.
Un "excipiente" significa un componente o un ingrediente que es aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de las composiciones o formulaciones de la invención y de no ser demasiado perjudicial para el paciente o el animal al que se va a administrar la formulación. Como se usan aquí, los "excipientes" incluyen líquidos, tales como benzoato de bencilo, aceite de algodón, N,N-dimetilacetamida, un alcohol C_{2-12} (por ejemplo, etanol), glicerol, aceite de cacahuete, un polietilenglicol ("PEG"), vitamina E, aceite de semillas de amapola, propilenglicol, aceite de alazor, aceite de sésamo, aceite de soja y aceite vegetal. Los excipientes, como se usan aquí, excluirán opcionalmente cloroformo, dioxano, aceite vegetal, DMSO o cualquier combinación de los mismos. Los excipientes comprenden uno o más componentes típicamente usados en las técnicas de la formulación farmacéutica, por ejemplo, agentes de carga, aglutinantes, desintegrantes y lubrificantes.
Un "sujeto" significa un ser humano o un animal. Usualmente el animal es un vertebrado tal como un primate, un roedor, un animal doméstico o un animal de caza. Los primates incluyen chimpancés, monos cinomólogos, monos araña, y macacos, por ejemplo, Rhesus. Los roedores incluyen ratones, ratas, marmotas, hurones, conejos y hámsters. Los animales domésticos y de caza incluyen vacas, caballos, cerdos, ciervos, bisontes, búfalos, felinos, por ejemplo, el gato doméstico, caninos, por ejemplo, perros, aves, por ejemplo, pollos, emú, avestruz, y peces, por ejemplo, trucha, barbo y salmón. El sujeto incluye cualquier subgrupo de los anteriores, por ejemplo, todos los anteriores, pero excluyendo uno o más grupos o especies tales como los seres humanos, los primates o los roedores.
A menos que se indique otra cosa o venga implicado por el contexto, las expresiones de un porcentaje de un ingrediente líquido, por ejemplo, un excipiente, en una composición o formulación de la invención, significan el porcentaje del ingrediente en volumen (v/v). Así, 20% de propilenglicol significa que en una composición o formulación de la invención está presente el 20% v/v de propilenglicol. La cantidad de excipiente indicada en las composiciones de la invención no se ve afectada por la forma usada, por ejemplo disolvente o excipiente de grado NF o USP. Así, una composición de la invención que comprende aproximadamente 30% de polietilenglicol 300 NF puede comprender en su lugar un análogo USP, con la condición de que no se excedan otras limitaciones tales como la cantidad de agua presente.
Como se usa aquí, "inmunidad innata" se refiere a uno o más componentes típicamente asociados con mecanismos no específicos de defensa inmunitaria en un sujeto. Estos componentes incluyen la ruta alternativa del complemento, por ejemplo Factor B, Factor D y properdina; células NK, fagocitos (monocitos, macrófagos), neutrófilos, eosinófilos, células dendríticas, fibrocitos; compuestos químicos antimicrobianos, por ejemplo, defensinas; barreras físicas-piel, epitelio mucosal; y ciertas interleuquinas, quimioquinas y citoquinas. La inmunidad innata desempeña un papel en la resistencia a infecciones parasitarias intracelulares, por ejemplo, infección de los leucocitos, una infección hepática y otras infecciones, por ejemplo infecciones de los nódulos linfáticos. La mejora del mecanismo de inmunidad innata mediante los compuestos de la fórmula 1 o el método descrito aquí, puede aumentar la fusión o movimiento de fagolisosoma, que inhiben algunos patógenos, por ejemplo las bacterias intracelulares tales como las micobacterias o Listeria.
Como se usan aquí, las referencias a las moléculas CD, subgrupos específicos de células inmunitarias, respuestas inmunitarias, y similares, generalmente usan nomenclatura que se aplica a las moléculas, células o similares que se encuentran en los seres humanos. Los análogos u homólogos de tales moléculas, células o similares en otras especies pueden tener una nomenclatura diferente, pero están incluidas en esta invención. Una descripción de la nomenclatura y función de diferentes moléculas CD y subgrupos de células inmunitarias se encuentra en las publicaciones científicas. Las referencias a células Th0, Th1 o Th2 y las referencias a respuestas inmunitarias Th1 o Th2 en el contexto de los pacientes humanos se refiere a los homólogos humanos de las células o respuestas inmunitarias murinas Th0, Th1 o Th2. para revisiones véase, por ejemplo, A.K. Abbas et al., editors, Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders Company, third edition, 1997, ISBN 0-7216-4024-9, pages 4-469 y I. Kimber and M. K. Selgrade, editors, T Lymphocyte Subpopulations in Immunotoxicology, John Wiley & Sons Ltd., 1998, ISBN 0-471-97194-4, páginas 1-53.
"Molécula inmunodepresora" significa moléculas tales como ciclosporina, ciclohexamida, mitomicina C, adriamicina, taxol y anfotericina B. Estas moléculas tienden a ser tóxicas frente al sistema inmunitario y son directa o indirectamente inmunodepresoras, esto es, tóxicas para la división de las células o pueden regular por disminución la inmunidad.
"Receptor de esteroides" significa un producto génico, típicamente un monómero o dímero proteínico que se puede unir a un ligando, por ejemplo, un esteroide natural o uno de sus análogos, tales como los compuestos de la fórmula 1. Los receptores de esteroides incluyen los receptores de esteroides huérfanos. Los receptores de esteroides huérfanos son proteínas para las que el ligando natural o la función biológica son al menos parcialmente desconocidos. Como se usan aquí, los receptores de esteroides incluyen homodímeros, por ejemplo, SXR y (CAR\beta)_{2}, y heterodímeros, por ejemplo, PXR-CAR\beta o RXR-CAR\beta. Los receptores de esteroides incluyen también isoformas, por ejemplo, PXR.1 y PXR.2 para el receptor PXR, y homólogos de los receptores de esteroides, por ejemplo, el homólogo de CAR\beta conocido como MB67. Las isoformas se generan típicamente por diferentes rutas de corte y empalme para un RNA nuclear procedente de un gen, mientras que los homólogos son típicamente una copia distinta de un gen del receptor de esteroides, en la que la copia génica codifica solamente diferencias relativamente pequeñas en comparación con el producto génico del receptor de esteroides de referencia. Tales diferencias se encuentran muy frecuentemente en áreas distintas de la región de dimerización y de la región de unión del esteroide dentro de la estructura del receptor de esteroides. Típicamente las isoformas y homólogos se unen a los mismos o similares ligandos que el producto génico o receptor de esteroides de referencia. Los receptores de esteroides pueden ser de origen humano o animal, por ejemplo, obtenidos de células, tejidos o de genotecas de expresión de cDNA derivadas de células o tejidos de cualquier especie de primates, roedores (incluyendo los murinos), aves, ovinos, bovinos, equinos, caninos o felinos o cualquiera de las especies dentro de cualquier grupo (por ejemplo, familia o género) de las especies mencionadas en otra parte de esta memoria o en cualquier referencia mencionada aquí.
En el contexto de una combinación de moléculas que incluye un receptor de esteroides y un compuesto de la fórmula 1, los "complejos de la invención" o "complejos" significan un complejo que contiene un receptor de esteroides y un compuesto de la fórmula 1 y opcionalmente otras moléculas. Estas otras moléculas incluyen (i) una secuencia de reconocimiento de DNA (de aquí en adelante "DNARS") esto es, una secuencia que el receptor de esteroides reconoce específicamente y a la que se une, y (ii) un factor de transcripción que se puede unir al complejo de receptor de esteroides-compuesto de la fórmula 1. Como se usan aquí, estos complejos pueden surgir en las células in vitro o in vivo, o en sistemas libres de células. Los complejos incluyen, por ejemplo, combinaciones de un heterodímero receptor de esteroides-compuesto de la fórmula 1, combinaciones de un homodímero receptor de esteroides-compuesto de la fórmula 1, combinaciones de monómero receptor de esteroides-compuesto de la fórmula 1, combinaciones de un heterodímero receptor de esteroides-compuesto de la fórmula 1-DNA (o DNARS), combinaciones de un homodímero receptor de esteroides-compuesto de la fórmula 1-DNA (o DNARS), combinaciones de un heterodímero receptor de esteroides-compuesto de la fórmula 1-factor de transcripción, combinaciones de un homodímero receptor de esteroides-compuesto de la fórmula 1-factor de transcripción, combinaciones de un heterodímero receptor de esteroides-compuesto de la fórmula 1-DNA (o DNARS)-factor de transcripción y combinaciones de un homodímero receptor de esteroides-compuesto de la fórmula 1-DNA (o DNARS)-factor de transcripción.
Un "agonista" o un "antagonista" es un compuesto o composición que, respectivamente, o aumenta o disminuye la actividad de un receptor, lo que puede llevar al aumento o disminución de la transcripción de un gen regulado. Los receptores (y factores de transcripción) pueden modular la transcripción de su gen o genes objetivos mediante el aumento de la transcripción o la disminución de la misma.
Métodos generales
Se han descrito métodos, por ejemplo Karl Fischer (KF) y pérdida por desecación (LOD), para determinar el contenido de agua o de disolventes en diferentes composiciones. La LOD mide todos los volátiles en una muestra, mientras que el KF se usa típicamente para medir toda el agua. Cuando el agua es el único volátil presente, los valores de LOD son iguales o menores que los valores de KF para una composición dada. El KF mide el agua de los hidratos de un compuesto y la LOD determina tanto el agua como la cantidad de otros volátiles que pueden estar presentes. Las composiciones y formulaciones de la invención se analizan convenientemente en cuanto a su contenido en agua por titulación por KF (por ejemplo, usando Metrohm 684 KF Coulometer o equivalente) de acuerdo con un procedimiento publicado (U.S. Pharmacopoeia, vol. 23, 1995, chapter <921>, U.S. Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD) y con las instrucciones del fabricante del Coulometer. La cantidad de material usado en el ensayo, aproximadamente 50-100 mg, se mide usando una balanza analítica con sensibilidad hasta la quinta cifra decimal (Sartorius, Model RC2 10D, o un equivalente adecuado). Las cantidades de agua especificadas en las composiciones y formulaciones de la invención es la cantidad obtenida por análisis de KF.
Los métodos de difracción por rayos X en polvo (XRD) se han usado para caracterizar diferentes compuestos cristalinos (véase, por ejemplo, U.S. Pharmacopoeia, vol. 23, 1995, <941>, p. 1843-1845, U.S. Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD; Stout et al., X-Ray Structure Determination; A practical Guide, MacMillan Co., New York, N. Y., 1986). El modelo de difracción o sus porciones, obtenido a partir de un compuesto cristalino es usualmente un diagnóstico de una forma cristalina dada, aunque los picos de difracción débiles o muy débiles no siempre aparecen en los replicados de los modelos de difracción obtenidos de lotes sucesivos de cristales. También, las intensidades relativas de las bandas XRD, particularmente en los valores de incidencia de los rayos X en el ángulo inferior (valor Theta), pueden variar debido a los efectos de la orientación preferida que surgen de las diferencias, por ejemplo, de la forma cristalina, el tamaño de partícula u otras condiciones de medida. Los picos del espectro XRD están típicamente definidos a un valor Theta dado \pm aproximadamente 0,1 a 0,2. La información de XRD desde los picos de XRD de intensidad principal 1, 2, 3, 4, 5 o más, combinada opcionalmente con uno o más datos de diagnóstico distintos (punto de fusión, DSC, IR), usualmente es adecuada para caracterizar o describir un material cristalino tal como el hemihidrato de BrEA de otras formas cristalinas que contienen el mismo compuesto.
Otras técnicas que se usan para identificar o describir un material cristalino tal como el hemihidrato de BrEA incluyen los datos del punto de fusión (MP), calorimetría diferencial de barrido (DSC) y espectroscopía de absorción en el infrarrojo (IR). La DSC mide las temperaturas de transición térmica a las que un cristal absorbe o libera calor cuando cambia su estructura cristalina o funde. Los datos del punto de fusión y las temperaturas de transición térmica por DSC son típicamente reproducibles entre límites de aproximadamente 1 ó 2ºC en análisis sucesivos. El IR mide la absorción de luz infrarroja que se asocia con la presencia de enlaces químicos particulares que están asociados con grupos, por ejemplo, hidroxilo, que vibran en respuesta a longitudes de onda particulares de la luz.
Realizaciones de la invención
La invención proporciona el hemihidrato de BrEA, que está sustancialmente libre de otras formas de BrEA, tales como BrEA amorfa o BrEA anhidra. Como se usa aquí, el hemihidrato de BrEA o el hemihidrato de BrEA cristalino se refiere a BrEA sólida y agua que tiene una disposición ordenada de sustancialmente todas las moléculas constituyentes en un modelo o red espacial tridimensional definido. El hemihidrato de BrEA cristalino puede comprender una o más formas cristalinas, por ejemplo, pastillas, barras, placas o agujas. El hemihidrato de BrEA que está sustancialmente libre de otras formas de BrEA significa una preparación sólida seca o sustancialmente seca (en la que un líquido(s) constituye menos de aproximadamente 10% p/p del peso total) en la que más de aproximadamente 55% p/p de la BrEA de la preparación está presente como hemihidrato de BrEA. Tales composiciones comprenden típicamente al menos aproximadamente 60% p/p, o al menos aproximadamente 70% p/p, o al menos aproximadamente 80% p/p, usualmente al menos aproximadamente 90% p/p, o al menos aproximadamente 95% p/p, o al menos aproximadamente 98% p/p, de hemihidrato de BrEA, estando presente la BrEA restante como otras formas de BrEA tales como BrEA amorfa o BrEA anhidra. El hemihidrato de BrEA sólido comprenderá típicamente al menos aproximadamente 90% p/p, usualmente al menos aproximadamente 97% o aproximadamente 98% p/p del compuesto y menos de aproximadamente 10% p/p, usualmente menos de aproximadamente 3% o 2% p/p de productos secundarios que pueden incluir el isómero 16\beta de BrEA o uno o más productos secundarios de la síntesis de BrEA. A menudo la cantidad de BrEA sólida que está presente en un medio sólido o líquido no contendrá cantidades detectables de otras formas de BrEA (usando métodos analíticos estándar tales como, por ejemplo, FTIR, DSC o XRD) y el hemihidrato podrá, por tanto, comprender aproximadamente 99-100% de la cantidad total de BrEA que está presente.
Otras realizaciones de la invención incluyen composiciones que comprenden una cantidad sustancial de hemihidrato de BrEA, que está presente en composiciones que comprenden una o más formas distintas de BrEA, por ejemplo, BrEA amorfa o BrEA anhidra, y opcionalmente uno o más componentes adicionales, tales como cualquier excipiente descrito en esta memoria. Como se usa aquí, la "cantidad sustancial" de hemihidrato de BrEA en estas composiciones comprende al menos aproximadamente 15-20% p/p, o al menos aproximadamente 20% p/p, de hemihidrato de BrEA de la cantidad total de BrEA que está presente, típicamente al menos aproximadamente 25% p/p, más típicamente al menos aproximadamente 30% p/p, a menudo al menos aproximadamente 35% p/p y usualmente al menos aproximadamente 45% p/p. Estas composiciones son generalmente sólidas, por ejemplo, formulaciones o dosis unitarias, pero pueden incluir también suspensiones, precipitados, geles y coloides que contienen BrEA sólida. Tales suspensiones o precipitados pueden prepararse a partir de, por ejemplo, precipitación del hemihidrato de BrEA de una solución que contiene agua o a partir de la adición de BrEA sólida a un excipiente o excipientes líquidos. Evidentemente, las composiciones que comprenden una cantidad sustancial de BrEA pueden estar sustancialmente libres de otras formas de BrEA sólida como se ha discutido antes.
El hemihidrato de BrEA se puede identificar convenientemente con referencia al hemihidrato de BrEA caracterizado por una o más de las técnicas siguientes, (1) su punto o intervalo de fusión o descomposición (opcionalmente expresado como \pm 2ºC), (2) una o más temperaturas o intervalos de transición por DSC del hemihidrato de BrEA (cualquiera de las cuales puede ser opcionalmente expresada como \pm 2ºC), (3) una o más bandas de absorción en el infrarrojo características del hemihidrato de BrEA, (4) 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más picos de XRD de la más alta intensidad (cualquiera de los cuales, uno o más, se expresan opcionalmente como \pm 0,1º Theta o \pm 0,2º Theta) obtenidos de un espectro XRD del hemihidrato de BrEA usando radiación Cu-K\alpha (por ejemplo, obtenidos esencialmente según el método descrito en U.S. Pharmacopoeia, vol. 23, 1995, <941>, p. 1843-1845), (5) la presencia de menos de aproximadamente 3% o menos de aproximadamente 2% p/p de otros compuestos, (6) un contenido en agua del hemihidrato de BrEA seco de aproximadamente 2,5% p/p (por ejemplo, 2,3-2,7% p/p), donde hemihidrato de BrEA seco significa el compuesto secado por filtración, lavado opcionalmente una vez con un disolvente anhidro tal como hexano, filtrado de nuevo y secado en vacío a aproximadamente 60ºC hasta que no hay más pérdida de peso en 24 horas a aproximadamente 60ºC (por ejemplo, cuando el contenido en agua se determina esencialmente por el método de Karl Fischer u otro método descrito en U.S. Pharmacopoeia, vol. 23, 1995, p. 1801-1802 o 1840-1843, métodos <731> o <921>), (7) constantes celulares y la matriz de orientación obtenidas de la cristalografía por rayos X de cristal único del hemihidrato de BrEA (obtenido, por ejemplo, esencialmente como se describe en el documento WO 99/04774 en el ejemplo 13), (8) una descripción de las formas cristalinas que se observan con un aumento de aproximadamente 100X hasta un aumento de aproximadamente 150X mediante microscopía de luz polarizada o (9) descripciones del tamaño medio y forma del cristal del hemihidrato de BrEA.
Así, por ejemplo, el hemihidrato de BrEA se puede caracterizar por una o más de sus bandas de absorción en IR, por ejemplo, los picos de carbonilo a 1741 cm^{-1} y 1752 cm^{-1}, y o por su punto o intervalo de fusión o descomposición y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más de los picos de XRD (usualmente los de intensidad más alta) en los valores Theta (ángulo de difracción de rayos X) de 17,8, 23,8, 24,2, 26,9-27,2, 28,6, 30,1 y 32,2.
El hemihidrato de BrEA es adecuado para preparar composiciones que comprenden un excipiente o excipientes adecuados para uso farmacéutico humano o para uso veterinario. Tales composiciones se usan para preparar formulaciones y formas farmacéuticas unitarias. Las formas farmacéuticas de dosis unitarias comprenden típicamente, comprimidos, cápsulas, comprimidos para chupar o soluciones estériles, incluyendo las soluciones estériles para administración parenteral. Las formas farmacéuticas unitarias sólidas comprenden típicamente, aproximadamente 5-1000 mg de hemihidrato de BrEA, típicamente aproximadamente 20-400 mg, por ejemplo, aproximadamente 25 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 100 mg, aproximadamente 150 mg o aproximadamente 250 mg por dosis unitaria.
La invención proporciona un método para preparar el hemihidrato de BrEA que comprende poner en contacto agua, 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona y un alcohol C_{1}-C_{6} (por ejemplo, metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol) y agua. Típicamente, solamente un alcohol C_{1}-C_{6} está presente, por ejemplo etanol, que es anhidro o puede comprender hasta aproximadamente 2% p/p de agua. En algunas realizaciones, el método utiliza una solución que comprende aproximadamente 5-25% p/p de agua, aproximadamente 39-45% p/p de etanol y aproximadamente 30-45% p/p de una preparación de BrEA. Las preparaciones típicas de BrEA son preparaciones sólidas que comprenden al menos aproximadamente 80% p/p, usualmente al menos aproximadamente 90% p/p o al menos aproximadamente 95% p/p de BrEA. Las soluciones pueden comprender aproximadamente 18-22% p/p de agua, aproximadamente 37-43% p/p de etanol y aproximadamente 37-43% p/p de una preparación de BrEA. Para realizar el método de precipitación o cristalización, la solución debe estar típicamente a una temperatura desde aproximadamente -20ºC hasta aproximadamente 45ºC, usualmente desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 20ºC. La solución se mantiene en este intervalo de temperaturas durante desde aproximadamente 30 minutos hasta aproximadamente 12 horas y la solución se agita opcionalmente usando una agitación de lenta a moderada durante la cristalización.
Una realización relacionada comprende un método para preparar el hemihidrato de BrEA, que comprende precipitar BrEA de una solución que comprende al menos aproximadamente 12-25% p/p de agua, aproximadamente 35-45% p/p de una preparación de BrEA y al menos aproximadamente 35-45% p/p de uno o más disolventes miscibles en agua, típicamente alcoholes C_{1}-_{6} (metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol). La preparación de BrEA puede comprender opcionalmente uno o más productos secundarios de la síntesis de BrEA. Las preparaciones o lotes típicos de hemihidrato de BrEA comprenden menos de aproximadamente 5% p/p, usualmente menos de aproximadamente 3% o aproximadamente 2% p/p de otros compuestos, tales como los productos secundarios de la síntesis de BrEA. Aspectos de este método incluyen poner en contacto agua con una solución orgánica que comprende BrEA y un disolvente orgánico tal como un alcohol C_{1}-C_{6} (por ejemplo, etanol) o acetona. La adición de agua a tales soluciones lleva a la precipitación del hemihidrato de BrEA. Las soluciones que contienen cristales o precipitado de hemihidrato de BrEA son realizaciones de la invención que se usan para preparar BrEA sólida que después se seca y almacena, típicamente a temperatura ambiente.
La precipitación del hemihidrato de BrEA de soluciones que contienen agua, se lleva a cabo por métodos conocidos, por ejemplo, reduciendo la temperatura de la solución, usando soluciones de BrEA saturadas o casi saturadas, concentración en vacío de las soluciones de BrEA saturadas o casi saturadas (que típicamente se realiza a una temperatura relativamente baja, usualmente aproximadamente 15-25ºC), cebando las soluciones de BrEA saturadas o casi saturadas con cristales de hemihidrato de BrEA (por ejemplo, aproximadamente 10-100 mg por 1-10 litros de solución), calentando una solución de BrEA saturada o casi saturada (aproximadamente 25-35ºC durante unos minutos seguido por dejar que baje la temperatura o enfriando activamente la solución) y opcionalmente cebando la solución con cristales de hemihidrato de BrEA o por adición de un líquido, por ejemplo, agua o etanol adicional, a una solución de BrEA en etanol-agua saturada o casi saturada, lo que hace que la solución se convierta en supersaturada. También se puede precipitar la BrEA en otros disolventes o sistemas de disolventes, incluyendo acetona y acetona-etanol. Tales disolventes son típicamente miscibles en agua. También se puede usar la precipitación de BrEA en dos etapas para recuperar el hemihidrato de BrEA sólido, por ejemplo, precipitación inicial y recuperación del sólido, seguida o bien por enfriamiento y cebado de las aguas madres o bien dejando en reposo las aguas madres, por ejemplo, durante aproximadamente uno, dos días o más a temperatura ambiente, para obtener una segunda cosecha de cristales. También, los cristales de hemihidrato de BrEA pueden ser opcionalmente recristalizados esencialmente como se describe aquí para aumentar adicionalmente la pureza del sólido final. Los métodos para cristalizar compuestos orgánicos han sido descritos, por ejemplo, por A.S. Myerson, Handbook of Industrial Crystallization, 1983, Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA, p 1-101.
Otras realizaciones relacionadas comprenden un producto producido por el procedimiento de poner en contacto una solución que contiene BrEA y un disolvente orgánico con agua. Típicamente las soluciones son como se han descrito antes, por ejemplo, una solución que comprende aproximadamente 3-5% v/v de agua y al menos aproximadamente 40% v/v de uno o más disolventes miscibles en agua, típicamente disolventes polares tales como alcoholes 
\hbox{C _{1} - _{6} }
o cetonas (por ejemplo, metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, típicamente etanol o acetona). Tales procedimientos se llevan a cabo por una cualquiera o más de las técnicas descritas en el párrafo anterior, por ejemplo, por enfriamiento de una solución de BrEA en etanol-agua saturada o casi saturada y opcionalmente cebando la solución enfriada con hemihidrato de BrEA. Una realización relacionada con ésta comprende soluciones o sólidos que contienen cristales húmedos de hemihidrato de BrEA, o tortas húmedas de hemihidrato de BrEA filtradas o centrifugadas, que se pueden obtener después de la cristalización. Ejemplos de estas realizaciones incluyen añadir agua a una solución etanólica de BrEA, por ejemplo la adición lenta de aproximadamente 0,5-1,5 volúmenes o aproximadamente 0,8-1,2 volúmenes de agua a aproximadamente 6 volúmenes de solución etanólica de BrEA para obtener hemihidrato de BrEA. Otros ejemplos de estas realizaciones incluyen añadir agua a una solución de BrEA en un disolvente cetónico, por ejemplo la adición lenta de aproximadamente 0,5-1,5 volúmenes o aproximadamente 0,8-1,2 volúmenes de agua a aproximadamente 10 volúmenes de solución de BrEA en acetona para obtener hemihidrato de BrEA.
Otra realización relacionada es el hemihidrato de BrEA que se muele hasta un tamaño medio de partícula de aproximadamente 0,01-200 \muM, o aproximadamente 0,1-10 \muM o aproximadamente 0,5-5 \muM. El tamaño o diámetro medio de partícula del hemihidrato de BrEA molido puede ser por tanto relativamente pequeño, por ejemplo, aproximadamente 0,03-2,0 \muM, o aproximadamente 0,1-10 \muM o algo mayor, por ejemplo, aproximadamente 0,5-5,0 \muM, o aproximadamente 1-5,0 \muM. El hemihidrato de BrEA molido es adecuado para preparar formulaciones sólidas y formulaciones parenterales para uso humano o veterinario. El material molido facilita la disolución del hemihidrato de BrEA en disolventes o excipientes y facilita la mezcla con sólidos o excipientes sólidos.
Aunque es posible administrar el hemihidrato de BrEA como un compuesto puro a un sujeto, usualmente se presenta como una formulación sólida o se usa para preparar una formulación líquida. Las formulaciones se usarán típicamente para preparar formas farmacéuticas de dosis unitarias, por ejemplo, comprimidos, cápsulas o comprimidos para chupar para administración oral, bucal o sublingual, que comprenden aproximadamente 1000 mg o típicamente aproximadamente 25-400 de hemihidrato de BrEA. Alternativamente, las realizaciones incluyen un producto para administración parenteral (por ejemplo, subcutánea, subdérmica, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal) preparado por el procedimiento de poner en contacto el hemihidrato de BrEA con un excipiente líquido, por ejemplo, uno, dos, tres o más entre PEG 100, PEG 200, PEG 300, PEG 400, propilenglicol, benzoato de bencilo, alcohol bencílico o etanol, y opcionalmente esterilizar la solución y opcionalmente dispensar la solución en viales o ampollas (típicamente de vidrio topacio), que pueden ser de un solo uso o multi-uso y opcionalmente conservar la formulación a temperatura reducida (aproximadamente 0-12ºC, o aproximadamente 2-10ºC). Tales productos para administración parenteral comprenden típicamente BrEA a una concentración de aproximadamente 10-170 mg/ml, usualmente a aproximadamente 20-110 mg/ml, o aproximadamente 30-100 mg/ml, y opcionalmente uno o más entre una sal, un tampón o un bacteriostático o conservante (por ejemplo, NaCl, BHA, BHT o EDTA).
Otras realizaciones incluyen un producto producido por el procedimiento de poner en contacto hemihidrato de BrEA, que está sustancialmente libre de otras formas de BrEA con un excipiente adecuado para uso farmacéutico humano o para uso veterinario. El producto es útil para preparar formulaciones o formas farmacéuticas de dosis unitarias que contienen el hemihidrato.
Las formulaciones preparadas a partir de hemihidrato de BrEA o que contienen hemihidrato de BrEA usualmente serán conservadas en condiciones que limitan la cantidad de agua que alcanza la formulación, por ejemplo, con gel de sílice en un recipiente sellado que contiene una formulación. Las características de permeación de agua de los recipientes han sido descritas, por ejemplo, Containers-Permeation, Chapter, USP 23, 1995, U.S. Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD, p 1787.
Las realizaciones incluyen las composiciones de la invención que se producen de modo transitorio cuando se realiza una etapa u operación de un método. Por ejemplo, cuando un compuesto de la fórmula 1 tal como BrEA, que contiene menos que aproximadamente 3% de agua se pone en contacto con un excipiente, por ejemplo, un PEG, un alcohol, propilenglicol o benzoato de bencilo, la composición antes de la adición de un ingrediente a otro, no es una mezcla homogénea. Cuando los ingredientes se ponen en contacto, aumenta la homogeneidad de la mezcla y la proporción de ingredientes en relación uno con otro, alcanza un valor deseado. Por tanto, las composiciones de la invención que contienen menos de aproximadamente 3% de agua pueden comprender aproximadamente 0,0001-99% de un compuesto de la fórmula 1 tal como BrEA y uno o más excipientes. Estas composiciones transitorias son intermedios que necesariamente surgen cuando se prepara una composición o formulación de la invención y están incluidas en las realizaciones de la invención hasta el punto de que son patentables.
En general, el compuesto de la fórmula 1 que está presente en las composiciones y formulaciones de la invención se disuelve completamente en los excipientes no acuosos. Sin embargo, en algunas realizaciones, por ejemplo, las composiciones transitorias y algunas formulaciones, el compuesto de la fórmula 1 se disuelve parcialmente mientras que la porción restante está presente como un sólido que puede ser una suspensión o un coloide.
Las composiciones y formulaciones de la invención adecuadas para la administración parenteral de los compuestos de la fórmula 1 a seres humanos o a animales comprenden típicamente dos, tres o más excipientes. Ejemplos de realizaciones incluyen (1) dos, tres o cuatro entre propilenglicol, PEG200, PEG300, etanol y benzoato de bencilo y (2) dos, tres o cuatro entre propilenglicol, PEG100, PEG200, PEG300, PEG400 y benzoato de bencilo.
Las composiciones y formulaciones de la invención generalmente comprenden aproximadamente 0,01-10% de BrEA, usualmente aproximadamente 1-5%, y aproximadamente 0,01-3% de agua, típicamente aproximadamente 0,05-3%, usualmente aproximadamente 0,01-1%. Las formulaciones de la invención se presentan usualmente como dosis unitarias o como multidosis adecuadas para administración parenteral una vez o dos veces al día o una vez cada 2-3 días. Las dosis unitarias comprenden aproximadamente 3-1000 mg de BrEA por dosis unitaria, típicamente aproximadamente 5-500 mg, usualmente aproximadamente 10-200 mg, para tratar los retrovirus tales como HIV en humanos, una dosis unitaria usualmente comprende aproximadamente 10-250 mg de BrEA, usualmente aproximadamente 100-200 mg, en un volumen de aproximadamente 1-6 ml, usualmente aproximadamente 2-4 ml.
Las realizaciones de la invención incluyen el producto preparado mediante un procedimiento de combinar, mezclar, o poner en contacto de otro modo BrEA y uno dos, o más excipientes. Tales productos se producen por los métodos rutinarios de poner en contacto los ingredientes. Tales productos también contienen opcionalmente un diluyente, un desintegrante y un aglutinante u otros excipientes descritos aquí o en las referencias citadas aquí.
Se encontró que la BrEA en presencia de cantidades significativas de agua se epimeriza en el átomo de bromo, llevando a una mezcla de los isómeros 16\alpha-BrEA y 16\beta-BrEA. Las composiciones y formulaciones de la invención que comprenden BrEA o hemihidrato de BrEA tendrán usualmente un contenido de agua menor que aproximadamente 3%, típicamente menor que aproximadamente 0,3%, usualmente menor que aproximadamente 0,1%. Se encontró que estas composiciones y formulaciones tienen una buena estabilidad cuando se almacenan a temperatura ambiente (aproximadamente 5-40ºC como se usa aquí) en recipientes cerrados en comparación con las composiciones y formulaciones de control que tienen más agua. Tales líquidos se caracterizan también por una inesperada reducción en la precipitación del compuesto, que parece inducida por tal agua.
Las realizaciones de la invención incluyen composiciones que comprenden menos de aproximadamente 3% de agua, un compuesto de la fórmula 1 y un compuesto que generalmente no se considera adecuado para uso humano pero que es útil para preparar una formulación de la invención para uso veterinario. Las formulaciones veterinarias son composiciones útiles para el propósito de administrar las composiciones de la invención a primates, gatos, perros, caballos, vacas, conejos y otros sujetos y pueden contener excipientes aceptables en la técnica veterinaria y son compatibles con compuestos de la fórmula 1 tales como BrEA. Estas composiciones veterinarias pueden no ser siempre adecuadas para uso humano porque contienen un excipiente que no es adecuado para uso humano, por ejemplo, un alcohol distinto de etanol tal como metanol, propanol o butanol. Típicamente tales excipientes estarán presentes a niveles relativamente bajos, por ejemplo, aproximadamente 1-30%, usualmente aproximadamente 1-5%.
Las realizaciones de la invención incluyen composiciones y formulaciones, por ejemplo formas farmacéuticas de dosis unitarias y soluciones estériles, que comprenden (1) aproximadamente 1-100 mg/ml de un compuesto(s) de la fórmula 1, aproximadamente 57,5% de propilenglicol, aproximadamente 25% de PEG300, aproximadamente 12,5% de etanol y aproximadamente 5% de benzoato de bencilo; (2) aproximadamente 1-60 mg/ml de un compuesto(s) de la fórmula 1, aproximadamente 70% de propilenglicol, aproximadamente 25% de PEG300 y aproximadamente 5% de benzoato de bencilo; (3) aproximadamente 1-60 mg/ml de un compuesto(s) de la fórmula 1, aproximadamente 25% de PEG300, aproximadamente 35% de propilenglicol, aproximadamente 35% de manitol y aproximadamente 5% de benzoato de bencilo; (4) aproximadamente 1-60 mg/ml de un compuesto(s) de la fórmula 1, aproximadamente 57,5% de propilenglicol, una mezcla que comprende aproximadamente 25% de PEG300 y PEG200 (por ejemplo, PEG300: PEG200 en una relación de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1), aproximadamente 12,5% de etanol y aproximadamente 5% de benzoato de bencilo; (5) aproximadamente 1-60 mg/ml de un compuesto(s) de la fórmula 1, aproximadamente 75% de propilenglicol, una mezcla que comprende aproximadamente 25% de PEG300 y PEG200 (por ejemplo, PEG300: PEG200 en una relación de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1) y aproximadamente 5% de benzoato de bencilo; (6) aproximadamente 1-60 mg/ml de un compuesto(s) de la fórmula 1, aproximadamente 25% de PEG300 y PEG200 (por ejemplo, PEG300:PEG200 en una relación de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1), aproximadamente 35% de propilenglicol, aproximadamente 35% de manitol y aproximadamente 5% de benzoato de bencilo; (7) cualquiera de las formulaciones (1) a (6) en las que el compuesto(s) de la fórmula 1 representa aproximadamente 40-55 mg/ml; (8) cualquiera de las formulaciones (1) a (6) en las que el compuesto(s) de la fórmula 1 representa aproximadamente 30-100 mg/ml; (9) cualquiera de las formulaciones (1) a (6) en las que están presentes 1, 2, 3 ó 4 compuestos de la fórmula 1; (10) cualquiera de las formulaciones (1) a (8) en las que están presentes 1 ó 2 compuestos de la fórmula 1; (11) cualquiera de las formulaciones (1) a (8) en las que está presente 1 compuesto de la fórmula 1; (12) cualquiera de las formulaciones (1) a (11) en las que el compuesto de la fórmula 1 comprende independientemente en 1, 1 ó 2 de cualquiera de R^{1}-R^{6}, R^{10}, R^{15}, R^{17} o R^{18}un éster, tioéster, carbonato, carbamato, aminoácido o péptido, independientemente seleccionado, de 1 ó 2 compuestos de la fórmula 1 independientemente seleccionados; (13) cualquiera de las formulaciones (1) a (12) en las que el compuesto de la fórmula 1 comprende o es BrEA o hemihidrato de BrEA; (14) cualquiera de las formulaciones (1) a (13) en las que el compuesto de la fórmula 1 comprende o es un éster, un éster sulfato o un fosfoéster de BrEA.
