ES2217815T3

ES2217815T3 - Sustancia gm-95, procedimiento pra su fabricacion y su utilizacion.

Info

Publication number: ES2217815T3
Application number: ES99949337T
Authority: ES
Inventors: Haruo Seto; Kazuo Shin-Ya; Konstanty Wierzba
Original assignee: Sosei Co Ltd
Current assignee: Sosei Co Ltd
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-20
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2019-10-20
Also published as: KR100446323B1; CA2346201A1; DE69917668D1; EP1123937B1; DE69917668T2; KR20010103610A; ATE267832T1; US6613759B1; PT1123937E; WO2000024747A1; EP1123937A1; US7192763B2; US20030191165A1; AU6227799A; DK1123937T3; AU770166B2; CA2346201C; EP1123937A9

Abstract

Compuesto representado por la siguiente fórmula (1). **(fórmula)**. Los inventores de la presente invención han estudiado varios compuestos producidos por microorganismos y han hallado que una sustancia que tiene actividades antitumorales se producía en un caldo de cultivo de la cepa 3533-SV4 que pertenece al género Streptomyces. Subsiguientemente, los inventores tuvieron éxito en aislar el producto activo, determinaron sus propiedades fisicoquímicas y su estructura, y comprobaron sus efectos antitumorales, para así conseguir la presente invención. La presente invención proporciona, además, un procedimiento para producir la Sustancia GM-95, que comprende cultivar un microorganismo que pertenece al género Streptomyces y es capaz de producir la Sustancia GM-95 en un medio de cultivo, y aislar la sustancia a partir del caldo de cultivo resultante.

Description

Sustancia GM-95, procedimiento para su fabricación y su utilización.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo compuesto que presenta efectos antitumorales y es útil como medicamento, a un procedimiento para su fabricación y a microorganismos que producen la sustancia.

Antecedentes de la técnica

Ejemplos conocidos de un macrólido que tiene dos o más anillos de oxazol incluyen las Ulapualidas A y B (Journal of the American Chemical Society, 108, 846-847, 1986) que se extraen de los nudibránquios (caracoles marinos sin concha del suborden Nudibranchia que tienen unos apéndices respiratorios externos, a menudo ramificados en el dorso y los lados) y poseen actividades antitumorales, y la Kabiramida C (Journal of the American Chemical Society, 108, 847-849, 1986) que también se extrae de los nudibránquios y tiene efectos antifúngicos.

A través de los documentos US-A-5567709 y EP-A-269322 se conocen macrólidos que tienen actividad antitumoral producidos por microorganismos del género Streptomyces.

Un objeto de la presente invención es obtener, utilizando un microorganismo, un nuevo compuesto que tiene efectos antitumorales y que es útil como medicamento, un procedimiento para producir el mismo, y microorganismos capaces de producir el nuevo compuesto que tiene efectos antitumorales.

Exposición de la invención

Los inventores de la presente invención han estudiado varios compuestos producidos por microorganismos y han hallado que una sustancia que tiene actividades antitumorales se producía en un caldo de cultivo de la cepa 3533-SV4 que pertenece al género Streptomyces. Subsiguientemente, los inventores tuvieron éxito en aislar el producto activo, determinaron sus propiedades fisicoquímicas y su estructura, y comprobaron sus efectos antitumorales, para así conseguir la presente invención.

La presente invención proporciona un compuesto de la siguiente fórmula (1).

1

El compuesto anterior se denominará en lo sucesivo "Sustancia GM-95".

La presente invención proporciona, además, un procedimiento para producir la Sustancia GM-95, que comprende cultivar un microorganismo que pertenece al género Streptomyces y es capaz de producir la Sustancia GM-95 en un medio de cultivo, y aislar la sustancia a partir del caldo de cultivo resultante.

La presente invención proporciona también un medicamento y un agente antitumoral que comprende la Sustancia GM-95 como principio activo.

La presente invención proporciona, asimismo, una composición farmacéutica que comprende la Sustancia GM-95 y un portador farmacéuticamente aceptable para la misma.

La presente invención se refiere, además, a la utilización de la Sustancia GM-95 para la fabricación de un medicamento destinado a la terapia de tumores.

Asimismo, la presente invención proporciona microorganismos capaces de producir la Sustancia GM-95, más específicamente microorganismos que pertenecen al género Streptomyces.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un espectro de absorción en el ultravioleta del presente compuesto tal como se obtiene en los Ejemplos.

La Figura 2 muestra un espectro de absorción en el infrarrojo del presente compuesto tal como se obtiene en los Ejemplos.

La Figura 3 muestra un espectro de ^{1}H-RMN del presente compuesto tal como se obtiene en los Ejemplos.

La Figura 4 muestra un espectro de ^{13}C-RMN del presente compuesto tal como se obtiene en los Ejemplos.

Mejor modo de poner en práctica la invención

Las propiedades fisicoquímicas de la Sustancia GM-95 representada por la fórmula anterior (1) son las siguientes:

1) Fórmula molecular: Cuando se mide por espectrometría de masas de bombardeo atómico rápido, de alta resolución, se revela el valor medido de (M+H)^{+} de 583,0790, y la fórmula molecular que corresponde al valor es C_{26}H_{15}N_{8}O_{7}S.

