ES2319583T3 - Pak65 humana. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA PROTEINA QUINASA SERICA HUMANA, LA PROTEINA P65 QUINASA SERICA ACTIVADA POR LA PROTEINA P21 HUMANA, DENOMINADA HPAK65, Y PROCEDIMIENTOS PARA SU PREPARACION Y UTILIZACION. SE DESCRIBEN ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN PARA HPAK65, Y PROCEDIMIENTOS PARA SU UTILIZACION EN LA PREPARACION DE HPAK65, ASI COMO PARA LA PREPARACION E IDENTIFICACION DE ANALOGOS DE HPAK65. SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA EL USO DE LA PROTEINA HPAK65 Y SUS FRAGMENTOS PROTEICOS, TALES COMO LOS QUE MANTIENEN AL MENOS UNA ACTIVIDAD HPAK65, QUE INCLUYEN LA BUSQUEDA EN BANCOS DE AGENTES PARA ENCONTRAR CANDIDATOS QUE MODULEN LA ACTIVIDAD HPAK65. SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA IDENTIFICAR AGENTES QUE MODULAN LA INTERACCION DE HPAK65 CON GTPASAS P21 DE TIPO RHO, EN PARTICULAR LA UNION DE RAC1 Y CDC42HS A HPAK65, Y LA POSTERIOR ACTIVACION DE LA ACTIVIDAD PROTEINA QUINASA SERICA DE HPAK65, QUE MODULA LA ACTIVIDAD PROTEINA QUINASA SERICA DE HPAK65, Y QUE MODULA EL EFECTO DE HPAK65 SOBRE LA ACTIVIDAD GTPASA DE LA PROTEINA P21. ESTOS AGENTES MODULADORES PUEDEN PROPORCIONAR NUEVOS AGENTES QUIMIOTERAPICOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA NEOPLASIA, LOS TRASTORNOS LINFOPROLIFERATIVOS, LA ARTRITIS, LA INFLAMACION, LAS ENFERMEDADES AUTOINMUNITARIAS, LA APOPTOSIS Y SIMILARES, QUE ESTAN RELACIONADAS CON LA VIAS DE SEÑAL DE LA TRANSDUCCION DE HPAK65 Y DE LA PROTEINA P21.

Description

PAK65 humana.

Campo técnico

Esta invención se refiere a procedimientos para preparar y usar, y composiciones que contienen secuencias de ácido nucleico o proteína de la quinasa p65 activada por p21 humana ("hPAK65").

Antecedentes

Las proteínas similares a rho (es decir, proteínas p21), como otras GTPasas, alternan entre una forma activa unida a GTP y un estado inactivo unido a GDP (Nobes y Hall, 1994). Se demostró que la regulación de estas formas estaba controlada por varias proteínas, incluyendo factores de intercambio de nucleótidos de guanina ("GEF"), tales como proteínas activadoras de DbI y GTPasa (Hart et al. 1991, Boguski y McCormick, 1993). Los miembros de la familia de proteínas rho, incluyendo RhoA, B, C, racI, 2, CDC42Hs ("CDC42 Homo sapien") y TC10, comparten una identidad de secuencia de al menos el 50% entre sí y una identidad del 30% con otras proteínas similares a ras (Nobes y Hall, 1994). Una nueva percepción de la función fisiológica de proteínas rho y rac surge de publicaciones recientes descritas por Ridley y Hall (Ridley y Hall, 1992; Ridley et al., 1992) en las que se detectaron efectos citoesqueléticos rápidos cuando se microinyectaron proteínas rho y rac en fibroblastos Swiss 3T3. La rho activada induce formación de fibras de estrés y adhesiones focales (Ridley y Hall 1992), mientras que rac activada induce la formación de rugosidades en la membrana y lamelipodios (Ridley et al. 1992). Las proteínas rho también están implicadas en otros papeles fisiológicos asociados con reorganizaciones citoesqueléticas tales como motilidad celular (Takaishi et al. 1993), citoquinesis (Kishi et al. 1993) y agregación de linfocitos (Tominaga et al. 1993).

Aunque se demostró que la función fisiológica de CDC42 era esencial en la formación de brotes en levaduras (Johnson y Pringle 1990), no se ha descrito ninguna función fisiológica similar para su homólogo en mamíferos CDC42Hs. Sin embargo, se obtuvo una indicación de su papel en células de mamífero a partir de un estudio que demuestra que el protooncogén DbI presenta actividad de GEF sobre rho y CDC42Hs (Hart et al. 1991). Esta observación sugiere un papel para proteínas similares a rho en la transformación de células en un estado neoplásico. Sin embargo, no todas las proteínas que contienen el dominio DbI demuestran actividad de intercambio de nucleótidos en proteínas similares a rho. Por ejemplo, vav (Gulbins et al. 1993), Ect2 (Miki et al. 1993), ras GRF y bcr (Boguski y McCormick 1993) no ejercen una actividad de intercambio de nucleótidos sobre rho, y el dominio DbI de bcr y ras GRF no transforma células. Un estudio reciente sugiere una conexión directa entre rho y DbI in vivo al demostrar que la transformación de vav y DbI está mediada por rho (Khosravi-Far et al. 1994).

Se sabe que las proteínas p21 son componentes integrales de mecanismos de transducción de señales que conducen al control de la proliferación celular. Muchas afecciones patológicas son el resultado, al menos en parte, de un control anormal de la proliferación o diferenciación celular. Por ejemplo, la neoplasia se caracteriza por una población celular derivada de forma clonal que tiene una capacidad reducida para responder a señales de control de la proliferación celular normal. La transformación oncogénica de células conduce a varios cambios en el metabolismo celular, la fisiología y la morfología. Una alteración característica de las células oncogénicamente transformadas es una pérdida de sensibilidad a las restricciones sobre la proliferación y diferenciación celular impuestas normalmente por la expresión apropiada de genes reguladores del crecimiento celular.

Actualmente se conocen sólo unas pocas moléculas efectoras para proteínas similares a rho, incluyendo la quinasa PAK65 de cerebro de rata (Manser et al. 1994) y la p67-phox de la NADPH oxidasa (Diekmann et al. 1994). A partir de estudios de la función molecular en fagocitos se demostró que rac 1 y 2 están implicados en el control de la generación de superóxido por la NADPH oxidasa (Abo et al. 1991, Knaus et al. 1991). La rac activada junto con otros dos componentes citosólicos de la oxidasa, p47-phox y p67-phox, se ensamblan con el citocromo unido a membrana b_{558} para formar una oxidasa activa (Segal y Abo 1993). La molécula efectora para rac en este sistema es p67-phox (Diekmann et al. 1994). Se demostró que un efector molecular adicional para rac y CDC42Hs era una serina/treonina quinasa de cerebro de rata que se activa por racI y CDC42Hs (Manser et al. 1994). Otros estudios sugerían que CDC42Hs y rho también puede activar la PI3 quinasa (Zhang et al. 1993; Zheng et al. 1994).

En vista de los papeles potenciales y variados para proteínas p21 similares a rho en rutas fisiológicas y patologías, tales como papeles fisiológicos y de integridad estructural celular asociados con reorganizaciones citoesqueléticas tales como motilidad celular, citoquinesis, agregación de linfocitos, transformación y proliferación de células tumorales, metástasis, agregación celular, y de la falta de conocimiento de las moléculas y agentes que afectan a o modulan selectivamente las actividades de estas proteínas en una o más de estas rutas fisiológicas, existe por lo tanto la necesidad en la técnica de compuestos y agentes con actividad efectora y moduladora y procedimientos para identificarlos y composiciones y agentes relacionados. Además, dichos agentes pueden servir como reactivos de investigación comerciales para el control de la proliferación celular, la diferenciación y otras afecciones relacionadas con p21. A pesar de los avances en el desarrollo de un modelo más definido de los mecanismos moleculares que subyacen al fenotipo transformado y a la neoplasia, se han obtenido escasos métodos terapéuticos significativos aplicables para tratar el cáncer más allá de la quimioterapia convencional. Dichos agentes moduladores de proteína p21 pueden proporcionar nuevos agentes quimioterápicos para el tratamiento de neoplasias, afecciones linfoproliferativas, artritis, inflamación, enfermedades autoinmunes, apoptosis y similares. Se proporcionan estos y otros objetos mediante esta invención.

Bibliografía relevante

1. Nobes, C., and Hall, A. (1994) Curr. Opin. Gen. Devel. 4, 77-81.

2. Hart, M. J., Eva, A., Evans, T., Aaronson, S.A., Cerione, R.A. (1991) Nature 354, 311-314.

3. Boguski, M.S.; McCormick, F. (1993) Nature, 366, 643-654.

4. Ridley, A.J., Hall, A. (1992) Cell 70, 389-399.

5. Ridley, A.J., Paterson, H.F., Johnston, C.L., Diekmann, D., Hall, A. (1992) Cell 70, 401-410.

6. Takaishi, K., Kikuchi, A., Kuroda, S., Kotani, K., Sasaki, T., Takai, Y. (1993), Mol. Cell. Biol. 13, 72-79.

7. Kishi, K., Sosaki, T., Kuroda, S., Itah, T., Takai, Y. (1993) J. Cell. Biol. 120, 1187-95.

8. Tominaga, T., Sugie, K., Hirata, M., Fukata, J., Uchida, A., Imura, H., Narumiya, S. (1993) J. Biol. Chem. 120, 1529-1537.

9. Johnson, D., Pringle, J. (1990) J. Cell Biol. 111, 143-152.

10. Gulbins, E., Coggeshall, K.M., Baier, G., Katzav, S., Burn, P., Altman, A. (1993) Science 260, 822-825.

11. Miki., T., Smith, C.L., Long, J.E., Eva, A., Flemming, T.P. (1993) Nature 362, 462-465.

12. Khosravi-Far, R., Chrzanowska-Wodnicka, M., Solski, P.A., Eva, A., Burridge, K., Der, C.J. (1994) Mol. Cell. Biol. 14, 6848-6857.

13. Abo, A., Pick, E., Hall, A., Totty, N., Teahan, C.G., Segal, A.W. (1991) Nature 353, 668-670.

14. Knaus, U. G., Heyworth, P.G., Evans, T., Curnutte, J.T., Bokoch, G..M. (1991) Science 254, 1512-1515.

15. Segal, A.W., Abo, A. (1993) Trends. Biochem. Sci. 18, 43-47.

16. Diekmann, D., Abo, A., Johnston, C., Segal, A.W., Hall, A. (1994) Science 265, 531-533.

17. Manser, E., Leung, T., Salihuddin, H., Zhao, Z., Lim, L. (1994) Nature 367, 40-46.

18. Zheng, Y., Bagrodia, S., Cerione, R.A. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18727-18730.

19. Zhang, J., King, W.G., Dillon, S., Hall, A., Feig, L., Rittenhouse, S.E. (1993) J. Biol. Chem. 268, 22251-4.

20. Abo, A., Webb, M. R., Grogan, A., Segal, A.W. Biochem. J. (1994) 298, 585-591.

21. Kawasaki, H., and Suzuki, K., (1990) Anal. Biochem. 186, 264-268.

22. Totty, N.F., Waterfield, M.D., Hsuan, J.J. (1992) Prot. Sci. 1, 1215-1224.

23. Grussenmeyer, T., Scheidtmann, K.H., Hutchinson, M.A., Eckhart, W., Gernot, W. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7952-7954.

24. Shacter, E. (1984) Anal. Biochem. 138, 416-420.

25. Cooper, A.J., Sefton, B.M., Hunter, T. (1983) in Methods in Enzymology 99, 37.

26. Manser, E., Leung, T., Monfries, C., Teo, M., Hall, C., Lim, L. (1992) J. Biol. Chem. 267, 16025-16028.

27. Ramer, S.W., and Davis, R.W. (1993) Proc. Nat. Acad. Sci, U.S.A. 90, 452-456.

28. Avruch, J., Zhang, X., Kyriakis, J. (1994) Trend. Biochem. Sci. 19, 279-284.

29. Leberer, E., Dignard, D., Harcus, D., Thomas, D.Y., Whiteway, M., (1992b) EMBO J. 11, 4805-4813.

30. Errede, B., Levin, D.E. (1993) Curr. Opin. Cell Biol. 5, 254-260.

31. Errede, B., Gartner, A., Zhou, Z., Nasmyth, K., Ammerer, G., (1993), Nature 362, 261-264.

\newpage

32. Leberer, E., Dignard, D., Harcus, D., Hougan, L., Whiteway, M., Thomas, D.Y. (1993) Mol. Gen. Genet. 241, 241-254.

33. Settleman, J., Albright, C.F., Foster, L.C., Weinberg, R. A. (1992) Nature 359, 153-154.

Resumen de la invención

La invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada purificada que comprende una secuencia que codifica una proteína serina quinasa p65 activada por proteína p21 humana (hPAK65) o un fragmento de la misma que comprende uno o más dominios estructurales o funcionales de hPAK65, seleccionada del grupo (a) la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 1; (b) la secuencia de ácido nucleico que contiene sustituciones de codones degenerados con la secuencia codificante de PAK65 de la SEC ID Nº: 1; (c) variantes que tienen una identidad de secuencia de al menos el 95% con la SEC ID Nº: 1 a lo largo de la longitud completa de la misma y que dan como resultado péptidos que conservan la función de una proteína hPAK65; y (d) una secuencia de ácido nucleico capaz de codificar la secuencia de aminoácido de hPAK65 de la SEC ID Nº: 2. La invención proporciona además una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a una secuencia de ácido nucleico de la presente invención, en la que dicha secuencia complementaria es homóloga a toda la secuencia de referencia. Las secuencias de ácido nucleico son preferiblemente las que se encuentran en la naturaleza, aunque en vista de esta invención, los polinucleótidos que contienen estas secuencias puedan prepararse de numerosas formas conocidas en la técnica, incluyendo procedimientos sintéticos. Se describen en este documento construcciones recombinantes de hPAK65, por ejemplo, fusiones, truncamientos, sustituciones, que proporcionan polipéptidos que tienen ciertas propiedades deseables tales como actividad serina quinasa constitutiva, actividad de unión a proteína p21 y facilidad de purificación e identificación.

También se proporcionan proteínas hPAK65 aisladas y purificadas que contienen las secuencias que se encuentran en los polinucleótidos de la invención. Se describen procedimientos para la preparación de proteínas hPAK65, incluyendo el aislamiento a partir de fuentes naturales, la producción sintética y la producción recombinante usando las secuencias de ácido nucleico proporcionadas por la invención, tal como el cultivo de una célula hospedadora transformada con una molécula de ácido nucleico proporcionada por la invención en un medio de cultivo adecuado y el aislamiento de la hPAK65. La invención proporciona una proteína hPAK65 humana, y fragmentos de la misma, que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 2A.

La invención incluye vectores y células hospedadoras transformadas para expresar los polinucleótidos aislados de la invención cuando los polinucleótidos aislados están unidos operativamente a un vector de expresión apropiado para la expresión en la célula hospedadora usada.

Las proteínas aisladas de la invención que tienen actividad de serina proteína quinasa se usan para generar proteínas y aminoácidos fosforilados. También pueden usarse péptidos de la invención para generar anticuerpos para ensayos de detección y procedimientos de aislamiento de PAK65 y complejos de PAK65 en rutas de transducción de señales y afecciones patológicas relacionadas con PAK-65. Los polinucleótidos aislados de la invención pueden encontrar una utilidad adicional en el análisis minucioso de y en tratamientos antisentido particulares para rutas de transducción de señales y afecciones patológicas relacionadas con PAK65.

También se describen en este documento composiciones y procedimientos para explorar bibliotecas de agentes por su capacidad para modular o inhibir las propiedades de hPAK65 que, como se describen en este documento, incluyen su actividad proteína quinasa, su actividad de unión a proteína p21, su actividad de autofosforilación inducida por proteína p21 y su actividad de liberación de fosfato unido a p21. Preferiblemente, los agentes modulan las propiedades de interacción con racI y CDC42Hs de la PAK65 humana. Además, se describen composiciones y métodos para tratar o prevenir neoplasias en pacientes humanos y veterinarios, composiciones y procedimientos para explorar una biblioteca de agentes por su actividad farmacológica en la regulación de la proliferación celular y/o la diferenciación celular, composiciones y métodos para la modulación de un fenotipo celular transformado in vitro, incluyendo el uso en el control de bioprocesos y como reactivos de laboratorio comerciales. Además, se describen composiciones farmacéuticas para el control de enfermedades dependientes de hPAK65 en mamíferos, que incluyen un agente capaz de modular al menos una de las propiedades asociadas con hPAK65, y un método de control de enfermedades dependientes de hPAK65, que incluye administrar a un mamífero que padece una enfermedad dependiente de quinasa hPAK65 o una cantidad de control de una enfermedad dependiente de quinasa hPAK65 de un agente capaz de modular una de las propiedades asociadas con hPAK65. El término mamífero tiene el significado habitual e incluye a seres humanos. Los usos farmacéuticos pretenden incluir los usos veterinarios, especialmente el uso en animales domésticos tales como ganado, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos, conejos, hámsteres, gerbos, ratas y ratones.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B representan el fraccionamiento del citosol de neutrófilos. La Figura 1B representa un cromatograma que muestra el fraccionamiento del citosol de neutrófilos en una columna Mono Q en la que se aplicaron 10 ml (10 mg/ml) y que se eluyó con 30 ml de un gradiente salino. Las fracciones recogidas se analizaron mediante un ensayo de superposición con [\gamma^{32}P]GTP CDC42Hs como sonda (Figura 1A), como se describe en detalle en la sección de Ejemplos.

Las Figuras 2A, 2B y 2C representan la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 1) y de aminoácidos deducida (SEC ID Nº: 2) de la PAK65 humana ("hPAK65"). Se clonó ADNc de hPAK65 de una genoteca de placenta humana. La Figura 2a presenta una secuencia de ácido nucleico de ADNc de PAK65 humana y su secuencia de aminoácidos deducida. En la Figura 2A, los aminoácidos subrayados se corresponden con la secuencia peptídica obtenida a partir de la purificación de p65. La Figura 2B representa una comparación entre las secuencias de aminoácidos deducidas de hPAK65 y PAK65 de cerebro de rata. La Figura 2C representa una comparación entre un dominio quinasa supuesto de hPAK65 y STE20 de levadura.

Las Figuras 3A, B y C presentan análisis de transferencia de Northern de hPAK65 en tejido y líneas celulares. Se usó una sonda marcada radiactivamente generada por PCR a partir del dominio quinasa (secuencia de nucleótidos 1009-1912) de ADNc de hPAK65 para hibridar con ARNm aislado de diversos tejidos inmovilizados sobre transferencias de northern. La autorradiografía se expuso durante 3 h.

La Figura 4 representa la especificidad de unión de hPAK65 entre proteínas similares a rho. Se aplicaron 80 \mug de citosol de neutrófilos ó 2-3 \mug de hPAK65 recombinante en un SDS-PAGE, se transfirieron sobre un filtro de PVDF y se analizaron mediante el ensayo de superposición. El filtro se sondó con la GTPasa indicada precargada con [\gamma^{32}P]GTP o [\beta^{32}P]GDP. Los carriles a contienen hPAK65 recombinante y los carriles b contienen citosol de neutrófilos. Los marcadores de peso molecular de proteínas se indican en kilodaltons.

Las Figuras 5A-C presentan resultados de la activación de la autofosforilación de hPAK65. En la Figura 5A se incubaron 1-2 \mug de hPAK65 recombinante inmovilizada sobre perlas en 40 \mul de tampón de quinasa con 1-2 \mug de la GTPasa indicada que estaban precargados con GTP o GDP. La reacción se incubó durante 20 min a 30ºC con ATP 50 \muM y [\gamma^{32}P]ATP 5 \muCi. Se analizaron proteínas fosforiladas en un SDS PAGE seguido de una autorradiografía. En la Figura 5B, se hidrolizaron 4 \mug de hPAK65 fosforilada radiomarcada mediada por CDC42Hs en HCl 6 N, a 110ºC durante 2 h, y los fosfoaminoácidos se separaron en una electroforesis en capa fina. Los restos marcados con ^{32}Pi se detectaron mediante autorradiografía. En la Figura 5C, se realizó una digestión proteolítica con las enzimas indicadas (tripsina, quimiotripsina, endoproteinasa Glu-C) sobre hPAK65, que se incubó previamente con rac1 o CDC42Hs en una reacción quinasa que contenía [\gamma^{32}P]ATP. Los péptidos radiomarcados se resolvieron en un gel de tricina al 16% y se visualizaron mediante autorradiografía.

Las Figuras 6A-D representan la activación de la actividad quinasa de hPAK65. En la Figura 6A, se incluyeron 3 \mug de MBP con hPAK65 en una reacción quinasa como se ha descrito para la Figura 5A. En la Figura 6B, se retiraron 5 \mul de la mezcla de la reacción quinasa cada 5 min y la reacción se interrumpió por adición de tampón de muestras SDS. La MBP fosforilada se separó en un SDS PAGE al 14%, la banda se escindió y el realizó un recuento del ^{32}Pi incorporado. En la Figura 6C, se incubaron primero 4 \mug de hPAK65 (30 \mul de perlas) durante 20 min con 3 \mug de CDC42Hs en presencia (activada) o ausencia (control) de ATP en una reacción quinasa. Para eliminar la CDC42Hs, las perlas de hPAK65 se lavaron tres veces y la hPAK65 se sometió a una segunda reacción quinasa que contenía [\gamma^{32}P]ATP y MBP. La Figura 6D presenta la actividad quinasa de hPAK65 como recuentos por minutos (CPM) incorporados en MBP aislada de las transferencias de la Figura 6A.

La Figura 7 presenta una comparación de la unión de CDC42Hs con hPAK65 fosforilada y no fosforilada. Se procesaron 2 \mug de hPAK65 fosforilada o no fosforilada (inducida por CDC42Hs) en un SDS PAGE, se tiñó con Azul de Coomassie, y también se ensayaron para determinar la unión a CDC42Hs mediante el ensayo de superposición. El carril A contiene la forma no fosforilada y el carril B contiene la forma fosforilada.

Las Figuras 8A y 8B representan el efecto de hPAK65 sobre la actividad GTPasa intrínseca y estimulada por p190 de CDC42Hs. Se incubó CDC42Hs 1 nM precargada con [\gamma^{32}P]GTP con las concentraciones indicadas de hPAK65 fosforilada o no fosforilada en ausencia (Figura 8A) o presencia (Figura 8B) de 20 nM del dominio catalítico de p190, seguido del ensayo de fosfato liberado.

La Figura 9 presenta un esquema de un modelo del papel de racI/CDC42Hs en la activación de la quinasa hPAK65. En la etapa 1, los factores de intercambio rac1 o CDC42Hs, que se estimulan por factores de crecimiento, estimulan la liberación de GDP de rac1 o CDC42Hs y, posteriormente, la unión de GTP a rac1 o CDC42Hs. En la etapa 2, el rac 1 o CDC42Hs activado se une a hPAK65. En la etapa 3, rac1 o CDC42Hs induce la autofosforilación de hPAK65 para activar la actividad serina quinasa de hPAK65. En la etapa 4, la actividad GTPasa intrínseca de rac1 o CDC42Hs hidroliza el GTP al estado inactivo GDP. En la etapa 5, la forma unida GDP de rac1 o CDC42Hs se disocia de la quinasa hPAK65 activa autofosforilada.