Otras realizaciones incluyen el producto obtenido mediante el almacenamiento de las composiciones y formulaciones de la invención, por ejemplo las formas farmacéuticas de dosis unitarias, cualquiera de las realizaciones (1)-(14) anteriores, o las composiciones usadas para preparar formulaciones, a aproximadamente 10-40ºC al menos durante aproximadamente 3 días, por ejemplo almacenamiento a temperatura ambiente durante aproximadamente 1-24 meses. Las formulaciones de la invención serán almacenadas típicamente en recipientes sellados herméticamente o por inducción durante estos periodos de tiempo. Las composiciones de la invención serán mantenidas típicamente en recipientes cerrados. La memoria descriptiva y las reivindicaciones describen ejemplos de formulaciones adecuadas y formas farmacéuticas de dosis unitarias para estas realizaciones.
Métodos de administración intermitente
Se pueden administrar intermitentemente los compuestos de la fórmula 1, por ejemplo el hemihidrato de BrEA, a un sujeto sin ninguno de los aspectos no deseados asociados normalmente con la administración discontinua. Tales aspectos indeseados incluyen, el desarrollo de la resistencia de un patógeno (virus tal como HIV o un parásito tal como un parásito Plasmodium) al agente terapéutico o el fallo del paciente o sujeto para adherirse a un régimen de administración. Los protocolos de administración intermitente incluyen la administración de un compuesto de la fórmula 1, por ejemplo, oralmente, tópicamente o parenteralmente como sigue: (1) administración durante aproximadamente 3 a aproximadamente 20 días, (2) sin administración del compuesto de la fórmula 1 durante aproximadamente 4 a aproximadamente 20 días, (3) administración durante aproximadamente 4 a aproximadamente 20 días y (4) repetición opcional del protocolo de administración 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 30 o más veces. A menudo, la administración de las etapas (1) y (3) se mantendrá durante aproximadamente 3-15 días, usualmente aproximadamente 3-5 días. En general, las etapas (1)-(3) del protocolo de administración detallado antes, se repetirán al menos una vez, típicamente al menos 2, 3, 4, 5 ó 6 veces. Para las infecciones que tienden a convertirse en crónicas, por ejemplo HIV, HCV u otras infecciones crónicas de virus o parásitos, el protocolo de administración intermitente se mantiene típicamente a lo largo de un periodo de tiempo relativamente largo, por ejemplo durante al menos desde aproximadamente 6 meses hasta aproximadamente 5 años.
En estos protocolos de administración intermitente, el compuesto o compuestos de la fórmula 1 se pueden administrar por cualquier vía adecuada, por ejemplo, intramuscular (i.m. o I.M.), subcutánea (s.c. o S.C.), intravenosa (i.v. o I.V.), intradérmica, otra vía parenteral, en aerosol usando de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg/día, usualmente aproximadamente 0,2-4 mg/kg/día. Alternativamente, el compuesto o compuestos de la fórmula 1 se pueden administrar oralmente usando de aproximadamente 4 a aproximadamente 40 mg/kg/día, usualmente aproximadamente 6-20 mg/kg/día. En algunas realizaciones, los métodos de administración intermitente excluyen los protocolos de administración que son comúnmente usados para administrar esteroides anticonceptivos, por ejemplo, a mujeres, tal como la administración diaria durante 21 días, seguida por no administración durante 7 días. En general, las formulaciones no acuosas descritas aquí que contienen un compuesto o compuestos de la fórmula 1 se administran i.m. ó s.c., mientras que las formulaciones acuosas que contienen un compuesto o compuestos de la fórmula 1 se administran i.v., i.m., s.c. o por otras vías parenterales. Las dosis diarias se pueden administrar como una dosis única, especialmente para las dosis dadas parenteralmente, o se puede dividir la dosis en dos, tres o cuatro subdosis, usualmente dos, especialmente para las dosis dadas oralmente.
Ejemplos de realizaciones son (a) administrar un compuesto o compuestos de la fórmula 1, por ejemplo hemihidrato de BrEA, una vez un día sí y otro no, durante 20 días, seguido por (b) no administrar durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 días o más y después (c) administrar el compuesto o compuestos de la fórmula 1 al menos una vez más un día, por ejemplo, administrar el compuesto o compuestos de la fórmula 1 una vez un día sí y otro no, durante 20 días y (d) repetir opcionalmente (a), (b) y (c) 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 veces o más. Un subgrupo de estas realizaciones es (a) administrar un compuesto o compuestos de la fórmula 1, por ejemplo hemihidrato de BrEA, una vez un día sí y otro no, durante 20 días, seguido por (b) no administrar durante aproximadamente 10-40 días y después (c) administrar el compuesto o compuestos de la fórmula 1 al menos una vez más un día, por ejemplo, administrando el compuesto o compuestos de la fórmula 1 una vez un día sí y otro no, durante 20 días y (d) repetir opcionalmente (a), (b) y (c) 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 veces o más. En cualquiera de estas realizaciones, se puede administrar el compuesto o compuestos de la fórmula 1 en 2 ó 3 subdosis por día.
Otras realizaciones son (a) administrar un compuesto o compuestos de la fórmula 1, por ejemplo BrEA, una vez al día durante aproximadamente 8-12 días, seguido por (b) no administrar durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 días o más y después (c) administrar el compuesto o compuestos de la fórmula 1 al menos una vez más un día, por ejemplo, administrar el compuesto o compuestos de la fórmula 1 una vez al día durante aproximadamente 8-12 días, y (d) repetir opcionalmente (a), (b) y (c) 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 veces o más. Un subgrupo de estas realizaciones es (a) administrar un compuesto o compuestos de la fórmula 1, por ejemplo hemihidrato de BrEA, una vez al día durante aproximadamente 10 días, seguido por (b) no administrar durante aproximadamente 10-40 días y después (c) administrar el compuesto o compuestos de la fórmula 1 al menos una vez más un día, por ejemplo, administrar el compuesto o compuestos de la fórmula 1 una vez al día durante aproximadamente 10 días, y (d) repetir opcionalmente (a), (b) y (c) 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 veces o más. En cualquiera de estas realizaciones, se puede administrar el compuesto o compuestos de la fórmula 1 en 2 ó 3 subdosis por día.
Un aspecto de la administración intermitente de la invención es hacer seguimiento de la respuesta del paciente a la administración. Por ejemplo, cuando se administra a un sujeto que tiene una infección viral (por ejemplo, HCV, HIV, SIV, SHIV), se puede medir la respuesta del sujeto o del patógeno, por ejemplo, la mejoría de uno o más síntomas o un cambio de las partículas infecciosas o del RNA viral en el suero. Una vez que se observa una respuesta se puede continuar la administración durante uno, dos o tres días adicionales, seguido por la discontinuación de la administración durante al menos un día (al menos 24 horas), usualmente durante al menos 2 ó 3 días, por ejemplo, células NK, LAK, células dendríticas o células que median en las respuestas inmunitarias ADCC. Una vez que la respuesta del sujeto muestra síntomas de remisión (por ejemplo el RNA viral en el suero empieza a aumentar), se puede reanudar la administración durante otro ciclo. Un aspecto de la respuesta del sujeto al compuesto o compuestos de la fórmula 1 es que el sujeto puede mostrar una respuesta medible en un tiempo corto, usualmente aproximadamente 5-10 días, lo que permite un rastreo directo de la respuesta del sujeto, por ejemplo, monitorizando el título viral en los leucocitos periféricos ("PBMC") o midiendo los niveles de ácido nucleico viral en la sangre. Se pueden monitorizar uno o más subgrupos de células inmunitarias, por ejemplo, células NK, LAK, células dendríticas o células que median en las respuestas inmunitarias ADCC durante la administración intermitente y después de ella, para hacer seguimiento de la respuesta del sujeto y para determinar cuándo está indicada una administración adicional del compuesto de la fórmula 1. Estos subgrupos de células se monitorizan como se describe aquí, por ejemplo, por citometría de flujo.
Para cualquiera de los tratamientos o métodos descritos aquí, pueden resultar efectos beneficiosos prolongados o una respuesta inmunitaria sostenida por un sujeto, de una administración única o de administraciones diarias durante algunos días del compuesto de la fórmula 1 del tratamiento intermitente con el compuesto de la fórmula 1. Una administración única significa que se administra al sujeto un compuesto de la fórmula 1 en una, dos, tres o más dosis en un periodo de 24 horas y que no tiene lugar ninguna administración adicional de ningún compuesto de la fórmula 1 al sujeto durante al menos de aproximadamente 45 días a aproximadamente 2 meses, por ejemplo, durante 3, 4, 5, 6 o más meses. Los efectos beneficiosos prolongados o las respuestas inmunitarias pueden persistir también después de que se haya completado un ciclo corto de tratamiento (por ejemplo, administración diaria durante 2, 3, 4, 5 ó 6 días) y el sujeto no está recibiendo más ningún compuesto de la fórmula 1, o en algunos casos, cualquier otro tratamiento terapéutico para tratar la causa principal de la afección patológica del sujeto. Tales efectos beneficiosos pueden persistir durante más de aproximadamente 5-30 días.
En algunos casos, se han observado efectos beneficiosos del tratamiento durante más de 3 meses (4 ó 5 o más meses) después de un ciclo corto de tratamiento de un sujeto con un compuesto de la fórmula 1. Por tanto, la administración de un compuesto de la fórmula 1 proporciona un método para proteger de modo efectivo a sujeto frente a la progresión de una infección o frente a las consecuencias adversas de reacciones inmunitarias no deseadas (por ejemplo, inflamación) o frente a la inmunodepresión (debida a infección, quimioterapia, etc.), sin ninguna administración del compuesto durante al menos 3 meses después de un protocolo inicial de administración, que podría ser un protocolo de administración intermitente o continua, a lo largo, por ejemplo de 1 día hasta aproximadamente 4 meses (1-15 días, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, etc.).
Formulaciones y composiciones para preparar formulaciones
Aunque es posible que el ingrediente o ingredientes activos se administren solos, es usual que se presenten como formulaciones farmacéuticas. Las formulaciones de la invención, tanto para veterinaria como para uso humano, comprenden al menos un ingrediente activo, esto es un compuesto de la fórmula 1, junto con uno o más excipientes aceptables para el mismo y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.
Otro aspecto de la invención se refiere a composiciones que comprenden uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Uno o más compuestos de la fórmula 1 (también denominados como ``ingrediente(s) 
\hbox{activo(s)'')}
se administran por cualquier vía apropiada para la enfermedad a ser tratada. Las vías adecuadas para las formulaciones líquidas no acuosas y otras formulaciones del compuesto de la fórmula 1 incluyen las vías oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural). En general, las formulaciones líquidas no acuosas se administran por una vía parenteral. En otras realizaciones, tales como los métodos de administración intermitente de la invención, el compuesto o compuestos de la fórmula 1 pueden estar presentes como una formulación líquida no acuosa, una formulación sólida seca que es una formulación oral, tópica, parenteral, o como una formulación líquida acuosa, que se usa parenteralmente, oralmente o tópicamente. Se puede apreciar que la vía preferida puede variar, por ejemplo, con el estado patológico del sujeto o el peso del sujeto o la respuesta del sujeto a la terapia con un compuesto de la fórmula 1 u otra terapia apropiada a las circunstancias.
Las formulaciones incluyen aquellas que son adecuadas para las vías de administración precedentes. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en formas farmacéuticas de dosis unitarias y se pueden preparar por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. De forma general, se encuentran métodos, excipientes y formulaciones, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publixhing Co., Easton, PA 1985, 17th Edition, Nema et al., PDA J. Pharm. Sci. Tech. 1997 51: 166-171. Los métodos para preparar las formulaciones de la invención incluyen la etapa de asociar un ingrediente(s) activo(s) con el excipiente o excipientes. En general, las formulaciones se preparan asociando de forma uniforme e íntima el ingrediente activo con los excipientes líquidos o con los excipientes sólidos finamente divididos o con ambos, y después, si es apropiado, modelar el producto.
Las formulaciones de la invención adecuadas para administración oral, se preparan como unidades discretas tales como cápsulas, sellos o comprimidos, conteniendo cada una, una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como un polvo o gránulos; como una solución o suspensión en un líquido acuoso o en un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida aceite-en-agua o una emulsión líquida agua-en-aceite. El ingrediente o ingredientes activos se pueden presentar también como un bolus, electuario o pasta.
Un comprimido se prepara por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos de compresión se pueden preparar comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente o ingredientes activos en una forma que fluye libremente tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclada con un aglutinante, lubrificante, diluyente inerte, conservante, agente tensioactivo o agente dispersante. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando en una máquina adecuada una mezcla del ingrediente o ingredientes activos pulverizados humedecida con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden ser opcionalmente recubiertos o ranurados y opcionalmente se formulan de tal forma que se proporcione una liberación lenta o controlada del ingrediente o ingredientes activos a partir de los mismos.
Para las infecciones oculares o de otros tejidos externos, por ejemplo boca y piel, las formulaciones se aplican típicamente como una pomada o crema tópica que contiene el ingrediente o ingredientes activos en una cantidad de, por ejemplo, 0,075 a 20% p/p (incluyendo el ingrediente o ingredientes activos en un intervalo entre 0,1% y 20% en incrementos de 0,1% p/p tal como 0,6% p/p, 0,7% p/p, etc.), a menudo 0,2 a 15% p/p y lo más a menudo 0,5 a 10% p/p. Cuando se formulan en una pomada, los ingredientes activos se pueden emplear con una base de pomadas parafínica o con una base de pomadas miscible en agua. Alternativamente, los ingredientes activos se pueden formular con una base de crema aceite-en-agua.
Si se desea, la fase acuosa de la base de la crema puede incluir, por ejemplo, al menos 30% p/p de un alcohol polihidroxilado, esto es un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo tales como propilenglicol, butano-1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol (incluyendo PEG400) y sus mezclas. Las formulaciones tópicas pueden incluir de forma deseable un compuesto que mejora la absorción o penetración del ingrediente o ingredientes activos a través de la piel u otras áreas afectadas. Ejemplos de tales mejoradores de la penetración dérmica incluyen dimetilsulfóxido y análogos relacionados.
La fase oleosa de las emulsiones de esta invención puede estar constituida por excipientes conocidos de forma conocida. Aunque la fase puede comprender meramente un emulsionante (conocido también como un emulgente), deseablemente comprende una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o un aceite o con ambos, una grasa y un aceite. Se puede incluir un emulsionante hidrófilo junto con un emulsionante lipófilo, que actúa como un estabilizante. Algunas realizaciones incluyen tanto un aceite como una grasa. Conjuntamente, el emulsionante o emulsionantes con o sin estabilizante o estabilizantes componen la llamada cera emulsionante, y la cera junto con el aceite y la grasa componen la llamada base de pomada emulsionante que forma la fase oleosa dispersada de las formulaciones en crema.
Los emulgentes y estabilizantes de la emulsión adecuados para uso en la formulación de la invención incluyen Tween60™, Span80™, alcohol cetoestearílico, alcohol bencílico, alcohol miristílico, monoestearato de glicerilo y laurilsulfato de sodio.
La elección de aceites o grasas adecuados para la formulación se basa en conseguir las deseadas propiedades cosméticas. Las cremas son generalmente productos no grasos, que no manchan, y lavables con consistencia adecuada para evitar escapes de los tubos y otros recipientes. Se pueden usar ésteres alquílicos monobásicos o dibásicos de cadena lineal o ramificada tales como di-isoadipato, estearato de isoacetilo, diéster de ácidos grasos de cacahuete y propilenglicol, miristato de isopropilo, oleato de decilo, palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de 2-etilhexilo o una mezcla de ésteres de cadena ramificada conocidos como Crodamol CAP. Estos se pueden usar solos o en combinación dependiendo de las propiedades requeridas. Alternativamente, se usan lípidos de alto punto de fusión tales como parafina blanca blanda y/o parafina líquida y otros aceites minerales.
Las formulaciones adecuadas para administración tópica a los ojos incluyen también las gotas oftálmicas en las que el ingrediente o ingredientes activos se disuelven o suspenden en un excipiente o excipientes adecuados, especialmente un disolvente acuoso para el ingrediente o ingredientes activos que comprende una o más cargas a valores de pH próximos a la neutralidad, por ejemplo aproximadamente pH 6-8. El ingrediente o ingredientes activos están típicamente presentes en tales formulaciones en una concentración de aproximadamente 0,5-20% p/p, típicamente aproximadamente 1-10% p/p, a menudo aproximadamente 2-5% p/p.
Las formulaciones adecuadas para administración tópica a la boca incluyen los comprimidos para chupar que comprenden el ingrediente activo en una base aromatizada, usualmente sacarosa y goma arábiga o goma tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente o ingredientes activos en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga; y colutorios que comprenden el ingrediente activo en un excipiente o excipientes líquidos adecuados.
Las formulaciones para administración rectal se pueden presentar como supositorios con una base adecuada que comprende por ejemplo manteca de cacao o un salicilato.
Las formulaciones adecuadas para administración intrapulmonar o nasal tienen un tamaño de partícula por ejemplo en el intervalo de 0,01 a 500 micras (incluyendo los tamaños medios de partículas en un intervalo entre 0,01 y 500 micras en incrementos de 0,1 micras u otros incrementos, por ejemplo, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 50, 75, 100, etc. micras), que se administran por inhalación rápida a través del tracto nasal o por inhalación a través de la boca de forma que alcancen los sacos alveolares. Las formulaciones micronizadas adecuadas incluyen soluciones o suspensiones acuosas u oleosas del ingrediente o ingredientes activos. Las formulaciones adecuadas para administración en aerosol, polvo seco o comprimidos se pueden preparar según métodos convencionales y se pueden dar con otros agentes terapéuticos tales como los compuestos de los mismos usados en el tratamiento o profilaxis de las infecciones virales u otras infecciones como se describen aquí. Tal formulación se puede administrar, por ejemplo, oralmente, parenteralmente (i.v., i.m., s.c.), tópicamente o por vía bucal.
Las formulaciones adecuadas para administración vaginal se pueden presentar como formulaciones de supositorios vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverizaciones que contienen además del ingrediente o ingredientes activos excipientes tales como los conocidos en la técnica como apropiados.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas que pueden contener anti-oxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del propuesto receptor; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes.
Las formulaciones se presentan en envases monodosis o multi-dosis, por ejemplo ampollas y viales y se pueden mantener en una condición de liofilizado que requiere solamente la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo agua para inyección, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones inyectables extemporáneas se preparan a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito previamente. Las formulaciones en dosis unitarias son aquellas que contienen una dosis diaria o una subdosis unitaria diaria, como se detallan aquí, o una fracción apropiada de la misma, del ingrediente o ingredientes activos.
Se debe entender que en adición a los ingredientes particularmente mencionados antes, las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agente o excipientes convencionales en la técnica con respecto al tipo de formulación en cuestión, por ejemplo, las adecuadas para administración oral pueden incluir agentes aromatizantes.
La invención proporciona además composiciones veterinarias que comprenden al menos un ingrediente activo como se ha definido antes junto con un excipiente o excipientes para el mismo. Los excipientes veterinarios son materiales útiles para el propósito de administrar la composición y pueden ser materiales sólidos, líquidos o gaseosos que por otro lado son inertes o aceptables en la técnica veterinaria y son compatibles con el ingrediente o ingredientes activos. Estas composiciones veterinarias se pueden administrar oralmente, parenteralmente o por cualquier otra vía deseada.
Las formulaciones de la invención incluyen formulaciones farmacéuticas de liberación controlada que contienen un ingrediente o ingredientes activos ("formulaciones de liberación controlada") en las cuales la liberación del ingrediente o ingredientes activos se controla y regula para permitir la administración con menos frecuencia o para mejorar el perfil farmacocinético o de toxicidad de un ingrediente activo dado.
Una dosis eficaz del ingrediente o ingredientes activos depende al menos de la naturaleza de la enfermedad a ser tratada, de la toxicidad, de si el compuesto o compuestos se van a usar profilácticamente (dosis bajas) o frente a una infección o enfermedad activa, del método de administración, y de la formulación farmacéutica, y deberá ser determinada por el médico usando los estudios convencionales de escalado de dosis. Se puede esperar que sea desde aproximadamente 0,05 hasta aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal al día. Por ejemplo, para administración tópica la dosis diaria propuesta para un adulto humano de aproximadamente 70 kg de peso corporal variará desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 500 mg, generalmente entre aproximadamente 5 mg y aproximadamente 40 mg, y puede hacerse en forma de dosis única o dosis o sitios de administración múltiples.
Las realizaciones incluyen formulaciones que comprenden un complejo de liposomas o lípidos que comprende un compuesto o compuestos de la fórmula 1, por ejemplo, carbamato, carbonato, aminoácido o péptido del mismo. Tales formulaciones se preparan según métodos conocidos, por ejemplo las patentes de Estados Unidos 4427649, 5043165, 5714163, 5744158, 5783211, 5795589, 5795987, 5798348, 5811118, 5820848, 5834016 y 5882678. Los liposomas opcionalmente contienen un agente o agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, anfoterina B, cis-platino, adriamicina, un inhibidor de la proteasa, un nucleósido o un análogo nucleótido, tal como uno de los mencionados aquí. Las formulaciones que contienen liposomas se pueden administrar a un sujeto por cualquier vía estándar, por ejemplo, oral, en aerosol, o parenteral (por ejemplo, s.c., i.v. o i.m.).
Aplicaciones terapéuticas
Los compuestos de la fórmula 1 o las sustancias biológicamente activas producidas a partir de estos compuestos por hidrólisis o metabolismo in vivo, tienen una serie de aplicaciones clínicas y no clínicas. Los compuestos son generalmente útiles para mejorar las respuestas inmunitarias Th1 o para reducir las respuestas inmunitarias Th2. Como se usan aquí, las respuestas inmunitarias Th1 o Th2 significan aquellas respuestas observadas en los mamíferos generalmente y no las observadas en el sistema murino, del cual se originó la terminología Th1 y Th2. Así, en los seres humanos, las células Th1 preferentemente presentan los receptores de quimioquina CXCR3 y CCR5, mientras que las células Th2 preferentemente expresan la molécula CCR4 y una pequeña cantidad de la molécula CCR3.
Algunos aspectos de la invención incluyen composiciones que comprenden una cantidad de al menos un compuesto de la fórmula 1 eficaz para mejorar la proporción relativa de un subgrupo de células inmunitarias deseadas, por ejemplo, células T CD4^{+}, células NK o células dendríticas, o para modular una o más funciones de los subgrupos de células inmunitarias y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La modulación inmunitaria típica se centra en modular la expresión del gen o genes que mejoran las respuestas inmunitarias Th1 o reducen las respuestas inmunitarias Th2. Funciona de tal modo que el compuesto de la fórmula 1 afectado incluye la expresión de las moléculas CD o la alteración de la proporción de los subgrupos de células, por ejemplo, células T CD4^{+} o CD8^{+}, o sus números relativos en la sangre o tejidos de un sujeto. Las moléculas CD participan en la función de diferentes subgrupos de células inmunitarias y pueden ser útiles como marcadores de la función inmunitaria in vivo. En algunos aspectos, el compuesto de la fórmula 1 activa las células inmunitarias lo que generalmente altera (aumenta o reduce) la expresión, o cambia los números, de las células que expresan las combinaciones de las moléculas CD4, CD6, CD8, CD25, CD27, CD28, CD30, CD38, CD39, CD43, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69, CD71, CD90 o HLA-DR. A menudo, se aumenta el número de células que expresan estas moléculas, por ejemplo CD25, CD16 o CD69. Típicamente tales aumentos se observan como un aumento de la proporción de leucocitos circulantes que expresan una o más de estas moléculas. En algunos casos el número de tales moléculas por célula se altera de forma detectable.
La expresión de una o más moléculas de adhesión CD2, CD5, CD8, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD31, CD44, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD54, CD58, CD103 O CD104 es también afectada de forma detectable después de la administración de los compuestos de la fórmula 1 a un sujeto. A menudo, se aumenta el número de células que expresan estas moléculas, por ejemplo CD5 o CD56. Las moléculas de adhesión funcionan en diferentes aspectos de las respuestas inmunitarias, tales como la unión a las moléculas MHC clase I, transduciendo señales entre las células o la unión a las moléculas en la matriz extracelular asociada con células endoteliales u otros tipos de células. La administración de los compuestos de la fórmula 1 a un sujeto también afecta al número de ciertos subgrupos de células inmunitarias, por ejemplo, las células NK (por ejemplo, CD8^{-}, CD56^{+} o CD8^{+}, CD56^{+}) o células agresoras activadas con linfoquina (LAK). Típicamente se observan aumentos de las células NK o LAK circulantes, lo que se refleja en el aumento del número de células que expresan una o más de CD16, CD38, CD56, CD57 o CD94. También, se observa el aumento de los números de precursores de células dendríticas circulantes, como se muestra por aumentos en las células que expresan una o más de CD11c, CD80, CD83, CD106 o CD123. Aunque se puede observar un aumento de la proporción de leucocitos circulantes que expresan una o más de estas moléculas, en algunos casos el número de tales moléculas por célula se altera de forma detectable. Tanto el número de células como la densidad de la molécula CD por célula puede ser también modulado de forma detectable. La modulación de los subgrupos de células inmunitarias típicamente tiene lugar en la administración intermitente de un compuesto de la fórmula 1.
La expresión de uno o más receptores buscadores tales como CD62L puede ser también afectada detectablemente después de la administración de los compuestos de la fórmula 1 a un sujeto. A menudo, aumenta el número de células que expresan estas moléculas, por ejemplo CD62L,
Otras moléculas CD que son moduladas por la presencia de los compuestos de la fórmula 1 en un sujeto incluyen moléculas de receptores de citoquina tales como CD115, CDW116, CD117, CD118, CDW119, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD125, CD126, CDW127, CDW128 o CDW130. A menudo, el número de moléculas de receptores por célula será modulado. Por ejemplo, los receptores de citoquina que median en las respuestas inmunitarias Th1 (por ejemplo, IL-2, \gammalFN) aumentarán típicamente en las células que median en las respuestas inmunitarias Th1. La modulación de estas moléculas puede ser por interacciones directas con un receptor o receptores de la célula que expresan el receptor de citoquina o indirectamente mediante la modulación de la síntesis de citoquina en las células afectadas o en otras células, típicamente las células inmunitarias, que pueden interactuar con las células cuya síntesis del receptor está siendo modulada.
El tratamiento de un sujeto con un compuesto de la fórmula 1 puede dar como resultado un cambio de al menos 25-50% por encima o por debajo (por ejemplo, al menos 30% o al menos 40% por encima o por debajo) del control o nivel basal de algunos subgrupos de células inmunitarias. Por ejemplo, aumentos de más que aproximadamente 30% en el número total de células T CD8^{+} activadas, por ejemplo, células T CD8^{+}, CD69^{+}, CD25^{+}, células T CD8^{+}, CD69^{+}, CD25^{+} o células T CD8^{+}, CD69^{+}, CD25^{+}, usualmente tiene lugar a los 7 días después de dar una dosis única de un compuesto de la fórmula 1 a un sujeto. Tales aumentos pueden ser mayores que 50%, 60% o 100% en el número total de células T CD8^{+} activadas, o subgrupos de células T CD8^{+} activadas en sujetos individuales. Típicamente tales aumentos tienen promedios de aproximadamente 30-40% en el número total de las células CD25^{+} activadas, o en los subgrupos de células T CD8^{+} activadas hacen un, con sujetos individuales que experimentan aumentos por encima del 100% en los números de células T CD8^{+} activadas por unidad de volumen de sangre en comparación con el nivel basal.
La administración de los compuestos de la fórmula 1 puede afectar a otros subgrupos de células inmunitarias. Por ejemplo, la concentración de CD4^{+}, CD69^{+}, CD25^{+} (células ayudadoras Th1) circulantes y de células LAK CD8^{+}, CD16^{+}, CD38^{+} o células LAK CD8^{-}, CD16^{+}, CD38^{+} aumenta típicamente durante el ciclo de administración de un compuesto de la fórmula 1 a un sujeto o después del mismo. También, las células CD8^{-}, CD16^{+}, CD38^{+} y CD8^{+}, CD16^{+}, CD38^{+} (células efectoras ADCC) y dispersión lateral baja Lin^{-}, DR^{+}, CD123^{+} (precursores dendríticos) o dispersión lateral baja Lin^{-}, DR^{+}, CD11c^{+} (células o precursores dendríticos) pueden mostrar aumentos que van de modestos a significativos.
En los sujetos que están inmunodeprimidos, por ejemplo a causa de una infección (por ejemplo, infección viral (HIV, HCV), infección bacteriana o infección parasitaria) o a causa de la quimioterapia (por ejemplo, una terapia antiviral, una quimioterapia anticáncer o una terapia de radiación), la administración de los compuestos de la fórmula 1 al sujeto da como resultado un cambio favorable en el equilibrio de las respuestas Th1 o Th2 que el sujeto puede aumentar ante la inmunodepresión. Cuando las respuestas Th1 son subóptimas o insuficientes, el tratamiento con un compuesto de la fórmula 1 da como resultado un aumento de las respuestas Th1 o una reducción de las respuestas Th2. Inversamente, cuando las respuestas Th2 son subóptimas o insuficientes, el tratamiento con un compuesto de la fórmula 1 da como resultado un aumento de las respuestas Th2 o una reducción de las respuestas Th1. Los compuestos de la fórmula 1 pueden ser usados por tanto para cambiar la naturaleza de la respuesta inmunitaria de un sujeto para dar como resultado una respuesta inmunitaria más equilibrada de inmunodepresión. Alternativamente, los compuestos pueden deprimir selectivamente las respuestas inmunitarias inapropiadas o no deseadas. El aumento de las respuestas Th1 parece que es debido al menos parcialmente a uno o más de (i) una reducción de las limitaciones biológicas, por ejemplo altos niveles de IL-4 o IL-10, en las funciones Th1 mediante las células efectoras Th1 cebadas preexistentes, (ii) mejor diferenciación de las células Th0 a las células Th1 o mejores respuestas mediadas por las células Th1, (iii) mejora de las funciones accesorias de las células, por ejemplo, presentación de antígenos por las células precursoras dendríticas o por los macrófagos, (iv) mejora de la proliferación y diferenciación de las células precursoras o progenitoras Th1, (v) mejora de la expresión de IL-12 en las células dendríticas o sus precursores, que dan como resultado la mejor diferenciación de las células Th1 de los precursores Th0, (vi) mejora de la expresión o actividad de los factores asociados con las funciones Th1, por ejemplo, IL-2, gamma-interferón (\gammaIFN) o linfotoxina.
Un aspecto de los métodos de la invención es una alteración en la expresión de IL-4 o IL-10 que tiene lugar después de la administración de un compuesto de la fórmula 1 a un sujeto. Una observación consistente es que los niveles de IL-4 o IL-10 extracelulares disminuyen rápidamente hasta niveles que son indetectables por el método ELISA. Los niveles de IL-10 intracelular se reducen a niveles que están próximos o por debajo de los límites de detección por citometría de flujo. La administración de un compuesto de la fórmula 1 a un sujeto propociona así un medio para inhibir cualquiera de estas interleuquinas o ambas. Tal inhibición puede estar asociada con el aumento de las respuestas inmunitarias Th1 en relación con las respuestas Th2 o Th0, por ejemplo, en los sujetos en los que las respuestas Th1 o bien están deprimidas (por ejemplo, debido a una infección viral, bacteriana o parasitaria (HIV, HCV, etc.) o a quimioterapia) o son subóptimas de otra manera. En muchos sujetos, los niveles de cualquiera de IL-4 o IL-10, usualmente IL-10, antes de la administración de un compuesto de la fórmula 1 son bajos o indetectables. En estos sujetos, la administración del compuesto de la fórmula 1 produce una rápida caída de la interleuquina que es detectable, usualmente la IL-4.
En algunas realizaciones, el compuesto de la fórmula 1 se administra a un sujeto que tiene una infección patógena, tal como una infección viral, bacteriana o parasitaria. Los compuestos de la fórmula 1 se pueden considerar para uso en un amplio campo de infecciones (véase, por ejemplo, J. B. Peter, editor, Use and Interpretation of Laboratory Tests in Infectious Disease, 5th edition, Specialty Laboratories, Santa Monica, CA 90404, 1998, pages 1-271), ya que los compuestos generalmente aumentan las respuestas inmunitarias Th1 y/o reducen las respuestas inmunitarias Th2. La dificultad para tratar algunas infecciones, por ejemplo, encefalitis toxoplásmica progresiva, malaria, tuberculosis, leishmaniasis y esquistosomiasis, aparecen a menudo como asociadas con respuestas inmunitarias Th2 no deseadas. Típicamente, las respuestas inmunitarias Th2 no deseadas se asocian con el aumento de la expresión de una o más citoquinas o interleuquinas tales como IL-4 y IL-10 o están causadas por el mismo. La administración de un compuesto de la fórmula 1, u otros compuestos descritos aquí, en general reducirá la expresión de una o más citoquinas o interleuquinas asociadas con Th2. Al mismo tiempo, los compuestos aumentan la expresión de una o más citoquinas o interleuquinas asociadas con las respuestas inmunitarias Th1. Debido a su capacidad para modular las respuestas inmunitarias Th1 y Th2, los compuestos son útiles para una variedad de afecciones clínicas, por ejemplo, infección, inmunodepresión o cáncer, cuando se desea un aumento de la respuesta inmunitaria Th1. Por ejemplo, en la tuberculosis diseminada o difusa, sería deseable una respuesta Th2 reducida para permitir a un paciente que retarde el progreso de la enfermedad o que elimine las células infectadas más eficientemente.
Un aspecto de la invención proporciona realizaciones en las que se administran a un sujeto un compuesto de la fórmula 1 y un inhibidor de la glutatión-reductasa tal como butatión-sulfoximina [CH_{3}-(CH_{2})_{3}-S(=O)(=NH)-(CH_{2})_{2}-
CHNH_{2}-C(O)-OH], para tratar infecciones, por ejemplo, una infección parasitaria tal como malaria, Toxoplasma, Cryptosporidium, o para tratar un cáncer o tumor maligno. La reducción del suministro de glutatión reducido puede aumentar la fagocitosis por los macrófagos, posiblemente debido al aumento del daño oxidativo en las células infectadas o en la replicación de las células malignas. Alternativamente, el uso de un inhibidor de la glutatión-reductasa puede dar como resultado un mejor reconocimiento de las células infectadas o malignas por el sistema inmunitario. Se usan un compuesto de la fórmula 1 y butatión-sulfoximina, por ejemplo, para aumentar la eliminación desde las células infectadas de la malaria en fase de anillo o para aumentar el reconocimiento por el sistema inmunitario de las células malignas en comparación con el uso del compuesto de la fórmula 1 solo. Las infecciones y tumores malignos a los que se aplican estas realizaciones son como se describen aquí.
