ES2218009T3 - Procedimiento para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos utilizando bacterias corineformes. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos utilizando bacterias corineformes.Info
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Abstract
Procedimiento para la preparación de uno o varios de los L-aminoácidos, seleccionados del grupo de L-treonina, L-isoleucina, L-valina y L-triptófano, por fermentación de bacterias corineformes, caracterizado porque se utilizan bacterias transformadas con un gen de la glutamato-deshidrogenasa procedente de microorganismos, en las que se incrementa la actividad intracelular de la glutamato-deshidrogenasa, sobre-expresándose en especial la secuencia de nucleótidos que codifica el gen de la glutamato-deshidrogenasa.
Description
Procedimiento para la preparación fermentativa de
L-aminoácidos utilizando bacterias
corineformes.
Objeto de la invención es un procedimiento para
la preparación fermentativa de L-aminoácidos
utilizando bacterias corineformes, en las que se produce una
sobre-expresión especialmente del gen de la
glutamato-deshidrogenasa.
Los L-aminoácidos se utilizan en
la nutrición animal, en medicina humana y en la industria
farmacéutica.
Los L-aminoácidos se preparan de
forma fermentativa con cepas de bacterias corineformes productoras
de L-aminoácidos, en especial Corynebacterium
glutamicum. Debido a la gran importancia de este grupo de
productos, se trabaja constantemente en la optimización del
procedimiento de preparación. Las mejoras del procedimiento pueden
afectar a las medidas técnicas de fermentación tales como, por
ejemplo, agitación y aprovisionamiento de oxígeno, o a la
composición del medio de nutrición tales como, por ejemplo, la
concentración de azúcares durante la fermentación, o al
procesamiento en la forma de producto mediante, por ejemplo,
cromatografía de intercambio de iones, o a las propiedades
intrínsecas de rendimiento del propio microorganismo.
Para mejorar las propiedades de rendimiento de
estos microorganismos, se utilizan métodos tales como mutagénesis,
selección y elección de mutantes. De esta forma, se obtienen cepas
que son resistentes contra antimetabolitos tales como, por ejemplo,
la
lisin-analogon-S-(2-aminoetil)-cisteína,
o que son auxotróficas para aminoácidos importantes en la
regulación y que producen L-aminoácidos.
Desde hace algunos años, se utilizan, asimismo,
métodos de la técnica del ADN recombinante para la mejora de las
cepas de Corynebacterium glutamicum productoras de
L-aminoácidos, en los que se amplifican los genes de
biosíntesis individuales y se investiga su efecto sobre la
producción de L-aminoácidos. Artículos de
recopilación sobre este asunto comprenden, entre otros, los de
Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", en: Biology of Industrial
Microorganisms; Demain y Solomon (Eds.), Benjamin Cummings,
Londres, Reino Unido, 1985, 115-142), Hilliger
(BioTec 2, 40-44 (1991)), Jetten y Sinskey (Critical
Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) y Sahm
et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782,
25-39 (1996)).
La enzima
glutamato-deshidrogenasa cataliza la aminación
reductora del ácido \alpha-cetoglutárico en ácido
glutamínico. En la Solicitud de Patente francesa 2.575.492 se
describe un fragmento de ADN de Corynebacterium melassecola
801, portador de un gen de glutamato-deshidrogenasa.
Posiblemente, se le utiliza allí para elevar la formación de ácido
glutamínico en la fermentación de Corynebacterium
melassecola, para preparar los aminoácidos glutamina, prolina y
arginina a partir de glutamato. Börmann et al. (Molecular
Microbiology 6, 317-326 (1992)) describieron la
secuencia de nucleótidos del gen de la
glutamato-deshidrogenasa de Corynebacterium
glutamicum ATCC13032. La referencia sólo contiene datos acerca
del incremento de la actividad específica de la enzima en la
célula.
Por el documento WO 99/46363 se conoce la
preparación de L-lisina con Corynebacterium,
transformada con el gen gdh procedente de un Peptostreptococcus
asaccharolyticus. La secuencia de nucleótidos del gen de la
glutamato-deshidrogenasa de Peptostreptococcus
asaccharolyticus se encuentra en Snedecor et al.
(Journal of Bacteriology 173, 6162-6167
(1991)).
Los presentes inventores se han impuesto como
misión poner a disposición nuevas medidas para una preparación
fermentativa mejorada de otros L-aminoácidos.
Los L-aminoácidos se utilizan en
la nutrición animal, en medicina humana y en la industria
farmacéutica. Existe, por lo tanto, un interés general en poner a
disposición nuevos procedimientos mejorados para la preparación de
L-aminoácidos.
