ES2217407T3

ES2217407T3 - Quinasa capaz de fosforilacion especifica de lugar de i-kappa-b-alpha.

Info

Publication number: ES2217407T3
Application number: ES97916786T
Authority: ES
Inventors: Zhijian J. Chen
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-03-19
Filing date: 1997-03-19
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2017-03-19
Also published as: DE69728880T2; ATE265537T1; US20020168740A1; DE69728880D1; AU728679B2; CA2249551A1; AU728679C; US20040161814A1; US6107073A; AU2531797A; US6787346B2; US20020151022A1; EP0910645B1; KR20000064670A; WO1997035014A1; EP0910645A1; BR9710408A; JP2000510328A; US7452977B2

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE, EN GENERAL, A UNA QUINASA QUE, EN SU ESTADO ACTIVADO, ES CAPAZ DE REALIZAR UNA FOSFORILACION DE SITIO ESPECIFICO DE I KA B AL , LA QUIN ASA DE I KA B AL . EN CONCRETO, LA INVENCION SE REFIERE A LA QUINASA PURIFICADA, A SUBUNIDADES POLIPEPTIDICAS DE LA MISMA PURIFICADAS, A MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN PARA DICHAS SUBUNIDADES POLIPEPTIDICAS PURIFICADAS; A MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO RECOMBINANTES; A CELULAS QUE CONTIENEN DICHAS MOLECULAS RECOMBINANTES; A ANTICUERPOS QUE PRESENTAN UNA AFINIDAD DE UNION ESPECIFICA PARA DICHA QUINASA O SUS SUBUNIDADES; A HIBRIDOMAS QUE CONTIENEN DICHOS ANTICUERPOS; A SONDAS DE ACIDOS NUCLEICOS PARA LA DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFIQUEN PARA DICHA QUINASA; A UN PROCEDIMIENTO DE DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN PARA DICHA QUINASA O PARA POLIPEPTIDOS DE DICHA QUINASA EN UNA MUESTRA; Y A EQUIPAMIENTOS QUE CONTIENEN DICHAS SONDAS O ANTICUERPOS. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A BIOENSAYOS QUE EMPLEANDICHAS SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS, PROTEINAS O ANTICUERPOS, PARA DIAGNOSTICAR, EVALUAR O PRONOSTICAR A UN MAMIFERO AFECTADO POR UNA ACTIVACION NO DESEADA DE NF- KA B. LA INVENCION SE REFIERE A LIGANDOS, AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DE DICHA QUINASA Y A USOS DIAGNOSTICOS Y TERAPEUTICOS DE LA MISMA. TAMBIEN SE DESCRIBEN BIOENSAYOS QUE EMPLEAN LA QUINASA O POLIPEPTIDOS DE LA MISMA PARA IDENTIFICAR LIGANDOS, AGONISTAS Y ANTAGONISTAS. MAS ESPECIFICAMENTE, LA INVENCION SE REFIERE A INHIBIDORES SELECTIVOS DE DICHA QUINASA Y AL DISEÑO BASADO EN LA ESTRUCTURA, DE LIGANDOS, AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DE LA MISMA. POR ULTIMO, LA INVENCION SE REFIERE A TERAPIA GENICA QUE EMPLEA LOS ACIDOS NUCLEICOS DE LA INVENCION.

Description

Quinasa capaz de fosforilación específica de lugar de I-\kappa-B-\alpha.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a una quinasa que en su estado activado es capaz de fosforilación específica de lugar del I\kappaB\alpha, la I\kappaB\alpha-quinasa. En particular, la presente invención se refiere a la quinasa purificada, subunidades polipeptídicas purificadas de la quinasa, moléculas de ácido nucleico que codifican las subunidades polipeptídicas purificadas; moléculas de ácido nucleico recombinante; células que contienen las moléculas de ácido nucleico recombinante; anticuerpos que tienen afinidad de unión específica por la quinasa o sus subunidades polipeptídicas; hibridomas que contienen los anticuerpos; sondas de ácido nucleico para detectar el ácido nucleico que codifica la quinasa; un método para detectar ácidos nucleicos que codifican la quinasa o polipéptidos de la quinasa en una muestra; y kits que contienen sondas de ácido nucleico o anticuerpos. Esta invención se refiere además a bioensayos que usan la secuencia de ácido nucleico, proteína o anticuerpos de esta invención para diagnóstico, evaluación, o pronóstico de un mamífero que padece una activación indeseada del NF-\kappaB. Esta invención también se refiere a ligandos, agonistas, y antagonistas de la quinasa, y a sus usos en diagnóstico y terapéuticos. Esta invención también se refiere a bioensayos que usan la quinasa o polipéptidos de la quinasa de esta invención, para identificar ligandos, agonistas y antagonistas. Más específicamente, esta invención se refiere a inhibidores selectivos de la quinasa y al diseño basado en la estructura de ligandos, agonistas y antagonistas de la quinasa. Esta invención se refiere además a la terapia génica usando ácidos nucleicos de la invención.

Técnica relacionada

La regulación de las respuestas inmunitaria e inflamatoria requiere la activación de grupos de genes específicos por una variedad de señales extracelulares. Dichas señales incluyen mitógenos (por ejemplo, LPS y PMA), citoquinas (por ejemplo, TNF-\alpha y IL-1\beta), proteínas víricas (por ejemplo, HTLV-1 Tax), antígenos, inhibidores de fosfatasa (por ejemplo, ácido okadaico y caliculina A), y luz UV. La familia de proteínas activadoras de la transcripción rel/NF-\kappaB juega un papel esencial en las rutas de transducción de señales que liga estas señales a la activación génica (revisado por Siebenlist, U. et al., Annu. Rev. Cell. Biol. 10:405-455 (1994); Baerle & Henkel, Annu. Rev. Immunol. 72:141-179 (1994); Thanos & Maniatis, Cell 80:529-532 (1995); Finco & Baldwin, J. Biol. Chem. 24:17676-17679 (1993); Verma, I.M. et al., Genes & Dev. 9:2723-2735 (1995)). El NF-\kappaB (p50/RelA(p65)), y otras proteínas heterodímeras de la familia rel son secuestradas en el citoplasma mediante su asociación con I\kappaB\alpha o I\kappaB\beta, miembros de la familia I\kappaB de proteínas inhibidoras. En el caso de I\kappaB\alpha, y más probablemente I\kappaB\beta, la estimulación de células conduce a la rápida fosforilación y degradación del inhibidor. Por consiguiente, el NF-\kappaB es liberado y se transloca al núcleo donde activa la expresión de genes diana La fosforilación del I\kappaB\alpha por sí mismo no es suficiente para disociar el
NF-\kappaB del complejo latente (Palombella, V.J., Cell. 78:773-785 (1994); Traenckner, E.B.-M. et al., EMBO J. 13:5433-56441 (1994); Finco, T.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:11884-11888 (1994); Miyamoto, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12740-12744 (1994); Lin, Y.-C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:552-556 (1995); Alkalay, I. et al., Mol. Cell. Biol. 75:1294-1304 (1995); DiDonato, J.A. et al., Mol. Cell. Biol. 15:1302-1311 (1995)). Más bien, la fosforilación provoca la degradación de I\kappaB\alpha (Brown, K. et al., Science 267:1485-1491 (1995) Brockman, J.A. et al., Mol. Cell. Biol. 15:2809-2818 (1995); Traenckner, E.B.-M. et al, EMBO J. 14:2876-2883 (1995); Whiteside, S.T. et al., Mol. Cell. Biol. 15:5339-5345 (1995)).

Recientemente, se ha mostrado que la degradación de I\kappaB\alpha inducida por señal es mediada por la ruta de ubiquitina-proteasoma (Chen, Z. J. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995); Scherer, D.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11259-11263 (1995); Alkalay, I. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:10599-10603 (1995)). En esta ruta, una proteína marcada para la degradación es modificada primero por unión covalente a ubiquitina, un polipéptido altamente conservado de 76 aminoácidos (revisado por Hershko & Ciechanover, Annu. Rev. Biochem. 57:761-807 (1992); Ciechanover, A., Cell 79:13-21 (1994)). La ubiquitinación es un procedimiento de tres etapas: Primero, la ubiquitina es activada por una enzima activadora de ubiquitina (E1); después la ubiquitina activada es transferida a una proteína portadora de ubiquitina (E2, también denominada enzima conjugadora de ubiquitina o UBC); finalmente, la ubiquitina se conjuga con un sustrato proteína formando un enlace isopeptídico entre el carboxilo terminal del resto de glicina de la ubiquitina y el grupo \varepsilon-amino de uno o más restos de lisina del sustrato proteína. Esta etapa de conjugación con frecuencia requiere una ubiquitina-proteína-ligasa (E3). Se pueden unir múltiples moléculas de ubiquitina a un sustrato proteína para formar cadenas de multiubiquitina, que después son reconocidas por una proteasa larga dependiente de ATP, (PM \sim 2000 kDa) denominada proteasoma 26S. El proteasoma 26S está compuesto de un núcleo catalítico 20S, y un complejo de regulación 19S (revisado por Goldberg, A.L., Science 268:522-523 (1995)).

Múltiples E2 y E3 funcionan juntas para mediar la ubiquitinación de una variedad de proteínas celulares. Por ejemplo, hay al menos una docena de E2 en levaduras que presentan distintas especificidades de sustrato y llevan a cabo distintas funciones celulares. Las proteínas E2 estrechamente relacionadas UBC4 y UBC5, están implicadas en el recambio de muchas proteínas de vida corta o anormales, y juegan un papel esencial en la respuesta al estrés (Seufert & Jentsch, EMBO J. 9:543-550 (1990)). Homólogos de UBC4/UBC5 median la ubiquitinación de la proteína P53 junto con el complejo HPV-16 E6-E6AP, que funciona como una E3 (Schaffner, M. et al., Cell, 75:495-505 (1993)). Estas E2 se han implicado también en la ubiquitinación del procesador MAT\alpha2 (Chen, P. et al., Cell, 74:357-369 (1993)), ciclina B (King, R.W. et al., Cell 81:279-288 (1995)), y la proteína precursora del NF-\kappaB, P105 (Orian, A. et al., J. Biol. Chem. 270:21707-21714 (1995)). La implicación de UBC4/UBC5 en la ubiquitinación de sustratos tan diversos indica que estas E2 solas no pueden conferir especificidad de sustrato. Sin embargo, pueden actuar junto con E3 específicas para reconocer sustratos específicos. Aunque hasta ahora se han identificado relativamente pocas E3, es probable que exista una gran familia de estas proteínas (Huibregtse, J.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2563-2567(1995)).

La ubiquitinación del I\kappaB\alpha es regulada por fosforilación inducida por señal en dos restos específicos, las serinas 32 y 36 (Chen, ZJ. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995)). Las sustituciones de aminoácidos solos de uno o ambos de estos restos suprimen la fosforilación inducida por señal y degradación del I\kappaB\alpha (Brown, K. et al., Science 267:1485-1491 (1995); Brockman, J.A. et al., Mol. Cell. Biol. 15:2809-2818 (1995); Traenckner, E.B.-M et al., EMBO J. 14:2876-2883 (1995); Whiteside, S.T. et al., Mol. Cell. Biol. 15:5339-5345 (1995)). Las mismas mutaciones también suprimen la fosforilación inducida por el ácido okadaico y la ubiquitinación de I\kappaB\alpha in vitro (Chen, ZJ. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995)). Se conoce relativamente poco sobre las rutas de transducción de señales y la(s)

\hbox{quinasa(s)}

responsable(s) de la fosforilación específica de lugar del I\kappaB\alpha. Los mutantes de I\kappaB\alpha que carecen de las serinas 32 y 36 son resistentes a la fosforilación inducida por una variedad de estímulos, sugiriendo que diferentes rutas de transducción de señales convergen en una quinasa o quinasas específicas. Sin embargo, a pesar del considerable esfuerzo, la identificación de esta I\kappaB\alpha-quinasa sigue siendo difícil de conseguir (Verma, I.M. et al. Genes & Dev. 9:2723-2735 (1995)).

Se ha mostrado que varias serina/treonina-quinasas, incluyendo la proteína-quinasa C (PKC), quinasa eIF-2\alpha controlada por hemo (HRI), proteína-quinasa A (Ghosh & Baltimore, Nature 344:678-682 (1990)), caseína-quinasa II (Barroga, C.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7637-7641 (1995)) y una quinasa de 42 kDa recientemente descrita (Kano, K. et al., J. Biol. Chem. 270:27914-27919 (1995)), fosforilan I\kappaB\alpha in vitro. Sin embargo, no se ha mostrado que ninguna de estas quinasas fosforile I\kappaB\alpha en las serinas 32 y 36. También se han implicado diferentes quinasas en la regulación del NF-\kappaB in vivo, tales como PKC\varsigma (Dominguez, I. et al., Mol. Cell. Biol. 13:1290-1295 (1993); Diaz-Meco, M.T. et al., EMBO J. 13:2842-2848 (1994)), proteína-quinasa dependiente de ceramida (Schutze, S. et al., Cell 71:765-776 (1992)), tirosina-quinasas (Devary, Y. et al., Science 257:1442-1445 (1993)), Raf (Finco & Baldwin, J. Biol. Chem., 24:17676-17679 (1993); Li & Sedivy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9247-9251 (1993)), y la pelle-quinasa de Drosophila que es necesaria para la inactivación de Cactus, un homólogo del I\kappaB de Drosophila (Wassermann, S.A., Mol. Biol. Cell, 4:767-771 (1993)). Estas quinasas pueden funcionar en varias etapas en la ruta de transducción de señales corriente arriba de la fosforilación de I\kappaB\alpha, pero no se ha mostrado que ninguna fosforile directamente I\kappaB\alpha en sitios relevantes.

Aunque la naturaleza variada de los estímulos al NF-\kappaB sugiere que las etapas iniciales de las rutas de transducción de señales son distintas, parece que estas rutas convergen en la generación de productos intermedios con oxígeno reactivo (ROI, tales como H_{2}O_{2}), que se cree que funcionan como moléculas de tipo segundo mensajero comunes en la activación del NF-\kappaB (Schreck, R. et al., EMBO J. 10:2247-2258 (1991)). Actualmente no se entiende la relación mecanística entre los ROI y la fosforilación de I\kappaB\alpha.

El establecimiento de un sistema in vitro para la fosforilación y ubiquitinación inducidas por señal del I\kappaB\alpha ha sido descrito previamente (Chen, Z.J. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995)). La presente invención implica fraccionar extractos citoplasmáticos de células HeLa y ensayar la fosforilación específica y ubiquitinación de I\kappaB\alpha. La presente invención proporciona un complejo de quinasa de alto peso molecular que, en su estado activado, fosforila específicamente el I\kappaB\alpha en las serinas 32 y 36. Sorprendentemente, UBC4/UBC5, ubiquitina, y E1 no están implicados en la ubiquitinación de I\kappaB\alpha, pero pueden ser necesarios también para la fosforilación de I\kappaB\alpha. Experimentos adicionales revelan que esta I\kappaB\alpha-quinasa puede ser activada por un suceso de ubiquitinación previo. En este caso, la ubiquitinación sirve como función reguladora sin implicar proteolisis. Adicionalmente, esta I\kappaB\alpha puede ser activada por MEKK1.

Sumario de la invención

La activación inducida por señal del factor de transcripción NF-\kappaB requiere la fosforilación específica del inhibidor I\kappaB\alpha y su posterior degradación proteolítica. La fosforilación de los restos de serina 32 y 36 dirigen I\kappaB\alpha a la ruta de ubiquitina-proteasoma. La presente invención proporciona una quinasa de multisubunidades grande (PM \sim700 kDa) sustancialmente purificada, que en su estado activado, fosforila el I\kappaB\alpha en las serinas 32 y 36. Increíblemente, esta quinasa puede ser activada por un suceso de ubiquitinación que requiere la enzima activadora de ubiquitina (E1), una proteína portadora de ubiquitina específica (E2) de la familia de UBC4/UBC5, y ubiquitina. Por lo tanto, en este caso, la ubiquitinación sirve como una nueva función reguladora que no implica proteolisis. Alternativamente, la quinasa puede ser activada por fosforilación de MEKK-1. También son posibles rutas de activación adicionales, por ejemplo, fosforilación por una quinasa distinta de MEKK-1.

La invención también proporciona un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica por la quinasa antes descrita.

La invención proporciona además un método para detectar la quinasa antes descrita en una muestra.

La invención proporciona además un kit de diagnóstico que comprende un primer medio de envase que contiene el anticuerpo antes descrito, y un segundo medio de envase que contiene un conjugado que comprende una pareja de unión del anticuerpo monoclonal y un marcador.

La invención también proporciona un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal antes descrito.

La invención proporciona además métodos de diagnóstico para enfermedades humanas, en particular enfermedades, trastornos, y lesiones que resultan de una activación indeseada del NF-\kappaB.

La invención también proporciona métodos para usos terapéuticos que implican la quinasa antes descrita.

La invención proporciona ligandos, agonistas y antagonistas de la quinasa antes descrita, y usos de diagnóstico y terapéuticos para estas moléculas. Preferiblemente, la molécula es un inhibidor selectivo de la actividad de quinasa, es decir, de la capacidad de fosforilar el I\kappaB\alpha en los restos de serina 32 y 36.

La invención también proporciona ensayos para identificar ligandos, agonistas y antagonistas de la quinasa antes descrita.

Objetivos y ventajas adicionales de la presente invención quedaran claros a partir de la siguiente descripción.

Definiciones

En la siguiente descripción, se usan mucho una serie de expresiones usados en la tecnología de DNA recombinante (rDNA), purificación de proteínas, y métodos de diagnóstico y terapéuticos. Con el fin de proporcionar una interpretación clara y coherente de la memoria descriptiva y reivindicaciones, incluyendo el alcance dado a dichas expresiones, se proporcionan las siguientes definiciones.

Molécula de ácido nucleico aislada. Una "molécula de ácido nucleico aislada", como se entiende generalmente y se usa en la presente memoria, se refiere a un polímero de nucleótidos, e incluye, pero no se debe limitar, DNA y RNA.

Segmento de DNA. Un segmento de DNA, como se entiende generalmente y se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula que comprende un tramo lineal de nucleótidos, en el que los nucleótidos están presentes en una secuencia que puede codificar, mediante el código genético, una molécula que comprende una secuencia lineal de restos de aminoácidos que se denomina una proteína, fragmento de proteína o un polipéptido.

Gen. Una secuencia de DNA relacionada con una cadena de polipéptido sencilla o proteína, y tal como se usa en la presente memoria incluye los extremos 5' y 3' no traducidos. El polipéptido puede ser codificado por un secuencia de longitud completa o cualquier parte de la secuencia codificante, siempre que se retenga la actividad funcional de la proteína.

DNA complementario (cDNA). Moléculas de ácido nucleico recombinantes sintetizadas por transcripción inversa del RNA mensajero ("mRNA").

Gen estructural. Una secuencia de DNA que es transcrita a mRNA que después es traducida a una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.

Endonucleasa de restricción. Una endonucleasa de restricción (también enzima de restricción) es una enzima que es capaz de reconocer una secuencia de bases específica (normalmente 4, 5 ó 6 pares de bases de longitud) en una molécula de DNA, y de escindir la molécula de DNA en cada sitio donde aparece esta secuencia. Por ejemplo, EcoRI reconoce la secuencia de bases GAATTC/CTTAAG.

Fragmento de restricción. Las moléculas de DNA producidas por digestión con una endonucleasa de restricción se denominan fragmentos de restricción. Cualquier genoma dado se puede hacer digerir por una endonucleasa de restricción particular en un grupo discreto de fragmentos de restricción.

Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). La técnica usada más habitualmente (aunque no la única) para lograr un fraccionamiento de polipéptidos basado en el tamaño, es la electroforesis en gel de poliacrilamida. El principio de este método es que las moléculas de polipéptido migran a través del gel como si hubiera un tamiz que retardara el movimiento de las moléculas más grandes en mayor medida y el movimiento de las moléculas más pequeñas en menor medida. Hay que indicar que cuanto más pequeño es el fragmento de polipéptido, mayor es la movilidad en la electroforesis en el gel de poliacrilamida. Tanto antes como durante la electroforesis, típicamente los polipéptidos son expuestos continuamente al detergente dodecil-sulfato sódico (SDS), en cuyas condiciones los polipéptidos se desnaturalizan. Los geles nativos se usan en ausencia de SDS.

Los polipéptidos fraccionados por electroforesis en gel de poliacrilamida se pueden visualizar directamente por un procedimiento de tinción si el número de componentes polipeptídicos es pequeño.

Procedimiento de transferencia Western. El propósito del procedimiento de transferencia Western (también denominado transferencia) es transferir físicamente polipéptidos fraccionados por electroforesis en gel de poliacrilamida, a un papel de filtro de nitrocelulosa o a otra superficie o método adecuado, mientras que se retienen las posiciones relativas de los polipéptidos resultantes del procedimiento de fraccionamiento. Después la transferencia se ensaya con sonda de un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido que interesa.

Hibridación de ácido nucleico. La hibridación de ácido nucleico depende del principio de que dos moléculas de ácido nucleico monocatenarias que tienen secuencias de bases complementarias volverán a formar la estructura bicatenaria termodinámicamente favorecida, si se mezclan en las condiciones adecuadas. La estructura bicatenaria se formará entre dos ácidos nucleicos monocatenarios complementarios, incluso si uno está inmovilizado sobre un filtro de nitrocelulosa. En procedimiento de hibridación southern, se produce esta última situación. Como se ha indicado previamente, el DNA del individuo que se va a ensayar se hace digerir con una endonucleasa de restricción, se fracciona por electroforesis en gel de agarosa, se convierte en la forma monocatenaria, y se transfiere a papel de nitrocelulosa, dejándolo disponible para la reasociación con la sonda de hibridación.

Sonda de anticuerpo. Para visualizar una secuencia polipeptídica particular en el procedimiento de transferencia western, se expone una sonda de anticuerpo marcado a los polipéptidos fraccionados unidos al filtro de nitrocelulosa. Las zonas del filtro que llevan polipéptidos que se unen a la sonda de anticuerpo marcado quedan marcadas ellas mismas como consecuencia de la unión. Se visualizan las zonas del filtro que presentan dicho marcaje.

Condiciones de hibridación rigurosas. Se pueden encontrar condiciones de hibridación en Current protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al., John Wily & Sons, Inc., New York, NY (1989). Se incuba toda la noche un filtro de nitrocelulosa a 68ºC con sonda marcada en una solución que contiene formamida al 50%, solución salina concentrada (o 5x SSC[20X: NaCl 3 M/citrato trisódico 0,3 M] o 5X SSPE [20X: NaCl 3,6 M/NaH_{2}PO_{4} 0,2 M/EDTA 0,02 M, pH 7,7]), 5X solución de Denhardt, SDS al 1%, y DNA de esperma de salmón desnaturalizado 100 \mug/ml. A esto le siguen varios lavados en 0,2X SSC/SDS al 0,1% a una temperatura seleccionada basándose en la rigurosidad deseada: temperatura ambiente (poco rigurosas), 42ºC (moderadamente rigurosas) o 68ºC (muy rigurosas). La temperatura seleccionada se determina basándose en la temperatura de fusión (Tf) del híbrido de DNA.

Oligonucleótido u oligómero. Una molécula compuesta de dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependerán de la función final o uso del oligonucleótido. Un oligonucleótido se puede obtener sintéticamente o por clonación.

Amplificación de secuencia. Un método para generar grandes cantidades de una secuencia diana. En general, se reasocian uno o más cebadores de amplificación a una secuencia de ácido nucleico. Usando enzimas adecuadas, se amplifican las secuencias que se encuentran adyacentes a, o entre, los cebadores.

Cebador de amplificación. Un oligonucleótido que puede reasociarse a una secuencia diana adyacente y que sirve como un punto de inicio para la síntesis de DNA, cuando se pone en las condiciones en las que se inicia la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico.

Vector. Un DNA de plásmido o fago u otra secuencia de DNA en la que se puede insertar DNA para clonar. El vector se puede replicar de forma autónoma en una célula hospedante, y se puede caracterizar además por uno o una serie pequeña de sitios de reconocimiento de endonucleasas en los que dichas secuencias de DNA se pueden cortar de una forma determinada y en los que se puede insertar DNA. Además el vector puede contener un marcador adecuado para usar en la identificación de células transformadas con el vector. Son marcadores, por ejemplo, la resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina. A veces se usan las palabras "vehículo de clonación" para "vector".

Expresión. La expresión es el proceso por el cual un gen estructural produce un polipéptido. Implica transcripción del gen en mRNA, y la traducción de dicho mRNA en polipéptido(s).

Vector de expresión. Un vector o vehículo similar a un vector de clonación que es capaz de expresar un gen que ha sido clonado en él, después de transformación en un hospedante. El gen clonado normalmente se pone bajo el control (es decir, unido operativamente) de ciertas secuencias de control tales como secuencias promotoras.

Las secuencias de control de expresión variarán dependiendo de si el vector está diseñado para expresar el gen operativamente unido en un hospedante procariota o eucariota, y pueden contener adicionalmente elementos de transcripción tales como elementos potenciadores, secuencias de terminación, elementos de especificidad de tejido, y/o sitios iniciación y terminación de traducción.

Derivado funcional. Un "derivado funcional" de una secuencia, proteína o ácido nucleico, es una molécula que tiene una actividad biológica (funcional o estructural) que es sustancialmente similar a la actividad biológica de la secuencia de proteína o ácido nucleico. Un derivado funcional de una proteína puede contener modificaciones postraduccionales tales carbohidrato unido covalentemente, dependiendo de la necesidad de dichas modificaciones para llevar a cabo una función específica. La expresión "derivado funcional" se pretende que incluya los "fragmentos", "segmentos", "variantes", "análogos", o "derivados químicos" de una molécula.

Tal como se usa en la presente memoria, se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula, cuando contiene grupos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la molécula. Dichos grupos pueden mejorar la solubilidad, absorción, semivida biológica y similares de la molécula. Alternativamente, los grupos pueden reducir la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseado de la molécula, y similares. Se describen grupos que pueden de mediar dichos efectos en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Los procedimientos para acoplar dichos grupos a una molécula son conocidos en la técnica.

Variante. Una "variante" de una proteína o ácido nucleico se refiere a una molécula sustancialmente similar en estructura y actividad biológica a la proteína o ácido nucleico. Por lo tanto, con la condición de que dos moléculas tengan una actividad común y se pueda sustituir una por otra, se consideran variantes tal como se usa el término en la presente memoria, incluso si la composición o la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de una molécula no es idéntica a la encontrada en la otra, o si la secuencia de aminoácidos o nucleótidos no es idéntica.

Alelo. Un "alelo" es una forma alternativa de un gen que ocupa un locus dado en el cromosoma.

Mutación. Una "mutación" es cualquier cambio detectable en el material genético que puede ser transmitido a células hija e incluso posiblemente a generaciones sucesivas que dan lugar a células mutantes o individuos mutantes. Si los descendientes de una célula mutante sólo dan lugar a células somáticas en organismos multicelulares, surge una mancha o zona de células mutantes. Las mutaciones en la línea germinal de organismos que se reproducen sexualmente, pueden ser transmitidas por los gametos a la siguiente generación dando como resultado un individuo con el nuevo estado mutante tanto en sus células somáticas como germinales. Una mutación puede ser cualquier (o combinación de) cambio detectable y no natural, que afecte a la constitución química o física, mutabilidad, replicación, función fenotípica, o recombinación de uno o más desoxirribonucleótidos; los nucleótidos se pueden añadir, suprimir, sustituir por, invertir o transponer a nuevas posiciones con o sin inversión. Las mutaciones se pueden producir espontáneamente y se pueden inducir experimentalmente por aplicación de mutágenos o por mutagénesis dirigida al lugar. Una variación mutante de una molécula de ácido nucleico resulta de una mutación. Un polipéptido mutante puede resultar de una molécula de ácido nucleico mutante.

Especie. Una "especie" es un grupo de poblaciones naturales que realmente o potencialmente se cruzan. Una variación de especie en una molécula de ácido nucleico o proteína es un cambio en la secuencia del ácido nucleico o aminoácidos que se produce entre especies y se puede determinar por secuenciación del DNA de la molécula en cuestión.

Purificado. Una proteína o ácido nucleico "purificado" es una preparación de proteína o ácido nucleico que generalmente no tiene contaminantes, se produzca de forma recombinante, se sintetice químicamente o se purifique de una fuente natural.

% homólogo. Cuando se hace referencia a una secuencia de aminoácidos como que es X% homóloga a otra secuencia de aminoácidos, los que se quiere decir es el porcentaje de secuencia idéntica o similitud de la secuencia. La similitud de secuencias de aminoácidos se describe con más detalle en la Tabla 1, a continuación.