Otro aspecto de la invención proporciona el uso de un compuesto de la fórmula 1 y un flavonoide, por ejemplo, un flavonoide naragina, para aumentar la biodisponibilidad del compuesto de la fórmula 1. En estas realizaciones, se administra al sujeto que está recibiendo un compuesto de la fórmula 1, una cantidad efectiva de un flavonoide. Típicamente, se administran al sujeto aproximadamente 1-10 mg de flavonoide por kg de peso corporal, de un flavonoide tal como bavaquinina A, didimina (isosakuranetina-7-rutinósido o neoponcirina), flavanomareina (isookanina-7-glucósido), flavanona-azina, flavanona-diacetilhidrazona, flavanona-hidrazona, silibina, silicristina, isosilibina o silandrina. El compuesto flavonoide se administra típicamente con el compuesto de la fórmula 1 en unas horas, por ejemplo, aproximadamente 1, 2 ó 3 horas, antes de que el compuesto de la fórmula 1 sea administrado al sujeto.
Las formulaciones en liposomas se pueden usar para mejorar la dispensación del compuesto o compuestos de la fórmula 1 a ciertos tipos de células tales como las células tumorales (véase por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5714163) o a células del sistema retículoendotelial ("RES"). El RES incluye macrófagos, células fagocíticas mononucleares, células de revestimiento de los sinusoides del bazo, nódulos linfáticos, y médula espinal, y las células reticulares fibroblásticas de los tejidos hematopoyéticos. En general, las células del RES son fagocíticas y son objetivos de la dispensación dirigida de un compuesto o compuestos de la fórmula 1 in vitro o in vivo usando liposomas, u otras composiciones o formulaciones. Así, se puede dispensar un compuesto de la fórmula 1 a un neoplasma que se deriva del tejido retículoendotelial (reticuloendotelioma). Los liposomas pueden comprender también opcionalmente un péptido procedente de un agente infeccioso tal como un parásito de la malaria. Los péptidos pueden facilitar la generación de una respuesta MHC clase II y de las células B.
Otros usos del compuesto de la fórmula 1 incluyen administrar el compuesto a un sujeto que padece una afección patológica. El tratamiento puede tratar o mejorar el origen de la afección y/o los síntomas asociados con la afección patológica tal como una infección con un patógeno(s) (virus, bacterias, hongos), un tumor maligno, respuestas inmunitarias no deseadas, esto es, una respuesta inmunitaria que causa patología y/o síntomas, por ejemplo, enfermedades autoinmunes o alergia o enfermedades tales como las enfermedades de hipoproliferación, por ejemplo, crecimiento de tejidos normales o deteriorados, o cicatrización de heridas o cicatrización de quemaduras, o en condiciones de inmunodepresión, por ejemplo, condiciones caracterizadas por la ausencia de una respuesta deseada y/o un grado inadecuado de una respuesta deseada.
Muchos cánceres o tumores malignos están asociados con una respuesta inmunitaria Th2 no deseada o una respuesta Th1 deficiente. Una respuesta inmunitaria Th1 deficiente puede desempeñar un papel en la capacidad de las células malignas para escapar a la vigilancia inmunitaria. Estas enfermedades incluyen el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el carcinoma broncogénico, cáncer o carcinoma de células renales, linfoma, glioma, melanoma, adenocarcinoma pancreático o gástrico, neoplasia intraepitelial del cuello uterino asociada con papilomavirus humano, carcinoma del cuello de útero, hepatoma y linfoma cutáneo de células T (micosis fungoides, síndrome de Sezary).
En algunas de estas realizaciones, la hiperproliferación o enfermedad maligna del sujeto puede estar asociada con uno o más patógenos. Por ejemplo, el carcinoma hepatocelular asociado con HCV o HBV, sarcoma de Kaposi asociado con HIV-1 o HIV-2, leucemia de células T asociada con HTLV I, linfoma de Burkitt asociado con el virus Epstein-Barr o papilomas o carcinoma asociados con papilomavirus (HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 45) o adenocarcinoma gástrico o linfoma MALT gástrico asociados con la infección de Helicobacter pylori. En otras realizaciones, el compuesto o compuestos de la fórmula 1 se administran a un sujeto que tiene una enfermedad de hiperproliferación que no parece estar asociada con un patógeno, por ejemplo, melanoma, o un cáncer o precáncer que aparece en la garganta, esófago, estómago, intestino, colon, ovarios, pulmón, mama o sistema nervioso central.
En un ejemplo de realización, los pacientes humanos que padecen lesiones de melanoma o precursor de melanoma se tratan con una formulación en crema tópica que contiene 2-20% de BrEA (p/p). La crema se aplica a los nevos primarios (nevos displásticos o nevos adquiridos comunes), melanomas cutáneos primarios, melanomas cutáneos secundarios y la piel que rodea a los nevos o melanomas. Las áreas a ser tratadas se lavan con jabón o se limpian con un alcohol (por ejemplo, etanol o isopropanol) antes de administrar la crema, cuando esto es práctico. Se aplican aproximadamente 0,1-0,4 g de crema, dependiendo del tamaño del área tratada, una vez o dos veces al día por región o lesión tratada durante aproximadamente 10-20 días. La crema se deja sin tocar en el sitio de la administración durante aproximadamente 15-30 minutos antes de que el paciente reanude su actividad normal. La progresión de los nevos y melanomas se retrasa en la mayoría de los pacientes y en algunas lesiones se observa una regresión significativa. Después del tratamiento inicial, se administra la formulación un día sí y otro no, durante al menos 1 a 4 meses usando la misma administración descrita para el ciclo inicial de tratamiento. Para estos pacientes, la terapia estándar para tratar la lesión precursora o el melanoma, por ejemplo, dimetil-triazen-imidazol-carboxamida o nitrosoureas (por ejemplo, BCNU, CCNU), se comienza opcionalmente o se continúa según las recomendaciones del médico del paciente y con la aprobación informada del paciente. En los casos en los que se eliminan quirúrgicamente un tumor o una lesión precursora y el sitio ha cicatrizado suficientemente, el paciente opcionalmente continúa usando la formulación tópica en el sitio y el área adyacente circundante un día sí y otro no, durante al menos 1 a 4 meses. En algunas de estas realizaciones, se administra un compuesto o compuestos de la fórmula 1 diariamente de forma continua como una composición o formulación oral, por ejemplo, para un compuesto o compuestos de la fórmula 1 que son un nuevo compuesto per se. La BrEA se administra también opcionalmente sistémicamente usando por ejemplo, una formulación descrita en los ejemplos que siguen para dispensar 1-5 mg/kg/día un día sí y otro no, durante desde aproximadamente 1 semana hasta aproximadamente 4 meses, por ejemplo, en el caso del melanoma maligno.
Las respuestas inmunitarias Th1 insuficientes se asocian a menudo con las infecciones virales. Las infecciones virales pueden venir de los DNA-virus o RNA-virus, por ejemplo, herpesvirus, hepadnavirus, adenovirus, retrovirus, togavirus, alfavirus, arbovirus, flavivirus, rinovirus, papilomavirus y/o pestivirus. Se han descrito ejemplos de virus. Véase por ejemplo B. N. Fields, et al., editors, Fundamental Virology 3rd edition, 1996, Lippencott-Raven Publishers, véase capítulo 2 en las páginas 23-57, incluyendo la tabla 4 en las páginas 26-27, tabla 5 en las páginas 28-29, capítulo 17 en las páginas 523-539, capítulos 26-27 en las páginas 763-916, capítulo 32 en las páginas 1043-1108 y capítulo 35 en las páginas 1199-1233. Como se usa aquí, los retrovirus incluyen virus de humanos y animales, por ejemplo, HIV-1, HIV-2, LAV, virus I de la leucemia de células T humanas ("HTLV I"), HTLV II, HTLV III, SIV, SHIV, FIV, FeLV. Virus adicionales, incluyendo sus genogrupos, especies, aislados, cepas y otros, que pueden establecer una infección vírica incluyen el virus de la hepatitis C humana ("HCV"), virus de la hepatitis B humana ("HBV"), virus de la hepatitis A humana ("HAV"), virus de la hepatitis del pato, virus de la hepatitis de la marmota, virus del papiloma humano ("HPV", por ejemplo, HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 45) o animal, poliovirus, virus 1 del herpex simple ("HSV-1"), virus 2 del herpex simple ("HSV-2"), herpesvirus 6 humano ("HHV-6"), herpesvirus 8 humano ("HHV-8"), virus del dengue (tipos 1-4), virus de la encefalitis equina Western, virus de la encefalitis japonesa, virus de la fiebre amarilla y virus de la diarrea viral bovina.
Otras enfermedades en las que está implicado un desequilibrio inmunitario o una respuesta inmunitaria Th2 excesiva incluyen las enfermedades autoinmunes tales como SLE (lupus eritematoso sistémico), osteoporosis, esclerosis múltiple, miastenia gravis, enfermedad de Graves, dermatitis ulcerativa asociada con ácaros, artritis reumatoide y osteoartritis. Las respuestas inmunitarias Th2 excesivas están asociadas también con un síntoma o patología no deseados, por ejemplo, fatiga, dolor, fiebre o un aumento de la incidencia de la infección, que se asocia con el envejecimiento, alergia y enfermedades inflamatorias tales como aspergilosis broncopulmonar alérgica en pacientes con fibrosis quística, asma atópica, enfermedad respiratoria alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica, fibrosis subepitelial en hiper-reactividad de las vías respiratorias, sinusitis crónica, rinitis alérgica perenne, enfermedad de Crohn (enteritis regional), colitis ulcerativa, enfermedad inflamatoria del intestino, alveolitis fibrosa (fibrosis pulmonar).
Otras indicaciones clínicas que están asociadas o tienen algún síntoma que es consistente con una respuesta inmunitaria Th2 excesiva, por ejemplo, fatiga, dolor, fiebre o un aumento de la incidencia de la infección, son esquizofrenia, mielitis aguda, sarcoidosis, quemaduras, traumatismos (por ejemplo, fractura de huesos, hemorragia, cirugía) y respuestas inmunitarias a los xenotrasplantes. Este componente común inmunitario subyacente en al menos parte de la patología de todas estas enfermedades permite que un único agente sea usado de forma eficaz para tratar la enfermedad o para tratar uno o más síntomas que se asocian con respuestas inmunitarias Th1 insuficientes o con respuestas Th2 excesivas. En todas las enfermedades en las que está presente una respuesta Th1 insuficiente o una respuesta Th2 no deseada, la mejoría de uno o más síntomas asociados con la enfermedad se consigue administrando una cantidad eficaz de un compuesto de la fórmula 1 según los métodos descritos aquí. Así pues, se puede administrar intermitentemente un compuesto de la fórmula 1 usando una formulación y una vía de administración como se describen aquí.
En algunas aplicaciones, el compuesto de la fórmula 1 puede interferir directa y/o indirectamente con la replicación, desarrollo o transmisión célula a célula de un patógeno tal como un virus o un parásito (malaria). La mejoría en el estado clínico de un sujeto puede surgir de un efecto directo sobre un agente infeccioso o sobre una célula maligna. La interferencia con la replicación celular puede surgir de la inhibición de una o más enzimas que un parásito o una célula infectada usan para la replicación normal o metabolismo, por ejemplo, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, que afecta a la generación células de NADPH (véase por ejemplo, Raineri et al., Biochemistry 1970 9: 2233-2243). Este efecto puede contribuir a los efectos citostáticos que pueden tener algunos compuestos de la fórmula 1. La modulación de la expresión o actividad de las enzimas celulares puede interferir también con la replicación o desarrollo de un patógeno, por ejemplo, HIV o parásitos de la malaria o con la replicación o desarrollo de las células neoplásicas, por ejemplo, la inhibición de angiogénesis. Generalmente también la mejoría clínica resultará de un aumento de la respuesta inmunitaria Th1.
En otras aplicaciones, las realizaciones son un método que comprende poner en contacto un compuesto de la fórmula 1 con una o más células, en el que el compuesto de la fórmula 1 forma un complejo con un receptor de hormonas esteroideas o da como resultado la modulación de una actividad biológica. El receptor de hormonas esteroideas puede ser un receptor nuclear de hormonas huérfano que presenta una moderada o alta afinidad de unión con el compuesto o compuestos de la fórmula 1. En algunas realizaciones, el receptor de esteroides es un receptor de esteroides conocido. Los efectos biológicos de la interacción de un compuesto de la fórmula 1 y un receptor pueden llevar a una interferencia con la replicación o desarrollo de un patógeno o de las propias células. Por ejemplo, se puede alterar la expresión de los transcritos de HIV en las células infectadas por HIV. El complejo de receptor-compuesto de la fórmula 1 puede interferir directamente con la transcripción de genes HIV dependiente de LTR., llevando a reducir la replicación
viral.
Los compuestos de la fórmula 1 se pueden usar para identificar a los receptores que modulan respuestas biológicas, por ejemplo, los receptores que participan en efectuar un aumento de la síntesis de citoquina Th1. Las realizaciones de la invención incluyen un método, "Método 1" que permite la determinación de uno o más efectos de un compuesto de ensayo sobre un receptor de esteroides en diferentes sistemas biológicos. Generalmente, el compuesto de ensayo es un compuesto de la fórmula 1. Tales sistemas incluyen células que contienen una estructura artificial de DNA que expresa de modo constitutivo o inducible uno o más receptores de esteroides de interés, por ejemplo, SXR, CAR\beta, RXR, PXR, PPAR\alpha o sus mezclas o sus dímeros, por ejemplo SXR/RXR. En otros sistemas biológicos, el receptor de esteroides puede estar bajo el control transcripcional de un promotor regulable. Alternativamente, la expresión de otro gen tal como un gen inducible por esteroides, por ejemplo, un citocromo P-450 inducible por esteroides. Para este método, una fuente de los receptores de esteroides se combina generalmente con un medio de hacer seguimiento a los mismos, por ejemplo, midiendo la transcripción de un gen regulado por el receptor. Las células que comprenden el receptor de esteroides y medios opcionales de monitorización se denominan aquí algunas veces como "sistema biológico". Las fuentes de los receptores de esteroides incluyen líneas celulares y poblaciones celulares que normalmente expresan el receptor de esteroides de interés y los extractos obtenidos de tales células. Otra fuente de un sistema biológico útil para los fines de este método son los tejidos de los animales experimentales que expresan el receptor.
En un aspecto, el método 1 permite determinar uno o más efectos de un compuesto de la fórmula 1 sobre un receptor de esteroides usando un método que comprende (a) proporcionar un sistema biológico, por ejemplo, un extracto celular, células o tejidos, que comprende células que tienen una pluralidad de receptores de esteroides que comprenden monómeros, homodímeros o heterodímeros que comprenden un receptor de esteroides, por ejemplo, SXR, CAR-\beta, RXR, PPAR\alpha, PXR o dímeros que comprenden uno o más de estos; (b) activar o inhibir la pluralidad de monómeros, homodímeros o heterodímeros que comprenden el receptor de esteroides, mediante poner en contacto las células con un agonista o antagonista de un receptor de esteroides (por ejemplo, SXR, CAR-\beta, RXR, PPAR\alpha o PXR); (c) separar sustancialmente de las células todo el agonista o antagonista del receptor de esteroides; (d) determinar una actividad de la pluralidad de monómeros, homodímeros o heterodímeros que comprenden el receptor de esteroides, mientras están en estado activado en ausencia de agonista o antagonista; (e) exponer las células al compuesto de ensayo; (f) determinar al menos un efecto del compuesto de ensayo sobre la actividad de la pluralidad de monómeros, homodímeros o heterodímeros que comprenden uno o más de los receptores de esteroides, mientras que están sustancialmente libres de agonista o antagonista; y (g) opcionalmente clasificar el compuesto de ensayo como agonista o antagonista del receptor de esteroides, o un compuesto neutral que tiene poco o ningún efecto detectable.
Los efectos que el método 1 puede medir incluyen determinar o medir un efecto sobre un gen cuya expresión es afectada por el receptor de esteroides. El gen podría ser un gen asociado con una afección patológica tal como una afección por un agente infeccioso, por un trastorno inmunitario o una hiperproliferación.
Por tanto, otro aspecto del método 1, "método 1A" es determinar si un compuesto químico que no se conoce previamente como modulador de la biosíntesis proteínica puede modular transcripcionalmente la expresión de un gen que codifica una proteína asociada con el mantenimiento o tratamiento de uno o más síntomas de una afección patológica. Este método comprende: (a) poner en contacto una muestra que comprende células eucarióticas con un compuesto de la fórmula 1, donde las células eucarióticas comprenden una pluralidad de proteínas del receptor de esteroides y una estructura artificial de DNA que contiene en orden 5' a 3' (i) una secuencia reguladora transcripcional modulable del gen que codifica la proteína de interés, (ii) un promotor del gen que codifica la proteína de interés, y (iii) un gen indicador que expresa un polipéptido capaz de producir una señal detectable, acoplada al promotor y bajo el control del mismo, en condiciones tales que el compuesto químico si es capaz de actuar como un modulador transcripcional del gen que codifica la proteína de interés, hace que una señal medible o detectable sea producida por el polipéptido expresado por el gen indicador; (b) determinar cuantitativamente la cantidad de la señal así producida; y (c) comparar opcionalmente la cantidad así determinada con la cantidad de señal producida detectada en ausencia de cualquier compuesto químico a ser ensayado o tras poner en contacto la muestra con otros compuestos químicos de forma que se identifique el compuesto químico como el causante de un cambio en la señal detectable producida por el polipéptido, y determinar si el compuesto químico modula de forma específica y transcripcionalmente la expresión del gen asociado con el mantenimiento o tratamiento de uno o más síntomas de la afección patológica.
Para llevar a cabo el método 1A, se pone típicamente en contacto una muestra que contiene un número predefinido de células eucarióticas idénticas o esencialmente idénticas con una concentración predeterminada de un compuesto de la fórmula 1. Las células eucarióticas comprenden una estructura artificial de DNA que se prepara usando métodos y protocolos convencionales de biología molecular. Generalmente la estructura artificial de DNA contiene en orden 5' a 3' (i) una secuencia reguladora transcripcional que participa en modular la expresión del gen que está asociado con el mantenimiento o tratamiento de la afección patológica, (ii) el promotor del gen, y (iii) un gen indicador que expresa un polipéptido capaz de producir una señal detectable, acoplada al promotor y bajo el control del mismo. La estructura artificial se mantiene en condiciones tales que el compuesto de la fórmula 1, si es capaz de actuar como un modulador transcripcional del gen que codifica la proteína de interés, hace que una señal medible o detectable sea producida por el polipéptido expresado por el gen indicador. Una vez que ha pasado suficiente tiempo para la generación de una respuesta o señal detectable, se puede determinar la cantidad de señal producida. Típicamente la respuesta o señal se miden cuantitativamente, pero puede ser útil una medida cualitativa con propósitos de un cribado rápido.
Para el método 1A, opcionalmente se puede comparar también la señal detectable con la cantidad de señal producida que (i) se detecta en ausencia de cualquier compuesto de la fórmula 1 o (ii) cuando se pone en contacto la muestra con otros compuestos químicos, que identifica el compuesto de la fórmula 1 como un compuesto químico que produce un cambio en la señal detectable que produce el polipéptido. Entonces se determina típicamente si el compuesto de la fórmula 1 modula transcripcionalmente de forma específica la expresión del gen asociado con el mantenimiento o tratamiento de uno o más síntomas de la afección patológica.
Otros aspectos del método 1 y 1A, incluyen un método de cribado que comprende poner en contacto de forma separada cada una de una pluralidad de muestras idénticas, esencialmente idénticas o diferentes, conteniendo cada muestra un número predefinido de tales células con una concentración predeterminada de cada diferente compuesto de la fórmula 1 a ser ensayado, por ejemplo, en los que la pluralidad de muestras comprenden más de aproximadamente 1 x 10^{3} o más de aproximadamente 1 x 10^{4} muestras o aproximadamente 0,5-5 x 10^{5} muestras. En otros aspectos, se determina la cantidad de RNA por la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa. En cualquiera de los métodos 1 o 1A, se puede utilizar un compuesto de la fórmula 1 tal como uno cualquiera de los descritos o citados aquí.
Otros aspectos de la invención incluyen otro método, "método 2", que se centra en identificar un gen cuya expresión se modula por un candidato copartícipe de unión de los agentes terapéuticos de la enfermedad infecciosa. Típicamente, el copartícipe de unión es un receptor de esteroides, por ejemplo, un monómero, homodímero o heterodímeros que comprende SXR, CAR-\beta, PXR, PPAR\alpha o RXR o uno de sus homólogos o isoformas. El receptor de esteroides está típicamente presente como un complejo que comprende por ejemplo, el compuesto de la fórmula 1 y la DNARS del gen regulado, cuyo receptor de esteroides, o complejo que comprende el receptor de esteroides, reconoce y se une específicamente al mismo. Tales complejos pueden comprender también un factor de transcripción que se une al receptor de esteroides o a las secuencias del ácido nucleico adyacentes o próximas a la DNARS. Ejemplos de los factores de transcripción que pueden estar presentes incluyen uno o más de ARA54, ARA55, ARA70, SRC-1, NF-\kappaB, NFAT, AP1, Ets, p300, CBP, p300/CBP, p300/CPB-factor asociado, SWI/SNF y los homólogos humanos de SWI/SNF, CBP, SF-1, RIP140, GRIP1 y Vpr. En general, se proporciona un primero y un segundo grupo de células in vitro o in vivo y se pone en contacto el primer grupo de células con el agente terapéutico de la enfermedad infecciosa, pero no se pone en contacto el segundo grupo de células in vitro o in vivo con el agente terapéutico de la enfermedad infecciosa. La recuperación del RNA de las células, o la generación de cDNA derivado del RNA, se consigue por protocolos convencionales. El análisis del RNA o cDNA derivado del RNA del primero y segundo grupo de células identifica diferencias entre ellas, lo que se puede usar para identificar un gen cuya regulación es modulada por el candidato copartícipe de unión para el agente terapéutico de la enfermedad infecciosa o cualquier DNARS asociada con dicho gen.
Un aspecto del método 2 es determinar la capacidad de un compuesto de la fórmula 1 para modular, o participar en la modulación de la transcripción de un gen asociada con el mantenimiento o tratamiento de uno o más síntomas de un estado patológico. Se espera que en general, los compuestos de la fórmula 1 producirán un aumento de la transcripción de dichos genes. El estado patológico es típicamente aquel que está asociado con un agente infeccioso, por ejemplo, virus, parásito o bacteria, pero puede incluir también una afección inmunitaria, por ejemplo una enfermedad autoinmune o una inmunodeficiencia. El estado patológico puede ser también una respuesta inmunitaria insuficiente a una infección o una respuesta insuficiente a una enfermedad hiperproliferativa o a tumores malignos. Otros estados patológicos a los que se puede aplicar el método son las enfermedades inflamatorias.
En algunos aspectos, los compuestos de la fórmula 1 usados en el método 2 serán marcados. Tales compuestos se preparan por métodos convencionales usando marcas estándar, tales como radiomarcas, marcas fluorescentes u otras marcas como se describen aquí y en las referencias citadas.
Una realización del método 2 incluye analizar el RNA o cDNA derivado del mismo, mediante la sustracción de la hibridación. En esta realización, el RNA o cDNA obtenido del primero y segundo grupos de células se hibridan y se separan los duplex resultantes. Esto permite la recuperación de ácidos nucleicos que codifican genes cuya transcripción se modula por el copartícipe de unión candidato, que es usualmente un receptor de esteroides. Se pueden usar métodos convencionales para amplificar y obtener información de la secuencia de ácido nucleico y proteína a partir de los ácidos nucleicos recogidos por este método. Las secuencias de ácido nucleico que son inducidas o reprimidas transcripcionalmente por el compuesto de la fórmula 1 son copartícipes de unión candidatos.
Uno o más genes inducidos transcripcionalmente serán enriquecidos en las células del grupo 1 tratadas con el compuesto de la fórmula 1, mientras que todos los genes reprimidos estarán reducidos o ausentes. En estas realizaciones, el RNA recuperado después de la separación de los duplex, se amplifica típicamente mediante protocolos RT-PCR o PCR estándar. Estos protocolos, usan típicamente conjuntos de pares de cebadores aleatorios, seguido por análisis de los ácidos nucleicos amplificados por electroforesis en gel. Los ácidos nucleicos que son inducidos por el compuesto de la fórmula 1 aparecerán como una banda o bandas, usualmente DNA duplex, que no está presente en el control ni en el segundo conjunto de células. Los ácidos nucleicos que son transcripcionalmente reprimidos por el copartícipe de unión del compuesto de la fórmula 1 estarán reducidos o ausentes en el primer grupo de células. Una vez que se identifican tales genes candidatos, se pueden clonar y expresar y la capacidad de la DNARS asociada con el gen para formar un complejo que comprende un copartícipe de unión candidato y un compuesto de la fórmula 1 opcionalmente marcado se analiza por métodos convencionales, por ejemplo, diálisis de equilibrio, cromatografía de afinidad usando por ejemplo, la DNARS inmovilizada en una columna, o la co-precipitación de complejos que comprenden una DNARS opcionalmente marcada y el copartícipe de unión candidato usando anticuerpos anti-copartícipe de unión. El análisis de la secuencia de ácido nucleico se usa normalmente para identificar regiones adyacentes a las regiones codificadoras del gen regulado para identificar cualquier DNARS asociada con los genes. La identidad de una DNARS se puede establecer por la unión a la DNARS de complejos que comprenden un copartícipe de unión candidato, por ejemplo, un receptor de esteroides, y opcionalmente comprenden también un compuesto de la fórmula 1. La localización e identidad de la DNARS se puede realizar por la huella de DNA u otros métodos para detectar las interacciones de unión. La DNARS, el receptor o el compuesto de la fórmula 1 se pueden marcar en estas variaciones del método 2.
En general, el segundo grupo de células será idéntico o esencialmente idéntico al primer grupo de células. En las realizaciones (para ambos métodos, 1 y 2) en las que las células son "esencialmente idénticas", el primero o el segundo grupo de células pueden distinguirse uno de otro por la presencia o ausencia de una estructura artificial de DNA que expresa (i) un receptor de esteroides y/o (ii) una proteína fácilmente detectada, por ejemplo, una \beta-galactosidasa, una peroxidasa, una fosfatasa, o una cloramfenicol-acetiltransferasa, cuya regulación transcripcional se modula usualmente por un receptor de esteroides. En estas realizaciones, la diferencia entre el primero y el segundo grupo de células se usa para facilitar el análisis de los efectos biológicos del compuesto de la fórmula 1 y el copartícipe de unión del receptor de esteroides. Los grupos de células se consideran "idénticos" si no presentan diferencias morfológicas o genéticas conocidas u obvias.
Usualmente, el segundo grupo de células servirá como control, y por tanto no será expuesto a ningún compuesto de la fórmula 1 antes de obtener el RNA o cDNA. Sin embargo, para algunas realizaciones, se puede exponer el segundo grupo de células a un agonista o antagonista conocido del copartícipe de unión del receptor de esteroides. Esto permite que se compare la potencia del compuesto de la fórmula 1 con la potencia del agonista o antagonista.
En otras realizaciones, se puede modificar el método 2 proporcionando un tercer grupo de células, que se usan opcionalmente como un control sin tratar cuando el segundo grupo de células se trata con un agonista o antagonista del receptor de esteroides. En estas realizaciones, se compara típicamente el efecto del compuesto de la fórmula 1 y el agonista o el antagonista de la expresión de un gen o una estructura artificial de DNA. La estructura artificial de DNA podría comprender un promotor u otras secuencias reguladoras que son sujeto de la modulación transcripcional, usualmente el aumento de la transcripción, mediante el compuesto de la fórmula 1 junto con su copartícipe de unión.
Ejemplos de mamífero y otros receptores de esteroides, incluyendo los receptores de esteroides huérfanos, sus homólogos, isoformas y co-factores (por ejemplo, co-represores, factores de transcripción, regiones o secuencias del promotor génico) que estos complejos pueden comprender son el factor-1 esteroidogénico (SF-1), promotor hacia arriba de ovoalbúmina de huevo-factor de transcripción (COUP-TFI) y sus homólogos de mamífero, el mediador silencioso para el receptor de la hormona tiroidea y retinoide (SMRT) y sus homólogos de los mamíferos, NF-E3, COUP-TFII y sus homólogos de los mamíferos, el receptor TR2 testicular huérfano, la hormona tiroidea \alpha1 (TR \alpha1), receptor \alpha del retinoide X, heterodímero TR \alpha1/RXR \alpha, elemento de respuesta de la hormona tiroidea 4 con repetición directa (DR4-TRE), receptor de estrógenos (ER), receptor de estrógenos relacionado \alpha (ERR\alpha), receptor de estrógenos relacionado \beta (ERR\beta), receptor xenobiótico de esteroides (SXR), factor nuclear 4 del hepatocito (HNF-4), factor nuclear 3 del hepatocito (HNF-3), receptores X hepáticos (LXRs), LXR\alpha, receptor \alphade estrógenos (ER\alpha), receptor \beta de androstano constitutivo (CAR-\beta), heterodímero RXR/CAR-\beta, copartícipe del heterodímero corto (SHP), heterodímero SHP/ER\alpha, receptor \beta de estrógenos, heterodímero SHP/ER\beta, receptor TR4 testicular huérfano, heterodímero TR2/TR4, receptor pregnano X (PXR) y las isoformas, la región promotora del gen 3A4 de la citocromo P-450-monooxigenasa e isoformas, el complejo de HNF-4 y la región promotora del gen 3A4 de la citocromo P-450-monooxigenasa e isoformas, la repetición terminal larga de HIV-1 (LTR), LTR de HIV-2, complejo de TR2/ LTR de HIV-1, complejo de TR4/ LTR de HIV-1, complejo de TR4/ LTR de HIV-1, complejo de TR \alpha1/TR4/ LTR de HIV-1, isoformas TR2 (TR2-5, TR7, TR9, TR11), DAX-1, DAX-1/región promotora del gen de la proteína reguladora aguda esteroidogénica, RevErb, Rev-erbA \alpha, Rev-erbA \beta, el coactivador del receptor de esteroides amplificado en cáncer de mama (AUB 1) p300/proteína interactuante con la proteína de unión CREB (p/CIP), receptor de la hormona tiroidea (TR, T3R), elementos de respuesta de la hormona tiroidea (T3REs), receptor androstano constitutivo (CAR), Xenopus xSRC-3 y homólogos de mamíferos (humanos), TAK1, complejo de TAK-1, proliferador de peroxima y receptor \alpha activado por el proliferador (PPAR\alpha), complejo PPAR\alpha/RXR\alpha, complejo TAK-1/RIP140, receptor del ácido retinoico (RAR), RAR\beta, complejo TR4/RXRE, SF-1/región promotora del gen de esteroides-hidroxilasa, SF-1/región promotora del gen de la oxitocina, SF-1/región promotora del gen del receptor de ACTH, Ear-2 de rata y homólogos de mamíferos, receptor TR3 huérfano humano (TR3), RLD-1, OR-1, receptor de andrógenos, receptor de glucocorticoides, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, receptor de mineralcorticoides, OR1, complejo OR1/RXR\alpha, TIF-1, complejo CBP/P300, complejo TRIP1/SUG-1, RIP-140, complejo SFC1\alpha/P160 y complejo TIF-2/GRIP-1, complejo RAR/N-CoR/RIP13, complejo RAR/SMRT/TRAC-2, y la DNARS 5' AGGTCANAGGTCA 3' o 5' TGCACGTCA 3'. Uno de estos complejos puede ser incluido en los métodos de la invención cuando por ejemplo, se realizan estos en ensayos libres de células. La formación de estos complejos en células se facilita insertando en las células una estructura artificial de DNA que expresa una o más de estas proteínas, por ejemplo, células de mamíferos o de levaduras que contienen una estructura artificial de DNA estable o una estructura artificial usada para ensayos de transfección transitorios. Los métodos para realizar ensayos o para inducir respuestas biológicas in vitro o in vivo usando los compuestos de la fórmula 1 como agonistas, antagonistas o como estándares de referencia son esencialmente como están descritos, véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5080139, 5696133, 5932431, 5932555, 5935968, 5945279, 5945404, 5945410, 5945412, 5945448, 5952319, 5952371, 5955632, 5958710, 5958892, 5962443; publicaciones internacionales números WO 96/19458, WO 99/41257, WO 99/45930. Los complejos o sistemas de ensayo, que comprenden un compuesto de la fórmula 1 y que se emplean en la práctica de estos métodos se incluyen como aspectos de la invención.
El compuesto de la fórmula 1 interactúa típicamente con uno o más ligandos biológicos para efectuar una respuesta biológica. Para facilitar la identificación de los copartícipes de unión candidatos para el compuesto de la fórmula 1, se puede usar un compuesto de la fórmula 1 radiomarcado que se liga a un soporte, usualmente un soporte sólido, como un medio para recuperar los copartícipes de unión candidatos. El compuesto de la fórmula 1 se puede ligar al soporte a través de, por ejemplo, la posición 3-, 7-, 16-, o 17- del núcleo esteroide. Los agentes ligantes son conocidos para tales usos e incluyen agentes homobifuncionales y heterobifuncionales, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. El ligante que se usa comprenderá típicamente alrededor de 2-20 átomos ligados. Los átomos ligados usualmente comprenderán principalmente carbono, con uno, dos o tres átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno que reemplazan a uno o más átomos de carbono. Se puede usar una genoteca de expresión de cDNA que se ha preparado a partir de células o tejidos adecuados como una fuente de candidatos de copartícipes de unión. Las células o tejidos se pueden obtener de un mamífero o de un vertebrado hospedante, por ejemplo, un ser humano, ratón, pájaro, primate o de otras fuentes, por ejemplo, insectos (por ejemplo, Drosophila), otros invertebrados (por ejemplo, levaduras, bacterias, Mycoplasma sp., Plasmodium sp., Tetrahymena sp., C. elegans) u otros grupos de organismos o especies listados aquí o en las referencias citadas. Los tejidos adecuados incluyen piel, tejidos o células hepáticas, incluyendo hepatocitos y células de Kupfer, fibrocitos, monocitos, células dendríticas, células y tejidos renales, células o tejidos del cerebro u otras células o tejidos del sistema nervioso central, incluyendo neuronas, ostiocitos y células gliales, tejidos del sistema nervioso periférico, pulmón, intestino, placenta, mama, ovarios, testículos, músculos incluyendo corazón o tejidos o células miocitos, leucocitos, incluyendo células T, células B, células y tejidos de la médula ósea, tejidos linfáticos o fluidos y condrocitos.
Típicamente un copartícipe de unión candidato que se aísla de una fuente no humana tendrá un homólogo humano que tiene similares propiedades de unión para el compuesto de la fórmula 1. Los copartícipes de unión candidatos no humanos pueden ser por tanto usados para facilitar la recuperación de los homólogos humanos, por ejemplo, preparando antisuero para precipitar el homólogo humano de una solución que comprende el homólogo humano o comparando la secuencia del copartícipe de unión candidato no humano con secuencias conocidas de genes humanos. Una vez que se obtiene una fuente del copartícipe de unión candidato, se puede poner en contacto con el compuesto de la fórmula 1 marcado, usualmente radiomarcado con, por ejemplo, ^{14}C o ^{3}H, y complejos que comprenden el compuesto de la fórmula 1 marcado, y el copartícipe de unión candidato se recupera usando, por ejemplo, cromatografía de afinidad o métodos de precipitación de anticuerpos. La recuperación del complejo proporciona una fuente del copartícipe de unión candidato al menos parcialmente purificado, esto es, el copartícipe de unión candidato se enriquece, por ejemplo, al menos se enriquece 10 veces, o al menos se enriquece 100 veces, o al menos se enriquece 500 veces, en comparación con su abundancia en el material original fuente del copartícipe de unión candidato.