2) Peso molecular: Cuando se mide por espectrometría de masas de bombardeo atómico rápido, se revela el valor medido de 582,0712.

3) Punto de fusión: 138-143ºC (con descomposición)

4) Rotación específica: [\alpha]_{D}^{20} = -9,38º, determinada a la concentración de C = 0,129 g/100 ml (metanol).

5) Espectro de absorción en el ultravioleta: mostrado en la Figura 1.

La medición se realizó en metanol (en una disolución 7,39 \muM). La absorción máxima se hallaba a la longitud de onda de 259,5 nm y la absorbancia a dicha longitud de onda era de 0,288. El coeficiente de absorción molar (\varepsilon) era 38982.

6) Espectro de absorción en el infrarrojo (FT-IR): mostrado en la Figura 2.

\numax (cm-^{1}): 3421, 3147, 2958, 2923, 2854, 1733, 1670, 1650, 1544, 1496, 1438, 1392, 1351, 1315, 1267, 1199, 1174, 1118, 1087, 1058, 1033, 975, 943, 929, 914, 883, 798

7) Solubilidades en disolventes

\hskip0,9cm

Insoluble en agua y en acetona.

\hskip0,9cm

Soluble en una mezcla de cloroformo:metanol = 1:1

8) Color de la sustancia: polvos de color blanco amarillento

9) Espectro de resonancia magnética nuclear

Los desplazamientos químicos del espectro de ^{1}H-RMN a 500 MHz (Figura 3) y el espectro de ^{13}C-RMN a 125 MHz (Figura 4) medidos en disolución en una mezcla de cloroformo deuterado:metanol deuterado = 1:1 a 25ºC se muestran a continuación.

TABLA 1

2

3

4

(10) Tiempo de retención (Rt) en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC):

Se detectó un pico a un tiempo de 6,1 minutos en el análisis bajo las siguientes condiciones.

Condiciones analíticas:

: Columna: ODS PEGASIL (4,6 mm de diámetro interno x 250 mm, Senshu Scientific Co.)

: Fase móvil: acetonitrilo/ácido trifluoroacético/agua (70:0,1:30, v/v/v)

: Velocidad de flujo: 1 ml/minuto

: Detección: 254 nm.

La Sustancia GM-95 de la presente invención se puede obtener cultivando una cepa de microorganismo capaz de producir la sustancia de la invención (denominado de aquí en adelante microorganismo productor de la sustancia GM-95) bajo condiciones apropiadas, típicamente bajo las condiciones que se indican más adelante. La presente invención también abarca el microorganismo productor de la sustancia GM-95.

Ejemplos del microorganismo productor de la sustancia GM-95 incluyen cepas de un microorganismo que pertenece al género Streptomyces. La presente invención también abarca la Sustancia GM-95 que se puede obtener cultivando un microorganismo del género Streptomyces y recuperando el caldo de cultivo.

Un ejemplo de las cepas del microorganismo que pertenece al género Streptomyces es la cepa 3533-SV4 del Streptomyces anulatus, y mutantes de la misma. La cepa 3533-SV4 del Streptomyces anulatus es una cepa de un microorganismo que pertenece al género Streptomyces y que ha sido recientemente aislada por los inventores a partir del suelo en Tensui-machi, Tamana-gun, Kumamoto-ken, Japón, y ha sido depositada en el "National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology" (1-3 Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) el 12 de agosto de 1998 bajo la designación de microorganismo: Streptomyces anulatus 3533-SV4(GM95) (referencia de Identificación dada por el DEPOSITANTE) y el número de depósito de FERM BP-6460.

La identificación del Streptomyces anulatus 3533-SV4 y la investigación de sus características microbiológicas se realizó de acuerdo con el método del "International Streptomyces Project (ISP)". Las características microbiológicas de la cepa 3533-SV4 del Streptomyces anulatus son las siguientes.

a) Características morfológicas

La cepa se hizo crecer sobre medios ISP (International Streptomyces Project) nº 2, nº 3, nº 4 y nº 5 a 27ºC durante 14 días. Los resultados son los siguientes:

1) Ramificación de las hifas en proceso de esporulación: ramificación simple

2) Forma de esporulación: espirales, siendo la forma de las esporas cilíndrica

3) Número de esporas: de 10 a 50, o más

4) Superficie de las esporas: lisa

5) Tamaño de la espora: 0,3-0,5 x 0,7-1,0 \mum

6) Presencia de flagelados: no presentes

7) Presencia de esporangios: no presentes

8) Sitio de asentamiento de los esporoforos: micelio aéreo

9) Posesión de capacidad formadora de esclerocios: ninguna posesión

b) Características del cultivo sobre diversos medios

En la Tabla 2 se muestran las características de cultivo de la cepa sobre diversos medios. Los tonos de color relacionados con las propiedades de los medios mostrados en la Tabla 2 se indican de acuerdo con "The Color Harmony Manual" (edición de 1958) publicado por la "Container Corporation of America".