La Figura 10 presenta la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión de unión a p21 GST-PAKette.

Descripción de realizaciones específicas

Se proporcionan por la invención nuevas composiciones que comprenden polinucleótidos y oligonucleótidos aislados que tienen secuencias de ácido nucleico de hPAK65. También se proporcionan por la invención proteínas aisladas codificadas por polinucleótidos de hPAK65. Se exponen secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos ejemplares en las SECUENCIAS ID Nº: 1 y 2, respectivamente. Los aspectos de la invención incluyen polinucleótidos y oligonucleótidos aislados que tienen secuencias de ácidos nucleicos homólogas a la SECUENCIA ID Nº: 1 o que codifican la SECUENCIA ID Nº: 2; y proteínas aisladas que tienen secuencias de aminoácidos homólogas a la SECUENCIA ID Nº: 2. Las realizaciones de la invención se llevan a cabo sintetizando químicamente polinucleótidos u oligonucleótidos que codifican hPAK65, en su totalidad o en parte, que tienen una homología de secuencia de ácido nucleico de al menos el 95% (preferiblemente con homologías crecientes hasta el 100%) con una secuencia de ácido nucleico de PAK65 humana; o aislando polinucleótidos que codifican una hPAK65 de origen natural que tiene una homología de secuencia de ácido nucleico de al menos el 95% (preferiblemente con homologías crecientes hasta el 100%) con una secuencia de ácido nucleico que codifica PAK65 humana. Por ejemplo, se conocen bien en la técnica procedimientos para sintetizar polinucleótidos y oligonucleótidos y pueden realizarse modificaciones en la secuencia de la SECUENCIA ID Nº: 1 que permitan desviarse de esa secuencia, al tiempo que permitan que se mantenga una homología de secuencia de ácido nucleico de al menos el 95% con la secuencia descrita en la SECUENCIA ID Nº: 1. En una realización preferida, las secuencias tienen una homología de al menos el 95% con la secuencia codificante de la SECUENCIA
ID Nº: 1.

Como alternativa, en otra realización de la invención se aíslan polinucleótidos que codifican una hPAK65 de origen natural con una homología de secuencia de ácido nucleico de al menos el 95% con una secuencia de ácido nucleico de PAK65 humana usando polinucleótidos u oligonucleótidos aislados que tienen secuencias de ácidos nucleicos derivadas de la SECUENCIA ID Nº: 1. Se conocen en la técnica, y se analizan en este documento, condiciones de hibridación y lavado que pueden usarse para hibridar selectivamente ácidos nucleicos de sonda generados a partir de la secuencia descrita en la SECUENCIA ID Nº: 1 con ácidos nucleicos con una homología de secuencia de ácido nucleico de al menos el 80% con la secuencia de ácido nucleico de PAK humana.

En los aspectos de proteínas aisladas de la invención, las proteínas aisladas de hPAK65 tienen secuencias de aminoácidos que se corresponden con una hPAK65 que tiene una homología de aminoácidos de al menos el 90% (con una preferencia creciente por secuencias con al menos el 95%, el 99%, hasta las que tienen una diferencia de un aminoácido) con una secuencia de PAK65 humana, la SECUENCIA ID Nº: 2. Las proteínas aisladas de la invención pueden expresarse usando los polinucleótidos de la invención unidos operativamente a una secuencia de control apropiada en un vector de expresión adecuado para la expresión en una célula de mamífero, insecto, levadura o bacteriana.

Definiciones

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. En general, la nomenclatura usada en este documento y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genética molecular y química e hibridación de ácidos nucleicos descritos a continuación son los bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica. Se usan técnicas convencionales para procedimientos de ácidos nucleicos recombinantes, síntesis de polinucleótidos y cultivos y transformación microbiana (por ejemplo, electroporación, lipofección). En general, las reacciones enzimáticas y las etapas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las técnicas y procedimientos se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales en la técnica y a la diversa bibliografía general (véase, en general, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.) que se proporciona por todo este documento. La nomenclatura usada en este documento y los procedimientos de laboratorio en la química analítica, la química orgánica sintética y la formulación farmacéutica que se describen a continuación son los bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica. Se usan técnicas convencionales para síntesis química, análisis químicos, formulación y administración farmacéutica y tratamiento de pacientes. Como se emplean por toda la descripción, los siguientes términos, a menos que se indique otra cosa, debe entenderse que tienen los siguientes significados:

La expresión "polinucleótido aislado" a la que se hace referencia en este documento se refiere a un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con toda o una porción de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está unido operativamente a un polinucleótido con el que no está unido en la naturaleza o (3) no aparece en la naturaleza como parte de una secuencia de mayor tamaño.

La expresión "proteína aislada" a la que se hace referencia en este documento se refiere a una proteína de origen de ADNc, ARN recombinante o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen la "proteína aislada" (1) no está asociada con otras proteínas que se encuentran en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas humanas, (3) se expresa por una célula de una especie diferente o (4) no aparece en la naturaleza.

El término "polipéptido" se usa en este documento como un término genérico para referirse a una proteína nativa, fragmentos o análogos de una secuencia polipeptídica. Por lo tanto, la proteína nativa, los fragmentos y análogos son especies del género polipeptídico. Los polipéptidos de hPAK65 que interaccionan con p21 preferidos incluyen: la proteína de longitud completa humana que comprende la secuencia polipeptídica que se muestra en la Figura 2A, polipéptidos que comprenden un dominio quinasa, tales como que consisten esencialmente en una secuencia que se muestra en la Figura 2C, polipéptidos que comprenden un dominio de unión a p21 que consiste esencialmente en los aminoácidos 49 a 113 de la Figura 2A, polipéptidos de hPAK65 que carecen de los aminoácidos 489, 490 y/o 491 o polipéptidos de hPAK65 que tienen los aminoácidos correspondientes a las posiciones 380, 383 y/o 384 de la Figura 2A reemplazados con Glu o Asp.

La expresión "de origen natural", como se usa en este documento aplicada a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio es de origen natural.

La expresión "unido operativamente" a la que se hace referencia en este documento se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una relación que los permite funcionar de la forma deseada. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante está ligada de tal modo que la expresión de la secuencia codificante se realiza en condiciones compatibles con las secuencias de control.

La expresión "secuencia de control" a la que se hace referencia en este documento se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias codificantes con las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control es distinta dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, dichas secuencias de control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión al ribosoma y una secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y una secuencia de terminación de la transcripción. La expresión "secuencia de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañeros de fusión.

El término "polinucleótido", como se denomina en este documento, significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN monocatenarias y bicatenarias.

El término "oligonucleótido" al que se hace referencia en este documento incluye nucleótidos de origen natural y modificados unidos entre sí mediante enlaces oligonucleotídicos de origen natural y de origen no natural. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos con 200 bases o menos de longitud. Preferiblemente, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud y, más preferiblemente, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o de 20 a 40 bases de longitud. Habitualmente los oligonucleótidos son monocatenarios, por ejemplo, para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, por ejemplo, para el uso en la construcción de un mutante de un gen. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos con sentido o antisentido. La expresión "nucleótidos de origen natural" a la que se hace referencia en este documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. La expresión "nucleótidos modificados" a la que se hace referencia en este documento incluye nucleótidos con grupos de azúcares modificados o sustituidos y similares. La expresión "enlaces oligonucleotídicos" a la que se hace referencia en este documento incluye enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato y similares. Un oligonucleótido puede incluir un marcador para detección si se desea.

La expresión "homología de secuencia" a la que se hace referencia en este documento describe la proporción de emparejamientos de bases entre dos secuencias de ácido nucleico y la proporción de emparejamientos de aminoácidos entre dos secuencias de aminoácidos. Cuando la homología de secuencia se expresa como porcentaje, por ejemplo, el 50%, el porcentaje denota la proporción de emparejamientos a lo largo de la longitud de la secuencia de hPAK65 que se compara con alguna otra secuencia. Se permiten huecos (en cualquiera de las dos secuencias) para maximizar los emparejamientos; se usan habitualmente longitudes de huecos de 15 bases o menos, se prefieren de 6 bases o menos, prefiriéndose más de 2 bases o menos. Cuando se usan oligonucleótidos como sondas o tratamientos, generalmente la homología de secuencia entre el ácido nucleico diana y la secuencia oligonucleotídica no es inferior a 17 emparejamientos de bases diana de los 20 emparejamientos de pares de bases oligonucleotídicas posibles (85%); preferiblemente, no es inferior a 9 emparejamientos de los 10 emparejamientos de pares de bases posibles (90%) y, más preferiblemente, no es inferior a 19 emparejamientos de los 20 emparejamientos de pares de bases posibles (95%).

La expresión "hibridar selectivamente" a la que se hace referencia en este documento significa unirse específicamente y de forma detectable. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de la invención hibridan selectivamente con cadenas de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan las cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos inespecíficos. Pueden usarse condiciones de alta rigurosidad para conseguir condiciones de hibridación selectivas, como se sabe en la técnica y se analiza en este documento. Generalmente, la homología de secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de la invención y una secuencia de ácido nucleico de interés será de al menos el 80% y, más típicamente, preferiblemente con homologías crecientes de al menos el 85%, 90%, 95%, 99% y 100%.

Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, una homología del 85% significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para un emparejamiento máximo. Se permiten huecos (en cualquiera de las dos secuencias que se emparejan) para maximizar el emparejamiento; se prefieren longitudes de huecos de 5 o menos, prefiriéndose más de 2 o menos. Como alternativa, y preferiblemente, dos secuencias proteicas (o secuencias polipeptídicas procedentes de las mismas de al menos 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, como se usa este término en este documento, si tienen una puntuación de alineamiento de más de 5 (en unidades de desviación típica) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalización por huecos de 6 o superior. Véase Dayhoff, M. O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, 1972, volumen 5, National Biomedical Research Foundation, págs. 101-110 y Suplemento 2 a este volumen, págs. 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferiblemente homólogas si sus aminoácidos tienen una identidad superior a o igual al 50% cuando se alinean de forma óptima usando el programa ALIGN.

La expresión "se corresponde con" se usa en este documento para significar que una secuencia polinucleotídica es homóloga (es decir, es idéntica, no estrictamente relacionada evolutivamente) a toda o a una porción de una secuencia polinucleotídica de referencia, o que una secuencia polipeptídica es idéntica a una secuencia polipeptídica de referencia. Por el contrario, la expresión "complementaria a" se usa en este documento para significar que la secuencia complementaria es homóloga a toda o a una porción de una secuencia polinucleotídica de referencia. Como ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" se corresponde con una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia de mayor tamaño, por ejemplo, como un segmento de un ADNc o una secuencia génica dada de longitud completa en una lista de secuencias, tal como una SECUENCIA ID Nº: 1, o puede comprender un ADNc o una secuencia génica completa. Generalmente, una secuencia de referencia tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos, frecuentemente una longitud de al menos 25 nucleótidos y a menudo una longitud de al menos 50 nucleótidos. Puesto que dos polinucleótidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia polinucleotídica completa) que sea similar entre los dos polinucleótidos y (2) comprender además una secuencia que sea divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente por comparación de las secuencias de los dos polinucleótidos a lo largo de una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", como se usa en este documento, se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótidos contiguas en las que una secuencia polinucleotídica puede compararse con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos y en la que la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de la dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mediante el método de búsqueda por similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos) 85: 2444, mediante aplicaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homología a lo largo de la ventana de comparación) generado por los diversos métodos. La expresión "identidad de secuencia" significa que dos secuencias polinucleotídicas son idénticas (es decir, en base a nucleótido por nucleótido) a lo largo de la ventana de comparación. La expresión "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula por comparación de dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de la ventana de comparación, determinación del número de posiciones en las que aparecen las bases de ácido nucleico idénticas (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) en ambas secuencias para dar el número de posiciones emparejadas, división del número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicación del resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. La expresión "identidad sustancial", como se usa en este documento, denota una característica de una secuencia polinucleotídica en la que el polinucleótido comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 por ciento, preferiblemente una identidad de secuencia al menos del 90 al 95 por ciento, más habitualmente una identidad de secuencia de al menos el 99 por ciento en comparación con una secuencia de referencia a lo largo de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos, frecuentemente a lo largo de una ventana de al menos 25-50 nucleótidos, en la que el porcentaje de identidad de secuencia se calcula por comparación de la secuencia de referencia con la secuencia polinucleotídica que puede incluir deleciones o adiciones que supongan un total del 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia a lo largo de la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia de mayor tamaño, por ejemplo, como un segmento de la secuencia polinucleotídica de la PAK65 humana que se muestra en la Figura 2A.

Como se usan en este documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional (Immunology - A Synthesis, 2ª Edición, E. S. Golub y D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Massachussets (1991)). También pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos \alpha,\alpha-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato, \in-N,N,N-trimetillisina, \in-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, \omega-N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en este documento, la dirección a la izquierda es la dirección amino-terminal y la dirección a la derecha es la dirección carboxi-terminal de acuerdo con el uso y la convención normal. De forma similar, a menos que se especifique otra cosa, el extremo a la izquierda de secuencias polinucleotídicas de cadena sencilla es el extremo 5'; la dirección a la izquierda de secuencias polinucleotídicas de cadena doble se denomina la dirección 5'. La dirección de adición 5' a 3' de transcritos de ARN nacientes se denomina la dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están 5' con respecto al extremo 5' del transcrito de ARN se denominan "secuencias cadena arriba"; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma la secuencia que el ARN y que están 3' con respecto al extremo 3' del transcrito de ARN se denominan "secuencias cadena abajo".

Como se aplica a polipéptidos, la expresión "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están óptimamente alineadas, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando valores de huecos por defecto, comparten una identidad de secuencia de al menos el 80 por ciento, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 90 por ciento, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 95 por ciento y, más preferiblemente, una identidad de secuencia de al menos el 99 por ciento. Preferiblemente, las posiciones de restos que no son idénticos difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la posibilidad de intercambio de restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas son glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas hidroxílicas son serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida son asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas son fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas son lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución de aminoácidos conservativos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutámico-aspártico y asparagina-glutamina.

La expresión "fragmento polipeptídico", como se usa en este documento, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi terminal, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, a partir de una secuencia de ADNc de longitud completa (por ejemplo, la secuencia de ADNc que se muestra en la Figura 2A). Típicamente, los fragmentos son de al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud, preferiblemente de al menos 14 aminoácidos de longitud, más preferiblemente, de al menos 20 aminoácidos de longitud, habitualmente de al menos 50 aminoácidos de longitud y aún más preferiblemente de al menos 70 aminoácidos de longitud.

El término "análogo", como se usa en este documento, se refiere a polipéptidos que están compuestos por un segmento de al menos 25 aminoácidos, que tiene una identidad sustancial con una porción de la secuencia de aminoácidos deducida que se muestra en la Figura 2A y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a un polipéptido p21, preferiblemente racI o CDC42Hs, en condiciones de unión adecuadas, (2) capacidad para ejercer una actividad de proteína p21, preferiblemente una actividad de rac1 o CDC42Hs, cuando se expresa en una célula de mamífero, (3) actividad de serina proteína quinasa o (4) capacidad para modular la actividad de una proteína p21, preferiblemente la actividad GTPasa de racI o CDC42Hs. Típicamente, los polipéptidos análogos comprenden una sustitución de aminoácido conservativa (o adición o deleción) con respecto a la secuencia de origen natural. Típicamente, los análogos son de al menos 20 aminoácidos de longitud, preferiblemente de al menos 50 aminoácidos de longitud o más, siendo más habitualmente tan largos como la el polipéptido de hPAK65 de origen natural de longitud completa que se muestra en la Figura 2A. Algunos análogos del polipéptido hPAK65 que interaccionan con p21 pueden carecer de la actividad biológica y aun así pueden emplearse para diversos usos, tal como para generar anticuerpos contra epítopos del polipéptido PAK que interacciona con p21, como reactivo inmunológico para detectar y/o purificar anticuerpos de polipéptidos PAK que interaccionan con p21 mediante cromatografía de afinidad, o como un agonista, antagonista o agonista parcial competitivo o no competitivo de la función del polipéptido hPAK65 que interacciona con p21 nativo.

La expresión "modulación de PAK65 humana" se usa en este documento para referirse a la capacidad de potenciar o inhibir una propiedad funcional de la PAK65 humana (por ejemplo, actividad quinasa, unión a p21); dicho potenciamiento o inhibición puede depender de que se produzca un acontecimiento específico, tal como la activación de una ruta de transducción de señales, y/o puede manifestarse solamente en tipos celulares particulares.

El término "agente" se usa en este documento para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto preparado a partir de materiales biológicos tales como células o tejidos de bacterias, plantas, hongos o animales (particularmente mamíferos). Los agentes se evalúan por su actividad potencial como agentes moduladores de la PAK65 humana (por ejemplo, agentes antineoplásicos, agentes citotóxicos, inhibidores de la transformación neoplásica o de la proliferación celular, agentes promotores de la proliferación celular, oncogenicidad inducida por Ras y similares) mediante su inclusión en ensayos de exploración que se describen en este documento.

La expresión "agente candidato" se usa en este documento para referirse a un agente que se identifica mediante uno o más procedimientos de exploración de la invención como un supuesto agente modulador de la PAK65 humana. Algunos agentes moduladores candidatos tienen potencial terapéutico como fármacos para uso en seres humanos.

Como se usan en este documento, los términos "marcar" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, por incorporación de un aminoácido radiomarcado o unión a un polipéptido de restos biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o una actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos). Se conocen en la técnica y pueden usarse diversos métodos de marcaje de polipéptidos y glicoproteínas. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero sin limitación, los siguientes: radioisótopos (por ejemplo, ^{3}H, ^{14}C, ^{35}S, ^{125}I, ^{131}I), marcadores fluorescentes, (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano, \beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), agentes quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcadores de epítopos). En algunas realizaciones, los marcadores se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.

Como se usa en este documento, la expresión "sustancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) y, preferiblemente, una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto constituye al menos aproximadamente el 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferiblemente, más de aproximadamente el 85%, 90%, 95% y 99%. Más preferiblemente, la especie objeto está purificada hasta una homogeneidad esencial (no pueden detectarse especies contaminantes en la composición por métodos de detección convencionales), en la que la composición consiste esencialmente en una sola especie macromolecular.

La expresión "agente farmacéutico o fármaco", como se usa en este documento, se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente.

En este documento se usan otros términos químicos de acuerdo con el uso convencional en la técnica, como se ejemplifica por el McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (ed. Parker, S., 1985), McGraw-Hill, San Francisco).

La expresión "agente antineoplásico" se usa en este documento para referirse a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir el desarrollo o la progresión de una neoplasia en un ser humano, particularmente una lesión tumoral maligna (cancerosa), tal como un carcinoma, sarcoma, linfoma o leucemia. Frecuentemente la inhibición de la metástasis es una propiedad de agentes antineoplásicos.

Detección de ácido nucleico de hPAK65 usando polinucleótidos de hPAK65

Los polinucleótidos aislados de la invención pueden usarse como sondas para detectar, y si se desea clonar, la PAK65 en una muestra de un organismo. Típicamente, la muestra es de tejido. (Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning, segunda edición (1989) (denominado en este documento "Sambrook et al."). Pueden usarse polinucleótidos aislados con secuencias de ácido nucleico que codifican la PAK65 humana (por ejemplo, SEC ID Nº: 1) como sondas para detectar la presencia de secuencias de ácido nucleico diana con homología de secuencia. Las sondas polinucleotídicas se preparan y se marcan mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, Sambrook et al., especialmente el capítulo 10, el texto de las secciones sobre la preparación y el marcaje de ácidos nucleicos. Por ejemplo, puede usarse la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el ADN y puede usarse un sistema de marcaje con biotina-avidina para marcar y detectar el polinucleótido diana. Las sondas polinucleotídicas se hibridan con ácidos nucleicos diana a temperaturas de hibridación apropiadas (por ejemplo, véase Sambrook et al.; el texto del capítulo 9); y se lavan a alta y baja rigurosidad de lavado dependiendo del ensayo de detección.

Preferiblemente los polinucleótidos se usan como sondas en condiciones de lavado de alta rigurosidad y con las condiciones de hibridación correspondientes, como se sabe en la técnica. Pueden usarse polinucleótidos aislados para generar sondas que tengan 50 pares de bases de la longitud completa del ADNc de hPAK65. Preferiblemente, las sondas se generan a partir de polinucleótidos aislados de 100-400 nucleótidos de longitud. Dichas condiciones pueden usarse para detectar alelos del gen de hPAK65 en seres humanos.

Como alternativa, los oligonucleótidos pueden emplearse como sondas. Se conocen bien en la técnica procedimientos para usar oligonucleótidos como sondas para detectar las mismas o secuencias de ácido nucleico relacionadas, véase, por ejemplo, Sambrook et al, especialmente el Capítulo 11. Pueden generarse sondas a partir de oligonucleótidos que tengan de 10 a 200 bases de longitud. Preferiblemente, se generan sondas a partir de oligonucleótidos de 10 a 60 nucleótidos de longitud y, más preferiblemente, de 12 a 40 bases de longitud. Para disminuir el número de falsos positivos, preferiblemente se usan dos sondas para identificar los clones que se unan a ambas sondas en condiciones de hibridación y lavado. Los oligonucleótidos pueden sintetizarse en un sintetizador de oligonucleótidos de Applied BioSystems de acuerdo con las especificaciones suministradas por el fabricante.

Un procedimiento para la amplificación de ácidos nucleicos diana, para el análisis posterior mediante ensayos de hibridación, se conoce como la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") o técnica de PCR. La técnica de PCR puede aplicarse para detectar secuencias de la invención en muestras dudosas usando cebadores oligonucleotídicos separados entre sí y basados en la secuencia genética que se expone en este documento. Los cebadores son complementarios a cadenas opuestas de una molécula de ADN bicatenario y, típicamente, están separados por aproximadamente 50 a 450 nucleótidos o más (habitualmente no más de 2000 nucleótidos). Este procedimiento supone preparar los cebadores oligonucleotídicos específicos, seguido de ciclos repetidos de desnaturalización del ADN diana, unión de cebadores y extensión con una ADN polimerasa para obtener fragmentos de ADN de la longitud esperada en base al espaciamiento de los cebadores. Los productos de extensión generados a partir de un cebador sirven como secuencias diana adicionales para el otro cebador. El grado de amplificación de una secuencia diana se controla por el número de ciclos que se realizan y se calcula teóricamente mediante la fórmula simple 2n, en la que n es el número de ciclos. Dado que la eficacia media por ciclo varía de aproximadamente el 65% al 85%, 25 ciclos producen de 0,3 a 4,8 millones de copias de la secuencia diana. El procedimiento de PCR se describe en varias publicaciones, incluyendo Saiki et al., Science (1985) 230: 1350-1354; Saiki et al., Nature (1986) 324: 163-166; y Scharf et al., Science (1986) 233: 1076-1078. Véanse también las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.194; 4.683.195 y 4.683.202. Se describen procedimientos adicionales para amplificación por PCR en: PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification ed. HA Erlich, Freeman Press, Nueva York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds. Innis, Gelfland, Snisky y White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4967; Eckert, K. A. y Kunkel, T. A. (1991) PCR Methods and Applications 1: 17 y; PCR, eds. McPherson, Quirkes y Taylor, IRL Press, Oxford.