Subunidad de la quinasa. La quinasa es una proteína de múltiples subunidades. Cada subunidad se define en la presente memoria como un solo polipéptido que es codificado por una secuencia de ácido nucleico.

p85, p70, p62, p55, p50, p43, p40, p38, p36, p33, p31. Para los propósitos de la invención, los términos se refieren a subunidades polipeptídicas de la quinasa antes descrita, en la que cada subunidad tiene un peso molecular correspondiente observado por SDS-PAGE. Por ejemplo, p85 es una subunidad polipeptídica con un peso molecular aproximado de 85 kDa observado por SDS-PAGE, de una quinasa de múltiples subunidades que en su estado activo fosforila al I\kappaB\alpha en las serinas 32 y 36. p70 tiene un peso molecular aproximado por SDS-PAGE de 70 kDa, p62 tiene un peso molecular aproximado por SDS-PAGE de 62 kDa, y así sucesivamente.

Sustrato. Un sustrato para la quinasa es un ligando que es fosforilado como resultado de su interacción con la quinasa.

Ligando. Ligando se refiere a cualquier molécula que puede interaccionar con la quinasa antes descrita o una de sus subunidades. El ligando puede ser un polipéptido natural, o se puede producir de forma sintética o recombinante. El ligando puede ser soluble o estar unido a la membrana. El ligando también puede ser una molécula no proteínica que actúa como ligando cuando interacciona con la quinasa. Las interacciones entre el ligando y la quinasa incluyen, pero no se limitan, cualesquiera interacciones covalentes o no covalentes. Preferiblemente, el ligando interacciona selectivamente con la quinasa. Los agonistas y antagonistas de la quinasa que pueden interaccionar con la quinasa son ejemplos de ligandos de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, el ligando es un inhibidor selectivo de la actividad de la quinasa, es decir, de la capacidad de fosforilar al I\kappaB-\alpha en los restos de serina 32 y 36.

Estados patológicos caracterizados por la activación indeseada del NF-\kappaB. La frase estados patológicos caracterizados por activación indeseada del NF-\kappa-B incluyen, pero no se limita, estados patológicos en un mamífero que pueden incluir inflamación, infección por VIH, cáncer, sepsis, psoriasis, y reestenosis.

Fármaco. Fármaco incluye, pero no se limita, proteínas, péptidos, péptidos degenerados, agentes purificados de medios celulares condicionados, moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas, anticuerpos u oligonucleótidos. Otros fármacos candidatos incluyen análogos del ligando o ligandos de la quinasa antes descrita. El fármaco puede ser natural o se puede producir de forma sintética o recombinante. Un experto en la técnica entenderá que dichos fármacos se pueden desarrollar por los ensayos descritos a continuación.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1. Representación de una autorradiografía de un gel de SDS-PAGE que demuestra que ubc4, pero no ubc3, ayuda a la ubiquitinación del I\kappaB\alpha.

Fig. 2. Las Figuras 2A-2E son representaciones de autorradiografías de geles de SDS-PAGE que demuestran que la quinasa de alto peso molecular descrita en la presente memoria fosforila el I\kappaB\alpha en las serinas 32 y 36.

Fig. 3. Las Figuras 3A-3E son representaciones de autorradiografías de geles de SDS-PAGE que demuestran que en las condiciones del experimento, la fosforilación del I\kappaB\alpha por la quinasa descrita en la presente memoria, requiere ubc4/ubc5.

Fig. 4. Las Figuras 4A-4B son representaciones de autorradiografías de geles de SDS-PAGE que demuestran que en las condiciones del experimento, es necesaria la ubiquitina para la fosforilación del I\kappaB\alpha por la quinasa descrita en la presente memoria.

Fig. 5. Las Figuras 5A-5B son representaciones de autorradiografías de geles de SDS-PAGE que demuestran que en las condiciones del experimento, es necesaria la E1 para la fosforilación del I\kappaB\alpha por la quinasa descrita en la presente memoria. No hay requisitos de ácido okadaico o RelA.

Fig. 6. La Figura 4A-4E es una representación de una autorradiografía de geles de SDS-PAGE que demuestra que en las condiciones del experimento, la I\kappaB\alpha-quinasa es activada por un suceso previo de ubiquitinación. La preincubación de la I\kappaB\alpha-quinasa con enzimas de ubiquitinación y ubiquitina elimina la fase de retardo en la fosforilación del I\kappaB\alpha. La Figura 6B es una representación gráfica de los mismos datos cuantificados por análisis con PhosphorImager.

Fig. 7. La Figura 7A es una representación de una autorradiografía de un gel de SDS-PAGE que demuestra que la I\kappaB\alpha-quinasa es ubiquitinada por ubc4. La Figura 7B es una representación gráfica de las cinéticas de ubiquitinación de la I\kappaB\alpha-quinasa.

Fig. 8. Representación esquemática de las etapas implicadas en la degradación del I\kappaB\alpha. Cuando la quinasa es activada por ubiquitinación, la ubiquitinación es necesaria tanto para la activación de la I\kappaB\alpha-quinasa como para dirigir al I\kappaB\alpha a la degradación por el proteasoma.

Fig. 9. Representación de una autorradiografía en un gel de SDS-PAGE que demuestra que la estaurosporina y su análogo K252a inhiben la fosforilación y ubiquitinación del I\kappaB\alpha en extractos de células HeLa.

Fig. 10. Las Figuras 10A-10D son representaciones de autorradiografías de geles de SDS-PAGE que demuestran que la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa es inducible y que está activada coordinadamente con la activación de la JNK.

Fig. 11. Las Figuras 11A-11D son representaciones gráficas de la actividad del indicador cloranfenicol-acil-transferasa (CAT), que demuestra que MEKK1 es necesaria para la inducción por el TNF-\alpha de los productos génicos dependientes del NF-\kappaB.

Fig. 12. Representación de una autorradiografía de un gel de SDS-PAGE que demuestra que MEKK1 induce la fosforilación específica de lugar del I\kappaB\alpha.

Fig. 13. Las Figuras 13A-13D son representaciones de autorradiografías de geles de SDS-PAGE que demuestran que la MEKK1 activa directamente la I\kappaB\alpha-quinasa.

Fig. 14. Las Figuras 14A-14D son representaciones de autorradiografías de geles de SDS-PAGE en los que se ensayó la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa en las funciones de extracto citoplasmático de célula HeLa en presencia de componentes de ubiquitinación (A y C) o MEKK1\Delta (D).

Fig. 15. Las Figuras 15A-15B son representaciones de autorradiografías de geles de SDS-PAGE que demuestran que la MEKK1 es un activador selectivo de la I\kappaB\alpha-quinasa.

Fig. 16. Las Figuras 16A-16B son representaciones de autorradiografías de geles de SDS-PAGE que demuestran que la MEKK1 activa el complejo de I\kappaB\alpha-quinasa por fosforilación.

Fig. 17. Representación esquemática de un modelo de activación coordinada de I\kappaB\alpha-quinasa y la ruta de JNK por la MEKK1.

Fig. 18. Representación esquemática de un esquema de purificación para la I\kappaB\alpha-quinasa.

Fig. 19. La Figura 19A es una representación de un gel nativo teñido con plata de una fracción de I\kappaB\alpha-quinasa purificada. La Figura 19B es una representación de un gel de SDS-PAGE teñido con plata de la misma fracción de I\kappaB\alpha purificada.

Fig. 20. Representación de una autorradiografía de un gel de SDS-PAGE que demuestra la inhibición de la fosforilación de ^{35}S-I\kappaB\alpha por el I\kappaB\alpha de longitud completa y por I\kappaB\alpha (5-72), un mutante truncado N-terminal del I\kappaB\alpha.

Fig. 21. Las Figuras 21A-21D son secuencias de aminoácidos para pep1-pep4.

Fig. 22. Las Figuras 22A-22B son secuencias de ácidos nucleicos que codifican p50 y p40, respectivamente.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Con propósito de aclarar la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones:

I. Una quinasa sustancialmente pura y sus subunidades.

II. Moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican las subunidades de quinasa.

III. Una sonda de ácido nucleico para la detección específica del ácido nucleico que codifica la quinasa o una de sus subunidades o fragmentos.

IV. Un método para detectar la presencia del ácido nucleico que codifica la quinasa o una de sus subunidades o fragmentos en una muestra.

V. Un kit para detectar la presencia de la quinasa o una de sus subunidades en una muestra.

VI. Construcciones de DNA que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica una subunidad de la quinasa y células que contienen estas construcciones.

VII. Un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica por la quinasa o su subunidad y un hibridoma que contiene el anticuerpo.

VIII. Un método para detectar la quinasa o una de sus subunidades en una muestra.

IX. Un kit de diagnóstico que comprende anticuerpos contra la quinasa o una de sus subunidades.

X. Detección de diagnóstico y tratamiento.

XI. Ligandos de la quinasa.

XII. Bioensayos para obtener ligandos de la quinasa.

XIII. Ratones transgénicos y knockout.

I. Una quinasa purificada y sus subunidades

La presente invención se refiere a una quinasa purificada que, en su estado activado es capaz de fosforilación específica de lugar del I\kappaB\alpha. Más específicamente, la quinasa se puede activar por ubiquitinación o por fosforilación por la MEKK1.

Se ha mostrado que la degradación de una serie de proteínas es inducida por fosforilación (Lin & Desiderio, Science 260:953-959 (1993); Yaglom, J. et al., Mol. Cell. Biol. 15:731-741 (1995)) y desfosforilación (Nishizawa, M. et al., EMBO J. 12:4021-4027 (1993)), y en algunos casos se ha implicado la ruta de ubiquitina-proteasoma. La degradación del I\kappaB\alpha es un ejemplo bien caracterizado de acoplamiento entre fosforilación y ubiquitinación (Chen, ZJ. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995); Scherer, D.C. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 92:11259-11263 (1995); Alkalay, I. et al., Proc. Natl. Acad. Set USA 92:10599-10603 (1995)). Se ha mostrado previamente que la ubiquitinación del I\kappaB\alpha es regulada por su fosforilación en las serinas 32 y 36 (Chen, ZJ. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995)), restos requeridos para la fosforilación y degradación inducidas por señal del I\kappaB\alpha in vivo (Brown, K. et al., Science 267:1485-1491 (1995); Brockman, J.A. et al., Mol. Cell. Biol. 15:2809-2818 (1995); Traenckner, E.B.-M. et al., EMBO J. 14:2876-2883 (1995); Whiteside, S.T. et al., Mol. Cell. Biol. 15:5339-5345 (1995)).

La actividad de la quinasa descrita aquí tiene varias propiedades esperadas para una I\kappaB\alpha-quinasa auténtica. La quinasa activada fosforila tanto al I\kappaB\alpha libre como al I\kappaB\alpha unido a RelA, en los restos de serina 32 y 36. Además, I\kappaB\alpha fosforilado por esta quinasa permanece unido al NF-\kappaB, una propiedad esperada por los estudios in vivo (revisado por Finco & Baldwin, Immunity 3:263-272 (1995)). Esta propiedad de la quinasa está en contraste con los ejemplos previos de fosforilación del I\kappaB\alpha in vitro, que daban como resultado la disociación del complejo de NF-\kappaB/I\kappaB\alpha (Ghosh & Baltimore, Nature 344:678-682 (1990); Kumar, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6288-6292 (1994)). Finalmente, el I\kappaB\alpha fosforilado in vitro puede ser ubiquitinado en restos de lisina específicos (K21 y K22) (Chen, ZJ. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995); Scherer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11259-11263 (1995); Baldi et al., J. Biol. Chem. 271:376-379 (1996)), y estos restos son necesarios para la degradación inducida por señal del I\kappaB\alpha in vivo (Scherer, D.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11259-11263 (1995)).

Purificación de la quinasa

Se demostró previamente que el inhibidor de fosfatasa, ácido okadaico, induce la fosforilación y ubiquitinación de I\kappaB\alpha traducido in vitro en un extracto citoplasmático de células HeLa (Chen, Z.J. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995)). Para identificar las enzimas implicadas en la ubiquitinación in vitro del I\kappaB\alpha, los extractos citoplasmáticos se separaron en dos fracciones por cromatografía de intercambio iónico en MonoQ. La fracción I (Fr.I) es el flujo a través de la columna MonoQ, mientras que la fracción II (Fr.II) es el eluato en KCl 0,5 M. Se ensayó la capacidad de cada fracción de ayudar a la ubiquitinación de I\kappaB\alpha. La mezcla de reacción contenía I\kappaB\alpha marcado con ^{32}S traducido in vitro, un sistema de regeneración de ATP, E1, ubiquitina, ubiquitina-aldehído (para inhibir isopeptidasas) y ácido okadaico (Chen, Z.J. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995)).

Ninguna de las fracciones solas era suficiente para ayudar a la ubiquitinación de I\kappaB\alpha (Figura 1, calles 3 y 7). Sin embargo, cuando la Fr.I se mezcló con la Fr.II se observó multiubiquitinación del I\kappaB\alpha (Figura 1, calle 8). Se sabe que la Fr.I contiene una subfamilia de E2 llamada UBC4/UBC5, mientras que la Fr.II contiene todas las demás E2 conocidas (Pickart & Rose, J. Biol. Chem. 260:1573-1581 (1985)). Se llevaron a cabo experimentos para determinar si el UBC4 recombinante de levadura puede sustituir a la Fr.I en la catálisis de la ubiquitinación de I\kappaB\alpha. El UBC4 de levadura solo cataliza la formación de conjugados ubiquitinados de I\kappaB\alpha de bajo peso molecular (Figura 1, calle 2). La formación independiente de E3 de conjugados de bajo peso molecular catalizada por ciertas E2 se ha descrito previamente (Pickart & Rose, J. Biol. Chem. 260:1573-1581 (1985)). La importancia biológica de esta ubiquitinación no esta clara, puesto que estos conjugados no son degradados por el proteasoma 26S (Hershko and Heller, Biochem. Biophys. Res. Comm. 128:1079-1086 (1985)). Sólo son reconocidos y degradados por el proteasoma 26S sustratos de proteína conjugados a una cadena de multiubiquitina (Chau, V. et al., Science 243:1576-1583 (1989)). Cuando se añade UBC4 recombinante junto con la Fr.II, se reconstituye la multiubiquitinación del I\kappaB\alpha (Figura 1, calle 4). Como testigo, un extracto de E. coli de prueba o UBC3 recombinante (también denominado CDC34) no mediaron la ubiquitinación del I\kappaB\alpha juntamente con la Fr.II (Figura 1, calles 5 y 6). El UBC5 recombinante humano (UBCh5) también ayudó a la ubiquitinación de I\kappaB\alpha cuando se añadió junto con la Fr.II. Por lo tanto, la E2 requerida para la ubiquitinación de I\kappaB\alpha en extractos de células HeLa pertenece a la familia de UBC4/UBC5 de las E2. Recientemente, se ha mostrado que es necesario otro miembro de la familia de UBC4/UBC5 (E2-F1) para la degradación del I\kappaB\alpha in vitro (Alkalay, I. et al., Mol. Cell. Biol. 75:1294-1301 (1995)). Una implicación importante de estos resultados es que esta fracción II contiene tanto la quinasa como la E3 necesarios para la fosforilación y ubiquitinación del I\kappaB\alpha.

La fracción II se sometió a purificación adicional como medio para identificar la I\kappaB\alpha-quinasa y E3. Para ensayar la actividad de la quinasa, se aprovechó la observación de que la fosforilación inducida por señal de I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S conduce a una reducción de su movilidad electroforética en SDS-PAGE (Chen, Z.J. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995)). La fracción II se separó por cromatografía FPLC/monoQ en cinco fracciones usando elución isocrática con KCl 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M y 0,5 M. La actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa se detectó en la fracción 0,3 M. Esta fracción se concentró por precipitación en sulfato amónico (40%), se volvió a suspender y se fraccionó por cromatografía de exclusión por tamaño usando FPLC/Superdex 200 (Figura 2A). El máximo de la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa eluyó en la fracción 19, que correspondía a una masa molecular aparente de aproximadamente 700 kDa. Para descartar la posibilidad de que el gran tamaño se debiera a agregación, las fracciones que contenían quinasa se volvieron a fraccionar en MonoQ con un gradiente lineal de NaCl 0,15 M-0,4 M, y se agruparon los máximos de actividad y se volvió a clasificar por tamaño en Superdex-200.

Como se muestra en la Figura 2B, el máximo de la actividad de la quinasa eluyó otra vez en la fracción 19. La ovalbúmina, que se incluyó como proteína vehículo, eluyó en una fracción correspondiente a su masa molecular esperada (43 kDa). Por lo tanto, el peso molecular aparentemente alto de la quinasa no es debido a la formación de agregados no específicos. Cuando se analizó la fracción que contenía quinasa en un gel de poliacrilamida nativo, se observaron tres bandas de peso molecular alto predominantes. Aunque no se pueden calcular con precisión los pesos moleculares de estos complejos en el sistema de gel nativo, las bandas migraron con movilidades correspondientes a pesos moleculares de aproximadamente 700 kDa, de acuerdo con el tamaño predicho por la filtración en gel. En SDS-PAGE, estas proteínas grandes se separaron en distintas especies de múltiples pesos moleculares menores, sugiriendo que la quinasa es un complejo de multisubunidades. Se usaron las fracciones activas de Superdex-200 para investigar los requisitos bioquímicos para la actividad de la quinasa.

Un ensayo crítico de la especificidad de la actividad de la quinasa es determinar si fosforila los restos de serina 32 y 36 del I\kappaB\alpha. Se ensayó un panel de I\kappaB\alpha mutantes que incluía: \DeltaN (truncado N-terminal en el aminoácido 72), S32A/S36A (sustituciones de serina por alanina en los restos 32 y 36), y S32E/S36E (sustituciones de serina por ácido glutámico en los restos 32 y 36) (Brockman, J.A. et al., Mol. Cell. Biol. 15:2809-2818 (1995)). Como se muestra en la Figura 2C, la fosforilación de I\kappaB\alpha de tipo salvaje dio como resultado una reducción de la movilidad electroforética (calle 2). En contraste, la incubación del las proteínas I\kappaB\alpha mutantes con la fracción de quinasa no condujeron a un cambio en la movilidad electroforética (Figura 2C, calles 4, 6, 8). El mutante S32E/S36E presentó una menor movilidad electroforética (debido a las dos cargas negativas), que no se afectó por la actividad de la quinasa.

Aunque los resultados mostrados en la figura 2C sugieren claramente que la quinasa fosforila al I\kappaB\alpha en los restos de serina 32 y 36, hay una posibilidad remota de que estos dos restos de serina funcionen como un sitio de "anclaje" para la quinasa, y realmente la fosforilación se produzca en cualquier otra parte. Para descartar esta posibilidad, se eliminó el fragmento N-terminal del I\kappaB\alpha fosforilado con trombina, que escinde después del resto 62. Se determinó si el fragmento N-terminal todavía estaba fosforilado (Figura 2D y E). En la Figura 2D, se incubaron I\kappaB\alpha de tipo salvaje (calles 3 y 4) y el mutante S32A/S36A (calles 5 y 6) con la fracción de quinasa y después se analizaron antes y después de tratamiento con fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIP). Puesto que tanto las proteínas de tipo salvaje como mutantes se marcaron con un epítopo FLAG en su extremo N (Brockman, J.A. et al., Mol. Cell. Biol. 15:2809-2818 (1995); Chen, Z.J. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995)), se ensayó el I\kappaB\alpha de tipo salvaje que no estaba marcado con epítopo (calles 1 y 2) para asegurar que el epítopo FLAG no complica la interpretación de los resultados.

El tratamiento con fosfatasa del I\kappaB\alpha de tipo salvaje fosforilado, convirtió la forma migrante más lenta en la forma migrante más rápida (Figura 2D, calles 1 y 4), y esta conversión era bloqueada por inhibidores de fosfatasa. Cuando se analizaron los fragmentos N-terminales escindidos por trombina de la proteína de tipo salvaje en un gel de Tris-tricina al 16,5% (Figura 2E), se encontró que los fragmentos N-terminales (aproximadamente 8 kDa) contenían grupos fosforilo que podían ser desfosforilados por la CIP (calles 1-4). El tratamiento con fosfatasa no alteró la movilidad electroforética ni de la proteína intacta ni del fragmento N-terminal del mutante S32A/S36A (Figura 2D y E, calles 5 y 6), indicando que este mutante no estaba fosforilado en el extremo N. Puesto que los únicos restos en el extremo N del I\kappaB\alpha que pueden ser fosforilados son las serinas 32 y 36 (Haskill, S. et al., Cell 55:1281-1289 (1991)), se concluyó que la fosforilación del I\kappaB\alpha por la I\kappaB\alpha-quinasa de alto peso molecular se produce en las serinas 32 y 36.

UBC4/UBC5 pueden ser necesarios para la fosforilación del I\kappaB\alpha

Los ensayos de fosforilación del I\kappaB\alpha se llevaron a cabo inicialmente en las mismas condiciones que los ensayos para la ubiquitinación del I\kappaB\alpha, es decir, se añadió siempre la fracción I a la reacción. Cuando se omitió la fracción I en la reacción, la fosforilación del I\kappaB\alpha se redujo notablemente (Figura 3A, calles 4 y 5). Como se esperaba, la fracción I no estimuló la fosforilación del mutante del I\kappaB\alpha S32A/S36A (calles 1 y 2). La actividad estimuladora de quinasa de la fracción I se podía sustituir por UBC4 de levadura o UBC5 humano (GST-UBCh5) recombinantes purificados (Figura 3B). La especificidad de esta actividad estimuladora de E2 se investigó ensayando cinco otras proteínas E2 purificadas distintas de reticulocitos de conejo, incluyendo E2_{14k}, E2_{17k}, E2_{20k}, E2_{25k}, y E2_{35k}. Increíblemente, ninguna de estas E2 estimuló la actividad de la quinasa (Figura 3C, calles 2-6). Igualmente, el UBC2 humano recombinante (Figura 3C, calle 7) y UBC3 de levadura tampoco estimularon la actividad de la quinasa. Todas estas E2 forman tioéster con la ubiquitina marcada con ^{125}I en presencia de E1 y ATP (Figura 3D). Por lo tanto, entre todas las E2 ensayadas hasta ahora, UBC4/UBC5 tienen la capacidad única de estimular la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa.

Después se determinó si es necesaria la actividad catalítica de las proteínas E2 para su capacidad de estimular la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa. Específicamente, se sustituyó el resto de cisteína del sitio activo del UBCh5 por alanina (C85A) o serina (C85S), y se analizaron los efectos de estas sustituciones en la fosforilación del I\kappaB\alpha dependiente de E2. Como se esperaba, estos dos mutantes eran defectuosos para formar tioésteres con la ^{125}I-ubiquitina (Figura 3D, calles 10-11). Significativamente, tampoco pudieron estimular la fosforilación del I\kappaB\alpha por la I\kappaB\alpha-quinasa (Figura 3C, calles 10-11). También se encontró que la inactivación del UBC4 o UBC5 por la N-etilmaleimida (NEM), dio como resultado una pérdida de la actividad estimuladora de la I\kappaB\alpha-quinasa. Finalmente, cuando se añadieron los mutantes C85A o C85S de GST-UBCh5 con un gran exceso (mutante:tipo salvaje = 20:1) a la reacción de fosforilación, se inhibió la fosforilación del I\kappaB\alpha dependiente de UBC5 (Figura 3E, calles 1 y 2). Como testigo, GST no tenía efecto en la fosforilación del I\kappaB\alpha (calle 3). Por lo tanto, los mutantes de UBC5 en el sitio activo parece que funcionan como mutantes negativos dominantes para inhibir la fosforilación del I\kappaB\alpha. Estos resultados muestran que en esas condiciones, es necesaria la función de conjugación de la ubiquitina de UBC4/UBC5 para la fosforilación del I\kappaB\alpha por la I\kappaB\alpha-quinasa.

La ubiquitina puede ser necesaria para la fosforilación del I\kappaB\alpha

El requisito inusual de E2 catalíticamente activa en el ensayo de la I\kappaB\alpha-quinasa sugería que la ubiquitina, que estaba presente en la mezcla de ensayo, podía ser también necesaria. De hecho, no se observó la fosforilación del I\kappaB\alpha cuando no se añadió ubiquitina a la reacción (Figura 4A, calle 1). Sin embargo, se observaron niveles significativos de fosforilación del I\kappaB\alpha en presencia de ubiquitina 1 \muM (calle 4), que es menos que la concentración fisiológica de ubiquitina (10-20 \muM; Haas & Bright, J. Biol. Chem. 250:12464-12473 (1985)). La dependencia con la concentración del requisito de ubiquitina sugiere un comportamiento altamente cooperador, de acuerdo con la posibilidad de que es necesaria la formación de cadena de multiubiquitina para la fosforilación de I\kappaB\alpha.

Una serie de observaciones descartan la posibilidad de que el efecto estimulador de quinasa de la ubiquitina sea debido a un contaminante en la preparación de ubiquitina (Sigma). Primero, la ubiquitina recombinante (tanto bovina como de levadura) expresada en E. coli estimula la actividad de la quinasa; segundo, cuando la ubiquitina (Sigma) se purificó adicionalmente por FPLC-monoS, la actividad estimuladora de quinasa se copurificó con la ubiquitina; tercero, la ubiquitina metilada (MeUb) no estimula la actividad de quinasa, si no que en su lugar inhibe competitivamente la fosforilación dependiente de ubiquitina de I\kappaB\alpha (Figura 4B). Estudios previos han mostrado que la MeUb es activada por E1, transferida a E2, y después conjugada con sustratos de proteína. Sin embargo, los conjugados que contienen la MeUb no pueden ser multiubiquitinados debido a que carecen de los restos de lisina libres en la MeUb (Hershko & Heller, Biochem. Biophys. Res. Comm. 128:1079-1086 (1985)).

Cuando se permite que se forme primero un tioéster de E2-Ub entre el UBC4 y una baja concentración de ubiquitina (2,4 \muM), y después se mezcla con un gran exceso de MeUb (40 \muM), se inhibe la fosforilación del I\kappaB\alpha (Figura 4B, calle 4). Esta inhibición se puede invertir añadiendo un gran exceso de ubiquitina durante la formación del tioéster (calle 5). Sin embargo, si el UBC4 y la MeUb forman un tioéster primero, seguido de la adición de ubiquitina, no se observa fosforilación del I\kappaB\alpha, incluso cuando la ubiquitina está en exceso (Figura 4B, calles 7 y 8). Por lo tanto, en estas condiciones, parece que es necesaria la multiubiquitinación para la actividad de la quinasa. De acuerdo con esta posibilidad, la ubiquitina-aldehído inhibidor de isopeptidasa potencia la fosforilación del I\kappaB\alpha en extractos brutos. Sin embargo, esta potenciación no se observa con las fracciones de quinasa más purificadas, supuestamente debido a la ausencia de isopeptidasas que contaminan.

Requisitos adicionales para la fosforilación del I\kappaB\alpha

Los requisitos de UBC4/UBC5 y ubiquitina para la fosforilación del I\kappaB\alpha nos condujo a determinar si también es necesaria E1 para esta actividad. El I\kappaB\alpha usado en estos experimentos fue traducido en un extracto de germen de trigo que contiene la E1 de trigo. Por lo tanto, fue necesario aislar el I\kappaB\alpha del extracto por inmunoprecipitación. Primero se permitió que I\kappaB\alpha se asociara con el homodímero RelA recombinante, y después se precipitó el complejo con el antisuero contra RelA. Los inmunoprecipitados se usaron directamente como un sustrato en el ensayo de fosforilación del I\kappaB\alpha. Como se muestra en la Figura 5A, la fosforilación del I\kappaB\alpha requería la adición de la E1 o extracto de germen de trigo. Este experimento también mostró que no era necesario ningún otro componente del extracto de germen de trigo para la fosforilación del I\kappaB\alpha.

El ácido okadaico inhibidor de fosfatasa es necesario para observar la fosforilación y ubiquitinación del I\kappaB\alpha en extractos citoplasmáticos de células HeLa brutos (Chen, Z.J. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995)). Estos extractos también contenían cantidades sustanciales de proteínas rel. Por lo tanto, es posible que el I\kappaB\alpha deba estar en un complejo con proteínas rel con el fin de ser fosforilado con precisión. Por estas razones, todos los ensayos de fosforilación antes descritos contienen ácido okadaico y homodímeros RelA recombinantes. Aunque era necesaria la presencia de ácido okadaico para observar la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa durante las primeras etapas de purificación de la quinasa, no era necesaria para la actividad de I\kappaB\alpha-quinasa parcialmente purificada (Figura 5B, calle 4). Por lo tanto, se debe haber eliminado una fosfatasa sensible al ácido okadaico durante la purificación de la I\kappaB\alpha-quinasa. RelA no es necesario para la fosforilación del I\kappaB\alpha in vitro (Figura 5B, calle 3). Esta observación está de acuerdo con un informe reciente de que el homólogo de I\kappaB de Drosophila Cactus experimenta degradación inducida por señal (y supuestamente también fosforilación) en embriones de Drosophila que carecen de la proteína de la familia rel Dorsal (Belvin, M.P. et al., Genes & Dev. 9:783-793 (1995)).