TABLA 2

5

c) Características fisiológicas

1) Intervalo de temperaturas para el crecimiento: 20 - 32ºC

: Temperatura óptima: 20 - 30ºC

2) Licuefacción de gelatina: +

3) Hidrólisis de almidón: +

4) Coagulación y peptonización de leche desnatada: +

5) Producción de pigmentos melanoides:

: Medio de agar de tirosina: -

: Medio de agar férrico de levadura y peptona: -

: Medio de caldo de levadura y triptona: +

6) Reducción de nitratos: +

7) Asimilación de fuentes de carbono (medio de agar de Pridham Gottlieb, (ISP nº9))

	L-arabinosa	+
	D-xilosa	+
	D-glucosa	+
	D-fructosa	+
	Sacarosa	+
	Inositol	+
	L-ramnosa	+
	Rafinosa	+
	D-manitol	+

d) Quimiotaxonomía

Los productos de la hidrólisis ácida de las células enteras fueron analizados por cromatografía en capa fina descrita en "The Society for Actinomycetes, Japan (ed.)", [``Experimental Method for Identifying Actinomycetes, 6-2-70, 1985]. Como resultado, se detectó la forma LL- del ácido diaminopimélico.

El micelio base de esta cepa no está fragmentado. El micelio aéreo forma un eje principal largo y una cadena de esporas espiral que consiste en 10-50 o más esporas y tienen 4-9 rotaciones sobre las puntas de cada micelio, irregularmente ramificadas a partir del eje. Las esporas carecen de motilidad, tienen una forma columnar o elíptica, una anchura de 0,3 - 0,5 \mum, una longitud de 0,7 - 1,0 \mum y una superficie lisa. No se observan ni esclerocio, ni esporangios ni otras formas específicas. El quimiotipo de la pared celular es del tipo (I).

En la Tabla 2 se muestran las propiedades del cultivo. El tono de color del micelio aéreo pertenece a la gama cromática de amarillos. El tono de color del micelio base es incierto y no es afectado por el cambio de pH. No se observa ningún pigmento soluble en conjunto. Las propiedades fisiológicas son las que se describen en el apartado anterior c). Esta cepa es mesófila. De acuerdo con las propiedades morfológicas y el quimiotipo de la pared celular de esta cepa, se determina que la cepa pertenece al género Streptomyces (de aquí en adelante abreviado "S.").

Basándose en las propiedades anteriores, se buscaron las especies del género S. descritas en [Approved Lists of Bacterial Names, 1980] y en las listas subsiguientes de nombres bacterianos disponibles, y se seleccionaron las especies relacionadas. Comparado con las propiedades de diagnóstico del S. spheroides, las propiedades de la cepa de la invención y el S. spheroides son casi iguales, y distintas sólo en la asimilación de las fuentes de carbono.

De acuerdo con lo expuesto, la cepa de la invención es una nueva cepa que se parece estrechamente al S. spheroides. Sin embargo, el S. spheroides viene definido como un sinónimo del S. anulatus por Williams et al. en "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", vol. 4. Por consiguiente, la cepa 3533-SV4 de la invención se identifica como una cepa que pertenece al S. anulatus y se denomina cepa 3533-SV4 del Streptomyces anulatus.

A continuación se incluyen comparaciones entre la cepa y la especie relacionada.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

6

La Sustancia GM-95 de la presente invención se puede producir cultivando diversos microorganismos productores de sustancia GM-95, por ejemplo, pertenecientes al género Streptomyces, tales como la cepa 3533-SV4 o un mutante de la misma, que tengan las características microbiológicas anteriores, en un medio adecuado, separando de un caldo de cultivo un extracto bruto que contiene la sustancia de la invención, y aislando y purificando la Sustancia GM-95 a partir del extracto bruto. El caldo de cultivo contiene un filtrado del cultivo y fracciones celulares sólidas.

El cultivo del microorganismo de la invención se lleva a cabo de acuerdo con el procedimiento de cultivo convencional y, por lo general, se lleva preferentemente a cabo en condiciones aerobias en un medio fluido por un proceso de cultivo por vibración o un proceso de cultivo por centrifugación en medio aerobio, y procesos análogos. Como medio de cultivo que se puede utilizar, se puede emplear cualquier medio que contenga fuentes de nutrientes que el microorganismo productor de la sustancia GM-95 pueda utilizar, y cabe emplear una variedad de medios sintéticos y medios naturales. La fuente de carbono agregada al medio incluye glucosa, sacarosa, fructosa, glicerina, dextrina, almidón, melazas, agua de remojo del maíz, ácidos orgánicos, etc., y estas fuentes se pueden utilizar solas o en combinación. La fuente de nitrógeno incluye sustancias nitrogenadas orgánicas tales como medios Pharma, peptona, extracto de carne, extracto de levadura, harina de soja, caseína, aminoácidos, urea, etc., y sustancias nitrogenadas inorgánicas tales como el nitrato sódico, el sulfato amónico, etc. Estas sustancias también se pueden utilizar solas o en combinación. Cuando sea necesario, el medio se puede complementar adecuadamente con sales sódicas, sales potásicas, sales magnésicas, fosfatos y sales de metales pesados.