Cuando, en lo sucesivo, se haga referencia a
L-aminoácidos, se dan a entender los aminoácidos
formadores de proteínas L-treonina,
L-isoleucina, L-valina,
L-triptófano y, eventualmente, sus sales, en
especial, L-treonina y
L-triptófano.
Objeto de la invención es un procedimiento para
la preparación de uno o más de los L-aminoácidos,
seleccionados del grupo de la L-treonina,
L-isoleucina, L-valina y
L-triptófano, por fermentación de bacterias
corineformes, caracterizado porque se utilizan bacterias
transformadas de microorganismos en las que se incrementa la
actividad intracelular de la
glutamato-deshidrogenasa y, en especial, se produce
una sobre-expresión de la secuencia de nucleótidos
que codifica el gen de la
glutamato-deshidrogenasa.
En las reivindicaciones se encuentran las formas
de realización preferidas.
El incremento de la actividad intracelular de una
o múltiples enzimas en un microorganismo, codificado por el
correspondiente ADN, se lleva a cabo, por ejemplo, aumentando el
número de copias del gen o de los genes, utilizando un potente
promotor o un gen que codifique una correspondientes enzima con una
elevada actividad y, eventualmente, combinando estas medidas.
Los microorganismos que son objeto de la presente
invención pueden producir L-aminoácidos a partir de
glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón,
celulosa, o a partir de glicerina y etanol. Se puede tratar de
representantes de las bacterias corineformes, en especial del género
Corynebacterium. Dentro del género de Corynebacterium
se debe citar, especialmente, la especie Corynebacterium
glutamicum que es conocida en la industria por su capacidad
para producir L-aminoácidos.
Cepas adecuadas del género
Corynebacterium, en particular de la especie
Corynebacterium glutamicum, son las cepas de tipo salvaje
conocidas
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermetum ATCC13869
y
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
y los mutantes o cepas preparados a partir de las
mismas, tales como, por
ejemplo,
las cepas productoras de
L-treonina
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 5835
Brevibacterium flavum
FERM-P 4164 y
Brevibacterium lactofermentum
FERM-P 4180,
o las cepas productoras de
L-isoleucina
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 756
Brevibacterium flavum
FERM-P 759 y
Brevibacterium lactofermentum
FER-P 4192,
o las cepas productoras de
L-valina
Brevibacterium flavum
FERM-P 512 y
Brevibacterium lactofermentum
FERM-P 1845,
y las cepas productoras de
L-triptófano
Corynebacterium glutamicum
FERM-BP 478
Brevibacterium flavum
FERM-BP 475 y
Brevibacterium lactofermentum
FERM-P 7127.
Los inventores han descubierto que las bacterias
corineformes producen, tras la sobre-expresión de
la L-glutamato-deshidrogenasa,
L-aminoácidos de manera optimizada, sin que se
reivindique aquí el ácido L-glutamínico.
De acuerdo con la invención, se puede utilizar el
gen de la glutamato-deshidrogenasa de C.
glutamicum, descrito por Börmann et al. (Molecular
Microbiology 6, 317-326 (1992)). Adicionalmente,
resulta adecuado el gen de la
glutamato-deshidrogenasa de otros microorganismos
tales como, por ejemplo, de Peptostreptococcus
asaccharolyticus, descrito por Snedecor et al. (Journal
of Bacteriology 173, 6162-6167 (1991)). Además, se
pueden utilizar alelos de los mencionados genes, procedentes de la
degeneración del código genético o de las mutaciones de sentido
("sense mutations") de función neutra.
Para obtener una sobre-expresión,
se puede elevar el número de copias del correspondiente gen, o se
puede mutar la región promotora y reguladora, que se encuentra
aguas arriba del gen estructural. Del mismo modo funcionan los
cartuchos de expresión, incorporados aguas arriba del gen
estructural. Mediante promotores inducibles resulta posible,
adicionalmente, elevar la expresión en el transcurso de la
producción fermentativa de L-aminoácidos. A través
de medidas para prolongar la duración de la vida del ARNm se
mejora, igualmente, la expresión. De la misma manera, evitando la
degradación de la proteína enzimática se potencia la actividad
enzimática. Los genes o construcciones génicas pueden estar
presentes en plasmidios con diferente número de copias, o estar
integrados en los cromosomas con la correspondiente amplificación.
De forma alternativa, se puede lograr, adicionalmente, una
sobre-expresión de los genes afectados modificando
la composición de los medios y la realización de los cultivos.