Se conocen en la técnica vectores adecuados para la replicación en células de mamífero y pueden incluir replicones virales o secuencias que aseguran la integración de la secuencia que codifica la PAK65 en el genoma del hospedador. Los vectores adecuados pueden incluir, por ejemplo, los derivados del virus de los simios SV40, retrovirus, virus del papiloma bovino, virus vaccinia y adenovirus.

Un vector adecuado, por ejemplo, es uno derivado de virus vaccinia. En este caso, el ADN heterólogo se inserta en el genoma de vaccinia. Se conocen en la técnica procedimientos para la inserción de un ADN extraño en el genoma de virus vaccinia y utilizan, por ejemplo, la recombinación homóloga. Generalmente, la inserción del ADN heterólogo es en un gen que no es esencial en la naturaleza, por ejemplo, el gen de la timidina quinasa (tk), que también proporciona un marcador de selección. Se han descrito vectores lanzadera plasmídicos que facilitan enormemente la construcción de virus recombinantes (véanse, por ejemplo, Mackett et al. (1984); Chakrabarti et al. (1985); Moss (1987)). Después, la expresión del polipéptido heterólogo se produce en células o individuos que se inmunizan con el virus vaccinia vivo recombinante.

Dichos vectores de expresión en mamíferos adecuados contienen habitualmente una o más unidades de transcripción eucariotas que son capaces de facilitar la expresión en células de mamífero. La unidad de transcripción está compuesta por al menos un elemento promotor para mediar la transcripción de secuencias de ADN extrañas. Se conocen en la técnica promotores adecuados para células de mamífero e incluyen promotores virales tales como el del virus de los simios 40 (SV40), citomegalovirus (CMV), virus del sarcoma de Rous (RSV), adenovirus (ADV) y virus del papiloma bovino (BPV).

La presencia opcional de un elemento potenciador (potenciador), combinado con los elementos promotores descritos en este documento, aumentará típicamente los niveles de expresión. Un potenciador es cualquier secuencia de ADN reguladora que puede estimular la transcripción hasta 1000 veces cuando está unido a promotores endógenos o heterólogos, comenzando la síntesis en el sitio normal de inicio del ARNm. Los potenciadores también son activos cuando están situados cadena arriba o cadena abajo del sitio de inicio de la transcripción, en una orientación normal o invertida, o a una distancia de más de 1000 nucleótidos del promotor (Maniatis et al. (1987) Science 236: 1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2ª ed.). Los elementos potenciadores derivados de virus pueden ser particularmente útiles, debido a que típicamente tienen un intervalo más amplio de hospedador. Los ejemplos útiles en células de mamífero incluyen el potenciador del gen temprano de SV40 (Dijkema et al (1985) EMBO J. 4: 761) y el potenciador/promotores derivados de la repetición terminal larga (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous (Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777) y del citomegalovirus humano (Boshart et al. (1985) Cell 41: 521). Además, algunos potenciadores son regulables y se vuelven activos solamente en presencia de un inductor, tal como una hormona o ión metálico (Sassone-Corsi y Borelli (1986) Trends Genet. 2: 215; Maniatis et al. (1987) Science 236: 1237).

Además, la unidad de transcripción también puede comprender una secuencia de terminación y secuencias de adición de poli(A) que estén unidas operativamente a la secuencia codificante de PAK65. La unidad de transcripción también puede estar compuesta por una secuencia potenciadora que aumente la expresión de PAK65.

También pueden ser deseables secuencias que causen la amplificación del gen, como son las secuencias que codifican marcadores de selección. Se conocen en la técnica marcadores de selección para células de mamífero e incluyen, por ejemplo, timidina quinasa, dihidrofolato reductasa (junto con metotrexato como amplificador de la DHFR), aminoglicósido fosfotransferasa, higromicina B fosfotransferasa, asparagina sintetasa, adenosina desaminasa, metalotioneína y genes de resistencia a antibióticos tales como neomicina.

El vector que codifica PAK65 puede usarse para la transformación de una célula hospedadora de mamífero adecuada. La transformación puede ser por cualquier procedimiento conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedadora incluyendo, por ejemplo, empaquetado del polinucleótido en un virus y transducción de una célula hospedadora con el virus, o por procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifican por las Patentes de Estados Unidos 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455. El procedimiento de transformación usado depende del hospedador que se transforme. Se conocen en la técnica procedimientos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero e incluyen la transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del polinucleótido o polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN en núcleos.

Se conocen en la técnica línea celulares de mamíferos disponibles como hospedadores para la expresión e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) incluyendo, pero sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y varias otras líneas celulares. Como se analiza a continuación, son líneas celulares de una preferencia particular las que expresan construcciones de hPAK65 recombinante que tienen actividad serina quinasa constitutiva y que, más preferiblemente, desarrollan posteriormente características de una célula transformada.

En el caso de la expresión en células de insecto, generalmente los componentes del sistema de expresión incluyen un vector de transferencia, habitualmente un plásmido bacteriano, que contiene tanto un fragmento del genoma del baculovirus como un sitio de restricción conveniente para la inserción del gen o genes heterólogos que se van a expresar; un baculovirus de tipo silvestre con una secuencia homóloga al fragmento específico de baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homóloga del gen heterólogo en el genoma del baculovirus); y células hospedadoras de insecto apropiadas y medios de cultivo. Un vector preferido es pAcC13 (Rubinfeld, B. (1991) Cell 65: 1033-1042). Un plásmido de expresión preferido es pAcPAK780, que contiene una construcción de fusión de epítopo Myc:hPAK65. Una línea celular de insecto preferida es Sf9. La secuencia de nucleótidos de la región codificante de la región de unión del epítopo Myc:hPAK65 de pAcPAK780 es ATG GAG CAG AAG CTG ATC TCC GAG GAG GAC CTG ATG GAG GAA, que continúa hasta el extremo de la secuencia codificante de hPAK65 en la Figura 2A.

Uno de los vectores de transferencia usados más comúnmente para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373. También se han diseñado muchos otros vectores conocidos por los expertos en la materia. Estos incluyen, por ejemplo, pVL985 (que modifica el codón de inicio de la polihedrina de ATG a ATT, y que introduce un sitio de clonación BamHI 32 pares de bases cadena abajo del ATT; véase Luckow y Summers, Virology (1989) 17: 31.

Habitualmente el plásmido también contiene la señal de poliadenilación de polihedrina (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42: 177) y un gen de resistencia a ampicilina procariota (amp) y un origen de replicación para la selección y propagación en E. coli.

Los vectores de transferencia de baculovirus contienen habitualmente un promotor de baculovirus. Un promotor de baculovirus es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción cadena abajo (5' a 3') de una secuencia codificante (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que habitualmente está situada proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de inicio de la transcripción incluye típicamente un sitio de unión a ARN polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un vector de transferencia de baculovirus también puede tener un segundo dominio denominado potenciador que, si está presente, habitualmente se encuentra distal al gen estructural. La expresión puede ser regulada o constitutiva.

Además, el polinucleótido PAK65 o un fragmento del mismo puede expresarse en un sistema bacteriano. En el mismo, un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción cadena abajo (3'') de una secuencia codificante (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que habitualmente está situada proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. La región de inicio de la transcripción incluye típicamente un sitio de unión de ARN polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor bacteriano también puede tener un segundo dominio denominado operador, que puede solapar con un sitio de unión a ARN polimerasa adyacente en el que comienza la síntesis de ARN. El operador permite una transcripción regulada (inducible) negativa, ya que una proteína represora de un gen puede unirse al operador y de este modo inhibir la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede producirse en ausencia de elementos reguladores negativos, tales como el operador. Además, puede conseguirse una regulación positiva mediante una secuencia de unión a una proteína activadora de un gen que, si está presente, habitualmente está proximal (5') a la secuencia de unión a ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora de un gen es la proteína activadora de catabolitos (CAP), que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) (Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18: 173]. Por lo tanto, la expresión regulada puede ser positiva o negativa, aumentando o reduciendo de este modo la transcripción.

Las secuencias que codifican enzimas de rutas metabólicas proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas del metabolismo de azúcares, tales como galactosa, lactosa (lac) (Chang et al. (1977) Nature 198: 1056) y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) (Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8: 4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9: 731; Patente de Estados Unidos Nº 4.738.921; EPO Pub. Nº 36.776 y 121.775). El sistema promotor de \beta-lactamasa (bla) (Weissmann (1981). En Interferon 3 (ed. l. Gresser)) y los sistemas promotores PL (Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128) y T5 (Patente de Estados Unidos Nº 4.689.406) del bacteriófago lambda también proporcionan secuencias promotoras útiles.

Además, también funcionan como promotores bacterianos promotores sintéticos que no aparecen en la naturaleza. Por ejemplo, secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o de bacteriófago pueden unirse con las secuencias del operón de otro promotor bacteriano o de bacteriófago, generando un promotor híbrido sintético (Patente de Estados Unidos Nº 4.551.433). Por ejemplo, el promotor tac es un promotor híbrido trp-lac compuesto por las secuencias tanto del promotor trp como del operón lac, que está regulado por el represor lac (Amann et al. (1983) Gene 25: 167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21). Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores de origen natural de origen no bacteriano que tengan la capacidad de unirse a una ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor de origen natural de origen no bacteriano también puede acoplarse con una ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema de ARN polimerasa/promotor de bacteriófago T7 es un ejemplo de un sistema promotor acoplado (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Tabor et al. (1985) Proc Natl. Acad. Sci. 82: 1074). Además, un promotor híbrido también puede estar compuesto por un promotor de bacteriófago y una región de operador de E. coli (EPO Pub. Nº 267.851).

Además, de una secuencia promotor de funcionamiento, un sitio de unión al ribosoma eficaz también es útil para la expresión del gen de PAK65 o un fragmento del mismo en procariotas. En E. coli, el sitio de unión a ribosoma se denomina la secuencia de Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud localizada 3-11 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio (Shine et al. (1975) Nature 254: 34). Se piensa que la secuencia de SD promueve la unión de ARNm al ribosoma mediante los emparejamientos de bases entre la secuencia de SD y el extremo 3' del ARNr 16S de E. coli (Steitz et al. (1979). En Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger)). Para expresar genes eucariotas y genes procariotas con un sitio de unión al ribosoma débil (Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli." En Molecular Cloning: A Laboratory Manual).

La PAK65 puede expresarse intracelularmente. Una secuencia promotora puede estar directamente unida con el gen de PAK65 o un fragmento del mismo, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N-terminal será siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N-terminal puede escindirse de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno o mediante incubación in vivo o in vitro con una peptidasa de metionina N-terminal bacteriana (EPO Pub. Nº 219.237).

Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa a la expresión directa. Típicamente, una secuencia de ADN que codifica la porción N-terminal de una proteína bacteriana endógena u otra proteína estable se fusiona en el extremo 5' de las secuencias codificantes de PAK65 heterólogas. Tras la expresión, esta construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen celular del bacteriófago lambda puede unirse en el extremo terminal 5' del gen de PAK65 o un fragmento del mismo y expresarse en bacterias. Preferiblemente, la proteína de fusión resultante conserva un sitio para que una enzima de procesamiento (factor Xa) escinda la proteína del bacteriófago del gen de PAK65 o fragmento del mismo (Nagai et al. (1984) Nature 309: 810). También pueden generarse proteínas de fusión con secuencias de los genes lacZ (Jia et al. (1987) Gene 60: 197), trpE (Allen et al. (1987) J. Biotechnol. 5: 93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Microbiol. 135: 11) y Chey (EPO Pub. Nº 324.647). La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede o no codificar un sitio de escisión. Otro ejemplo es una proteína de fusión de ubiquitina. Dicha proteína de fusión se genera con la región de ubiquitina que preferiblemente conserva un sitio para que una enzima de procesamiento (por ejemplo, proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) escinda la ubiquitina del polipéptido PAK65. Mediante este procedimiento, pueden aislarse polipéptidos PAK65 maduros (Miller et al. (1989) Bio/Technology 7: 698). Una fusión obtenida de forma recombinante preferida contiene un epítopo Myc (con una metionina añadida: MEQKLlSEEDL) fusionado en el extremo N-terminal de un polipéptido o fragmento de PAK. Un anticuerpo específico para este epítopo Myc permite el aislamiento y/o la identificación (como en un ensayo) de la proteína de fusión. Una realización de este tipo es la construcción que se encuentra en el vector de expresión de hPAK65 pAcPAK780. Otro sistema preferido es una fusión con glutatión-S-transferasa ("GST"; disponible en Pharmacia) en el extremo C-terminal de hPAK65 o su fragmento. La proteína de fusión recombinante se aísla fácilmente por su capacidad para unirse a glutatión unido a un soporte sólido, seguido de elución de la fusión con glutatión. Una realización más preferida de este tipo se encuentra en el plásmido pGSTPAKette, que codifica la proteína de fusión recombinante denominada GST-PAKette, que contiene GST fusionada a un fragmento proteico de hPAK65 de los aminoácidos 49 a 113, y que conserva la capacidad para unirse específicamente a rac1 o CDC42Hs. Este dominio de hPAK65 contiene el dominio de unión a rac1. La secuencia de aminoácidos de GST-PAKette se proporciona en la Figura 10.

Como alternativa, los polipéptidos de hPAK65 también pueden secretarse a partir de la célula por generación de moléculas de ADN quiméricas que codifiquen una proteína de fusión compuesta por un fragmento de secuencia de un péptido señal que proporcione la secreción de los polipéptidos de hPAK65 en bacterias (Patente de Estados Unidos Nº 4.336.336). El fragmento de secuencia señal codifica típicamente un péptido señal compuesto por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula. La proteína se secreta hacia el medio de cultivo (bacterias gram-positivas) o hacia el espacio periplásmico, localizado entre la membrana interna y externa de la célula (bacterias gram-negativas). Preferiblemente, existen sitios de procesamiento, que pueden escindirse in vivo o in vitro, codificados entre el fragmento de péptido señal y el polipéptido hPAK65.

Puede obtenerse ADN que codifica secuencias señal adecuadas a partir de genes para proteínas bacterianas secretadas, tales como el gen de la proteína de la membrana de la membrana externa de E. coli (ompA) (Masui et al. (1983), en: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3: 2437) y la secuencia señal de la fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) (Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7212). Como ejemplo adicional, la secuencia señal del gen de la alfa-amilasa de diversas cepas de Bacillus puede usarse para secretar proteínas heterólogas de B. subtilis (Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPO Pub. Nº 244.042).

Típicamente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por bacterias son regiones reguladoras localizadas 3' al codón de terminación de la traducción y, por lo tanto, junto con el promotor franquean la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que puede traducirse en el polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen frecuentemente secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras de tallos y bucles que ayudan a la terminación de la transcripción. Los ejemplos incluyen secuencias de terminación de la transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp de E. coli, así como otros genes biosintéticos.

Típicamente, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, una secuencia señal (si se desea), una secuencia codificante de interés y una secuencia de terminación de la transcripción se combinan en construcciones de expresión. Con frecuencia las construcciones de expresión se mantienen en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos), capaz del mantenimiento estable en un hospedador, tal como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo de este modo que se mantenga en un hospedador procariota para la expresión o para la clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido de alto o bajo número de copias. Un plásmido de alto número de copias tendrá generalmente un número de copias que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 y, típicamente, de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un hospedador que contiene un plásmido de alto número de copias contendrá preferiblemente al menos aproximadamente 10 y, más preferiblemente, al menos aproximadamente 20 plásmidos. Puede seleccionarse un vector de alto o bajo número de copias dependiendo del efecto del vector y del polipéptido hPAK65 en el hospedador.

Como alternativa, las construcciones de expresión pueden integrarse en el genoma bacteriano con un vector de integración. Los vectores de integración contienen típicamente al menos una secuencia homóloga al cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen ser el resultado de recombinaciones entre el ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos con ADN de diversas cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (EPO Pub. Nº 127.328). Los vectores de integración también pueden estar compuestos por secuencias de bacteriófagos o transposones.

Típicamente, las construcciones de expresión extracromosómicas y de integración pueden contener marcadores de selección para permitir la selección de cepas bacterianas que se hayan transformado. Los marcadores de selección pueden expresarse en el hospedador bacteriano y pueden incluir genes que hacen a las bacterias resistentes a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina) y tetraciclina (Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 469). Los marcadores de selección también pueden incluir genes biosintéticos, tales como los de las rutas biosintéticas de histidina, triptófano y leucina.

Como alternativa, algunos de los componentes descritos anteriormente pueden combinarse en vectores de transformación. Típicamente, los vectores de transformación están compuestos por un marcador de selección que se mantiene en un replicón o desarrollado como un vector de integración, como se han descrito anteriormente.

Se han desarrollado vectores de expresión y transformación, ya sean replicones extracromosómicos o vectores de integración, para la transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para, entre otras, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis (Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPO Pub. Nº. 36.259 y 63.953; PCT WO 84/04541), Escherichia coli (Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128; Amann et al. (1985) Gene 40: 183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; EPO Pub. Nº 36.776, 136.829 y 136.907; Solicitud de Patente del Reino Unido de Nº de Serie 8418273), Streptococcus cremoris (Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655) Streptococcus lividans (Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655), Streptomyces lividans (Patente de Estados Unidos Nº 4.745.056).

Se conocen bien en la técnica procedimientos de introducción de ADN exógeno en hospedadores bacterianos y, típicamente, incluyen la transformación de bacterias tratadas con CaCl_{2} u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. También puede introducirse ADN en células bacterianas por electroporación. Los procedimientos de transformación varían habitualmente con la especie bacteriana a transformar. Véanse, por ejemplo (Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60: 273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPO Pub. Nº 36.259 y 63.953; P.C.T. WO 84/04541, Bacillus), (Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 949, Campylobacter), (Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEI-derived plasmids". En Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H. W. Boyer y S. Nicosia); Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol. 53: 159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949: 318; Escherichia), (Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44: 173 Lactobacillus); (Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 170: 38, Pseudomonas); (Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66: 203, Staphylococcus), (Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144: 698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation", en: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti y R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infec. Immun. 32: 1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1: 412, Streptococcus).

Como se analiza en este documento, se contemplan variaciones minoritarias en la secuencia de aminoácidos de la proteína hPAK65 como incluidas en el término hPAK65, con tal de que las variaciones minoritarias en la secuencia de aminoácidos conserven al menos una homología del 95%, más preferiblemente de al menos el 99% y hasta una diferencia de al menos un aminoácido con la secuencia codificante de la proteína PAK65 humana que se presenta en la Figura 2A. Es probable que dichas variaciones minoritarias aparezcan entre variantes alélicas de hPAK65. En particular, se contemplan reemplazos de aminoácidos conservativos. Los reemplazos conservativos son los que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados por sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en familias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Las familias más preferidas son: serina y treonina son la familia alifática hidroxílica; asparagina y glutamina son una familia que contiene amida; alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptófano y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto importante sobre las propiedades de unión o quinasa de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no implica un aminoácido en un sitio de unión a p21 o un sitio activo quinasa. Puede determinarse fácilmente si un cambio de aminoácido da como resultado un péptido funcional mediante el ensayo de la actividad específica del derivado del polipéptido. Se describen ensayos en detalle en este documento.

Pueden prepararse fragmentos o análogos de hPAK65 por los expertos en la materia. Los extremos amino y carboxi-terminales preferidos de fragmentos o análogos aparecen cerca de los límites de los dominios funcionales. Por ejemplo, dichos dominios funcionales incluyen dominios que confieren la propiedad de la unión para formar un complejo de hPAK65-proteína p21, un dominio de proteína quinasa, un dominio de autofosforilación y dominios que confieren la propiedad de modular rutas de transducción de señales relacionadas con hPAK65 de células. Pueden identificarse dominios estructurales y funcionales por comparación de los datos de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con bases de datos de secuencias públicas o patentadas. Preferiblemente, se usan métodos de comparación informatizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación proteica predichos que aparecen en otras proteínas de estructura y/o función conocida, tales como el dominio quinasa que se proporciona en la sección de Ejemplos. Se conocen procedimientos para identificar secuencias proteicas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida (Bowie et al. (1991) Science 253: 164). Por lo tanto, los ejemplos siguientes demuestran que los expertos en la materia pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales en una secuencia de hPAK65.

Pueden fusionarse fragmentos o análogos que comprenden sustancialmente uno o más dominios funcionales con secuencias polipeptídicas heterólogas, en las que la proteína de fusión resultante presenta las propiedades funcionales conferidas por el fragmento de hPAK65. Por ejemplo, la proteína de fusión GST-PAKette (que contiene los aminoácidos 49 a 113) conserva la capacidad para unirse específicamente a racl y CDC42Hs. Como alternativa, los polipéptidos en los que se ha delecionado uno o más dominios funcionales presentarán una pérdida de la propiedad conferida normalmente por el fragmento ausente. Por ejemplo, una proteína de truncamiento N-terminal de hPAK65 que contiene los nucleótidos 1065-2248 no conservó la actividad serina quinasa.

Aunque una clase de realizaciones preferidas son fragmentos que tienen extremos amino y/o carboxi-terminales que se corresponden con posiciones de aminoácidos próximas a los bordes de los dominios funcionales, pueden prepararse fragmentos alternativos. La elección de los extremos amino y carboxi-terminales de dichos fragmentos es a discreción del experto y se realizará en base a consideraciones experimentales tales como facilidad de construcción, estabilidad a la proteolisis, estabilidad térmica, reactividad inmunológica, modificación de restos amino o carboxilo-terminales u otras consideraciones.

Además de fragmentos, pueden generarse análogos de hPAK65. Dichos análogos pueden incluir una o más deleciones o adiciones de la secuencia de aminoácidos, ya sea en el extremo amino o carboxi-terminal o internamente, o ambas; los análogos pueden incluir adicionalmente transposiciones de secuencias. Los análogos también pueden comprender sustituciones de aminoácidos, preferiblemente sustituciones conservativas. Además, los análogos pueden incluir secuencias heterólogas unidas generalmente en el extremo amino o carboxi- terminal, donde la secuencia o secuencias heterólogas confieren una propiedad funcional al análogo resultante que no es intrínseca a una proteína hPAK65 nativa. Sin embargo, los análogos deben comprender un segmento de 25 aminoácidos que tenga una identidad sustancial con una porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa. Son sustituciones de aminoácidos preferidas las que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de hPAK65-proteína p21, (4) alteran la afinidad de unión para formar complejos de hPAK65 con sustratos proteicos para actividad serina quinasa y (4) confieren o modifican otras propiedades físico-químicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia de hPAK65 distinta de la secuencia peptídica de origen natural. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de un solo o de múltiples aminoácidos (preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural (preferiblemente en la porción del polipéptido fuera del dominio o dominios que forman contactos intermoleculares.