Cuando en el curso del cultivo se produce un espumado copioso, puede agregarse al medio un agente antiespumante. Ejemplos de agentes antiespumantes son aceites vegetales como, por ejemplo, el aceite de soja, el aceite de lino, etc., alcoholes superiores como, por ejemplo, el octadecanol, el tetradecanol, el heptadecanol, etc., y diversos compuestos de silicio.

El valor del pH del medio se controla preferentemente alrededor de la neutralidad. La temperatura de cultivo debe mantenerse dentro del intervalo adecuado para el crecimiento del microorganismo productor de la sustancia GM-95, generalmente 20-32ºC, preferentemente alrededor de 25-30ºC. El tiempo de cultivo es preferentemente de 2 a 6 días tanto para el proceso de cultivo por vibración como para el proceso de cultivo por centrifugación en medio aerobio.

Las diversas condiciones de incubación explicadas anteriormente se pueden modificar adecuadamente de acuerdo con el tipo y las características del microorganismo utilizado, las condiciones externas, y análogos, y las condiciones óptimas se pueden seleccionar entre, y controlar dentro de, los intervalos anteriores.

La separación de un extracto bruto que contiene la Sustancia GM-95 a partir del caldo de cultivo se puede lograr de acuerdo con el procedimiento convencional para aislar productos de fermentación. Por ejemplo, procesos habituales tales como la extracción con disolventes, la cromatografía, la cristalización, etc. se pueden utilizar individualmente o en una secuencia y combinación adecuadas.

Más específicamente, se puede utilizar el siguiente método. Dado que la Sustancia GM-95 producida en el curso del cultivo existe principalmente en el filtrado del cultivo y los gránulos de células, el caldo de cultivo se filtra o se centrifuga de una manera convencional para separar la fracción celular sólida del filtrado del cultivo. Seguidamente, la Sustancia GM-95 se eluye de la fracción celular sólida que contiene la Sustancia GM-95 utilizando un disolvente tal como metanol, acetona, etc. Subsiguientemente, el disolvente se elimina por destilación a presión reducida para proporcionar el concentrado bruto que contiene la Sustancia GM-95. Al concentrado bruto se agrega acetato de etilo, cloroformo, butanol o un disolvente orgánico insoluble en agua, de este tipo, para transferir la Sustancia GM-95 a la capa de disolvente orgánico, y luego la capa de disolvente se deshidrata agregando mirabilita. Seguidamente, el disolvente se elimina por destilación a presión reducida para proporcionar el extracto bruto que contiene la Sustancia GM-95. Adicionalmente, la Sustancia GM- 95 contenida en el filtrado del cultivo también se puede transferir a la capa de disolvente orgánico, tal como se ha expuesto anteriormente, para proporcionar el extracto bruto. Opcionalmente, se pueden realizar etapas tales como ajustar el pH con hidróxido sódico o ácido clorhídrico, aumentar la eficacia de la extracción y evitar la producción de emulsiones agregando sal industrial, etc.

La Sustancia GM-95 se puede aislar y purificar a partir del extracto bruto anterior por el procedimiento convencional para el aislamiento y la purificación de sustancias lipófilas de bajo peso molecular, tal como la cromatografía de adsorción utilizando carbón activado, gel de sílice, alúmina, resinas adsorbentes macroporosas no iónicas o adsorbentes análogos, la cromatografía de fase inversa utilizando gel de sílice ligado a ODS, o análogos. Entre esas técnicas, son particularmente útiles la cromatografía sobre gel de sílice utilizando como eluyente cloroformo o una mezcla de cloroformo/acetato de metilo, cloroformo/metanol, cloroformo/acetona, benceno/acetona, etc., y la cromatografía de fase inversa utilizando como eluyente acetonitrilo o una mezcla de metanol/0,05% de ácido trifluoroacético, o fosfato monopotásico 10 mM etc.. Es más, cuando se precisa una purificación adicional, el procedimiento cromatográfico anterior se puede repetir o se puede llevar a cabo en combinación con la cromatografía en columna utilizando Sephadex LH-20 (Pharmacia) y cloroformo, metanol etc., como eluyente, o técnicas análogas. Por el procedimiento anterior, se puede obtener Sustancia GM-95 de un alto grado de pureza.

Para la identificación de la Sustancia GM-95 durante el procedimiento de purificación, se puede llevar ventajosamente a cabo la detección por cromatografía en capa fina y cromatografía líquida de alta resolución, combinadas.

La Sustancia GM-95 de la invención presenta actividades antitumorales, y su eficacia como agente antitumoral ha sido confirmada.

Para utilizar la Sustancia GM-95, purificada de la manera descrita anteriormente, en forma de una composición farmacéutica, se procesa en una forma de dosificación farmacéuticamente adecuada de acuerdo con la aplicación pretendida. La forma de dosificación incluye formas de dosificación oral tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, gránulos finos, líquidos y disoluciones, píldoras, emulsiones, suspensiones, etc., y formas de dosificación parenteral, tales como inyecciones, así como supositorios, pomadas, emplastos, cataplasmas, aerosoles, soluciones oftálmicas, etc. Estas formas de dosificación se pueden fabricar por procedimientos conocidos y comúnmente utilizados por una persona experta en la materia.