Otros aspectos incluyen un método para determinar una actividad biológica de un compuesto de la fórmula 1 que comprende: (a) poner en contacto el compuesto o compuestos de la fórmula 1 con una célula o población de células; (b) medir uno o más de (i) un complejo entre un copartícipe de unión y el compuesto de la fórmula 1, (ii) proliferación de la célula o población de células, (iii) diferenciación de la célula o población de células, (iv) una actividad de una proteína quinasa C, (v) un nivel de fosforilación de un sustrato de proteína quinasa C, (vi) transcripción de uno o más genes objetivos, (vii) inhibición de la respuesta celular a los esteroides, por ejemplo, glucocorticoides, (viii) inhibición de la transcripción inducida por esteroides, por ejemplo, glucocorticoides, esteroides sexuales o (ix) inhibición de la transcripción dirigida por LTR de HIV; y (c) opcionalmente comparar el resultado obtenido en la etapa (b) con un control apropiado. Los aspectos de esta realización incluyen (i) el método en el que el copartícipe de unión es un receptor de esteroides, un factor de transcripción o una DNARS, (ii) el método en el que la actividad biológica determinada es una actividad de modulación del compuesto de la fórmula 1 para la replicación o los efectos citopáticos asociados con un retrovirus, un virus de la hepatitis o un parásito protozoario, (iii) el método en el que la actividad biológica determinada es una actividad de modulación del compuesto de la fórmula 1 para la replicación, efectos citopáticos asociados con el retrovirus, el virus de la hepatitis o el parásito protozoario, o la actividad biológica determinada es el metabolismo (ensayo por absorción de ^{3}H-timidina u otro ensayo como se menciona o describe aquí) de una célula o población de células que comprende células NK, fagocitos, monocitos, macrófagos, basófilos, eosinófilos, células dendríticas, sinoviocitos, células microgliales, fibrocitos, células transformadas (neoplásicas), células infectadas con virus, células infectadas con bacterias o células infectadas con parásitos, y (iv) el método en el que el gen objetivo es un gen vírico, un gen bacteriano, un gen de parásitos o un gen asociado con el cáncer, por ejemplo, en el que el gen del virus es un gen de la DNA o RNA-polimerasa, un gen de la transcriptasa inversa, un gen de la envoltura, un gen de la proteasa o un gen asociado con la replicación del ácido nucleico viral o un gen estructural viral.
Una realización es un método que comprende poner en contacto un complejo que comprende un receptor de esteroides y un compuesto de la fórmula 1 con una proteína transactivadora, en el que se forma un complejo que comprende la proteína del receptor de esteroides, el compuesto de la fórmula 1 y la proteína transactivadora, donde la proteína transactivadora está en (1) un extracto celular o tisular (por ejemplo, núcleos, lisado que contiene núcleos o lisado sin núcleos a partir de una célula(s) o tejido(s)), (2) un extracto celular o tisular parcialmente purificado o purificado, (3) una célula(s) en cultivo de tejidos o (4) una célula(s) en un sujeto, en el que cualquiera de los (1)-(4) comprende opcionalmente un gen objetivo (gen nativo o introducido por técnicas estándar de manipulación de genes) cuyo nivel de expresión se ensaya opcionalmente una vez que se ha formado el complejo. En algunas de estas realizaciones, la proteína transactivadora está parcialmente purificada o purificada y está en el extracto celular o tisular o en el extracto celular o tisular parcialmente purificado o purificado. La proteína transactivadora puede ser TIF-1, CBP/P300, TRP1/SUG-1, RIP-140, SRC1\alpha/P160, o TIF-2/GRP-1. En cualquiera de estas realizaciones el complejo que comprende la proteína del receptor de esteroides, el compuesto de la fórmula 1 y la proteína transactivadora puede aumentar o reducir la transcripción del gen objetivo en comparación con un control adecuado (por ejemplo, un control bajo las mismas condiciones pero careciendo de cualquier compuesto añadido que corresponde al compuesto de la fórmula 1, o cuando se usa otro compuesto (por ejemplo, un esteroide del que se conoce que se une al receptor de esteroides) como un punto de referencia o estándar de referencia frente al cual se mide la expresión alterada del gen objetivo). En estos métodos, el gen objetivo puede ser un gen de un patógeno (por ejemplo, virus, bacteria, parásito, hongo, levadura) o un gen asociado con un estado patológico (autoinmunidad, inflamación, hiperproliferación).
Los compuestos de la fórmula 1 son adecuados para uso en ciertos métodos descritos que utilizan esteroides para modular las actividades biológicas en células o tejidos. Por ejemplo, un compuesto o compuestos de la fórmula 1 se pueden usar para interactuar selectivamente con los receptores de esteroides específicos o los receptores de esteroides huérfanos, o sus subtipos, que se asocian con un estado patológico en un sujeto, esencialmente como se describe en la patente de Estados Unidos 5668175. En estas aplicaciones, el compuesto de la fórmula 1 puede actuar como un ligando para que el receptor module la expresión anormal de un producto génico que se correlaciona con el estado patológico (una enfermedad que responde a una hormona esteroidea). Tales genes se regulan normalmente por hormonas esteroides. En otras aplicaciones, se pueden usar los compuestos de la fórmula 1 para seleccionar los ligandos que se unen a un receptor de esteroides o un receptor de esteroides huérfano y uno o más factores de transcripción (o cofactores) tales como AP-1 y/o con una secuencia o secuencias de DNA, esencialmente como se describen en la patente de Estados Unidos 5643720. Similarmente, los compuestos de la fórmula 1 se pueden usar esencialmente como se describe en las patentes de Estados Unidos 5597693, 5639598, 5780220, 5863733 y 5869337. En algunas de estas realizaciones, el compuesto o compuestos de la fórmula 1 se marcan para facilitar su uso. En la técnica se conocen marcas adecuadas e incluyen radiomarcas (por ejemplo, ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, ^{131}I, ^{99}Tc y otros isótopos de halógenos), restos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, resorufina, rojo Texas, rodamina, BODIPY, cianinas de arilsulfonato), restos quimioluminiscentes (por ejemplo, ésteres de acridinio), quelantes de metales, biotina, avadina, marcas de péptidos (por ejemplo, hexámero de histidina, un péptido reconocido por anticuerpos monoclonales o policlonales), moléculas reticulantes covalentes. Se preparan los compuestos marcados según métodos conocidos.
Los métodos adecuados para medir los efectos biológicos de diferentes compuestos, por ejemplo, activación sobre células del sistema inmunitario (por ejemplo, células NK, fagocitos, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, células dendríticas, sinoviocitos, células microgliales, fibrocitos) han sido descritos, por ejemplo, Jakob et al., J. Immunol. 1998 161: 3042-3049, Pierson et al., Blood 1996 87: 180-189, Cash et al., Clin. Exp. Immunol. 1994 98: 313-318, Monick et al., J. Immunol. 1999 162: 3005-3012, Rosen et al., Infect. Immun. 1999 67: 1180-1186, Grunfeld et al., J. Lipid. Res. 1999 40: 245-252, Singh et al., Immunol. Cell Biol. 1998 76: 513-519, Chesney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997 94: 6307-6312, Verhasselt et al., J. Immunol. 1999 162: 2569-2574, Avice et al., J. Immunol. 1999 162: 2748-2753, Cella et al., J. Exp. Med. 1999 189: 821-829, Rutalt et al., Free Radical Biol. Med. 1999 26: 232-238, Akbari et al., J. Exp. Med. 1999 189: 169-178, Hryhorenko et al., Immunopharmacology 1998 40: 231-240, Femvik et al., Inflamm. Res. 1999 48: 28-35, Cooper et al., J. Infect. Dis. 1999 179: 738-742, Betsuyaku et al., J. Clin. Invest. 1999 103: 825-832, Brown et al., Toxicol. Sci. 1998 46: 308-316, Sibelius et al, Infect. Immunol. 1999 67: 1125-1130. El uso de los compuestos de la fórmula 1 en tales métodos son aspectos de la invención y permiten, por ejemplo, la medida de los efectos biológicos de los compuestos de la fórmula 1 en genes cuya expresión se regula por el compuesto de la fórmula 1 y el receptor de esteroides.
Las realizaciones incluyen cualquiera de los métodos descritos antes, por ejemplo, método 1, en el que las células o el sistema biológico comprenden células NK, fagocitos, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, células dendríticas, sinoviocitos, células microgliales, células gliales, fibrocitos o hepatocitos que opcionalmente comprenden una estructura artificial de DNA que expresa uno o dos receptores de esteroides clonados. El método opcionalmente analiza el efecto de un compuesto de la fórmula 1 sobre las células en comparación a los controles. Los controles incluyen el uso de un agonista o antagonista conocido para el receptor de esteroides o la comparación de las células expuestas a un compuesto de la fórmula 1 con las células controles (usualmente el mismo tipo de células que las células tratadas) que no son expuestas al compuesto de la fórmula 1. Una respuesta, por ejemplo. la activación del receptor de esteroides se puede medir por ensayos conocidos en comparación a los controles.
El compuesto de la fórmula 1 en algunos casos modulará (aumentará o reducirá) la transcripción de uno o más genes en las células. En otros casos, el compuesto de la fórmula 1 aumentará el movimiento de los lisosomas en una o más de las células NK, fagocitos, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, células dendríticas, sinoviocitos, células microgliales, o fibrocitos del sujeto. Tales efectos estarán típicamente mediados directa o indirectamente por los receptores de esteroides que actúan para modular la transcripción de genes, por ejemplo, para aumentar la actividad de la proteína quinasa C (PKC) en las células usadas en el ensayo, por ejemplo, PKC\alpha, PKC\beta, PKC\gamma o PKC\xi.
Otras realizaciones relacionadas son una composición que comprende un complejo parcialmente purificado o purificado que comprende un compuesto de la fórmula 1 y un receptor de esteroides, una proteína sérica que se une al esteroide (por ejemplo, seroalbúmina humana, glicoproteína ácida \alpha1, globulina que se une a las hormonas sexuales, globulina que se une a la testosterona, globulina que se une a corticosteroides, proteína (de rata) que se une a los andrógenos u otro copartícipe de unión, por ejemplo. factor de transcripción o DNARS. Un aspecto de estas composiciones incluye un producto producido por el procedimiento de poner en contacto la composición parcialmente purificada o purificada con una o más células, uno o más tejidos, plasma o sangre.
Otra realización comprende un método para determinar una actividad biológica de un compuesto de la fórmula 1 que comprende: (a) poner en contacto el compuesto o compuestos de la fórmula 1 con una célula o población de células; (b) medir uno o más de (i) un complejo entre un copartícipe de unión y el compuesto de la fórmula 1, (ii) proliferación de la célula o población de células, (iii) diferenciación de la célula o población de células, (iv) una actividad de una proteína quinasa C, (v) un nivel de fosforilación de un sustrato de proteína quinasa C, (vi) transcripción de uno o más genes objetivos, (vii) inhibición de la respuesta celular a los esteroides, por ejemplo, glucocorticoides, (viii) inhibición de la transcripción inducida por esteroides, por ejemplo, glucocorticoides, esteroides sexuales o (ix) inhibición de la transcripción dirigida por LTR de HIV; y (c) opcionalmente comparar el resultado obtenido en la etapa (b) con un control apropiado. Los aspectos de esta realización incluyen (i) el método en el que el copartícipe de unión es un receptor de esteroides, un factor de transcripción o una DNARS, (ii) el método en el que la actividad biológica determinada es una actividad de modulación del compuesto de la fórmula 1 para la replicación o los efectos citopáticos asociados con un retrovirus, un virus de la hepatitis o un parásito protozoario, (iii) el método en el que la actividad biológica determinada es una actividad de modulación del compuesto de la fórmula 1 para la replicación, efectos citopáticos asociados con el retrovirus, el virus de la hepatitis o el parásito protozoario, o la actividad biológica determinada es el metabolismo (ensayo por absorción de ^{3}H-timidina u otro ensayo como se menciona o describe aquí) de una célula o población de células que comprende células NK, fagocitos, monocitos, macrófagos, basófilos, eosinófilos, células dendríticas, sinoviocitos, células microgliales, fibrocitos, células transformadas (neoplásicas), células infectadas con virus, células infectadas con bacterias o células infectadas con parásitos, y (iv) el método en el que el gen objetivo es un gen vírico, un gen bacteriano, un gen de parásitos o un gen asociado con el cáncer, por ejemplo, en el que el gen del virus es un gen de la DNA o RNA-polimerasa, un gen de la transcriptasa inversa, un gen envoltura, un gen de la proteasa o un gen asociado con la replicación del ácido nucleico viral o un gen estructural viral.
Otra realización es un método que comprende poner en contacto un complejo que comprende un receptor de esteroides y un compuesto de la fórmula 1 con una proteína transactivadora, en el que se forma un complejo que comprende la proteína del receptor de esteroides, el compuesto de la fórmula 1 y la proteína transactivadora, donde la proteína transactivadora está en (1) un extracto celular o tisular (por ejemplo, núcleos, lisado que contiene núcleos o lisado sin núcleos a partir de una célula(s) o tejido(s)), (2) un extracto celular o tisular parcialmente purificado o purificado, (3) una célula(s) en cultivo de tejidos o (4) una célula(s) en un sujeto, en el que cualquiera de los (1)-(4) comprende opcionalmente un gen objetivo (gen nativo o introducido por técnicas estándar de manipulación de genes) cuyo nivel de expresión se ensaya opcionalmente una vez que se ha formado el complejo. En algunas de estas realizaciones, la proteína transactivadora está parcialmente purificada o purificada y está en el extracto celular o tisular o en el extracto celular o tisular parcialmente purificado o purificado. La proteína transactivadora puede ser TIF-1, CBP/P300, TRP1/SUG-1, RIP-140, SRC1\alpha/P160, o TIF-2/GRP-1. En cualquiera de estas realizaciones el complejo que comprende la proteína del receptor de esteroides, el compuesto de la fórmula 1 y la proteína transactivadora puede aumentar o reducir la transcripción del gen objetivo en comparación con un control adecuado (por ejemplo, un control bajo las mismas condiciones pero careciendo de cualquier compuesto añadido que corresponde al compuesto de la fórmula 1, o cuando se usa otro compuesto (por ejemplo, un esteroide del que se conoce que se une al receptor de esteroides) como un punto de referencia o estándar de referencia frente al cual se mide la expresión alterada del gen objetivo). En estos métodos, el gen objetivo puede ser un gen de un patógeno (por ejemplo, virus, bacteria, parásito, hongo, levadura) o un gen asociado con un estado patológico (autoinmunidad, inflamación, hiperproliferación).
Los efectos biológicos observados mientras se realizan los métodos descritos aquí se espera que usualmente incluyan la formación de complejos que contienen dos o más componentes. Estos componentes pueden incluir uno o más factores de transcripción o co-reguladores o co-represores de transcripción y sus homólogos e isoformas. Estos factores y complejos que los contienen incluyen los miembros de la familia del coactivador 1 del receptor de esteroides (SRC-1, SRC-1/factor sérico de respuesta), NF-\kappaB, NFAT, p300, CBP, p300/CBP, p300/CPB-factor asociado, SWI/SNF y los homólogos humanos y otros homólogos, BRG-1, OCT-1/OAF, AP1, Ets, proteína 54 asociada con el receptor de andrógenos (ARA54) proteína 55 asociada con el receptor de andrógenos (ARA55), proteína 70 asociada con el receptor de andrógenos (ARA70), RAC3/ACTR, proteína de unión a CREB (CPB), SRC-1\alpha, proteína 140 que interactúa con el receptor (RIP-140), proteína 1 activadora del factor de transcripción, activación de la función-2, proteína 1 que interactúa con el receptor de glucocorticoides (GRIP-1), proteína 160 que interactúa con el receptor (RIP-160), depresor de las lesiones gal4D (SUG-1), factor 1 intermediario de la transcripción (TIF-1), factor 2 intermediario de la transcripción (TIF-2), SMRT, N-CoR, N-CoA-1, p/CIP, factor 1 esteroidógeno (SF-1), p65 (RelA) y Vpr codificado por el virus de la inmunodeficiencia humana y sus isoformas y homólogos. Uno o más de estos factores pueden estar presentes en complejos que comprenden un compuesto de la fórmula 1 y un receptor de esteroides tal como SXR, PPAR\alpha, CAR-\beta, RXR y/o PXR.
En una realización relacionada, un compuesto de la fórmula 1 se usa para ejercer un efecto citostático en las células de mamífero in vitro. Típicamente tales células son células linfoides, por ejemplo, las poblaciones de células T procedentes, por ejemplo. de sangre u órganos que son ricos en células linfoides (por ejemplo, bazo, tejido o nódulos linfoides), o líneas de células T transformadas. Tal actividad proporciona un estimado de la potencia de los compuestos de la fórmula 1 para mediar en los efectos inmunológicos, tal como aumentando las respuestas inmunitarias Th1 o deprimiendo la expresión de una o más citoquinas asociadas a Th2. Por tanto, un método de la invención comprende (a) poner en contacto un compuesto de la fórmula 1 y las células linfoides in vitro, (b) determinar el grado de citostasis que ejerce el compuesto para identificar un compuesto citostático y (c) opcionalmente administrar el compuesto citostático a un sujeto inmunodeprimido para determinar el efecto del compuesto sobre una o más de las respuestas inmunitarias del sujeto como se describe aquí, por ejemplo. aumento de la citoquina o respuesta celular Th1 o reducción de la expresión de citoquina asociada a Th2. Típicamente, tales métodos se llevan a cabo usando un intervalo de concentraciones del compuesto de la fórmula 1 y controles adecuados, tales como un agente citostático conocido o un blanco que contiene disolvente que carece del compuesto de la fórmula 1. La inhibición de la proliferación celular se mide por métodos estándar. Los métodos para medir los efectos citostáticos de los compuestos incluyen medir el número de células viables en los cultivos tratados y sin tratar o midiendo la síntesis de DNA usando por ejemplo, la incorporación de ^{3}H-timidina a DNA en los cultivos tratados y sin tratar. Los intervalos típicos de las concentraciones de la fórmula 1 en el medio de crecimiento celular son aproximadamente de 0,1 \muM a aproximadamente 100 \muM, usando aproximadamente 4-6 concentraciones diferentes de compuestos con un número fijo de células (por ejemplo, de aproximadamente 0,4 x 10^{5} a aproximadamente 5 x 10^{5}). El compuesto de la fórmula 1 se deja en contacto con las células en cultivo de tejidos durante un tiempo suficiente para observar la citostasis, por ejemplo, de aproximadamente 16 horas a aproximadamente 6 días, típicamente aproximadamente 24-72 horas. En estas realizaciones, se puede hacer opcionalmente un cribado en cuanto a la modulación de una actividad biológica de un receptor de esteroides, por ejemplo, activación de PPAR\alpha, que se puede asociar con la citostasis inducida por el compuesto.
En algunas aplicaciones, los compuestos de la fórmula 1 parece que producen una mejoría de uno o más de los síntomas asociados con una infección o una enfermedad. Por ejemplo, el tratamiento de sujetos que están inmunodeprimidos, por ejemplo, debido a una infección por retrovirus, quimioterapia del cáncer u otra causa, generalmente presenta una mejoría de uno o más síntomas asociados, tales como pérdida de peso, fiebre, anemia, fatiga o reducción de los síntomas de la infección que se asocian con una infección secundaria, por ejemplo, infecciones por HSV-1, HSV-2, papiloma, citomegalovirus humano ("CMV"), Pneumocystis (por ejemplo, P. carinii) o Candida (C. albicans, C. krusel, C. tropicalis). Los compuestos de la fórmula 1 son útiles también para facilitar la recuperación del sistema inmunitario en situaciones de trasplantes autólogos de médula ósea o trasplantes de células madre. En algunas realizaciones, el compuesto o compuestos de la fórmula 1 se administran como una formulación líquida no acuosa como se describe aquí o el compuesto o compuestos de la fórmula 1 se administran según cualquiera de los protocolos de administración intermitente descritos aquí usando una formulación sólida o líquida. En el caso de un sujeto que tiene una infección retroviral con síntomas que incluyen uno o más entre, un recuento relativamente bajo de CD4 (por ejemplo, aproximadamente 10-200, usualmente aproximadamente 20-100), una o más infecciones patógenas adicionales (una infección por HSV-1, HSV-2, HHV-6, HHV-8, CMV, HCV, HPV, P.carinii o Candida) y uno o más entre, anemia, fatiga, sarcoma de kaposi, fiebre o pérdida involuntaria de peso (al menos aproximadamente 5% de peso corporal), la administración de aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10 mg/kg/día (usualmente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 5 mg/kg/día) de un compuesto o compuestos de la fórmula 1 al sujeto da como resultado típicamente una mejoría notable de uno o más síntomas antes de aproximadamente 1-4 semanas. En otras realizaciones, el compuesto o compuestos de la fórmula 1 se administran a un sujeto que tiene una enfermedad que parece estar asociada con una infección viral, por ejemplo, pneumonía o retinitis asociada con CMV, carcinoma nasofaríngeo o leucoplaquia vellosa oral asociada con el virus de Epstein-Barr, pancefalitis progresiva o diabetes asociada con el virus de la rubeola o crisis aplásica en anemia hemolítica asociada con el Parvovirus 19.
En un ejemplo de realización, se administra a los pacientes humanos infectados con HCV una formulación isotónica acuosa de \alpha-ciclodextrina o \beta ciclodextrina que contiene aproximadamente 20 mg/ml de hemihidrato de BrEA. La formulación se administra intravenosamente en una única dosis diaria o en dos subdosis al día. Los pacientes reciben de 1 a 10 mg/kg/día durante 4 a 10 días, seguido por ninguna administración durante 5 a 30 días, seguido por nueva administración de la formulación de ciclodextrina durante 4 a 10 días. El régimen de administración se repite una, dos o más veces. Los marcadores clínicos de la infección de HCV se siguen durante el tratamiento, por ejemplo, el ácido nucleico viral en la sangre o plasma, los niveles de enzimas hepáticas en la sangre o plasma (por ejemplo, AST/SGOT, ALT/SGPT, fosfatasa alcalina). Para estos pacientes, un tratamiento estándar anti-HCV, por ejemplo, interferón y/o ribavirina, se comienza opcionalmente o se continúa según las recomendaciones del médico del paciente y con la aprobación informada del paciente. En algunas de estas realizaciones, se administra un compuesto o compuestos de la fórmula 1 diariamente de forma continua como un componente en una composición o formulación oral o parenteral, por ejemplo, para un compuesto o compuestos de la fórmula 1 que son un nuevo compuesto per se. Opcionalmente se administra también hemihidrato de BrEA sistémicamente usando, por ejemplo, la formulación del ejemplo 1 para dispensar 1-5 mg/kg/día un día sí y otro no, durante aproximadamente 1 a 4 meses, o una formulación oral para administrar aproximadamente 5-40 mg/kg/día un día sí y otro no, durante aproximadamente 1 a 4 meses.
En cualquiera de las realizaciones descritas aquí, se puede administrar opcionalmente a un sujeto un tratamiento terapéutico adicional conjuntamente, esto es antes, durante o después, con la administración de un compuesto o compuestos de la fórmula 1. Por ejemplo, en los sujetos que tienen una infección viral o parasitaria y están en el ciclo de administración de un compuesto de la fórmula 1, se pueden administrar también otros tratamientos al sujeto, por ejemplo, análogos de nucleósidos para infecciones virales o cloroquina para la malaria. Tales tratamientos adicionales incluirán típicamente terapias estándar para las afecciones patológicas del sujeto, pero pueden incluir también tratamientos experimentales u otros tratamientos. Por ejemplo, se pueden coadministrar vitaminas (multivitaminas, vitaminas individuales), antioxidantes u otros agentes (vitamina E, alopurinol), suplementos nutricionales (preparaciones líquidas de proteínas o carbohidratos) u otras terapias cuando la condición médica del paciente lo precise y el médico del paciente lo recomiende. Cualquiera de estos tratamientos adicionales puede ser acoplado con la administración de cualquiera de los compuestos de la fórmula 1, por ejemplo, hemihidrato de BrEA, uno de sus ésteres, carbamatos, carbonatos o aminoácidos o péptidos conjugados, en cualquiera de las realizaciones descritas
aquí.
Tales tratamientos adicionales son evidentes para los expertos en la técnica. Tales tratamientos se seleccionan basándose en la enfermedad a ser tratada, las reactividades cruzadas de los ingredientes y las propiedades farmacológicas de la combinación. Por ejemplo, cuando se tratan infecciones retrovirales en un ser humano u otro sujeto, los compuestos de la fórmula 1 se combinan con uno o más inhibidores de la transcriptasa inversa, inhibidores de la proteasa, antibióticos o analgésicos. Los compuestos de la fórmula 1 adecuados incluyen los descritos, por ejemplo, en los grupos de compuestos de 1 a 42-25-20-6 y en otras partes aquí. Ejemplos de inhibidores de la transcriptasa inversa son AZT, 3TC, D4T, ddI, ddC, adefovir-dipivoxil, 9-[2-(R)-[[bis[[(isopropoxicarbonil)oxi]metoxi]-fosfinoil]metoxi]propil]adenina, (R)-9-[2-(fosfonometoxi)propil]-adenina y adefovir. Ejemplos de inhibidores de la proteasa son indinavir, nelfinavir, ritonavir, crixivan y sequanavir. los inhibidores de fusión Se pueden usar también los inhibidores de fusión, por ejemplo, inhibidores de fusión de HIV. Cuando se tratan infecciones virales del sistema respiratorio u otros sistemas, por ejemplo, infección por el virus de la hepatitis C ("HCV") o por el virus de la gripe (por ejemplo, influenza A o B), las composiciones de la invención se usan opcionalmente conjuntamente con antivirales (tales como \gamma-interferón, amantidina, rimantadina, ribavirina o los compuestos descritos en las patentes de Estados Unidos 5763483 (especialmente los compuestos detallados en las reivindicaciones 1 y 2) y 5866601), mucolíticos, expectorantes, broncodilatadores, antibióticos, antipiréticos o analgésicos.
En algunas realizaciones, el compuesto de la fórmula 1 se administra a sujetos que tienen una infección parasitaria o bacteriana, para retardar el progreso de la infección, interferir con la replicación o desarrollo del agente infeccioso o para mejorar uno o más de los síntomas asociados, por ejemplo, pérdida de peso, anemia o infecciones secundarias. Los parásitos son parásitos de la malaria, parásitos de la enfermedad del sueño, y parásitos asociados con infecciones gastrointestinales. Los parásitos y bacterias incluyen especies, grupos, genotipos, cepas o aislados de helmintos gastrointestinales, microsporidia, isospora, cryptosporidia (Cryptosporidium parvum), Mycobacterium (M. avium, M. bovis, M. leprae, M. tuberculosis, M. pneumoniae, M. penetrans) Mycoplasma (M. fermentans, M. penetrans, M. pneumoniae), Trypanosoma (T. brucei, T. gambiense, T. cruzi, T. evansi), Leishmania (L. donovani, L. major, L. braziliensis), Plasmodium (P. falciparum, P. knowlesi, P. vivax, P. berghei), Ehrlichia (E. canis, E. chaffeensis, E. phagocytophila, E. equi, E. sennetsu), Babesis microti, Haemophilus (H. somnus, H. Influenzae), Brucella (B. militensis, B. abortus), Bartonella (B. henselae), Bordetella (B. bronchiseptica, B. pertussis), Escherichia (E. coli), Salmonella (S. typhimurium), Shigella (S. flexneri), Pseudomonas (P. aeruginosa), Neisseria (N. gonorrhoeae, N. meningitidis), Strptococcus, Staphylococcus (S. aureus), Rickettsia (R. rickettsi), Yersinia (Y. enterocolitica), Legionella pneumonia y Listeria (L. monocytogenes).
Uno o más de los protocolos de administración intermitente de la invención o una o más de las formulaciones líquidas no acuosas descritas aquí se pueden aplicar por experimentación rutinaria a cualquiera de los usos o aplicaciones descritos aquí. Para un compuesto de la fórmula 1 que es un nuevo compuesto per se, se puede administrar el compuesto a un sujeto según un protocolo o protocolos de administración intermitente de la invención o por otros protocolos, por ejemplo, administración diaria continua de una dosis única o dos o más subdosis por día. En adición, cualquiera de los compuestos de la fórmula 1, por ejemplo, uno o más compuestos de la fórmula 1 que son nuevos per se, se pueden presentar en cualquier formulación sólida o líquida descritas aquí. Estas formulaciones y protocolos de administración se pueden aplicar por experimentación rutinaria a cualquiera de los usos o aplicaciones descritos aquí.
Realizaciones numeradas
Las siguientes realizaciones numeradas incluyen varios aspectos de la invención y materias relacionadas.
En algunos aspectos, la invención se refiere a formulaciones líquidas no acuosas que comprenden un compuesto de la fórmula 1. Ejemplos de realizaciones son las siguientes.
1. Una composición que comprende uno o más compuestos de la fórmula 1 y uno o más excipientes líquidos no acuosos, en la que la composición comprende menos de aproximadamente 3% v/v de agua.
5. La composición de la realización 1, en la que la composición comprende menos de aproximadamente 0,3% v/v de agua.
6. La composición de las realizaciones 1 ó 5, en la que los uno o más excipientes líquidos no acuosos, son uno, dos o más entre, un alcohol, un polietilenglicol, propilenglicol o benzoato de bencilo.
9. La composición de cualquiera de las realizaciones 1, 5 ó 6, en la que la composición comprende dos, tres, cuatro o cinco excipientes líquidos no acuosos.
10. La composición de la realización 9, en la que la composición comprende tres o más excipientes líquidos no acuosos.
11. La composición de cualquiera de las realizaciones 1, 5, 6, 9 ó 10, en la que el compuesto de la fórmula 1 constituye aproximadamente 0,0001-99% p/v de la composición.
12. La composición de cualquiera de las realizaciones anteriores, en la que la composición comprende una dosis unitaria.
13. La composición de la realización 12, en la que la dosis unitaria comprende aproximadamente 0,5-100 mg/ml del compuesto de la fórmula 1.
14. La composición de la realización 10, en la que la composición comprende aproximadamente 1,0-60 mg/ml del compuesto de la fórmula 1.
16. La composición de la realización 1, en la que los uno o más excipientes líquidos no acuosos, comprenden un polietilenglicol, propilenglicol y benzoato de bencilo.
17. La composición de la realización 16, en la que la composición comprende menos de aproximadamente 0,3% v/v de agua.
20. La composición de la realización 16, que comprende además un alcohol.
22. La composición de la realización 1, en la que los uno o más excipientes líquidos no acuosos, comprenden benzoato de bencilo, un polietilenglicol, un alcohol y opcionalmente un excipiente líquido no acuoso adicional.
23. La composición de la realización 22, en la que la composición comprende menos de aproximadamente 0,3% v/v de agua.
26. La composición de las realizaciones 22 ó 23, en la que el polietilenglicol es polietilenglicol 300 y/o polietilenglicol 200.
27. La composición de la realización 26, en la que el polietilenglicol es polietilenglicol 300.
28. La composición de las realizaciones 22 ó 23, que comprende aproximadamente 2,5-25% v/v de etanol, aproximadamente 1-10% v/v de benzoato de bencilo, aproximadamente 10-35% v/v de polietilenglicol 300, aproximadamente 40-65% v/v de propilenglicol y aproximadamente 2-60 mg/ml de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-
\hbox{17-ona.}
28A. La composición de las realizaciones 22, 23 ó 26, que comprende aproximadamente 0,1-10% v/v de benzoato de bencilo, aproximadamente 0,1-10% v/v de alcohol bencílico, aproximadamente 1-95% v/v de polietilenglicol 200, aproximadamente 1-95% v/v de propilenglicol y aproximadamente 2-60 mg/ml de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona. La composición de la realización 28A puede comprender aproximadamente 2% v/v de benzoato de bencilo, aproximadamente 2% v/v de alcohol bencílico, aproximadamente 40% v/v de polietilenglicol 200, aproximadamente 51% v/v de propilenglicol (c.s.) y aproximadamente 50 mg/ml de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona.
29. La composición de la realización 28, que comprende aproximadamente 12,5% v/v de etanol, aproximadamente 5% v/v de benzoato de bencilo, aproximadamente 25% v/v de polietilenglicol 300, aproximadamente 57,5% v/v de propilenglicol y aproximadamente 50 mg/ml de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona.
30. La composición de cualquiera de las realizaciones anteriores, que comprende además un anestésico local.
31. La composición de la realización 30, en la que el anestésico local es procaína, benzocaína o lidocaína.
32. La composición de cualquiera de las realizaciones anteriores, en la que la composición comprende un solvato, una suspensión, un coloide, un gel o una combinación de cualquiera de los anteriores.
33. Un producto producido por el procedimiento de poner en contacto una composición que comprende uno o más compuestos de la fórmula 1 y un primer excipiente líquido no acuoso con un segundo excipiente líquido no acuoso, donde el producto comprende menos de aproximadamente 3% v/v de agua y sus sales, análogos, isómeros configuracionales y tautómeros.
34. El producto de la realización 33, en el que el producto comprende menos de aproximadamente 0,3% v/v de agua.
35. El producto de las realizaciones 33 ó 34, en el que el primer excipiente líquido no acuoso es un polietilenglicol (por ejemplo, PEG300 o PEG 200) o propilenglicol.
36. El producto de las realizaciones 33, 34 ó 35, en el que el segundo excipiente líquido no acuoso es un polietilenglicol (por ejemplo, PEG300 o PEG 200) o propilenglicol.
38. Un producto producido por el procedimiento de poner en contacto una composición que comprende uno o más compuestos de la fórmula 1 y dos excipientes líquidos no acuosos con un tercer excipiente líquido no acuoso, donde el producto comprende menos de aproximadamente 3% de agua y sus sales, análogos, isómeros configuracionales y tautómeros.
39. El producto de la realización 38, en el que el producto comprende menos de aproximadamente 0,3% de agua.
40. El producto de las realizaciones 38 ó 39, en el que los dos excipientes líquidos no acuosos se seleccionan entre un polietilenglicol (por ejemplo, PEG300 o PEG 200), propilenglicol, benzoato de bencilo y un alcohol (por ejemplo, etanol).
41. El producto de las realizaciones 38, 39 ó 40, en el que el tercer excipiente líquido no acuoso es un polietilenglicol (por ejemplo, PEG300 o PEG 200), propilenglicol, benzoato de bencilo o un alcohol (por ejemplo, etanol).
42. Un producto producido por el procedimiento de poner en contacto una composición que comprende uno o más compuestos de la fórmula 1 y tres excipientes líquidos no acuosos con un cuarto excipiente líquido no acuoso, donde el producto comprende menos de aproximadamente 3% de agua y sus sales, análogos, isómeros configuracionales y tautómeros.
43. El producto de la realización 42, en el que el producto comprende menos de aproximadamente 0,3% de agua.
44. El producto de las realizaciones 42 ó 43, en el que los tres excipientes líquidos no acuosos se seleccionan entre un polietilenglicol (por ejemplo, PEG300 o PEG 200), propilenglicol, benzoato de bencilo o un alcohol (por ejemplo, etanol).
45. El producto de las realizaciones 42, 43 ó 44, en el que el cuarto excipiente líquido no acuoso es un polietilenglicol (por ejemplo, PEG300 o PEG 200), propilenglicol, benzoato de bencilo o un alcohol (por ejemplo, etanol).
46. El producto de cualquiera de las realizaciones 33-45, donde el producto se mantiene a temperatura reducida (de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 8ºC) o a temperatura ambiente durante 30 minutos aproximadamente hasta 2 años aproximadamente.