Una sustitución de aminoácido conservativa no debería modificar sustancialmente las características estructurales de la secuencia precursora (por ejemplo, un reemplazo de aminoácido no debería tender a romper una hélice que aparece en la secuencia precursora ni alterar otros tipos de estructura secundaria que caractericen la secuencia precursora). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles, (1984) Creighton (ed.), W. H. Freeman and Company, Nueva York; Introduction to Protein Structure, (1991), C. Branden y J. Tooze, Garland Publishing, Nueva York, NY; y Thornton et al. (1991) Nature 354: 105.

Puede ser ventajoso emplear un análogo peptídico de hPAK65, o una porción del mismo, como un agente farmacéutico o como un reactivo de investigación comercial. Por ejemplo, un análogo peptídico de hPAK65 que tiene una alta afinidad por la unión a una proteína p21 puede usarse como un inhibidor competitivo de la formación del complejo de hPAK65-proteína p21 por competición con la hPAK65 nativa por la unión a una proteína p21.

Además de polipéptidos que consisten solamente en aminoácidos de origen natural, también se proporcionan peptidomiméticos. Se usan comúnmente en la industria farmacéutica análogos peptídicos como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan "miméticos de péptidos" o "peptidomiméticos" (Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15: 29; Veber y Freidinger (1985) TINS p. 392; y Evans et al. (1987) J. Med. Chem 30: 1229) y habitualmente se desarrollan con la ayuda de modelado molecular informatizado. Los miméticos de péptidos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como la PAK65 humana, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}-CH_{2}-, -CH=CH- (cis y trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}- y -CH_{2}SO-, por procedimientos conocidos en la técnica y que se describen adicionalmente en las siguientes referencias: Spatola, A. F. en "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins", B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, Nueva York, pág. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (marzo 1983), Vol. 1, Cuestión 3, "Peptide Backbone Modifications" (revisión general); Morley, J. S., Trends Pharm Sci (1980) págs. 463-468 (revisión general); Hudson, D. et al., IntJ Pept Prot Res (1979) 14: 177-185 (-CH_{2}NH-, CH_{2}CH_{2}-); Spatola, A. F. et al., Life Sci (1986) 38: 1243-1249 (-CH_{2}-S); Hann, M. M., J Chem Soc Perkin Trans I (1982) 307-314 (-CH-CH-, cis y trans); Almquist, R. G. et al., J Med Chem (1980) 23: 1392-1398 (-COCH_{2}-); Jennings-White, C. et al., Tetrahedron Lett (1982) 23: 2533 (-COCH_{2}-); Szelke, M. et al., Solicitud europea EP 45665 (1982) CA: 97: 39405 (1982) (-CH(OH)CH_{2}-); Holladay, M. W. et al., Tetrahedron Lett (1983) 24: 4401-4404 (-C(OH)CH_{2}-); y Hruby, V. J., Life Sci (1982) 31: 189-199 (-CH_{2}-S-). Un enlace no peptídico particularmente preferido es -CH_{2}NH-. Dichos miméticos de péptidos pueden tener ventajas significativas sobre realizaciones de polipéptidos, incluyendo, por ejemplo: una producción más económica, mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas mejoradas (vida media, absorción, potencia, eficacia, etc.), una especificidad alterada (por ejemplo, un amplio espectro de actividades biológicas), una antigenicidad reducida y otras. Habitualmente el marcaje de peptidomiméticos implica la unión covalente de uno o más marcadores directamente o a través de un espaciador (por ejemplo, un grupo amida), en una posición o posiciones no interferentes sobre el peptidomimético que se predicen mediante los datos cuantitativos de estructura-actividad y/o modelado molecular. Generalmente dichas posiciones no interferentes son posiciones que no forman contactos directos con la macromolécula o macromoléculas (por ejemplo, no son puntos de contacto en complejos de hPAK65-p21) con las que se une el peptidomimético para producir el efecto terapéutico. La derivatización (por ejemplo, marcaje) de peptidomiméticos no debería interferir sustancialmente con la actividad biológica o farmacológica deseada del peptidomimético.

Puede usarse una sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) para generar péptidos más estables. Además, pueden generarse péptidos restringidos que comprenden una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica mediante procedimientos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch (1992) Ann. Rev. Biochem. 61: 387; por ejemplo, por adición de restos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

Se identifican secuencias de ADNc de PAK65 humana y pueden aislarse clones genómicos por exploración de una genoteca de clones genómicos humanos, tal como una genoteca genómica humana en cromosomas artificiales de levadura, cósmidos o bacteriófago \lambda (por ejemplo, \lambda Charon 35), con una sonda polinucleotídica que comprende una secuencia de aproximadamente al menos 30 nucleótidos contiguos (o su complementaria) de la secuencia de ADNc que se muestra en la Figura 2A. Típicamente, las condiciones de hibridación y lavado se realiza a alta rigurosidad de acuerdo con procedimientos de hibridación convencionales. Los clones positivos se aíslan y se secuencian. Como ilustración y no como limitación, un polinucleótido de longitud completa que se corresponde con la secuencia de la Figura 2A puede marcarse y usarse como una sonda de hibridación para aislar clones genómicos a partir de una genoteca de clones genómicos humanos en \lambdaEMBL4 o \lambdaGEM11 (Promega Corporation, Madison, Wisconsin); las condiciones de hibridación típicas para exploración por transferencia de placas (Benton y Davis (1978) Science 196: 180) pueden ser: formamida al 50%, SSC o SSPE 5x, solución de Denhardt 1-5x, SDS al 0,1-1%, 100-200 \mug de ADN o ARNt heterólogo roto, sulfato de dextrano al 0-10%, 1 x 10^{5} a 1 x 10^{7} cpm/ml de sonda desnaturalizada con una actividad específica de aproximadamente 1 x 10^{8} cpm/\mug e incubación a 42ºC durante aproximadamente 6-36 horas. Las condiciones de hibridación previa son esencialmente idénticas excepto por que no se incluye la sonda y el tiempo de incubación se reduce típicamente. Típicamente, las condiciones de lavado son de SSC 1-3x, SDS al 0,1-1%, 50-70ºC con cambio de la solución de lavado a aproximadamente 5-30 minutos. De esta forma pueden obtenerse secuencias humanas afines, incluyendo secuencias alélicas.

De forma análoga, pueden aislarse ADNc no humanos y clones genómicos (es decir, genes de PAK65 no humanos afines) a partir de diversas genotecas de ADNc y clones genómicos no humanos disponibles en la técnica (por ejemplo, Clontech, Palo Alto, CA) mediante el uso de sondas basadas en secuencias que se muestran en la Figura 2A, siendo típicamente las condiciones de hibridación y lavado menos rigurosas que para el aislamiento de clones humanos. Una realización más preferida es un gen de PAK65 de ratón.

Los polinucleótidos que comprenden secuencias de aproximadamente 30-50 nucleótidos, preferiblemente de al menos 100 nucleótidos, que se corresponden con o complementarias a la secuencia de nucleótidos que se muestra en la Figura 2A pueden servir como cebadores de PCR (de al menos 10 nucleótidos) y/o sondas de hibridación para identificar y aislar genes de líneas germinales estrechamente relacionados con hPAK65. Estos genes de líneas germinales pueden ser humanos o pueden ser de otra especie de mamífero, preferiblemente primates o ratones. Dichos genes de líneas germinales pueden aislarse por diversos procedimientos convencionales en la técnica incluyendo, pero sin limitación, mediante exploración por hibridación de genotecas genómicas en bacteriófago \lambda o genotecas en cósmidos, o mediante amplificación por PCR de secuencias genómicas usando cebadores derivados de las secuencias que se muestran en la Figura 2A. Las genotecas genómicas humanas están públicamente disponibles o pueden construirse de novo a partir de ADN humano.

Pueden usarse clones genómicos de PAK65, particularmente del gen de PAK65 afín murino, para construir construcciones de dirección homólogas para generar células y animales transgénicos no humanos que tengan al menos un alelo de PAK65 funcionalmente alterado, preferiblemente homocigotos para alelos de PAK65 cortados. Pueden encontrarse en la técnica directrices para la construcción de construcciones de dirección homólogas incluyendo: Rahemtulla et al. (1991) Nature 353: 180; Jasin et al. (1990) Genes Devel. 4: 157; Koh et al. (1992) Science 256: 1210; Molina et al. (1992) Nature 357: 161; Grusby et al. (1991) Science 253: 1417; Bradley et al. (1992) Bio/Technology 10: 534). Puede usarse la dirección homóloga para generar los denominados ratones "knock out" que son heterocigotos u homocigotos para un alelo de PAK65 inactivado. Dichos ratones pueden comercializarse como animales de investigación para el estudio de afecciones dependientes de PAK65, tales como integridad estructural celular, neoplasia, proliferación celular, transducción de señales, exploración de fármacos y otros usos.

Los ratones quiméricos dirigidos se obtienen de acuerdo con Hogan, et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) y Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D. C., (1987). Las células madre embrionarias se manipulan de acuerdo con procedimientos publicados (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D. C. (1987); Zjilstra et al. (1989) Nature 342: 435; y Schwartzberg et al. (1989) Science 246: 799).

Además, puede usarse una copia de ADNc de PAK65 o de un gen genómico para construir transgenes para expresar polipéptidos de PAK65 a altos niveles y/o bajo el control transcripcional de secuencias de control de la transcripción que no aparecen de forma natural adyacentes al gen de PAK65, como se ha analizado anteriormente. Por ejemplo, pero sin limitación, un promotor constitutivo (por ejemplo, un promotor HSV-tk o pgk) o una secuencia reguladora de la transcripción específica de linaje celular (por ejemplo, una albúmina, elastasa o un promotor/potenciador de un gen CD4 o CD8) puede unirse operativamente a una secuencia de polinucleótidos que codifique PAK65 para formar un transgén (típicamente en combinación con un marcador de selección tal como un casete de expresión de un gen neo). Dichos transgenes pueden introducirse en células (por ejemplo, células ES, células madre hematopoyéticas, hepatocitos primarios cultivados) y pueden obtenerse células transgénicas y animales transgénicos no humanos de acuerdo con procedimientos convencionales. Pueden usarse células transgénicas y/o animales transgénicos no humanos para explorar para agentes antineoplásicos y/o para explorar para agentes moduladores de la proliferación celular potenciales, ya que la sobreexpresión de PAK65 o la expresión inapropiada de PAK65 pueda dar como resultado un estado hiperproliferativo o un estado hipoproliferativo.

Los oligonucleótidos antisentido de la invención pueden sintetizarse por cualquiera de los procedimientos de síntesis química de oligonucleótidos conocidos. Dichos procedimientos se describen en general, por ejemplo, en Winnacker, From Genes to Clones: Introduction to Gene Technology. VCH Verlagsgesellschaft mbH (H., Ibelgaufts trans. 1987). Cualquiera de los procedimientos conocidos de síntesis de oligonucleótidos puede utilizarse en la preparación de los presentes oligonucleótidos antisentido. Los oligonucleótidos antisentido se preparan más ventajosamente por utilización de cualquiera de los sintetizadores de ácidos nucleicos automáticos disponibles en el mercado. El dispositivo utilizado para preparar los oligonucleótidos que se describen en este documento, el Applied Biosystems 380B DNA Synthesizer, utiliza química de \beta-cianoetil fosforamidita. Pueden prepararse oligonucleótidos antisentido que pueden hibridar con cualquier porción del transcrito de ARNm mediante los procedimientos de síntesis de oligonucleótidos conocidos por los expertos en la materia. Aunque puede utilizarse un oligonucleótido de cualquier longitud puede utilizarse en la práctica de la invención, secuencias más cortas que 12 bases pueden ser menos específicas en la hibridación con el ARNm de PAK65 diana y pueden destruirse más fácilmente por digestión enzimática. Por lo tanto, se prefieren oligonucleótidos que tengan 12 o más nucleótidos. Secuencias más largas que 18 a 21 nucleótidos pueden ser algo menos eficaces en la inhibición de la traducción de PAK65 debido a una captación disminuida por la célula diana. Por lo tanto, se prefieren más oligómeros de 12-21 nucleótidos en la práctica de la presente invención, particularmente oligómeros de 12-18 nucleótidos. Los oligonucleótidos complementarios a y que pueden hibridad con cualquier porción del transcrito de ARNm de PAK65 son, en principio, eficaces para inhibir la traducción del transcrito y capaces de inducir los efectos descritos en este documento. La traducción se inhibe más eficazmente por bloqueo del ARNm en un sitio en o próximo al codón de inicio. Por lo tanto, se prefieren los oligonucleótidos complementarios a la región terminal 5' del transcrito de ARNm de PAK65. La estructura secundaria terciaria que podría interferir con la hibridación es mínima en esta región. Además, las secuencias que están demasiado alejadas en la dirección 3' del sitio de inicio pueden ser menos eficaces en la hibridación con los transcritos de ARNm debido a un fenómeno de "ultralectura" por el que se postula que el ribosoma desenrolla el dúplex antisentido/sentido para permitir la traducción del mensaje (véase, por ejemplo, Shakin, J. Biochemistry 261, 16018 (1986)). Preferiblemente, el oligonucleótido antisentido está dirigido a un sitio en o próximo al codón de inicio ATG para la síntesis proteica. Se prefieren oligonucleótidos complementarios a una porción del ARNm de PAK65 que incluye el codón de inicio. Aunque se prefieren oligómeros antisentido complementarios a la región terminal 5' del transcrito de PAK65, particularmente la región que incluye el codón de inicio, debe apreciarse que los oligómeros antisentido útiles no se limitan a los complementarios a las secuencias que se encuentran en la porción traducida del transcrito de ARNm, sino que también incluyen oligómeros complementarios a secuencias de nucleótidos contenidas en, o que se prolongan hacia, las regiones 5' y 3' no traducidas. Los nucleótidos antisentido o construcciones de expresión antisentido pueden encontrar utilidad para explorar para agentes antineoplásicos y/o para explorar para agentes moduladores de la proliferación celular potenciales, ya que la expresión inapropiada de PAK65 puede dar como resultado un estado hiperproliferativo o un estado hipoproliferativo.

Como se ha determinado en este documento, existe una proteína humana, denominada hPAK65, que es una proteína de 65 kDa (determinada mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras; el peso molecular basado en la secuencia de aminoácidos deducida es de 56,5 kDa) que interacciona de una forma dependiente de GTP con rac1 y CDC42Hs pero no con rho A. El ARNm de PAK65 humana se expresa de forma ubicua en tejidos humanos. La hPAK65 recombinante presenta una especificidad idéntica a la p65 endógena; ambas pueden unirse a racI CDC42Hs de una forma dependiente de GTP. Las formas unidas a GTP de racl y CDC42Hs inducen la autofosforilación de hPAK65 en restos de serina solamente. La hPAK65 activada por rac1 o CDC42HS se fosforila en los mismos sitios. La inducción de la autofosforilación de hPAK65 por rac1 o CDC42Hs estimula la actividad quinasa de hPAK65 hacia proteínas, por ejemplo, proteína básica de mielina ("MBP") y, una vez que se activa hPAK65, rac1 o CDC42Hs ya no son necesarias para mantenerla activa. Las afinidades de rac1 y CDC42Hs por la hPAK65 fosforilada o no fosforilada eran similares. La PAK65 humana tenía un efecto marginal sobre la actividad GTPasa intrínseca de CDC42Hs y una inhibición mas significativa de la GAP p190 estimulaba la actividad GTPasa. Estos datos concuerdan con un modelo en el que la hPAK65 funciona como una molécula efectora para rac1 y CDC42Hs.

Por consiguiente, los ácidos nucleicos y polipéptidos de hPAK65 de la invención encuentran una utilidad particular proporcionando una nueva actividad proteína quinasa, en el efecto sobre o la modulación de rutas relacionadas con rac1 humana y CDC42Hs, en la identificación de rutas y afecciones patológicas relacionadas con hPAK65 y en la identificación de agentes que ejercen un efecto o modulan la actividad de hPAK65 y rutas relacionadas. Dichos agentes moduladores de la proteína p21 pueden proporcionar nuevos agentes quimioterápicos para el tratamiento de neoplasias, afecciones linfoproliferativas, artritis, angiogénesis, inflamación, enfermedades autoinmunes, apoptosis y similares.

Los presentes inventores han determinado que ciertas proteínas p21 se unen a hPAK65 para formar un complejo intermolecular de alta afinidad en condiciones fisiológicas y que estos complejos se detectan mediante numerosos ensayos que incluyen un "ensayo de superposición" modificado y ELISA. Los complejos de proteína p21-hPAK65 son dianas para agentes capaces de modular ciertas rutas dependientes de proteína p21 (preferiblemente rac1 y CDC42Hs) y dependientes de hPAK65 y, particularmente, son dianas para nuevos agentes antineoplásicos e inmunomoduladores quimioterápicos o quimiopreventivos. Por ejemplo, pueden desarrollarse agentes que alteren las interacciones de racl:hPAK65 en células neoplásicas y/o preneoplásicas como fármacos terapéuticos humanos potenciales. Pueden identificarse agentes antineoplásicos candidatos por su capacidad para inhibir la formación del complejo de rac1:hPAK65 in vitro y/o in vivo y/o inhibir la función proteína quinasa de hPAK65 in vitro y/o in vivo (por ejemplo, bloquear la capacidad de hPAK65 para fosforilar dianas celulares aguas abajo en una ruta dependiente de hPAK65). Por consiguiente, se proporcionan ahora por la invención procedimientos de identificación de agentes antioneoplásicos e inmunomoduladores.

Después, los agentes antineoplásicos candidatos se ensayan adicionalmente para determinar su actividad antineoplásica en ensayos que se usan de forma rutinaria para predecir la idoneidad para el uso como fármacos antineoplásicos humanos. Los ejemplos de estos ensayos incluyen, pero sin limitación: (1) capacidad del agente candidato para inhibir la capacidad de células transformadas independientes de anclaje para crecer en agar blando, (2) capacidad para reducir la oncogenicidad de células transformadas transplantadas en ratones nu/nu, (3) capacidad para revertir la transformación morfológica de células transformadas, (4) capacidad para reducir el crecimiento de tumores transplantados en ratones nu/nu, (5) capacidad para inhibir la formación de tumores o células preneoplásicas en modelos animales de carcinogénesis espontánea o inducida químicamente y (6) capacidad para inducir un fenotipo más diferenciado en células transformadas a las que se aplica el agente.

Puesto que hPAK65 es abundante en neutrófilos, los agentes que potencian o inhiben la actividad de hPAK65 pueden servir como agentes inmunomoduladores, por ejemplo, para atenuar una reacción inflamatoria, reacción de injerto contra huésped o afección autoinmune, enfermedades neurodegenerativas, neoplasias y similares.

Una categoría de ensayo en el que pueden identificarse agentes moduladores de hPAK65 (por ejemplo, agentes antineoplásicos candidatos) es un ensayo de inhibición de la unión, en el que los agentes se evalúan individualmente (o en combinaciones) para determinar su capacidad para inhibir la formación de un complejo de unión que comprende un polipéptido de proteína p21 (preferiblemente rac1 o CDC42Hs) unido a un polipéptido hPAK65 en condiciones de unión acuosas en las que la unión de proteína p21:hPAK65 se produce en ausencia del agente (véanse los Ejemplos). Pueden identificarse agentes moduladores de hPAK65 (por ejemplo, agentes antineoplásicos candidatos) por exploración para agentes que interfieran con la formación de o la actividad de complejos de proteína p21:hPAK65 funcionales. Los agentes que inhiben la unión de polipéptidos racI a polipéptidos hPAK65 se identifican como agentes moduladores de hPAK65 (por ejemplo, agentes antineoplásicos candidatos).

Los ensayos de exploración de la presente invención pueden utilizar formas aisladas o purificadas de los componentes de ensayo (polipéptidos hPAK65 y polipéptidos de proteína p21, preferiblemente rac1 y CDC42Hs). Esto se refiere a polipéptidos de la presente invención que se han separado de su entorno nativo (por ejemplo, una fracción citoplasmática o nuclear de una célula) o mediante producción recombinante, hasta una pureza de al menos aproximadamente el 10-50%. Una composición sustancialmente pura incluye dicho polipéptido o polipéptidos o complejos que se aproximan a la homogeneidad, es decir, aproximadamente el 80-90% puros, preferiblemente el 95-99% puros y, más preferiblemente, más del 99% puros. Las realizaciones preferidas incluyen ensayos de unión que usan rac1 o CDC42Hs en combinación con polipéptidos hPAK65 que se producen por procedimientos recombinantes o se sintetizan químicamente.

Las realizaciones preferidas adicionales comprenden análogos de proteína p21 o hPAK65 que tienen una estabilidad mayor como reactivos experimentales. Por ejemplo, los análogos preferidos pueden ser resistentes a la degradación por actividades proteolíticas presentes en la reacción o reacciones de unión y/o pueden ser resistentes a la inactivación oxidativa. Dichos análogos pueden incluir sustituciones de aminoácidos que eliminen sitios de escisión proteolítica y/o reemplacen restos responsables de la inactivación oxidativa (por ejemplo, metionina, cisteína). No obstante, los análogos deben ser funcionales en al menos el ensayo o ensayos de unión de control; por lo tanto, no se emplean para dichos ensayos análogos que comprenden sustituciones de aminoácidos que destruyen o degradan significativamente la utilidad funcional del análogo en el ensayo de unión. Un polipéptido de unión a proteína p21 hPAK65 preferido contiene los aminoácidos 49 a 113 de hPAK65, con una forma más preferida como proteína de fusión GST-PAKette. Un polipéptido preferido para ensayos de inhibición de quinasa es una hPAK65 constitutivamente activa. Los polipéptidos preferidos de ésta son truncamientos que carecen del dominio regulador que inhibe la actividad quinasa o son sustituciones de la serina 380, la serina 383 y/o la treonina 384 por ácido glutámico o aspártico. Los análogos de proteína p21 preferidos tienen un resto marcador de identificación unido, preferiblemente un marcador de epítopo peptídico reconocible por un anticuerpo. Son marcadores preferidos los marcadores de epítopo Myc y péptido Glu-Glu que se proporcionan en los Ejemplos. También se prefieren hPAK65 que tienen mutaciones C-terminales en las que los aminoácidos 489-491 (es decir, Ser-Ser-Leu) se reemplazan de forma no conservativa o se eliminan. Una realización de hPAK65 constitutivamente activa de este tipo tiene una deleción de los aminoácidos 482 a 506. Una realización preferida tiene tanto la rhPAK65 marcada con epítopo myc analizada anteriormente como la deleción
482-506.

Estos procedimientos de exploración pueden implicar el marcaje de una proteína p21 o de un polipéptido hPAK65 con cualquiera de una miríada de marcadores adecuados, incluyendo radiomarcadores (por ejemplo, ^{125}I o ^{32}P), diversos marcadores fluorescentes y enzimas (por ejemplo, glutatión-S-transferasa, luciferasa y \beta-galactosidasa). Si se desea para ensayos de unión básicos, el polipéptido diana puede inmovilizarse por técnicas convencionales. Por ejemplo, pero sin limitación, dicha inmovilización puede efectuarse por unión a soporte sólido, tal como una matriz cromatográfica, un pocillo de una placa de microtitulación, o por unión a una superficie cargada, tal como una membrana de Nylon 66.