Un suceso de ubiquitinación activa la I\kappaB\alpha-quinasa

¿Por qué la fosforilación del I\kappaB\alpha por la I\kappaB\alpha-quinasa puede requerir E1, UBC4 o UBC5, y ubiquitina?. Una posibilidad es que sea necesaria la ubiquitinación de un factor hasta ahora no identificado para la activación de la I\kappaB\alpha-quinasa. Esta posibilidad está de acuerdo con el transcurso de tiempo de la fosforilación del I\kappaB\alpha, que es bifásico: un retardo de 6 min seguido de un desencadenamiento de fosforilación del I\kappaB\alpha (Figura 6A, calles 1-5; Figura 6B). Este comportamiento cinético sugiere que a la activación de la quinasa le precede un suceso adicional. Para ensayar esta posibilidad, se preincubó I\kappaB\alpha-quinasa parcialmente purificada con E1, UBC4 y ubiquitina en presencia de ATP a 37ºC durante 10 min, y después se inició la reacción de fosforilación por adición de I\kappaB\alpha marcado con 35S (Figura 6A, calles 10-13; Figura 6B). Increíblemente, la preincubación eliminó la fase de retardo de la fosforilación del I\kappaB\alpha. Cuando no se añadió la I\kappaB\alpha-quinasa a la mezcla de preincubación (Figura 6B), o cuando se omitió la ubiquitina en la mezcla de preincubación (Figura 6A, calles 6-9; Figura 6B), la fase de retardo de fosforilación del I\kappaB\alpha persistió. El grado de fosforilación del I\kappaB\alpha se redujo ligeramente cuando se incluyó I\kappaB\alpha-quinasa en la mezcla de preincubación (compárense las calles 5, 9 y 13 en la Figura 6A). Esto se debe probablemente a la inestabilidad de la I\kappaB\alpha-quinasa cuando se incuba a 37ºC durante 10 minutos adicionales. Estos resultados sugieren claramente que la I\kappaB\alpha-quinasa era activada durante el periodo de preincubación, muy probablemente por un suceso de ubiquitinación.

Para demostrar directamente que se produce ubiquitinación durante la reacción de preincubación, se incubaron E1, UBC4 y I\kappaB\alpha-quinasa con ^{125}I-Ub en presencia de ATP a 37ºC. Como se muestra en la Figura 7A, se observó una acumulación dependiente del tiempo de conjugados ubiquitinados de alto peso molecular (estos conjugados no podían entrar en el gel concentrador al 5%). La cinética de acumulación de conjugados era paralela a la de fosforilación del I\kappaB\alpha sólo cuando la I\kappaB\alpha-quinasa se preincubó con E1, UBC4 y ubiquitina (compárese la Figura 6B y Figura 7B). Esta observación está de acuerdo con la idea de que la formación de estos conjugados precede a la fosforilación del I\kappaB\alpha. No se observó la formación de conjugado cuando se eliminaron el UBC4 o la I\kappaB\alpha-quinasa de la reacción de conjugación (Figura 7A, calles 8 y 9). Además, la formación de estos conjugados se redujo aproximadamente 50% por la presencia de MeUb en exceso (calle 11). La inhibición completa de la actividad de la quinasa por la MeUb observada en el experimento de la Figura 4B, era probablemente la consecuencia de permitir que E2 formara un tioéster con un gran exceso de MeUb antes de la adición de ubiquitina. Todos estos resultados apoyan la hipótesis de que es necesaria la ubiquitinación de un factor desconocido (factor X, probablemente como parte del complejo de quinasa) para la activación de la I\kappaB\alpha-quinasa. Puesto que la multiubiquitinación de sustratos de proteína normalmente requiere una E3, el complejo de I\kappaB\alpha-quinasa probablemente contiene una actividad de E3.

Otro ejemplo del acoplamiento de fosforilación y ubiquitinación se proporciona por la ubiquitinación de ciclinas mitóticas por el ciclosoma, un complejo 20S que alberga la actividad de E3 (E3-C; Sudakin, V. et al., Mol. Biol. Cell. 6:185-198 (1995); King, R.W. et al., Cell 81:279-288 (1995)). La actividad de E3-C depende de cdc2, una quinasa dependiente de ciclina. Sin embargo, la activación de E3-C por cdc2 es indirecta, puesto que el tratamiento previo del ciclosoma con cdc2 suprime una fase de retardo en la ubiquitinación de las ciclinas. Por lo tanto, se podría propagar una cascada de fosforilación desde cdc2 en el ciclosoma.

La determinación del papel de esta quinasa in vivo requerirá la identificación e inactivación del (los) gen(es) que codifica(n) el complejo de quinasa. En relación con esto, es interesante que la inactivación térmica de la proteína E1 mutante da como resultado la acumulación de I\kappaB\alpha no fosforilado en células estimuladas por IL-1 (Alkalay, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:10599-10603 (1995)). En contraste, las células estimuladas tratadas con inhibidores de proteasomas acumulan tanto I\kappaB\alpha fosforilado como no fosforilado. Estas observaciones están de acuerdo con la posibilidad de que la E1 sea necesaria tanto para la fosforilación como para la degradación del I\kappaB\alpha in vivo.

La ubiquitinación y degradación no dependiente de ubiquitina, activa la quinasa puesto que no es necesaria la actividad proteolítica para la fosforilación del I\kappaB\alpha en el sistema parcialmente purificado. Además, los inhibidores de proteasomas no inhiben la fosforilación del I\kappaB\alpha in vivo (Palombella, V.J., Cell 78:773-785 (1994), Traenckner, E.B.-M. et al., EMBO J. 13:5433-56441 (1994); Brockman, J.A. et al., Mol. Cell. Biol. 15:2809-2818 (1995); Chen, Z.J. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995)) o in vitro (Scherer, D.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11259-11263 (1995)). Además, la activación de la I\kappaB\alpha-quinasa in vitro se correlaciona con la acumulación de conjugados multiubiquitinados que no son degradados (Figura 6 y 7). Finalmente, en contraste con la ubiquitina metilada en la que los siete restos lisina está bloqueados por metilación, un mutante de ubiquitina (K48R), que no puede formar cadenas de multiubiquitina por K48, todavía es capaz de estimular la actividad de I\kappaB\alpha-quinasa. Se cree que las cadenas de multiubiquitina unidas a K48 son reconocidas específicamente por el proteasoma 26S (Chau, V. et al., Science 243:1576-1583 (1989)). Sin embargo, pueden existir en células cadenas de multiubiquitina con uniones por los restos de lisina distintos de K48 y juegan un papel importante en la respuesta al estrés (Arnason & Ellison, Mol. Cell. Biol. 14:7876-7883 (1994)) y reparación del DNA (Spence, J. et al., Mol. Cell. Biol. 15:1265-1273 (1995)). Es posible que estén implicadas diferentes configuraciones de cadena de multiubiquitina en la regulación de la actividad de la proteína, más que en la proteolisis (Arnason & Ellison, Mol. Cell. Biol. 14:7876-7883 (1994)).

Aunque un componente de la quinasa parcialmente purificada es ubiquitinado in vitro cuando la quinasa es activada por ubiquitinación, no se ha identificado la diana de la ubiquitinación. Esta diana podría ser la quinasa o un componente esencial del complejo de quinasa. Esta modificación covalente del complejo de I\kappaB\alpha-quinasa podría activar la quinasa por inducción de un cambio conformacional, o la ubiquitinación podría inactivar un inhibidor de quinasa. Se ha mostrado que varios inhibidores de quinasas dependientes de ciclina (CDK), tales como P40^{SICI} (Schwob, E. et al., Cell 79:233-244 (1994)); Farl (McKinney, J.D. et al., Gene & Dev. 7:833-843 (1993)), y p27 (Pagano, M. et al., Science 269:2682-685 (1995)) son dianas de la ruta de ubiquitina-proteasoma, pero no parece que ninguno de ellos sean inactivado sólo por ubiquitinación. Otros ejemplos de proteínas cuyas actividades pueden ser reguladas por ubiquitinación son quinasas asociadas a receptores (revisado por Ciechanover, A., Cell 79:13-21 (1994)). Por ejemplo, se ha descrito que la ubiquitinación inducida por antígeno del receptor E de inmunoglobulina (FC\varepsilonRI) no depende de la fosforilación previa del receptor, pero está ligada a la activación de la molécula (Paolini & Kinet, EMBO J. 72:779-786 (1993)). El desacoplamiento del antígeno da como resultado la desubiquitinación rápida. No se sabe si la ubiquitinación sirve para provocar la subregulación del receptor por proteolisis, o si lleva a cabo otras funciones reguladoras.

Puede ser necesario un suceso de ubiquitinación para la activación de la I\kappaB\alpha-quinasa in vitro (Figura 8), pero no se ha determinado si este suceso es regulado in vivo. Es posible que la actividad de la quinasa sea constitutiva in vivo y la fosforilación del I\kappaB\alpha sea controlada por inactivación de una fosfatasa. Alternativamente, la actividad de la quinasa es regulada por señales que inducen el NF-\kappaB. La primera posibilidad está de acuerdo con la observación de que no es necesario el ácido okadaico para activar la actividad de la quinasa en las fracciones más purificadas (Figura 5B). Además, la I\kappaB\alpha-quinasa se purificó a partir de extractos de células HeLa. Sin embargo, las células HeLa pueden tener un nivel relativamente alto de actividad de quinasa "constitutiva" comparada con células normales (no transformadas). El NF-\kappaB puede ser activado sólo por ácido okadaico en células transformadas, mientras que es necesaria una señal adicional tal como H_{2}O_{2} para activar el NF-\kappaB en células primarias (Menon, S.D. et al., J. Biol. Chem. 268:26805-26812 (1993)). Es posible que el estado de fosforilación del I\kappaB\alpha in vivo esté determinado por un equilibrio entre las actividades de la quinasa y fosfatasa, y una pequeña sobrerregulación de la quinasa sería suficiente para dirigir el I\kappaB\alpha a la ruta de degradación. Puede no ser posible mimetizar estas condiciones in vitro donde las enzimas de ubiquitinación y ubiquitina están en un gran exceso.

La mayoría, si no todos, los inductores del NF-\kappaB conocidos dan como resultado estrés oxidativo mediante la generación de productos intermedios con oxígeno reactivo (ROI, Schmidt et al., 1995). Los ROI podrían afectar a la fosforilación del I\kappaB\alpha directamente por activación de la(s) I\kappaB\alpha-quinasa(s) o por inactivación de la(s) I\kappaB\alpha-

\hbox{fosfatasa(s)}

. Alternativamente, el efecto de los ROI en la fosforilación de I\kappaB\alpha puede ser indirecto. Por ejemplo, los ROI pueden provocar una respuesta de estrés, que a su vez conduciría a la fosforilación del I\kappaB\alpha.

Ciertas proteínas (es decir RNasa A) proporcionan una posible conexión entre los ROI y la ruta de ubiquitina-proteasoma, en las que la oxidación suave de restos metionina aumenta mucho su susceptibilidad a la ubiquitinación (Hershko, A. et al., J. Biol. Chem. 261:11992-11999 (1986)). Igualmente, la oxidación de la glutamina-sintetasa en
E. coli en un solo resto de histidina por H_{2}O_{2}, da como resultado la inactivación y degradación de esta enzima (Levine, R.L., J. Biol. Chem. 258:11823-11827 (1983); Fucci, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1521-1525 (1983)). Por lo tanto, un modelo de transducción de señales por NF-\kappaB, es que los inductores del NF-\kappaB producen estrés oxidativo, potenciando así la multiubiquitinación de un componente de la I\kappaB\alpha-quinasa, lo cual conduce a la fosforilación del I\kappaB\alpha en los sitios específicos.

Si el complejo de I\kappaB\alpha-quinasa es regulado por los ROI, la diana oxidativa podría ser la quinasa, E3 u otros componentes de la maquinaria de ubiquitinación. Sin embargo, no parece probable que las E2 sean las dianas de los ROI. En general se considera que la actividad de UBC4/UBC5 es constitutiva, aunque la síntesis de las proteínas pueda ser sobrerregulada como respuesta al estrés (Seufert & Jentsch, EMBO J. 9:543-550 (1990)). Puesto que la fosforilación del I\kappaB\alpha se produce en unos minutos después de la estimulación, y no requiere nueva síntesis de proteínas, no es probable que la fosforilación del I\kappaB\alpha sea regulada a nivel de la síntesis de UBC4/UBC5. Estas E2 solas probablemente no determinan las especificidades de sustrato, puesto que participan en la ubiquitinación de una variedad de proteínas. En su lugar, estas E2 funcionan juntamente con la E3 específicas para reconocer proteínas diana. El reconocimiento específico del I\kappaB\alpha fosforilado probablemente requiere una E3 (E3y, Figura 8), que sigue sin estar identificada.

Por lo tanto, aquí se muestra que puede ser necesario un suceso de ubiquitinación para la activación de una I\kappaB\alpha-quinasa, que fosforila el I\kappaB\alpha en las serinas 32 y 36. Esta ruta de ubiquitinación de dos etapas para la degradación de I\kappaB\alpha se ilustra en la Figura 8. La ubiquitinación de la I\kappaB\alpha-quinasa no requiere una E3 exógena, sugiriendo que el complejo de I\kappaB\alpha-quinasa tiene una actividad de E3 (E3_{x}, Figura 8). Después la quinasa activada fosforila el I\kappaB\alpha, dirigiendo así al inhibidor a la ruta de ubiquitina-proteasoma. La E3 necesaria para el segundo suceso de ubiquitinación (E3_{y}) puede ser distinta de la E3_{X}, puesto que la quinasa parcialmente purificada no puede ubiquitinar el I\kappaB\alpha en presencia de E1, UBC4/UBC5 y Ub.

No sólo es fosforilado el I\kappaB\alpha como respuesta a una variedad de señales extracelulares, si no que también se observa un nivel básico de fosforilación. Se ha hecho un mapa de los sitios de fosforilación básica en los sitios C-terminales de la caseína-quinasa II (CKII) en la región PEST del I\kappaB\alpha, y la Ser-293 es el sitio preferido de fosforilación (Barroga, C.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7637-7641 (1995); Kano, K. et al., J. Biol. Chem. 270:27914-27919 (1995)).La caseína-quinasa II y una quinasa de 42 kDa (probablemente similar a la caseína-quinasa II) se unen al I\kappaB\alpha y catalizan la fosforilación básica del I\kappaB\alpha in vitro. Sin embargo, la supresión de una región C-terminal del I\kappaB\alpha que incluye la secuencia PEST, o mutación de los sitios de fosforilación básica, no evita la fosforilación inducible del I\kappaB\alpha (Brown, K. et al, Science 267:1485-1491 (1995); Brockman, J.A. et al., Mol. Cell. Biol. 15:2809-2818 (1995); Traenckner, E.B.-M et al., EMBO J. 14:2876-2883 (1995); Whiteside, S.T. et al., Mol. Cell. Biol. 15:5339-5345 (1995); Verma, I.M. et al., Genes & Dev. 9:2723-2735 (1995)). De acuerdo con este resultado se encontró que la supresión de 75 aminoácidos C-terminales del I\kappaB\alpha no evita que la quinasa descrita aquí fosforile este mutante. Por otra parte, la degradación inducida de I\kappaB\alpha es dificultada por la supresión de la secuencia PEST C-terminal (Brown, K. et al, Science 267:1485-1491 (1995); Rodriguez, M.S. et al., Mol. Cell. Biol. 15:2413-2419 (1995); Whiteside, S.T. et al., Mol. Cell. Biol. 15:5339-5345 (1995)). Esto puede no ser debido a la falta de fosforilación básica, puesto que el mutante de I\kappaB\alpha en el que los cinco sitios de CKII en el extremo C se han mutado a alanina todavía es degradado por estimulación por el TNF\alpha (revisado por Verma, I.M. et al., Genes & Dev. 9:2723-2735)). Por lo tanto, el papel de la secuencia PEST C-terminal, si tiene alguno, en la degradación del I\kappaB\alpha inducida sigue sin quedar establecido.

La actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa puede ser inducible por el TNF-\alpha

Los estudios previos dejaron abierta la cuestión de si la I\kappaB\alpha-quinasa es regulada por inductores del NF-\kappaB. En estos estudios, la I\kappaB\alpha-quinasa se detectó como una actividad aparentemente constitutiva en extractos citoplasmáticos S100 preparados a partir de células HeLa no inducidas. usando el procedimiento de lisis hipotónica de Dignam, J.D. et al., Nucl. Acids Res. 11:1475-1489 (1983) (Chen, Z.J. et al., Cell 84:853-862 (1996)). Usando un método alternativo para preparar extractos citoplasmáticos (un procedimiento de lisis rápida descrito antes), se encuentra que la I\kappaB\alpha-quinasa puede ser inducida por el TNF-\alpha. Las células HeLa se trataron con TNF-\alpha durante diferentes periodos de tiempo, y en los extractos sometidos a lisis rápida se ensayó la presencia de I\kappaB\alpha endógeno por transferencia Western, y la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa por incubación con I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S exógeno en presencia de ácido okadaico (Figuras 10A y 10B). En estos y todos los experimentos posteriores, el ácido okadaico se usa estrictamente como un inhibidor de fosfatasa (es decir, para preservar las especies de I\kappaB\alpha fosforiladas) más que como un inductor de la fosforilación de I\kappaB\alpha (Thevenin, C. et al., New Biol. 2:793-800 (1990); Traenckner, E.B.-M. et al., EMBO J. 14:2876-2883 (1995)). De acuerdo con resultados previos (Henkel, T. et al. Nature 365:182-185 (1993); Mellits, K.H. et al., Nucl. Acids Res. 21:5059-5066 (1993)), los extractos de células HeLa no inducidas contienen I\kappaB\alpha hipofosforilado (Figura 10A, calle 1), pero después de sólo 5 min de tratamiento con TNF-\alpha una parte significativa del I\kappaB\alpha endógeno está fosforilado (como se demuestra por la migración más lenta de la especie I\kappaB\alpha, calle 2). Después de 30 min de tratamiento, prácticamente todo el I\kappaB\alpha se ha degradado (calle 3). Ensayos paralelos con los mismo extractos ponen de manifiesto que la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa está ausente en células no inducidas (Figura 10B, calle 2) (se puede detectar débilmente actividad cuando se usan concentraciones mayores de estos extractos). Sin embargo, después de exponer las células al TNF-\alpha durante sólo 5 min, la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa se puede detectar fácilmente, como se pone de manifiesto por la migración más lenta de la especie I\kappaB\alpha (calle 4). El fraccionamiento de estos extractos por filtración en gel pone de manifiesto que la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa inducible por el TNF-\alpha reside en un complejo grande (aproximadamente 700 kDa). Es interesante, que esta actividad persiste y está presente 30 min después de la inducción por el TNF-\alpha (calle 6), momento en el que el I\kappaB\alpha endógeno ha sido degradado (Figura 10A, calle 3). La actividad de I\kappaB\alpha-quinasa está esencialmente ausente a los 60 min (Figura 10B, calle 8). Es posible que formalmente la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa sea constitutiva que el tratamiento con TNF-\alpha simplemente de como resultado la inactivación de una fosfatasa en el extracto que desfosforila al I\kappaB\alpha. Para abordar esta posibilidad, el mismo extracto se incubó con I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S en ausencia de ácido okadaico (Figura 10B, calles 1, 3, 5 y 7). En estas condiciones, se suprime completamente el cambio de movilidad del I\kappaB\alpha (por ejemplo, compárense las calles 3 y 4). Por lo tanto, los efectos del tratamiento con TNF-\alpha no se pueden considerar solos en la inactivación de una I\kappaB\alpha-fosfatasa sensible a ácido okadaico, que implica que el tratamiento con TNF-\alpha induce la actividad de I\kappaB\alpha-quinasa. Además, la rápida inducción de la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa se correlaciona con la rápida aparición de la forma fosforilada del I\kappaB\alpha.

Activación de I\kappaB\alpha-quinasa y actividades de JNK coordinadas in vitro

El tratamiento con TNF-\alpha también conduce a la activación de c-Jun por la JNK (Hibi, M., et al., Genes & Dev. 7:2135-2148 (1993)). Se llevaron a cabo experimentos para determinar si la I\kappaB\alpha-quinasa y la JNK son coactivadas en extractos de células tratadas con TNF-\alpha. Se incubaron extractos citoplasmáticos de células HeLa no inducidas e inducidas por TNF-\alpha con I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S traducido in vitro o c-Jun, y las proteínas se fraccionaron por SDS-PAGE (Figura 10C). Como antes, se detecta actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa en extractos de células inducidas por el TNF-\alpha pero no en los de células no inducidas (compárense la calles 2 y 4). La especificidad de la fosforilación está indicada por el hecho de que la mutación S32A/S36A en el I\kappaB\alpha suprime completamente el cambio de I\kappaB\alpha (calle 6). Igualmente, los extractos de células inducidas por TNF-\alpha muestran actividad de la JNK, como se demuestra por la aparición de una especie c-Jun con una movilidad notablemente menor (compárense las calles 9 y 10). El cambio observado es un resultado de la actividad de la JNK, puesto que las sustituciones de aminoácidos en los sitios de fosforilación de la JNK (S63A/S73A) en c-Jun suprimen este cambio (calle 12). Se observa un cambio distinto con el mutante de c-Jun, sugiriendo que la JNK puede fosforilar c-Jun en otros restos distintos de las Ser-63 y 73. Lo que es más importante, los extractos de células no inducidas no muestran actividad de la JNK significativa (calle 8). Por lo tanto, las actividades tanto de la I\kappaB\alpha-quinasa como de la JNK son activadas en los extractos tratados por lísis rápida preparados a partir de células tratadas con TNF-\alpha, pero no en los no tratados.

En contraste, la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa es detectada fácilmente en extractos citoplsmáticos de S100 preparados a partir de células HeLa no estimuladas usando el procedimiento de lisis hipotónica (Chen, Z. J. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995)). es posible que las rutas de estrés sean activadas por este procedimiento, puesto que se ha mostrado que otra forma de estrés osmótico, el choque hiperosmolar, es un activador eficaz de la ruta de la JNK (Galcheva-Gargova, Z. et al., Science 265:806-808 (1994)). Realmente, las actividades tanto de la I\kappaB\alpha-quinasa como de la JNK se detectaron cuando los extractos de S100 se incubaron durante 60 min (Figura 10D). Se detectó activación dependiente del tiempo de la JNK, cuando los extractos de S100 se incubaron y después se examinaron por un ensayo de quinasa en gel usando el sustrato de la JNK ATF-2. Por lo tanto, tanto la JNK como la I\kappaB\alpha-quinasa pueden ser activadas durante la incubación de los extractos de S100, posiblemente debido a las condiciones de lisis hipotónica.

La MEKK1 activa el NF-\kappaB in vivo

Se llevaron a cabo estudios de transfección transitoria para examinar la relación entre la activación de la I\kappaB\alpha-quinasa y JNK in vivo. El potenciador IFN-\beta contiene múltiples dominios reguladores positivos (PRD) que se unen a distintos factores de transcripción, incluyendo NF-\kappaB (PRDII) y AFT-2/c-Jun (PRDV) (revisado por Thanos, D. et al., cold Spring Harbor Sump. Quant. Biol. 58:73-81 (1993)). Las células HeLa fueron transfectadas con indicadores unidos a dos copias de PRDII (PII), seis copias de PRDIV (PIV), o el potenciador IFN-\beta intacto (IFN) que incluyen esos además de otros PRD, y un vector de expresión para la MEKK1 o un vector de expresión solo. Hay que indicar que en este y todos los experimentos posteriores, la MEKK1 y MEKK1\Delta se refieren a los fragmentos C-terminales de los restos 672 y 321, respectivamente, de la molécula de longitud completa (para una discusión, véase Xu, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93:5291-5295 (1996)). Ambas quinasas son constitutivamente activas e indistinguibles en estudios de transfección. Como se esperaba, la MEKK1 activa el indicador unido a un multímero de PRDIV (Figura 11A), que se une a un homodímero AFT-2 o un heterodímero AFT-2/c-Jun (Du, W. and Maniatis, T., Cell 74:887-898 (1993)). Tanto AFT-2 como c-Jun contienen dominios desactivación transcripcional que son fosforilados por la ruta de la JNK (Gupta, S. et al., Science 267:389-393 (1995)). Lo que es más importante, la MEKK1 también activa el indicador PRDII. La MEKK1 no activa todos los promotores, puesto que su efecto en un gen indicador que contiene el potenciador IFN-\beta intacto sólo es marginal. Este potenciador contiene PRD adicionales que se unen a otros factores distintos del NF-\kappaB o ATF-2/c-Jun (Thanos, D. et al., Cold Spring Harbor Sump. Quant. Biol. 58:73-81 (1993)). Como se esperaba, el potenciador IFN-\beta es activado eficazmente por infección vírica, la cual activa todos los PRD. Por lo tanto MEKK1 puede activar tanto ATF-2/c-Jun como NF-\kappaB in vivo.

Para examinar si la MEKK1 juega un papel en la activación del NF-\kappaB como respuesta al TNF-\alpha, se transfectaron células HeLa con un indicador PRDII y un vector de expresión para la MEKK1\Delta catalíticamente inactiva (K432M), o un vector de expresión vacío. Después se estimularon algunas células con TNF-\alpha, y posteriormente se recogieron todas las células y se examinó la actividad de gen indicador. Como se esperaba, el TNF-\alpha activa el indicador PRDII eficazmente (Figura 11B). En contraste, la MEKK1\Delta mutante (K432M) inhibe tanto la actividad básica de este indicador como la inducida por el TNF-\alpha, comportándose así como un inhibidor negativo dominante, como también han mostrado Hirano, M. et al., J. Biol. Chem. 271:13234-13238 (1996)). Se observan resultados similares en células L929 (Figura 11C). Como testigo negativo, la activación por cAMP de un indicador del elemento de respuesta de cAMP no es afectado significativamente por la MEKK1\Delta negativa dominante (Figura 11D). Estos resultados sugieren que la MEKK1 juega un papel en la activación del NF-\kappaB por el TNF-\alpha.

La activación de NF-\kappaB por la MEKK1 se produce por fosforilación específica de lugar del I\kappaB\alpha

Se ha mostrado que numerosos estímulos que activan el NF-\kappaB inducen fosforilación específica de lugar del I\kappaB\alpha en las Ser-32 y 36 (Brockman, J.A. et al., Mol. Cell. Biol. 15:2809-2818 (1995); Brown, K. et al. Science 267:1485-1491 (1995); Traenckner, E.B.-M. et al., EMBO J. 14:2876-2883 (1995)). Por lo tanto se llevaron a cabo experimentos para examinar si la MEKK1 induce esta misma fosforilación. Se transfectaron células HeLa con vectores de expresión para I\kappaB\alpha de tipo salvaje marcado con Flag o mutante (S32A/S36A), y un vector de expresión para la MEKK1 o sólo el vector de expresión. Después el I\kappaB\alpha se inmunoprecipitó con anticuerpos anti-Flag, y después se visualizó por transferencia Western usando anticuerpos anti-I\kappaB\alpha. La MEKK1 induce la aparición de una especie I\kappaB\alpha con menor movilidad comparada con la aislada de células no inducidas (Figura 12A, calle 2). Esta especie es sensible al tratamiento con fosfatasa alcalina de intestino de ternero (compárense las calles 2 y 6), de acuerdo con ser una forma fosforilada del I\kappaB\alpha. Lo que es más importante, las mutaciones de Ser por Ala en los restos 32 y 36 del I\kappaB\alpha suprimen esta especie (calle 4). Por lo tanto, la MEKK1 induce la fosforilación específica de lugar del I\kappaB\alpha en las Ser-32 y -36.

La MEKK1 activa coordinadamente la I\kappaB\alpha-quinasa y JNK in vitro

Los datos de transfección muestran que la expresión de la MEKK1 conduce a fosforilación específica de lugar del I\kappaB\alpha. Para investigar la posibilidad de que la MEKK1 active la I\kappaB\alpha-quinasa, se prepararon extractos citoplasmáticos a partir de células HeLa no inducidas por el procedimiento de lisis rápida, y después se trataron con MEKK1\Delta recombinante. En ausencia de MEKK1\Delta, estos extractos no muestran actividad específica de lugar de I\kappaB\alpha-quinasa o JNK significativa, cuando se incuban con I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S traducido in vitro o c-Jun, respectivamente (Figura 13A, calles 2 y 6). En contraste, cuando se añadió MEKK1\Delta recombinante al extracto, se observó fosforilación específica de lugar de c-Jun (compárense las calles 7 y 9). Lo que es más importante, también se observó actividad de I\kappaB\alpha-quinasa específica de lugar (compárense las calles 3 y 5), pero la MEKK1\Delta sola no induce esta fosforilación específica de lugar (calle 1). Para descartar la posibilidad de que la MEKK1\Delta inactive una I\kappaB\alpha-fosfatasa, se incubaron extractos con MEKK1\Delta en ausencia o presencia del ácido okadaico inhibidor de fosfatasa (figura 13B), En ausencia de ácido okadaico, el cambio del I\kappaB\alpha inducido por la MEKK1\Delta es suprimido en gran medida (compárense las calles 2 y 3). Por lo tanto, los efectos de la MEKK1\Delta no se pueden considerar los únicos para la inactivación de una I\kappaB\alpha-fosfatasa sensible al ácido okadaico, que implica que la MEKK1\Delta activa la I\kappaB\alpha-quinasa. Por lo tanto, la MEKK\Delta activa coordinadamente las rutas de la I\kappaB\alpha-quinasa y la JNK en extractos citoplasmáticos.