65. Un método que comprende administrar la composición o producto de cualquiera de las anteriores realizaciones a un sujeto que padece una infección patógena o un tumor maligno o una afección de inmunodepresión o des-regulación, por ejemplo, una respuesta inmunitaria Th1 deprimida o una respuesta inmunitaria Th2 no deseada.
\newpage
66. El método de la realización 65, en el que la infección patógena es una infección por DNA-virus o una infección por RNA-virus.
67. El método de la realización 66, en el que la infección por RNA-virus es una infección de retrovirus o una infección del virus de la hepatitis.
68. El método de la realización 67, en el que la infección de retrovirus o infección del virus de la hepatitis es una infección de HIV, FIV, SIV, SHIV o infección del virus de la hepatitis C.
69. El método de la realización 65, en el que la infección por patógenos es una infección parasitaria intracelular.
70. El método de la realización 69, en el que la infección parasitaria intracelular es una infección de malaria.
En otros aspectos, la invención proporciona métodos de administración adecuados para tratar las enfermedades descritas aquí. Las siguientes realizaciones describen alguno de estos métodos.
1B. Un método que comprende administrar intermitentemente hemihidrato de BrEA (o una composición que contiene hemihidrato de BrEA) a un sujeto o dispensar hemihidrato de BrEA (o una composición que contiene hemihidrato de BrEA) a los tejidos del sujeto.
2B. El método de la realización 1B, en el que el sujeto tiene una infección, un trastorno de hiperproliferación, una enfermedad hiperproliferativa, una afección de inmunodepresión, una respuesta inmunitaria no deseada o en el que el sujeto ha experimentado recientemente o experimentará en un futuro próximo un traumatismo, cirugía o un tratamiento terapéutico en el que el tratamiento terapéutico es distinto del método de la realización 1B.
3B. El método de la realización 2B, en el que la afección de inmunodepresión o la respuesta inmunitaria no deseada se asocia con una infección viral, una infección bacteriana intracelular, una infección bacteriana extracelular, una infección fúngica, una infección de levaduras, una infección parasitaria extracelular, una infección parasitaria intracelular, un parásito protozoario, un parásito multicelular, una enfermedad autoinmune, un cáncer, un precáncer, una quimioterapia, una radioterapia, una terapia inmunodepresora, una terapia con agente anti-infectivo, una herida, una quemadura, la presencia de una molécula inmunodepresiva, irritación gastrointestinal o cualquier combinación de las anteriores.
4B. El método de la realización 3B, en el que la afección de inmunodepresión del sujeto se mejora o la respuesta inmunitaria no deseada (por ejemplo, una respuesta Th2) se reduce, o en el que la respuesta inmunitaria Th1 del sujeto se aumenta.
5B. El método de la realización 3B, en el que se aumenta la inmunidad innata del sujeto, la inmunidad específica o ambas.
6B. El método de la realización 5B, en el que se aumenta la inmunidad innata del sujeto.
7B. El método de la realización 6B, en el que se aumenta la inmunidad específica del sujeto, por ejemplo, en el que se reduce la respuesta inmunitaria Th2 del sujeto o en el que se aumenta la respuesta inmunitaria Th1 del sujeto.
8B. El método de la realización 2B, en el que el hemihidrato de BrEA se administra de acuerdo con un régimen de administración que comprende las siguientes etapas,
(a) administrar hemihidrato de BrEA al sujeto al menos una vez al día durante al menos 2 días;
(b) no administrar hemihidrato de BrEA al sujeto durante al menos 1 día;
(c) administrar hemihidrato de BrEA al sujeto al menos una vez al día durante al menos 2 días; y
(d) opcionalmente repetir las etapas (a), (b), y (c) al menos una vez o variaciones de las etapas (a), (b), y (c) al menos una vez.
9B. El método de la realización 8B, en el que la etapa (c) comprende el mismo régimen de administración que la etapa (a).
10B. El método de la realización 9B, en el que la etapa (a) del régimen de administración comprende administrar hemihidrato de BrEA una vez al día, dos veces al día, tres veces al día o cuatro veces al día.
11B. El método de la realización 10B, en el que la etapa (a) del régimen de administración comprende administrar compuestos de hemihidrato de BrEA una vez al día o dos veces al día.
12B. El método de la realización 10B, en el que la etapa (a) comprende administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 3 a aproximadamente 24 días.
13B. El método de la realización 12B, en el que la etapa (a) comprende administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 días.
14B. El método de la realización 13B, en el que la etapa (a) comprende administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 días.
15B. El método de la realización 14B, en el que la etapa (b) comprende no administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 3 a aproximadamente 120 días.
16B. El método de la realización 15B, en el que la etapa (b) comprende no administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 60 días.
17B. El método de la realización 16B, en el que la etapa (b) comprende no administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 días.
18B. El método de la realización 16B, en el que la etapa (b) comprende no administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 8 a aproximadamente 60 días.
19B. El método de la realización 15B, en el que las etapas (a), (b) y (c) se repiten al menos aproximadamente 4 veces.
20B. El método de la realización 15B, en el que las etapas (a), (b) y (c) se repiten al menos de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 25 veces.
21B. El método de la realización 15B, en el que las etapas (a), (b) y (c) y las repeticiones de las etapas (a), (b) y (c) tienen lugar a lo largo de un periodo de tiempo de al menos aproximadamente 2 meses.
22B. El método de la realización 15B, en el que las etapas (a), (b) y (c) y las repeticiones de las etapas (a), (b) y (c) tienen lugar a lo largo de un periodo de tiempo de al menos aproximadamente 12 meses.
23B. El método de la realización 8B, en el que la etapa (b) comprende no administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 3 a aproximadamente 120 días.
24B. El método de la realización 23B, en el que la etapa (b) comprende no administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 60 días.
25B. El método de la realización 24B, en el que la etapa (b) comprende no administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 días.
26B. El método de la realización 23B, en el que la etapa (b) comprende no administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 8 a aproximadamente 60 días.
27B. El método de la realización 8B, en el que la etapa (d) comprende repetir las etapas (a), (b) y (c) al menos una vez.
28B. El método de la realización 27B, en el que la etapa (d) comprende repetir las etapas (a), (b) y (c) de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 25 veces.
29B. El método de la realización 1B, en el que las etapas (a), (b) y (c) y las repeticiones de las etapas (a), (b) y (c) tienen lugar a lo largo de un periodo de tiempo de al menos aproximadamente 2 meses.
30B. El método de la realización 29B, en el que las etapas (a), (b) y (c) y las repeticiones de las etapas (a), (b) y (c) tienen lugar a lo largo de un periodo de tiempo de al menos aproximadamente 12 meses.
31B. El método de cualquiera de las realizaciones 8B-30B, en el que la afección de inmunodepresión o la respuesta inmunitaria no deseada se asocia con una infección viral, una infección bacteriana intracelular, una infección bacteriana extracelular, una infección fúngica, una infección de levaduras, una infección parasitaria extracelular, una infección parasitaria intracelular, un parásito protozoario, un parásito multicelular, una enfermedad autoinmune, un cáncer, un precáncer, una quimioterapia, una radioterapia, una terapia inmunodepresora, una terapia con agente anti-infectivo, una herida, una quemadura, la presencia de una molécula inmunodepresiva, irritación gastrointestinal o cualquier combinación de las anteriores.
32B. El método de la realización 31B, en el que la afección de inmunodepresión del sujeto se mejora o la respuesta inmunitaria no deseada se reduce.
33B. El método de la realización 32B, en el que se aumenta la inmunidad innata del sujeto, la inmunidad específica o ambas.
34B. El método de la realización 33B, en el que se aumenta la inmunidad innata del sujeto.
35B. El método de la realización 34B, en el que se aumenta la inmunidad específica del sujeto.
36B. El método de la realización 8B, en el que la etapa (c) comprende un régimen de administración más corto que la etapa (a).
37B. El método de la realización 36B, en el que la etapa (a) comprende administrar hemihidrato de BrEA durante 7 a aproximadamente 24 días.
38B. El método de la realización 37B, en el que la etapa (c) comprende administrar hemihidrato de BrEA durante 4 a aproximadamente 12 días.
39B. El método de la realización 38B, en el que la etapa (b) comprende no administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 3 a aproximadamente 120 días.
40B. El método de la realización 39B, en el que la etapa (b) comprende no administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 60 días.
41B. El método de la realización 40B, en el que la etapa (b) comprende no administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 días.
42B. El método de la realización 36B, en el que la etapa (d) comprende repetir las etapas (a), (b) y (c) al menos una vez.
43B. El método de la realización 42B, en el que la etapa (d) comprende repetir las etapas (a), (b) y (c) de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 25 veces.
44B. El método de la realización 36B, en el que las etapas (a), (b) y (c) y las repeticiones de las etapas (a), (b) y (c) tienen lugar a lo largo de un periodo de tiempo de al menos aproximadamente 2 meses.
45B. El método de la realización 44B, en el que las etapas (a), (b) y (c) y las repeticiones de las etapas (a), (b) y (c) tienen lugar a lo largo de un periodo de tiempo de al menos aproximadamente 12 meses.
46B. El método de cualquiera de las realizaciones 36B-45B, en el que la afección de inmunodepresión o la respuesta inmunitaria no deseada se asocia con una infección viral, una infección bacteriana intracelular, una infección bacteriana extracelular, una infección fúngica, una infección de levaduras, una infección parasitaria extracelular, una infección parasitaria intracelular, un parásito protozoario, un parásito multicelular, una enfermedad autoinmune, un cáncer, un precáncer, una quimioterapia, una radioterapia, una terapia inmunodepresora, una terapia con agente anti-infectivo, una herida, una quemadura, la presencia de una molécula inmunodepresiva, irritación gastrointestinal o cualquier combinación de las anteriores.
47B. El método de la realización 46B, en el que la afección de inmunodepresión del sujeto se mejora o la respuesta inmunitaria no deseada se reduce.
48B. El método de la realización 47B, en el que se aumenta la inmunidad innata del sujeto, la inmunidad específica o ambas.
49B. El método de la realización 48B, en el que se aumenta la inmunidad innata del sujeto.
50B. El método de la realización 48B, en el que se aumenta la inmunidad específica del sujeto.
51B. El método de la realización 8B, en el que la etapa (c) comprende un régimen de administración más largo que la etapa (a).
52B. El método de la realización 51B, en el que la etapa (a) comprende administrar hemihidrato de BrEA durante de 7 a aproximadamente 24 días.
53B. El método de la realización 52B, en el que la etapa (c) comprende administrar hemihidrato de BrEA durante 4 a aproximadamente 12 días.
54B. El método de la realización 53B, en el que la etapa (b) comprende no administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 3 a aproximadamente 120 días.
55B. El método de la realización 54B, en el que la etapa (b) comprende no administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 60 días.
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56B. El método de la realización 55B, en el que la etapa (b) comprende no administrar hemihidrato de BrEA durante un periodo de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 días.
57B. El método de la realización 51B, en el que la etapa (d) comprende repetir las etapas (a), (b) y (c) al menos una vez.
58B. El método de la realización 57B, en el que la etapa (d) comprende repetir las etapas (a), (b) y (c) de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 25 veces.
59B. El método de la realización 51B, en el que las etapas (a), (b) y (c) y las repeticiones de las etapas (a), (b) y (c) tienen lugar a lo largo de un periodo de tiempo de al menos aproximadamente 2 meses.
60B. El método de la realización 59B, en el que las etapas (a), (b) y (c) y las repeticiones de las etapas (a), (b) y (c) tienen lugar a lo largo de un periodo de tiempo de al menos aproximadamente 12 meses.
61B. El método de cualquiera de las realizaciones 51B-60B, en el que la afección de inmunodepresión o la respuesta inmunitaria no deseada se asocia con una infección viral, una infección bacteriana intracelular, una infección bacteriana extracelular, una infección fúngica, una infección de levaduras, una infección parasitaria extracelular, una infección parasitaria intracelular, un parásito protozoario, un parásito multicelular, una enfermedad autoinmune, un cáncer, un precáncer, una quimioterapia, una radioterapia, una terapia inmunodepresora, una terapia con agente anti-infectivo, una herida, una quemadura, la presencia de una molécula inmunodepresiva, irritación gastrointestinal o cualquier combinación de las anteriores.
62B. El método de la realización 61B, en el que la afección de inmunodepresión del sujeto se mejora o la respuesta inmunitaria no deseada se reduce.
63B. El método de la realización 62B, en el que se aumenta la inmunidad innata del sujeto, la inmunidad específica o ambas, o en el que se aumenta la respuesta inmunitaria Th1 del sujeto o se reduce la respuesta inmunitaria Th2 del sujeto.
64B. El método de la realización 8B, en el que las variaciones de las etapas (a), (b) y (c) comprenden realizar un primer régimen de administración de las etapas (a), (b) y (c) una vez, dos o tres veces, seguido por uno o más segundos regímenes de administración de las etapas (a'), (b') y (c') en el que una o más de las etapas (a'), (b') y (c') del segundo régimen de administración son más largas que la correspondiente etapa del primer régimen de administración.
65B. El método de la realización 8B, en el que las variaciones de las etapas (a), (b) y (c) comprenden realizar un primer régimen de administración de las etapas (a), (b) y (c) una vez, dos o tres veces, seguido por uno o más segundos regímenes de administración de las etapas (a'), (b') y (c') en el que una o más de las etapas (a'), (b') y (c') del segundo régimen de administración son más cortas que la correspondiente etapa del primer régimen de administración.
66B. El método de cualquiera de las realizaciones 1B-67B, en el que el hemihidrato de BrEA se administra oralmente, intramuscularmente, intravenosamente, subcutáneamente, tópicamente, vaginalmente, rectalmente, intracranealmente, intratecalmente, intradérmicamente, como un aerosol o por vía bucal.
67B. El método de la realización 66B, en el que el hemihidrato de BrEA se presenta en una formulación sólida predominantemente como un sólido o el hemihidrato de BrEA se presenta en una formulación líquida predominantemente como un solvato, coloide o una suspensión o el hemihidrato de BrEA se presenta en un gel, crema o pasta.
68B. El método de cualquiera de las realizaciones 2B-67B, en el que la infección viral del sujeto, la infección bacteriana intracelular, infección bacteriana extracelular, infección fúngica, infección de levaduras, infección parasitaria extracelular, infección parasitaria intracelular, parásito protozoario, parásito multicelular, enfermedad autoinmune, cáncer, precáncer, quimioterapia, radioterapia, terapia inmunodepresora, terapia con agente anti-infectivo, una herida, una quemadura, o la presencia de una molécula inmunodepresiva, irritación gastrointestinal o cualquier combinación de las anteriores, es (a) una infección de DNA-virus o una infección de RNA-virus (HSV, CMV, HBV, HCV, HIV, SHIV, SIV); (b) una infección por micoplasma, una infección de Listeria o una infección de Mycobacterium; (c) infección bacteriana extracelular; (d) infección fúngica; (e) una infección de levaduras (Candida, Cryptococcus); (d) protozoos (malaria, leishmania, cryptosporidium, toxoplasmosis, pneumocystis); (e) un parásito multicelular; (f) enfermedades autoinmunes (SLE, RA, diabetes); (g) cánceres (cánceres sólidos seleccionados por ejemplo, entre cáncer de ovarios, mama, próstata, glioma; cánceres diseminados seleccionados de linfoma, leucemia, cáncer de colon, sarcoma); (h) precánceres; (i) quimioterapias (adriamicina, cisplatina, mitomicina C); (j) radioterapias; (k) terapias inmunodepresoras; (l) terapias con agentes anti-infectivos; (m) heridas (quirúrgicas u otras); (n) quemaduras de primer grado, segundo grado o tercer grado; (o) moléculas inmunodepresoras; (p) irritación gastrointestinal (intestino irritable, enfermedad de Crohn, diarrea crónica); o (q) cualquier combinación de (a) a (p).
69B. El método de la realización 68B, en el que la infección de RNA-virus es una infección retroviral o una infección por el virus de la hepatitis.
71B. El método en el que el hemihidrato de BrEA está en una composición que comprende (a) uno o más excipientes líquidos no acuosos, en el que la composición comprende menos de aproximadamente 3% v/v de agua; (b) un sólido que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable; o (c) uno o más excipientes líquidos, en el que la composición comprende más de aproximadamente 3% v/v de agua.
75B. Un método para tratar la pérdida de peso involuntaria, lesiones orales, lesiones de la piel, infecciones oportunistas, diarrea o fatiga en un sujeto, que comprende administrar intermitentemente hemihidrato de BrEA al sujeto (por ejemplo, pérdida de peso involuntaria debida a una infección viral, infección gastrointestinal, quimioterapia, anorexia).
76B. El método de la realización 75B, en el que el sujeto tiene una afección de inmunodepresión.
77B. El método de la realización 76B, en el que el sujeto es un ser humano.
78B. El método de la realización 77B, en el que el sujeto es un ser humano de edad desde 1 día a 18 años (por ejemplo, 1 mes a 6 años de edad).
79B. El método de cualquiera de las realizaciones 75B-78B, en el que la inmunidad específica del sujeto está deteriorada en comparación con un típico sujeto control comparable que no tiene la situación patológica del sujeto.
80B. El método de la realización 79B, en el que el recuento de células CD4 del sujeto no aumenta significativamente durante uno o más ciclos de administración (por ejemplo, administración de 1 semana a aproximadamente 2 semanas o más).
81B. El método de la realización 80B, en el que el recuento de células CD4 del sujeto es de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 células CD4^{+}/mm^{3} o de aproximadamente 20 a aproximadamente 75 células CD4^{+}/mm^{3}.
82B. El método de cualquiera de las realizaciones 1B-81B, en el que el sujeto tiene una infección patógena o un tumor maligno y la infección patógena o el tumor maligno no se hacen resistentes al hemihidrato de BrEA durante el tiempo normalmente asociado con el desarrollo de una resistencia medible en al menos aproximadamente 50% de los sujetos que son tratados con un tratamiento terapéutico distinto del hemihidrato de BrEA.
83B. El método de la realización 82B, en el que la infección patógena es una infección de HIV, SIV, SHIV o HCV.
En otras realizaciones, la invención proporciona métodos para modular las células inmunitarias o las respuestas inmunitarias en un sujeto. Las siguientes realizaciones numeradas describen alguno de estos métodos.
1C. Un método para modular la inmunidad innata de un sujeto o para aumentar la respuesta inmunitaria Th1 de un sujeto o para reducir las respuestas inmunitarias Th1 de un sujeto que comprende administrar al sujeto un hemihidrato de BrEA.
2C. El método de la realización 1C, en el que se aumenta la inmunidad innata del sujeto.
3C. El método de las realizaciones 1C o 2C, en el que el sujeto padece una afección de depresión de la inmunidad innata, una disminución de la respuesta inmunitaria Th1 o una respuesta inmunitaria Th2 no deseada.
4C. El método de la realización 3C, en el que la afección de depresión de la inmunidad innata o la respuesta inmunitaria Th1 reducida o la respuesta Th2 no deseada se asocia con una infección viral, una infección bacteriana intracelular, una infección bacteriana extracelular, una infección fúngica, una infección de levaduras, una infección parasitaria extracelular, una infección parasitaria intracelular, un parásito protozoario, un parásito multicelular, una enfermedad autoinmune, un cáncer, un precáncer, una quimioterapia, una radioterapia, una terapia inmunodepresora, una terapia con agente anti-infectivo, una herida, una quemadura, la presencia de una molécula inmunodepresiva, irritación gastrointestinal o cualquier combinación de las anteriores.
5C. El método de cualquiera de las realizaciones 1C-3C, en el que se aumenta la respuesta inmunitaria Th1 del sujeto.
6C. El método de la realización 1C, en el que se reduce la respuesta inmunitaria Th2 del sujeto.
7C. El método de la realización 6C, en el que el sujeto tiene una afección que comprende una respuesta inmunitaria no deseada (por ejemplo, enfermedad autoinmune, SLE, diabetes).
9C. El método de las realizaciones 6C o 7C, en el que el sujeto es un vertebrado, un mamífero, un primate o un ser humano.
10C. El método de la realización 9C, en el que la modulación de la inmunidad específica del vertebrado, del mamífero, del primate o del ser humano es (i) un aumento de la respuesta CTL o Th1 a una infección de virus o a una célula maligna in vitro o in vivo, (ii) un aumento de la presentación de antígeno o de la actividad biológica por las células dendríticas o precursores de las células dendríticas, o (iii) aumento de la destrucción de las células infectadas por virus o de las células malignas.
11C. El método de 10C, en el que el vertebrado es un ser humano, la infección vírica es una infección por HIV y la respuesta CTL o Th1 comprende un aumento de la respuesta a una o más de las proteínas gag de HIV o a la gp 120 de HIV.
12C. El método de las realizaciones 1C, 4C, 10C o 11C, en el que las células Th1, linfocitos infiltrantes del tumor (células TIL), células NK, linfocitos de la sangre periférica, fagocitos, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, células dendríticas o fibrocitos del sujeto, se activan como se mide por ejemplo, por el aumento de la absorción de ^{3}H-timidina en comparación con los controles no tratados o por un aumento del número del tipo de células en circulación o movimiento demostrable del tipo de células de un tejido o compartimento (por ejemplo, la piel) a otro tejido o compartimento (por ejemplo, sangre, nódulos linfáticos, bazo o timo).
13C. El método de las realizaciones 1C, 4C, 10C, 11C o 12C, en el que el hemihidrato de BrEA modula la transcripción de uno o más genes en las células NK, fagocitos, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, células dendríticas o fibrocitos del sujeto, que se activan (como se mide por ejemplo, por el aumento de la actividad de la proteína quinasa C o por la modulación de una actividad biológica de un receptor de esteroides o de un receptor nuclear de hormonas huérfano).
14C. El método de la realización 1C, en el que el hemihidrato de BrEA aumenta el movimiento de los lisosomas en una o más de las células NK, fagocitos, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, células dendríticas o fibrocitos del sujeto.
15C. El método de la realización 1C, en el que el hemihidrato de BrEA aumenta la actividad de la proteína quinasa C en una o más de las células NK, fagocitos, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, células dendríticas o fibrocitos del sujeto (por ejemplo, PKC\alpha, PKC\beta, PKC\gamma y PKC\zeta).
18C. El método de cualquiera de las realizaciones 1C-17C, en el que el sujeto tiene una infección, un trastorno de hiperproliferación, una enfermedad hiperproliferativa, una afección de inmunodepresión, una respuesta inmunitaria no deseada o en el que el sujeto ha experimentado recientemente o experimentará en un futuro próximo un traumatismo, cirugía o un tratamiento terapéutico en el que el tratamiento terapéutico es distinto del método de la realización 1C.
19C. El método de la realización 18C, en el que la afección de inmunodepresión o la respuesta inmunitaria no deseada se asocia con una infección viral, una infección bacteriana intracelular, una infección bacteriana extracelular, una infección fúngica, una infección de levaduras, una infección parasitaria extracelular, una infección parasitaria intracelular, un parásito protozoario, un parásito multicelular, una enfermedad autoinmune, un cáncer, un precáncer, una quimioterapia, una radioterapia, una terapia inmunodepresora, una terapia con agente anti-infectivo, una herida, una quemadura, la presencia de una molécula inmunodepresiva, irritación gastrointestinal o cualquier combinación de las anteriores.
20C. El método de la realización 19C, en el que la afección de inmunodepresión del sujeto se mejora o la respuesta inmunitaria no deseada se reduce.
21C. El método de la realización 19C, en el que la afección de inmunodepresión del sujeto se asocia con una infección viral.
22C. El método de la realización 21C, en el que la infección viral comprende una infección por DNA-virus o por RNA-virus.
23C. El método de la realización 22C, en el que la infección por RNA-virus comprende una infección retroviral o una infección por el virus de la hepatitis.
24C. El método de cualquiera de las realizaciones 18C-23C, en el que el sujeto sufre uno o más entre, diarrea crónica, pérdida de peso involuntaria (usualmente al menos aproximadamente 5% o más), caquexia (usualmente al menos aproximadamente 5% o más), pérdida muscular, una o más lesiones orales (usualmente al menos aproximadamente 1 cm^{2}), una o más lesiones genitales (usualmente al menos aproximadamente 1 cm^{2}), lesiones de la piel (usualmente al menos aproximadamente 1 cm^{2}) o una infección oportunista asociada con el SIDA.
25C. Un método (por ejemplo, para determinar una actividad biológica del hemihidrato de BrEA o para modular la transcripción de un gen en una célula o en un sistema de transcripción libre de células) que comprende: (a) poner en contacto el hemihidrato de BrEA con una célula o población de células in vitro o in vivo; (b) medir uno o más de (i) un complejo entre un copartícipe de unión y el hemihidrato de BrEA, (ii) proliferación de la célula o población de células, (iii) diferenciación de la célula o población de células, (iv) una actividad de una proteína quinasa C, (v) un nivel de fosforilación de un sustrato de proteína quinasa C, (vi) transcripción de uno o más genes objetivos, (vii) aumento o inhibición de la respuesta celular a los esteroides, por ejemplo, glucocorticoides, (viii) inhibición de la transcripción inducida por esteroides, por ejemplo, glucocorticoides, esteroides sexuales, (ix) inhibición de la transcripción, dirigida por LTR, de retrovirus (por ejemplo. HIV, SIV, FIV o SHIV), o (x) modulación de los números de una población de células inmunitarias en circulación in vivo (por ejemplo, linfocitos circulantes de la sangre periférica en un mamífero tal como un primate o un ser humano); y (c) comparar opcionalmente el resultado obtenido en la etapa (b) con un control apropiado.
26C. El método de la realización 25C, en el que el copartícipe de unión es un receptor de esteroides, un factor de transcripción o un receptor huérfano de la superfamila de las hormonas esteroideas.
27C. El método de la realización 25C, en el que la actividad biológica determinada es una actividad de modulación del hemihidrato de BrEA para la replicación o efectos citopáticos asociados con un retrovirus, un virus de la hepatitis o un parásito protozoario.
28C. El método de la realización 25C, en el que la actividad biológica determinada es una actividad de modulación del hemihidrato de BrEA para la replicación, efectos citopáticos asociados con el retrovirus, el virus de la hepatitis o el parásito protozoario, o la actividad biológica determinada es el metabolismo (ensayo por absorción de ^{3}H-timidina) de una célula o población de células que comprende células NK, fagocitos, monocitos, macrófagos, basófilos, eosinófilos, fibrocitos, células transformadas, células infectadas con virus, células infectadas con bacterias o células infectadas con parásitos.
29C. El método de la realización 25C, en el que el gen objetivo es un gen vírico, un gen bacteriano, un gen de parásitos, un gen asociado con el cáncer.
30C. El método de la realización 29C, en el que el gen del virus es un gen de la polimerasa, un gen de la transcriptasa inversa, un gen de la envoltura, un gen de la proteasa o un gen asociado con la replicación del ácido nucleico viral o un gen estructural viral.
31C. El método de la realización 30C, en el que el gen de la polimerasa codifica una DNA-polimerasa o codifica una RNA-polimerasa.
32C. El método de la realización 30C, en el que el gen de la transcriptasa inversa codifica una transcriptasa inversa de retrovirus humano, de primate, aviar o felino.
33C. Un método que comprende administrar hemihidrato de BrEA a un ser humano o a un primate que tiene una infección retroviral con un recuento de CD4 de 550 o menos.
34C. El método de la realización 33C, en el que el ser humano tiene un recuento de CD4 de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 o de aproximadamente 20 a aproximadamente 80.
35C. El método de la realización 33C, en el que el ser humano tiene un recuento de CD4 de aproximadamente 30 a aproximadamente 150.
36C. El método de la realización 33C, en el que el ser humano tiene un recuento de CD4 de aproximadamente 500 o menos, aproximadamente 450 o menos, aproximadamente 400 o menos, aproximadamente 350 o menos, aproximadamente 300 o menos, aproximadamente 250 o menos, aproximadamente 200 o menos, aproximadamente 150 o menos, aproximadamente 100 o menos, aproximadamente 50 o menos o aproximadamente 25 o menos, o aproximadamente 20 o menos.
37C. El método de cualquiera de las realizaciones 33C-36C, en el que el hemihidrato de BrEA está presente en una composición que comprende uno o más excipientes líquidos no acuosos y menos de aproximadamente 3% v/v de agua o cualquiera de las formulaciones que se describen en la memoria descriptiva o en cualquiera de las realizaciones numeradas anteriores.
38C. El método de cualquiera de las realizaciones 33C-37C, en el que el hemihidrato de BrEA se administra según un protocolo de administración intermitente como se describe en la memoria descriptiva o en cualquiera de las realizaciones numeraradas anteriores.
39C. El método de cualquiera de las realizaciones 30C-45C, en el que el ser humano está coinfectado con virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis B, HSV-1, HSV-2, un parásito de la malaria, un parásito Pneumocystis, o un parásito Cryptosporidium.
40C. El método de la realización 46C, en el que el nivel del HCV se reduce en el ser humano.
41C. Un método que comprende administrar hemihidrato de BrEA a un sujeto, o a una célula(s) del sistema nervioso en cultivo de tejidos, en el que el hemihidrato de BrEA se une a un receptor asociado con una célula(s) del sistema nervioso y (1) produce una respuesta biológica en la célula(s) en el sistema nervioso o en la célula(s) en el cultivo de tejidos y/o (2) produce una respuesta neuronal que se transmite a un sitio(s) o célula(s) distantes, en el que el método se usa opcionalmente para cribar un compuesto o compuestos de la fórmula 1, en particular el hemihidrato de BrEA, en cuanto a su actividad biológica, para tratar una afección patológica (por ejemplo, infección patógena tal como un virus (HIV), un tumor maligno o un trastorno neurológico, por ejemplo, demencia asociada con el Sida, enfermedad de Alzheimer, de Parkinson, esclerosis múltiple) en el sujeto o para determinar la biodisponibilidad o metabolismo del hemihidrato de BrEA para el sujeto o para la célula(s) en el sistema nervioso o en el cultivo de tejidos, en el que el metabolismo se determina opcionalmente comparando el efecto biológico de un compuesto o compuestos de la fórmula 1 con un compuesto control, que puede ser un compuesto diferente de la fórmula 1.
42C. El método de la realización 41C, en el que el receptor asociado con la célula(s) del sistema nervioso es un receptor o receptores de neurotrasmisores (por ejemplo, un receptor de ácido \gamma-aminobutírico tal como un receptor NMDA, tipo A) y/o un receptor de esteroides (por ejemplo, receptor de andrógenos, receptor de estrógenos).
43C. El método de las realizaciones 41C o 42C, en el que la célula(s) del sistema nervioso es una neurona(s) y astrocito(s) y/o una célula(s) glial.
44C. El método de las realizaciones 41C, 42C o 43C, en el que la respuesta biológica en la célula(s) del sistema nervioso o en la célula(s) del cultivo de tejidos es el aumento o reducción de la transcripción de un gen (por ejemplo, un neurotransmisor, vasopresina, una proteína del shock por calor), el aumento o reducción de la secreción de una proteína o proteínas (por ejemplo, vasopresina), la reducción del daño debido a estrés oxidativo, el aumento de la liberación de óxido nítrico y/o el aumento del crecimiento de las neuritas.
45C. El método de cualquiera de las realizaciones 1C-44C, en el que compuesto o compuestos de la fórmula 1 es hemihidrato de BrEA.
46C. Un método para (a) modular la expresión de al menos un antígeno de las células inmunitarias mediante una célula inmunitaria en un sujeto, en el que el antígeno de las células inmunitarias se selecciona entre CD3, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD25, CD38, CD56, CD62L, CD69, CD45RA, CD45RO, CD123, HLA-DR, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF\alpha, IGF_{1} y \gammaIFN, o (b) activar las células T CD8^{+}, o las células T CD8^{-} en un sujeto, donde la activación comprende al menos la mejora temporal de la expresión de CD25 o CD69 por las células T, o (c) aumentar la proporción de las células agresoras activadas por las linfoquinas CD8^{+} o CD8^{-} en las células CD16^{+} de un sujeto (por ejemplo, células CD8^{+}, CD16^{+}, CD38^{+}, o células CD8^{-}, CD16^{+}, CD38^{+}), o (d) aumentar la proporción de (i) células agresoras naturales CD8^{-}, CD16^{+}, (ii) células agresoras naturales CD8^{+}, CD16^{+} o (iii) células CD8^{-}, CD16^{+} que median en la citotoxicidad mediada por las células dependiente de los anticuerpos, o (iv) células CD8^{+}, CD16^{+} que median en la citotoxicidad mediada por las células dependiente de los anticuerpos, o (e) aumentar la proporción de los precursores de las células dendríticas en los leucocitos circulantes de un sujeto (por ejemplo, Lin^{-}, HLA-DR^{+}, CD123^{+} o células Lin^{-}, HLA-DR^{+}, CD11c^{+}) o (f) aumentar la proporción de células T CD45RA^{+} o células T CD45^{+}, R0^{+} en los leucocitos circulantes de un sujeto o (g) cambiar (aumentar o reducir) la proporción de los números relativos de células T CD62L^{+} en los leucocitos circulantes de un sujeto o (h) aumentar la proporción de células T CD8^{+} o CD4^{+} que expresan CD62L en las células T CD8^{+} o CD4^{+} circulantes de un sujeto, o (i) reducir la proporción de células T CD8^{+} o CD4^{+} que expresan CD62L en las células T CD8^{+} o CD4^{+} circulantes de un sujeto, o (j) aumentar la proporción de células HLA-DR^{+}, CD8^{+}, CD38^{+} en los leucocitos circulantes de un sujeto, o (k) reducir el nivel de IL-4 o IL-10 que es expresado o está presente en los leucocitos de un sujeto o en el plasma de un sujeto (o que es expresado una vez que son estimulados los leucocitos del sujeto in vitro), (l) aumentar al menos temporalmente el número de precursores de las células dendríticas que están presentes en los leucocitos de un sujeto o en el plasma de un sujeto, o (m) aumentar la capacidad de las células T CD4^{+} para expresar IL-2, IL-12 o \gammaIFN, comprendiendo el método administrar al sujeto, hemihidrato de BrEA y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
48C. El método de las realizaciones 46C o 47C, en el que se administra al sujeto hemihidrato de BrEA diariamente a lo largo de un periodo de uno a aproximadamente 15 días, por ejemplo, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 días o más.
49C. El método de la realización 48C, en el que la expresión del antígeno de las células inmunitarias se modula de forma detectable durante al menos aproximadamente 4-7 días después de la última administración del hemihidrato de BrEA al sujeto, por ejemplo, durante al menos 4, 5, 6, 7 días o más.
50. El método de las realizaciones 48C o 49C, en el que la expresión del antígeno de las células inmunitarias es detectable al menos durante aproximadamente 8-90 días después de la última administración del hemihidrato de BrEA, por ejemplo, al menos aproximadamente durante 8, 10, 12, 15, 20, 25, 28, 30, 35, 40, 42, 45, 49, 50, 55, 56, 60, 63, 65, 70, 75, 77, 80, 84, 85, 90, 91, 95, 98, 100 días o más.
51C. El método de cualquiera de las realizaciones 48C-51C, en el que el sujeto tiene una afección de inmunodepresión, una infección patógena o afecciones asociadas con una respuesta inmunitaria Th1 deficiente o una respuesta inmunitaria Th2 excesiva.
52C. El método de la realización 51C, en el que la infección patógena es una infección viral, una infección bacteriana, una infección de levaduras, una infección fúngica o, una infección viroide, por ejemplo, en el que la infección patógena es una infección viral tal como una infección de DNA-virus o una infección de RNA-virus (por ejemplo, una infección causada por un hepadnavirus, un parvovirus, un papovirus, un adenovirus, un herpesvirus, un retrovirus, un flavivirus, un togavirus, un rhabdovirus, un picornavirus, un bunyavirus, un reocirus, un orthomyxovirus o un paramyxovirus, tal como un HIV1, HIV2, SIV, SHIV u otro virus descrito aquí o en las referencias citadas).