Los ensayos de unión adoptan generalmente una o de dos formas: puede usarse un polipéptido o polipéptidos de hPAK65 inmovilizado para unirse a un polipéptido o polipéptidos de proteína p21 marcado o, por el contrario, puede usarse un polipéptido o polipéptidos de proteína p21 inmovilizado para unirse a polipéptidos de hPAK65 marcados. En cada caso, el polipéptido marcado se pone en contacto con el polipéptido inmovilizado en condiciones acuosas que permitan la unión específica del polipéptido o polipéptidos para formar un complejo en ausencia de agente añadido. Pueden seleccionarse condiciones acuosas particulares por el experto de acuerdo con procedimientos convencionales. Como una guía general, pueden usarse las condiciones acuosas tamponadas siguientes: NaCl 10-250 mM, Tris-HCl 5-50 mM, pH 5-8, con adición opcional de un catión o cationes divalentes y/o quelantes de metales y/o detergentes no iónicos y/o fracciones de membrana. Se aprecia por los expertos que pueden realizarse adiciones, deleciones, modificaciones (tales como del pH) y sustituciones (tales como la sustitución de NaCl por KCl o la sustitución del tampón) de estas condiciones básicas. Pueden realizarse modificaciones de las condiciones de la reacción de unión básicas siempre que la unión específica de un polipéptido o polipéptidos de proteína p21 a polipéptidos de hPAK65 se produzca en la reacción o reacciones de control. Las condiciones que no permitan la unión específica en las reacciones de control (sin agente incluido) no son adecuadas para el uso en ensayos de unión. Como se determina en este documento, la rho A humana ni se une a ni activa hPAK65.

Preferiblemente, al menos una especie polipeptídica está marcada con un marcador detectable. Los marcajes adecuados incluyen, pero sin limitación, radiomarcaje por incorporación de un aminoácido radiomarcado (por ejemplo, leucina marcada con ^{14}C, glicina marcada con ^{3}H, metionina marcada con ^{35}S), radiomarcaje mediante radioyodación post-traduccional con ^{125}I o ^{131}I (por ejemplo, reacción de Bolton-Hunter y cloramina T), marcaje mediante fosforilación post-traduccional con ^{32}P (por ejemplo, fosforilasa y fosfato inorgánico radiomarcado), marcaje fluorescente por incorporación de un marcador fluorescente (por ejemplo, fluoresceína o rodamina) o un marcaje por otros procedimientos convencionales conocidos en la técnica. En realizaciones en las que una de las especies polipeptídicas se inmoviliza por unión a un sustrato, el otro polipéptido se marca generalmente con un marcador detectable. Un formato preferido es un ensayo de ELISA, en el que un marcador preferido es un epítopo peptídico que se reconoce específicamente por un anticuerpo y que está unido a una de las proteínas, por ejemplo, por conjugación química o enzimática o, preferiblemente, por procedimientos de ADN recombinante que producen una proteína de fusión. El GTP\gammaS radiomarcado que se une a pero que no se hidroliza por GTPasas de proteína p21 también puede usarse para marcar un polipéptido de proteína p21 en un ensayo de unión de proteína p21-hPAK65.

Además, en algunas realizaciones puede usarse un polipéptido de proteína p21 o hPAK65 en combinación con una proteína accesoria (por ejemplo, una proteína que forma un complejo con el polipéptido, preferiblemente in vivo). Se prefiere que se usen diferentes marcadores para cada especie polipeptídica, de tal modo que pueda diferenciarse la unión de complejos individuales y/o heterodiméricos y/o multiméricos. Por ejemplo, un polipéptido CDC42Hs puede marcarse con fluoresceína y un polipéptido accesorio, por ejemplo, p190, puede marcarse con un marcador fluorescente que presente fluorescencia con una longitud de onda de excitación o una longitud de onda de emisión diferente, o ambas. Como alternativa, puede usarse un contador de centelleo de doble marcaje, en el que un polipéptido está marcado con isótopo (por ejemplo, ^{3}H) y una segunda especie polipeptídica está marcada con isótopo diferente (por ejemplo, ^{14}C) que puede diferenciarse por recuento de centelleo usando técnicas de discriminación.

El polipéptido o polipéptidos marcados se ponen en contacto con un polipéptido o polipéptidos inmovilizados en condiciones acuosas como se describe en este documento. El tiempo y la temperatura de incubación de una reacción de unión pueden variar, siempre que las condiciones seleccionadas permitan que se produzca la unión específica en una reacción de control en la que no esté presente el agente. Las realizaciones preferibles emplean una temperatura de reacción de aproximadamente al menos 15ºC, más preferiblemente de 35 a 42ºC, y un tiempo de incubación de aproximadamente al menos 15 segundos, aunque son preferibles periodos de incubación más prolongados de tal modo que, en algunas realizaciones, se alcanza un equilibrio de unión. La cinética de unión y la estabilidad termodinámica de complejos de proteína p21:hPAK65 unidos, preferiblemente de rac1:hPAK65 y CDC42Hs:hPAK65 o en los que hPAK65 se reemplaza por GST-PAKette, determinan la libertad disponible para variar el tiempo, la temperatura, la concentración de sal, el pH y otras condiciones de reacción. Sin embargo, para cualquier realización particular, pueden calibrarse fácilmente las condiciones de la reacción de unión deseadas por el experto usando procedimientos convencionales en la técnica, que pueden incluir análisis de unión usando el análisis de Scatchard, análisis de Hill y otros procedimientos (Proteins, Structures and Molecular Principles, (1984) Creighton (ed.), W. H. Freeman and Company, Nueva York).

La unión específica de polipéptido de proteína p21 o hPAK65 marcado (por ejemplo, marcado con péptido) a un polipéptido de hPAK65 o proteína p21 inmovilizado, respectivamente, se determina incluyendo una proteína o proteínas competidoras sin marcar (por ejemplo, albúmina). Después de que se complete una reacción de unión, se detecta el polipéptido o polipéptidos marcados que están unidos específicamente a polipéptido inmovilizado. Por ejemplo, después de un periodo de incubación adecuado para la unión, la fase acuosa que contiene la proteína no inmovilizada se elimina y el sustrato que contiene la especie polipeptídica inmovilizada y cualquier proteína marcada unida a la misma se lava con un tampón adecuado, que contiene opcionalmente un agente o agentes bloqueantes sin marcar, y se elimina el tampón o tampones de lavado. Después del lavado, se determina la cantidad de marcador detectable que continúa unido específicamente al polipéptido inmovilizado (por ejemplo, por procedimientos ópticos, enzimáticos, inmunológicos, autorradiográficos u otros radioquímicos, o combinaciones de los mismos). En un formato preferido, el marcador es un epítopo detectable por anticuerpo (marcador), en el que el anticuerpo anti-marcador puede detectarse después por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, por medición de la actividad enzimática de una fosfatasa alcalina conjugada con el anticuerpo.

En algunas realizaciones, se incluye la adición de agentes bloqueantes sin marcar que inhiben la unión inespecífica. Los ejemplos de dichos agentes bloqueantes incluyen, pero sin limitación, los siguientes: ADN de timo de ternera, ADN de esperma de salmón, ARN de levaduras, oligonucleótidos de secuencia mixta (secuencia aleatoria o pseudoaleatoria) de diversas longitudes, albúmina de suero bovino, detergentes no iónicos (NP-40, Tween, Triton X-100, etc.), proteínas de leche desnatada deshidratada, reactivo de Denhardt, polivinilpirrolidona, Ficoll y otros agentes bloqueantes. Los expertos pueden, a su juicio, seleccionar agentes bloqueantes en concentraciones adecuadas para incluirlos en ensayos de unión; sin embargo, las condiciones de reacción se seleccionan de tal modo que permitan la unión específica entre un polipéptido hPAK65 y un polipéptido de proteína p21 en una reacción de unión de control. Se incluyen agentes bloqueantes para inhibir la unión inespecífica de proteína marcada a proteína inmovilizada y/o para inhibir la unión inespecífica de polipéptido marcado al sustrato de inmovilización.

En realizaciones en las que se inmoviliza un polipéptido, puede usarse un enlace covalente o no covalente a un sustrato. La química de enlaces covalentes incluye, pero sin limitación, procedimientos bien caracterizados conocidos en la técnica (Kadonaga yTijan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83: 5889). Un ejemplo no limitante es la unión covalente a un sustrato derivatizado con bromuro de cianógeno (tal como Sepharose 4B derivatizada con CNBr). Puede ser deseable usar un espaciador para reducir el impedimento estérico potencial del sustrato. La unión no covalente de proteínas a un sustrato incluye, pero sin limitación, la unión de la proteína a una superficie cargada y la unión con anticuerpos específicos.

En una clase de realizaciones, se realizan reacciones de unión en paralelo en las que un conjunto de reacciones sirve como control y al menos otro conjunto de reacciones incluye diversas cantidades de agentes, mezclas de agentes o extractos biológicos, que se están ensayando para determinar la capacidad para inhibir la unión de un polipéptido de proteína p21 a un polipéptido de hPAK65. Por lo tanto, los agentes que inhiben la unión con respecto a la reacción o reacciones de control se identifican como agentes moduladores de hPAK65 y/o agentes antineoplásicos candidatos y/o agentes inmunomoduladores candidatos.

En una variación, se mide la actividad GTPasa y/o la actividad de unión a GDP o GTP de una proteína p21, preferiblemente rac1 o CDC42Hs, como el criterio de valoración del ensayo. La capacidad de un polipéptido de hPAK65 para modular una o más de estas actividades de nucleótidos de guanina de una proteína p21 sirve como base para el ensayo de exploración (véase el Ejemplo 1--ensayo de superposición modificado; véase el Ejemplo 12). Por lo tanto, los compuestos de ensayo que modulan la actividad de hPAK65 para modular las actividades de nucleótidos de guanina de una proteína p21 se identifican como moduladores de la proteína hPAK65 y moduladores de la proteína p21.

Puede usarse una levadura que comprende (1) un casete de expresión que codifica un dominio de unión a ADN de GAL4 (o dominio activador de GAL4) fusionado con un fragmento de unión de hPAK65 capaz de unirse a un polipéptido rac1, (2) un casete de expresión que codifica un dominio activador de ADN de GALA (o dominio de unión a GAL4, respectivamente) fusionado con un fragmento de unión de racl (o CDC42Hs) capaz de unirse a un polipéptido hPAK65 y (3) un gen indicador (por ejemplo, \beta-galactosidasa), que comprende un elemento de respuesta transcripcional GAL4 unido en cis, para la exploración de agentes en un ensayo de exploración de doble híbrido. Dicha levadura se incuba con un agente de ensayo y se determina la expresión del gen indicador (por ejemplo, \beta-galactosidasa); la capacidad del agente para inhibir la expresión del gen indicador en comparación con un cultivo de control identifica al agente como un agente modulador de hPAK65 o agente modulador de proteína p21 candidato.

Los polipéptidos de hPAK65 y racl o CDC42Hs, especialmente las porciones que forman contactos directos en un complejo, pueden usarse para el diseño farmacológico racional de agentes moduladores candidatos (por ejemplo, antineoplásicos e inmunomoduladores). Los complejos sustancialmente purificados y la identificación de racI o CDDC42Hs como un compañero de unión para hPAK65, como se proporciona en este documento, permiten la producción de complejos polipeptídicos sustancialmente puros y modelos computacionales que pueden usarse para cristalografía de rayos X de proteínas u otros procedimientos de análisis de la estructura, tales como el programa DOCK (Kuntz et al. (1982) J. Mol. Biol. 161: 269; Kuntz ID (1992) Science 257: 1078) y variantes del mismo. Pueden diseñarse racionalmente fármacos terapéuticos potenciales en base a la información estructural proporcionada de este modo. En una realización, dichos fármacos se diseñan para impedir la formación de un complejo proteico.

Por lo tanto, la presente invención puede usarse para diseñar fármacos, incluyendo fármacos con una capacidad para inhibir la unión de proteínas p21, preferiblemente rac1 o CDC42Hs, a hPAK65. Usando los procedimientos que se muestran en este documento se ensayan fácilmente otras proteínas p21 para determinar su capacidad para unirse a y activar hPAK65.

El diseño de compuestos que interaccionan preferentemente con un polipéptido hPAK65 o complejo de hPAK65:
proteína p21 puede desarrollarse usando análisis informático de estructuras tridimensionales. Puede determinarse un conjunto de coordinados moleculares usando: (1) datos cristalográficos, (2) datos obtenidos por otros procedimientos físicos, (3) datos generados por programas de predicción de estructura informatizados que funcionan sobre los datos de la secuencia de aminoácidos deducida o, preferiblemente, una combinación de estos datos. Son ejemplos de procedimientos físicos que pueden usarse para definir la estructura, por ejemplo, espectroscopía de correlación homonuclear bidimensional (COSY). Para los expertos en la materia de espectroscopía de RMN unidimensional, la COSY proporciona la clase de información disponible a partir de un experimento de desacoplamiento en una sola frecuencia (por ejemplo, cuyos espín están acoplados entre sí a nivel escalar). En una representación de COSY, el espectro 1D se sitúa a lo largo de la diagonal y los elementos fuera de la diagonal están en la intersección de los desplazamientos químicos de los grupos con acoplamiento J. La región de "identificación" contiene picos cruzados (^{1}H^{N}, ^{1}H^{\alpha}) de la estructura peptídica. El grado de resolución de la región de "identificación" del mapa de COSY obtenido en H_{2}O es un buen predictor del éxito de las asignaciones específicas de secuencia que se van a obtener sin recurrir al marcaje isotópico. El espectro (^{1}H RMN) del efecto Overhauser nuclear transferido (TRNOE) depende de espectros de NOE 2D diferentes y, en esencia, examina la conformación del ligando justo después de haberse disociado de la proteína. El uso de TRNOE asume, sin embargo, que los ligandos unidos y libres están en un intercambio rápido en la escala temporal de desplazamiento químico, que se traduce en una K_{D} de ligando superior a o igual a aproximadamente 1 x 10^{-4} M. Los procedimientos de TRNOE son útiles para comprobar y aumentar la información de distancias obtenida mediante otras estrategias.

No se pretende que la presente invención se limite al procedimiento particular usado para obtener información estructural. Además, no se pretende que la presente invención se limite a una búsqueda de un tipo cualquiera de fármaco; una o más de las moléculas pueden ser de origen natural o pueden ser sintéticas o pueden ser una forma modificada químicamente de una molécula de origen natural.

En algunas realizaciones, es deseable comparar la estructura de la proteína hPAK65 con la estructura de otras proteínas. Esto ayudará a la identificación de y a la selección de fármacos que afecten selectivamente a hPAK65 o que tengan un efecto de amplio espectro en más de una especie de polipéptido relacionado (por ejemplo, otras proteínas relacionadas con rac1). En una realización de la invención, se proporciona un ensayo para determinar la actividad proteína quinasa de hPAK65.

En otra realización de la invención, se proporciona un ensayo de inhibición de la quinasa hPAK65, pudiendo usarse dicho ensayo para explorar bibliotecas de fármacos o agentes por su capacidad para inhibir una actividad quinasa de hPAK65. En una realización de esta invención, se proporciona un procedimiento para identificar agentes que inhiben la actividad quinasa de hPAK65, comprendiendo dicho procedimiento administrar un agente a una mezcla de reacción que contiene hPAK65 sustancialmente purificada, preferiblemente hPAK65 activada, un sustrato sustancialmente purificado, por ejemplo MBP, y \gamma-^{33}P-ATP y después determinar el grado en el que el agente inhibe la fosforilación del sustrato en comparación con una reacción de control que carece del agente.

Por consiguiente, también se proporciona un kit de ensayo para identificar agentes que inhiban la actividad quinasa de hPAK65, conteniendo el kit un polipéptido sustancialmente purificado que contiene hPAK65 o, más preferiblemente, hPAK65 activada constitutivamente, o un fragmento de la misma con actividad constitutiva. La hPAK65 activada puede proporcionarse en numerosas formas, incluyendo como forma autofosforilada, como un análogo que tiene al menos una serina diana de autofosforilación reemplazada por un aminoácido que mimetiza la fosfoserina, por ejemplo Glu o Asp (Huang y Erikson (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 8960-8963) y como una forma truncada N-terminal en la que se deleciona el dominio regulador de hPAK65 responsable de inhibir la actividad serina quinasa. El kit de ensayo puede contener además un sustrato sustancialmente purificado, como una MBP, y puede contener además una solución acuosa tamponada y \gamma^{33}P-ATP. Son formas análogas de hPAK65 activadas constitutivamente sustituidas con serina preferidas aquellas en las que cualquiera o ambas serinas en la posición aminoacídica 381 ó 383 se reemplazan por ácido glutámico o aspártico. La treonina en la posición 384 puede reemplazarse opcionalmente por ácido glutámico o aspártico. También se prefiere la hPAK65 que tiene mutaciones C-terminales en las que los aminoácidos 489-491 (es decir, Ser-Ser-Leu) se modifican o eliminan. Una realización de este tipo tiene una deleción de los aminoácidos 482 a 506. Una realización preferida tiene tanto el marcador de epítopo myc analizado anteriormente como la deleción 482-506.

En una realización de la invención se proporciona un procedimiento para inhibir una quinasa hPAK65 que incluye las etapas de poner en contacto una composición que contiene una quinasa hPAK65 o un agente que tiene la capacidad de inhibir la actividad quinasa de hPAK65, como se determina en un ensayo de inhibición de quinasa hPAK65 descrito en este documento. Preferiblemente, la composición comprende un fluido corporal de un mamífero, más preferiblemente el fluido corporal es sangre o una fracción sanguínea. Preferiblemente, la PAK65 es una PAK65 humana. El procedimiento puede incluir además las etapas de medir la actividad quinasa de hPAK65 en dicho fluido corporal en presencia y ausencia de dicho inhibidor y relacionar dicha actividad quinasa con la concentración de la quinasa hPAK65 o del sustrato para la quinasa hPAK65 en dicha composición. El contacto puede producirse
in vivo.

Se describe en este documento una composición farmacéutica para el control de enfermedades dependientes de la quinasa PAK65 en mamíferos, que incluye un agente que tiene la capacidad de inhibir la actividad quinasa de PAK65, como se determina en un ensayo de actividad quinasa de PAK65, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Además, se describe un procedimiento de control de una enfermedad dependiente de la quinasa PAK65, que incluye las etapas de administrar a un mamífero que padece una enfermedad dependiente de la quinasa PAK65 una cantidad de control de una enfermedad dependiente de la quinasa PAK65 de un agente que tiene la capacidad de inhibir la actividad quinasa de PAK65, como se determina en un ensayo de actividad de inhibición de la quinasa PAK65.

También se proporciona un procedimiento para identificar compuestos que inhiban la actividad de unión a p21 de PAK65. El procedimiento incluye las etapas de administrar un compuesto junto con una proteína p21 sustancialmente purificada a una mezcla de reacción que comprende PAK65 sustancialmente purificada y determinar el grado en el que el agente inhibe la unión en comparación con una reacción de control que carece del compuesto.

En otra realización de la invención, se proporciona un procedimiento para inhibir una actividad de unión a p21 de hPAK65, que incluye las etapas de poner en contacto una composición que contiene una hPAK65 con un agente que tiene la capacidad de inhibir la actividad de unión a p21 de hPAK65, como se determina en un ensayo de inhibición de la unión a p21 de hPAK65.

Por consiguiente, también se proporciona un kit de ensayo para identificar agentes que inhiban o modulen la actividad de unión a p21 de hPAK65, que incluye hPAK65 sustancialmente purificada. El kit de ensayo puede contener opcionalmente una proteína p21 sustancialmente purificada, preferiblemente racI o CDC42Hs, una solución acuosa tamponada, GTP\gammaS o un anticuerpo contra el marcador de epítopo Glu-Glu unido al extremo N-terminal de rac1 o CDC42Hs. GTP\gammaS es una forma de GTP que no puede hidrolizarse a GDP por GTPasas de p21.

Se proporciona un procedimiento para identificar agentes que inhiban o modulen la liberación de fosfato de proteínas p21 unidas a hPAK65. El procedimiento incluye las etapas de poner en contacto una proteína p21 sustancialmente purificada con una mezcla de reacción que contiene hPAK65 sustancialmente purificada para formar un complejo de proteína p21-PAK65, después poner en contacto el complejo con el agente de ensayo y, después, determinar el grado en el que el agente inhibe la liberación de fosfato en comparación con una reacción de control que carece del agente. La hPAK65 puede estar unida a un soporte sólido o puede estar libre en solución.

En otra realización de la invención, se proporciona un procedimiento para inhibir o modular la liberación del fosfato de la proteína p21 unida a hPAK65, que incluye las etapas de poner en contacto una composición que contiene una proteína p21 unida a hPAK65 con un agente que tenga la capacidad de inhibir o modular la liberación de fosfato de la proteína p21 unida a hPAK65, como se determina en un ensayo de liberación de fosfato.

Por consiguiente, también se proporciona un kit de ensayo para identificar agentes que inhiban o modulen dicha liberación de fosfato. El kit incluye hPAK65 sustancialmente purificada. El kit de ensayo puede contener opcionalmente una proteína p21 sustancialmente purificada, preferiblemente racI o CDC42Hs, una solución acuosa tamponada y GTP\gammaP^{32}.

La invención proporciona ahora por primera vez la capacidad de identificar sustratos celulares por su actividad quinasa de hPAK65 que estén implicados en rutas relacionados con hPAK65. El uso apropiado de las realizaciones de proteína y ácido nucleico de hPAK65 proporcionadas por esta invención, preferiblemente con las fuentes de tejido o líneas celulares que se indica en este documento que expresan hPAK65 y, particularmente hPAK65 activada constitutivamente, permitirá la identificación de las macromoléculas celulares que se fosforilen cuando se activa la actividad serina quinasa de hPAK65.

Todos los agentes identificados mediante las diversas realizaciones de esta invención se adaptan fácilmente al uso terapéutico como inhibidores de la quinasa hPAK65 (o como inhibidores de la unión hPAK65-rac1/CDC42Hs y/o de la autofosforilación) para el control de enfermedades dependientes de la quinasa PAK65 en mamíferos. Las enfermedades dependientes de la quinasa PAK65 pueden incluir trastornos hiperproliferativos que se inician/mantienen por una actividad de la enzima serina quinasa PAK65 anormal. Los ejemplos incluyen, cáncer, aterosclerosis y antiangiogénesis (por ejemplo, crecimiento tumoral, retinopatía diabética). Se entiende en la técnica que los agentes inhibidores de quinasa terapéuticamente útiles deberían ser preferiblemente selectivos. Los inhibidores de la quinasa PAK65 que inhiben muchas otras proteínas quinasas como resultado de su falta de especificidad son altamente citotóxicos. Por lo tanto, pueden usarse ensayos de rutina que miden la citotoxicidad para identificar inhibidores de PAK65 que probablemente produzcan efectos secundarios indeseados debido a la falta de selectividad. Como un ensayo más detallado de selectividad, los compuestos deberían ensayarse para determinar su capacidad para inhibir la actividad enzimática de una variedad de otras proteínas quinasas, por ejemplo, clases de proteínas quinasas identificadas en base al aminoácido o aminoácidos que sirven como sustrato: quinasas que fosforilan tirosina, quinasas que fosforilan tirosina y treonina y quinasas que fosforilan serina y treonina. Los ejemplos de quinasas que fosforilan serina y treonina incluyen RAF, proteína quinasa A, proteína quinasa C y receptor del TGF beta. La quinasa MEK es un ejemplo de quinasas que fosforilan tirosina y treonina.