MKK1 activa directamente la I\kappaB\alpha-quinasa

En la ruta de la JNK, la MEKK1 fosforila y activa la MK4, que a su vez activa la JNK. Por lo tanto es posible que el I\kappaB\alpha pueda ser un sustrato para la MEKK1, MEKK4, o JNK. Sin embargo, cuando se expresan como proteínas recombinantes, ni la MKK4 ni la JNK1 fosforilaron el I\kappaB\alpha, demostrando con experimentos de control adecuados que estas proteínas eran enzimáticamente activas. La MEKK1\Delta fosforilaba el I\kappaB\alpha directamente; sin embargo, el grado de fosforilación era cerca de 10 veces menor que el observado con la MKK4 como sustrato, y como se muestra a continuación, la MEKK1\Delta no fosforila el I\kappaB\alpha en las Ser-32 ó 36. Además, experimentos recientes indican que la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa reside en un complejo mulitproteico grande, de aproximadamente 700 kDa, (Chen, Z.J. et al., Cell 84:853-862 (1996)), y la transferencia Western de este complejo no reveló la presencia de MEKK1, MKK4, JNK1 o JNK2. Por lo tanto, una hipótesis razonable, es que la MEKK1 o una de las quinasas corriente abajo fosforila el I\kappaB\alpha indirectamente por estimulación de la I\kappaB\alpha-quinasa.

Para distinguir entre estas posibilidades, se incubó MEKK1\Delta con I\kappaB\alpha-quinasa inducible por ubiquitinación, purificada (Chen, Z.J. et al., Cell 84:853-862 (1996)), y I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S traducido in vitro (Figura 13C). En ausencia de la enzima conjugadora de ubiquitina Ubc5 y ubiquitina, la I\kappaB\alpha-quinasa es inactiva (calle 3), mientras que en su presencia la quinasa es activa, como se pone de manifiesto por el cambio de movilidad del I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S (calle 8) como se ha mostrado previamente (Chen, Z.J. et al., Cell 84:853-862 (1996)). Sorprendentemente, la adición de MEKK1\Delta activa independientemente la I\kappaB\alpha-quinasa (calle 4), mientras que la MEKK1\Delta sola no fosforila específicamente en el sitio al I\kappaB\alpha (calle 2). El que este cambio refleje la fosforilación del I\kappaB\alpha en las Ser-32 y 36 queda indicado por el hecho de que el mutante S32A/S36A no presenta este cambio (calle 5). La activación de la I\kappaB\alpha-quinasa depende de la actividad catalítica de la MEKK1\Delta, puesto que la MEKK1\Delta mutante (K432M) no activa (calle 6). Ni la MEKK1\Delta ni la JNK1 recombinantes aumentan la estimulación por la MEKK\Delta de la I\kappaB\alpha-quinasa, descartando la posibilidad de que la activación por MEKK1\Delta de la I\kappaB\alpha-quinasa sea mediada por la actividad de tipo MKK4 o JNK de célula de insecto (Sf9) que se copurifica en cantidades de trazas con la proteína MEKK1\Delta. Para eliminar la posibilidad de que la activación por MEKK1\Delta de la I\kappaB\alpha-quinasa esté mediada por un factor presente en el extracto de germen de trigo usado para la traducción in vitro del I\kappaB\alpha, se usó I\kappaB\alpha inmunoprecipitado como sustrato. Como se muestra en la calle 7, este I\kappaB\alpha también es un sustrato para la I\kappaB\alpha-quinasa activada por MEKK1\Delta. Por lo tanto, la activación por MEKK1\Delta de la I\kappaB\alpha-quinasa es directa. Experimentos adicionales indican que la MEKK1\Delta es un potente activador de la I\kappaB\alpha-quinasa (Figura 13D), con activación que se puede demostrar con dosis de MEKK1\Delta tan bajas como 5 ng (calle 2). Finalmente, el I\kappaB\alpha formando complejo con RelA (p65) es un sustrato para I\kappaB\alpha-quinasa activada por la MEKK1\Delta, tal como para la quinasa activada por ubiquitinación.

La I\kappaB\alpha-quinasa inducible por MEKK1 es un complejo de alto peso molecular

Para examinar con más detalle la relación entre la I\kappaB\alpha-quinasa inducible por MEKK1\Delta y por ubiquitinación previamente descrita (Chen, Z.J. et al., Cell 84:853-862 (1996)), se fraccionaron extractos citoplasmáticos de células HeLa y se ensayaron ambas actividades (Figura 14). Particularmente, se copurifican las actividades de la I\kappaB\alpha-quinasa tanto inducible por ubiquitinación como por MEKK1\Delta durante las cuatro primeras etapas de fraccionamiento, que incluyen cromatografía de intercambio iónico, fraccionamiento en sulfato amónico, cromatografía en hidroxiapatito, y filtración en gel (Figuras 14A y 5B). En relación con la etapa de filtración en gel, el máximo de la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa inducible por MEKK1\Delta eluye en una posición (fracciones 19 a 20) correspondiente a un peso molecular nativo de aproximadamente 700 kDa, indistinguible del de la I\kappaB\alpha-quinasa inducible por ubiquitinación (Chen, Z.J. et al., Cell 84:853-862 (1996)). El fraccionamiento posterior por cromatografía de intercambio aniónico pone de manifiesto que la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa inducible por MEKK1\Delta eluye en un máximo más ancho que la actividad inducible por ubiquitinación (Figuras 14C y 14D). Por lo tanto, algunas fracciones (por ejemplo, 32 y 33) son inducibles tanto por MEKK1\Delta como por ubiquitinación, mientras que otras (por ejemplo, 29 y 30) son inducibles sólo por MEKK1\Delta. Por lo tanto, los dos complejos de quinasa son similares en gran medida pero pueden tener diferencias sutiles de estructura o de composición de subunidades.

La MEKK1 es un activador selectivo de la I\kappaB\alpha-quinasa

Para examinar la especificidad de la activación por MEKK1\Delta de la I\kappaB\alpha-quinasa, se ensayó la capacidad de activar la I\kappaB\alpha-quinasa de tres quinasas adicionales, caseína-quinasa II (CKII), proteína-quinasa a (PKA), y proteína-quinasa C\varsigma (PKC\varsigma) (Figura 15). En acusado contraste con la MEKK\Delta, ninguna de estas enzimas activa la I\kappaB\alpha-quinasa (Figura 15A). La actividad enzimática de las quinasas se demuestra por su grado más o menos comparable de fosforilación del I\kappaB\alpha recombinante con [\gamma-^{32}P]ATP (Figura 15B). El experimento mostrado en la Figura 15A también demuestra que ninguna de las enzimas, a parte de la I\kappaB\alpha-quinasa, fosforila el I\kappaB\alpha en la Ser-32 ó 36 en las condiciones usadas. Se supone que la fosforilación por estas otras enzimas se produce en restos distintos de la Ser-32 ó 36.

La MEKK1 activa el complejo de I\kappaB\alpha-quinasa por fosforilación

El hecho de que la MEKK1\Delta catalíticamente inactiva no active la I\kappaB\alpha-quinasa (Figura 13C, calle 6) sugiere claramente que la MEKK1\Delta fosforila el complejo de I\kappaB\alpha-quinasa. Para examinar con más detalle esta posibilidad, se incubó I\kappaB\alpha-quinasa activada por MEKK1\Delta con o sin fosfatasa alcalina de intestino de ternero, y después se ensayó la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa frente a I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S, en ausencia o presencia de MEKK1\Delta. Como se muestra en la Figura 16A, el tratamiento de la I\kappaB\alpha-quinasa activada por MEKK1\Delta con fosfatasa da como resultado la inactivación de la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa (compárense las calles 2 y 4). La posterior adición de MEKK1\Delta da como resultado el restablecimiento sustancial, pero incompleto, de la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa (compárense las calles 2, 3 y 4). Para extender estas observaciones, la I\kappaB\alpha-quinasa purificada se incubó con o sin MEKK1\Delta en presencia de [\gamma-^{32}P]ATP (Figura 16B). En ausencia de MEKK1\Delta, el marcador de ^{32}P se incorporó en las tres subunidades (aproximadamente 200, 180 y 120 kDa) del complejo de I\kappaB\alpha-quinasa (calle 2). En presencia de MEKK1\Delta, el marcador de ^{32}P se incorporó en tres subunidades adicionales de pesos moleculares aproximadamente 105, 64 y 54 kDa (calle 3). Juntamente con el experimento que usa la MEKK1\Delta catalíticamente inactiva (Figura 13C), estos experimentos muestran que la MEKK1\Delta activa el complejo de I\kappaB\alpha-quinasa por fosforilación.

La activación de la ruta de la I\kappaB\alpha-quinasa y JNK por una sola proteína, MEKK1, proporciona una explicación convincente de como múltiples estímulos pueden activar simultáneamente estas dos quinasas distintas (Figura 17). Así, se ha mostrado también que el TNF-\alpha, irradiación UV, y los lipopolisacáridos activan la ruta de la JNK. Su activación implícita por la MEKK1 ahora proporciona un mecanismo para la activación de la I\kappaB\alpha-quinasa. Los estímulos tales como miristato-acetato de forbol/ionomicina también podrían actuar potencialmente por esta ruta; en las células T, por ejemplo, el acetato-miristato de forbol y la ionomicina activan de forma sinérgica la ruta de la JNK (Su, B. et al., Cell 77:727-736 (1994)), y por lo tanto pueden activar la I\kappaB\alpha-quinasa a través de la MEKK1. La activación coordinada de la I\kappaB\alpha-quinasa y JNK conduce a la posibilidad de que potenciales activadores corriente arriba de la MEKK1, tales como las pequeñas proteínas de unión a GTP Racl, Cdc42, y Ras, así como proteína-quinasas que activan, tales como PAK, también puedan ser elementos comunes de un solo mecanismo de transducción de señales corriente arriba.

Estudios previos han implicado quinasas distintas de la MEKK1 en la activación del NF-\kappaB. Por ejemplo, se ha mostrado que la PKA disocia el complejo de NF-\kappaB-I\kappaB (Ghosh, S. and Baltimore, D., Nature 344:678-682 (1990)), mientras que la PKC\varsigma co-inmunoprecipita con un factor que puede fosoforilar al I\kappaB\alpha (Diaz-Meco, M.T. et al., EMBO J. 15:2842-2848 (1994)); en relación con esta última, se ha sugerido que PKC\varsigma activa una quinasa que fosforila al I\kappaB\alpha. Sin embargo, ni la PKA ni la PKC\varsigma fosforilan al I\kappaB\alpha en la Ser-32 ó 36, ni tampoco activan la I\kappaB\alpha-quinasa (Figura 15A). Quinasas adicionales que se han implicado en la activación del NF-\kappaB son raf-1 y la proteína-quinasa activada por RNA bicatenario (PKR) (Finco, T.S. and Baldwin, A.S., J. Biol. Chem. 268:17676-17679 (1993); Yang, Y.L. et al., EMBO J. 14:6095-6106 (1995)). En experimentos preliminares, no se observó la activación de la I\kappaB\alpha-quinasa por c-raf enzimáticamente activo (UBI).

La MEKK1 es un miembro de una familia de enzimas que comparten un dominio catalítico C-terminal conservado y por lo tanto pueden compartir superposición en sustratos (Lange-Carter, C.A. et al., Science 260:315-319 (1993); Blank, J.L. et al., J. Biol Chem. 271:5361-5368 (1996); Xu, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93:5291-5295 (1996)). Por lo tanto, es concebible que isoformas de la MEKK distintas de la MEKK1 puedan activar la I\kappaB\alpha-quinasa. Diferentes isoformas de MEKK podrían estar potencialmente implicadas en la señalización de respuestas a diferentes estímulos. Por ejemplo, se ha mostrado que la MEKK1 se une a Ras de una forma dependiente de GTP, y por lo tanto su actividad se puede regular de una forma similar (Russell, M. et al., J. Biol. Chem. 270:11757-11760 (1995)). Realmente, la activación por Ha-Ras de NF-\kappaB (Devary, Y. et al, Science 261:1442-1445 (1993)) podría estar mediada, en parte, por la activación de la MEKK1. A parte de su interacción con Ras, se sabe poco sobre la regulación y activación de la MEKK1. La reciente identificación de la MEKK1 como una proteína asociada a membrana grande, constituyendo su dominio catalítico C-terminal menos de 20% de la molécula, plantea la posibilidad de modos complejos de regulación (Xu, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93:5291-5295 (1996)). Aunque todavía no se ha demostrado, otras MEKK podrían ser reguladas por otros reguladores corriente arriba tales como Rac1, Cdc42, y PAK. Estos datos también dejan abierta la posibilidad de que pueda haber otras I\kappaB\alpha-quinasas que respondan a estímulos distintos de los que señalan a través de la MEKK1.

Se ha mostrado (Hirano, M. et al., J. Biol. Chem. 271:13234-13238 (1996)) que la MEKK1 negativa dominante inhibe la activación por el TNF-\alpha de un gen indicador del NF-\kappaB in vivo. Esto está en contraste con un informe reciente que pone de manifiesto que no hay efecto negativo dominante de MEKK1 en experimentos similares, y que concluye que la MEKK1 se encuentra en una ruta distinta de la de la I\kappaB\alpha-quinasa (Liu, Z.-G. et al., Cell 87:565-576 (1996)). Hasta el momento, no hay explicación de esta discrepancia. Sin embargo, los resultados de la transfección están claramente apoyados por la observación de que la I\kappaB\alpha-quinasa es fosforilada y activada por la MEKK1\Delta in vitro. Por lo tanto, la I\kappaB\alpha-quinasa y la MEKK1, o por lo menos una isoforma de MEKK, son realmente parte de la misma ruta.

La I\kappaB\alpha-quinasa puede ser activada por ubiquitinación independientemente de la fosforilación (Figura 17). Esta doble regulación por fosforilación o ubiquitinación no tiene precedentes. Por lo tanto, la propia I\kappaB\alpha-quinasa se puede considerar un integrador de señal, que responde tanto a fosforilación como a ubiquitinación. Por lo tanto, diferentes estímulos pueden activar una, la otra, o ambas rutas. En principio entonces, es posible aislar una especie de I\kappaB\alpha-quinasa inducida que no es dependiente de ubiquitinación, o una que no es dependiente de fosforilación. Realmente, el fraccionamiento de la I\kappaB\alpha-quinasa altamente purificada por cromatografía de intercambio iónico pone de manifiesto especies quinasa que son inducibles por fosforilación pero no por ubiquitinación (Figuras 14C y 14D).

Un resultado desconcertante de estudios previos es que mientras que la I\kappaB\alpha-quinasa se ensaya fácilmente cuando está presente en extractos citoplasmáticos de S100 de células HeLa, la quinasa purificada es inactiva, y requiere componentes de ubiquitinación para la actividad (Chen, Z.J. et al., Cell 84:853-862 (1996)). Una posibilidad es que la purificación de la quinasa separa los componentes de ubiquitinación de la quinasa; por lo tanto, la quinasa purificada es inactiva. Los resultados descritos aquí presentan una segunda posibilidad distinta, concretamente, que la I\kappaB\alpha-quinasa es activada por la MEKK1 en el extracto durante el transcurso del ensayo de la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa. Por lo tanto, la purificación de la I\kappaB\alpha-quinasa de los extractos de S100 elimina tanto los componentes de ubiquitinación como la MEKK1 presentes en el extracto; de hecho, la transferencia western indica que la MEKK1 no está presente en el complejo de I\kappaB\alpha-quinasa. Ni la fosforilación dependiente de ubiquitinación ni de MEKK1 pueden activar la I\kappaB\alpha-quinasa purificada (Figura 13C).

El mecanismo molecular detallado por el cual la MEKK1 activa la I\kappaB\alpha-quinasa sigue estando sin determinar. Una posibilidad es que la MEKK1 inactive una subunidad reguladora negativa de la I\kappaB\alpha-quinasa, tal como el cAMP se une e induce la disociación de la subunidad reguladora de la PKA (Francis, S.H. and Corbin, J.D., Annu. Rev. Physiol. 56:237-272 (1994)). Alternativamente, la MEKK1 puede activar la subunidad catalítica de la I\kappaB\alpha-quinasa que posteriormente fosforila las Ser-32 y 36 del I\kappaB\alpha. Todavía otra posibilidad es que la MEKK1 inicie una cascada de tipo MAPK en el complejo de I\kappaB\alpha-quinasa, siendo la quinasa terminal la subunidad que fosforila las Ser-32 y 36; esto sería un poco análogo a la organización de los módulos de MAPK como complejos de alto peso molecular en levaduras (Choi, K.Y. et al., Cell 78:499-512 (1994)). La incorporación de ^{32}P en las múltiples subunidades del complejo de I\kappaB\alpha-quinasa en presencia de MEKK1\Delta (Figura 16) podría estar de acuerdo con cualquiera de estas posibilidades.

Las variantes de la secuencia de aminoácidos de la quinasa antes descrita, sus subunidades o sus derivados funcionales, se pueden preparar por mutaciones en el DNA o por síntesis química. Entre dichas variantes se incluye, por ejemplo, supresiones de, o inserciones o sustituciones de restos en la secuencia de aminoácidos de las subunidades de quinasa o derivados. También se puede hacer cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, con la condición de que la construcción final tenga la actividad deseada. Obviamente, las mutaciones que se harán en el DNA que codifica la variante no deben poner la secuencia fuera del marco de lectura, y preferiblemente no crearán regiones complementarias que podrían producir estructura de mRNA secundario.

Aunque el sitio para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la mutación por sí misma está predeterminada. Por ejemplo, para optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se puede llevar a cabo mutagénesis aleatoria en el codón o región diana, y cribar las variantes expresadas de las subunidades de quinasa antes descrita según la combinación óptima de la actividad deseada. Las técnicas para hacer mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en el DNA que tiene una secuencia conocida, son conocidas, por ejemplo, mutagénesis específica de lugar.

La preparación de una variante de quinasa antes descrita de acuerdo con la presente, se logra preferiblemente por mutagénesis específica de lugar del DNA que codifica una versión variante o no variante de la proteína preparada antes. La mutagénesis específica de lugar permite la producción de variantes de quinasa mediante el uso de secuencias de oligonucleótidos específicas que codifican la secuencia de DNA de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebador de tamaño y complejidad de secuencia suficientes para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión de supresiones que se debe atravesar. Típicamente, se prefiere un cebador de aproximadamente 20 a 25 nucleótidos de longitud, habiendo alterado aproximadamente 5 a 10 restos en ambos lados de la unión de la secuencia que se va a alterar. En general, la técnica de mutagénesis específica de lugar es conocida en la técnica, como se ejemplifica por publicaciones tales como Adelman et al. DNA 2:183 (1983).

Como se comprenderá, la técnica de mutagénesis específica de lugar típicamente usa un vector fago que existe tanto en forma monocatenaria como bicatenaria. Entre los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida al lugar, se incluyen vectores tales como el fago M13, por ejemplo, como describen Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981). Estos fagos están fácilmente disponibles en el comercio y su uso es conocido en general por los expertos en la técnica. Alternativamente, se pueden usar vectores plasmídicos que contienen un origen de replicación de fago monocatenario (Vieira et al., Meth. Enzymol. 153:3 (1987)) para obtener DNA monocatenario.

En general, la mutagénesis dirigida al lugar de acuerdo con la presente, se lleva a cabo obteniendo primero un vector monocatenario que incluye en su secuencia una secuencia de DNA que codifica la proteína relevante. Se prepara un cebador oligonucleótido que lleva la secuencia mutada deseada, generalmente sintéticamente, por ejemplo, por el método de Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75:5765 (1978). Después este cebador se reasocia con el vector monocatenario que contiene la secuencia de la proteína, y se somete a enzimas de polimerización del DNA tales como el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli, para completar la síntesis de la hebra que lleva la mutación. Por lo tanto, una secuencia mutada y la segunda hebra llevan la mutación deseada. Después, este vector heterodúplex se usa para transformar células adecuadas, y se seleccionan los clones que incluyen los vectores recombinantes que llevan la disposición de secuencia mutada.

Después de seleccionar dicho clon, se puede sacar la región de proteína mutada y ponerla en un vector adecuado para la producción de proteínas, generalmente un vector de expresión del tipo que se puede usar para la transformación de un hospedante adecuado.

Las supresiones en la secuencia de aminoácidos en general están en el intervalo de 1 a 30 restos, más preferiblemente 1 a 10 restos, y típicamente son contiguas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de amino y/o carboxilo terminales de un resto a polipéptidos de longitud esencialmente no restringida, así como inserciones de intrasecuencias de uno o múltiples restos de aminoácidos. Las inserciones de intrasecuencias (es decir, inserciones en una secuencia de subunidad de quinasa completa) generalmente pueden estar en el intervalo de aproximadamente 1 a 10 restos, más preferiblemente 1 a 5 restos.

El tercer grupo de variantes son aquellas en las que se ha eliminado al menos un resto de aminoácido en la molécula de quinasa antes descrita, y preferiblemente sólo uno, y se ha insertado un resto diferente en su lugar. Dichas sustituciones preferiblemente se hacen de acuerdo con la siguiente Tabla 1 cuando se desea modular con precisión las características de la quinasa antes descrita.

TABLA 1

Resto original	Sustituciones de ejemplo
Ala	gly; ser
Arg	lys
Asn	gln; his
Asp	glu
Cys	ser
Gln	asn
Glu	asp
Gly	ala; pro
His	asn; gln
Ile	leu; val
Leu	ile; val
Lys	arg; gln; glu
Met	leu; tyr; ile
Phe	met; leu; tyr
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp; phe
Val	ile; leu

Los cambios sustanciales en la identidad funcional o inmunológica se hacen seleccionando sustituciones que son menos conservativas que las de la Tabla 1, es decir, seleccionando restos que difieren más significativamente en su efecto de mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que se esperan en general son aquellas en las que (a) glicina y/o prolina se sustituye por otro aminoácido o se suprime o inserta; (b) un resto hidrófilo, por ejemplo, serilo o treonilo, sustituye a (o se sustituye por) un resto hidrófobo, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (c) un resto cisteína sustituye a (o se sustituye por) cualquier otro resto; (d) un resto que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo, o histidilo, sustituye a (o se sustituye por) un resto que tiene una carga electronegativa, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (e) un resto que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenillaina, sustituye a (o se sustituye por) una que no tiene dicha cadena lateral, por ejemplo, glicina.

Algunas supresiones e inserciones y sustituciones no se espera que produzcan cambios radicales en las características de la quinasa antes descrita. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, supresión o inserción antes de hacerlo, un experto en la técnica comprenderá que el efecto se evaluará por ensayos de cribado rutinarios. Por ejemplo, una variante típicamente se hace por mutagénesis específica de lugar de un ácido nucleico que codifica la subunidad de quinasa nativa, expresión del ácido nucleico variante en cultivo de células recombinantes, y opcionalmente, purificación del cultivo celular, por ejemplo, por adsorción de inmunoafinidad en un columna (para absorber la variante por unión a al menos un epítopo inmunitario que quede). Después se criba la actividad del lisato celular o variante de la molécula de quinasa purificada en un ensayo de cribado adecuado según las características deseadas. Por ejemplo, un cambio en el carácter inmunológico de la molécula de quinasa antes descrita, tal como la afinidad por un anticuerpo dado, se mide por un inmunoensayo de tipo competitivo. Los cambios en la actividad de inmunomodulación se miden por el ensayo adecuado. Las modificaciones de propiedades de las proteínas tales como estabilidad redox o térmica, hidrofobicidad, susceptibilidad a la degradación proteolítica o la tendencia a agregarse con vehículos o formando multímeros, se ensayan por métodos conocidos por los expertos en la técnica.

El péptido o polipéptido se podrá purificar de tejidos o células que producen naturalmente el péptido. Alternativamente, los fragmentos de ácido nucleico aislados antes descritos se podrán usar para expresar la quinasa antes descrita o su subunidad en cualquier organismo. Las muestras de la presente invención incluyen células, extractos de proteínas o extractos de membranas celulares, o fluidos biológicos. La muestra variará basándose en el formato de ensayo, el método de detección y la naturaleza de los tejidos, células o extractos usados como muestra. Adicionalmente, el péptido o polipéptido se podrá sintetizar químicamente, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos en fase sólida automático (véase Ausubel, F.M. et al., Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY (1989), específicamente en la página 18.6.11 de Supplement 35).

Se podrá usar cualquier organismo eucariota como fuente del péptido de la invención, siempre que el organismo fuente contenga dicho péptido de forma natural. Tal como se usa en la presente memoria, "organismo fuente" se refiere al organismo original del cual se obtiene la secuencia de aminoácidos de la subunidad, independientemente del organismo en el que se exprese la subunidad y finalmente del que se aísle.

Un experto en la técnica puede seguir fácilmente métodos para aislar proteínas con el fin de obtener la quinasa antes descrita o su subunidad sin contaminantes naturales. Entre estos se incluyen los listados en los ejemplos así como también, pero sin limitar: inmunocromatografía, cromatografía de exclusión por tamaño, HPLC, cromatografía de intercambio iónico, y cromatografía de inmunoafinidad.

En una realización preferida, los procedimientos de purificación comprenden cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño. Se puede usar cualquiera de una larga serie de resinas de intercambio iónico conocidas en la técnica, incluyendo por ejemplo, monoQ, sefarosa Q, macro-prepQ, AG1-X2, o HQ. Entre los ejemplos de resinas de exclusión por tamaño adecuadas se incluyen, pero no se limita, Superdex 200, Superose 12, y Sephycryl 200. La elución se puede lograr con soluciones acuosas de cloruro potásico o cloruro sódico en concentraciones en el intervalo de 0,01 M a 2,0 M.

II. Moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican las subunidades de quinasa

La presente invención describe una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la quinasa antes descrita o a una subunidad de la quinasa antes descrita.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la quinasa antes descrita, hibrida con una segunda molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en una cualquiera de las Figuras 22A-B. Más preferiblemente, dicho ácido nucleico aislado hibrida preferiblemente o hibrida en condiciones poco rigurosas, incluso más preferiblemente de rigurosidad moderada, e incluso más preferiblemente en condiciones muy rigurosas, con un segundo ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las Figuras 22A-B. Más preferiblemente, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en una cualquiera de las Figuras 22A-B.

También se describen los equivalentes funcionales de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en la presente memoria y sus derivados. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico se pueden alterar por sustituciones, adiciones o supresiones que proporcionan moléculas funcionalmente equivalentes. Debido a la degeneración de las secuencias de nucleótidos codificantes, se pueden usar en la práctica de la presente invención otras secuencias de DNA que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que una subunidad de quinasa. Entre estas se incluyen, pero no se limita, secuencias de nucleótidos que comprenden todos o parte de los ácidos nucleicos de la subunidad de quinasa que son alterados por la sustitución de diferentes codones que codifican un resto de aminoácido funcionalmente equivalente en la secuencia, produciendo así un cambio silencioso.

Dichas alteraciones funcionales de una secuencia de ácido nucleico dada proporcionan una oportunidad para promover la secreción y/o procesamiento de proteínas heterólogas codificadas por secuencias de ácido nucleico extrañas fusionadas a ellas.

Además, la secuencia de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que resulta de la adición, supresión o sustitución de al menos un nucleótido en el extremo 5' y/o 3' de la fórmula de ácido nucleico del gen de la quinasa antes descrita o uno de sus derivados. En relación con esto, se puede usar cualquier nucleótido o polinucleótido, con la condición de que su adición, supresión o sustitución no altere la secuencia de aminoácidos del gen de la quinasa antes descrita que es codificado por la secuencia de nucleótidos. Además, la molécula de ácido nucleico de la presente invención, si es necesario, puede tener sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción añadidas a su extremo 5' y/o extremo 3'.

Además, se pueden suprimir codones o sustituir uno o más codones por codones distintos de los codones degenerados para producir un polipéptido estructuralmente modificado, pero uno que tenga sustancialmente la misma utilidad o actividad que el polipéptido producido por la molécula de ácido nucleico sin modificar. Como se reconoce en la técnica, los dos polipéptidos son funcionalmente equivalentes, así como lo son las dos moléculas de ácido nucleico que dan lugar a su producción, incluso aunque las diferencias entre moléculas de ácido nucleico no estén relacionadas con la degeneración del código genético.

A. Aislamiento del ácido nucleico

Se puede aislar una molécula de ácido nucleico de una muestra biológica que contiene RNA o DNA humano.

La molécula de ácido nucleico se puede aislar de una muestra biológica que contiene RNA humano usando las técnicas de clonación de cDNA e hibridación substractiva. La molécula de ácido nucleico también se puede aislar de una biblioteca de cDNA usando una sonda homóloga.

La molécula de ácido nucleico se puede aislar de una muestra biológica que contiene DNA genómico humano o de una biblioteca genómica. Entre las muestras biológicas adecuadas se incluyen, pero no se limitan, sangre, semen y tejido. El método para obtener la muestra biológica variará dependiendo de la naturaleza de la muestra.