En la fabricación de preparaciones sólidas para la administración oral, al principio activo de la invención se agrega un excipiente y opcionalmente un aglutinante, un desintegrante, un lubricante, un agente colorante, un correctivo, un correctivo del aroma, etc., y los comprimidos, las cápsulas, los polvos, los gránulos, los gránulos finos, etc. se pueden fabricar de la manera habitual. Ejemplos del excipiente incluyen lactosa, sacarosa, almidón, talco, estearato magnésico, celulosa cristalina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, glicerina, alginato sódico, acacia, etc., y del aglutinante incluyen alcohol polivinlílico, éter polivinílico, etilcelulosa, acacia, laca, azúcar blanco, etc., y del desintegrante incluyen almidón seco, alginato sódico, polvo de agar, bicarbonato sódico, carbonato cálcico, laurilsulfato sódico, monoestearato de glicerilo, lactosa, etc., y del lubricante incluyen estearato magnésico, talco, etc., y del correctivo incluyen azúcar blanco, cáscara de naranja amarga, ácido cítrico, ácido tartárico, etc. Se pueden utilizar agentes colorantes, correctivos del aroma y otros aditivos que son conocidos en el estado de la técnica. En caso necesario, tales comprimidos se pueden acondicionar adicionalmente en forma de comprimidos recubiertos formando una película de recubrimiento ordinario por un método conocido, por ejemplo comprimidos recubiertos de azúcar, comprimidos recubiertos de gelatina, comprimidos con recubrimientos entéricos, comprimidos recubiertos de una película, etc., y pueden ser comprimidos de doble capa, comprimidos de múltiples capas, etc.

En la fabricación de preparaciones líquidas para la administración oral, al principio activo de la invención se agrega un correctivo, un tampón, un estabilizador, un correctivo del aroma, etc. y las disoluciones, los jarabes y los elixires se pueden fabricar de la manera usual. Arriba se mencionan correctivos utilizables. El tampón que se puede utilizar incluye citrato sódico, etc., y el estabilizador incluye goma tragacanto, acacia, gelatina, etc.

En la fabricación de inyectables, al principio activo de la invención se agrega un diluyente, un agente de control del pH, un tampón, un estabilizador, un agente isotónico, un anestésico local, etc., y las inyecciones para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica o intraperitoneal se pueden fabricar de la manera usual. El diluyente que se puede utilizar incluye agua, alcohol etílico, macrogoles, propilenglicol, alcohol isoestearílico etoxilado, alcohol isoestearílico polioxilado, ésteres de ácidos grasos con polioxietilensorbitano, etc. El agente de control del pH o el tampón incluye citrato sódico, acetato sódico y fosfato sódico. El estabilizador incluye pirosulfito sódico, ácido etilendiaminotetraacético, ácido tioglicólico y ácido tioláctico, entre otras sustancias. El agente isotónico que se puede utilizar incluye cloruro sódico, glucosa, etc., y el anestésico local incluye clorhidrato de procaína, clorhidrato de lidocaína, etc.

En la fabricación de supositorios, al principio activo de la invención se agrega una base de supositorios, opcionalmente un tensioactivo, etc.; los supositorios se pueden fabricar de la manera usual. La base que se puede utilizar incluye excipientes grasos tales como los macrogoles, la lanolina, la manteca de cacao, triglicéridos de ácidos grasos, Witepsol.RTM (Dynamit Nobel), etc.

En la fabricación de pomadas, al principio activo de la invención se agrega, según se requiera, una base, un estabilizador, un agente humectante, un conservante, etc., y la mezcla y la formulación se procesan de la manera acostumbrada. La base incluye parafina líquida, parafina blanda blanca, cera de abejas blanca, alcohol octildodecílico y parafina; y el conservante incluye p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de etilo, p-hidroxibenzoato de propilo, etc.

En la fabricación de cataplasmas, éstos se pueden confeccionar recubriendo un soporte convencional con dicha pomada, crema, gel, pasta, etc. de una manera habitual. Los soportes incluyen telas tejidas o no tejidas de algodón, estambre de rayón hilado o fibra química, películas de cloruro de polivinilo, polietileno, poliuretano, etc., flexibles, y láminas espumadas de tales materiales.

En caso necesario, las formas de dosificación anteriormente descritas se pueden complementar con otros aditivos tales como colorantes, conservantes, perfumes, saborizantes, edulcorantes, etc., u otros principios medicinalmente activos.

La proporción de la sustancia de la invención en la composición farmacéutica de la invención no es tan crítica y se puede seleccionar libremente dentro de un amplio intervalo pero, hablando de una manera general, constituye preferentemente del 1-70% en peso en la composición farmacéutica.