En la siguiente discusión de usos de inhibidores de quinasas, la discusión se centra en la proteína quinasa hPAK65, no obstante, debe entenderse que cualquier discusión en este documento del uso de un compuesto como inhibidor de la quinasa hPAK65 es aplicable en general al uso de un agente que sea específico para una de las otras actividades de hPAK65. Se determina fácilmente si un agente es específico para la actividad quinasa de PAK65 mediante el uso de los ensayos de actividad quinasa expuestos en los ejemplos.

Para que los compuestos que inhiben (o modulan) la actividad quinasa de hPAK65 o una de sus otras actividades sean terapéuticamente útiles, deberían ser activos en células intactas. Están fácilmente disponibles varios procedimientos para determinar la actividad de inhibidores (o moduladores) de hPAK65 candidatos frente a la hPAK65 en células intactas. La fosforilación de los sustratos celulares de hPAK65 puede medirse usando anticuerpos antifosfoserina o identificaciones de fosfopéptidos. Además, pueden medirse acontecimientos de señalización intracelular adicionales que incluyen el flujo de calcio, el metabolismo del inositol fosfato, la proliferación celular y la síntesis de ADN celular o cualquiera de los otros procesos fisiológicos relacionados con rutas dependientes de hPAK65. Preferiblemente, una línea celular modificada por ingeniería genética para expresar hPAk65 activa constitutivamente puede conducir a una línea celular transformada sobre la que pueden ensayarse inhibidores de la actividad quinasa de hPAK65 candidatos para determinar su capacidad para disminuir la actividad quinasa de hPAK65, disminuir la fosforilación global en una célula o revertir la célula hasta un estado menos tranformado.

Los agentes candidatos que inhiben o modulan la unión de proteína p21 a hPAK65 pueden ensayarse adicionalmente frente a una línea celular transformada por una rac1 recombinante que se ha modificado en una forma activa constitutivamente. Las células transformadas con rac1 tienen las características de células neoplásicas, por ejemplo de formación de loci y tumores en ratones, y pueden analizarse para determinar su reversión a un estado más normal en presencia de agentes candidatos que inhiban la activación por racI de hPAK65.

Es probable que la solubilidad de los agentes de la presente invención tanto en agua como en disolventes ligeramente hidrófobos aumente la probabilidad de que atraviesen la membrana celular.

Los compuestos de esta invención pueden ser útiles en forma del ácido libre, en forma de una sal y como hidrato. Todas las formas están dentro del alcance de la invención. Pueden formarse sales básicas y son simplemente una forma más conveniente de uso; en la práctica, el uso de la forma de sal equivale intrínsicamente al uso de la forma ácida. Las bases que pueden usarse para preparar las sales incluyen preferiblemente las que producen, cuando se combinan con el ácido libre, sales farmacéuticamente aceptables, es decir, sales cuyos aniones no son tóxicos para el organismo animal en dosis farmacéuticas de las sales, de tal modo que las propiedades beneficiosas intrínsecas al ácido libre no se afecten negativamente por los efectos secundarios atribuible a los cationes. Aunque se prefieran sales farmacéuticamente aceptables del compuesto ácido, todas las sales son útiles como fuentes de la forma de ácido libre incluso si la propia sal particular se desea solamente como un producto intermedio como, por ejemplo, cuando la sal se forma sólo con fines de purificación e identificación y cuando se usa como un intermedio en la preparación de una sal farmacéuticamente aceptable por procedimientos de intercambio iónico.

Los agentes dentro del alcance de esta invención que tienen actividad como inhibidores o moduladores específicos de hPAK65 poseen un valor terapéutico como agentes de antiproliferación celular para el tratamiento de ciertas afecciones que incluyen, por ejemplo, neoplasia, inflamación, afecciones linfoproliferativas, artritis, enfermedades autoinmunes, apoptosis y similares.

Los compuestos de la presente invención pueden administrarse a un hospedador mamífero en una diversidad de formas, es decir, pueden combinarse con diversos vehículos inertes farmacéuticamente aceptables en forma de comprimidos, cápsulas, grageas, trociscos, caramelos duros, polvos, pulverizaciones, elixires, jarabes, soluciones inyectables o colirios y similares dependiendo de la vía de administración seleccionada, por ejemplo, por vía oral o parenteral. La administración parenteral a este respecto incluye la administración por las siguientes vías: intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, intrasinovial, transepitelial (incluyendo, transdérmica, oftálmica, sublingual y bucal), tópica (incluyendo oftálmica, dérmica, ocular, rectal, inhalación nasal por insuflación y aerosol) y sistémica rectal.

El compuesto activo puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable o puede incluirse en cápsulas de gelatina de carcasa dura o blanda o puede comprimirse en comprimidos o puede incorporarse directamente con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, puede incorporarse un excipiente al compuesto activo y usarse en forma de comprimidos, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares que pueden ingerirse. Dichas composiciones y preparaciones deberían contener al menos el 0,1% de compuesto activo. Por supuesto, el porcentaje de las composiciones y preparaciones puede variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente el 2 y aproximadamente el 6% del peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosificación adecuada. Las composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo con la presente invención se preparan de tal modo que una forma unitaria de dosificación oral contiene entre aproximadamente 1 y 1000 mg de compuesto activo.

Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: un aglutinante tal como polivinilpirrolidona, goma tragacanto, goma arábiga, sacarosa, almidón de maíz o gelatina; un excipiente tal como fosfato de calcio, citrato de sodio y carbonato de calcio; un agente disgregante tal como almidón de maíz, almidón de patata, almidón de tapioca, ciertos silicatos complejos, ácido algínico y similares; un lubricante tal como lauril sulfato de sodio, talco y estearato de magnesio; un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa y sacarina; un agente aromatizante tal como menta, aceite de gaulteria o aroma de cerezas. También se emplean composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina blandas y duras rellenas; los materiales preferidos a este respecto también incluyen lactosa o azúcares de la leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Diversos otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante, un aromatizante tal como aroma de cereza o naranja, agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión así como diluyentes como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y diversas combinaciones similares de los mismos. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma unitaria de dosificación debería ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo puede incorporarse en preparaciones y formulaciones de liberación
sostenida.

El compuesto activo también puede administrarse por vía parenteral o intraperitoneal. Con el fin de la administración parenteral, pueden emplearse soluciones en aceite de sésamo o cacahuete o en propilenglicol acuoso, así como soluciones acuosas estériles de las sales de metales alcalinos o metales alcalinotérreos hidrosolubles correspondientes enumeradas anteriormente. Dichas soluciones acuosas deberían estar adecuadamente tamponadas, si es necesario, y el diluyente líquido hacerse primero isotónico con solución salina o glucosa suficiente. Pueden prepararse soluciones del compuesto activo como una base libre o una sal farmacológicamente aceptable en agua convenientemente mezclada con un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa. Una dispersión también puede prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas con fines de inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, todos los medios acuosos estériles empleados pueden obtenerse fácilmente por técnicas convencionales bien conocidas para los expertos en la materia.

Las formas farmacéuticas adecuadas para el uso mediante inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado de que pueda inyectarse con jeringa fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede provocarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo; azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse mediante el uso de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se preparan soluciones inyectables estériles por incorporación del compuesto activo en la cantidad necesaria en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguida de esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones por incorporación del ingrediente activo esterilizado en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son secado al vacío y la técnica de secado por congelación, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de la solución previamente esterilizada por filtración de los mismos.

Con fines de administración tópica, se preparan soluciones acuosas estériles diluidas (habitualmente en una concentración de aproximadamente el 0,1% al 5%), de otro modo similares a las soluciones parenterales anteriores, en recipientes adecuados para la administración gota a gota en el ojo. Los compuestos terapéuticos de esta invención pueden administrarse a un mamífero en solitario o en combinación con vehículos farmacéuticamente aceptables. Como se ha indicado anteriormente, las proporciones relativas de ingrediente activo o de vehículo se determinan por la solubilidad y la naturaleza química del compuesto, la vía de administración seleccionada y la práctica farmacéutica convencional. La dosificación de los presentes agentes terapéuticos que serán más adecuados para la profilaxis o el tratamiento variará con la forma de administración, el compuesto particular seleccionado y las características fisiológicas del paciente particular en tratamiento. Generalmente, se usarán inicialmente dosificaciones pequeñas y, si es necesario, se aumentarán en pequeños incrementos hasta que se alcance el efecto óptimo en las circunstancias. La administración oral requiere mayores dosificaciones. Los compuestos administran por vía oral o parenteral, o tópicamente como colirios. Las dosificaciones pueden determinarse fácilmente por los médicos que usen procedimientos conocidos en la técnica, usando dosificaciones típicamente determinadas a partir de estudios animales como puntos de partida.

Habiéndose descrito ahora la invención en general, la misma se entenderá mejor con respecto a los siguientes ejemplos detallados, que se proporcionan con fines ilustrativos solamente y no deben considerarse limitantes de la invención a menos que se especifique otra cosa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos

Ejemplo 1

Identificación de proteínas efectoras en neutrófilos para rac1 y CDC42Hs

Para detectar si existen dianas para rac/CDC42Hs en seres humanos, se usó un ensayo de superposición para detectar cualquier diana de este tipo en el citosol de neutrófilos. El ensayo de superposición para GTPasa se describió inicialmente como un procedimiento para detectar proteínas activadoras de GTPasa ("GAP") (Manser et al. 1992) para proteínas similares a rho; mediante el sondaje de un filtro de nitrocelulosa que contiene un lisado con proteínas similares a rho unidas a (\gamma^{32}p)GTP fue posible detectar proteínas sobre el filtro que pueden afectar al índice de hidrólisis de GTP, puesto que las GAP catalizan la liberación del \gammaPi del GTP, la pérdida de Pi radiomarcado de la sonda de GTPasa se visualizó como banda claras sobre un fondo negro. No obstante, por modificación de las condiciones de sondaje los presentes inventores descubrieron que se pueden detectar proteínas efectoras que inhiben la liberación de Pi como bandas oscuras en la transferencia. Como se describe en este documento, se detectaron tres bandas principales que se agrupaban próximas al marcador de 68 Kda usando citosol de neutrófilos humanos. Se aplicaron 40 \mul de fracción citosólica de neutrófilos bruta o parcialmente purificada que contenía p65 (-80 \mug de proteína) en un SDS PAGE al 14% y se transfirió a una membrana de PVDF. La membrana se tiñó durante 30 s con tinción de Azul de Coomassie para detectar las proteínas transferidas, se destiñó durante 2 min y se incubó durante 30 min con PBS que contenía BSA al 1%, MgCl_{2} 0,5 mM, Triton x-100 al 0,1% y DTT 5 mM. Se diluyeron 30-50 \mul (3-5 \mug de proteína) de CDC42Hs, rac1 humana o rho A humana preparadas como proteínas recombinantes en células Sf9 de insecto en 200 \mul de tampón de intercambio: MES 25 mM, pH 6,5, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, Triton x-100 al 0,05% y 1 \mul de [\gamma^{33}p]GTP (5 \muCi, ICN) o [\beta^{32}p]GDP (5 \muCi, ICN). Las proteínas se incubaron con el tampón de intercambio durante 15 min a temperatura ambiente y después se mezclaron con 10 ml de tampón de unión que contenía tampón MES 25 mM MES a pH 6,5, GTP 0,5 mM, MgCl_{2} 5 mM, NaCl 50 mM y DTT 5 mM. Inmediatamente después se usó la proteína cargada con nucleótidos para sondar el filtro. La mezcla se incubó durante 5-8 min y se lavó durante cinco min con tampón MES 25 mM, pH 6,5, MgCl_{2} 5 mM, Triton X-100 al 0,05%. La membrana se secó y se expuso en una película durante 2-3 horas. Se detectaron tres proteínas principales como dianas para rac1/CDC42Hs. Se determinó adicionalmente que estas proteínas eran abundantes en las fracciones citosólicas de neutrófilos y células HL-60. Por consiguiente, se usaron neutrófilos como fuente para purificar la proteína. El fraccionamiento del citosol de neutrófilos en una columna Mono Q resolvió las bandas que se agrupaban próximas al marcador de 68 kDa en tres bandas diferentes de un tamaño molecular de 62, 65 y 68 kDa, detectándose todas ellas solamente cuando el filtro se sondaba con la forma unida a GTP de rac1 y CDC42Hs y no con rho A unida a GTP. Véanse las Figuras 1 y 3.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Aislamiento de proteína hPAK65

La banda p65, que era la más abundante de las tres proteínas identificadas en el Ejemplo 1, se aisló y purificó posteriormente. Se preparó el citosol de neutrófilos humanos como se ha descrito anteriormente (Abo et al. 1994). Todas las etapas de purificación se realizaron en columnas conectadas a un sistema de FPLC a 40ºC, flujo de 1 ml/min, y se recogieron fracciones de 1 ml. Se aplicaron 10 ml (10 mg/ml) de citosol de neutrófilos en una columna Mono Q (HR5/5 Pharmacia LKB) equilibrada con tampón A: Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, DTT 1 mM, MgCl_{2} 5 mM, PMSF 1 mM, pepstatina 1 \mug/ml. Las proteínas se eluyeron con un gradiente de 30 ml de NaCl de 0 a 0,5 M y las fracciones recogidas se ensayaron para determinar la unión a racl o CDC42Hs mediante el ensayo de superposición. Las fracciones que contenían la proteína p65 se combinaron y se sometieron a precipitación con sulfato de amonio. Se añadieron granos de sulfato de amonio a la mezcla durante un periodo de 15 min para conseguir una saturación del 40%. La solución se agitó en hielo durante 30 min adicionales y posteriormente se centrifugó a 100.000 g durante 15 min en una ultracentrífuga TLX Beckman. El sedimento se resuspendió en tampón A hasta su volumen original y las fracciones se analizaron mediante el ensayo de superposición. El sobrenadante obtenido por sedimentación con sulfato de amonio al 40% que contenía la proteína p65 deseada se purificó adicionalmente en una columna Phenyl Superose (HR 5/5 Pharmacia LKB) equilibrada con tampón Pi 100 mM, pH 7,2, DTT 1 mM, MgCl_{2} 5 mM, PMSF 1mM, pepstatina 1 \mug/ml y sulfato de amonio 1,2 M. Las proteínas unidas se eluyeron mediante un gradiente de 30 ml de sulfato de amonio de 1,2 M a 0 M. En el caso de la purificación de una gran cantidad de material de partida (300-500 mg de proteína), las etapas de sulfato de amonio y Phenyl Superose fueron los primeros procedimientos de purificación, seguidos del fraccionamiento en Mono Q. Con este fin se usó una columna Hiload Phenyl Sepharose 16/10 (Pharmacia, LKB). Las fracciones recogidas se analizaron mediante el ensayo de superposición y las fracciones que contenían la proteína p65 se combinaron y se desalificaron en tampón A en una columna PD 10 (Pharmacia, LKB). La p65 parcialmente purificada se purificó adicionalmente en una columna HR5/5 (Pharmacia LKB) equilibrada con el tampón A. Las proteínas se eluyeron mediante un gradiente de 30 ml de NaCl de 0 a 0,5 M y las fracciones se analizaron mediante el ensayo de superposición. En esta fase, el polipéptido p65 podía identificarse fácilmente mediante tinción con Azul de Coomassie y la banda se escindió y se usó para el análisis de aminoácidos.

Se determinó la secuencia de aminoácidos de la forma siguiente. La preparación de p65 se purificó mediante SDS-PAGE, seguido de tinción con Azul de Coomassie G-250, y la proteína se escindió. Después del lavado, se maceraron fragmentos de gel y se digirieron con endoproteinasa de Achromobacter Iyticus Ly-C. Se recuperaron los péptidos mediante lavados secuenciales y se separaron mediante hplc en tándem usando columnas de intercambio aniónico y de fase inversa de diámetro interno de 2,1 mm en serie, después de los procedimientos descritos anteriormente (Kawasaki et al. 1990). Se recogieron las fracciones y se aplicaron directamente en un secuenciador automático de líquido por pulsos Applied Biosystem 477A modificado para química de ciclo rápido como se describe (Totty et al. 1992). La digestión de p65 y el posterior análisis de aminoácidos dieron las siguientes secuencias de aminoácidos: STMVGTPYWMAPEVVTR, que está estrechamente relacionada con una secuencia dentro del dominio de serina/treonina quinasa de STE20 de levadura (Ramer y Davis 1993) y tiene una identidad del 100% con una serina/treonina quinasa de cerebro de rata, PAK65 (Manser et al. 1994).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Aislamiento de un clon de ADNc de hPAK65

En base a la secuencia proteica de la PAK65 de cerebro de rata (Manser et al. 1994) y a la secuencia de aminoácidos obtenida de la p65 purificada determinada en el Ejemplo 2, se diseñaron los oligómeros GM749 5' GGGGCCATC
CAATAGGGGGTACCNACCATNG 3' y GM752: 5' ACCGGAGAATTCACCGGCATGCCTGAACAGTGG 3' y se usaron para amplificar ADNc humanos que codifiquen proteínas PAK. Estos oligómeros se usaron para amplificar ADNc específicos de PAK a partir de varias genotecas de ADNc humano disponibles en el mercado. Aunque el producto esperado se detectó en varias genotecas específicas de tejido, se detectaron cantidades relativamente grandes en una genoteca de placenta humana. Se seleccionó una genoteca de placenta humana de Stratagene (1994 número de catálogo 936203) como una fuente para un clon de ADNc. El producto de PCR de 962 pares de bases purificado en gel se amplificó en presencia de ^{32}P dCTP y ^{32}P dGTP dando como resultado un producto radiactivo. Este producto de PCR se usó para explorar aproximadamente 100.000 placas recombinantes usando condiciones de hibridación rigurosas (tampón de hibridación: formamida al 50%, SSC 5X, Denhardt 5X, NaPO_{4} 50 mM pH 7 y SDS al 0,1% a 42ºC; lavado: SSC 5x, SDS al 0,1%) para aislar un ADNc de longitud completa. Un clon positivo se purificó por placas y se autoescindió ("escisión in vivo") a partir de lambda Zap II de acuerdo con los protocolos del fabricante para dar el clon plasmídico que contiene el ADNc de PAK65 humana de longitud completa con la secuencia que se presenta en la Figura 2A (SEC ID Nº: 1), que se denominó pBSPAK. La secuencia del inserto de ADNc contenida dentro del plásmido Bluescript resultante se determinó usando el procedimiento de terminación de la cadena con didesoxinucleótidos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Homología de aminoácidos

La secuencia de nucleótidos y aminoácidos deducida del ADNc de PAK65 humana, que se denominará en este documento hPAK65, se muestra en la Figura 2. Un clon de ADNc de hPAK65 de longitud completa obtenido a partir de una genoteca de placenta humana presentaba una similitud de secuencia con el dominio quinasa de la PAK65 de cerebro de rata y STE20 de levadura. Aunque tanto la PAK65 de cerebro de rata como la hPAK65 presentan una especificidad similar por rac1/CDC42Hs, las secuencias presentan una identidad de secuencia de sólo el 70% a nivel de aminoácidos en los dominios de unión de rac1/CDC42Hs. La secuencia de aminoácidos completa de hPAK65 comparte una identidad de \sim73% con la PAK65 previamente aislada del cerebro de rata (Manser et al. 1994) (Figura 2A) y comparte una identidad de más del 95% con el dominio quinasa (aminoácidos: 230-506) (Figura 2B). Además, la hPAK65 presenta una identidad de \sim63% con el dominio quinasa de STE20 (posición: 620-880) (Ramer y Davis 1993) (Figura 2C). Como se ha descrito para la PAK65 de rata (Manser et al. 1994), el dominio de unión a racl y CDC42Hs (aminoácidos: 47-113) de hPAK65 también comparte algunas similitudes con el dominio regulador de STE20 (no se muestran los datos).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Distribución tisular de hPAK65

Para determinar la distribución tisular de ARNm que codifican hPAK65, se usó un producto de PCR radiactivo que contenía el dominio quinasa altamente conservado (pares de bases 1009 a 1912) del ADNc de PAK humana para hibridar con ARNm obtenido de 16 tejidos humanos y 8 líneas celulares cancerosas inmovilizadas sobre transferencias de Northern (el ARNm unido a membrana está disponible en Clontech). Puesto que la sonda se obtuvo a partir del dominio quinasa, la región más conservada entre hPAK65, PAK65 de cerebro de rata y STE20, se esperaba que se analizaría la expresión de mensajes estrechamente relacionados. Las condiciones de hibridación usadas eran las sugeridas por el fabricante usando ExpressHyb (Clontech) excepto por que la temperatura era de 72ºC y el tiempo de hibridación era durante una noche. El análisis de transferencia de northern indica que el ARNm relacionado con hPAK65 se distribuye de forma ubicua entre diversos tejidos con mayores niveles en células de origen mieloide, en concreto en músculo esquelético, ovario, timo y bazo, y 2-3 veces superiores en la línea celular HL-60 (Figura 3). Se detectaron cuatro especies de ARN en la mayoría de los tejidos con tamaños de aproximadamente 7,5 kb, 5 kb, 4,4 kb y 3 kb. El mensaje de 7,5 kb era la especie predominante en todos los tejidos excepto en músculo esquelético, donde el ARNm de 7,5 kb y el de 3 kb eran aproximadamente iguales. Por el contrario, las líneas celulares HL-60, Molt-4, Raji y SW480 tenían cantidades equivalentes de las cuatro especies, mientras que en cerebro se detectó un ARNm de tamaño diferente de aproximadamente 3,3 kb. En base a los resultados de la transferencia de Southern de genómico en condiciones rigurosas (no se muestran resultados; ADN genómico humano unido a membrana disponible en Clontech; las condiciones eran las sugeridas por el fabricante excepto por que la temperatura de hibridación era de 64ºC en lugar de 60ºC y la hibridación se desarrolló durante una noche), estos múltiples ARNm eran más probablemente formas de corte y empalme alternativas de un solo gen (Figura 3).