Un experto en la técnica se dará cuenta de que el genoma humano puede estar sujeto a ligeras variaciones alélicas entre individuos. Por lo tanto, se pretende que la molécula de ácido nucleico aislada también incluya variaciones alélicas, con la condición de que la secuencia sea un derivado funcional del gen de la quinasa antes descrita. Cuando el alelo de quinasa no codifica la secuencia idéntica a un alelo conocido, se puede aislar e identificar como el alelo de quinasa usando las mismas técnicas usadas en la presente memoria, especialmente técnicas de PCR para amplificar el gen adecuado con cebadores.

Un experto en la técnica se dará cuenta de que organismos distintos de los seres humanos también contendrá genes de la subunidad de quinasa (por ejemplo, eucariotas; más específicamente, mamíferos, pájaros, peces y plantas; más específicamente, gorilas, monos rhesus, y chimpancés).

B. Síntesis del ácido nucleico

Las moléculas de ácido nucleico aisladas también se pueden sintetizar químicamente. Por ejemplo, se puede diseñar una molécula de ácido nucleico con la secuencia de nucleótidos que codifica el producto de expresión del gen de la quinasa antes descrita, y si es necesario, dividirlo en fragmentos más pequeños adecuados. Después, se puede sintetizar un oligómero que corresponde a la molécula de ácido nucleico, o a cada uno de los fragmentos individuales. Dichos oligonucleótidos sintéticos se pueden preparar, por ejemplo, por el método del triéster de Metteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191 (1981) o usando un sintetizador de DNA automático.

Un oligonucleótido se puede obtener sintéticamente o por clonación. Si es necesario, los extremos 5' de los oligómeros se pueden fosforilar usando la polinucleótido-quinasa T4. La fosforilación de hebras sencillas antes de la reasociación o para marcaje se puede lograr usando un exceso de la enzima. Si la fosforilación es para marcar una sonda, el ATP puede contener radioisótopos con alta actividad específica. Después, el oligómero de DNA se puede someter a reasociación y unión con ligasa T4 o similar.

III. Una sonda de ácido nucleico para la detección específica del ácido nucleico que codifica la quinasa o una de sus subunidades o fragmentos

Se describe en la presente memoria una sonda de ácido nucleico para la detección específica de la presencia de la quinasa antes descrita o una de sus subunidades en una muestra que contiene las moléculas de ácido nucleico antes descritas o al menos uno de sus fragmentos que se une en condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico que codifica la quinasa antes descrita o una de sus subunidades.

Se describe una sonda de ácido nucleico aislada que consta de 10 a 1000 nucleótidos (preferiblemente, 10 a 500, 10 a 100, 10 a 50, 10 a 35, 20 a 1000, 20 a 500, 20 a 100, 20 a 50 o 20 a 35) que hibrida preferiblemente con RNA o DNA de la quinasa antes descrita o una de sus subunidades (preferiblemente, la sonda hibridará sólo con secuencias que codifican total o parcialmente la quinasa antes descrita o su subunidad), en la que dicha sonda de ácido nucleico es o es complementaria a una secuencia de nucleótidos que consta de al menos 10 nucleótidos consecutivos (preferiblemente, 15, 20, 25 o 30) de la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica al menos 90% idéntica a una secuencia de la quinasa antes descrita o una de sus subunidades.

La sonda de ácido nucleico se puede usar para ensayar con sonda una biblioteca cromosómica o de cDNA adecuada por métodos de hibridación habituales para obtener otra molécula de ácido nucleico de la presente invención. Una biblioteca de DNA o cDNA se puede preparar a partir de células adecuadas de acuerdo con métodos reconocidos en la técnica (véase, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, edited by Sambrook, Fritsch, & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Alternativamente, se lleva a cabo síntesis química con el fin de obtener sondas de ácido nucleico que tienen secuencias de nucleótidos que corresponden a las partes N-terminal y C-terminal de la secuencia de aminoácidos de la quinasa antes descrita o su subunidad. Por lo tanto, las sondas de ácido nucleico sintetizadas se pueden usar como cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) llevada a cabo de acuerdo con técnicas de PCR reconocidas, esencialmente de acuerdo con PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, edited by Michael et al., Academic Press, 1990,usando la biblioteca cromosómica o de cDNA adecuada para obtener el fragmento de la presente invención.

Un experto en la técnica diseñará fácilmente dichas sondas basándose en la secuencia descrita en la presente memoria, usando métodos de alineación y análisis de secuencias por ordenador, conocidos en la técnica (véase, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, edited by Sambrook, Fritsch, & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Las sondas de hibridación se pueden marcar por técnicas de marcaje patrón tales como con radiomarcador, marcador enzimáticos, marcador fluorescentes, marcador de biotina-avidina, quimioluminiscencia y similares. Después de hibridación, las sondas se pueden visualizar usando métodos conocidos.

Las sondas de ácido nucleico incluyen sondas de RNA así como de DNA, siendo generadas dichas sondas usando técnicas conocidas en la técnica.

Una sonda de ácido nucleico se puede inmovilizar en un soporte sólido. Entre los ejemplos de dichos soportes sólidos se incluyen, pero no se limita, plásticos tales como policarbonato, carbohidratos complejos tales como agarosa y sefarosa, y resinas acrílicas, tales como poliacrilamida y perlas de látex. Las técnicas para acoplar sondas de ácido nucleico a dichos soportes sólidos son conocidas en la técnica.

Entre las muestras de ensayo adecuadas para los métodos de ensayo con sondas de ácido nucleico se incluyen, por ejemplo, células o extractos de ácidos nucleicos de células, o fluidos biológicos. La muestra usada en los métodos antes descritos variará basándose en el formato de ensayo, el método de detección y la naturaleza de los tejidos, células o extractos que se va a ensayar. Los métodos para preparar extractos de ácidos nucleicos de células son conocidos en la técnica y se pueden adaptar fácilmente con el fin de obtener una muestra que sea compatible con el método usado.

IV. Un método para detectar la presencia del ácido nucleico que codifica la quinasa o una de sus subunidades o fragmentos en una muestra

Se describe método para detectar la presencia de la quinasa antes descrita o su subunidad en una muestra, que comprende a) poner en contacto la muestra con (i) la sonda de ácido nucleico antes descrita, en condiciones tales que se produzca la hibridación; (ii) una molécula de ácido nucleico que hibride con una segunda molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en una cualquiera de las Figuras 22A-B; o (iii) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las figuras 22A-B, y b) detectar la presencia de la sonda unida a la molécula de ácido nucleico.

Un experto en la técnica seleccionará la molécula de ácido nucleico de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica como se ha descrito antes. Entre las muestras que se van a ensayar se incluyen, pero no se deben limitar, muestras de RNA de tejido humano.

Los niveles de expresión alterados del RNA de la subunidad de quinasa de un individuo, comparado con los niveles normales, pueden indicar la presencia de una enfermedad. Las sondas de quinasa antes descritas se pueden usar además para ensayar la actividad celular en general.

V. Un kit para detectar la presencia de la quinasa o una de sus subunidades en una muestra

Se describe un kit para detectar la presencia de la quinasa antes descrita o una de sus subunidades en una muestra, que comprende al menos un medio de envase que tiene dispuesto en él la molécula de ácido nucleico antes descrita. El kit puede comprender además otros envases que comprenden uno o más de los siguientes: reactivos de lavado y reactivos capaces de detectar la presencia de la sonda de ácido nucleico unida. Entre los ejemplos de reactivos de detección se incluyen, pero no se limita, sondas radiomarcadas, sondas enzimáticamente marcadas (peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina), y sondas marcadas por afinidad (biotina, avidina, o estreptavidina).

En detalle, un kit compartimentalizado incluye cualquier kit en el que los reactivos estén contenidos en envases separados. Dichos envases incluyen pequeños envases de vidrio, envases de plástico o tiras de plástico o papel. Dichos envases permiten la transferencia eficaz de reactivos de un compartimento a otro compartimento de modo que las muestras y reactivos no se contaminen entre ellos, y los agentes o soluciones de cada envase se puedan añadir de una forma cuantitativa de un compartimento a otro. Dichos envases incluirán un envase que aceptará la muestra de ensayo, un envase que contiene la sonda o cebadores usados en el ensayo, envases que contienen los reactivos de lavado (tales como solución salina tamponada con fosfato, tampones de Tris, y similares), y envases que contienen los reactivos usados para detectar la sonda hibridada, anticuerpo unido, producto amplificado, o similar.

Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que las moléculas y sondas de ácido nucleico descritas en la presente invención se pueden incorporar fácilmente en uno de los formatos de kit establecidos que son conocidos en la técnica.

VI. Construcciones de DNA que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica una subunidad de quinasa y células que contienen estas construcciones

Se describe una molécula de DNA recombinante que comprende, de 5' a 3', un promotor eficaz para iniciar la transcripción en una célula hospedante y las moléculas de ácido nucleico antes descritas. Además, se describe una molécula de DNA recombinante que comprende un vector y una molécula de ácido nucleico antes descrita.

Además, se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una región de control de la transcripción funcional en una célula, una secuencia complementaria a una secuencia de RNA que codifica una secuencia de aminoácidos correspondiente al polipéptido antes descrito, y una región de terminación de la transcripción funcional en la célula.

Preferiblemente, las moléculas antes descritas son moléculas de DNA aisladas y/o purificadas.

El péptido se puede purificar de células que se han alterado para expresar el péptido.

Tal como se usa en la presente memoria, se dice que una célula'' se ha alterado para expresar un péptido deseado'' cuando se hace que la célula, mediante manipulación genérica, produzca una proteína que normalmente no produce o que la célula produce normalmente en niveles bajos. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente procedimientos para introducir y expresar cDNA genómico, o secuencias sintéticas en células eucariotas o procariotas.

Se dice que una molécula de ácido nucleico, tal como DNA, "es capaz de expresar" un polipéptido si contiene secuencias de nucleótidos que contienen información reguladora transcripcional y traduccional, y dichas secuencias están "unidas operativamente" a las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido. Una unión operativa es una unión en la que las secuencias de DNA reguladoras y la secuencia de DNA que se trata de expresar están conectadas de modo que permitan la expresión de la secuencia génica. La naturaleza exacta de las regiones reguladoras necesarias para la expresión de la secuencia génica puede variar de un organismo a otro, pero en general incluirá una región promotora que, en procariotas contiene tanto el promotor (que dirige el inicio de la transcripción de RNA) así como las secuencias de DNA, que cuando se han transcrito a RNA, señalarán el inicio de la síntesis. Dichas regiones normalmente incluirán las secuencias 5' no codificantes implicadas en el inicio de la transcripción y traducción, tales como la caja TATA, secuencia de rematado, secuencia CAAT, y similares.

Si se desea, se puede obtener de la región 3' no codificante a la secuencia que codifica el gen de la subunidad de quinasa antes descrita, por los métodos antes descritos. Esta región se puede retener por sus secuencias reguladoras de la terminación de la transcripción, tales como terminación y poliadenilación. Por lo tanto, reteniendo la región 3' natural contigua a la secuencia de DNA que codifica el gen de la quinasa, se pueden proporcionar las señales de terminación de la transcripción. Cuando las señales de terminación de la transcripción no son satisfactoriamente funcionales en la célula hospedante de expresión, entonces se puede sustituir una región 3' funcional en la célula hospedante.

Se dice que dos secuencias de DNA (tales como una secuencia de la región promotora y una secuencia de la subunidad de quinasa antes descrita) están operativamente unidas si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de DNA (1) no da como resultado la introducción de una mutación de desplazamiento del marco de lectura, (2) no interfiere con la capacidad de la secuencia de la región promotora para dirigir la transcripción de una secuencia génica de la subunidad de quinasa antes descrita, o (3) no interfiere con la capacidad de la secuencia génica de la subunidad de quinasa antes descrita a ser transcrita por la secuencia de la región promotora. Por lo tanto, una región promotora estaría operativamente unida a una secuencia de DNA si el promotor fuera capaz de realizar la transcripción de esta secuencia de DNA.

Los genes de la subunidad de quinasa antes descrita (o sus derivados funcionales) podrán ser expresados en células procariotas o eucariotas. En general, los hospedantes procariotas son los más eficaces y convenientes para producir proteínas recombinantes, y por lo tanto se prefieren para la expresión del gen de la subunidad de quinasa antes descrita.

Con frecuencia las procariotas están representadas por diferentes cepas de E. coli. Sin embargo, también se pueden usar otras cepas microbianas, incluyendo otras cepas bacterianas. En los sistemas procariotas, se pueden usar vectores plasmídicos que contienen sitios de replicación y secuencias de control procedentes de una especie compatible con el hospedante. Entre los ejemplos de vectores plasmídicos adecuados se incluyen pBR322, pCDNA, pGEX, pGEM, pUC118, pUC119 y similares; entre los vectores de fagos o bacteriófagos adecuados se incluyen \lambdagt10, \lambdagt11 y similares; y entre los vectores de virus adecuados se incluyen pMAM-neo, pKRC y similares. Preferiblemente, el vector seleccionado de la presente invención es capaz de replicarse en la célula hospedante seleccionada.

Entre los hospedantes procariotas reconocidos se incluyen bacterias tales como E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, y similares. Sin embargo, en dichas condiciones, el péptido no será glicosi-
lado. El hospedante procariota debe ser compatible con las secuencias replicón y de control en el plásmido de
expresión.

Para expresar una subunidad de quinasa antes descrita en una célula procariota, es necesario unir operativamente la secuencia de quinasa a un promotor procariota funcional. Dichos promotores pueden ser constitutivos, o más preferiblemente, regulables (es decir, inducible o reprimible). Entre los ejemplos de promotores constitutivos se incluyen el promotor int del bacteriófago \lambda, el promotor bla de la secuencia génica de la \beta-lactamasa de pBR322, y el promotor CAT de la secuencia génica de la cloranfenicol-acetil-trasnferasa depBR325, y similares. Entre los ejemplos de promotores procariotas inducibles se incluyen los promotores derecho e izquierdo fundamentales del bacteriófago \lambda (P_{L} y P_{R}), los promotores trp, recA, lacZ, lacI, y gal de E. coli, la \alpha-amilasa (Ulmanen et al., J. Bacteriol. 162:176-182 (1985)) y los promotores específicos \varsigma-28 de B. subtilis (Gilman et al., Gene sequence 32:11-20 (1984)), los promotores de los bacteriófagos de Bacillus (Gryczan, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)), y promotores de Streptomyces (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203:468-478 (1986)). Los promotores procariotas son revisados por Glick (J. Ind. Microbiol. 1:277-282 1987)); Cenatiempo (Biochimie 65:505-516 (1986)); y Gottesman (Ann. Rev. Genet. 18:415-442 (1984)).

La expresión adecuada en una célula procariota también requiere la presencia de un sitio de unión al ribosoma corriente arriba de la secuencia que codifica la secuencia génica. Dichos sitios de unión al ribosoma son descritos, por ejemplo, por Gold et al. (Ann. Rev. Microbiol. 35:365-404 (1981)).

La selección de secuencias de control, vectores de expresión, métodos de transformación y similares, depende del tipo de célula hospedante usada para expresar el gen. Tal como se usa en la presente memoria, "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se pueden usar de forma intercambiable y todas dichas denominaciones incluyen progenie. Por lo tanto, las palabras "transformados" o "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y los cultivos derivados a partir de ella, sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser exactamente igual en el contenido de DNA, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Sin embargo, como se ha definido, la progenie mutante tiene la misma funcionalidad que la célula originalmente transformada.

Las células hospedantes que se pueden usar en los sistemas de expresión de la presente invención no están estrictamente limitadas, con la condición de que sean adecuadas para usar para expresar la subunidad de quinasa antes descrita que interesa. Entre los hospedantes adecuados se incluyen células eucariotas. Entre los hospedantes eucariotas preferidos se incluyen, por ejemplo, levaduras, hongos, células de insecto y células de mamífero in vivo o en un cultivo tisular. Entre las células de mamífero preferidas se incluyen células HeLa, células procedentes de fibroblastos tales como VERO o CHO-K1, o células procedentes de linfoide, y sus derivados.

Además, las células vegetales también están disponibles como hospedantes, y están disponibles secuencias de control compatibles con células vegetales, tales como el virus del mosaico de la coliflor 35S y 19S, y el promotor de la nopalina-sintasa y las secuencias señal de poliadenilación.

Otro hospedante preferido es una célula de insecto, por ejemplo larvas de Drosophila. Usando células de insecto como hospedante, se puede usar el promotor de la alcohol-deshidrogenasa de Drosophila. Rubin, Science 240:1453-1459 (1988). Alternativamente, se pueden diseñar vectores de baculovirus para expresar grandes cantidades de la quinasa antes descrita o su subunidad en células de insecto (Jasny, Science 238:1653 (1987); Miller et al., In: Genetic Engineering (1986), Setlow, J.K., et al., eds., Plenum, Vol. 8, pp. 277-297).

Las diferentes células hospedantes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación traduccional y postraduccional (por ejemplo, glicosilación, escisión) de proteínas. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas hospedantes adecuados para asegurar la modificación y procesamiento deseados de la proteína extraña expresada. Por ejemplo, se puede usar la expresión en un sistema bacteriano para producir un producto de proteína nuclear no glicosilada. La expresión en levaduras producirá un producto glicosilado. Se puede usar la expresión en células de mamífero para asegurar la glicosilación "nativa" de la quinasa antes descrita o su subunidad. Además, diferentes sistemas de expresión del vector/hospedante pueden producir reacciones de procesamiento tales como escisiones proteolíticas en diferente grado.

Se puede usar cualquiera de una serie de sistemas de expresión de secuencias génicas de levaduras que incorporan elementos promotores y de terminación de las secuencias génicas activamente expresadas que codifican enzimas glicolíticas que son producidas en grandes cantidades cuando se hacen crecer las levaduras en medios ricos en glucosa. Las secuencias génicas glicolíticas conocidas también pueden proporcionar señales de control transcripcional muy eficaces.

La levadura proporciona una serie de ventajas sustanciales, en cuanto que también puede llevar a cabo modificaciones del péptido postraduccionales. Existen una serie de estrategias de DNA recombinante que usan secuencias promotoras fuertes y un gran número de copias de plásmidos que se pueden usar para producir las proteínas deseadas en levaduras. La levadura reconoce secuencias líder en productos de secuencias génicas de mamíferos clonadas y segrega péptidos que llevan las secuencias líder (es decir, pre-péptidos). Para un hospedante mamífero, hay disponibles varios sistemas de vectores posibles para expresar la quinasa antes descrita o sus subunidades.

Se puede usar un gran número de secuencias reguladoras de la transcripción y traducción, dependiendo de la naturaleza del hospedante. Las señales reguladoras transcripcionales y traduccionales pueden proceder de fuentes víricas, tales como adenovirus, virus de papiloma bovino, virus simian, o similares, donde las señales reguladoras están asociadas con una secuencia génica particular que tiene un alto nivel de expresión. Alternativamente, se pueden usar promotores de productos de expresión de mamíferos, tales como actina, colágeno, miosina y similares. Las señales reguladoras de inicio transcripcional se pueden seleccionar de modo que permitan la represión o activación, de modo que se pueda modular la expresión de las secuencias génicas. Son interesantes las señales reguladoras que son sensibles a la temperatura, de modo que variando la temperatura se puede reprimir o iniciar la expresión, o que están sometidas a regulación química (tal como metabolito).

Como se ha discutido antes, la expresión de la quinasa antes descrita o sus subunidades en hospedantes eucariotas requiere el uso de regiones reguladoras eucariotas. En general, dichas regiones incluirán una región promotora suficiente para dirigir el inicio de la síntesis de RNA. Entre los promotores eucariotas preferidos se incluyen, por ejemplo, el promotor de la secuencia génica de la metalotioneina I de ratón (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288 (1982)); el promotor TK del virus Herpes (McKnight, Cell 31:355-365 (1982)); el promotor temprano de SV40 (Benoist et al., Nature (London) 290:304-310 (1981)); el promotor de la secuencia génica gal4 de levadura (Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:6971-6975 (1982); Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5951-5955 (1984)).

Como se conoce ampliamente, la traducción del mRNA eucariota se inicia en el codón que codifica la primera metionina. Por esta razón, se prefiere asegurar que la unión entre un promotor eucariota y una secuencia de DNA que codifica la quinasa antes descrita o una de sus subunidades, no contiene ningún codón interpuesto que pueda codificar metionina (es decir, AUG). La presencia de dichos codones da como resultado la formación de una proteína de fusión (si el codón AUG está en el mismo marco de lectura que la secuencia que codifica la subunidad de quinasa antes descrita) o una mutación de desplazamiento del marco de lectura (si el codón AUG no está en el mismo marco de lectura que la secuencia que codifica la subunidad de quinasa antes descrita).

Se puede introducir una molécula de ácido nucleico de la subunidad de quinasa antes descrita y un promotor operativamente unido en una célula procariota o eucariota receptora, como una molécula de DNA (o RNA) no replicativa, la cual puede ser una molécula lineal, o más preferiblemente, una molécula circular covalentemente cerrada. Puesto que dichas moléculas no son capaces de replicación autónoma, la expresión del gen se puede producir por la expresión transitoria de la secuencia introducida. Alternativamente, se puede producir la expresión permanente mediante integración de la secuencia de DNA introducida en el cromosoma del hospedante.

Se puede usar un vector que pueda integrar las secuencias génicas deseadas en el cromosoma de la célula hospedante. Se pueden seleccionar las células que hayan integrado establemente el DNA introducido en sus cromosomas, introduciendo también uno o más marcadores que permitan seleccionar las células hospedantes que contienen el vector de expresión. El marcador puede proporcionar prototropía a un hospedante auxotrófico, resistencia a biocidas, por ejemplo, antibióticos, o metales pesados, tales como cobre o similares. La secuencia génica marcadora seleccionable se puede unir directamente a las secuencias génicas de DNA que se van a expresar, o se puede introducir en la misma célula por cotransfección. Pueden ser necesarios también elementos adicionales para la síntesis óptima del mRNA monocatenario de la proteína de unión. Estos elementos pueden incluir señales de ayuste, así como promotores de transcripción, potenciadores y señales de terminación. Los vectores de expresión de cDNA que incorporan dichos elementos incluyen los descritos por Okayama, Molec. Cell. Biol. 3:280 (1983).

La molécula de ácido nucleico introducida se incorporará en un vector plasmídico o vírico que pueda replicarse autónomamente en el hospedante receptor. Se puede usar cualquiera de una amplia variedad de vectores para este propósito. Entre los factores importantes para seleccionar un vector plasmídico o vírico particular, se incluyen: la facilidad con la que se pueden reconocer las células receptores que contienen el vector, y seleccionar de las células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desean en un hospedante particular; y si se desea poder "lanzar" el vector entre células hospedantes de diferentes especies. Entre los vectores procariotas preferidos se incluyen plásmidos tales como los que se pueden replicar en E. coli (tales como por ejemplo, pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, \piVX. Dichos plásmidos son descritos, por ejemplo, por Sambrook (véase Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, edited by Sambrook, Fritsch, & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Entre los plásmidos de Bacillus se incluyen pC194, pC221, pT127, y similares. Dichos plásmidos son descritos por Gryczan (En: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), pp. 307-329). Entre los plásmidos de Streptomyces adecuados se incluye pIJ101 (Kendall et al., J. Bacterial. 169:4177-4183 (1987)), y bacteriófagos de Streptomyces tales como \phiC31 (Chater et al., En: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54). Los plásmidos de Pseudomonas son revisados por John et al. (Rev. Infect. Dis. 8:693-704 (1986)), e Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742 (1978)).

Entre los plásmidos eucariotas preferidos se incluyen, por ejemplo, BPV, vacuna de la viruela, SV40, plásmido "circulo de 2 micrómetros", y similares, o sus derivados. Dichos plásmidos son de todos conocidos en la técnica (Botstein et al., Miami Wntr. Symp. 19:265-274 (1982); Broach, en: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, p. 445-470 (1981); Broach, Cell 25:203-204 (1982); Bollon et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48 (1980); Maniatis, en: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, pp. 563-608 (1980)).

Una vez que se ha preparado el vector o molécula de ácido nucleico que contiene la(s) construcción(es) para la expresión, la(s) construcción(es) de DNA se puede(n) introducir en una célula hospedante adecuada por cualquiera de una variedad de medios adecuados, es decir, transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplasto, electroporación, tecnología de disparo de partícula, precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa, y similares. Después de introducir el vector, las células receptoras se hacen crecer en un medio selectivo, que selecciona el crecimiento de células que contienen el vector. La expresión de la(s) molécula(s) génica(s) clonada(s) da como resultado la producción de una subunidad(es) de quinasa antes descrita(s). Esto se puede producir en las células transformadas como tales, o después de inducir estas células a la diferenciación (por ejemplo, por administración de bromodesoxiuracilo a células de neuroblastoma o similares).

VII. Un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica por la quinasa y un hibridoma que contiene el anticuerpo

En otra realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene afinidad de unión específicamente por la quinasa antes descrita, como se ha descrito antes. Estos anticuerpos que se unen selectivamente a la quinasa antes descrita se elegirán para usar en métodos que pueden incluir, pero no se deben limitar, el análisis de la expresión alterada de la quinasa.

La quinasa de la presente invención antes descrita se puede usar en una variedad de procedimientos y métodos, tales como para generar anticuerpos, para usar en la identificación de composiciones farmacéuticas, y para estudiar la interacción de DNA/proteína.

La quinasa de la presente invención antes descrita se puede usar para producir anticuerpos o hibridomas. Un experto en la técnica reconocerá que si se desea un anticuerpo, dicho péptido será generado como se describe en la presente memoria y usado como un inmunogen.

Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, así como fragmentos de estos anticuerpos. La invención incluye además anticuerpos de una sola cadena. Los fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molécula se pueden generar por técnicas conocidas. Por ejemplo, entre dichos fragmentos se incluyen, pero no se limitan: el fragmento F(ab')_{2}; los fragmentos Fab', fragmentos Fab, y fragmentos Fv.

Son especialmente interesantes en la presente invención los anticuerpos contra la quinasa antes descrita o sus subunidades, que son producidos en seres humanos, o son "humanizados" (es decir, no inmunógenos en un ser humano) por tecnología recombinante u otra. Se pueden producir anticuerpos humanizados, por ejemplo, sustituyendo una parte inmunógena de un anticuerpo con una parte correspondiente, pero no inmunógena (es decir anticuerpos quiméricos) (Robinson, R.R. et al., Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, K. et al., Solicitud de Patente Europea 184.187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171.496; Morrison, S.L. et al., Solicitud de Patente Europea 173.494; Neuberger, M.S. et al., Solicitud PCT WO 86/01533; Cabilly, S. et al., Solicitud de Patente Europea 125.023; Better, M. et al., Science 240:1041-1043 (1988); Liu, A.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Liu, A.Y. et al., J. Immunol. 139:3521-3526 (1987); Sun, L.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Nishimura, Y. et al., Canc. Res. 47:999-1005 (1987); Wood, C.R. et al., Nature 314:446-449 (1985)); Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559 (1988). Proporcionan revisiones generales de anticuerpos quiméricos "humanizados" Morrison, S.L. (Science, 229:1202-1207 (1985)) y Oi, V.T. et al., BioTechniques 4:214 (1986)). Se pueden producir alternativamente anticuerpos "humanizados" adecuados por sustitución de CDR o CEA (Jones, P.T. et al., Nature 321:552-525 (1986); Verhoeyan et al., Science 239:1534 (1988); Beidler, C.B. et al., J. Immunol. 141:4053-4060 (1988)).

En otra realización, la presente invención se refiere a un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal antes descrito. Un hibridoma es una línea celular inmortalizada que puede segregar un anticuerpo monoclonal específico. En general, en la técnica son bien conocidas las técnicas para preparar anticuerpos monoclonales e hibridomas (Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology," Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1984); St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35:1-21 (1980)).

Se puede inmunizar cualquier animal (ratón, conejo, y similares) que se sepa que produce anticuerpos con el polipéptido seleccionado. Los métodos de inmunización son bien conocidos en la técnica. Entre dichos métodos se incluyen la inyección subcutánea o interperitoneal del polipéptido. Un experto en la técnica reconocerá que la cantidad de polipéptido usada para la inmunización variará basándose en el animal que se inmuniza, la antigenicidad del polipéptido y el sitio de inyección.

El polipéptido se puede modificar o administrar en un adyuvante con el fin de aumentar la antigenicidad del péptido. Los métodos para aumentar la antigenicidad de un polipéptido son conocidos en la técnica. Entre dichos procedimientos se incluyen el acoplamiento del antígeno con una proteína heteróloga (tal como globulina o \beta-galactosidasa) o por inclusión de un adyuvante durante la inmunización. Para los anticuerpos monclonales, se sacan células del bazo de los animales inmunizados, se fusionan con células de mieloma, y se deja que se conviertan en células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales.