No hay ninguna limitación sobre el modo de administración de la composición farmacéutica de la invención fabricada por los métodos anteriores. Así pues, un modo adecuado se puede seleccionar de acuerdo con la forma de dosificación particular, la edad y el sexo y otros factores del paciente, y la gravedad de la enfermedad. Las preparaciones en forma inyectable se pueden administrar por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía hipodérmica, por vía intradérmica o por vía intraperitoneal. En caso necesario, las inyecciones se pueden administrar por vía intravenosa íntimamente mezcladas con un líquido de perfusión intravenosa ordinario tal como una disolución de glucosa o una disolución de aminoácidos. Las preparaciones sólidas tales como los comprimidos, las píldoras, los gránulos, las cápsulas, etc. y las preparaciones líquidas para la administración oral, de la invención, se pueden administrar por vía oral o enteral. Los supositorios se pueden administrar en el recto.

La cantidad del compuesto activo de la invención que hay que formular en cada unidad de dosificación de las formas anteriores no se puede definir en términos generales, puesto que depende del estado clínico del paciente y de la forma de dosificación. Por lo general, la cantidad en cada forma de dosificación unitaria es preferentemente de alrededor de 1-1.000 mg para las preparaciones orales, de alrededor de 0,1-500 mg para las inyecciones, y de alrededor de 5-1.000 mg para los supositorios.

La posología diaria del compuesto activo en cualquiera de las formas de dosificación anteriores se puede seleccionar adecuadamente de acuerdo con el estado, el peso corporal, la edad, el sexo y otras condiciones del paciente. Normalmente, la dosis por día para un paciente adulto puede ser de alrededor de 0,1-1.000 mg/kg y preferentemente de alrededor de 1-100 mg/kg. Esta posología se puede administrar en una sola vez o en aproximadamente 2-4 dosis divididas por día.

Los tumores que se pueden tratar administrando las preparaciones que contienen la Sustancia GM-95 de la invención incluyen, pero no se limitan a, un tumor maligno sólido tal como el cáncer de cabeza y de cuello, el cáncer esofágico, el cáncer gástrico, el cáncer de colon, el cáncer rectal, el cáncer de hígado, el cáncer de la vesícula biliar o colangioma, el cáncer pancreático, el cáncer renal, el carcinoma pulmonar, el cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de vejiga, el cáncer de próstata, el tumor ensayoicular, el osteosarcoma, los tumores de los tejido blandos, el cáncer cervical, el cáncer de piel, los tumores del cerebro, etc., un linfoma maligno y la leucemia, preferentemente un tumor sólido maligno.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos de trabajo y ejemplos de ensayo ilustran la invención con mayor detalle.

Ejemplo 1 Preparación para la Sustancia GM-95 (a) Procedimiento de cultivo

Un tubo de ensayo (50 ml) se cargó con 15 ml de un medio de precultivo (pH 7,2) que contenía un 1,0% de almidón soluble, un 1,0% de polipeptona, un 1,0% de melazas y un 1,0% de extracto de carne, y después de la esterilización, el medio se inoculó con un asa impregnada de la cepa 3533-SV4 de Streptomyces anulatus (FERM BP-6460). El cultivo inoculado en el tubo de ensayo se sometió entonces a un proceso de cultivo por vibración a 27ºC sobre un vibrador de vaivén durante 2 días.

Seguidamente, un medio de producción (pH 7,2) que contenía un 2,0% de glicerina, un 1,0% de melazas, un 0,5% de caseína, un 0,1% de polipeptona y un 0,4% de carbonato cálcico se distribuyo en matraces cónicos de 500 ml de capacidad, a razón de 100 ml por matraz, y después de la esterilización (121ºC, 15 minutos), a cada uno de los matraces se agregó el cultivo de siembra anterior en una proporción del 2% (v/v). El contenido de los matraces se sometió a un proceso de cultivo vibratorio a 27ºC sobre un vibrador rotatorio durante 3 días (220 revoluciones por minuto, 7 cm de carrera).

Seguidamente, cada uno de tres recipientes de fermentación (Marubishi Bioengineering Co., Ltd.) de 50 litros de capacidad se cargó con 30.000 ml del medio de producción anterior. A los recipientes de fermentación se agregó un agente antiespumante (15 ml de Disfoam (CC-118, Nippon Oil and Fats Co., Ltd.), 15 ml de Silicona Shin-Etsu (KM-68-2F, Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) y 15 ml de aceite de ensalada (Ajinomoto, Co, Inc.)), y después de la esterilización (120ºC, 20 minutos), a cada uno de los recipientes de fermentación se agregó el cultivo de siembra anterior en una proporción del 2% (v/v). El contenido de los recipientes de fermentación se sometió a un proceso de cultivo a 27ºC durante 3 días (centrifugador aerobio: 400 rpm (agitación), 30 l/minuto (aireación)).