El experto encontrará referencias en, entre
otros, Martin et al. (Bio/Technology 5,
137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138,
35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology
6, 428-430 (1988)), Eikmanns et al. (Gene
102, 93-98 (1991)), en la Patente Europea EPS
0.472.869, en la Patente de EE.UU. 4.601.893, en Schwarzer y Pühler
(Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), en Reinscheid
et al. (Applied and Environmental Microbiology 60,
126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal
of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la
Solicitud de Patente WO 96/15246, en Jensen y Hammer (Biotechnology
and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), en Makrides
(Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) y en
libros de texto conocidos de genética y biología molecular.
Ejemplos de plasmidios con cuya cooperación se
puede sobre-expresar la
glutamato-deshidrogenasa son pEK1,
9gdh-1 y pEKExpgdh, que están contenidos en las
cepas ATCC13032/pEK1, 9gdg-1 y
DH5\alpha/pEKExpgdh. El plasmidio pEK1, 9gdh-1 es
un vector pendular que contiene el gen de la
glutamato-deshidrogenasa dependiente de NADP de
C. glutamicum. El plasmidio pEKExpgdh es un vector pendular
que contiene la glutamato-deshidrogenasa dependiente
de NAD de Peptostreptococcus asaccharolyticus.
Adicionalmente, para la producción de los
correspondientes L-aminoácidos puede ser
conveniente la sobre-expresión de una o varias
enzimas de las respectivas vías de síntesis de los aminoácidos,
junto con la glutamato-deshidrogenasa. De esta
forma, resulta posible, por ejemplo
- \bullet
- para mejorar las bacterias corineformes productoras de L-valina, se puede sobre-expresar, adicionalmente, el gen que codifica la acetohidroxiácido-sintasa (documento EP-B 0356739),
- \bullet
- para mejorar las bacterias corineformes productoras de L-triptófano se puede sobre-expresar, adicionalmente, el gen que codifica la antranil-ácido fosforibosil-transferasa (documento EP-B 0124048),
- \bullet
- para mejorar las bacterias corineformes productoras de L-treonina o L-isoleucina se puede sobre-expresar, adicionalmente, el gen que codifica la homoserin-deshidrogenasa (documento EP-A 0131171).
Adicionalmente, para la producción de los
correspondientes L-aminoácidos puede ser
conveniente, además de la sobre-expresión de la
glutamato-deshidrogenasa, inhibir las reacciones
secundarias indeseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid
Producing Micro-organisms", en: Overproduction of
Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic
Press, Londres, Reino Unido, 1982).
Los microorganismos preparados de acuerdo con la
invención se pueden cultivar de manera continua o discontinua en
procedimientos de lote (cultivo en serie) o en procedimiento de
lote de alimentación (procedimiento de afluencia) o procedimiento
repetido de lote de alimentación (procedimiento de afluencia
repetitivo) con fines de producción de
L-aminoácidos. Una recopilación de los métodos de
cultivo conocidos se describe en el libro de texto de Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), o en el libro de texto de Storhas
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/ Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo utilizado debe satisfacer
adecuadamente los requisitos de las correspondientes cepas. La obra
"Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad
Americana de Bacteriología (Washington D.C., EE.UU., 1981) contiene
descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos.
Como fuente de carbono se pueden utilizar azúcares e hidratos de
carbono tales como, por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa,
fructosa, maltosa, melaza, almidón y celulosa, aceites y grasas
tales como, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite
de cacahuete y aceite de coco, ácidos grasos tales como, por
ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico,
alcoholes tales como, por ejemplo, glicerina y etanol, y ácidos
orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético. Estos elementos se
pueden usar aislados o mezclados. Como fuente de nitrógeno se
pueden utilizar compuestos que contengan nitrógeno orgánico tales
como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de
malta, agua de manantial de maíz, harina de semillas de soja y
urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro
de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de
amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar aisladas o
mezcladas. Como fuente de fósforo se pueden utilizar
hidrógeno-fosfato de potasio o
hidrógeno-fosfato dipotásico, o las
correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo
debe contener, adicionalmente, sales metálicas tales como, por
ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, necesarias para
el crecimiento. Por último, se pueden agregar nutrientes esenciales
tales como aminoácidos y vitaminas a los elementos anteriormente
mencionados. Al medio de cultivo se pueden agregar, adicionalmente,
precursores adecuados. Los elementos mencionados se pueden agregar
al cultivo en forma de una única adición, o de manera adecuada
durante el cultivo.