Se puede usar cualquiera de una serie de métodos conocidos en la técnica para identificar la célula de hibridoma que produce un anticuerpo con las características deseadas. Entre éstos se incluyen la selección de hibridomas con un ensayo ELISA, análisis de transferencia western, o radioinmunoensayo (Lutz et al., Exp. Cell Res. 175:109-124 (1988)). Los hibridomas que segregan los anticuerpos deseados se clonan, y se determina la clase y subclase usando procedimientos conocidos en la técnica (Campbell, Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, véase antes (1984)).

Para anticuerpos policlonales, se aísla antisuero que contiene anticuerpo del animal inmunizado, y se selecciona la presencia de anticuerpos con la especificidad deseada usando uno de los procedimientos antes descritos.

En otra realización de la presente invención, los anticuerpos antes descritos son marcados de forma detectable. Los anticuerpos se pueden marcar de forma detectable mediante el uso de radioisótopos, marcadores de afinidad (tales como biotina, avidina, y similares), marcadores enzimáticos (tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, y similares), marcadores fluorescentes (tales como FITC o rodamina, y similares), átomos paramagnéticos y similares. Los procedimientos para llevar a cabo dicho marcaje son conocidos en la técnica, por ejemplo véase (Stemberger et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval et al., Immunol. 109:129 (1972); Goding, J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)). Los anticuerpos marcados de la presente invención se pueden usar para ensayos in vitro, in vivo e in situ, para identificar células o tejidos que expresan un péptido específico.

En otra realización de la presente invención, los anticuerpos antes descritos se inmovilizan en un soporte sólido. Entre los ejemplos de dichos soportes sólidos se incluyen plásticos tales como policarbonato, carbohidratos complejos tales como agarosa y sefarosa, resinas acrílicas tales como poliacrilamida y perlas de látex. Las técnicas para acoplar anticuerpos a dichos soportes sólidos son conocidas en la técnica (Weir et al., "Handbook of Experimental Immunology" 4th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Chapter 10 (1986); Jacoby et al., Meth. Enzym. 34 Academic Press, N.Y. (1974)). Los anticuerpos inmovilizados de la presente invención se pueden usar para ensayos in vitro, in vivo e in situ así como en inmunocromatografía.

Además, un experto en la técnica puede adaptar fácilmente los procedimientos actualmente disponibles, así como las técnicas, métodos y kits descritos antes en relación con los anticuerpos, para generar péptidos capaces de unirse a una secuencia peptídica específica con el fin de generar péptidos antipéptidos racionalmente diseñados, por ejemplo, véase Hurby et al., "Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides", en Synthetic Peptides, A User's Guide, W.H. Freeman, NY, pp. 289-307 (1992), y Kaspczak et al., Biochemistry 28:9230-8 (1989).

Los péptidos antipéptidos se pueden generar en una de dos formas. Primero, los péptidos antipéptidos se pueden generar sustituyendo los restos de aminoácidos básicos encontrados en la secuencia de quinasa antes descrita o su subunidad por restos ácidos, mientras que se mantienen los grupos hidrófobos y polares no cargados. Por ejemplo, los restos de lisina, arginina, y/o histidina se sustituyen por ácido aspártico o ácido glutámico, y los restos de ácido glutámico se sustituyen por lisina, arginina o histidina.

VIII. Un método para detectar una quinasa en una muestra

En otra realización, la presente invención se refiere a un método para detectar la quinasa antes descrita en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo antes descrito, en condiciones tales que se formen inmunocomplejos, y b) detectar la presencia del anticuerpo unido al polipéptido. En detalle, los métodos comprenden incubar una muestra de ensayo con uno o más de los anticuerpos de la presente invención, y ensayar si el anticuerpo se une a la muestra de ensayo. Los niveles alterados de la quinasa antes descrita o sus subunidades en una muestra comparado con los niveles normales, puede indicar una enfermedad específica.

Las condiciones para incubar un anticuerpo con una muestra de ensayo varían. Las condiciones de incubación dependen del formato usado en el ensayo, los métodos de detección usados, y el tipo y naturaleza del anticuerpo usado en el ensayo. Un experto en la técnica reconocerá que cualquiera de los formatos de ensayos inmunológicos normalmente disponibles (tales como radioinmunoensayos, ensayos de inmunoabsorción con enzimas ligadas, difusión basadas en Ouchterolony, o ensayos de inmunofluorescencia) se puede adaptar fácilmente para usar los anticuerpos de la presente invención. Se pueden encontrar ejemplos de dichos ensayos en Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986); Bullock et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL Vol. 1 (1982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985).

Entre las muestras de ensayos inmunológicos de la presente invención se incluyen células, extractos de proteína o membrana de células, o fluidos biológicos tales como sangre, suero, plasma u orina. La muestra de ensayo usada en el método antes descrito variará basándose en el formato de ensayo, la naturaleza del método de detección, y los tejidos, células o extractos usados como muestra que se va a ensayar. Los métodos para preparar extractos de proteína o extracto de membranas de células son conocidos en la técnica, y se pueden adaptar fácilmente con el fin de obtener una muestra que sea competente con el sistema usado.

IX. Un kit de diagnóstico que comprende anticuerpos contra la quinasa

En otra realización de la presente invención, se proporciona un kit que contiene todos los reactivos necesarios para llevar a cabo los métodos de detección previamente descritos. El kit puede comprender: i) un primer medio de envase que contiene un anticuerpo antes descrito, y ii) un segundo medio de envase que contiene un conjugado que comprende una pareja de unión del anticuerpo y un marcador. En otra realización preferida, el kit además comprende uno o más envases distintos que comprenden uno o más de los siguientes: reactivos de lavado y reactivos que pueden detectar la presencia de anticuerpos unidos. Entre los ejemplos de reactivos de detección se incluyen, pero no se limitan, anticuerpos secundarios marcados, o alternativamente, si el primer anticuerpo está marcado, reactivos cromóforos, enzimáticos o de unión al anticuerpo que puedan reaccionar con el anticuerpo marcado. El kit compartimentalizado puede ser como se ha descrito antes para los kits de sonda de ácido nucleico.

Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que los anticuerpos descritos en la presente invención se pueden incorporar fácilmente en uno de los formatos de kit establecidos que son conocidos en la técnica.

X. Detección de diagnóstico y tratamiento; sólo dirigido a propósitos de ilustración

Hay que entender que aunque la siguiente discusión se dirige específicamente a pacientes humanos, las enseñanzas también se pueden aplicar a cualquier animal que exprese la quinasa antes descrita o una de sus subunidades.

Los métodos de diagnóstico y detección de la invención son especialmente útiles para un paciente que se sospecha que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad asociada con un nivel de expresión alterado de la quinasa antes descrita, basándose en el historial familiar, o un paciente en el que se desee diagnosticar una enfermedad relacionada con la quinasa antes descrita.

De acuerdo con la invención, ahora es posible la detección presintomática de un individuo que necesite dicha detección usando DNA que codifica la quinasa antes descrita o una de sus subunidades. El método de detección de la invención permite un diagnóstico presintomático, incluyendo diagnóstico prenatal, de la presencia de un gen de la subunidad de quinasa aberrante o que falta en individuos, y por lo tanto una opinión con respecto a la probabilidad de que dicho individuo desarrolle o haya desarrollado una enfermedad asociada con la quinasa antes descrita. Esto es especialmente valioso para identificar portadores de genes de quinasa alterados o que faltan, por ejemplo, de individuos con un historial familiar de una enfermedad asociada con la quinasa antes descrita. El diagnóstico precoz también es conveniente para maximizar la intervención oportuna adecuada.

En el método de detección, se tomará una muestra de tejido de dicho individuó, y se detectará (1) la presencia

\hbox{del(los)}

gen(es) de la subunidad de quinasa "normal"; (2) la presencia de mRNA(s) de la subunidad de quinasa y/o (3) la presencia de la quinasa. El gen humano normal se puede caracterizar basándose, por ejemplo, en la detección de los patrones de digestión de restricción en DNA "normal" frente al DNA del paciente, incluyendo análisis por RFLP, usando sondas de DNA preparadas contra la secuencia de quinasa (o uno de sus fragmentos funcionales) enseñadas en la invención. Igualmente, el mRNA que codifica una subunidad(es) de quinasa se puede caracterizar y comparar con (a) los niveles y/o (b) tamaño de mRNA de quinasa normal encontrados en una población humana sin riesgo de desarrollar la enfermedad asociada a la quinasa, usando sondas similares. Finalmente, las subunidades de quinas antes descritas se pueden (a) detectar y/o (b) cuantificar usando un ensayo biológico para la actividad de la quinasa, o usando un ensayo inmunológico y los anticuerpos de quinasa antes descritos. Cuando se ensaya la proteína quinasa antes descrita, se prefiere el ensayo inmunológico por su velocidad. (1) un patrón de tamaño de DNA de la subunidad de quinasa aberrante, y/o (2) tamaños o niveles de mRNA de la(s) subunidad(es) de quinasa aberrantes, y/o (3) niveles de la proteína quinasa aberrantes, indicarán que el paciente tiene riesgo de desarrollar una enfermedad asociada con la quinasa antes descrita.

Los métodos de detección y diagnóstico de la invención no requieren que se use la secuencia codificante del DNA de la subunidad de quinasa entera para la sonda. Si no que, sólo es necesario usar un fragmento o longitud de ácido nucleico que sea suficiente para detectar la presencia del(los) gen(es) de la subunidad de quinasa en la preparación de DNA de un individuo normal o afectado, la ausencia de dicho gen, o una propiedad física alterada de dicho gen (tal como un cambio en el patrón de migración eletroforético).

El diagnóstico prenatal se puede llevar a cabo cuando se desee, usando cualquier método conocido para obtener células fetales, incluyendo amniocentesis, toma de muestra del vello coriónico (CVS), y fetoscopía. El análisis cromosómico prenatal se puede usar para determinar si la parte del cromosoma que tiene el gen de la subunidad de quinasa normal está presente en un estado heterozigótico.

En el método para tratar una enfermedad asociada con la quinasa antes descrita en un paciente que necesite dicho tratamiento, se puede proporcionar un DNA de quinasa funcional o una de sus subunidades, a las células de dicho paciente de una forma y en una cantidad que permita la expresión de la proteína proporcionada por dicho gen, durante un tiempo y en una cantidad suficiente para tratar a dicho paciente.

Se conocen muchos sistemas vectores en la técnica para proporcionar el suministro a pacientes humanos que necesiten un gen o proteína que falta en la célula. Por ejemplo, se pueden usar sistemas de retrovirus, especialmente sistemas de retrovirus modificados y especialmente sistemas del virus herpes simplex. Dichos métodos se proporcionan, por ejemplo, en las enseñanzas de Breakefield, X.A. et al., The New Biologist 3:203-218 (1991); Huang, Q. et al., Experimental Neurology 115:303-316 (1992), documentos WO93/03743 y WO90/09441. El suministro de una secuencia de DNA que codifica una quinasa funcional o su subunidad (como se ha descrito antes) sustituirá eficazmente el gen que falta o mutado de la invención.

XI. Ligandos de la quinasa

La invención se refiere a ligandos de la quinasa antes descrita. Preferiblemente, el ligando interacciona selectivamente con la quinasa. Los agonistas y antagonistas de la quinasa son ejemplos de ligandos. Los anticuerpos que reconocen la quinasa o una de sus subunidades o variantes funcionales, también son ligandos. Preferiblemente, el ligando es un inhibidor selectivo de la actividad de quinasa.

En otra realización preferida, el ligando es un sustrato para la quinasa antes descrita. Los sustratos son útiles en métodos de ensayo para medir la actividad de la quinasa. Entre los sustratos preferidos se incluyen el I\kappaB\alpha y sus fragmentos peptídicos o polipeptídicos.

La capacidad de los antagonistas y agonistas de la quinasa antes descrita para interferir en o potenciar la actividad de la quinasa antes descrita, se puede evaluar en muestras que contienen la quinasa antes descrita. Un ensayo de la actividad de la quinasa en la muestra se puede usar para determinar la funcionalidad de la proteína en presencia de un agente que puede actuar como antagonista o agonista, y así, se identifican los ligandos que interfieren o potencian la actividad de la quinasa.

Los agentes seleccionados en los ensayos pueden ser, pero no se limitan, péptidos, carbohidratos, derivados de vitaminas, u otros agentes farmacéuticos. Estos agentes se pueden seleccionar y se seleccionan 1) aleatoriamente, 2) por una selección lógica, 3) por diseño usando por ejemplo, técnicas de modelización de proteínas o ligandos.

Para la selección aleatoria, se seleccionan aleatoriamente agentes tales como péptidos, carbohidratos, agentes farmacéuticos y similares, y se ensaya su capacidad para unirse o estimular/bloquear la actividad de la quinasa.

Alternativamente, los agentes se pueden seleccionar de forma lógica o diseñar. Tal como se usa en la presente memoria, se dice que un agente se "selecciona de forma lógica o se diseña" cuando el agente se escoge basándose en la configuración de la quinasa antes descrita o su subunidad o ligando conocido.

Se demuestra en la presente memoria, que la estaurosporina y su análogo K252a inhiben la fosforilación y
ubiquitinación del I\kappaB\alpha en extractos de células HeLa. Se pueden diseñar agentes adicionales basándose en estas estructuras.

También se demuestra en la presente memoria, que un mutante truncado que comprende los restos de aminoácidos 5-72 de I\kappaB\alpha, inhibe selectivamente la fosforilación del I\kappaB\alpha por la I\kappaB\alpha-quinasa purificada. También se pueden diseñar agentes adicionales basándose en esta estructura.

Usando un ligando de la quinasa antes descrita (incluyendo antagonistas y agonistas como se ha descrito antes), la presente invención proporciona además un método para modular la actividad de la quinasa antes descrita en una célula. En general, los agentes (antagonistas y agonistas) que se ha identificado que bloquean o estimulan la actividad de la quinasa antes descrita, se pueden formular de forma que el agente se pueda poner en contacto con una célula que expresa la proteína quinasa antes descrita in vivo. El contacto de dicha célula con dicho agente da como resultado la modulación in vivo de la actividad de la quinasa antes descrita. Siempre que no exista una barrera de formulación o barrera de toxicidad, los agentes identificados en los ensayos descritos en la siguiente Sección XII, serán eficaces para usar in vivo.

El NF-\kappaB es una diana atractiva para el diseño de fármacos e intervención terapéutica, debido a su implicación en muchos estados patológicos tales como inflamación, enfermedad autoinmune, cáncer e infección vírica. Una serie de estudios han mostrado que la inhibición de la actividad del NF-\kappaB puede tener profundos efectos fisiológicos (Kitajima, I., Science 258:1792-1795 (1992); Higgins, K.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9901-9905 (1993); Kopp & Ghosh, Science 265:956-969 (1994); Reed, M.A. et al., Immunity 2:1-20 (1995); Jung, M. et al., Science 268:1619-1621 (1995); Scheinman, R.I. et al., Science 270:283-286 (1995); Auphan, N. et al., Science 270:268-290 (1995)). Estudios recientes del mecanismo de activación del NF-\kappaB han proporcionado nuevas dianas para la intervención con fármacos. El descubrimiento de una nueva I\kappaB\alpha-quinasa descrita aquí proporciona métodos para inhibir funciones aberrantes del NF-\kappaB.

XII. Bioensayos para obtener ligandos de la quinasa

La presente invención se refiere además a un método para seleccionar un agonista o antagonista que estimula o bloquea la actividad de la quinasa antes descrita o su subunidad, que comprende:

(a) incubar una muestra que contiene la quinasa antes descrita o su subunidad con un agente que se va a ensayar; y

(b) evaluar la actividad biológica mediada por dicho contacto.

En una realización, la muestra comprende una célula o extracto celular. Se puede usar cualquier célula o extracto celular en el ensayo anterior con la condición de que exprese una forma funcional de la quinasa antes descrita o su subunidad, y se pueda medir la actividad. Las células de expresión preferidas son células eucariotas u organismos. Dichas células se pueden modificar para que contengan secuencias de DNA que codifican la(s) subunidad(es) de la quinasa antes descrita, usando procedimiento rutinarios conocidos en la técnica. Alternativamente, un experto en la técnica puede introducir mRNA que codifica una proteína o proteínas de la subunidad de quinasa antes descrita directamente en la célula.

En una realización preferida, la muestra comprende la quinasa antes descrita purificada en un estado activado y un sustrato. Se pueden usar enzimas de ubiquitinación o la MEKK1 para activar la quinasa. El sustrato puede ser el I\kappaB\alpha o una de sus variantes funcionales o un péptido o un polipéptido que es fosforilado por la quinasa.

En una realización preferida, el ensayo anterior se lleva a cabo en condiciones que apoyan la fosforilación estable del I\kappaB\alpha. Por lo tanto, las mezclas de reacción comprenden I\kappaB\alpha marcado, un sistema de regeneración de ATP, E1, una E2, ubiquitina, y un inhibidor de fosfatasa (Chen et al., Genes and Dev. 9:1586 1597 (1995)). El sustrato I\kappaB\alpha puede contener cualquier marca detectable como saben los expertos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, un marcador enzimático, un marcador cromogénico. En los ejemplos de la presente invención, se usó I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S traducido in vitro. La E2 preferiblemente es una de la subfamilia de UBC4/UBC5. El inhibidor de fosfatasa pueden ser cualquiera de muchos inhibidores de fosfatasa conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitar, ácido okadaico, caliculina A, pirofosfato sódico, molibdato sódico, ortovanadato sódico, o fluoruro sódico. Se prefiere que el inhibidor de fosfatasa sea ácido okadaico o caliculina A.

Al final de la reacción, el sustrato fosforilado, por ejemplo I\kappaB\alpha, se separa de los otros componentes de la mezcla de reacción y se cuantifica por un método adecuado según el marcador usado. En los ejemplos, después de terminar la reacción con tampón de muestra con SDS, las muestras se analizan por SDS-PAGE y fluorografía. Hay que entender que el uso de sustratos que llevan diferentes marcadores necesitará el uso de diferentes métodos de detección como conocen los expertos en la técnica. Cuando hay presente una sustancia de ensayo en la mezcla de la reacción, la inhibición de la quinasa es indicada por una reducción de la cantidad de sustrato fosforilado producido en la reacción de ensayo, comparado con la producida en una mezcla de reacción testigo que no contiene la sustancia de ensayo.

XIII. Ratón transgénico y "knockout", sólo con propósitos ilustrativos Métodos para generar animales transgénicos no humanos

Los animales no humanos de la invención comprenden cualquier animal que tenga una interrupción o alteración transgénica del (los) gen(es) (animales knockout) de la subunidad de quinasa dependiente de ubiquitina endógena, y/o en el genoma del cual se han introducido uno o más transgenes que dirigen la expresión de la quinasa antes descrita.

Dichos animales no humanos incluyen vertebrados tales como roedores, primates no humanos, ovejas, perros, vacas, anfibios, reptiles, etc. Los animales no humanos preferidos se seleccionan de especies de animales mamíferos no humanos, más preferiblemente, animales de la familia de los roedores incluyendo ratas y ratones, más preferiblemente ratones.

Los animales transgénicos de la invención son animales en los que se han introducido por medios no naturales (es decir, por manipulación humana), uno o más genes que no se encuentran normalmente en el animal, por ejemplo, genes extraños, genes endógenos genéticamente diseñados, etc. Los genes introducidos de forma no natural, conocidos como transgenes, pueden ser de la misma o diferente especie que el animal, pero no se encuentran normalmente en el animal en la configuración y/o en el locus cromosómico conferido por el transgén. Los transgenes pueden comprender secuencias de DNA extraño, es decir, secuencias que no se encuentran normalmente en el genoma del animal hospedante. Alternativamente o adicionalmente, los transgenes pueden comprender secuencias de DNA endógeno que son anormales en cuanto que se han traspuesto o mutado in vitro con el fin de alterar el patrón de expresión normal del gen in vivo, o alterar o eliminar la actividad biológica de un producto génico endógeno codificado por el gen. (Watson, J.D., et al., en Recombinant DNA, 2d Ed., W.H. Freeman & Co., New York (1992), pages 255-272; Gordon, J.W., Intl. Rev. Cytol. 115:171-229 (1989); Jaenisch, R., Science 240:1468-1474 (1989); Rossant, J., Neuron 2:323-334 (1990)).

Los animales transgénicos no humanos de la invención se producen introduciendo transgenes en la línea germinal del animal no humano. Se usan células diana embrionarias en diferentes estados de desarrollo para introducir los transgenes de la invención. Se usan diferentes métodos dependiendo del estado de desarrollo de la(s) célula(s) diana embrionarias.

1. La microinyección de zigotos es el método preferido para incorporar transgenes en genomas de animales en el transcurso de la práctica de la invención. Un zigoto, un óvulo fertilizado que no ha experimentado fusión de pronúcleos o posterior división celular, es la célula diana preferida para microinyectar secuencias de DNA transgénicas. El pronúcleo del macho murino alcanza un tamaño de aproximadamente 20 micrómetros de diámetro, una característica que permite una inyección reproducible de 1-2 picolitros de una solución que contiene secuencias de DNA transgénicas. El uso de un zigoto para introducir transgenes tiene la ventaja, en la mayoría de los casos, de que las secuencias de DNA transgénicas inyectadas se incorporarán en el genoma del animal hospedante antes de la primera división celular (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:4438-4442 (1985)). Como consecuencia, todas las células de los animales transgénicos resultantes (animales fundadores) llevan establemente un transgén incorporado en un locus genético particular, denominado alelo transgénico. El alelo transgénico demuestra la herencia Mendeliana: la mitad de la descendencia resultante del cruce de un animal transgénico con un animal no transgénico heredará el alelo transgénico, de acuerdo con las leyes de Mendel de mezcla aleatoria.

2. También se puede usar la integración vírica para introducir los transgenes de la invención en un animal. Los embriones en desarrollo se cultivan in vitro hasta el estado de desarrollo conocido como blastocito. En este momento, se pueden infectar los blastómeros con retrovirus adecuados (Jaenich, R., Proc. Natl. Sci. (USA) 73:1260-1264 (1976)). La infección de los blastómeros se potencia mediante eliminación enzimática de la zona pelúcida (Hogan, et al., en Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1986)). Los transgenes se introducen mediante vectores víricos que típicamente son defectuosos en la replicación pero que siguen siendo competentes para la integración de secuencias de DNA asociadas al virus, incluyendo secuencias de DNA transgénicas unidas a dichas secuencias víricas, en el genoma del animal hospedante (Jahner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:6927-6931 (1985); Van der Putten, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:6148-6152 (1985)). La transfección se obtiene fácil y eficazmente mediante cultivo de blastómeros en una monocapa de células que producen el vector vírico que contiene el transgén (Van der Putten, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:6148-6152 (1985); Stewart, et al., EMBO Journal 6:383-388 (1987)). Alternativamente, la infección se puede llevar a cabo en una etapa posterior, tal como en un blastocele (Jahner, D., et al., Nature 298:623-628 (1982)). En cualquier caso, la mayoría de los animales fundadores transgénicos producidos por integración vírica serán "mosaicos" en cuanto al alelo transgénico; es decir, el transgén se incorpora sólo en un subgrupo de todas las células que forman el animal fundador transgénico. Además, se pueden producir sucesos de integración vírica múltiple en un solo animal fundador, generando alelos transgénicos múltiples que se separarán en generaciones futuras de descendencia. La introducción de transgenes en células de la línea germinal por este método, es posible pero probablemente se produce con baja frecuencia (Jahner, D., et al., Nature 298:623-628 (1982)). Sin embargo, una vez que se ha introducido un transgén en células de la línea germinal por este método, se puede producir descendencia en la que el alelo transgénico esté presente en todas las células del animal, es decir, tanto en células somáticas como de la línea germinal.

3. Las células madre embrionarias (ES, por sus siglas en inglés embryonic stem) también pueden servir como células diana para introducir los transgenes de la invención en animales. Las células madre se obtienen de embriones antes de la implantación cultivados in vitro (Evans, M.J., et al., Nature 292:154-156 (1981); Bradley, M. O., et al., Nature 309:255-258 (1984); Gossler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83:9065-9069 (1986); Robertson et al., Nature 322:445-448 (1986); Robertson, E.J., en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, E.J., ed., IRL Press, Oxford (1987), pages 71-112). Las células ES, que están disponibles en el comercio (por ejemplo, en Genome Systems, Inc., St. Louis, MO), se pueden transformar con uno o más transgenes por métodos establecidos (Lovell-Badge, R.H., en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, E.J., ed., IRL Press, Oxford (1987), pages 153-182). Las células Es transformadas se pueden combinar con un bastocito de animal, donde después las células ES colonizan el embrión y contribuyen a la línea germinal del animal resultante, que es una quimera (compuesto de células derivadas de dos o más animales) (Jaenisch, R., Science 240:1468-1474 (1988); Bradley. A., en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, E.J., ed., IRL Press, Oxford (1987), pages 113-151).

Otra vez, una vez que se ha introducido un transgén en células de la línea germinal por este método, se puede producir descendencia en la que el alelo transgénico esté presente en todas las células del animal, es decir tanto en células somáticas como en células de la línea germinal.

Sin embargo, sucede que la introducción inicial de un transgén es un suceso Lamarckiano (no Mendeliano). Sin embargo, los transgenes de la invención se pueden integrar establemente en las células de la línea germinal y ser transmitidos a la descendencia del animal transgénico como loci Mendeliano. Otras técnicas transgénicas dan como resultado animales transgénicos "mosaico", en los que algunas células llevan transgenes y otras células no. En los animales transgénicos "mosaico" en los que las células de la línea germinal no llevan los transgenes, la transmisión de los transgenes a la descendencia no se produce. No obstante, los animales transgénicos "mosaico" pueden demostrar fenotipos asociados con los transgenes.

Se pueden introducir transgenes en animales no humanos con el fin de proporcionar modelos de animales para enfermedades humanas. Los transgenes que dan como resultado dichos modelos de animales incluyen, por ejemplo, transgenes que codifican productos génicos mutantes asociados con un error innato del metabolismo en una enfermedad genética humana y los transgenes que codifican un factor humano necesario para conferir susceptibilidad a un patógeno humano (es decir, una bacteria, virus, u otro microorganismo patógeno) (Leder et al., patente de EE.UU. 5.175.383 (29 de Diciembre, 1992); Kindt et al., Patente de EE.UU. 5.183.949 (2 de Febrero,e 1993); Small et al., Cell 46:13-18 (1986); Hooper et al., Nature 326:292-295 (1987); Stacey et al., Nature 332:131-136 (1988); Windle et al., Nature 343:665-669 (1990); Katz et al., Cell 74:1089-1100 (1993)). Las mutaciones introducidas transgénicamente comprenden además alelos nulos (knockout) en los que un secuencia genética normalmente endógena en un animal no humano se sustituye por una secuencia de DNA que codifica un marcador seleccionable y/o detectable. Los animales transgénicos no humanos resultantes que tienen predisposición a tener una enfermedad, o en los que el transgén produce una enfermedad, se pueden usar para identificar composiciones que inducen la enfermedad y evaluar el potencial patógeno de composiciones conocidas o que se sospecha que inducen la enfermedad (Berns, A.J.M., Patente de EE.UU. 5.174.986 (20 de Diciembre, 1992)), o para evaluar composiciones que se pueden usar para tratar la enfermedad o mejorar sus síntomas (Scott et al., documento WO 94/12627 (1994)).

La descendencia que ha heredado los transgenes de la invención se distingue de los cachorros de la misma camada que no han heredado los transgenes por análisis en material genético de la descendencia de la presencia de biomoléculas que comprenden secuencias únicas correspondientes a secuencias de, o codificadas por, los transgenes de la invención. Por ejemplo, los fluidos biológicos que contienen polipéptidos codificados únicamente por el marcador seleccionable de los transgenes de la invención, se pueden someter a inmunoensayo la presencia de los polipéptidos. Un método más sencillo y fiable de identificar descendencia transgénica comprende obtener una muestra de tejido de una extremidad de un animal, por ejemplo, una cola, y analizar en la muestra la presencia de secuencias de ácido nucleico correspondientes a la secuencia de DNA de la parte o partes únicas de los transgenes de la invención, tales como sus marcadores seleccionables. La presencia de dichas secuencias de ácido nucleico se puede determinar, por ejemplo, por análisis de hibridación ("southern") con secuencias de DNA correspondientes a las partes únicas del transgén, análisis de los productos de las reacciones de PCR usando secuencias de DNA en una muestra como sustratos y oligonucleótidos derivados de la secuencia de DNA del transgén, etc.

La presente invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Los siguientes protocolos y detalles experimentales son citados en los siguientes ejemplos.