53C. El método de la realización 52C, en el que el sujeto tiene una afección de inmunodepresión que se asocia con una infección patógena o es causada por ella.
54C. El método de cualquiera de las realizaciones 46C-53C, en el que el sujeto es un mamífero, un ser humano, un primate o un roedor.
55C. El método de cualquiera de las realizaciones 46C-53C, en el que desde aproximadamente 0,05 mg/kg/día hasta aproximadamente 20 mg/kg/día, se administran parenteralmente (por ejemplo, por inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular, o intramedular), tópicamente, oralmente, sublingualmente o bucalmente al sujeto, por ejemplo, aproximadamente 0,1 mg/kg/día, aproximadamente 0,2 mg/kg/día, aproximadamente 0,5 mg/kg/día, aproximadamente 1,0 mg/kg/día, aproximadamente 1,5 mg/kg/día, aproximadamente 2 mg/kg/día, aproximadamente 2,5 mg/kg/día, aproximadamente 3,0 mg/kg/día, aproximadamente 4 mg/kg/día o aproximadamente 6 mg/kg/día, esto es, aproximadamente 0,1-10 mg/kg/día, típicamente aproximadamente 0,2-7 mg/kg/día.
56C. El método de la realización 55C, en el que el sujeto está tomando concurrentemente uno o más segundos agentes terapéuticos para tratar una infección patógena, por ejemplo, una infección viral, tal como una infección de HIV-1, una infección de HIV-2, una infección de HAV, una infección de HBV, una infección de HCV, una infección de virus de Epstein Barr, una infección de HSV-1, una infección de HSV-2, infección de herpesvirus 6 humano, infección de herpesvirus 7 humano, infección de herpesvirus 8 humano, o una infección bacteriana o una infección parasitaria, tal como una infección de malaria, leishmaniasis, cryptosporidiosis, toxoplasmosis, una infección de mycoplasma, una infección de Trichomonas, una infección de Chlamidya, una infección de Pneumocystis, una infección de Salmonella, una infección de Listeria, una infección de Escherichia coli, una infección de Yersinia, una infección de Vibrio, una infección de Pseudomonas, una infección de Mycobacterium, una infección de Haemophilus, una infección de Neisseria, una infección de Staphylococcus o una infección de Streptococcus.
57C. El método de la realización 56C, en el que el segundo o segundos agentes terapéuticos son un inhibidor de la proteasa, un inhibidor de la transcriptasa inversa, un inhibidor de la DNA-polimerasa o RNA-polimerasa viral, bacteriana o parasitaria, un antibiótico antibacteriano o un agente antifúngico, tal como AZT, ddl, ddC, D4T, 3TC, un inhibidor de la fusión viral, (por ejemplo, HIV), hidroxiurea, nelfinavir, saquinavir, ritonavir, indinavir, cloroquina, un análogo de cloroquina, anfotericina B, fluconazol, clotrimazol, isoniazida, dapsona, rifamicina, cicloserina, eritromicina, un antibiótico de tetraciclina, vancomicina, etambutol, pirazinamida, una fluoroquinolona (por ejemplo, ciprofloxacina, norfloxacina), un antibiótico cefalosporínico, un antibiótico \beta-lactámico o un antibiótico aminoglucósido (por ejemplo, estreptomicina, kanamicina, tobramicina).
58C. El método de cualquiera de las realizaciones 46C-57C, en el que el sujeto es un ser humano, un primate, un canino, un felino o un roedor.
59C. Una composición que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de la fórmula 1 moduladora de un subgrupo de células inmunitarias, en particular hemihidrato de BrEA y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
60C. La composición de la realización 59C, en la que el subgrupo de células inmunitarias es (1) células T CD8^{+}, (2) células T CD4^{+}, (3) células agresoras activadas por las linfoquinas CD8^{+}, (4) células agresoras activadas por las linfoquinas CD8^{-}, (5) células agresoras naturales CD8^{-}, CD16^{+}, (6) células agresoras naturales CD8^{+}, CD16^{+}, (7) células CD8^{-}, CD16^{+} que median en la citotoxicidad mediada por las células dependiente de los anticuerpos, (8) células CD8^{+}, CD16^{+} que median en la citotoxicidad mediada por las células dependiente de los anticuerpos, (9) células dendríticas o precursores de las células dendríticas, (10) células T CD45RA^{+}, (11) células T CD45RO^{+}, (12) células T CD45RA^{+}, CD45RO^{+}, (13) células T CD8^{+}, CD62L, (13) células T CD4^{+}, CD62L^{+} o (14) células T HLA-DR^{+}, CD8^{+}, CD38^{+}.
61C. Un método para detectar una respuesta biológica asociada con la administración de hemihidrato de BrEA a un sujeto que comprende (1) obtener una muestra del sujeto, (2) administrar el hemihidrato de BrEA al sujeto para obtener un sujeto tratado, (3) obtener una muestra del sujeto tratado, (4) antes de 24 horas después de obtener la muestra, analizar la muestra para obtener información de control para detectar la respuesta biológica, (5) antes de 24 horas después de obtener la segunda muestra, analizar la segunda muestra en cuanto a presencia o ausencia de respuesta biológica para obtener información experimental y (6) comparar opcionalmente la información de control y la información experimental para detectar la presencia, ausencia, magnitud relativa o magnitud absoluta de la respuesta biológica.
62C. El método de la realización 61C, en el que el hemihidrato de BrEA comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
63C. El método de las realizaciones 61C o 62C, en el que la respuesta biológica asociada con la administración de hemihidrato de BrEA al sujeto es la modulación de la expresión de un antígeno de superficie de las células, un aumento del número absoluto o relativo de células en un subgrupo de células inmunitarias, una disminución del número absoluto o relativo de células en un subgrupo de células inmunitarias o ningún cambio en el número absoluto o relativo de células en un subgrupo de células inmunitarias.
64C. El método de la realización 63C, en el que el subgrupo de células inmunitarias lo forman las células T CD8^{+}, células T CD4^{+}, células agresoras activadas por las linfoquinas CD8^{+}, células agresoras naturales CD8^{-}, CD16^{+}, precursores de las células dendríticas circulantes, células dendríticas circulantes, precursores de las células dendríticas tisulares, células dendríticas tisulares, células agresoras activadas por las linfoquinas CD8^{+}, células agresoras activadas por las linfoquinas CD8^{-}, células agresoras naturales CD8^{-}, CD16^{+}, células agresoras naturales CD8^{+}, CD16^{+}, células CD8^{-}, CD16^{+} que median en la citotoxicidad mediada por las células dependiente de los anticuerpos, células CD8^{+}, CD16^{+} que median en la citotoxicidad mediada por las células dependiente de los anticuerpos, células T CD45RA^{+}, CD45RA^{+}, células T CD45RO^{+}, células T CD45RO^{+}, células T CD8^{+}, CD62L^{+}, células T CD4^{+}, CD62L^{+} o células T HLA-DR^{+}, CD8^{+}, CD38^{+}, monocitos o macrófagos.
65C. El método de la realización 64C, en el que la respuesta biológica es al menos la modulación transitoria de un antígeno de las células inmunitarias o un antígeno de las células inmunitarias accesorias (por ejemplo, una molécula de adhesión en la superficie de células endoteliales o un receptor de citoquinas en la superficie de células T o de 
\hbox{células B).}
66C. El método de la realización 65C, en el que el antígeno de las células inmunitarias es una proteína, glucoproteína o antígeno de superficie de las células o es solamente expresado por las células linfoides (linfocitos o leucocitos o sus precursores, por ejemplo, células T, células B, monocitos, macrófagos, células LAK, células NK, células dendríticas).
67C. El método de la realización 65C, en el que el antígeno de las células inmunitarias es una molécula CD, una interleuquina o una citoquina, seleccionada opcionalmente entre CD16, CD25, CD38, CD62L, CD69, CD45RA, CD45RO, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF\alpha, IGF_{1} y \gammaIFN.
68C. El método de cualquiera de las realizaciones 61C-67C, en el que el sujeto es un ser humano, un primate, un canino, un felino o un roedor.
69C. Un método para alterar el equilibrio Th1-Th2 en un sujeto que comprende administrar una cantidad eficaz de hemihidrato de BrEA a un sujeto, en el que la expresión o secreción de IL-4 o IL-10 por el sujeto se modula de forma detectable.
70C. El método de la realización 30, en el que la expresión o secreción de IL-4 o IL-10 por el sujeto se reduce y el equilibrio Th1-Th2 en las respuestas inmunitarias Th1 del sujeto frente a una infección o afección de inmunodepresión se aumenta de forma detectable.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención y no se pretende que la limiten de ningún modo.
Ejemplo 1 Formulación de BrEA
Se prepararon dos lotes de una formulación no acuosa de BrEA con una concentración de BrEA de 50 mg/ml, con 25% de polietilenglicol 300, 12,5% de alcohol etílico deshidratado, 5% de benzoato de bencilo, y 57,5% de propilenglicol, como sigue. La BrEA se obtuvo de Procyte, Inc. Los excipientes restantes se muestran a continuación.
Excipiente Especificación Proveedor Lote Nº: Concentración en
el producto final
Propilenglicol USP Arco Chemical 57,5% (v: v)
HOC-61220-01104
Polietilenglicol 300 NF Union Carbide 25% (v: v)
695752
Alcohol deshidratado USP McCornick Distilling 12,5% (v: v)
97K10
Benzoato de bencilo USP Spectrum Pharmaceuticals 5% (v: v)
MG025
Se preparó la formulación suspendiendo la BrEA en polietilenglicol 300, y añadiendo secuencialmente propilenglicol, benzoato de bencilo, y alcohol etílico deshidratado para formar una solución, que se diluyó hasta el volumen final deseado con propilenglicol adicional. A continuación se describe el procedimiento.
Se añadió la cantidad calculada de polietilenglicol 300 a un recipiente de preparación. Después, mientras se mezclaba, se añadió la cantidad calculada de BrEA al recipiente, y se mezcló durante al menos 5 minutos para formar un líquido cremoso sin grumos, se añadió propilenglicol al recipiente, y se mezcló durante un mínimo de 5 minutos para formar una suspensión uniforme. Se añadió la cantidad calculada de benzoato de bencilo al recipiente, y se mezcló durante aproximadamente 5 minutos para formar una suspensión líquida translúcida. Se añadió alcohol etílico deshidratado al recipiente, y se mezcló durante aproximadamente 5 minutos para formar una solución incolora, límpida. Se añadió después propilenglicol para conseguir la formulación final deseada, y se mezcló durante aproximadamente 5 minutos. La solución del fármaco se transfirió a un equipo con un dispositivo de dosificación de volumen para administrar 1,2 ml por vial. Bajo presión de nitrógeno, se filtró la solución a través de dos filtros de fluoruro de polivinilideno de 0,2 \mum en serie a viales de vidrio topacio de 2 cc. Se taparon los viales con tapones de butilo revestidos con teflón y se sellaron con cápsula de bordes rizados. Los materiales usados en los viales del producto se listan a continuación.
Material Fuente Código del producto Descripción
Vial Wheaton 2702-B51BA Vial de tubo de vidrio, tipo 1, topacio, 2 ml/13 mm
Tapón Omniflex V9239 FM257/2 Tapón de butilo revestido con teflón, 13 mm
Precinto West 4107 Precinto levantable, 13 mm, mist gray bridge
Las especificaciones del producto se examinaron por uno o más de los siguientes ensayos.
3
Análisis de lotes
4
Ejemplo 2 Estabilidad de la sustancia medicamentosa BrEA y de la formulación de BrEA
Se realiza un estudio de estabilidad acelerada de 6 meses de duración usando BrEA y las formulaciones del ejemplo 1. Se toman muestras en los puntos de tiempo de 1, 2, 3, 4, 5, y 6 meses y se comparan con las especificaciones listadas en el ejemplo 1. La estabilidad a tiempo real (25ºC, 60% de humedad relativa) se realiza usando la formulación de BrEA, lotes 1 y 2, con tiempos de muestreo a los 3, 6, 9, 12, 18, 24, y 36 meses, Después de 3 meses de almacenamiento a 40ºC y 75% de humedad relativa, la potencia valorada de BrEA es al menos 95% del valor teórico. Los resultados del ensayo de estabilidad indican que la BrEA es estable durante al menos 3 meses a temperatura y humedad elevadas en las formulaciones de los lotes 1 y 2.
Ejemplo 3 Protocolo de administración intermitente en primates
Se trataron monos macacos cola de cerdo infectados con retrovirus SHIV_{229} con una formulación de BrEA como se describe en el ejemplo 1. El SHIV_{229} es un retrovirus recombinante que contiene secuencias de HIV y SIV. J. Thompson et al., abstract #75, 16th Annual Symposium on Nonhuman Primate Models for AIDS, October 7-10, 1998, Atlanta, GA, M. Agy et al., abstract #67, 16th Annual Symposium on Nonhuman Primate Models for AIDS, October 7-10, 1998, Atlanta, GA. En los monos se establece una infección agresiva que lleva a síntomas graves de la etapa final de la enfermedad en los animales infectados no tratados en aproximadamente 180-210 días después de la infección. Cuatro macacos cola de cerdo (2/grupo) recibieron inyecciones subcutáneas de la formulación a 1 ó 2 mg/kg de peso corporal durante 10 días consecutivos (Protocolo 1). En la semana 8, 3 de los 4 monos fueron tratados de nuevo y 2 monos sin tratamiento previo fueron tratados con 5 mg/kg de la formulación un día sí y otro no, durante un periodo de 20 días (Protocolo 2). En la semana 19, todos los primates que recibían tratamiento empezaron un régimen de tratamiento de 3 ciclos con 3 mg/kg de la formulación de BrEA una vez al día durante 10 días consecutivos, repetido cada cuatro semanas durante un total de 3 ciclos de tratamiento (Protocolo 3).
Los animales fueron infectados con 1-100 unidades TCID_{50} administradas intravenosamente o intrarrectalmente. Los títulos virales en el primer grupo de animales variaron de 10^{6} a 10^{8}antes de empezar la administración. Todos los animales demostraron un aumento inicial del RNA de SHIV viral en el plasma. Después de un periodo de 2 a 3 semanas, empezaron a bajar los títulos y 3 de los 4 animales presentaron una respuesta a la terapia con títulos virales medios de 0,76 log por debajo de la línea base en las semanas 4 a 5 después de la iniciación del tratamiento. En la semana 8, los títulos en todos los animales habían vuelto a los valores de la línea base. Los niveles de glucosa sanguínea cayeron significativamente, los niveles de fosfatasa alcalina se elevaron y los valores de SGOT/GGT tendieron hacia el extremo superior de lo normal. No se observaron otros cambios significativos en ninguno de los parámetros monitorizados. Los niveles de CD4 en todos los monos permanecieron por debajo de 100 células/mm^{3} al final del primer protocolo.
Tres de los cinco monos del segundo régimen (Protocolo 2) respondieron a la terapia de BrEA con una mayor profundidad y duración de respuesta que la observada en los niveles más bajos de dosis. En los animales que responden, la caída media por debajo de la línea base fue 1,47 log. El animal que no responde en el protocolo 1, respondió cuando se le administró la formulación de BrEA en el protocolo 2. Dos animales no respondieron, uno de cada grupo, uno procedente del tratamiento experimentado y el otro sin tratamiento previo. El tercer régimen (Protocolo 3) está en marcha y los animales están siendo monitorizados.
Los monos de este estudio fueron recuperados de un estudio de infectividad y se esperaba que el primer grupo de cuatro monos del estudio (Protocolo 1) vivieran sólo unas semanas después de la iniciación de estos experimentos ya que ellos empezaron a deteriorarse debido a causas relacionadas con la enfermedad. Un animal murió el día 356 de una reacción tóxica al anestésico usado durante la toma de una muestra de sangre para análisis. En el momento de esta solicitud, los monos restantes que están recibiendo múltiples rondas de terapia parece que están con buena salud clínica. Su supervivencia fue mayor que 380 días desde el tiempo de la infección. Se usó el tratamiento por administración intermitente de la formulación de BrEA. Se infectaron tres monos controles con 1-10.000 unidades TCID_{50} de SHIV_{229} y no recibieron tratamiento. Estos animales se consideran la rama sin tratamiento de un estudio de supervivencia. El tiempo medio hasta la muerte de los macacos cola de cerdo infectados con SHIV_{229} fue 193 días. Los monos que recibieron terapia permanecieron con buena salud clínica durante 350 días con niveles de CD4 inferiores a 20 células/mm^{3} y sin infecciones oportunistas o síntomas relacionados con la enfermedad, aparte de una anemia moderada en un animal.
Estos resultados muestran respuestas terapéuticas completamente inesperadas de los primates infectados con retrovirus SHIV, que es bastante virulento. Los resultados muestran que la mayoría de los sujetos de estos protocolos de tratamiento no solamente tuvieron una supervivencia significativamente prolongada en comparación con los controles no tratados, sino que también los síntomas clínicos asociados con la infección retrovírica mejoraron notablemente, a pesar del hecho de que los recuentos de CD4 permanecieron bajos, esto es menos de aproximadamente 100 células CD4/mm^{3} inicialmente y menos de aproximadamente 20 células CD4/mm^{3} más tarde en los protocolos de tratamiento. Hasta la fecha, resultados tales como éste, esto es, (1) buena salud clínica en una mayoría de sujetos que tienen bajos niveles de CD4 (menos de aproximadamente 100 células/mm^{3}, especialmente menos de aproximadamente 75 células/mm^{3}) y (2) ningún signo clínico de resistencia viral al tratamiento a pesar de la administración intermitente a lo largo de un prolongado periodo de tiempo, no tienen precedentes en los primates, ni en los seres humanos ni en cualquier otro animal. El modelo SHIV_{229} es extremadamente patógeno en los macacos cola de cerdo. Los sucesos que tuvieron lugar en este modelo durante varias semanas hubieran necesitado típicamente varios años en los seres humanos infectados con HIV. El tratamiento de los monos infectados con este virus y tratados con los antirretrovirales usados comúnmente, por ejemplo, AZT, 3TC o un inhibidor de las proteasas, no es de esperar que afecte significativamente al curso de progresión de la enfermedad. El estado clínico de los animales continúa mejorando, por ejemplo, la ganancia de peso es aproximadamente 8-15% por animal. Estos resultados demuestran que el tratamiento que usa el protocolo de administración intermitente es muy efectivo a pesar del aparente deterioro de la inmunidad específica del sujeto, como se demuestra por los bajos recuentos de CD4. Se puede conseguir el aumento de los recuentos de CD4 usando estimuladores inmunitarios tales como IL2 o pueden aumentar los mismos espontáneamente en algunos sujetos tales como los seres humanos, dependiendo del protocolo de tratamiento, la duración de la administración o el estado médico inicial del sujeto. Los efectos antivirales demostrados aquí parece que funcionan al menos en parte aumentando las respuestas inmunitarias del sujeto, por ejemplo, aumentando la respuesta inmunitaria de las células fagocíticas (células NK, monocitos y/o macrófagos), y/o aumentando todas las respuestas inmunitarias especificas residuales, si las hubiera, que el sujeto pueda lograr.
Ejemplo 4 Protocolo de tratamiento a seres humanos
Se realiza un ensayo clínico de escalado de dosis usando una formulación no acuosa que contiene BrEA u otro compuesto o compuestos de la fórmula 1 que se prepara esencialmente como se describe en el ejemplo 1. Los pacientes no han tenido tratamiento previo o han experimentado tratamiento y se examinaron aproximadamente 3-10 pacientes en cada nivel de dosis. La dosis inicial es 25 mg de BrEA o de otro compuesto o compuestos de la fórmula 1 que se administra parenteralmente, por ejemplo, s.c. o i.m. La dosis se administra una vez o una o dos veces al día durante 1-2 días, seguido por no administración durante al menos 7 días (por ejemplo, 7 a 90 días). Las dosis subsiguientes se administran una vez o una al día durante 1-12 días, seguido por no administración durante al menos 7 días (por ejemplo, 7 a 90 días). Otros niveles de dosis ensayados son 20 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg y 300 mg administrando cada dosis una vez al día como una dosis única o como dos, tres o más dosis subdivididas. Se realiza un ensayo de eficacia de la administración usando el mismo protocolo de administración que en el ensayo de escalado de dosis o puede comprender alternativamente administrar una vez o dos veces un día sí y otro no, durante 3-17 días, seguido por no administración durante 7-90 días y después repetir la administración una vez o dos veces un día sí y otro no, durante 3-17 días. Se repite este protocolo indefinidamente (por ejemplo, al menos aproximadamente 3-18 meses) usando la dosis óptima obtenida en el ensayo de escalado de dosis, por ejemplo, aproximadamente 10-200 mg/día de un compuesto de la fórmula 1.
Ejemplo 5 Estudios farmacológicos en animales
Se realizaron estudios no clínicos usando una formulación oral de BrEA y una subcutánea. Se administró oralmente a ratas ^{14}C-BrEA solubilizada en diferentes excipientes para determinar los niveles de fármaco en la sangre y diferentes tejidos. Los resultados de estos estudios farmacocinéticos preliminares indicaron que la absorción de BrEA por administración oral es aproximadamente 0,1 a 15%, con al menos aproximadamente 80% excretado en las heces.
La formulación no acuosa de BrEA del ejemplo 1 se administró como una única dosis subcutánea a conejos. Más del 90% del fármaco dejó el sitio de la inyección antes de las 24 horas de administración, y alcanzó una concentración plasmática máxima de aproximadamente 1,2% de la dosis inyectada a las ocho a doce horas post-administración. La semi-vida circulante del fármaco en el plasma fue de aproximadamente doce horas. El fármaco no se acumuló de forma extensa en ningún órgano importante y fue principalmente excretado en la orina.
Se administró subcutáneamente a ratas BrEA usando la formulación del ejemplo 1. Aproximadamente 90% del fármaco dejó el sitio de la inyección antes de las 24 horas de administración, y alcanzó una concentración plasmática máxima de aproximadamente 1,2% de la dosis inyectada una hora post-administración. La eliminación del plasma fue bifásica, con semividas de aproximadamente 12 y 72 horas respectivamente. La BrEA no se acumuló de forma extensa en ningún órgano importante y fue principalmente excretada en las heces. Se realiza también un estudio en monos Rhesus con la formulación del ejemplo 1 para determinar la farmacocinética en plasma.
Se realizó un análisis farmacocinético de ^{14}C-BrEA en plasma en dos monos Rhesus hembras. Se usó un compuesto marcado con trazas (16\alpha-bromo-3-beta-hidroxi-5\alpha-[4-^{14}C]-androstan-17-ona [50 mCi/mmol]) a una dosis de 1 mg/kg como una inyección subcutánea en la región escapular usando un volumen de inyección de 1 ml/kg. La BrEA se formuló con 25% de polietilenglicol 300, 12,5% de etanol absoluto, 5% de benzoato de bencilo y cantidad suficiente de propilenglicol. Se inyectaron 40 \muCi por animal. Se tomaron muestras de sangre a las 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, y 24 horas para determinación de la actividad de ^{14}C. La radiactividad en plasma aumentó hasta casi el pico de concentración en 8 horas y permaneció en aproximadamente el mismo nivel hasta el final del estudio durante 24 horas.
Se realizó un análisis farmacocinético de ^{14}C-BrEA en conejos blancos de Nueva Zelanda. Se administraron veinte \muCi de (16\alpha-bromo-3-beta-hidroxi-5\alpha-[4-^{14}C]-androstan-17-ona [50 mCi/mmol]) más 1 mg/kg de BrEA sin marcar, a cada uno de tres conejos blancos de Nueva Zelanda como una inyección subcutánea en la región escapular usando un volumen de inyección de 1 ml/kg. El fármaco se formuló con 25% de polietilenglicol 300, 12,5% de etanol absoluto, 5% de benzoato de bencilo y cantidad suficiente de propilenglicol. Se tomaron muestras de sangre a las 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 y 24 horas de los tres animales y a las 48 horas de dos de los animales. Veinticuatro y 48 horas después de la administración, se sacrificaron uno y dos animales respectivamente y se recogieron los siguientes órganos/tejidos: cerebro, corazón, riñones, hígado, pulmones, músculo esquelético, bazo, y el músculo y la piel del sitio de la inyección. En adición a los órganos y tejidos, se recogieron la orina y heces así como los lavados de las jaulas. La BrEA no se acumuló en grado significativo en ninguno de los órganos listados antes. De todos los órganos, la mayor masa de fármaco fue observada en el hígado, conteniendo aproximadamente 0,8% y 0,12% de la dosis inyectada a las 24 y 48 horas respectivamente (promedio 0,13%).
Porcentaje de fármaco en los órganos (conejos)
5
Los porcentajes medios de la dosis administrada en la sangre entera se calcularon multiplicando la concentración de fármaco en la sangre entera por el volumen supuesto de sangre en los animales, 200 ml. La cantidad de fármaco en la sangre alcanza un máximo en alrededor de 8 horas, y una pequeña cantidad era todavía evidente a las 48 horas. La cantidad de BrEA en la sangre entera fue consistentemente más baja que en el plasma, lo que sugiere que el fármaco no es absorbido en gran medida por los eritrocitos.
Se realizaron experimentos in vivo para determinar la biodisponibilidad de BrEA por la administración oral usando diferentes formulaciones. La BrEA (1) se solubilizó en aceite de soja, aceite con vitamina E, una mezcla de vitamina E y cremoforo o (2) se micronizó la BrEA y se combinó con o sin un tensioactivo. Estas formulaciones se describen a continuación. Las formulaciones se administraron oralmente a ratas y se determinaron los niveles de BrEA en la sangre, hígado, bazo, riñones y en los nódulos linfáticos. En los estudios que usan BrEA micronizada, se evaluó el cerebro en cuanto a absorción del fármaco. Se recogieron la orina y heces de veinticuatro horas cuando se solubilizó la BrEA en vitamina E y aceite de soja y vitamina E mezclada con cremoforo. Los datos de estos estudios indican que la BrEA entra en los vasos linfáticos pero es rápidamente eliminada de los otros tejidos. La cantidad de radiactividad ^{14}C recuperada en las heces 24 horas después de la administración fue 78 a 83%. Seguidamente se proporciona un breve resumen de cada experimento y los resultados se proporcionan en la Tabla 6.
Se administró intragástricamente a ratas BrEA (5 mg en 1,0 ml de aceite de soja o aceite de vitamina E) suplementada con BrEA marcada con ^{14}C. Se facilitó la solubilización de BrEA en la vitamina E o aceite de soja con 50 ml de etanol. Se analizaron los animales (3/punto de tiempo) a las 1,5, 3, 5,5, y 24 horas después de la administración y se midió la radiactividad ^{14}C en la sangre, hígado, bazo, riñones, nódulos linfáticos y en la orina y heces de 24 horas. Los resultados indican que basándose en la radiactividad ^{14}C, algo de la BrEA es absorbido en el sistema linfático. La absorción es mayor con aceite de soja que con aceite de vitamina E en la sangre, hígado y nódulos linfáticos.
Se administró intragástricamente a ratas BrEA (5 mg en 1,0 ml de vitamina E y cremoforo) suplementada con BrEA marcada con ^{14}C. Se facilitó la solubilización de BrEA en la mezcla de vitamina E-cremoforo añadiendo 60 \mul de etanol. Se sacrificaron los animales (4/punto de tiempo) a las 2, 3, 5,5, y 24 horas y se midió la radiactividad de ^{14}C en la sangre, hígado, bazo, riñones, nódulos linfáticos y en la orina y heces de 24 horas. Los resultados indican que una pequeña porción del fármaco es absorbida en el sistema linfático. Basándose en los valores en plasma, hígado y nódulos linfáticos, parece que la absorción del fármaco es más baja comparada con aceite de soja o vitamina E y su presencia en los tejidos es más persistente.
Se administró oralmente a ratas, en grupos de tres machos, 1,0 ml de NaCl al 0,9% que contenía 10 o 32 mg de BrEA micronizada con un tensioactivo, Synperonic PE/F 127 (2,5% p/p). Se examinaron las ratas a las 1,5, 5 y 24 horas después de la administración. Se analizaron la sangre, hígado, bazo, riñones, nódulos linfáticos y cerebro en cuanto a radiactividad de ^{14}C. Los niveles de BrEA en la sangre, en comparación con los de los experimentos con BrEA en aceite de vitamina E y soja fueron más altos, 0,3% a las 1,5 horas, y aumentaron después de 5 horas hasta 0,8% y 0,9% de las dosis de 10 y 32 mg, respectivamente. Adicionalmente, los valores en los nódulos linfáticos fueron similares a los medidos a las 1,5 horas y los niveles se mantuvieron a las 5 horas (5,3 y 5,0%) y 24 horas (3,7 y 3,1%) para las dosis de 10 y 32 mg, respectivamente (véase la Tabla 6).
En un experimento repetido de dosificación, se administró intragástricamente a las ratas 1,0 ml de NaCl al 0,9% que contenía 2 mg de BrEA micronizada con Synperonic PE/F 127 (2,5% p/p) cada 6 a 16 horas. Se sacrificaron las ratas (3/punto de tiempo) a las 40, 72, 84, 90 y 96 horas después de la primera administración. Se analizaron la sangre, hígado, bazo, riñones y nódulos linfáticos en cuanto a radiactividad de ^{14}C. Se observaron niveles más altos en la sangre, hígado, bazo, riñones y nódulos linfáticos en este experimento con relación a estudios previos.
Se administró oralmente a ratas, en grupos de tres machos, 1,0 ml de NaCl al 0,9% que contenía 2, 4 o 10 mg de BrEA micronizada sin un tensioactivo. Se sacrificaron las ratas a las 1,5, 5 y 24 horas después de la administración y se analizaron la sangre, hígado, bazo, riñones, nódulos linfáticos y cerebro en cuanto a radiactividad de ^{14}C. La concentración de BrEA micronizada sin un tensioactivo en los tejidos observados fue más baja que la de la BrEA más un tensioactivo.
Ejemplo 6 Inhibición de parásitos in vitro
Se usaron placas de microtitulación para ensayos antimalaria in vitro. Se prepararon las concentraciones de los fármacos como pMol/pocillo según los procedimientos estándar de la Organización Mundial de la Salud (WHO, 1990). Se disolvió el compuesto de ensayo en DMSO al 15% en RPMI-1640 estéril. Se usaron aislados de la especie Plasmodium tanto sensibles a la cloroquina (por ejemplo, WS/97) como resistentes (por ejemplo, MN/97).
El ensayo de inhibición de esquizontes se realizó como sigue. Se predosificaron las placas de microtitulación con diferentes concentraciones del compuesto de ensayo. Se dispensaron 50 \mul de suspensión de eritrocitos parasitados en RPMI-1640 (0,2 ml de eritrocitos + 0,3 ml de suero + 4-5 ml de RPMI-1640) a pocillos de microtitulación que contenían diferentes concentraciones de fármaco. Se hicieron lecturas por triplicado para cada concentración.
Se realizó un ensayo de incorporación de ^{3}H-hipoxantina como sigue. Se llevó a cabo el ensayo según el procedimiento de Desjardins et al., 1979. Después de 30 horas de cultivo a 37 grados centígrados, las mismas placas de microtitulación de los ensayos de inhibición de esquizontes con otros pocillos triplicados se pulsaron con ^{3}H-hipoxantina durante la noche. Las suspensiones de células se lavaron dos veces sobre un filtro de fibra de vidrio de millipore con el aparato de filtración Millipore. Los discos del filtro se contaron en cuanto a DPM mediante un contador de \beta-centelleo Beckman LS6000. Se midió la actividad del fármaco representando DPM frente a la concentración del fármaco.
Actividad de los compuestos frente a P. falciparum T996/66 sensible a la cloroquina, in vitro
Concentración (\muM) DHEA* BrEA* Éster metílico del Éster metílico del
ácido etiénico* ácido etiánico*
30 65,6 98 60 61,5
15 44 60,1 45,7 47,4
7,5 38,3 50 40,9 45,3
3,25 37,2 43,7 46 41,4
1,875 23,2 40,9 41 43,4
0,938 37,2 31,8 43,3 47,1
IC_{50} 19,0 \muM 7,5 \muM 19,5 \muM 17,5 \muM
* = % de inhibición
Concentración (nM) Cloroquina % de inhibición Cloroquina
200 95,9
100 94,6
50 97,3
25 94,5
(Continuación)
Concentración (nM) Cloroquina % de inhibición Cloroquina
12,5 86,8
6,25 27,2
IC_{50} 9,0 nM
La actividad de 16\alpha-cloroepiandrosterona y 16\alpha-bromodeshidroepiandrosterona frente a P. falciparum T996.86 sensible a la cloroquina y P. falciparum KI resistente a la cloroquina, in vitro, se muestra a continuación.
T996.86 KI
16-cloroepiandrosterona IC_{50} -9,25 pg/ml \sim9,25 \mug/ml
DHEA-Br IC_{50} -25,0 pg/ml \sim25,0 \mug/ml
Otros compuestos de la fórmula 1, por ejemplo, cualquier compuesto en el grupo de compuestos de 1 hasta 25-6 se usan de manera similar para inhibir los parásitos Plasmodium.
Ejemplo 7 Protocolo de 4 días in vivo para la inhibición de Plasmodium berghel
El ensayo de depresión de 4 días ha sido usado ampliamente y se puede realizar en un periodo de 1 semana. El ensayo consiste en la inoculación de eritrocitos parasitados el primer día del experimento (D_{0}), seguido por una inyección del compuesto de ensayo que se administra también el 2º, 3º y 4º días del protocolo. El día 5º, se preparan extensiones de sangre y se evalúa la actividad antimalaria o bien calculando la parasitemia, o bien puntuando los números de parásitos sobre una escala predeterminada (esto es, 1-5). Peters (Ann. Trop. Med. Parasitol. 64: 25-40, 1980) describió un procedimiento básico usando este ensayo de 4 días.
El protocolo se resume a continuación. Se usaron cinco ratones TO hembras por grupo de ensayo. Se recogieron los parásitos P. berghei HP15 ANKA por punción cardiaca usando una jeringa heparinizada de un ratón donador que tenía un 30 + % de parasitemia. Se diluyó la sangre con agente de dilución (50% de HIFCS + 50% de PBS estéril) hasta una concentración final de 1% de parasitemia o 1 x 10^{7} de eritrocitos infectados por 0,2 ml de la suspensión infectante. Cada ratón fue inoculado intravenosamente, lo que produjo una tasa de infección más uniforme que la administración intraperitoneal de 0,2 ml de la suspensión infectante. Se prepararon los compuestos de ensayo a dosis de 100 mg/kg en 16,7% de DMSO + 83,3% de Celacol. Las formulaciones esteroideas se administraron peritonealmente 2 horas después de la inoculación del parásito. Se administraron los compuestos una vez al día empezando el D_{0}, y se continuó en los tres días siguientes. Se prepararon extensiones de sangre de la sangre de la cola el día después de la última administración del compuesto y se fijó la sangre con metanol al 100% y se tiñó con Giemsa al 10%. Se puntuaron las parasitemias sobre una escala de 0-5, en la que 5 es igual al control.
Se dispensó un inóculo con 1% de parasitemia, 1 x 10^{7} eritrocitos/ml, 0,2 ml por ratón (ratones cepa TO, hembras), por inyección intravenosa. La administración del fármaco comenzó 2 horas después de la inoculación del Día 1 y continuó durante 3 días. Los resultados se muestran a continuación procedentes de extensiones de sangre de los 20 ratones el Día 5 cuando se evaluaron las parasitemias.