Por el contrario, mediante el uso del ensayo de superposición, se detectó un alto nivel de proteínas PAK de rata principalmente en células de cerebro (Manser et al. 1994), mientras que mediante el análisis de northern se descubrió una expresión mayor de hPAK65 en neutrófilos y células HL-60, como se describe en este documento. Lo más probable es que el ensayo de superposición no sea lo bastante sensible para detectar PAK en tejidos con una expresión relativamente menor de proteína y, por lo tanto, no es un procedimiento preferido para determinar la distribución tisular de PAK.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Producción de proteínas recombinantes en células Sf9

Se clonó un marcador de epítopo Glu-Glu (Grussenmeyer et al. 1985; modificado a Met-Glu-Tyr-Met-Pro-Thr-Asp) en el extremo N-terminal de rac1, CDC42Hs y rho usando una reacción en cadena de la polimerasa (Grussenmeyer et al. 1985). La hPAK65 se marcó con epítopo myc (MEQKLlSEEDL) por ligación de oligómeros hibridados en el sitio Xba I (417 pb) inmediatamente cadena arriba de la Met de inicio de hPAK65. Los ADNc marcados se clonaron en el vector de expresión de baculovirus pAcC13. El pAcPAK780 contiene la hPAK65 marcada con myc. Se homogeneizaron en Dounce 1 g de sedimentos de Sf9 congelados rápidamente, que expresaban las proteínas deseadas, en 10 ml de Tampón B: Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 5 mM, GDP 200 \muM, Pefabloc 1 mM, leupeptina 10 \mug/ml, aprotinina 10 \mug/ml. Para eliminar la fracción particulada, el homogeneizado se centrifugó a 100.000 g durante 15 min. La fracción soluble se aplicó en una columna de proteína G Sepharose de 2 ml conjugada con anticuerpos monoclonales anti-Glu-Glu o anti-Myc. La columna se lavó con 10 ml de tampón B que carecía de GDP y la proteína se eluyó con el mismo tampón que contenía el marcador de péptido Myc o 50 \mug/ml del marcador de péptido ED (EYMPTD). Las fracciones se analizaron en un SDS-PAGE, se cuantificaron mediante el procedimiento de Bradford, se concentraron mediante un Centricon 10 (Amicon) hasta 1 mg/ml, se dividieron en alícuotas, se congelaron rápidamente y se almacenaron a -70ºC. Se usó una alícuota recién preparada de la proteína para cada ensayo. La expresión de la hPAK65 en células Sf9 permitió la preparación de hPAK65 recombinante marcada con epítopo myc esencialmente homogénea ("rhPAK65"), que se usó para la caracterización de las propiedades bioquímicas de hPAK65.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7

La especificidad de unión de hPAK 65 a proteínas p21

Se detectó la hPAK65 recombinante o la hPAK65 endógena en citosol de neutrófilos sólo cuando el filtro se sondaba con [\gamma^{32}P]GTP-CDC42Hs y [\gamma^{32}P]GTP-rac1, pero no con [\gamma^{32}P]GTP-rho A (Figura 4). No se detectaron proteínas cuando la GTPasa se precargaba con [\beta^{32}P]GDP, indicando que la proteína hPAK65 se comporta como una molécula efectora para racI y CDC42Hs. La afinidad relativa a juzgar por el ensayo de superposición es \sim3-4 veces superior para CDC42hs que para racl (Figura 4).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8

CDC42Hs y rac1 inducen la autofosforilación de hPAK65

Para determinar si CDC42Hs y racl inducirían la autofosforilación de hPAK65, se incubó hPAK65 con la forma activada de rac1 o CDC42Hs en una reacción quinasa que contenía [\gamma^{32}P]ATP. La estimulación de la autofosforilación de hPAK65 se observó en ambos casos (Figura 5A). No se observó fosforilación con rho A o por omisión de la GTPasa y simple adición de GTP (Figura 5A). La fosforilación se producía de una forma dependiente de la dosis solamente con la forma de GTP o GTP\gammaS de CDC42Hs o racI. Se obtuvo una fosforilación máxima después de 15 min a 30ºC (no se muestran los datos).

Para determinar el patrón de fosforilación en hPAK65 inducido por racl y CDC42Hs, se sometió a hPAK a una reacción quinasa que contenía racI o CDC42Hs activado. Para eliminar rac1 y CDC42Hs, la hPAK65 inmovilizada sobre perlas se lavó tres veces con PBS que contenía Tritón X-100 al 1% y las perlas se resuspendieron en Tris HCl 100 mM, pH 6,8, SDS al 0,5%, DTT 10 mM, glicerol al 10%. Las muestras se llevaron a ebullición durante 3 min y se añadieron 10 \mug de la proteasa indicada (todas de Boehringer). Las proteínas se digirieron durante una noche a temperatura ambiente y las muestras se analizaron en geles de Tricina al 16%. El gel se tiñó con Azul de Coomassie, se destiñó, se secó y se expuso en una película durante una noche. Se realizó el análisis de fosfoaminoácidos para determinar la localización de la autofosforilación. Se sometieron 4 \mug (sobre 50 \mul de perlas) de hPAK65 recombinante a una reacción quinasa como se ha descrito anteriormente. La hPAK65 fosforilada inmovilizada sobre perlas de Sepharose G se lavó tres veces en PBS que contenía Triton X-100 al 1% y después se hidrolizó en 50 \mul de HCl 6 N a 100ºC durante 2 h. Las perlas se retiraron por centrifugación y el sobrenadante se secó y se disolvió en 10 \mul de tampón de electroforesis a pH 3,5 (10:100:1890; piridina:ácido acético:agua).Los fosfoaminoácidos se resolvieron en una placa de celulosa en capa fina usando el tampón de electroforesis esencialmente como se ha descrito anteriormente (Cooper et al.1983). Los patrones se visualizaron por tinción con ninhidrina al 0,2% en acetona y los restos marcados con ^{32}Pi se detectaron mediante autorradiografía durante una noche. El análisis de fosfoaminoácidos indicaba que la hPAK65 se fosforilaba en restos de serina cuando se activaba por CDC42Hs y no en restos de treonina o tirosina (Figura 5B).

Puesto que rac1 y CDC42Hs comparten una identidad de secuencia de \sim72% y aparentemente desempeñan papeles fisiológicos diferentes, es concebible que rac1 y CDC42Hs puedan activar la autofosforilación de hPAK65 en sitios diferentes. Para ensayar esta hipótesis se incubó la hPAK65 con racl o CDC42Hs en una reacción quinasa con [\gamma^{32}P]ATP y la proteína fosforilada se digirió con tres enzimas diferentes: tripsina, quimiotripsina y Glu-C. Este tratamiento dio como resultado la generación de fosfopéptidos radiomarcados que se resolvieron en un gel de Tricina al 16%. Se generaron perfiles de fosfopéptidos idénticos a partir de la digestión de hPAK65 activada por rac o por CDC42Hs (Figura 5C). Este resultado sugiere que rac y CDC42Hs estimulan que la hPAK65 se autofosforile en los mismos sitios serina.

Como la p65 de neutrófilos humanos y la PAK65 de cerebro de rata, la hPAK65 recombinante interaccionaba específicamente con la forma activada de racl o CDC42 y, posteriormente, si se suministraba ATP, se autofosforilaba. Los datos sugieren que rac/CDC42Hs median la autofosforilación de hPAK65, generando de este modo una quinasa activa. El estricto requerimiento de la unión de hPAK65 y la activación por sólo la forma unida a GTP de rac y CDC42Hs indica que hPAK65 sirve como proteína efectora para rac/CDC42Hs. Además, lo más probable es que la afinidad de unión relativa de rac/CDC42Hs por hPAK65 esté regulada por su estado de nucleótidos y no por el estado fosforilado de hPAK65. Al contrario que el modelo sugerido (Manser et al. 1994), los datos descritos por los presentes inventores indican que el estado de fosforilación de hPAK65 no está implicado en la regulación de la unión de rac/CDC42Hs. La hPAK65 fosforilada y no fosforilada presentaba afinidades comparables por rac1 y CDC42Hs.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9

La hPAK fosforilada es una quinasa activa

Se realizó un ensayo quinasa para determinar si la hPAK65 tenía actividad quinasa hacia otras proteínas y si esa actividad se veía afectada por proteínas p21. Se lavaron una vez 1-2 \mug de rhPAK65 (unida a proteína G Sepharose conjugada con anticuerpo monoclonal de Myc) y se incubaron en 40 \muI de tampón de quinasa (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM, MnCl_{2} 1 mM) con 1-2 \mug de rac1, rho o CDC42Hs, estando todas previamente cargadas con GTP o GDP. La reacción se inició por adición de 10 \muI de tampón de quinasa que contenía ATP 50 \muM y [\gamma^{32}P]ATP 5 \muCi y se incubó durante 20 min a 30ºC. La reacción se interrumpió por adición de 10 \mul de tampón de muestras de SDS PAGE 5X y ebullición durante 5 min. Las muestras se aplicaron a un SDS PAGE al 14%, el gel se tiñó con Azul de Coomassie, se destiñó, se secó y se expuso en una película durante 1-2 h. Las bandas fosforiladas se escindieron y se contaron los ^{32}fosfatos incorporados. En el caso de la fosforilación de proteína básica de mielina ("MBP"), se incluyeron 3 \mug de MBP (Sigma) en la reacción quinasa.

La fosforilación de hPAK65 inducida por rac1 o CDC42Hs estimula su actividad quinasa hacia el sustrato MBP (Figura 6a). Tanto rac como CDC42Hs eran capaces de estimular una quinasa hPAK65 activa de una forma dependiente del tiempo. Se obtuvo la fosforilación máxima de MBP en 10 minutos a 30ºC (Figura 6B).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10

La hPAK activada no requiere rac1 ni CDC42Hs para mantener su actividad quinasa

Los experimentos anteriores demuestran claramente la necesidad de rac1/CDC42Hs en la activación de la autofosforilación de hPAK65. Se investigó si rac1/CDC42Hs son necesarios para la actividad quinasa de hPAK65 mediante el siguiente experimento: se indujo primero la autofosforilación de hPAK65 mediante CDC42Hs en presencia de ATP frío, después se alteró el complejo de hPAK65 y CDC42Hs mediante lavados exhaustivos. La hPAK65 autofosforilada libre de CDC42Hs (confirmado mediante transferencia de western) se sometió a una segunda reacción quinasa que contenía [\gamma^{32}P]ATP y MBP. La hPAK65 autofosforilada libre de CDC42Hs era suficiente para activar la fosforilación de MBP (Figura 6C). La hPAK65 de control se trató exactamente de la misma forma excepto por que no se incluía ATP en la primera reacción quinasa. Se detectaron niveles inferiores de autofosforilación de hPAK65 en la hPAK65 de control, que más probablemente eran debidos a niveles residuales de complejos de CDC42Hs/PAK sin lavar. Estos datos sugieren que rac y CDC42Hs desempeñan un papel importante en la activación de hPAK65 por estimulación de su autofosforilación pero no en el mantenimiento y la regulación de la actividad quinasa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11

Comparación de la unión de CDC42Hs a la hPAK65 fosforilada frente a la no fosforilada

La hPAK65 completamente fosforilada y no fosforilada, a juzgar por el cambio de movilidad y la reacción quinasa, se unen igual de bien a CDC42Hs activada. (Figura 7) La fosforilación de hPAK65 más probablemente sirve para activar la quinasa de hPAK65 pero no altera su afinidad por rac/CDC42Hs. Este resultado contrasta con el sistema de rata, en el que se demostró que CDC42 tiene una afinidad reducida por la forma activada de PAK65 de cerebro de rata y se sugirió que la fosforilación de PAK es un mecanismo por el que rac/CDC42 puede liberarse de PAK una vez activada (Manser et al. 1994).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12

El efecto de hPAK65 sobre la actividad GTPasa intrínseca y estimulada

Puesto que la proteína p65 se detectó inicialmente mediante el ensayo de superposición como un efector potencial e inhibidor de GTPasa para rac1/CDC42Hs, se examinó el efecto de la hPAK65 sobre la actividad GTPasa en solución. Se unió previamente CDC42Hs purificada (800 nM) a g-32P-GTP 80 nM (6000 Ci/mmol) en presencia de EDTA 1 mM durante 5 min a 25ºC, seguido de la adición de 19 volúmenes de tampón de ensayo de GAP (MES 50 mM, pH 6, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM) para dar \gamma32P-GTP-CDC42Hs 4 nM. Se incubó [\gamma-^{32}P]-GTP-CDC42Hs 1 nM con las concentraciones indicadas de hPAK65, que se había preincubado en presencia o ausencia de ATP. Se llevaron a cabo reacciones en tampón de ensayo de GAP que contenía BSA (BSA 0,2 mg/ml, MES 50 mM, pH 6,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM) en presencia o ausencia del fragmento catalítico de p190 humana 20 nM durante 5-10 min a 25ºC, seguido de ensayo por liberación de fosfato (Shacter 1984). Para reacciones estimuladas por p190, se realizaron las reacciones correspondientes en ausencia de p190 y la hidrólisis resultante se restó para dar solamente la actividad dependiente de p190. p190 es un estimulante de la actividad GTPasa.

La hPAK65 presenta un efecto marginal sobre la actividad GTPasa intrínseca de CDC42Hs (Figura 8A). El aumento de la cantidad de hPAK65 hasta 1000 veces por encima de CDC42Hs inhibía la actividad GTPasa intrínseca pero sólo en el 10-15% (Figura 8A). Curiosamente, la hPAK65 activada tenía un efecto idéntico, sugiriendo que la fosforilación no tiene efecto regulador sobre la actividad GTPasa intrínseca de rac/CDC42Hs (Figura 8A).

Por el contrario, cuando el dominio catalítico de la GAP p190 humana (Settleman et al. 1992 describió la p190 de rata) se incluía en el ensayo, la hPAK65 ejercía una inhibición significativa de la hidrólisis de GTP estimulada por p190. El aumento de la concentración de hPAK65 hasta 5 veces superior a la de CDC42Hs daba como resultado el bloqueo de hasta el 40% de la hidrólisis de GTP estimulada por GAP (Figura 8B). No se observaron diferencias en la estimulación de GTPasa por GAP cuando la hPAK 65 fosforilada se comparó con la no fosforilada (Figura 8B).

Rac1 y CDC42Hs comparten una identidad de secuencia de \sim72% y tienen papeles fisiológicos diferentes. Por ejemplo, rac1 induce la rugosidad de membrana (Ridley et al. 1992) e interacciona con p67-phox para activar la NADPH oxidasa (Diekmann et al. 1994), mientras que CDC42Hs no tiene efecto sobre la actividad NADPH oxidasa ni sobre la inducción de rugosidades de membrana. En levaduras, CDC42 está implicada en la formación de brotes (Johnson y Pringle 1990). La afinidad relativamente inferior de hPAK65 por racl en comparación con CDC42Hs puede sugerir que CDC42Hs es el activador fisiológico de hPAK65. Sin embargo, es poco probable que la activación de hPAK65 por racl sea un artefacto in vitro, puesto que la activación in vitro de la NADPH oxidasa requiere específicamente rac y no CDC42Hs. Lo más probable es que proteínas similares a rho tengan numerosos dominios efectores, algunos de los cuales pueden estar compartidos entre los diversos miembros de la familia, mientras que otros pueden ser únicos para cada miembro. Puesto que el mapa de fosfopéptidos parcial generado a partir de la hPAK65 activada por rac o CDC42Hs era idéntico, esto indica que rac y CDC42Hs activan la hPAK65 de la misma forma, en concreto, mediante la estimulación de la autofosforilación en los mismos sitios. Será muy importante determinar qué agonista conectará la estimulación de rac1 o CDC42Hs con la activación de hPAK65 in vivo. Dichos estudios determinarán qué factor de intercambio de nucleótidos para proteínas similares a rho está implicado en esta ruta. Por ejemplo, se demostró que Db1 tiene una actividad de intercambio de nucleótidos sobre rho, CDC42Hs pero no sobre racl (Hart et al. 1991). Por lo tanto, es posible que la activación de Dbl pueda conducir a una estimulación de hPAK65 dependiente de CDC42Hs.

La homología de la hPAK65 y la PAK65 de cerebro de rata con el dominio quinasa de la STE20 de levadura sugiere un papel de proteínas rac/CDC42Hs y PAK en la cascada de proteínas quinasas activadas por mitógenos ("MAP") en células de mamífero (Avruch et al 1994), que está implicada en la proliferación y la transformación celular. Se demostró que STE20 es una diana para las subunidades \beta\gamma de la proteína G heterotrimérica en S. cerevisiae que conectan la respuesta a feromonas con una cascada de quinasas que conduce a la activación de la transcripción (Leberer et al. 1992, Errede y Levin 1993). Cinco proteínas quinasas (STE20, STE11, STE7, FUS3 y KSS1) estaban implicadas entre las proteínas G y el factor de transcripción STE12 (Errede y Levine 1993). STE7 tiene cierta homología con MAP quinasa y FUS3 y KSS1 son homólogas de levaduras de MAP quinasa (Errede et al. 1993). Además, las pruebas genéticas demuestran una asociación funcional entre un nuevo gen STE5 y STE20 (Leberer et al. 1993). Aparte de una homología limitada con FAR1, STE5 no tiene un motivo estructural conocido específico y sin embargo funciona dentro de esta cascada de quinasas y muy probablemente funciona como una proteína adaptadora (Leberer et al. 1993, Errede y Levine 1993). La divergencia relativamente elevada entre la PAK65 de cerebro de rata y la hPAK65 en sus dominios reguladores sugiere que estas proteínas pueden estar controladas por moléculas diferentes. Por lo tanto, las homólogas de STE5 de mamíferos diferentes pueden servir como proteínas adaptadoras para ensamblar distintas quinasas similares a PAK con quinasas aguas abajo tales como STE7 y STE11. Se piensa que rac está implicada en la activación de rutas de quinasas por estrés que puede conducir a, entre otras cosas, apoptosis. La MEK quinasa (MEKK), implicada en rutas de quinasas por estrés, puede actuar aguas abajo de hPAK65 puesto que MEKK tiene homología con la STE11 de levadura, que actúa aguas abajo de la STE20 de levaduras, una proteína que se ha demostrado en este documento que tiene homología con la hPAK65.

En resumen, los datos que se presentan en este documento concuerdan con el modelo presentado en la Figura 9. Tras el intercambio de nucleótido de GDP a la forma activa GTP, rac1/CDC42Hs interaccionan con hPAK65 y posteriormente inducen la autofosforilación de hPAK65. El GTP se hidroliza a GDP mediante la actividad GTPasa intrínseca de rac1/CDC42Hs. La forma unida a GDP inactiva de rac1/CDC42Hs se libera de la quinasa hPAK65 activa, que posteriormente fosforila un sustrato fisiológico aún no identificado.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 13

Anticuerpos contra hPAK65

Se usaron anticuerpos generados contra un péptido derivado del dominio quinasa de hPAK65 para determinar si las otras dos proteínas efectoras, p62 y p68, identificadas en el citosol de neutrófilos, están relacionados con proteínas hPAK65. No se observó reactividad cruzada usando sueros policlonales.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 14

Un ELISA de unión de hPAK65 a rac/CDC42

El siguiente ensayo en formato de ELISA proporciona una realización de un medio para detectar o medir la unión de proteína p21 a hPAK65 o fragmentos de la misma y, por lo tanto, proporcionar un medio para explorar para agentes que modulen su unión. Una superficie, por ejemplo, de un pocillo de microtitulación, se recubrió con una solución de proteína hPAK65 preparada por adición en primer lugar de DTT 0,5 mM a solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (que contenía Ca^{2+} y Mg^{2+}), seguida de la adición de proteína de fusión GST-pakette sustancialmente purificada a una concentración final de 10 \mug/ml (para 0,5 \mug/pocillo). Después de una mezcla suave preferiblemente por inversión, se colocaron 50 \mul de esta solución de GST-PAKette en cada pocillo de una placa de microtitulación, por ejemplo una placa Immulon, que después se cubrió con un sellador de placas y se incubó durante una noche, preferiblemente a 4ºC y, preferiblemente, con balanceo para distribuir uniformemente la solución por toda la superficie. Las placas recubiertas se podían usar típicamente durante 4-5 días. Antes del uso la placa se lavó una vez con 200 \mul de tampón de lavado: PBS que contenía Ca^{2+} y Mg^{2+} más Tween-20 al 0,1%. Los sitios de unión inespecífica se bloquearon por adición a cada pocillo de 200 \mul de PBS que contenía Ca^{2+}, Mg^{2+} y BSA al 1% con incubación a 4ºC durante al menos 2 horas, preferiblemente con balanceo, seguida de dos lavados con 200 \mul de tampón de lavado cada vez.

La racl humana o CDC42Hs recombinantes se mezclaron a las concentraciones deseadas con GDP/GTP\gammaS 1 mM y EDTA (a dos veces la concentración molar de MgCl_{2} para quelar Mg^{2+}) a un total de aproximadamente \sim3 X el volumen de rac1/CDC42Hs añadida. El volumen se ajustó con tampón de preunión (Tris 50 mM a pH 8, NaCl 50 mM). La solución de proteína p21 se incubó después a 30ºC durante 30 minutos. Se añadió MgCl_{2} a dos veces la concentración molar de EDTA. El ión magnesio estimula la unión de nucleótidos a proteínas p21. El EDTA quela el Mg^{2+} para ayudar a la eliminación de nucleótidos.

Para la unión, la solución de proteína p21 anterior se ajustó a un volumen con tampón de unión (Tris 50 mM a pH 8, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 50 mM, NP-40 al 1%, BSA al 0,1%). La unión se comenzó por adición de 50 \mul de solución de rac1/CDC42Hs a cada pocillo. Para ensayar un agente por su capacidad para inhibir o modular la unión, se añadió un agente de ensayo a 10 \muM a la solución de 50 \mul (por ejemplo, 5 \mul de agente + 45 \mul de solución de racl/CDC42 GTP\gammaS). Se dejó que la unión se desarrollara durante 1 hora a 35ºC. Después, los pocillos se lavaron tres veces con 200 \mul de tampón de lavado cada vez.

Para detectar la rac1/CDC42Hs unida a hPAK65, se añadió un conjugado de anticuerpo-fosfatasa alcalina ("Ab-AP") que reconocía el marcador apropiado a cada pocillo. Típicamente, el conjugado de anticuerpo-AP se diluyó 1:4000 en tampón de dilución de Ab (PBS que contenía Ca^{2+} y Mg^{2+}, Tween-20 al 0,1%, BSA al 0,1%) y después se añadieron 50 \mul de solución de Ab-AP a cada pocillo. Después de la incubación durante 1 h a temperatura ambiente, cada pocillo se lavó tres veces con 200 \mul de tampón de lavado. Se añadieron 100 \mul de sustrato para AP (solución madre: 1 comprimido de PNPP (Boeringher-Mannheim) en 100 ml de H_{2}O) a cada pocillo, seguido de incubación durante 10-20 minutos a 35ºC para que se desarrollara el color. El color se leyó a 405 nm cuando la DO era de aproximadamente 1,0.

Un agente candidato es uno que inhibe significativamente la unión de rac1 o CDC42Hs a GST-PAKette y, preferiblemente, tiene una CI_{50} (concentración a la que se produce el 50% de la inhibición máxima) en el intervalo de menos de 1 \muM y, más preferiblemente, menor de 1 nM. Más preferiblemente, un agente presentará selectividad en la inhibición de la unión al no inhibir sustancialmente otras parejas de proteína p21:proteína quinasa, preferiblemente con una selectividad de al menos dos veces, más preferiblemente de al menos tres veces y, aún más preferiblemente, de al menos diez veces.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 15

Exploración para compuestos que inhiban la actividad quinasa de hPAK65

Los compuestos pueden evaluarse en un formato de ensayo in vitro para determinar la capacidad para inhibir la actividad quinasa de la PAK65 humana para el sustrato MBP. Los formatos de ensayo generales son como se proporcionan en los Ejemplos anteriores. Otro ensayo puede adaptarse (MacDonald et al. (1993) Mol. Cell. Biol. 13: 6615) de la forma siguiente: proteína PAK65 humana purificada y MBP purificada se combinan en un recipiente de reacción (por ejemplo, un pocillo de una placa de microtitulación) en condiciones acuosas tamponadas en presencia de \gamma^{33}-P-ATP y se incuban a 32ºC; la incorporación catalizada por quinasa de ^{33}P en la proteína se detecta como recuentos radiactivos retenidos en papel de fosfocelulasa después de aclarar para eliminar los componentes no unidos (es decir, no proteicos), incluyendo el \gamma^{33}-P-ATP. Se incluyen agentes de ensayo en reacciones en paralelo y se evalúan por su capacidad para inhibir la incorporación dependiente de hPAK65 de ^{33}p en proteína retenida sobre fosfocelulosa. En una realización alternativa, puede usarse \gamma-^{32}P-ATP en lugar de \gamma^{33}-P-ATP. En una segunda realización alternativa, puede usarse un péptido tal como CQQFGFGRRASDDG en lugar de MBP (Kolch et al. (1993) Nature
364: 249).