Plásmidos, proteínas y anticuerpos

Los cDNA que codifican el I\kappaB\alpha y sus mutantes han sido descritos (Brockman, J.A. et al., Mol. Cell. Biol. 15:2809-2818 (1995); Chen, Z.J. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995)), las proteínas I\kappaB\alpha marcadas con ^{35}S se prepararon por traducción in vitro en extractos de germen de trigo (Promega). pGEX-2TK-UBCh5 se construyó por PCR usando cDNA de UBCh5 (proporcionado por el Dr. P. Howley) como molde. Los mutantes del sitio activo de UBCh5, pGEX-2TK-UBCh5 (C85A) y pGEX-2TK-UBCh5(C85S), se crearon por mutagénesis dirigida al lugar usando el kit mutagénesis de "Unique Site Elimination" (U.S.E) (Pharmacia). Los cebadores mutágenos (reasociados a hebras no codificantes) fueron: 5' TTG TGA CCT CAG GAT ATC GAG AGC AAT ACT TCC ATT 3' para C85A, y 5' TTG TGA CCT CAG GAT ATC GAG AGA AAT ACT TCC AT 3' para C85S. Todas las construcciones se conformaron por secuenciación del DNA. Para la expresión de GST-UBCh5 y sus mutantes, las construcciones de expresión adecuadas se transformaron en la cepa de E. coli BL21/DE3, y la expresión de proteínas se indujo con IPTG 200 \muM. Las proteínas de fusión GST se purificaron usando glutatión-Sefarosa (Pharmacia). El UBC4 de levadura (yUBC4) se expresó en AR85 de E. coli que alberga el vector de expresión de UBC4 (pL\lambdaUBC4, proporcionado por el Dr. V. Chau). Después de inducción térmica (30ºC a 42ºC), UBC4 se purificó por cromatografía covalente en ubiquitina-Sefarosa seguido de filtración en gel por FPLC/Superdex-200. El homodímero RelA recombinante se preparó de acuerdo con Thanos and Maniatis, Cell 80:529-532 (1992) (proporcionado por el Dr. J. Hagler). El UBC2 humano recombinante purificado fue proporcionado por el Dr. O. Coux. La purificación de E1, E2_{14K}, E2_{7k}, E2_{20K}, E2_{25k}, E2_{35K} de reticulocitos de conejo se llevó a cabo de acuerdo con Haas and Bright, J. Biol. Chem. 263:13258-13267 (1988). La preparación de ubiquitina metilada y ubiquitina-aldehído han sido descritas (Chen, Z.J. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995)). La ^{125}l-ubiquitina se preparó por el método de la cloramina T. Los anticuerpos contra I\kappaB\alpha y RelA eran de Santa Cruz Biotechnology.

Preparación de proteínas recombinantes

La (His)_{6}MEKK1\Delta y (His)_{6}MEKK1\Delta (K432M) se purificaron usando Ni-NTA-agarosa de células Sf9 infectadas con baculovirus preparadas usando el sistema de expresión "Bac-to-Bac" (GIBCO-BRL Life Technologies). pFastBacHT-MEKK1\Delta y pFastBacHT-MEKK1\Delta (K432M) se construyeron por subclonación del fragmento de secuencia que codifica NcoI/XbaI de 1,2 kb de pcDNA3-FlagMEKK1\Delta y pcDNA3-FlagMEKK1\Delta (K432M), respectivamente, en el sitio NcoI/XbaI de pFastBacHTa. Posteriormente se prepararon los bácmidos y baculovirus recombinantes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. GST-MKK4 y GST-JNK1 se purificaron de E. coli HB101 transformada con pGEX-MKK4 y pGEX-JNK1, respectivamente, usando cromatografía de afinidad en glutatión-sefarosa como se ha descrito (Smith, D.B. and Johnson, K.S., Gene 67:31-40 (1988)). pGEX-MKK4 se construyó por subclonación del fragmento BamHI (romo)/Bspl201 (romo) de 1,1 kb de pcDNA3-FlagMKK4 que contiene la secuencia que codifica la MKK4 en el sitio SmaI de pGEX-3X (Pharmacia). pGEX-JNK1 se construyó por subclonación del fragmento Ncol (romo)/SaII de 1,4 kb de pSR\alphaHA-JNK1 que contiene la secuencia que codifica la JNK1 en el sitio EcoRI (romo)/SaII de pGEX-5X-1 (Pharmacia). El (His)_{6}I\kappaB\alpha se purificó usando Ni-NTA-agarosa de E. coli BL21(DE3)LysS transformada con pRSET-I\kappaB\alpha. El pRSET-l\kappaB\alpha se construyó por subclonación del fragmento EagI (romo)/HindIII de pBS-I\kappaB\alpha que contiene la secuencia que codifica el I\kappaB\alpha en el sitio PvuII/Hindlll de pRSET A (Invitrogen). Las enzimas E2 Ubc4 y GST-Ubc5 se prepararon como se ha descrito (Chen, Z.J. et al., Cell 84:853-862 (1996)). Las concentraciones de proteínas recombinantes se determinaron por SDS-PAGE seguido de tinción con azul Coomassie y comparación con patrones de albúmina de suero bovino.

pCMV5-MEKK1 (que codifica los 672 restos C-terminales de la MEKK1), pcDNA3-FlagMKK4, y pSR\alphaHA-JNK1 fueron regaos del Dr. Roger Davis (University of Massachusetts, Worcester) y han sido descritos (Derijard, B. et al., Cell 76:1025-1037 (1994); Derijard, B. et al., Science 267:682-685 (1995); Whitmarsh, A.J. et al., Science 269:403-407 (1995)). pcDNA3-MEKK1 se construyó por subclonación del fragmento EcoRI/EcoRI/EcoNI (romo) de 2,4 kb de pCMV5-MEKK1 que codifica la MEKK1 en el sitio de EcoRI/EcoRV de pcDNA3. pcDNA3-FlagMEKK1\Delta (K432M) consiste en un epítopo Falg N-terminal fusionado al fragmento de 321 aminoácidos C-terminal de la MEK1 con la mutación indicada (numeración de aminoácidos de acuerdo con Lange-Carter, C.A. et al, Science 250:315-319 (1993)) y se construyó por la reacción en cadena de la polimerasa (Ausubel, F.M. et al., Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY (1989)). pcDNA3-FlagMEKK1\Delta se construyó sustituyendo el fragmento Stul de 2,1 kb de pcDNA3-FlagMEKK1\Delta (K432M), que codifica los 262 aminoácidos C-terminales por el correspondiente fragmento de pcDNA3-MEKK1. pCMV4-FlagI\kappaB\alpha y pCMV4-FlagI\kappaB\alpha (S32A/S36A) fueron regalos del Dr. Dean Ballard (Vanderbilt University) y han sido descritos (Brockman, J.A. et al., Mol. Cell. Biol. 15:2809-2818 (1995)). pcDNA1-cJun ha sido descrito (Du, W. and Maniatis, T., Cell 74:887-898 (1993)). pcDNA1-cJun(S63A/S73A) se construyó usando la reacción en cadena de la polimerasa con superposición (Ausubel, F.M. et al., Current protocols in Molecular Biology, John Wily & Sons, Inc., New York, NY (1989)). PBS-I\kappaB\alpha, pBS-I\kappaB\alpha(S32A/S36A), pBS-FlagI\kappaB\alpha, pBS-FlagI\kappaB\alpha (S32A/S36A), (PRDII)_{2}CAT, (PRDIV)_{6}CAT, (CRE)_{6}CAT, -110IFN-\betaCAT, y pCMV-lacZ han sido descritos (MacGregor, G.R. and Caskey, C.T., Nucl. Acids Res. 17:2365 (1989); Du, W. and Maniatis, T., Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 89:2150-2154 (1992); Thanos, D. and Maniatis, Cell 71:777-789 (1992); Chen, Z.J. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597(1995)).

Preparación de extractos

Los extractos citoplasmáticos de células HeLa S_{3} se prepararon por dos métodos. En el primero ("procedimiento de lisis rápida"), se cultivaron células HeLa S_{3} en la fase logarítmica media de crecimiento en medio RPMI 1640 complementado con suero de caballo al 5%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, y estreptomicina 100 \mug/ml, y se centrifugaron a 2.600 x g durante 10 min. Las células se volvieron a suspender en medio RPMI que contenía suero de caballo al 5%, y después se trataron ficticiamente o se incubaron con TNF-\alpha 1000 U/ml a 37ºC. A diferentes tiempos, las células se centrifugaron a 1.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Después las células se lavaron rápidamente con PBS helado, se centrifugaron otra vez a 1.000 x g durante 1 min, se volvieron a suspender en Tris 50 mM helado (pH 7,5), EGTA 1 mM, y después se sometieron a lisis inmediatamente por homogeneización en el dispositivo Dounce (15-20 golpes con una mano de mortero de tipo A). El lisato bruto se clarificó por centrifugación a 4.600 x g durante 10 min a 4ºC, y el líquido sobrenadante resultante se congeló inmediatamente a -80ºC. En el segundo método ("S100"), las células HeLa S_{3} se hincharon en un tampón hipotónico y se sometieron a lisis, seguido de separación de los núcleos y centrifugación a 100.000 x g como se ha descrito (Dignam et al., 1983). Después el liquido sobrenadante se dializó completamente frente a Tris 20 mM (pH 7,5), DTT 0,5 mM. Si no se iba a usar inmediatamente, el extracto se almacenó a -80ºC.

Fraccionamiento de los extractos citoplasmáticos de HeLa y purificación de la I\kappaB\alpha-quinasa

Método A

Se concentraron extractos citoplasmáticos de HeLa S100 por precipitación en sulfato amónico (80%), seguido de diálisis en Tris-HCl 20 mM, pH 7,2, DTT 0,5 mM. Los extractos dializados se aplicaron a FPLC/monoQ (Pharmacia) equilibrada con Tampón A (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, DTT 0,5 mM), y se recogió el flujo a través de la columna y se concentró usando Cetriprep-10 (Amicon). El flujo a través de la columna concentrado se denominó fracción I. Para preparar la fracción II, las proteínas unidas se eluyeron con Tampón B (Tampón A + KCl 0,5 M) y se concentraron. Para purificar la I\kappaB\alpha-quinasa, las proteínas unidas a monoQ se eluyeron por pasos con KCl 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 y 0,5 M en Tampón A. Las fracciones que contenían I\kappaB\alpha-quinasa (eluato con KCl 0,2-0,3 M) se juntaron y se volvieron a fraccionar por precipitación en sulfato amónico (40%). Los precipitados se volvieron a suspender en un volumen mínimo de Tampón A, y después se separaron por cromatografía de exclusión por tamaño por FPLC/Superdex 200 en Tampón C (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, DTT 0,5 mM, NaCl 150 mM). Las fracciones activas se juntaron y se aplicaron a FPLC/monoQ que se había equilibrado con Tampón C. La columna se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0,15 M-0,4 M en Tampón C. Las fracciones que contenían la I\kappaB\alpha-quinasa se concentraron con Centricon-10 y después se volvieron a separar por tamaños por FPLC/Superdex-200 como se ha descrito antes. Las fracciones activas se juntaron, concentraron y almacenaron a -80ºC. El tampón de almacenamiento es Tampón A más glicerol al 10%.

Método B

Se aplicó extracto citoplasmático S100 de células HeLa, preparado como antes, a una columna de intercambio aniónico mono-Q. La actividad de I\kappaB\alpha-quinasa se eluyó con KCl 0,2-0,3 M en Tampón D (Tris 50 mM, pH 7,5, DTT 0,5 mM), y después se precipitó en sulfato amónico al 40%. Los precipitados vueltos a suspender se dializaron frente a K_{2}HPO_{4}-KH_{2}PO_{4} 10 mM (pH 7,0), DTT 0,5 mM, y después se aplicaron a una columna de hidroxiapatito. Después de eluir con K_{2}HPO_{4}-KH_{2}PO_{4} 0,2 M (pH 7,0), las fracciones que contenían quinasa se aplicaron a una columna de filtración en gel Superdex-200 equilibrada con Tris 50 mM (pH 7,5), DTT 0,5 mM, y NaCl 150 mM. Las fracciones de alto peso molecular que contenían la actividad de quinasa se aplicaron a una columna Mono-Q y se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 150-325 mM en Tampón D. En las fracciones de las cromatografías en Superdex-200 y segunda en mono-Q se ensayó la actividad de I\kappaB\alpha-quinasa y la presencia de componentes de ubiquitinación (Ubc4 y ubiquitina, además de E1 suministrada por el extracto de germen de trigo usado para la traducción de I\kappaB\alpha in vitro) (Chen, Z.J. et al., Cell 54:853-862 (1996)), o MEKK1\Delta recombinante.

Método C (Figura 18)

Se cargaron extractos citoplasmáticos de células HeLa en una columna de intercambio aniónico MonoQ y se eluyó la actividad de I\kappaB\alpha-quinasa con KCl 0,3 M en Tampón A (Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, DTT 0,5 mM). Después se añadió sulfato amónico sólido a las fracciones que contenían quinasa de forma que la concentración final era igual a 40% de saturación. Los precipitados se volvieron a suspender en Tampón B (K_{2}HPO_{4}-KH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,0, DTT 0,5 mM) y se dializaron frente a Tampón B a 4ºC toda la noche. Después, el material dializado se aplicó a una columna de hidroxiapatito, y se eluyó la I\kappaB\alpha-quinasa con un gradiente lineal de K_{2}HPO_{4}-KH_{2}PO_{4} 0-0,2 M, pH 7,0. Las fracciones de quinasa activa se juntaron y se aplicaron a una columna Superdex-200 en Tampón A que contenía NaCl 150 mM. Las fracciones de alto peso molecular que contenían la actividad de I\kappaB\alpha-quinasa se juntaron y se volvieron a fraccionar en columna MonoQ con un gradiente lineal de NaCl 150-325 mM en Tampón A. Se ensayó en cada fracción la actividad de I\kappaB\alpha-quinasa y se analizó el contenido de proteína por electroforesis en gel nativo al 2-15% seguido de tinción con plata.

Ensayos de fosforilación y ubiquitinación

Salvo que se indique lo contrario, la fosforilación del I\kappaB\alpha normalmente se llevó a cabo a 37ºC durante 1 hora en un volumen de reacción de 10 \mul, que contenía: un sistema de regeneración de ATP (Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 5 mM, ATP 2 mM, fosfato de creatina 10 mM, creatina-quinasa 3,5 unidades/ml, pirofosfatasa inorgánica 0,6 unidades/ml), 0,5 \mul de I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S traducido in vitro, 2 \mug/ml del homodímero RelA recombinante (para formar complejo con I\kappaB\alpha), ácido okadaico 3 \muM, ubiquitina 60 \muM, E1 50 nM (conejo), UBC4 1 \muM (levadura) o GST-UBCh5 (humano) y fracciones de 0,5-3 \mul que contenían I\kappaB\alpha-quinasa. En algunos experimentos, se usó la fracción I de HeLa (1 mg/ml) como fuente de E2. Al final de cada reacción, se añadió tampón de muestra con SDS para parar la reacción, y las muestras se analizaron por SDS-PAGE (9%) seguido de fluorografía: se cuantificó la fosforilación del I\kappaB\alpha por análisis con PhosphorImager. La ubiquitinación de I\kappaB\alpha ha sido descrita previamente (Chen, ZJ. et al., Genes & Dev. 9:1586-1597 (1995)).

Ensayos de tioéster

Las mezclas de reacción de tioéster contienen: Tris 50 mM, pH 7,6, E1 0,1 \muM (conejo), E2 aproximadamente 1 \muM, ubiquitina marcada con ^{125}I 0,6 \muM (10^{7} cpm/nmol). Después de 3 minutos a 37ºC, las reacciones se pararon por adición de igual volumen de tampón de muestra con SDS que carecía de agentes de reducción. Las muestras se sometieron a SDS-PAGE (gel con gradiente 10-20%) y fluorografía.

Tratamiento con fosfatasa y trombina

Después de la fosforilación de I\kappaB\alpha, se añadieron tampón RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, NP40 al 1%, desoxicolato al 0,5%, y también incluía SDS al 0,1%) y antisuero anti-I\kappaB\alpha (contra el extremo C del I\kappaB\alpha), a la mezcla de reacción, la cual después se incubó a 4ºC durante 45 min. Se añadió proteína A-Trisacril a la mezcla y la incubación se continuó a 4ºC durante otros 45 min. Las perlas se lavaron tres veces con tampón RIPA que carecía de SDS, y tres veces con tampón A. En las reacciones de desfosforilación, se añadieron 1 \mul de fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIP, 18 U/l) y 1 \mul de 10 x tampón de desfosforilación (Tris-HCl 0,5 M, pH 8,5, EDTA 1 mM), a las perlas que contenían el inmunocomplejo de I\kappaB\alpha, y se incubaron a 37ºC durante 30 min. La reacción se paró con tampón de muestra con SDS y se analizó por SDS-PAGE (9%) y fluorografía. Las reacciones testigo contienen sólo tampón de desfosforilación o CIP más un cóctel inhibidor de fosfatasa (NaF 50 mM, glicerol-2-fosfato 50 mM, ortovanadato sódico 1 mM, ácido okadaico 5 \muM).

Para escindir el extremo N del I\kappaB\alpha con trombina, los inmunoprecipitados que contenían I\kappaB\alpha (tratamiento con CIP +/-) se lavaron tres veces con tampón de trombina (Tris 20 mM, pH 8,3, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2,5 mM, y glicerol al 10%), y después se trataron con 3U de trombina (Sigma) a 30ºC durante 2 horas. El líquido sobrenadante que contenía el fragmento N-terminal escindido de I\kappaB\alpha se mezcló con tampón de muestra con SDS, y después se analizó en geles de Tris-tricina al 16,5%, seguido de fluorografía (Whiteside, S.T. et al, Mol. Cell. Biol. 15:5339-5345 (1995)).

Cultivo tisular y transfección

Se mantuvieron células HeLa y L929 en medio DME complementado con suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, y estreptomicina 100 \mug/ml. Las transfecciones e infecciones con virus, realizadas en pocillos de 3,5 cm de diámetro, se llevaron a cabo como se ha descrito (Thanos, D. and Maniatis, Cell 71:777-789 (1992)). Típicamente las células se recogieron a las 41 a 49 h después de la transfección. Se llevaron a cabo los ensayos de CAT y \beta-galactosidasa como se ha descrito (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Las concentraciones de proteína se midieron por el método de Bradford.

Inmunoprecipitaciones I\kappaB\alpha transfectado

Sedimentos celulares obtenidos de la recolección de pocillos de 3,5 cm de diámetro, se trataron por adición de 200 \mul de Tampón A (Tris 20 mM, pH 7,5, KCl 0,4 M, \beta-glicerolfosfato 4 mM, ortovanadato sódico 0,1 mM, NP-40 al 0,1%, glicerol al 10%, leupeptina 10 \mug/ml, PMSF 1 mM, y DTT 1 mM), seguido de tres ciclos de congelación/descongelación. Después de centrifugar a 14.000 x g durante 5 min a 4ºC, el líquido sobrenadante se incubó (320 \mug de proteína) con 20 \mul de M2-agarosa (IBI-Kodak) en 1 ml de Tampón A con una rotación de extremo a extremo durante 1 h a 4ºC. Después las resinas se lavaron tres veces con Tampón A y una vez con 0,1 X Tampón A.

FlagI\kappaB\alpha marcado con ^{35}S

FlagI\kappaB\alpha traducido in vitro se inmunoprecipitó por incubación con 10 \mul de M2-agarosa en 1 ml de Tampón B (Tris 10 mM, pH 7,6, NaCl 100 mM, NP-40 al 0,1%, leupeptina 10 \mug/ml, DTT 1 mM) con rotación de extremo a extremo durante 1 h a 4ºC. Después las resinas se lavaron tres veces con Tampón B, una vez con Tampón C (Tris 10 mM, pH 7,6, BSA 1 mg/ml, leupeptina 10 \mug/ml, DTT 1 mM), y después se eluyeron por adición de 24 \mul de Tampón C que contenía el péptido Flag 0,7 mg/ml durante 30 min, en hielo.

Transferencia western

Las proteínas se sometieron a electroforesis por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas Immobilon-NC (Millipore). Las membranas se bloquearon con leche sin grasa al 5% y se ensayaron con sonda de anticuerpos policlonales anti-I\kappaB\alpha (C21, Santa Crus, Biotechnology). Después las membranas se incubaron con conjugados de IgG de anti-conejo de cabra-fosfatasa alcalina o IgG de anti-conejo de mono-peroxidasa de rábano picante, y se desarrollaron usando sustratos cromógenos patrón o de quimioluminiscencia potenciada (Amersham), respectivamente. Las transferencias western de la I\kappaB\alpha-quinasa purificada usaron anticuerpos (anti-MEKK1 [C22], anti-MKK4 [C20], anti-JNK1 [FL], anti-JNK2 [FL]) obtenidos de Santa Cruz Biotechnology.

Ensayos de la proteína quinasa Ensayos basados en gel

Típicamente, se incubaron extractos citoplasmáticos de células HeLa o I\kappaB\alpha-quinasa purificada (de la cromatografía de filtración en gel antes descrita), con 0,5 \mul de proteína marcada con ^{35}S traducida in vitro, en un volumen total de 10 \mul que contenían Tris 50 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 6 mM, ATP 2 mM, fosfocreatina 10 mM, creatina-fosfoquinasa 3,5 U/ml, y ácido okadaico 2,5 \muM. Se prepararon I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S traducido in vitro, FlagI\kappaB\alpha y c-Jun, o sus mutantes deficientes en la fosforilación, usando kits de extracto de germen de trigo TnT (Promega) y pBS-I\kappaB\alpha, pBS-4\kappaB\alpha (S32A/S36A), pBS-FlagI\kappaB\alpha, pBS-FlagI\kappaB\alpha (S32A/S36A), pcDNA1-cJun o pcDNA1-cJun (S63A/S73A) como moldes.

Marcaje de I\kappaB\alpha con [\gamma-^{32}P]ATP

La enzima se incubó con 0,5 \mug de (His)_{5}I\kappaB\alpha en 10 \mul de Tris 50 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 5 mM, ácido okadaico 2,5 \muM, ATP 200 \muM y 5 \muCi de [\gamma-^{32}P]ATP. Las incubaciones se llevaron a cabo a 30ºC durante 30 min.

Desfosforilación del complejo de I\kappaB\alpha-quinasa

La I\kappaB\alpha-quinasa purificada (de la cromatografía por filtración en gel) se trató con MEKK1\Delta en Tris 50 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 5 mM, ATP 2 mM durante 30 min a 30ºC. La I\kappaB\alpha-quinasa activada por MEKK1\Delta se separó del ATP por filtración en gel centrífuga en Sephadex G50, y posteriormente se incubó con o sin fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIP) en Tris 50 mM (pH 7,8), EDTA 0,1 mM durante 30 min a 30ºC. Después se separó la I\kappaB\alpha-quinasa de la CIP y MEKK1\Delta por cromatografía en una columna Superdex 200, y se ensayó la actividad de I\kappaB\alpha-quinasa en ausencia o presencia de MEKK1\Delta.

Marcaje del complejo de I\kappaB\alpha-quinasa con [\gamma-^{32}P]ATP

Se incubaron 2 nanogramos de MEKK1\Delta en 7 \mul de Tris 70 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 7 mM, ácido okadaico 3,5 \muM, y ATP 140 \muM durante 15 min a 30ºC. Posteriormente, se añadieron la I\kappaB\alpha-quinasa purificada (de la segunda etapa de cromatografía en MonoQ como se ha descrito antes) y [\gamma-^{32}P]ATP 10 \muci en un volumen total de 3 \mul, y la incubación se continuó a 30ºC durante 30 min adicionales. En las reacciones testigo se omitió la MEKK1\Delta o la I\kappaB\alpha-quinasa.

Ejemplo 1 La ubiquitinación de I\kappaB\alpha requiere UBC4 (Figura 1)

Se separaron extractos citoplasmáticos de células HeLa en fracción I y fracción II por cromatografía en MonoQ. Se ensayó en cada fracción sola (calles 3 y 7) o combinadas (calle 8) la ubiquitinación de I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S. Para determinar si UBC4 recombinante de levadura podría sustituir la fracción I en el ensayo de ubiquitinación, se ensayó UBC4 (calle 2) solo o combinado con fracción II (calle 4). Como testigos, se añadieron un extracto de E. coli ficticio (calle 5) o UBC3 recombinante de levadura (calle 6) junto con la fracción II. Tanto UBC4 como UBC3 forman tioésteres con la ^{125}I-ubiquitina.

Ejemplo 2 Una quinasa de alto peso molecular fosforila el I\kappaB\alpha en las serinas 32 y 36 (Figura 2)

(A) Fraccionamiento de la I\kappaB\alpha-quinasa en Superdex-200. Se juntaron las fracciones que contenían I\kappaB\alpha-quinasa de la cromatografía en monoQ, y se hicieron precipitar en sulfato amónico al 40%. El precipitado vuelto a suspender se cargó en una columna de filtración en gel Superdex-200, y se ensayó la capacidad de las fracciones de fosforilar I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S (la generación de la banda de migración más lenta, como se indica para p-I\kappaB\alpha). Calle 1: testigo de I\kappaB\alpha; calle 2, fracción sin quinasa; calle 3, fracciones con quinasa (juntadas) de la cromatografía en monoQ (Q); calle 4, precipitado en sulfato amónico al 40% (Qa); calles 5-13, fracciones 17-25. No se detectó actividad de quinasa en las fracciones 26-36. Los números 670 y 440 encima del autorradiograma indican masas moleculares aproximadas. La banda por encima de p-I\kappaB\alpha es I\kappaB\alpha monoubiquitinado debido a la presencia de la fracción I en la reacción.

(B) Recromatografía de I\kappaB\alpha-quinasa en Superdex-200. Las fracciones que contenían I\kappaB\alpha-quinasa procedentes de Superdex-200 (fracciones 18-21, Figura 2A) se volvieron a aplicar a una columna monoQ y se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl de 150 mM a 400 mM. Se juntaron las fracciones activas, se concentraron y después se volvieron a cromatografiar en una columna Superdex-200. Calle 1, fracción sin quinasa; calle 2, fracciones con quinasa (fracciones 18-20) de la primera columna Superdex-200 (S1, Figura 2A); calle 3, fracciones con quinasa (fracciones 24-26) de la segunda columna monoQ (Q2); calles 4-10, fracciones 17-23 de la segunda columna Superdex-200.

(C) Fosforilación de los mutantes de I\kappaB\alpha. Los mRNA del I\kappaB\alpha sintetizados in vitro que codifican las proteínas mutantes se tradujeron in vitro y después se ensayó su capacidad de ser fosforilados por la I\kappaB\alpha-quinasa. Calles 1 y 2, I\kappaB\alpha de tipo salvaje; calles 3 y 4, I\kappaB\alpha mutante S32A/S36A; calles 5 y 6, mutante S32E/S36E; calles 7 y 8, mutante \DeltaN, calles 1, 3, 5 y 7, reacción testigo; calles 2, 4, 6 y 8, incubación con I\kappaB\alpha-quinasa. I\kappaB\alpha fosforilado se indica
por *.

(D) Tratamiento con fosfatasa de I\kappaB\alpha fosforilado. ^{35}S-I\kappaB\alpha se fosforiló con la I\kappaB\alpha-quinasa, se inmunoprecipitó con antisuero contra el extremo C de I\kappaB\alpha (c-21), y después se incubó con (calles 2, 4 y 6) o sin (calles 1, 3 y 5) fosfatasa (CIP). Las muestras se analizaron por SDS-PAGE al 9%. Calles 1 y 2, I\kappaB\alpha de tipo salvaje (sin marcas de epítopos); calles 3 y 4, I\kappaB\alpha marcado con el epítopo Flag en el extremo N; calles 5 y 6, S32A/S36A (también con epítopo Flag).

(E) Tratamiento con trombina de I\kappaB\alpha fosforilado. Los inmunoprecipitados mostrados antes en 2D se hicieron digerir con trombina y los líquidos sobrenadantes que contenían los fragmentos N-terminales se analizaron en gel de poliacrilamida con Tris-tricina al 16,5%. Las asignaciones de las calles son las mismas que en la Figura 2D.

Ejemplo 3 La fosforilación de I\kappaB\alpha requiere UBC4/UBC5 (Figura 3)

(A) La fosforilación de I\kappaB\alpha requiere la fracción I. Se fosforiló I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S con I\kappaB\alpha-quinasa en mezclas de reacción que contenían (calles 2 y 5) o carecían (calles 1, 3 y 4) de fracción I. Calles 1 y 2, mutante de I\kappaB\alpha S32A/S36A; calles 3-5, I\kappaB\alpha de tipo salvaje. En las calles 1 y 3, no se añadió I\kappaB\alpha-quinasa a la reacción.

(B) La fosforilación de I\kappaB\alpha requiere UBC4/UBC5. Se incubó I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S con I\kappaB\alpha-quinasa en una mezcla de reacción que contenía UBC4 recombinante purificado (levadura, calle 3) o GST-UBC5 purificado (humano, calle 4), o no tenía E2 (calle 2). En la calle 1, no se añadió I\kappaB\alpha-quinasa a la reacción.