Compuesto Tratamiento Puntuación de la parasitemia (0-5)
BrEA 100 mg/kg x 4 días i.p.* 1
Ácido etiénico 100 mg/kg x 4 días i.p. 2
DHEA 100 mg/kg x 4 días i.p. 1
Cloroquina 3 mg/kg x 4 días i.p. 1
Control N/A 5
* i.p. = inyección intraperitoneal
En un protocolo similar, se inoculan los ratones con una solución que contiene 1 x 10^{7} eritrocitos/ml mediante inyección i.v. Dos horas más tarde, se administra el fármaco por inyección i.v. La BrEA u otro compuesto de la fórmula 1 se dan (0,2 ml i.v. o s.c.) una vez al día durante 4 días. Se usan cortes de la cola para obtener sangre después del estudio. Se usaron ratones infectados con P. berghei para obtener células infectadas. Se recogen los parásitos de la sangre cardiaca del ratón, y los ratones no infectados se infectan usando 0,2 ml de sangre con 14% de parasitemia por ratón i.v. Dos horas más tarde, se administra la primera dosis de BrEA (100 mg/kg i.v. o s.c.) a los animales infectados. La formulación de BrEA era una solución estéril que contiene 15 mg/ml de BrEA en hidroxipropil-\beta-ciclodextrina al 45% y solución salina al 0,9%. En los días 1, 2, 3 y 4 después de la infección de los animales, se administra BrEA (100 mg/kg i.v. o s.c.) a los animales infectados. No aparecieron muertes en el grupo que recibió BrEA i.v. En el día 30, pero todos los animales controles murieron antes del día 10. Todos los animales tratados con BrEA por administración s.c. murieron antes del día 11.
Ejemplo 8 Estudio in vitro e in vivo en ratas
En el protocolo in vitro el nivel del parásito (Plasmodium falciparum, cepa WT sensible a la cloroquina y cepa Dd2 resistente a la cloroquina) se ajusta al 1% y el hematocrito se ajusta al 7% con medio. Usando una placa de 96 pocillos, se añaden a cada pocillo 50 \mul de parásito y 100 \mul de fármaco mezclados con medio y el procedimiento se realiza por triplicado. Se coloca la placa en una cámara que contiene una mezcla gaseosa fisiológica y se incuba a 37ºC. La mezcla de medio/fármaco se cambia a las 24, 48 y 72 horas. El día 5 (96 horas) se preparan portaobjetos de cada pocillo, se tiñen con Gemsia y se cuentan 500 eritrocitos para cada portaobjetos. Se hace el promedio de los triplicados y se registran los datos en porcentaje de inhibición.
En el protocolo in vivo, las ratas Lewis que pesan 80-85 gramos recibieron una inyección i.p. estandarizada de parásito (Plasmodium berghei). Después, las ratas fueron inyectadas intravenosamente 2 horas más tarde con uno de los tratamientos descritos en la tabla que sigue, se volvieron a sus jaulas, se alimentaron con alimento estándar de laboratorio y se les dejó acceso libre al agua. Se pesaron los animales y se les trató de nuevo a las 24, 48 y 72 horas después del primer tratamiento y de nuevo volvieron a sus jaulas y se les dejó acceso libre al alimento y al agua. Se pesaron los animales de nuevo y después se desangraron usando una aguja de calibre 26 en los días 5, 11 y 28 post inoculación. Se midieron los hemocritos y se prepararon frotis de sangre para cada rata. Los frotis de sangre se tiñeron entonces usando Gemsia y se determinaron los niveles de parasitemia (definida como el porcentaje de eritrocitos con parásitos). Se volvieron de nuevo los animales a sus jaulas y se observaron dos veces al día para buscar evidencia de enfermedad progresiva, definida como apatía y/o reacción adversa al fármaco, que se define como una pérdida de 20% del peso corporal original, durante un total de 28 días. Si se observa una enfermedad progresiva o una reacción al fármaco, los animales son sacrificados.
La formulación de BrEA era una solución estéril que contiene 15 mg/ml de BrEA en hidroxipropil-\beta-ciclodextrina al 45% y solución salina al 0,9%.
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4
Control, sol. salina Control, cloroquina BrEA dosis baja BrEA dosis alta
0,9% 40 mg/kg 30 mg/kg 60 mg/kg
Las inyecciones intravenosas se administraron los días 0, 1, 2 y 3 y los resultados se muestran a continuación. Los resultados demostraron que el tratamiento in vivo con una formulación que comprende BrEA redujo la parasitemia a un nivel comparable al visto con la cloroquina ("Clq") control. Los resultados se resumen a continuación.
% de parasitemia en eritrocitos
Día 4
Control, sol salina 16%
Control, cloroquina 10%
BrEA dosis baja 9%
BrEA dosis alta 7%
% de parasitemia en eritrocitos
Día 11
Control, sol salina 36%
Control, cloroquina 16%
BrEA dosis baja 12%
BrEA dosis alta 11%
Ejemplo 9 Estudio clínico humano - infección parasitaria
La respuesta al tratamiento con el fármaco se graduó según los criterios de la Organización Mundial de la Salud (WHO 1973) en los pacientes infectados. La evaluación de la respuesta terapéutica se determinó usando los tiempos de aclaramiento de los parásitos y de la fiebre. El aclaramiento de los parásitos se expresó como tres índices; (i) el tiempo para que el recuento de parásitos caiga un 50% del valor del pretratamiento (línea base) (PC_{50}), (ii) el tiempo para que el recuento de parásitos caiga un 90% del valor de la línea base (PC_{90}), (iii) el tiempo para que el recuento de parásitos caiga por debajo del nivel de detección microscópica (tiempo de aclaramiento del parásito PCT) (N. J. White and S. Krishna Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 83: 767-777, 1989; White et al., J. Infect. Dis. 165: 599-600, 1992; White et al., J. Infect. Dis. 166: 1195-1196, 1992). El tiempo de aclaramiento de la fiebre fue definido como el tiempo desde la administración del fármaco hasta que la temperatura oral o rectal cayó hasta 37,2ºC o por debajo de 37,2ºC y permaneció así durante al menos 48 horas.
Se obtuvo sangre venosa (5 ml) de dos pacientes antes del tratamiento y a las 4, 6, 8, 12, 20, 24, 30 y 36 horas después del tratamiento o a intervalos de 4 ó 6 horas después del tratamiento hasta que hubo completo aclaramiento de la parasitemia periférica. Se recogió la sangre asépticamente y se transfirió a jeringas de 10 ml que contienen 2 ml de citrato ácido de dextrosa (ACD) para cultivo in vitro. Antes de la incubación, se separó el plasma de los eritrocitos y los eritrocitos se lavaron dos veces. Se cultivaron los parásitos por modificación de las técnicas estándar de cultivo in vitro (W. Trager and J. B. Jensen, Science 193: 673-675, 1976; A. M. Oduola et al., J. Protozool. 39: 605-608, 1992). Se dispensaron las muestras a tubos de centrífuga estériles antes de los 10 min de la recolección y se centrifugaron. Se almacenó el plasma sobrenadantemientras que las células sedimentadas se lavaron dos veces con medio de cultivo (medio de lavado, medio RPMI-640, que contiene tampón HEPES 25 mM y 25 mmol/l de NaOH). Se separó la capa leucocítica por aspiración con vacío. Se hizo una dilución 1:10 veces para cada muestra de sangre con medio de lavado completo [CMP (medio de lavado suplementado con 10% de plasma humano)]. Se transfirió un mililitro de cada una de las muestras a 2 pocillos de una placa de microcultivo de 24 pocillos. Se incubaron los cultivos a 37ºC en una atmósfera de una premezcla de gas con 5% de CO_{2}, 5% de O_{2} y 90% de N_{2}. Se cambió el medio de cultivo diariamente y se prepararon frotis de sangre finos para microscopía a las 24 y 48 horas después de comienzo del cultivo. Las muestras de cultivo se diluyeron con eritrocitos Rh-positivos tipo A no parasitados y lavados si la proporción de eritrocitos parasitados era mayor que 2%.
Microscopía
Durante el estudio in vivo, se fijaron extensiones de sangre finas y gruesas con metanol deshidratado (100%) y calor, respectivamente, y se tiñeron con Giemsa al 10% durante 20 minutos. Se cuantificó la parasitemia en las extensiones finas contando 2000 eritrocitos en campos contiguos claros y encontrando la proporción de los que estaban parasitados. En las extensiones gruesas, se cuantificó la parasitemia contando los parásitos de los leucocitos. Se declaró negativa una extensión si no se encontraron parásitos después de examinar al microscopio 200 campos de un frotis grueso. Durante el estudio in vitro y ex vivo, los frotis finos y gruesos del pretratamiento se clasificaron en cuanto a las fases de anillo por el método de Jiang modificado por Li et al., (J. B. Liang et al., Lancet 2 (8293): 285-288, 1982; K. Silamut and N. J. White Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 87: 436-443, 1993; X. L. Li et al., Chi. J. Parasitol. Dis. 12: 296, 1994). Se contaron aproximadamente 5000 eritrocitos en campos contiguos claros 24 y 48 horas después de la incubación de la sangre obtenida en cada punto de tiempo y se clasificaron en cuanto a madurez en anillos diminutos, anillos pequeños, anillos grandes, trofozoites y esquizontes. La viabilidad funcional se estimó como el porcentaje de formas de anillos asexuales capaces de madurar hasta trofozoites o esquizontes pigmentados después de 24-48 horas de cultivo in vitro (W. M. Watkins et al., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 87: 75-78, 1983).
Cálculo de parámetros
Los pacientes presentaban malaria de P. falciparum pura no cerebral con síntomas agudos graves. Tenían intolerancia a los fluidos orales, temperaturas corporales superiores a 39ºC, más de 5000 parásitos por microlitro de sangre, parasitemia asexual y dieron una prueba negativa de fármacos antimalaria en orina. Se les administraron intravenosamente cada cuatro horas 25 ml de BrEA suspendida en \beta-ciclodextrina al 45% en solución salina estéril a una concentración de 25 mg/ml. Se continuó este régimen durante cuatro días. La cuantificación de la parasitemia y el examen clínico se realizaron una vez cada 6 horas durante las primeras 72 horas, seguido por la evaluación diaria de los parámetros hasta el día 7 (168 horas) y después el día 14.
Las extensiones de sangre fueron teñidas con Giemsa y la cuantificación de la parasitemia se hizo en las extensiones gruesas contando 2000 parásitos de los leucocitos, y en las extensiones finas encontrando la proporción de eritrocitos infectados. La respuesta al tratamiento con el fármaco se puntuó según los criterios de la WHO. La evaluación de la respuesta terapéutica se realizó usando los tiempos de aclaramiento de los parásitos y de la fiebre. El aclaramiento de los parásitos se expresó como tres índices: el tiempo para que el recuento de parásitos cayera un 50% del valor del pre-tratamiento (línea base) (PC_{50}); para que cayera un 90% del valor de la línea base (PC_{90}); y para que cayera por debajo del nivel de detección microscópica (tiempo de aclaramiento del parásito) PCT.
El tiempo de aclaramiento de la fiebre fue definido como el tiempo desde la administración del fármaco hasta que la temperatura oral o rectal cayó hasta 37,2ºC o por debajo de 37,2ºC y permaneció así durante más de 48 horas. La tasa de aclaramiento de los parásitos el día 14 fue el 100%. La respuesta clínica incluyó por tanto un efecto sobre la parasitemia en ambos pacientes y la mejoría de uno o más síntomas de la infección.
Ensayo de BrEA intravenosa en pacientes con malaria
Paciente A Paciente B
Tiempo de aclaramiento de la fiebre 12 horas 18 horas
Tiempos de aclaramiento de los parásitos
Tiempo hasta 50% de aclaramiento 18 horas 24 horas
Tiempo hasta 90% de aclaramiento 24 horas 48 horas
Tiempo hasta 100% de aclaramiento 48 horas 64 horas
Ejemplo 10 Estudios celulares in vitro
Se examinó el efecto de la BrEA sobre la actividad de comunicación de la pentosa-fosfato (PPS) en los eritrocitos humanos normales, usando células enteras. Puesto que la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa ("G6PD") es la enzima limitante de la PPS, se considera que la medida del flujo vía PPS refleja mejor la actividad de G6PD en la célula entera en comparación con la actividad de G6PD medida en un lisado celular. La actividad de G6PD medida en un lisado celular es típicamente aproximadamente 1100 veces más alta que el flujo vía PPS en los eritrocitos enteros (RBC) no estimulados restantes (actividad de G6PD en el lisado celular: 165; flujo vía PPS 0,142 micromoles/hora/ml de RBC). El flujo vía PPS y la actividad de G6PD en los RBC enteros depende de una serie de factores (la concentración de NADPH, NAD, y ATP, y el pH intracelular), que se mantienen constantes si se realiza la medida en el lisado y pueden variar en los RBC enteros. Los niveles de actividad de G6PD en las células están considerablemente por debajo de las necesidades basales normales y la inhibición de la actividad global de G6PD podría no tener ninguna consecuencia o consecuencias menores sobre el flujo vía PPS en la célula entera. Por ejemplo, los RBC con el mutante G6PD mediterráneo con aproximadamente 1-3 por ciento de actividad residual comparados con los individuos normales no tienen ningún deterioro en el flujo vía PPS basal, pero muestran deterioro en el flujo cuando el flujo a través de PPS es estimulado por la adición de azul de metileno. Se realizaron una serie de experimentos usando cantidades variables de BrEA y se midió el flujo vía PPS en RBC basales no estimulados y en RBC estimulados con azul de metileno (MB).
Los datos que siguen muestran el flujo vía PPS (micromoles/hora/ml de RBC) en los RBC normales no estimulados basales y en los RBC normales estimulados con MB. Diferentes concentraciones de BrEA (0,3, 3,5 y 7 micromolar, final) fueron añadidas a las suspensiones de RBC lavados suspendidos en RPMI, pH 7,4 con 10% de hematocrito, con lo que el flujo vía PPS fue medido inmediatamente sin incubación posterior y sin lavados posteriores. Se observó una menor inhibición del flujo vía PPS estimulado con MB con BrEA a concentración 7 \muM.
Flujo vía PPS
Control, RBC no estimulados 230
Control con DMSO, RBC no estimulados 270
Control con DMSO, RBC estimulados con MB 5090
BrEA 0,3 \muM, no estimulado 250
BrEA 0,3 \muM, estimulado con MB 5000
BrEA 3,5 \muM, no estimulado 270
BrEA 3,5 \muM, estimulado con MB 4950
BrEA 7 \muM, no estimulado 295
BrEA 7 \muM, estimulado con MB 4660
Los datos que siguen muestran los valores medios de 3 experimentos, en los que el flujo vía PPS basal, no estimulado y estimulado con MB (micromoles/hora/ml de RBC) se midió en RBC normales. En estos experimentos, diferentes concentraciones de BrEA (\sim0,8, 8 y 80 micromolar, final) fueron añadidas a las suspensiones de RBC lavados suspendidos en RPMI, pH 7,4 con 10% de hematocrito. Después de una incubación de 90 minutos a 37ºC con y sin BrEA se midió el flujo vía PPS. Los resultados mostraron un inhibición dosis-dependiente del flujo vía PPS estimulado con MB. La inhibición fue del 10% a la concentración 8 micromolar (p = 0,006 vs control+DMSO) y 25% a la concentración 80 micromolar (p = 0,002 vs control+DMSO).
\newpage
Flujo vía PPS
Control, RBC no estimulados 430
Control, RBC estimulados con MB 5410
Control con DMSO, RBC no estimulados 480
Control con DMSO, RBC estimulados con MB 4890
BrEA 0,8 \muM, no estimulado 410
BrEA 0,8 \muM, estimulado con MB 4930
BrEA 8 \muM, no estimulado 450
BrEA 8 \muM, estimulado con MB 4430
BrEA 80 \muM, no estimulado 450
BrEA 80 \muM, estimulado con MB 3660
Ejemplo 11 Inhibición del crecimiento de los parásitos
Se demostró el efecto de Epi (16\alpha-bromoepiandrosterona) sobre el crecimiento de los parásitos (Plasmodium falciparum). EPI fue activo a una concentración 1 \muM.
Parasitemia después del tratamiento
Tiempo 0 24 horas 48 horas 72 horas
Control + DMSO 5% 5,40% 3,10% 5,20%
Epi 1 \muM 5% 5,70% 5,50% 1,60%
Epi 10 \muM 5% 5,60% 0,90% 0
Epi 100 \muM 5% 0 0 0
Epi 500 \muM 5% 0 0 0
Control + DMSO 2% 8,80% 11% 8%
Epi 50 \muM 2% 9,90% 9,20% 8,30%
Epi 1 \muM 2% 5,80% 6,10% 2,10%
Epi 2,5 \muM 2% 7,30% 5,80% 3,20%
Epi 5 \muM 2% 5,40% 6% 1,80%
Epi 10 \muM 2% 4,20% 3% 0
Epi 50 \muM 2% 0 0 0
Se determinaron las parasitemias por métodos estándar (inspección microscópica de al menos 500 células, teñidas con Diff-Quick™ (Baxter). Se cultivaron parásitos en condiciones estándar en RPMI-1640 suplementado con Herpes/Glucosa (10 mM), glutamina (0,3 g/litro) y 10% de plasma humano. El hematocrito fue 1%.
Ejemplo 12 Estimulación de la fagocitosis
Se examina la capacidad de BrEA para influir sobre la fagocitosis de los RBC infectados con el parásito Plasmodium usando monocitos humanos adherentes. El nivel de parasitemia es aproximadamente 8-10% y los monocitos humanos se obtienen de las capas leucocíticas de la sangre como sigue. Las células mononucleares de la sangre periférica se separan de las capas leucocíticas pobres en plaquetas recientemente recogidas eliminadas de las muestras de sangre de donantes adultos sanos de ambos sexos. Las células separadas se lavan una vez con PBS templado suplementado con glucosa 10 mM (PBS-g) y resuspendido a 5 x 10^{6} células/ml en medio RPMI 1640 enfriado en hielo suplementado con NaHCO_{3} 23 mM y Hepes 25 mM, pH 7,4 (RMBH). Se añadieron a las células Dynabeads M450 Pan B y Pan T (Dynal) en una proporción 4:1 durante 20 minutos a 4ºC. Se separan los linfocitos B y los linfocitos T como se especifica por el fabricante. Los monocitos restantes se lavan 2 veces en RMBH, se resuspenden en medio de cultivo celular AIM-V (Gibco) a 1 x 10^{6} células/ml. Se recoge la capa de monocitos, se lava con PBS-G a 37ºC y se resuspende en medio AIM-V a 1 x 10^{6} células/ml. Las células purificadas son > 90% monocitos como se evalúa por la expresión de CD14.
La fagocitosis de los RBC parasitados (PE) opsonizados se determina como sigue. La fagocitosis de los PE opsonizados del suero fresco se inicia mezclando 10 PE/monocito. Las suspensiones se centrifugan brevemente (150 x g durante 5 segundos a temperatura ambiente) para mejorar el contacto entre los PE y los monocitos. Para evitar la aglomeración de los monocitos después de la centrifugación y durante todo el periodo de incubación, se mantienen las células en suspensión a 5 x 10^{6} células/5 ml de medio AIM-V en placas con fondo de teflón de 6 cm de diámetro (Heraeus) en un incubador humidificado (95% de aire, 5% de CO_{2}) a 37ºC. Como promedio, al menos 90% de los monocitos fagocitan a los PE, como se evalúa por inspección microscópica. Las células control se mantienen en condiciones similares sin fagocitosis. La evaluación cuantitativa de la fagocitosis se realiza mediante un método de luminiscencia previamente descrito (E. Schwarzer, et al., Br. J. Haematol. 1994 88: 740-745).
Los tratamientos de los eritrocitos y los cultivos de parásitos son como sigue. Se usa sangre fresca (Rh+) para aislar los eritrocitos (RBC). Los RBC lavados se infectan con las fases esquizonte/trofozoite del parásito (cepa Palo Alto, libre de micoplasmas). Se aíslan los parásitos de una fase específica mediante el método de Percoll-manitol. Brevemente, los RBC (SPE) normales parasitados con la fase de esquizonte separados en gradiente de Percoll-manitol (parasitemia > 95% de SPE) se mezclan con los RBC suspendidos en medio de crecimiento (medio RPMI 1640 conteniendo 25 mmol/l de Hepes, 20 mmol/l de glucosa, 2 mmol/l de glutamina, 24 mmol/l de NaHCO_{3}, 32 mmol/l de gentamicina y 10% de suero humano AB o A, pH 7,30) para empezar cultivos sincronizados a los valores seleccionados de hematocrito. La parasitemia del inóculo se ajusta al 20% de SPE normal para el aislamiento de los RBC parasitados con anillos (RPE) y al 5% de SPE normal para el aislamiento de los RBC parasitados con la fase de trofozoite (TPE). A las 14-18 horas después del inóculo, los parásitos están en la fase de anillos en el primer ciclo; a las 34-33 horas, los parásitos están en la fase de trofozoite en el primer ciclo; y a las 40-44 horas después del inóculo, los parásitos están en la fase de esquizonte en el primer ciclo. Se separan RPE, TPE y SPE sobre gradientes de Percoll-manitol. La parasitemia es usualmente 8-10% de RPE, y > 95% de TPE. Los RBC parasitados y no parasitados se cuentan electrónicamente. Para evaluar la parasitemia total y la contribución relativa de RPE, TPE y SPE, se preparan extensiones a partir de los cultivos a los tiempos indicados, se tiñen con el tinte de parásitos Diff-Quik™ y se examinan microscópicamente alrededor de 400-1000 células.
Se examina el efecto de un compuesto de la fórmula 1 tal como BrEA en los BRC parasitados usando diferentes concentraciones del compuesto, por ejemplo, BrEA, por ejemplo, 0,5 \muM, 1 \muM, 10 \muM, 25 \muM, y 50 \muM. Los RBC parasitados con trofozoites, los RBC parasitados con esquizontes o los RBC parasitados con anillos se examinan como se ha descrito.
Ejemplo 13 Ensayo clínico de la malaria humana
Se establece el protocolo del ensayo clínico que incorpora aproximadamente 15-20 pacientes. Para un ensayo de fase I, I/II o II, los pacientes están ligeramente infectados con uno o más parásitos Plasmodium y tienen síntomas suaves (menos de aproximadamente 8-10% de parasitemia de RBC). Antes del tratamiento, opcionalmente se hacen pruebas a los pacientes en cuanto a infección por HIV, HCV, TB y Cryptosporidium. Los pacientes con una o más co-infecciones reciben cuidado estándar para la co-infección. Se hospitaliza a los pacientes para el tratamiento durante una semana. Cuando los pacientes son tratados, se administran dos o más grupos de dosis, por ejemplo, 25, 50, 100 mg/día de BrEA administrada parenteralmente, por ejemplo, por inyección intramuscular, subcutánea o intravenosa, en los días 3, 4, o 5 de la semana. La administración se hace en días consecutivos o en un programa intermitente, por ejemplo, 2, 3 ó 4 dosis con una dosis administrada un día sí y otro no.
La formulación que contiene BrEA es como se describe aquí, por ejemplo, la formulación del ejemplo 1 o una formulación que comprende 100 mg/ml de BrEA, \sim30% v/v de PEG300, 30% v/v de propilenglicol, 30% v/v de benzoato de bencilo y 2% v/v de alcohol bencílico. En los días 5-7 si se observa menos de aproximadamente 50% de reducción de la parasitemia, se proporciona a los pacientes el cuidado estándar de la malaria (mefloquina). Durante la semana de tratamiento y durante 1, 2, 3 o más semanas después, se toman muestras de sangre periódicamente para evaluación de la parasitemia, farmacocinética, citoquinas plasmáticas (por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-10, IGF_{1}, \gammaIFN, GM-CSF) y citoquinas intracelulares (por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-10, IGF_{1}, \gammaIFN, GM-CSF). Los pacientes se vuelven a tratar opcionalmente en aproximadamente 2 a 12 semanas después de la administración inicial, usando el mismo o similar protocolo que se usa en el protocolo de administración inicial.
Se realiza como ejemplo, un estudio abierto de una formulación de BrEA administrado intramuscularmente a pacientes semi-inmunes con malaria no complicada. La formulación comprende 100 mg/ml de BrEA, \sim30% v/v de PEG300, 30% v/v de propilenglicol, 30% v/v de benzoato de bencilo y 2% v/v de alcohol bencílico. Los pacientes permanecerán en el hospital como pacientes internos durante los 7 primeros días del estudio. Los pacientes recibirán una administración intramuscular diaria de 50 mg o 100 mg de BrEA durante 5 días consecutivos. La evaluación diaria durante los 7 primeros días, y hasta el día 14 del estudio, puede incluir la evaluación de la parasitemia (dos veces al día), análisis químicos, hematología y niveles de fármaco (evaluación farmacocinética). Si después del día 7 del estudio, bajan los niveles de parasitemia desde el valor del momento de la selección y el paciente es clínicamente estable, se puede hacer seguimiento diario del paciente en cuanto a la parasitemia (dos veces al día), durante hasta 7 días adicionales como pacientes internos en el hospital. Si un paciente llega a ser clínicamente inestable en cualquier momento durante el estudio, el paciente será discontinuado y podrá recibir el tratamiento estándar de la malaria. Los pacientes deficientes en la enzima glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa pueden ser excluidos, porque la BrEA inhibe la enzima. Otras consideraciones que pueden llevar a la exclusión de pacientes del ensayo incluyen los pacientes diagnosticados de cualquiera de las situaciones siguientes: anemia grave (hematocrito < 2% o hemoglobina < 7 g/dl); insuficiencia renal o hepática por historia y/o resultados de laboratorio, distrés respiratorio como se evidencia por disnea o frecuencia respiratoria \geq 30 por minuto; hipotensión (presión sanguínea sistólica < 90 mm de Hg); taquicardia (frecuencia cardiaca > 130 latidos/minuto); mujeres embarazadas o en periodo de lactancia; enfermedad co-mórbida significativamente activa (diagnosis médica aguda que requiere terapia específica; pacientes con parasitemia > 10% en frotis periférico.
Se pueden recoger muestras de sangre de cada paciente para futura evaluación clínica tal como la determinación de los marcadores de activación o los análisis inmunológicos (por ejemplo, valoraciones de las interleuquinas intracelulares o extracelulares IL-1\beta, IL-2, IL-4, IL-6, L-10 y IL-12, \gammaIFN, y TNF\alpha).
Ejemplo 14 Formulación en liposomas
Los liposomas adecuados para la administración parenteral se preparan como sigue. Se disuelven 400 mg de fosfatidil-colina y 80 mg de BrEA en cloroformo y metanol (2:1 v/v) y se seca la solución por evaporación rotatoria a presión reducida. La película resultante se rehidrata añadiendo 8,0 ml de una solución de NaCl al 0, 9% p/v y agitando la solución. Se miden opcionalmente los tamaños de los liposomas, por ejemplo, por espectroscopía de correlación fotónica (Malvern Zetasizer 3000 o equivalente). Los liposomas se clasifican opcionalmente, por ejemplo, por sonicación para reducir el tamaño medio por debajo de 400 mn, o por filtración usando filtros adecuados. Se usan procedimientos similares para preparar preparaciones de liposomas que contienen un compuesto de la fórmula 1 a aproximadamente 15-100 mg/ml. La formulación se usa para administrar el compuesto oral o parenteralmente (i.m., s.c., i.v.).
Ejemplo 15 Formulación en ciclodextrinas
Una formulación en ciclodextrina que contiene BrEA se prepara como sigue. Se añaden 45 g de hidroxipropil-\beta-ciclodextrina a 1 litro de solución salina fisiológica estéril y se agita la mezcla durante aproximadamente 4-24 horas, hasta que se obtiene una solución transparente. Se añade BrEA no micronizada para dar una concentración de 20 mg/ml y se agita la mezcla hasta que se obtiene una solución transparente. Se esteriliza la solución por filtración usando un filtro de tamaño de poro de 0,2 \mum y se dispensa en envases estériles. Se usan procedimientos similares para preparar las formulaciones en ciclodextrinas que contienen un compuesto de la fórmula 1 a aproximadamente 15-100 mg/ml. La formulación se usa para administrar el compuesto oral o parenteralmente (i.m., s.c., i.v.) o por vía bucal o sublingual.
Ejemplo 16 Formulación en supositorios
Una formulación en supositorios que contiene un compuesto de la fórmula 1 tal como BrEA se prepara como sigue. Se mide suficiente BrEA no micronizada para obtener un número deseado de unidades que comprenden cada una 500 mg de BrEA. Se mezcla la BrEA con una base de supositorios, por ejemplo, triglicéridos de aceite vegetal comestible, para proporcionar las características deseadas, por ejemplo, un contenido de ácido graso libre de aproximadamente 0,1% p/v, un índice de saponificación de aproximadamente 242, un índice de yodo de aproximadamente 3, humedad de aproximadamente 0,1% p/p, y un punto de fusión en capilar cerrado de aproximadamente 35ºC.
Ejemplo 17 Ensayo clínico de HCV en humanos
Una paciente mujer infectada con HIV y HCV recibió i.v. BrEA durante 3 días consecutivos usando una formulación que contenía 20 mg/ml de BrEA en hidroxipropil-\beta-ciclodextrina al 45% y solución salina. Se administraron a la paciente cuatro ml de la formulación (80 mg de BrEA) cada 4 horas durante los 3 días del periodo de tratamiento. El nivel de HCV de la paciente previo a la administración fue 6,5 Log_{10} tal como se midió por PCR y el nivel de HCV fue 6,2 Log_{10} el primer día de administración, 5,5 Log_{10} el tercer día de administración y 4,9 Log_{10} tres días después de la administración de la última dosis. Los niveles de RNA-HIV como se midieron por PCR fueron 5,2 Log_{10} (pre-administración), 5,8 Log_{10} (primer día), 5,9 Log_{10} (tercer día) y 5,4 Log_{10} (día 6). Los recuentos de células NK (células/mm^{3}) fueron 28, 41 y 38 en la pre-administración, día 0 y día 3.
Ejemplo 18 Formulación
Se preparó una formulación que comprende 100 mg/ml de BrEA, \sim30% v/v de PEG300, 30% v/v de propilenglicol, 30% v/v de benzoato de bencilo y 2% v/v de alcohol bencílico, suspendiendo la BrEA en polietilenglicol 300, y añadiendo secuencialmente propilenglicol y benzoato de bencilo, para formar una solución, que se diluyó hasta el volumen final deseado con propilenglicol adicional. A continuación se describe el procedimiento.
Se añadió la cantidad calculada de polietilenglicol 300 a un recipiente de preparación. Después, mientras se mezclaba, se añadió la cantidad calculada de BrEA al recipiente, y se mezcló durante al menos 5 minutos para formar un líquido cremoso sin grumos, se añadió propilenglicol al recipiente, y se mezcló durante un mínimo de 5 minutos para formar una suspensión uniforme. Se añade la cantidad calculada de benzoato de bencilo al recipiente, y se mezcla durante aproximadamente 5 minutos para formar una suspensión líquida translúcida. Se añadió después propilenglicol para conseguir la formulación final deseada, y se mezcló durante aproximadamente 5 minutos. La solución del fármaco se transfirió a un equipo con un dispositivo de dispensación de volumen para administrar 1,2 ml por vial. Bajo presión de nitrógeno, se filtró la solución a través de dos filtros de fluoruro de polivinilideno de 0,2 \mum en serie a viales de vidrio topacio de 2 cc. Se taparon los viales con tapones de butilo revestidos con teflón y se con cápsula de bordes rizados.
Ejemplo 19 Protocolo clínico de infección oportunista
Estudio doble ciego, aleatorio, controlado con placebo, de 100 mg de BrEA administrada intramuscularmente a pacientes infectados con HIV, en su última etapa, con riesgo de infecciones oportunistas (Ois). Se identificaron para inclusión potencial en el protocolo, pacientes HIV-1-seropositivos con un recuento de células CD4 \leq 100 células/mm^{3}, HIV-RNA a 1 x 10^{6} copias/ml y una puntuación de Karnofsky de al menos 60. Los pacientes de todos los protocolos clínicos deben entender y firmar un consentimiento informado escrito antes de las evaluaciones para selección.
Se usa la BrEA de la formulación del ejemplo 16. La administración del fármaco o vehículo se hará durante 3 a 5 días consecutivos seguida por aproximadamente 35-90 días de observación, por ejemplo, 37 días de observación. Un ejemplo de régimen de tratamiento comprende 5 días de tratamiento seguido por 37 días de observación, que se repite durante un total de 7 ciclos a lo largo de 42 semanas. Se monitorizará la tasa de incidencia de infecciones oportunistas así como el tiempo para la resolución o control de las infecciones oportunistas y se comparará con el grupo control con placebo. Los pacientes deben ser monitorizados mensualmente durante 1 ó 2 meses después de completar el estudio para seguimiento. Se monitoriza la incidencia de infecciones oportunistas o de enfermedades asociadas con el SIDA, por ejemplo, tuberculosis (TB), candidiasis, pneumonía pneumocística (PCP), diarrea o sarcoma de Kaposi, y puede ser evaluada como criterio de valoración del protocolo. Si se diagnostica un paciente con una o más de las infecciones oportunistas especificadas en el protocolo, se deberá iniciar un régimen de tratamiento del protocolo para las infecciones oportunistas, por ejemplo, fluconazol para candidiasis o para PCP, trimetoprim y sulfametoxazol o Dapsona. Con otros compuestos de la fórmula 1 se usa un protocolo similar.
Ejemplo 20 Protocolo clínico para HIV humano
Los pacientes infectados con HIV reciben una inyección i.m. de 25-200 mg de BrEA, usando una formulación que contiene 100 mg/ml de BrEA, \sim30% v/v de PEG300, 30% v/v de propilenglicol, 30% v/v de benzoato de bencilo y 2% v/v de alcohol bencílico. Los pacientes reciben la dosis una vez por día durante 5 días consecutivos seguido por un periodo de aproximadamente 28 días o más en los que no hay tratamiento con BrEA. Se proporcionó a los pacientes un ciclo más de 5 días consecutivos de administración con BrEA seguido por un periodo de no administración de al menos aproximadamente 28 días. Se proporcionaron hasta 5 ciclos de tratamientos de 5 días, seguidos por al menos 28 días sin administración. Las respuestas inmunológicas se analizaron después usando muestras de sangre o plasma de los pacientes mediante citometría de flujo y otros métodos analíticos conocidos. Los subgrupos de células inmunitarias u otros marcadores medidos se analizaron antes de 24 horas de obtener la muestra de cada paciente. Se prepararon anticuerpos marcados, por ejemplo, anticuerpos del antígeno CD conjugados con colorantes fluorescentes (FITC, ficoeritrina, aloficocianina o PerCP), y se usaron esencialmente según protocolos estándar utilizando reactivos comercialmente disponibles, véase, por ejemplo, Pharmigen, 1998 Research Products Catalog, protocolos técnicos en las páginas 732-774, moléculas de la superficie de células humanas en las páginas 182-295, y moléculas de la superficie de células de ratón, rata y hámster en las páginas 2-173, y reactivos de citoquina y quimioquina en las páginas 344-489.