(b) Proceso de separación

El caldo de cultivo obtenido por el procedimiento anterior se cosechó en una cantidad de 84,0 l y se centrifugó para separar los gránulos de células. Después de desechar el fluido sobrenadante, los gránulos de células sedimentados se sometieron a una extracción de dos horas con acetona (10,0 l) bajo agitación frecuente. El extracto se separó por filtración y luego la extracción y la separación se repitieron con un volumen adicional de acetona de 5,0 l. Estos extractos acetónicos se combinaron y luego se destilaron y se concentraron hasta un volumen final de 2 l. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida hasta que la acetona y el agua se hubieron evaporado por completo. El residuo aceitoso obtenido se disolvió en 450 ml de metanol y, después de filtrar, se evaporó hasta sequedad a presión reducida.

(c) Proceso de aislamiento y purificación

El residuo aceitoso obtenido se disolvió en 400 ml de un disolvente mixto que comprendía cloroformo y metanol (20:1) (v/v). La disolución se aplicó a una columna de gel de sílice (Wakogel C-200 (tamaño de partícula 75-150 \mum), 6 cm de diámetro interno x 45 cm) y se eluyó con 5 l de un disolvente mixto de cloroformo/metanol preparado como anteriormente. Las fracciones que contenían un producto activo se eluyeron con un disolvente cloroformo/metanol (10:1) (v/v). Las fracciones que contenían un producto activo se reunieron y se evaporaron hasta sequedad a presión reducida. La sustancia purificada bruta se aplicó a una columna de gel de sílice (tamaño de partícula 75-150 \mum, 3,6 cm de diámetro interno x 30 cm) y se eluyó con una mezcla de cloroformo/metanol/ disolución acuosa de amoníaco al 29% (700:100:1) (v/v/v).

Se recogió un eluato que contenía un producto activo y se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en 10 ml de la fase móvil anterior y luego se sometió a una cromatografía líquida de alta resolución utilizando una columna ODS PEGASIL (Senshu Scientific Co., 20 mm de diámetro interno x 250 mm) (fase móvil: acetonitrilo/ ácido trifluoroacético/agua 70:0,1:30, v/v/v), velocidad de flujo: 10,0 ml/minuto, detección: 254 nm (en cubeta de UV de 0,5 mm)). El extracto se inyectó cada vez en una cantidad de 0,8 ml. Las fracciones que contenían la Sustancia GM-95 se recogieron y se evaporaron hasta sequedad a presión reducida.

El residuo se puso en suspensión en metanol al 10%/agua, y luego se aplicó a la columna ODS PEGASIL (Senshu Scientific Co., 1,0 cm de diámetro interno x 3 cm). Después de que la columna se hubo lavado con metanol al 10%/agua, la elución se llevó a cabo con metanol al 70%/agua. El eluato se eliminó por destilación a presión reducida, para proporcionar 3,2 mg de Sustancia GM-95.

Las fracciones que contenían la Sustancia GM-95 en cada etapa de la purificación se detectaron por cromatografía líquida de alta resolución utilizando una columna ODS PEGASIL (Senshu Scientific Co., 4,6 mm de diámetro interno x 250 mm) (fase móvil: acetonitrilo/ácido trifluoroacético/agua (70:0,1:30, v/v/v)), velocidad de flujo: 1,0 ml/minuto).

Las propiedades fisicoquímicas de la Sustancia GM-95 son las siguientes.

1) Fórmula molecular: Cuando se midió por espectrometría de masas de bombardeo atómico rápido, de alta resolución, se reveló el valor medido de (M+H)^{+} de 583,0790, y la fórmula molecular que corresponde al valor es C_{26}H_{15}N_{8}O_{7}S.

2) Peso molecular: Cuando se midió por espectrometría de masas de bombardeo atómico rápido se reveló el valor medido de 582,0712.

3) Punto de fusión: 138-143ºC (con descomposición)

5) Espectro de absorción en el ultravioleta: mostrado en la Figura 1.

La medición se realizó en metanol (en una disolución 7,39 \muM). La absorción máxima se encontraba a la longitud de onda de 259,5 nm y la absorbancia a esta longitud de onda era de 0,288. El coeficiente de absorción molar (\varepsilon) era 38982.

6) Espectro de absorción en el infrarrojo (FT-IR): mostrado en la Figura 2.

\numax (cm^{-1}): 3421, 3147, 2958, 2923, 2854, 1733, 1670, 1650, 1544, 1496, 1438, 1392, 1351, 1315, 1267, 1199, 1174, 1118, 1087, 1058, 1033, 975, 943, 929, 914, 883, 798.

7) Solubilidades en disolventes:

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Insoluble en agua y en acetona.

\hskip0,7cm

Soluble en una mezcla de cloroformo: metanol = 1:1

8) Color de la sustancia: polvos de color blanco amarillento

9) Espectro de resonancia magnética nuclear

Los desplazamientos químicos del espectro de ^{1}H-RMN a 500 MHz (Fig. 3) y el espectro de ^{13}C-RMN a 125 MHz (Fig. 4) medidos en la disolución de una mezcla de cloroformo deuterado:metanol deuterado = 1:1 a 25ºC se muestran a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4

7

Condiciones analíticas:

: Velocidad de flujo: 1 ml/minuto

: Detección: 254 nm.

De acuerdo con los datos fisicoquímicos anteriores, la estructura de la Sustancia GM-95 se identificó como se indica a continuación.