(C) Sólo UBC4/UBC5 funcional estimula la fosforilación de I\kappaB\alpha. Se ensayó la capacidad de las E2 purificadas de reticulocitos de conejo para estimular la fosforilación de I\kappaB\alpha. Entre estas E2 se incluyen: E2_{14K} (calle 2), E2_{17K} (calle 3), E2_{20k}(calle 4), E2_{25k} (calle 5) y E2_{35k} (calle 6). Entre otras E2 que se ensayaron se incluyen: UBC2 humano recombinante purificado (calle 7) UBC4 de levadura (calle 8), y GST-UBC5 humano (\mug, calle 9). En las calles 10 y 11, se ensayaron los mutantes del sitio activo de UBC5 humano. C85A, la cisteína del sitio activo del resto 85 (C85) de UBC5 se sustituyó por alanina. C85S, C85 de UBC5 se cambió por serina. No se añadió E2 en la calle 1.

(D) Ensayos del tioéster de las E2. También se ensayó la capacidad de las E2 y E2 mutantes mostradas en la Figura 3C para formar tioésteres con ^{125}I-ubiquitina en presencia de E1.

(E) Efecto negativo dominante de los mutantes de UBCh5. Se añadieron 8 \mug de C85A (calle 1), C85S (calle 2), o GST (calle 3) a reacciones de fosforilación de I\kappaB\alpha que contenían 0,4 \mug de UBCh5 de tipo salvaje, y se analizó la fosforilación de I\kappaB\alpha por SDS-PAGE. Los dobletes por encima de I\kappaB\alpha en la calle 3 probablemente corresponden a proteínas fosforiladas en uno o ambos restos serina en las posiciones 32 y 36.

Ejemplo 4 La fosforilación de I\kappaB\alpha requiere ubiquitina (Figura 4)

(A) Estimulación dependiente de la concentración de la fosforilación de I\kappaB\alpha por la ubiquitina. Se incubó I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S con I\kappaB\alpha-quinasa en presencia de diferentes concentraciones de ubiquitina, y se analizó la fosforilación de I\kappaB\alpha por SDS-PAGE.

(B) Inhibición de la fosforilación dependiente de ubiquitina de I\kappaB\alpha por ubiquitina metilada (MeUb). Se incubó I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S con I\kappaB\alpha-quinasa en presencia de ubiquitina (calles 2 y 3) o MeUb (calle 6). En las calles 4 y 5, la ubiquitina (2,4 \muM o 60 \muM) se preincubó con E1 (0,1 \muM) y UBC4 (1 \muM) a 37ºC durante 3 minutos, para formar un tioéster E2-Ub. Después, se añadió esta mezcla a la mezcla de reacción de fosforilación que contenía I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S, I\kappaB\alpha-quinasa, y MeUb (40 \muM). En las calles 7-8, la mezcla de preincubación contiene MeUb (40 \muM) en lugar de ubiquitina. Después se añadió la mezcla del tioéster E2-MeUb a la mezcla de reacción de fosforilación que contenía ubiquitina 2,4 \muM (calle 7) o 60 \muM (calle 8).

Ejemplo 5 La fosforilación de I\kappaB\alpha requiere E1, pero no requiere ácido okadaico o unión a RelA (Figura 5)

(A) Requisito de E1. El I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S traducido en un extracto de germen de trigo se dejó asociar con RelA recombinante y después se hizo precipitar con antisuero anti-RelA. Se usó el inmunocomplejo como un sustrato para la fosforilación por la I\kappaB\alpha-quinasa. Todas las reacciones contienen ubiquitina y GST UBCh5. Calle 1, sin E1; calle 2, E1 añadida; calle 3, extracto de germen de trigo añadido.

(B) Requisito de ácido okadaico y relA. Se fosforiló I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S con I\kappaB\alpha-quinasa en una mezcla de reacción que contenía todos los componentes necesarios excepto por las siguientes exclusiones: calle 1, sin quinasa; calle 3, sin RelA; calle 4, sin ácido okadaico (OA).

Ejemplo 6 La I\kappaB\alpha-quinasa es activada por un suceso de ubiquitinación previo (Figura 6)

(A) Preincubación de la I\kappaB\alpha-quinasa con enzimas de ubiquitinación, y la ubiquitina elimina la fase de retardo en la fosforilación de I\kappaB\alpha. Se incubó I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S con I\kappaB\alpha-quinasa en presencia de E1, ubiquitina y UBC4. Después de 0, 3, 6, 10 y 20 minutos a 37ºC, se analizó una parte alícuota de la reacción por SDS-PAGE (calles 1-5). En las calles 10-13, la I\kappaB\alpha-quinasa se preincubó con E1, ubiquitina, y UBC4 en presencia de ATP a 37ºC durante 10 min antes de añadir I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S que iniciaba la reacción de fosforilación. En las calles 6-9, se omitió la ubiquitina de la mezcla de preincubación pero se añadió junto con I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S. Los dobletes encima de I\kappaB\alpha probablemente representan la fosforilación en uno o ambos restos de serina en las posiciones 32 y 36.

(B) Cinética de la fosforilación de I\kappaB\alpha. Se cuantificó el I\kappaB\alpha fosforilado (P- I\kappaB\alpha) mostrado en la Figura 6A por análisis con PhosporImager, y se expresó como el porcentaje de I\kappaB\alpha convertido en P-I\kappaB\alpha. Círculos blancos, sin preincubación: círculos negros, preincubación en presencia de I\kappaB\alpha-quinasa y ubiquitina; triángulos blancos, preincubación en ausencia de I\kappaB\alpha-quinasa; triángulos negros, preincubación en ausencia de ubiquitina; cuadrados blancos, sin enzimas de ubiquitinación o ubiquitina en la reacción.

Ejemplo 7 Ubiquitinación del complejo de I\kappaB\alpha (Figura 7)

(A) Formación de conjugados de ubiquitina de alto peso molecular en presencia de UBC4 y I\kappaB\alpha-quinasa. Se incubó la I\kappaB\alpha-quinasa (2 \mul por 10 \mul de reacción) con E1 (80 nM), UBC4 (2,5 \muM) y ubiquitina marcada con ^{125}I (28 \muM, 1,6 x 10 cpm/nmol) en presencia de un sistema de regeneración de ATP. Después de 0, 3, 6, 10, 20 y 40 minutos a 37ºC (calles 1-6), la reacción se paró y se analizó por SDS-PAGE (gel concentrador al 5%, gel separador al 9%). En las calles 7-11, las reacciones de ubiquitinación se llevaron a cabo a 37ºC durante 45 minutos en presencia o ausencia de UBC4 o I\kappaB\alpha-quinasa como se muestra en la figura. En la calle 11, se añadió MeUb (0,15 mM) a la reacción. En las calles 2, 3 y 4, se desarrolla ubiquitina libre en el gel. NS, bandas no específicas.

(B) Cinética de la ubiquitinación de la I\kappaB\alpha-quinasa. Los conjugados de alto peso molecular en la parte superior del gel mostrado en (A, calles 1-6) se cuantificaron por análisis con PhosphorImager, y se expresaron como una función del tiempo.

Ejemplo 8 La estaurosporina y su análogo K252a inhiben la fosforilación y ubiquitinación de I\kappaB\alpha en extractos de células HeLa (Figura 9)

Se sintetizó I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S por traducción in vitro, y se usó como un sustrato para ensayos de fosforilación (panel inferior, exposición corta) y ubiquitinación (panel superior, exposición larga) en extractos citoplasmáticos de células HeLa en presencia de ácido okadaico (Chen et al., Genes and Dev. P.1586-1597 (1995)). Se incluyeron diferentes agentes en la reacción para ensayar su capacidad para inhibir la fosforilación y ubiquitinación del I\kappaB\alpha. Calle 1: EDTA (40 mM); calle 2: DMSO; calle 3: MG102 (50 \muM) (Ac-L-Leu-L-Leu-L-Met-H); calle 4: MG132 (50 \muM) (Cbz-L-Leu-L-Leu-L-Leu-H); calle 5: K252a (10 \muM) (Calbiochem; Kase, H., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 142:436 (1987); calle 6: estaurosporina (10 \muM) (Calbiochem; Tomaoki, T., et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 135:397 (1986)); calle 7: TPCK (50 \muM) (N-tosil-L-fenilalanina-clorormetil-cetona); calle 8: TLCK (50 \muM) (N\alpha-p-tosil-L-lisina-clorometil-cetona). TPCK y TLCK son agentes de alquilación que se ha mostrado previamente que inhiben la fosforilación y degradación de I\kappaB\alpha in vivo (Beg et al., Mol. Cell. Biol. 13:3301-3310 (1993); Henkel et al., Nature 365:182-185 (1993); Sun et al., Science 259:1912-1915 (1993)). La estaurosporina y K252a inhiben la activación del NF-\kappaB in vivo por varios agonistas, incluyendo PMA y ionomicina, TNF-\alpha y LPS. K252a también inhibe la fosforilación del I\kappaB\alpha por la I\kappaB\alpha-quinasa parcialmente purificada.

Ejemplo 9 La actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa es inducible y se correlaciona con la actividad de la JNK (Figura 10)

(A) Se trataron células HeLa con TNF-\alpha durante los tiempos indicados, y se prepararon extractos citoplasmáticos por el procedimiento de lisis rápida. Después, los extractos (14 \mug) se sometieron a SDS-PAGE al 10%, se transfirieron a membrana de nitrocelulosa, y se ensayaron con sonda con anticuerpos anti-I\kappaB\alpha. Las posiciones de I\kappaB\alpha no fosforilado (I\kappaB\alpha) y fosforilado (P-I\kappaB\alpha) se indican a la izquierda. El marcador de peso molecular (en kilodaltons) se indica a la derecha.

(B) Se trataron células HeLa con TNF-\alpha durante los tiempos indicados, y se prepararon extractos citoplasmáticos por el procedimiento de lisis rápida. Después, los extractos (9 \mug) se incubaron con I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S en ausencia o presencia de ácido okadaico 6 \muM durante 1 h a 30ºC. Los productos de reacción se sometieron a SDS-PAGE al 9% y se analizaron por autorradiografía. Las posiciones de I\kappaB\alpha no fosforilado (I\kappaB\alpha) y fosforilado (P-I\kappaB\alpha) se indican a la izquierda.

(C) Se trataron células HeLa ficticiamente o con TNF-\alpha (5 min), y se prepararon extractos citoplasmáticos por el procedimiento de lisis rápida. Después, los extractos (8 \mug) se incubaron con I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S de tipo salvaje (WT) o mutante (S32A/S36A, M) o c-Jun de tipo salvaje (WT) o mutante (S63A/S73A, M) durante 0 o 60 min a 30ºC en presencia de ácido okadaico 2,5 \muM. Los productos de reacción se sometieron a SDS-PAGE al 10% y se analizaron por autorradiografía. Los marcadores de peso molecular (en kilodaltons) se indican a la izquierda. Las posiciones de c-Jun no fosforilado (cJun) y fosforilado (P-cJun) se indican a la derecha; las de I\kappaB\alpha se indican a la izquierda.

(D) Se incubaron extractos de S100 de células HeLa (18 \mug) con I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S de tipo salvaje (WT) o mutante (S32A/S36A, M) o c-Jun de tipo salvaje (WT) o mutante (S63A/S73A, M) durante 0 o 60 min a 30ºC en presencia de ácido okadaico 2,5 \muM. Los productos de reacción se sometieron a SDS-PAGE al 10% y se analizaron por autorradiografía. Los marcadores de peso molecular (en kilodaltons) se indican a la izquierda.

Ejemplo 10 La MEKK1 activa el NF-\kappaB in vivo (Figura 11)

(A) Se transfectaron células HeLa con 3 \mug de (PRDII)_{2}CAT, (PRDIV)_{6}CAT o -110IFN-\betaCAT, 2 \mug de pCMV-lacZ, y 4 \mug de pCMV5-MEKK1 de pcDNA3. Veintiséis a 28 horas después de la transfección, las células de un pocillo se infectaron con virus de Sendai durante 15 h. Todas las células se recogieron 41 a 43 h después de la transfección. Las actividades de CAT se normalizaron respecto a las concentraciones de proteína de los extractos celulares. Se muestran las medias y desviaciones típicas de tres experimentos independientes.

(B y C) Se transfectaron células HeLa (B) y L929 (C) con 3 \mug de (PRDII)_{2}CAT, 2 \mug de pCMV-lacZ, y 4 \mug de pcDNA3-FlagMEKK1\Delta (K432M) o pcDNA3. Cuarenta a 41 h después de la transfección, algunas células se trataron con 20 ng/ml de TNF-\alpha de ratón (Boehringer) durante 8 h. Todas las células se recogieron 48 a 49 h después de la transfección. Las actividades de CAT se normalizaron respecto a las de la \beta-galactosidasa. Se muestras las medias y desviaciones típicas de un experimento realizado por triplicado (B) o tres experimentos independientes (C).

(D) Se transfectaron células L929 con 3 \mug de (CRE)_{6}CAT, 2 \mug de pCMV-lacZ, y 4 \mug de pcDNA3-FlagMEKK1\Delta (K432M) o pcDNA3. Cuarenta a 41 h después de la transfección, algunas células se trataron con 8-Br-cAMP 1 mM durante 8 h. Todas las células se recogieron 48 a 49 h después de la transfección. Las actividades de CAT se normalizaron respecto a las de la \beta-galactosidasa. Se muestras las medias y desviaciones típicas de tres experimentos independientes.

Ejemplo 11 La activación del NF-\kappaB por la MEKK1 es por fosforilación específica de lugar de I\kappaB\alpha (Figura 12)

Se transfectaron células HeLa con 0,3 \mug de vectores de expresión para I\kappaB\alpha de tipo salvaje (WT) (pCMV4-Flag I\kappaB\alpha) o mutante (M) (pCMV4-Flag [S32A/S36A]), 3 \mug de pCMV5-MEKK1 de pCMV5, y 3 \mug de SP72. Cuarenta y una h después de la transfección, se inmunoprecipitó el I\kappaB\alpha marcado con epítopo, y algunas muestras se trataron con fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIP). Después todas las muestras se sometieron a SDS-PAGE al 10%, se transfirieron a membrana de nitrocelulosa, y se ensayaron con sonda de anticuerpos anti-I\kappaB\alpha.

Ejemplo 12 La MEKK1 activa directamente la I\kappaB\alpha-quinasa (Figura 13)

(A) Se incubaron extractos citoplasmáticos de células HeLa no inducidas (2 \mug) preparadas por el procedimiento de lisis rápida, con I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S de tipo salvaje (WT) o mutante (S32A/S36A, M) o c-Jun de tipo salvaje (WT) o mutante (S63A/S73A, M), en ausencia o presencia de 20 ng de MEKK1\Delta durante 1 h a 30ºC, en presencia de ácido okadaico 1,2 \muM. Una incubación adicional (calle 1) contenía 20 ng de MEKK1\Delta e I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S en ausencia de extracto. Los productos de reacción se sometieron a SDS-PAGE al 10% y se analizaron por autorradiografía. Los marcadores de peso molecular (en kilodaltons) se indican a la izquierda.

(B) Se incubaron extractos citoplasmáticos de células HeLa no inducidas (2 \mug) preparadas por el procedimiento de lisis rápida, con I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S en ausencia o presencia de 20 ng de MEKK1\Delta y/o ácido okadaico 1,2 \muM durante 1 h a 30ºC. Los productos de reacción se sometieron a SDS-PAGE al 10% y se analizaron por autorradiografía

(C) Se incubó I\kappaB\alpha-quinasa purificada con Flag-I\kappaB\alpha de tipo salvaje (WT), mutante (S32A/S36A) (M), o marcado con ^{35}S de tipo salvaje inmunoprecipitado (IP), en ausencia o presencia de 20 ng de MEKK1\Delta de tipo salvaje (WT) o mutante (K432M) (M), o 0,9 \mug de GST-Ubc5 + ubiquitina 0,5 mg/ml durante 1 h a 30ºC en presencia de ácido okadaico 2,5 \muM. Una incubación adicional (calle 1) contenía 20 ng de MEKK1\Delta y Flag-I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S en ausencia de I\kappaB\alpha-quinasa. Los productos de reacción se sometieron a SDS-PAGE al 10% y se analizaron por autorradiografía. En la calle 8, las bandas adicionales a pesos moleculares mayores que I\kappaB\alpha fosforilado representan la especie I\kappaB\alpha ubiquitinada, debido a la presencia de componentes de ubiquitinación (Chen et al., 1995, 1996).

(D) Se incubó I\kappaB\alpha-quinasa purificada en ausencia o presencia de 5, 10 ó 20 ng de MEKK1\Delta, con Flag-I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S durante 1 h a 30ºC en presencia de ácido okadaico 2,5 \muM. Los productos de reacción se sometieron a SDS-PAGE al 10% y se analizaron por autorradiografía.

Ejemplo 13 La I\kappaB\alpha-quinasa inducible por MEKK1 es un complejo de alto peso molecular (Figura 14)

Se fraccionaron extractos citoplasmáticos de células HeLa como se describe en los procedimientos experimentales, y después se cromatografiaron en una columna de filtración en gel Superdex-200 (A y B), seguido de una columna de intercambio iónico Mono-Q (C y D). Se ensayó en las fracciones la actividad de la I\kappaB\alpha-quinasa con Flag-I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S en presencia de componentes de ubiquitinación (A y C) o de 10 ng de MEKK1\Delta (B y D) durante 1 h a 37ºC en presencia de ácido okadaico 3 \muM. Los productos de reacción se sometieron a SDS-PAGE al 9% y se analizaron por autorradiografía. Los números 670 y 400 en (A) y (B) indican las posiciones de elución de los patrones de peso molecular (en kilodaltons).

Ejemplo 14 La MEKK1 es un activador selectivo de la I\kappaB\alpha-quinasa (Figura 15)

(A) Se incubaron MEKK1\Delta (10 ng), CKII (0,35 ng, 250 mU, New England Biolabs), PKA (0,8 ng, 1 mU, New England Biolabs), y PKC\varsigma (15 ng, Pan Vera), solas o combinadas con I\kappaB\alpha-quinasa purificada, con Flag-I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S durante 30 min a 30ºC, en presencia de ácido okadaico 2,5 \muM. Una incubación adicional (calle 2) contenía I\kappaB\alpha-quinasa purificada y Flag-I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S. Los productos de reacción se sometieron a SDS-PAGE al 10% y se analizaron por autorradiografía.

(B) Se incubaron I\kappaB\alpha-quinasa purificada, MEEKK1\Delta, CKII, PKA y PKC\varsigma en las cantidades usadas en (A), con 0,5 \mug de (His)_{6}I\kappaB\alpha en presencia de [\gamma-^{32}P]ATP. Los productos de reacción se sometieron a SDS-PAGE al 10% y se analizaron por autorradiografía. Las actividades relativas de quinasa determinadas por análisis con PhosphorImager para la I\kappaB\alpha-quinasa, MEEKK1\Delta, CKII, PKA y PKC\varsigma son 1, 0,6, 2,2, 1,0 y 1,3, respectivamente.

Ejemplo 15 La MEKK1 activa el complejo de I\kappaB\alpha-quinasa por fosforilación (Figura 16)

(A) Se incubó I\kappaB\alpha-quinasa activada por MEKK1\Delta con o sin fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIP, como se ha indicado), y posteriormente se incubó con o sin 12 ng de MEKK1\Delta (como se ha indicado) y con Flag-I\kappaB\alpha marcado con ^{35}S, durante 60 mi a 37ºC en presencia de ácido okadaico 3 \muM. Los productos de reacción se sometieron a SDS-PAGE al 9% y se analizaron por autorradiografía. El doblete enzima del I\kappaB\alpha probablemente representa la fosforilación en una o ambas serinas en las posiciones 32 y 36.

(B) Se incubaron MEKK1\Delta y I\kappaB\alpha-quinasa purificada, solas o combinadas, en presencia de [\gamma-^{32}P]ATP. Los productos de reacción se sometieron a SDS-PAGE al 8% y se analizaron por autorradiografía. Los marcadores de pesos moleculares (en kDa) se muestran a la izquierda. Las manchas indican bandas (aproximadamente 200, 180 y 120 kDa) presentes cuando la I\kappaB\alpha-quinasa se incuba con [\gamma-^{32}P]ATP en ausencia de MEKK1\Delta. El paréntesis indica bandas presentes cuando la MEKK1\Delta se incuba con [\gamma-^{32}P]ATP en ausencia de I\kappaB\alpha-quinasa, mostrando autofosforilación de MEKK1\Delta.

Ejemplo 16 La composición de subunidades de la quinasa es capaz de fosforilación específica de lugar del I\kappaB\alpha (Figura 19)

Se obtuvo I\kappaB\alpha-quinasa purificada de acuerdo con el método C anterior. La fracción 24 de la última columna MonoQ se desarrolló en gel nativo al 2-15% a 4ºC, 45 mV toda la noche, y el contenido de proteínas se analizó por tinción con plata (Figura 19, izquierda de la página). A la izquierda se muestran los marcadores de proteínas: 20S: 700 kDa; HSP90: 90 kDa. La banda predominante debajo del marcador 20S en el panel izquierdo (gel nativo) se sacó y se desarrolló en gel con SDS al 12% a 25ºC, 200 V. La composición de subunidades del complejo de quinasa se analizó por tinción con plata (Figura 19, panel derecho), y a la izquierda se muestran los pesos moleculares de cada subunidad individual.

Ejemplo 17 Un polipéptido inhibidor de la I\kappaB\alpha-quinasa (Figura 20)

Se expresó un fragmento N-terminal (restos 5-72) del I\kappaB\alpha en E. coli como una proteína recombinante que contenía un marcador de poli-histidina (His6) en el extremo N. La purificación de proteínas se llevó a cabo por cromatografía de afinidad con níquel. Como testigo, también se expresó el I\kappaB\alpha de longitud completa (Haskill (1991) Cell 65:1281) y se purificó de una forma similar.

Se añadió el I\kappaB\alpha de longitud completa recombinante o I\kappaB\alpha (5-72) a la concentración indicada, a 10 \mul de mezcla de reacción que contenía un sistema de regeneración de ATP (Tris 50 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 5 mM, ATP 2 mM, fosfocreatina 10 mM, creatina-fosfoquinasa 3,5 U/ml, pirofosfatasa inorgánica 0,6 U/ml)), ubiquitina 60 \muM, E1 50 nM, UBC4 1 \muM, 0,5 \mul de ^{35}S-I\kappaB\alpha traducido in vitro, 0,5 \mul de I\kappaB\alpha-quinasa (fracción 19 de una columna Superdex 200), y ácido okadaico 3 \muM. Después de incubación a 37ºC durante 40 min, la reacción se paró por adición de tampón de muestra con SDS, se separó por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS al 9%, y después se analizó por fluorografía.

Ejemplo 18 Ensayo de la I\kappaB\alpha-quinasa basado en gel

Se preparó extracto de células HeLa por lisis hipotónica seguido de centrifugación a 100.000 x g (S-100). Se recogió el líquido sobrenadante y a una etapa de precipitación en sulfato amónico al 80% le siguió diálisis frente a Tris 20 mM pH 7,6, DTT 1 mM. El extracto celular se cargó en una columna de intercambio aniónico MonoQ a pH 7,6, y la quinasa se eluyó con un gradiente por pasos de KCl 300 mM. El eluato después se concentró en sulfato amónico al 40%, y después se dializó frente a HEPES 50 mM, pH 7,6, DTT 1 mM. Esta quinasa parcialmente purificada se activó por incubación con E1 250 nM, UBC4 750 nM, ubiquitina 60 \muM, sistema de regeneración de ATP 2,5 mM, ácido okadaico 3 \muM, durante 90 minutos a 37ºC. Se añadieron péptidos de soluciones madre 10 mM a una concentración nominal de 1 mM, y se dejó equilibrar durante 30 minutos. Se añadió I\kappaB\alpha marcado con [^{35}S] traducido in vitro, durante 20 minutos, y después las reacciones de fosforilación se pararon con 5 x tampón de muestra con SDS, después se cromatografiaron en SDS-PAGE reductora al 9%. Para determinar las CI50, los péptidos se diluyeron de forma seriada en el intervalo 1 mM - 1 \muM antes del ensayo. Toda la cuantificación de la actividad de fosforilación en este ensayo de desplazamiento en gel se llevó a cabo con PhosphorImager. La columna de intercambio aniónico MonoQ y perlas de exclusión por tamaño Superosa-6 se obtuvieron de Pharmacia, Upsala, Suecia.

Ejemplo 19 Determinación de Km del ATP

Se determinó la constante de Michaelis para el ATP, primero activando la quinasa parcialmente purificada con componentes del sistema de ubiquitinación durante 90 minutos, o con MEKK1\Delta 30 nM durante 30 minutos a 37ºC usando MgATP 2,5 mM. Después las muestras se pasaron por columnas Biospin-6 de desalación (Biorad, Hercules, CA). Se volvieron a añadir diferentes concentraciones de ATP a la muestra de quinasa desalada junto con el sustrato [^{35}S]I\kappaB\alpha traducido in vitro, durante 20 minutos antes de parar y cromatografiar en SDS-PAGE. Mediante este análisis, se determinó que la Km de la I\kappaB\alpha-quinasa para el ATP era aproximadamente 300 \muM.

Ejemplo 20 Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de p40 y p50

Cada subunidad de proteína mostrada en la Figura 19 se sacó del gel de poliacrilamida y se hizo digerir con tripsina in situ. Los péptidos digeridos se extrajeron, separaron por HPLC, y se microsecuenciaron por espectrometría de masas en tándem (MS/MS) en las instalaciones de Harvard Microchemistry. Las secuencias peptídicas de p50 y p40 se muestra en la Figura 21.

En la Figura 21, un resto con asterisco no se puede diferenciar sin ambigüedad dentro del par isobárico en la secuenciación de espectrometría de masas (Confianza: A = alta; [A] = Probable/Razonable; (A) = Posible/Baja.

Las secuencias peptídicas mostradas en la Figura 21 se usaron para buscar en la base de datos EST pública, y las correspondencias se muestran en la Figura 22A y B. La Figura 22A muestra la secuencia de nucleótidos cuya secuencia de aminoácidos traducida contiene pep2 (LQEVIETLLSLEK). La Figura 22B representa la secuencia de nucleótidos cuya secuencia de aminoácido traducida contiene pep4 (TYHALSNLPK).

Las secuencias de ácidos nucleicos mostradas en las Figuras 22A y 22B se pueden radiomarcar y usar como sondas para obtener el clon de longitud completa de p50 y p40, respectivamente, mediante cribado de una biblioteca de cDNA (es decir, biblioteca de cDNA de células HeLa, por ejemplo, véase Chen and Pickart,. J. Biol. Chem. 265: 21835-21842 (1990)).

Abreviaturas usadas - TMB: 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; o-PD: dihidrocloruro de fenilenediamina; HEPES:
N-[2-Hidroxietil]piperazina-N'-[ácido 2-etanosulfónico]; DT: ditiotrietol; ATP: trifosfato de adenosina; SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico; EDTA: ácido etilendiamina-tetraacético; TFA: ácido trifluoroacético; PBS: solución salina tamponada con fosfato; HPLC: cromatografía líquida de alta eficacia; FPLC: cromatografía líquida de proteínas rápida; SEC: cromatografía de exclusión por tamaño.

Claims

1. Una quinasa purificada que fosforila al I\kappaB\alpha en los restos de serina 32 y 36, en la que la quinasa es un complejo de aproximadamente 700 kDa de peso molecular determinado por cromatografía de filtración en gel o cromatografía de exclusión por tamaño.

2. Una quinasa purificada que, cuando está activada, fosforila al I\kappaB\alpha en los restos de serina 32 y 36, en la que la quinasa es un complejo de aproximadamente 700 kDa de peso molecular determinado por cromatografía de filtración en gel o cromatografía de exclusión por tamaño.

3. La quinasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la quinasa se purifica por purificación cromatográfica de extractos celulares.

4. La quinasa de acuerdo con la reivindicación 3, en la que los extractos son extractos citoplasmáticos celulares.

5. La quinasa de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la purificación cromatográfica comprende cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño.

6. Un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica por la quinasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Un método para detectar una quinasa en una muestra, que comprende:

(a) poner en contacto un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6 con una muestra que comprende la quinasa, en condiciones tales que se forme un inmunocomplejo del anticuerpo y la quinasa; y

(b) detectar la presencia del inmunocomplejo.

8. Un kit de diagnóstico que comprende:

(a) un medio de envase que contiene el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6; y

(b) un medio para detectar el anticuerpo.

9. Un hibridoma que produce el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6.

10. Un método de selección de un agonista para la actividad de la quinasa de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra que comprende la quinasa de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, I\kappaB\alpha, y un sustrato de ensayo en condiciones en las que la quinasa fosforila el I\kappaB\alpha; y

(b) medir la fosforilación del I\kappaB\alpha, en el que un aumento de la cantidad de fosforilación del I\kappaB\alpha en presencia de la sustancia de ensayo comparado con la fosforilación en ausencia de la sustancia de ensayo, indica que la sustancia de ensayo es un agonista de la quinasa.

11. Un método de selección de un antagonista para la actividad de la quinasa de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende:

(b) medir la fosforilación del I\kappaB\alpha, en el que una disminución de la cantidad de fosforilación del I\kappaB\alpha en presencia de la sustancia de ensayo comparado con la fosforilación en ausencia de la sustancia de ensayo, indica que la sustancia de ensayo es un antagonista de la quinasa.