El protocolo clínico es un estudio de fase I/II, abierto, aleatorio de 3 niveles de dosis de BrEA administrada intramuscularmente a pacientes infectados con HIV que no han recibido tratamiento previo. Habrá 3 grupos de tratamiento y cada grupo constará de 2 partes (partes A y B). Los pacientes recibirán la misma dosis de BrEA a lo largo de las partes A y B del estudio. Si un paciente experimenta una respuesta antiviral (un título de HIV-RNA como mínimo 0,5 log por debajo de la media de los valores obtenidos durante la selección y de los valores de la línea base) o se beneficia (cualquiera reducción de los títulos de HIV-RNA por debajo de la media de los valores obtenidos durante la selección y de los valores de la línea base) del tratamiento recibido durante las partes A y B del estudio, el paciente puede continuar recibiendo los ciclos de tratamiento de 5 días de la formulación de BrEA del ejemplo 2 en la dosis recibida inicialmente. Este ciclo de tratamiento puede ser repetido hasta seis veces.
Se debe hacer seguimiento de todos los pacientes en cuanto a los niveles de HIV-RNA (Chiron Quantiplex™, ensayo de DNA de cadena ramificada), subgrupos de células T [CD4/CD8], HIV-DNA proviral (PBMC), interleuquinas [IL-2, 4, 6, 8, 10 y 12] (suero), \gammaIFN (suero), factor de crecimiento tipo insulina [IGF-1] (suero) y factor de la necrosis tumoral [TNF] (suero) a lo largo del estudio. El co-cultivo cuantitativo de PBMC (células) se puede realizar en un subgrupo de muestras del paciente. Se pueden llevar a cabo análisis de marcadores de activación adicionales. Se planifica el análisis de paneles químicos y hematológicos y análisis de orina. Adicionalmente, los pacientes co-infectados con virus de la hepatitis B y/o C, malaria o tuberculosis pueden ser monitorizados regularmente en cuanto a títulos virales o cultivos microbiológicos. Se recogerán muestras en serie de sangre y orina de un subgrupo de pacientes para determinación farmacocinética después de la primera dosis en la parte A y de la última dosis en la parte B.
El tratamiento puede constar de más de una inyección intramuscular. Las inyecciones intramusculares se pueden administrar en diferentes localizaciones (esto es, parte superior de los brazos derecho o izquierdo o muslos o nalgas) y se puede administrar a los pacientes una sola dosis de 100 mg o 200 mg de BrEA en dos o más subdosis de menos de 100 mg (por ejemplo, 50 mg).
Hay dos segmentos de este estudio, segmento 1 y 2. Ambos segmentos constan de dos partes, parte A y parte B. Los 12 primeros pacientes incluidos en el estudio serán asignados al diseño descrito en el segmento 1. Los 24 pacientes restantes serán asignados al segmento 2 del estudio. Más adelante se proporciona el diseño de cada segmento.
La parte A consistirá en una única inyección intramuscular de una formulación de BrEA. El día en que el paciente recibe la inyección será el día 1 del estudio. A los pacientes que participan en el subgrupo de farmacocinética, se les recogerá muestras en serie de sangre y orina, empezando el día 1 del estudio. La parte B del estudio empieza el día 8 del estudio (segmento 1) o el día 15 del estudio (segmento 2).
La parte B del segmento 1 consta de 5 inyecciones intramusculares en días consecutivos de la formulación del ejemplo 1 con la misma dosis que la recibida en la parte A del estudio. El día que el paciente recibe la primera dosis será aproximadamente el día 8-12 del estudio. El ciclo de tratamiento de 5 días va seguido por un periodo de observación de aproximadamente 28 días (o aproximadamente 32 días desde una primera dosis el día 8 hasta la iniciación de un segundo ciclo de tratamiento el día 40). Durante el periodo de observación, se les pedirá a los pacientes que vuelvan a la clínica semanalmente para diferentes pruebas. A los pacientes que participan en el subgrupo de farmacocinética, se les recogerá muestras en serie de sangre y orina, empezando aproximadamente el día 12-17 del estudio.
La parte B del segmento 2 consta de 5 inyecciones intramusculares en días consecutivos de la formulación del ejemplo 2 con la misma dosis que la recibida en la parte A del estudio. El día que el paciente recibe la primera dosis será aproximadamente el día 15 del estudio. El ciclo de tratamiento de 5 días va seguido por un periodo de observación de aproximadamente 45 días (o aproximadamente 49 días desde la primera dosis el día 15 del estudio hasta la iniciación del siguiente ciclo de tratamiento el día 64 del estudio). Durante el periodo de observación, se les pedirá a los pacientes que vuelvan a la clínica semanalmente para diferentes pruebas. A los pacientes que participan en el subgrupo de farmacocinética, se les recogerá muestras en serie de sangre y orina, empezando aproximadamente el día 19 del estudio.
La aleatorización en este estudio de escalado de dosis es como sigue. Cuando 4 de los 12 pacientes por grupo de tratamiento han completado 5 días de administración diaria en la parte B y no han experimentado ningún suceso adverso grave relacionado con el fármaco, tendrá lugar la inscripción para el siguiente nivel de dosis más alto, después de consultas entre el patrocinador y los investigadores.
Los cuatro primeros pacientes inscritos serán asignados al grupo de dosis de 50 mg. Si no experimentan sucesos adversos graves relacionados con el fármaco, los 8 sujetos siguientes serán distribuidos aleatoriamente o bien al nivel de dosis de 50 mg o bien al de 100 mg en una forma 1:1. Si no ocurren sucesos adversos graves relacionados con el fármaco en los pacientes que reciben 100 mg, entonces los 24 pacientes siguientes serán distribuidos aleatoriamente o bien al grupo de dosis de 50, 100 o al grupo de dosis de 200 en una forma 1:2:3.
Si 4 de los 12 pacientes en un grupo de dosis experimentan un suceso grave relacionado con el fármaco (grado III o IV), se inscribirán 2 pacientes adicionales en el mismo nivel de dosis. Adicionalmente, la inscripción del paciente en el siguiente nivel de dosis, si se inscribe, quedará temporalmente en espera hasta que se evalúe la seguridad. Si uno de los 2 pacientes adicionales experimenta un suceso grave relacionado con el fármaco, la administración en este nivel de dosis será discontinuada. Después de consulta con el patrocinador y los investigadores, se pueden inscribir pacientes adicionales a una dosis entre el grupo del límite de dosis y el siguiente grupo de dosis más bajo para determinar la dosis máxima tolerada (MTD). La inscripción de pacientes adicionales a un nivel de dosis específico será determinada en una enmienda del protocolo.
Los resultados indican que una dosis única de 50 mg o 100 mg de BrEA aumenta los números de células T CD8^{+} y CD4^{+} activadas (por ejemplo, células CD8^{+}, CD69^{+}, CD25^{+}) que estaban circulando en la sangre del paciente. También, aumentaron los números circulantes de células precursoras de las dendríticas, células NK, células LAK y células que median las funciones de ADCC (citotoxicidad mediada por las células dependiente de los anticuerpos, mediada por los subgrupos de células inmunitarias CD8^{+}, CD16^{-}). Se observaron usualmente incrementos adicionales en la administración durante 5 días consecutivos.
Algunos de los resultados se resumen a continuación. Los ciclos 1, 2 y 3 se refieren a cada régimen de tratamiento de 5 días consecutivos de una inyección diaria con BrEA (50 o 100 mg de BrEA por inyección). En los diagramas que siguen, HE2000 se refiere a la formulación que contiene 100 mg/ml de BrEA, \sim30% v/v de PEG300, 30% v/v de propilenglicol, 30% v/v de benzoato de bencilo y 2% v/v de alcohol bencílico. Los datos que se muestran a continuación se obtuvieron de muestras de sangre de pacientes en la línea base (el día en que se inició la administración) y a diferentes tiempos después de que los pacientes recibieron al menos una dosis de BrEA. Los resultados mostraron incrementos significativos en las poblaciones de células inmunitarias y en los perfiles de expresión de citoquinas asociada con las respuestas Th1. Los pacientes de este protocolo tenían inicialmente recuentos de CD4 de al menos 200 por mm^{3} y una carga de HIV-RNA en el suero de 5.000 a 1 x 10^{6} copias de RNA/ml. Después de la administración de un ciclo de BrEA (5 inyecciones i.m. en días consecutivos), todos los pacientes mostraron aumentos en los niveles de células inmunitarias que incluyen células T CD8 activadas (por ejemplo, CD8^{+}, CD69^{+}, CD25^{+}), células LAK (por ejemplo, CD8^{+}, CD16^{+}, CD38^{+}), células NK (por ejemplo, CD8^{-}, CD16^{+}), células ADCC (por ejemplo, CD8-^{+}, CD16^{+}) y células dendríticas (Lin^{-}, HLA-DR^{+}, CD11c^{+} o Lin^{-}, HLA-DR^{+}, CD123^{+}). La producción media de IL-10 CD4 cayó desde una mediana de 66% a 4% de las células, mientras que las IFN\gamma CD4 fueron desde una mediana de 8% a 63%, llevando a una tendencia de Th2 a Th1 en la producción de citoquinas.
En los diagramas que siguen los datos de la línea base se indican por "BL" o por "pre".
Aumento de inmunofenotipos después de terapia con BrEA
Fenotipo Línea base^{a} Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3
CD8+CD69+CD25- 18 54 56 75
n= (13) (13) (9) (4)
^{b}p= <0,001 <0,001 0,04
CD8+CD16+CD38+ 8 27 28 25
n= (10) (10) (4) (4)
p= <0,001 0,047 0,02
CD8-CD16+ 53 253 288 249
n= (12) (12) (4) (2)
p= <0,001 0,02 0,04
Lin-HLA-DR+
CD11c+/CD123+ 3,2 17,7 11,4^{c} 14,7^{c}
n= (10) (10) (5) (4)
p= <0,001 0,02 0,04
IL2+CD4^{d} 3,14^{e} 29,25 31,42 13,59
n= 13 13 3 4
p= <0,001 0,09 0,04
IL10+CD4^{d} 66 20,9 8,9 15,3
n= 13 13 5 3
p= 0,005 0,005 0,03
Respuesta Th1^{d} 17 66 64 53
n= (13) (13) (5) (5)
p= 0,001 0,033 0,025
^{a} valores de la mediana de células/\mul
^{b}prueba de la t para datos emparejados
^{c} prueba no disponible en la línea base para los pacientes que reciben el segundo y tercer ciclo, el valor en
la línea base del inicio del 2º ciclo = 6,4
^{d}% de CD4
^{e} valores en la línea base del día 8 (precediendo al primer tratamiento de cinco días)
6
7
8
9
Ejemplo 21 Tratamiento de los síntomas de la infección por HIV
A dos pacientes infectados con HIV con diarrea crónica se les administró BrEA como sigue. Se les administró subcutáneamente una formulación de BrEA (40 mg/ml de BrEA, 25% v/v de PEG300, 12,5% v/v de etanol, 5% v/v de benzoato de bencilo, \sim57,5% v/v de propilenglicol). Los pacientes recibieron 60 mg de BrEA en 1,5 ml diariamente durante 10 días. Durante el periodo de administración, cesó la diarrea. Una vez que terminó el periodo de administración de 10 días, volvió la diarrea. En otros pacientes que recibieron BrEA oral, la diarrea también remitió.
Ejemplo 22 Formulación subcutánea
Se preparó una formulación de BrEA esencialmente como se describe aquí. La formulación contenía 50 mg/ml de BrEA, 40% v/v de PEG300, 2% v/v de alcohol bencílico, 2% v/v de benzoato de bencilo y \sim66% v/v de propilenglicol (c.s.). La formulación es particularmente adecuada para la administración subcutánea del compuesto.
Ejemplo 23 Preparación del hemihidrato de BrEA - procedimiento 1
Se preparó BrEA cruda por bromación de epiandrosterona, seguido por la cristalización en metanol. Se preparó el hemihidrato disolviendo 25 g de BrEA cruda en 75 ml de etanol a reflujo con agitación moderado. A la solución de BrEA se añadieron lentamente 12,5 ml de agua mientras se mantiene la solución a reflujo con agitación. Se mantuvo la agitación de la solución y se dejó después que la solución se enfriara hasta aproximadamente 20-25ºC y se mantuvo a aproximadamente 20-25ºC durante aproximadamente 15 minutos para obtener una suspensión de cristales de hemihidrato de BrEA. Se recogieron los cristales por filtración, se lavaron con una solución de 25 ml de agua: etanol (5:1 v/v) a aproximadamente 20-25ºC y después secaron en vacío durante aproximadamente 13 horas a 50-60ºC hasta que el peso del producto fue constante. Los cristales tenían principalmente forma de barras y agujas, con pequeñas cantidades de otras formas tales como pastillas.
El procedimiento dio 22,5 g de hemihidrato de BrEA (rendimiento 90%) con un contenido en agua de 2,6% p/p por análisis de KF, una pureza de 100% por análisis de área por HPLC, un espectro FTIR con picos de carbonilo a 1741 cm^{-1} y 1752 cm^{-1}. El barrido FTIR de la BrEA anhidra muestra un único pico de carbonilo a 1749 cm^{-1}. El barrido por DSC mostró tres endotermos. Uno tenía un pico ancho poco agudo con comienzo a aproximadamente 109-110ºC y finalización a aproximadamente 150ºC. Este pico ancho por DSC es consistente con la pérdida de agua desde los cristales de hemihidrato de BrEA cuando aumenta la temperatura de la muestra. El segundo endotermo a aproximadamente 83-100ºC es consistente con la pérdida de la pequeña cantidad de etanol residual de la muestra. Un barrido por DSC de la BrEA anhidra no tiene el endotermo ancho que se observa con el hemihidrato. También es consistente con la pérdida de agua desde el hemihidrato a lo largo del intervalo de 100-150ºC un tercer pico endotermo agudo en el DSC del hemihidrato a aproximadamente 163-164ºC, que es el punto de fusión de la BrEA anhidra. El FTIR se obtuvo usando el método de la USP <197>, en el que la muestra del hemihidrato de BrEA se preparó en KBr. El termograma por DSC se obtuvo barriendo de 25ºC a 250ºC con una velocidad de calentamiento de 10ºC/minuto.
Ejemplo 24 Preparación del hemihidrato de BrEA - procedimiento 2
Se preparó el hemihidrato disolviendo 10 g de BrEA cruda en 40 ml de acetona a reflujo con agitación moderada. A la solución de BrEA se añadieron lentamente 4,0 ml de agua mientras se mantiene la solución a reflujo con agitación. Se mantuvo la agitación de la solución y se dejó después que la solución se enfriara hasta aproximadamente 20-25ºC y se mantuvo a aproximadamente 20-25ºC durante aproximadamente 15 minutos para obtener una suspensión de cristales de hemihidrato de BrEA. Se recogieron los cristales por filtración, se lavaron con una solución de 6,0 ml de agua:acetona (10:1 v/v) a aproximadamente 20-25ºC y después se secaron en vacío (aproximadamente 13-15 horas) a 50-60ºC hasta que el peso del producto fue constante. El procedimiento dio 7,0 g de hemihidrato de BrEA (rendimiento 70%) con un contenido en agua de 2,6% p/p por análisis de KF, y un espectro FTIR con picos de carbonilo a 1741 cm^{-1} y 1752 cm^{-1}.
Ejemplo 25 Análisis del tamaño de partícula del hemihidrato de BrEA
Los cristales de hemihidrato de BrEA se prepararon esencialmente como se ha descrito aquí y se determinó su tamaño usando un aparato medidor de partículas (instrumentos Malvern). El modelo de análisis usado fue para una muestra polidispersa y un tipo de distribución de volumen. El análisis demostró un intervalo de tamaños de diámetro de los cristales desde aproximadamente 0,5 \mum hasta aproximadamente 880 \mum. Aproximadamente el 90% de los cristales tenía un diámetro desde aproximadamente 20 \mum hasta aproximadamente 220 \mum y la mayoría de los cristales tenían un diámetro de aproximadamente 30-200 \mum. El diámetro medio de los cristales fue aproximadamente 93 \mum. La superficie específica de los cristales fue aproximadamente 0,25 m^{2}/g.

Claims (56)

1. Hemihidrato de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona.
2. El hemihidrato de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona según la reivindicación 1, caracterizado por uno o más de (1) comienzo de un endotermo de absorción como se mide por análisis de calorimetría diferencial de barrido de aproximadamente 100ºC \pm 2ºC, (2) dos bandas de absorción de carbonilo a aproximadamente 1741 cm^{-1} y 1750 cm^{-1} como se mide por espectroscopia de absorción en el infrarrojo por transformada de Fourier, (3) un contenido de agua de aproximadamente 2,4% p/p a aproximadamente 2,6% p/p como se mide por titulación por Karl Fisher y (4) 1, 2, 3 o más de los picos de XRD en los valores Theta de aproximadamente 17,8º \pm 0,2º, 23,8º \pm 0,2º, 24,2º \pm 0,2º, 26,9º - 27,2 º \pm 0,2º, 28,6 º \pm 0,2º, 30,1 º \pm 0,2º y 32,2 \pm 0,2º Theta, donde los picos de XRD se determinan usando radiación Cu-K\alpha.
3. El hemihidrato de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona de la reivindicación 1, caracterizado porque está molido hasta un tamaño medio de partícula de 0,01-200 \mum.
4. El hemihidrato de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona de la reivindicación 1, caracterizado porque está molido hasta un tamaño medio de partícula de 0,1-10 \mum.
5. Una composición que comprende hemihidrato de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona y un excipiente adecuado para uso farmacéutico humano o para uso veterinario.
6. La composición de la reivindicación 5 en la forma de una dosis unitaria que comprende 3 a 1000 mg de hemihidrato de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona.
7. La composición de las reivindicaciones 5 ó 6 en la forma de un comprimido, cápsula, comprimido para chupar, solución, suspensión, gel o coloide.
8. La composición de las reivindicaciones 5 ó 6 en la forma de un comprimido, cápsula, comprimido para chupar, solución, suspensión, gel o coloide, en la que la dosis unitaria es adecuada para administración oral, parenteral, tópica, bucal o sublingual a un sujeto.
9. Un método para preparar el hemihidrato de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona que comprende poner agua en contacto con una solución que comprende 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona y un alcohol C_{1}-C_{6}.
10. El método de la reivindicación 9, en el que el alcohol C_{1}-C_{6} es etanol.
11. El método de la reivindicación 9, en el que la solución comprende 5-25% p/p de agua, 30-45% p/p de etanol y 30-45% p/p de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona.
12. El método de la reivindicación 9, en el que la solución comprende 18-22% p/p de agua, 37-43% p/p de etanol y 37-43% p/p de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona.
13. El método de la reivindicación 12, en el que la solución está a una temperatura de aproximadamente -20ºC a aproximadamente 45ºC.
14. El uso del hemihidrato de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona para preparar un medicamento para el tratamiento de un sujeto que tiene o es susceptible de tener una afección de inmunodepresión o una respuesta inmunitaria no deseada, y cualquiera de ellas o ambas están asociadas con (1) una infección patógena seleccionada entre una infección viral, una infección bacteriana intracelular, una infección bacteriana extracelular, una infección fúngica, una infección de levaduras, una infección parasitaria extracelular, una infección parasitaria intracelular, una infección parasitaria de un protozoo y una infección parasitaria multicelular, (2) una enfermedad autoinmune, (3) un tumor maligno o un precáncer, (4) una quimioterapia, una radioterapia, una terapia inmunodepresora, una terapia con agente anti-infectivo, una herida, una quemadura, la presencia de una molécula inmunodepresiva, irritación gastrointestinal o (5) cualquier combinación de las anteriores.
15. El uso según la reivindicación 14, en el que la afección de inmunodepresión o la respuesta inmunitaria no deseada, se asocia con un tumor maligno o un precáncer.
16. El uso según la reivindicación 15, en el que el tumor maligno o el precáncer es cáncer de ovarios, cáncer de mama, cáncer de próstata, hiperplasia prostática benigna, un glioma, un linfoma, una leucemia, cáncer de colon, un sarcoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma broncogénico, cáncer de células renales, carcinoma de células renales, melanoma, adenocarcinoma pancreático o gástrico, neoplasia intraepitelial del cuello uterino asociada con el papilomavirus humano, carcinoma de cuello uterino, hepatoma, linfoma cutáneo de células T o un cáncer o precáncer que aparece en la garganta, esófago, estómago, intestino, colon, ovarios, pulmón, mama o sistema nervioso central.
17. El uso según la reivindicación 14, en el que la afección de inmunodepresión o la respuesta inmunitaria no deseada, se asocia con una infección viral, una infección bacteriana intracelular, una infección bacteriana extracelular, una infección fúngica, una infección de levaduras, una infección parasitaria extracelular, una infección parasitaria intracelular, una infección parasitaria de un protozoo y una infección parasitaria multicelular.
18. El uso según la reivindicación 17, en el que la infección viral, infección bacteriana intracelular, infección bacteriana extracelular, infección fúngica, infección de levaduras, una infección parasitaria extracelular, infección parasitaria intracelular, infección parasitaria de un protozoo o infección parasitaria multicelular es una infección causada por un grupo, especie o género seleccionado entre un retrovirus, un togavirus, un flavivirus, un hepadnavirus, un herpesvirus, un papilomavirus, HIV-1, HIV-2, HHV-6, HHV-8, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, HSV-1, HSV-2, CMV, Escherichia, Haemophilus, Legionella pneumonia, Listeria, Mycoplasma, Neisseria, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Streptococcus, Staphylococcus, Yersinia, Pneumocystis, Candida, Cryptococcus, Aspergillus, Cryptosporidium, Toxoplasma, Trichomonas, Chlamidya, Pneumocystis, Trypanosoma, Leishmania, Plasmodium, un helminto gastrointestinal, un parásito microsporidium o un parásito isosporum.
19. El uso según la reivindicación 18, en el que un medicamento que comprende un agente antiviral, un agente antibacteriano, un agente antifúngico o un agente antiparasitario se administra opcionalmente conjuntamente con el medicamento de la reivindicación 14.
20. El uso según la reivindicación 19, en el que el agente antiviral, agente antibacteriano o agente antifúngico es un inhibidor de la transcriptasa inversa, un inhibidor de la proteasa, un antibiótico, un inhibidor de la fusión, \gamma-interferón, amantadina, rimantadina, ribavirina, cloroquina o un análogo de la cloroquina.
21. El uso según las reivindicaciones 19 o 20, en el que el agente antiviral se selecciona entre AZT, 3TC, D4T, ddI, ddC, adefovir-dipivoxil, 9-[2-(R)-[[bis[[(isopropoxicarbonil)oxi]metoxi]-fosfinoil]metoxi]propil]adenina, (R)-9-[2-(fosfonometoxi)propil]-adenina, adefovir, indinavir, nelfinavir, ritonavir, crixivan, sequanavir e hidroxiurea.
22. El uso según la reivindicación 21, en el que el agente antibacteriano o el agente antifúngico se seleccionan entre anfotericina B, fluconazol, clotrimazol, isoniazida, dapsona, rifamicina, cicloserina, eritromicina, un antibiótico de tetraciclina, vancomicina, etambutol, pirazinamida, una fluoroquinolona opcionalmente seleccionada entre ciprofloxacina y norfloxacina, un antibiótico cefalosporínico, un antibiótico \beta-lactámico o un antibiótico aminoglucósido seleccionado opcionalmente entre estreptomicina,kanamicina y tobramicina.
23. El uso según la reivindicación 14, en el que la afección de inmunodepresión o la respuesta inmunitaria no deseada, está asociada con la inflamación.
24. El uso según la reivindicación 23, en el que la inflamación es aspergilosis broncopulmonar alérgica en pacientes con fibrosis quística, asma atópica, enfermedad respiratoria alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica, fibrosis subepitelial en hiper-reactividad de las vías respiratorias, sinusitis crónica, rinitis alérgica perenne, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad inflamatoria del intestino o alveolitis fibrosa.
25. El uso según la reivindicación 14, en el que la afección de inmunodepresión o la respuesta inmunitaria no deseada, se asocia con una enfermedad autoinmune.
26. El uso según la reivindicación 25, en el que la enfermedad autoinmune es lupus eritematoso sistémico, osteoporosis, esclerosis múltiple, miastenia gravis, enfermedad de Graves, artritis reumatoide u osteoartritis.
27. El uso según las reivindicaciones 14-26, en el que el medicamento se administra al sujeto usando un protocolo de administración intermitente.
28. El uso según la reivindicación 27, en el que el sujeto es un mamífero.
29. El uso de hemihidrato de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona para preparar un medicamento para la modulación de una citoquina o interleuquina que facilita la respuesta inmunitaria Th1 o la respuesta inmunitaria Th2 en un sujeto.
30. El uso según la reivindicación 29, en el que la citoquina o interleuquina es IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, \gammaIFN o TNF\alpha.
31. El uso según la reivindicación 30, en el que la citoquina o interleuquina es IL-12.
32. El uso según la reivindicación 30, en el que la citoquina o interleuquina es IL-1.
33. El uso según la reivindicación 30, en el que la citoquina o interleuquina es IL-6.
34. El uso según la reivindicación 30, en el que la citoquina o interleuquina es IL-10.
35. El uso según la reivindicación 30, en el que la citoquina o interleuquina es TNF\alpha.
36. El uso según las reivindicaciones 29-35, en el que el medicamento se administra al sujeto usando un protocolo de administración intermitente y el sujeto es un mamífero.
37. El uso de hemihidrato de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona para preparar un medicamento para el aumento de las células dendríticas Lin^{-} HLA-DR^{+} CD123^{+}, células dendríticas Lin^{-} HLA-DR^{+} CD11c^{+}, células agresoras activadas por las linfoquinas CD8^{-}CD16^{+}CD38^{+}, células agresoras naturales CD8^{-}CD16^{+}, células agresoras naturales CD8^{+}CD16^{+}, células CD8^{-}CD16^{+} que median en la citotoxicidad mediada por las células dependiente de los anticuerpos, células CD8^{+}CD16^{+} que median en la citotoxicidad mediada por las células dependiente de los anticuerpos en un sujeto, células T CD45RA^{+} o células T CD45^{+}RO^{+} en un sujeto.
38. El uso según la reivindicación 37, en el que el sujeto tiene una afección de inmunodepresión o una respuesta inmunitaria no deseada, y cualquiera de ellas o ambas están asociadas con (1) una infección patógena seleccionada entre una infección viral, una infección bacteriana intracelular, una infección bacteriana extracelular, una infección fúngica, una infección de levaduras, una infección parasitaria extracelular, una infección parasitaria intracelular, una infección parasitaria de un protozoo y una infección parasitaria multicelular, (2) una enfermedad autoinmune, (3) un tumor maligno o un precáncer, (4) una quimioterapia, una radioterapia, una terapia inmunodepresora, una terapia con agente anti-infectivo, una herida, una quemadura, la presencia de una molécula inmunodepresiva, irritación gastrointestinal o (5) cualquier combinación de las anteriores.
39. El uso según las reivindicaciones 37 ó 38, en el que el medicamento se administra al sujeto usando un protocolo de administración intermitente y el sujeto es un mamífero.
40. El uso según las reivindicaciones 37 ó 38, en el que la afección de inmunodepresión o la respuesta inmunitaria no deseada, se asocia con un tumor maligno o un precáncer.
41. El uso según la reivindicación 40, en el que el tumor maligno o precáncer es cáncer de ovarios, cáncer de mama, cáncer de próstata, hiperplasia prostática benigna, un glioma, un linfoma, una leucemia, cáncer de colon, un sarcoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma broncogénico, cáncer de células renales, carcinoma de células renales, melanoma, adenocarcinoma pancreático o gástrico, neoplasia intraepitelial del cuello uterino asociada con el papilomavirus humano, carcinoma de cuello uterino, hepatoma, linfoma cutáneo de células T o un cáncer o precáncer que aparece en la garganta, esófago, estómago, intestino, colon, ovarios, pulmón, mama o sistema nervioso central.
42. El uso según las reivindicaciones 37 ó 38, en el que la afección de inmunodepresión o la respuesta inmunitaria no deseada, se asocia con una infección viral, una infección bacteriana intracelular, una infección bacteriana extracelular, una infección fúngica o una infección de levaduras.
43. El uso según la reivindicación 42, en el que la infección viral, infección bacteriana intracelular, infección bacteriana extracelular, infección fúngica o infección de levaduras, es una infección causada por un grupo, especie o género seleccionado entre un retrovirus, un flavivirus, un papilomavirus, HIV-1, HIV-2, HHV-6, HHV-8, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, HSV-1, HSV-2, CMV, Escherichia, Legionella pneumonia, Listeria, Mycoplasma, Neisseria, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella,Shigella, Streptococcus, Staphylococcus, Yersinia, Trichomonas, Chlamidya, Pneumocystis, Candida, Cryptococcus, Aspergillus, Cryptosporidium, Toxoplasma y Pneumocystis.
44. El uso según las reivindicaciones 37 ó 38, en el que la afección de inmunodepresión o la respuesta inmunitaria no deseada, está asociada con la inflamación.
45. El uso según la reivindicación 44, en el que la inflamación es aspergilosis broncopulmonar alérgica en pacientes con fibrosis quística, asma atópica, enfermedad respiratoria alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica, fibrosis subepitelial en hiper-reactividad de las vías respiratorias, sinusitis crónica, rinitis alérgica perenne, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad inflamatoria del intestino o alveolitis fibrosa.
46. El uso según las reivindicaciones 37 ó 38, en el que la afección de inmunodepresión o la respuesta inmunitaria no deseada, está asociada con una enfermedad autoinmune.
47. El uso según la reivindicación 46, en el que la enfermedad autoinmune es lupus eritematoso sistémico, osteoporosis, esclerosis múltiple, miastenia gravis, enfermedad de Graves, artritis reumatoide o osteoartritis.
48. El uso de hemihidrato de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona para preparar un medicamento para la modulación de la inmunidad innata de un sujeto o para el aumento de las respuestas inmunitarias Th1 de un sujeto.
49. El uso según la reivindicación 48, en el que el sujeto tiene una afección de depresión de la inmunidad innata o una depresión de la respuesta inmunitaria Th1.
50. El uso de hemihidrato de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona para preparar un medicamento para aumentar el número de neutrófilos, células dendríticas, monocitos, macrófagos o células NK en la sangre de un sujeto.
51. El uso según la reivindicación 50, en el que el sujeto tiene una afección de depresión de la inmunidad innata o una depresión de la respuesta inmunitaria Th1.
52. El uso según la reivindicación 51, en el que la afección de depresión de la inmunidad innata o la depresión de la respuesta inmunitaria Th1 se asocia con una infección viral, una infección bacteriana intracelular, una infección bacteriana extracelular, una infección fúngica, una infección de levaduras, una infección parasitaria extracelular, una infección parasitaria intracelular, un parásito protozoario, un parásito multicelular, una enfermedad autoinmune, un cáncer, un precáncer, una quimioterapia, una radioterapia, una terapia inmunodepresora, una terapia con agente anti-infectivo, una herida, una quemadura, la presencia de una molécula inmunodepresiva o cualquier combinación de las anteriores.
53. El uso según la reivindicación 52, en el que el sujeto tiene o es propenso a desarrollar una afección de depresión de la inmunidad innata o una depresión de la respuesta inmunitaria Th1 que se asocia con una quimioterapia, una radioterapia, una terapia inmunodepresora, una terapia con agente anti-infectivo.
54. El uso según la reivindicación 53, en el que la afección de depresión de la inmunidad innata o la depresión de la respuesta inmunitaria Th1 se asocia con una quimioterapia, una radioterapia o una terapia inmunodepresora, en la que la terapia se selecciona opcionalmente entre tratamiento con adriamicina, tratamiento con cisplatina, tratamiento con mitomicina C, tratamiento con anfotericina B, terapia de radiación \gamma, tratamiento con análogos de nucleósidos para una infección viral o cáncer, tratamiento con ciclosporina o tratamiento con corticosteroides.
55. El uso según las reivindicaciones 50, 51 ó 52, en el que las células dendríticas son células dendríticas Lin^{-} HLA-DR^{+} CD123^{+} o células dendríticas Lin^{-} HLA-DR^{+} CD11c^{+}.
56. Hemihidrato de 16\alpha-bromo-3\beta-hidroxi-5\alpha-androstan-17-ona para uso como un medicamento.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070129282A1 (en) 1998-11-24 2007-06-07 Ahlem Clarence N Pharmaceutical treatments and compositions
US6667299B1 (en) 2000-03-16 2003-12-23 Hollis-Eden Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions and treatment methods
DE60045751D1 (de) 1999-09-30 2011-04-28 Harbor Biosciences Inc Therapeutische Behandlung androgenrezeptorbedingter Leiden
WO2001062259A1 (en) 2000-02-25 2001-08-30 Hollis Eden Pharmaceuticals Method of treatment of prostate cancer
AU2002244247B2 (en) * 2001-03-01 2007-12-13 Harbor Biosciences, Inc. Use of certain steroids for treatment of blood cell deficiencies
FR2829697B1 (fr) * 2001-09-14 2004-03-19 Mayoly Spindler Lab Derives 7-hydroxyles et 7-cetoniques des hormones steroides 3 beta-hydroxylees pour le traitement des maladies inflammatoires ou fonctionnelles de l'intestin
JP2006506445A (ja) 2002-08-28 2006-02-23 ホリス − イーデン ファーマスーティカルズ、 インコーポレイテッド 治療処置の方法
GB0304927D0 (en) 2003-03-04 2003-04-09 Resolution Chemicals Ltd Process for the production of tibolone
AU2004308806B9 (en) * 2003-12-26 2010-01-28 Nissan Chemical Industries, Ltd. Neutrophilia inhibitor
MD4009C2 (ro) * 2008-07-15 2010-08-31 Институт Химии Академии Наук Молдовы Utilizarea 1-metil-4-(N-metilaminobutil-4)-β-carbolinei în calitate de remediu antituberculos
CN104072564B (zh) * 2013-03-28 2016-08-17 广州市赛普特医药科技股份有限公司 2β,3α,5α-三羟基-雄甾-6-酮及其制备方法与用途
CN106565654B (zh) * 2016-10-14 2018-08-31 云南中烟工业有限责任公司 一种从白云参中提取的新型黄酮类化合物、其制备方法及其用途
CN112088208A (zh) * 2018-06-01 2020-12-15 雀巢产品有限公司 膳食丁酸盐（酯）
US10836788B2 (en) 2019-02-05 2020-11-17 SD Chem, Inc. Aqueous suspension compositions, formulations, and water dispersible dry compositions comprising 16alpha-bromo-3beta-hydroxy-5alpha-androstan-17-ketone and hydrates, derivatives, and analogs thereof
WO2021110963A1 (en) * 2019-12-05 2021-06-10 Société des Produits Nestlé S.A. Dietary butyrate
CN114907333B (zh) * 2022-05-11 2023-07-04 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 环丙甲酰胺衍生物及其制备方法和用途

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH197784A (de) * 1934-05-25 1938-05-15 Schering Kahlbaum Ag Verfahren zu Darstellung von D5,6-trans-Androstendiol-3,17.
CA1314870C (en) * 1983-08-02 1993-03-23 Arthur G. Schwartz Steroids useful as anti-cancer, anti-obesity, anti-hyperglycemic, anti-autoimmune and anti-hypercholesterolemic agents
NL194728C (nl) * 1987-04-16 2003-01-07 Hollis Eden Pharmaceuticals Farmaceutisch preparaat geschikt voor de profylaxe of therapie van een retrovirale infectie of een complicatie of gevolg daarvan.
US4910226A (en) * 1987-04-29 1990-03-20 Smithkline Beckman Corporation Steroid 5-alpha-reductase inhibitors
JPH0289327A (ja) * 1988-09-27 1990-03-29 Matsushita Electron Corp 銀ペースト塗布装置
US5837269A (en) * 1989-09-25 1998-11-17 University Of Utah Research Foundation Vaccine compositions and method for enhancing an immune response
IE60458B1 (en) * 1989-10-26 1994-07-13 Elan Corp Plc Enhanced bioavailability adsorbates

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