9

Ensayo farmacológico (efectos antitumorales)

Las células tumorales descritas en la Tabla 5 se pusieron en suspensión en un medio RPMI1640 que contenía un 10% de suero fetal de ternera, se sembraron en placas de cultivo (38 mm) a la densidad de 2 x 10^{3} células cada una y se cultivaron toda la noche a 37ºC en un incubador con un 5% de CO_{2},. Seguidamente, a cada una de las placas se añadieron los agentes experimentales (el compuesto de la invención y 5-fluorouracilo), diluidos a varias concentraciones utilizando medio RPMI1640 que contenía un 10% de suero fetal de ternera, y se prosiguió el cultivo por espacio de 72 horas más. Una vez terminado el cultivo de las células, éstas se fijaron con aldehído glutárico al 25% durante 15 minutos y se lavaron tres veces con agua. Después de esto, las células se tiñeron con violeta cristal al 0,05% diluido en una disolución acuosa de metanol al 20%, se lavaron tres veces con agua y luego se secaron. El violeta cristal se extrajo con 100\mul de fosfato monosódico 0,05 M/etanol (1/1 (v/v)) y se determinó su absorbancia a 540 nm por medio de un espectroscopio automático. ``La IC_{50} se definió como la concentración requerida para provocar una reducción del 50% en el crecimiento, en comparación con la absorbancia del control. Los resultados son los siguientes.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5 Concentraciones para producir un 50% de inhibición del crecimiento de diversas células tumorales (IC_{50} \muM)

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El compuesto de la presente invención podría inhibir el crecimiento in vitro de diversas células tumorales.

Ensayo farmacológico (efectos inhibidores sobre la telomerasa)

El compuesto de la invención se sometió al examen de actividad inhibitoria sobre la telomerasa utilizando extractos celulares que contenían telomerasa, de acuerdo con la manera convencional, para proporcionar la concentración necesaria para inhibir la actividad de la telomerasa en un 50% (IC_{50}) en los extractos celulares. Se demostró que el compuesto de la invención tenía un valor de la IC_{50} de 50 nM, y, por consiguiente, que poseía una actividad inhibitoria sumamente fuerte sobre la telomerasa.

La telomerasa apenas existe en las células normales, pero está ampliamente presente en diversos tumores malignos (hallada en el 85% o más de todos los tumores malignos que incluyen aquéllos que se originan en la región de la piel, la mama, el pulmón, el estómago, el páncreas, el ovario, el cuello, el útero, el riñón, la vejiga, el colon y la próstata, en el sistema nervioso central (CNS), en la retina y en el sistema de células hemáticas). El compuesto de la presente invención inhibe la actividad de dicho enzima, lo que sugiere que es útil como agente antitumoral que tiene un amplio espectro de aplicación.

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Ejemplo de formulación 1

Cápsulas

Sustancia GM-95	10 mg
Lactosa	50 mg
Almidón de maíz	47 mg
Celulosa cristalina	50 mg
Talco	2 mg
Estearato magnésico	1 mg
Por cápsula	160 mg

De acuerdo con la receta anterior, se fabricaron cápsulas de la manera convencional.

Ejemplo de formulación 2

Inyectables

Sustancia GM-95	5 mg
Agua destilada para inyectables	cantidad adecuada
Por ampolla	5 ml

De acuerdo con la receta anterior, se fabricaron inyectables de la manera convencional.

Ejemplo de formulación 3

Supositorios

Sustancia GM-95	20 mg
Witepsol W-35
(marca registrada de Dynamit Nobel Co. Ltd.)	1380 mg
Por supositorio	1400 mg

De acuerdo con la receta anterior, se fabricaron supositorios de la manera convencional.

Aplicabilidad industrial

La sustancia GM-95 de la presente invención presenta un efecto antitumoral excelente y es útil como fármaco terapéutico para tumores malignos. Además, el microorganismo productor de la sustancia GM-95 es útil porque es capaz de producir la Sustancia GM-95 que tiene un efecto antitumoral excelente.

Claims

1. Compuesto representado por la siguiente fórmula (1).

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2. Procedimiento para la fabricación de un compuesto según la reivindicación 1, que comprende cultivar un microorganismo que pertenece al género Streptomyces y es capaz de producir el compuesto según la reivindicación 1 en un medio de cultivo, y aislar el compuesto de un caldo de cultivo.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el microorganismo es la cepa 3533-SV4 del Streptomyces anulatus o un mutante de la misma.

4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el número de depósito del microorganismo es FERM BP-6460.

5. Medicamento que comprende el compuesto según la reivindicación 1 como principio activo.

6. Agente antitumoral que comprende el compuesto según la reivindicación 1 como principio activo.

7. Composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del compuesto según la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, destinada a la terapia de un tumor.

9. Utilización del compuesto según la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento destinado a la terapia de tumores.

10. Microorganismo capaz de producir el compuesto según la reivindicación 1, que es la cepa 3533-SV4 del Streptomyces anulatus, o un mutante de la misma.

11. Microorganismo según la reivindicación 10, que tiene el número de depósito FERM BP-6460.