Un agente candidato es uno que inhibe significativamente la actividad quinasa de hPAK65 y, preferiblemente, tiene una CI_{50} (concentración a la que se produce el 50% de la inhibición máxima) en el intervalo de aproximadamente 3 x 10^{-8} M. Más preferiblemente, un agente presentará una selectividad en la inhibición de hPAK65 al no inhibir sustancialmente la actividad de la proteína quinasa C (PKC) a concentraciones de hasta 1 x 10^{-5} M. Más preferiblemente, un agente no debería inhibir significativamente la actividad de rasGAP ni de rapGAP mediante agente 1 x 10^{-5} M en condiciones de ensayo convencionales para esas actividades.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 16

Inhibición del crecimiento de tumores humanos en ratones SCID

Para evaluar la capacidad de un agente candidato para inhibir el crecimiento de tumores humanos, se inyectaron células tumorales humanas en ratones SCID (inmunodeficiencia combinada grave) para formar masas tumorales palpables. Los efectos de un agente candidato en la inhibición del crecimiento tumoral pueden determinarse de la forma siguiente. Aproximadamente 1 x 10^{7} células de la línea celular CCL 221 (ATCC, Rockville, MO), una línea celular de adenocarcinoma de colon dependiente de ras humana, se suspenden en 100 \mul de DMEM y se inyectan subcutáneamente en ratones SCID, de tal modo que se forman dos tumores por ratón. Los ratones SCID reciben células CCL 221 y los tumores crecen durante 7 días sin tratamiento; el día 7 (Día 0) se registran los diámetros máximos de los tumores y los pesos de los animales. El Día 0, se determina el tamaño tumoral medio para los ratones. El día 1 (ocho días después de la inyección de células tumorales), se comienza el tratamiento de los ratones con agente candidato o vehículo en solitario. A un grupo de los ratones (controles) se les inyectó por vía intraperitoneal 0,2 ml de vehículo y un segundo grupo de ratones recibieron agente por inyección intraperitoneal. Pueden ensayarse diversas dosis de agente en grupos separados de ratones. El Día 7 y el Día 14 se mide el peso del animal y el diámetro máximo de los tumores. Se compara el tamaño tumoral máximo medio para cada grupo el Día 0, Día 7 y Día 14. El Día 14, se realizó el seguimiento de un animal con una dosis elevada durante un periodo adicional para determinar si el agente produce una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento tumoral. Los efectos de toxicidad puede examinarse por seguimiento del peso de los ratones y por extirpación de los pulmones, hígados y bazos de los animales para tinción histológica.

Habiéndose descrito ahora la invención completamente, será evidente para un experto en la materia que muchos cambios y modificaciones pueden realizarse en la misma sin alejarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citados en la descripción

\bullet US 4683194 A [0046]

\bullet EP 219237 A [0063]

\bullet US 4683195 A [0046]

\bullet EP 324647 A [0064]

\bullet US 4683202 A [0046]

\bullet US 4336336 A [0065]

\bullet US 4399216 A [0053]

\bullet EP 244042 A [0066]

\bullet US 4912040 A [0053]

\bullet EP 127328 A [0069]

\bullet US 4740461 A [0053]

\bullet EP 36259 A [0072] [0073]

\bullet US 4959455 A [0053]

\bullet EP 63953 A [0072] [0073]

\bullet us 4738921 A [0060]

\bullet WO 8404541 A [0072] [0073]

\bullet EP 36776 A [0060] (0072]

\bullet EP 136829 A [0072]

\bullet EP 121775 A [0060]

\bullet EP 136907 A [0072]

\bullet US 4689406 A [0060]

\bullet GB 8418273 A [0072]

\bullet US 4551433 A [0061]

\bullet US 4745056 A [0072]

\bullet EP 267851 A [0061]

\bullet EP 45665 A [0081]

Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción

\bulletNOBES, C.; HALL, A. Curr. Opin. Gen. Davel., 1994, vol. 4, 77-81 [0007]

\bulletHART, M. J.; EVA, A.; EVANS, T.; AARONSON, S.A.; CERIONE, R.A. Nature, 1991, vol. 354, 311-314 [0007]

\bulletBOGUSKI, M.S.; MCCORMICK, F. Nature, 1993, vol. 366, 643-654 [0007]

\bulletRIDLEY, A.J.; HALL, A. Cell, 1992, vol. 70, 389-399 [0007]

\bulletRIDLEY, A.J.; PATERSON, H.F.; JOHNSTON, C.L.; DIEKMANN, D.; HALL, A. Cell, 1992, vol. 70, 401-410 [0007]

\bulletTAKAISHI, K.; KIKUCHI, A.; KURODA, S.; KOTANI, K.; SASAKI, T.; TAKAI, Y. Mol. Cell. Biol., 1993, vol. 13, 72-79 [0007]

\bulletKISHI, K.; SOSAKI, T.; KURODA, S.; ITAH, T.; TAKAI, Y. J. Cell. Biol., 1993, vol. 120, 1187-95 [0007]

\bulletTOMINAGA, T.; SUGIE. K.; HIRATA, M.; FUKATA, J.; UCHIDA, A.; IMURA, H.; NARUMIYA, S. J. Biol. Chem., 1993, vol. 120, 1529-1537 [0007]

\bulletJOHNSON, D.; PRINGLE, J. J. Cell Biol., 1990, vol. 111, 143-152 [0007]

\bulletGULBINS, E.; COGGESHALL, K.M.; BAIER, G.; KATZAV, S.; BURN, P.; ALTMAN, A. Science, 1993, vol. 260, 822-825 [0007]

\bulletMIKI., T.; SMITH, CI.; LONG, J.E.; EVA, A.; FLEMMING, T.P. Nature, 1993, vol. 362, 462-465 [0007]

\bulletKHOSRAVI-FAR, R,; CHRZANOWSKA-WODNICKA, M.; SOLSKI, P.A.; EVA, A.; BURRIDGE, K.; DER, C. J. Mol. Cell. Biol., 1994, vol. 14, 6848-6857 [0007]

\bulletABO, A.; PICK, E.; HALL, A.; TOTTY, N.; TEAHAN, C.G.; SEGAL, A.W. Nature, 1991, vol. 353, 668-670 [0007]

\bulletKNAUS, U. G.; HEYWORTH, P.G.; EVANS, T.; CURNUTTE, J.T.; BOKOCH, G.,M. Science, 1991, vol. 254, 1512-1515 [0007]

\bulletSEGAL, A.W.; ABO, A. Trends. Biochem. Sci., 1993, vol. 18, 43-47 [0007]

\bulletDIEKMANN, D.; ABO, A.; JOHNSTON, C.; SEGAL, A.W.; HALL, A. Science, 1994, vol. 265, 531-533 [00071

\bulletMANSER, E.; LEUNG, T.; SALIHUDDIN, H.; ZHAO, Z.; LIM, L. Nature, 1994, vol. 367, 40-46 [0007]

\bulletZHENG, Y.; BAGRODIA, S.; CERIONE, R.A. J. Biol. Chem., 1994, vol. 269, 18727-18730 [0007]

\bulletZHANG, J.; KING, W.G.; DILLON, S.; HALL, A.; FEIG, L.; RITTENHOUSE, S.E. J. Biol. Chem., 1993, vol. 268, 22251-4 [0007]

\bulletABO, A.; WEBB, M. R.; GROGAN, A.; SEGAL, A.W. Biochem. J., 1994, vol. 298, 585-591 [00071

\bulletKAWASAKI, H.; SUZUKI, K. Anal. Biochem., 1990, vol. 186, 264-268 [0007]

\bulletTOTTY, N.F.; WATERFIELD, M.D.; HSUAN, J. J. Prot, Sci., 1992, vol. 1, 1215-1224 [0007]

\bulletGRUSSENMEYER, T.; SCHEIDTMANN, K.H.; HUTCHINSON, M.A.; ECKHART, W.; GERNOT, W. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985, vol. 82, 7952-7954 [0007]

\bulletSHACTER, E. Anal. Biochem., 1984, vol. 138, 416-420 [0007]

\bulletCOOPER, A.J.; SEFTON, B.M.; HUNTER, T. Methods in Enzymology, 1983, vol. 99, 37 [0007]

\bulletMANSER, E.; LEUNG, T.; MONFRIES, C.; TEO, M.; HALL, C.; LIM, L. J. Biol. Chem., 1992, vol. 267, 16025-16028 [0007]

\bulletRAMER, S.W.; DAVIS, R.W. Proc. Nat. Acad. Sci, U.S.A., 1993, vol. 90, 452-456 [0007]

\bulletAVRUCH, J.; ZHANG, X.; KYRIAKIS, J. Trend. Biochem. Sci., 1994, vol. 19, 279-284 [0007]

\bulletLEBERER, E.; DIGNARD, D.; HARCUS, D.; THOMAS, D.Y.; WHITEWAY, M. EMBO J., 1992, vol. 11, 4805-4813 [0007]

\bulletERREDE, B.; LEVIN, D.E. Curr. Opin. Cell Biol., 1993, vol. 5, 254-260 [0007]

\bulletERREDE, B.; GARTNER, A.; ZHOU, Z.; NASMYTH, K.; AMMERER, G. Nature, 1993, vol. 362, 261-264 [0007]

\bulletLEBERER, E.; DIGNARD, D.; HARCUS, D.; HOUGAN, L.; WHITEWAY, M.; THOMAS, D.Y. Mal. Gen. Genet., 1993, vol. 241, 241-254 [0007]

\bulletSETTLEMAN, J.; ALBRIGHT, C.F.; FOSTER, LC.; WEINBERG, R. A. Nature, 1992, vol. 359, 153-154 [0007]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0017]

\bulletDAYHOFF, M.O. Atlas of Protein Sequence and Structure, 1972, vol. 5, 101-110 [0028]

\bulletSMITH; WATERMAN. Adv. Appl. Math., 1981, vol. 2, 482 [0030]

\bulletNEEDLEMAN; WUNSCH. J. Mol. Biol., 1970, vol. 48, 443 [0030]

\bulletPEARSON; LIPMAN. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, vol. 85, 2444 [0030]

\bullet The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms. McGraw-Hill, 1985 [0041]

\bulletSAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning. 1989 [0043]

\bulletSAIKI et al. Science, 1985, vol. 230, 1350-1354 [0046]

\bulletSAIKI et al. Nature, 1986, vol. 324, 163-166 [0046]

\bulletSCHARF et al. Science, 1986, vol. 233, 1076-1078 [0046]

\bullet PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification. Freeman Press, 1992 [0046]

\bullet PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, 1990 [0046]

\bulletMATTILA et al. Nucleic Acids Res., 1991, vol. 19, 4967 [0046]

\bulletECKERT, K.A.; KUNKEL, T.A. PCR Methods and Applications, vol. 1, 17 [0046]

\bullet PCR. IRL Press [0046]

\bulletMANIATIS et al. Science, 1987, vol. 236, 1237 [0050] [0050]

\bulletALBERTS et al. Molecular Biology of the Cell. 1989 [0050]

\bulletDIJKEMA et al. EMBO J., 1985, vol. 4, 761 [0050]

\bulletGORMAN et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1982, vol. 79, 6777 [0050]

\bulletBOSHART et al. Cell, 1985, vol. 41, 521 [0050]

\bulletSASSONE-CORSI; BORELLI. Trends Genet., 1986, vol. 2, 215 [0050]

\bulletRUBINFELD, B. Cell, 1991, vol. 65, 1033-1042 [0055]

\bulletLUCKOW; SUMMERS. Virology, 1989, vol. 17, 31 [0056]

\bulletMILLER et al. Ann. Rev. Microbiol., 1988, vol. 42, 177 [0057]

\bulletRAIBAUD et al. Annu. Rev. Genet., 1984, vol. 18, 173 [0059]

\bulletCHANG et al. Nature, 1977, vol. 198, 1056 [0060]

\bulletGOEDDEL et al. Nuc. Acids Res., vol. 8, 4057[0060]

\bulletYELVERTON et al. Nucl. Acids Res., 1981, vol. 9, 731 [0060]

\bulletSHIMATAKE et al. Nature, 1981, vol. 292, 128 [0060] [0072]

\bulletAMANN et al. Gene, 1983, vol. 25, 167 [0061]

\bulletDE BOER et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1983, vol. 80, 21 [0061]

\bulletSTUDIER et al. J. Mol. Biol, 1986, vol. 189, 113 [0061] [0072]

\bulletTABOR et al. Proc Natl. Acad. Sci., 1985, vol. 82, 1074 [0061]

\bulletSHINE et al. Nature, 1975, vol. 254, 34 [0062]

\bulletSTEITZ et al. Biological Regulation and Development: Gene Expression. 1979 [0062]

\bullet Expression of cloned genes in Escherichia coli. SAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1989 [0062]

\bulletNAGAI et al. Nature, 1984, vol. 309, 810 [0064]

\bulletJIA et al. Gene, 1987, vol. 60, 197 [0064]

\bulletALLEN et al. J. Biotechnol, 1987, vol. 5, 93 [0064]

\bulletMAKOFF et al. J. Gen. Microbiol., 1989, vol. 135, 11 [0064]

\bulletMILLER et al. Bio/Technology, 1989, vol. 7, 698 [0064]

\bulletMASUI et al. Experimental Manipulation of Gene Expression, 1983 [0066]

\bulletGHRAYEB et al. EMBO J., 1984, vol. 3, 2437[0066]

\bulletOKA et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1985, vol. 82, 7212 [0066]

\bulletPALVA et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, vol. 79, 5582 [0066] [0072] [0073]

\bulletDAVIES et al. Annu. Rev. Microbiol., 1978, vol. 32, 469 [0070]

\bulletAMANN et al. Gene, 1985, vol. 40, 183 [0072]

\bulletPOWELL et al. Appl. Environ. Microbial, 1988, vol. 54, 655 [0072] [0072] [0073]

\bulletMASSON et al. FEMS Microbial. Lett., 1989, vol. 60, 273 [0073]

\bulletMILLER et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1988, vol. 85, 856 [0073]

\bulletWANG et al. J. Bacterial., 1990, vol. 172, 949 [0073]

\bulletCOHEN et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1973, vol. 69, 2110 [0073]

\bullet DOWER et al. Nucleic Acids Res., 1988, vol. 16, 6127 [0073]

\bullet An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids. KUSHNER. Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering. 1978 [0073]

\bulletMANDEL et al. J. Mol. Biol., 1970, vol. 53, 159[0073]

\bulletTAKETO. Biochim. Biophys. Acta, 1988, vol. 949, 318 [0073]

\bulletCHASSY et al. FEMS Microbiol. Lett., 1987, vol. 44, 173 [0073]

\bulletFIEDLER et al. Anal. Biochem, 1988, vol. 170, 38 [0073]

\bulletAUGUSTIN et al. FEMS Microbial. Lett., 1990, vol. 66, 203 [0073]

\bulletBARANY et al. J. Bacteriol., 1980, vol. 144, 698 [0073]

\bullet Transformation of Streptococcus lactis by electroporation. HARLANDER. Streptococcal Genetics. 1987 [0073]

\bulletPERRY et al. Infec. Immun., 1981, vol. 32, 1295 [0073]

\bulletSOMKUTI et al. Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology, 1987, vol. 1, 412 [0073]

\bulletBOWIE et al. Science, 1991, vol. 253, 164 [0075]

\bullet Proteins, Structures and Molecular Principles. W.H. Freeman and Company, 1984 [0079] [0102]

\bullet C. BRANDEN; J. TOOZE. Introduction to Protein Structure. Garland Publishing, 1991 [0079]

\bulletTHORNTON et al. Nature, 1991, vol. 354, 105 [0079]

\bulletFAUCHERE, J. Adv. Drug Res., 1986, vol. 15, 29 [0081]

\bulletVEBER; FREIDINGER. TINS, 1985, 392 [0081]

\bulletEVANS et al. J. Med. Chem, 1987, vol. 30, 1229 [0081]

\bulletSPATOLA, A.F. Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins. Marcel Dekker, 1983, 267 [0081]

\bulletSPATOLA, A.F. Peptide Backbone Modifications. Vega Data, March 1983, vol. 1 (3 [0081]

\bulletMORLEY, J.S. Trends Pharm Sci, 1980, 463-468 [0081]

\bulletHUDSON, D. et al. Int J Pept Prof Res, 1979, vol. 14, 177-185 [0081)

\bulletSPATOLA, A.F. et al. Life Sci, 1986, vol. 38, 1243-1249 [0081]

\bulletHANN, M.M. J Chem Soc Perkin Trans 1982, 307-314 [0081]

\bulletALMQUIST, R.G. et al. J Med Chem, 1980, vol. 23, 1392-1398 [0081]

\bulletJENNINGS-WHITE, C. et al. Tetrahedron Lett, 1982, vol. 23, 2533 [0081]

\bulletHOLLADAY, M.W. et al. Tetrahedron Lett, 1983, vol. 24, 4401-4404 [0081]

\bulletHRUBY, V.J. Life Sci, 1982, vol. 31, 189-199 [0081]

\bulletRIZO; GIERASCH. Ann. Rev. Biochem., 1992, vol. 61, 387 [0082]

\bulletBENTON; DAVIS. Science, 1978, vol. 196, 180 [0083]

\bulletRAHEMTULLA et al. Nature, 1991, vol. 353, 180 [0086]

\bulletJASIN et al. Genes Devel., 1990, vol. 4, 157 [0086]

\bulletKOH et al. Science, 1992, vol. 256, 1210 [0086]

\bulletMOLINA et al. Nature, 1992, vol. 357, 161 [0086]

\bulletGRUSBY et al. Science, 1991, vol. 253, 1417 [0086]

\bulletBRADLEY et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 534 [0086]

\bulletHOGAN et al. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 [0087]

\bullet Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. IRL Press, 1987 [0087] [0087]

\bulletZJILSTRA et al. Nature, 1989, vol. 342, 435 [0087]

\bulletSCHWARTZBERG et al. Science, 1989, vol. 246, 799 [0087]

\bulletWINNACKER. From Genes to Clones: Introduction to Gene Technology. VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1987 [0089]

\bulletSHAKIN. J. Biochemistry, 1986, vol. 261, 16018 [0089]

\bulletKADONAGA; TIJAN. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, vol. 83, 5889 [0105]

\bulletKUNTZ et al. J. Mol. Biol., 1982, vol. 161, 269 [0109]

\bulletKUNTZ ID. Science, 1992, vol. 257, 1078 [0109]

\bulletHUANG; ERIKSON. Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, vol. 91, 8960-8963 [0115]

\bulletMACDONALD et al. Mot. Cell. Biol., 1993, vol. 13, 6615 [0170]

\bulletKOLCH et al. Nature, 1993, vol. 364, 249 [0170]

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Abo, Arie Martin, George

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PAK65 humana

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Cooley Godward et al.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Five Palo Alto Square

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Palo Alto

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: CA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EEUU

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 94306

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC Compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 06 enero 1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Mendlein, John D., Ph. D.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 38.770

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: ONYX-006/00US

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2248 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: hPAK65

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 391..1908

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1

1

2

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 506 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2

7

8

9

Claims (15)

1. Molécula de ácido nucleico aislada purificada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína serina quinasa p65 activada por proteína p21 humana (hPAK65) o un fragmento de la misma que comprende uno o más dominios estructurales o funcionales de la proteína hPAK65, seleccionada del grupo:

(a) la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 1

(b) la secuencia de ácido nucleico que contiene sustituciones de de codones degenerados dentro de la secuencia codificante de la proteína PAK65 de SEC ID Nº: 1;

(c) secuencias de ácido nucleico variantes que tienen una identidad de secuencia de al menos el 95% con la SEC ID Nº: 1 a lo largo de la longitud completa de la misma y que dan como resultado polipéptidos de hPAK65 que conservan la función de una proteína hPAK65; y

(d) una secuencia de ácido nucleico capaz de codificar la secuencia de aminoácidos de la proteína hPAK65 de SEC ID Nº: 2.

2. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1 en la que la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de ADNc que codifica la proteína hPAK65 que se muestra en la SEC ID Nº: 1.

3. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha secuencia complementaria es homóloga a toda la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Fragmento de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que codifica un polipéptido que comprende al menos 70 aminoácidos, en el que dicho polipéptido es capaz de la unión específica a un polipéptido p21 o conserva la actividad quinasa de hPAK65.

5. Fragmento de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que codifica la secuencia de los aminoácidos 42-113 de SEC ID Nº: 2 de la proteína hPAK65, o que codifica la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 10 de la proteína hPAK65, o que codifica la secuencia de los aminoácidos 1 a 481 de SEC ID Nº: 2 de la proteína hPAK65.

6. Vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

7. Célula hospedadora transformada con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un vector de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la molécula de ácido nucleico está (a) en asociación operativa con una secuencia de control de la expresión capaz de dirigir la expresión de dicha molécula, o está (b) opcionalmente interrumpida, codifica hPAK65 y está flanqueada por al menos una secuencia de ADN de tipo no salvaje 5' a 3' en la secuencia codificante de hPAK65.

9. Polipéptido de hPAK65 que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Polipéptido de hPAK65 que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 90% con la secuencia que se muestra en SEC ID Nº: 2 a lo largo de la longitud completa de la misma.

11. Polipéptido hPAK65 que tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 2.

12. Polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del aminoácido 49 al 113 de SEC ID Nº: 2.

13. Procedimiento para producir un polipéptido de hPAK65, que comprende cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8 en un medio de cultivo adecuado, y aislar el polipéptido de hPAK65.

14. Procedimiento para identificar un compuesto que inhibe la actividad proteína quinasa de hPAK65, comprendiendo dicho procedimiento administrar un compuesto a una mezcla de reacción que comprende un polipéptido de hPAK65 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 que tiene actividad serina quinasa; sustrato sustancialmente purificado de quinasa hPAK65; y ATP marcado; y determinar el grado en el que el compuesto inhibe la fosforilación del sustrato de hPAK65 en comparación con una reacción de control que carece del
compuesto.

15. Procedimiento para identificar agentes que inhiben la actividad de unión a p21 de proteínas hPAK65, comprendiendo dicho procedimiento administrar un agente junto con una proteína p21 sustancialmente purificada a una mezcla de reacción que comprende un polipéptido de hPAK65 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 que tiene actividad de unión a rac1, y determinar el grado en el que el agente inhibe la unión de la proteína p21 al polipéptido de hPAK65 en comparación con una reacción de control que carece del agente.