Para el control de pH del cultivo se utilizan, de
manera adecuada, compuestos básicos tales como hidróxido sódico,
hidróxido de potasio, amoniaco, o compuestos ácidos tales como
ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para el control de desarrollo de
espuma se pueden emplear agentes antiespumantes tales como, por
ejemplo, ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para mantener la
estabilidad de los plasmidios se pueden agregar al medio sustancias
de acción selectiva adecuadas, por ejemplo, antibióticos. Con el
fin de mantener las condiciones aerobias, se alimentan al cultivo
oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno tales como, por
ejemplo, aire. La temperatura del cultivo es normalmente de 20ºC
hasta 45ºC y, preferentemente, de 25ºC a 40ºC. El cultivo se
prolonga durante el tiempo necesario para que se forme el máximo de
los L-aminoácidos deseados. Este objetivo se
alcanza, normalmente, en el plazo de 10 horas hasta 160 horas.
El análisis de los L-aminoácidos
se puede llevar a cabo de manera automática, basado en la
cromatografía de intercambio de aniones, con derivatización
posterior de ninhidrina, como lo describe Spackmann et al.
(Analytical Chemistry 30, 1190 (1958)).
Se han depositado los siguientes microorganismos
en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares
(DSMZ, Braunschweig, Alemania), según el Acuerdo de Budapest:
Corynebacterium glutamicum cepa
ATCC13032(pEK1, 9gdh-1 como DSM 12614;
Escherichia coli K12 cepa
DH5\alpha/pEKExpgdh como DSM 12613.
La presente invención se explicará de forma más
detallada mediante ejemplos de realización.
A este efecto se llevaron a cabo ensayos con
cepas productoras de aminoácidos, en los que se demuestra la
superioridad del procedimiento reivindicado:
- a)
- la cepa de Brevibacterium flavum DSM5399 (documento EP-B 0.385.940), productora de L-treonina y L-isoleucina, y
- b)
- la cepa ATCC13032\DeltailvA, depositada como DSM12455 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares en Braunschweig (Alemania), según el Acuerdo de Budapest, productora de L-valina y pobre en isoleucina.
El plasmidio pEK1,9gdh-1 se
corresponde con el plasmidio pEK1.9gdh descrito por Börmann et
al. (Molecular Microbiology 6, 317-326 (1992)).
Se le aisló de ATCC13032(pEK1,9gdh-1. Del
mismo modo, se aisló el plasmidio conocido pEKExpgdh (Marx et
al., Metabolic Engineering 1, 35-48 (1991)),
portador del gen de la glutamato-deshidrogenasa de
Peptostreptococcus asaccharo-lyticus
(Snedecor et al., Journal of Bacteriology 173,
6162-6167 (1991)), de la cepa de E. coli
DH5\alpha/pEKExpgdh.
Las cepas DSM5399 y ATCC13032\DeltailvA se
transformaron con el plasmidio pEK1,9gdh-1 de la
forma descrita por Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters
65, 299-304 (1989)). La selección de los
transformantes se efectuó sobre Agar de
Cerebro-Corazón de la Compañía Merck (Darmstadt,
Alemania), suplementado con 50 mg/l de kanamicina. De esta manera,
se formaron las cepas DSM5715/pEK1,pgdh-1,
DSM5399/pEK11,9gdh-1 y
ATCC13032\DeltailvA/pEK1,9gdh-1. De la misma forma
se transformó la cepa DSM5715 con el plasmidio pEKExpgdh y se
obtuvo la cepa DSM5715/
pEKExpgdh.
pEKExpgdh.
| Componentes | Concentración por litro |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 20 g |
| Urea | 5 g |
| KH_{2}PO_{4} | 1 g |
| K_{2}HPO_{4} | 1 g |
| Componentes | Concentración por litro |
| MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O | 0,25 g |
| Ácido 3-morfolin-propanosulfónico | 42 g |
| FeSO_{4} \cdot 7H_{2}O | 10 mg |
| MnSO_{4} \cdot H_{2}O | 10 mg |
| ZnSO_{4} \cdot 7H_{2}O | 1 mg |
| CuSO_{4} | 0,2 mg |
| NiCl_{2} \cdot 6H_{2}O | 0,02 mg |
| CaCl_{2} | 10 mg |
| Ácido proto-catecólico | 0,03 mg |
| Biotina | 200 \mug |
| Medio CgXII (Keilhauer et al.) |
Después de la fermentación, se determinaron la
densidad óptica (DO) (Biochrom Novaspec 4049, LKB Instruments GmbH,
Gräfelfing, Alemania) a una longitud de onda de medición de 600 nm,
y la concentración de L-aminoácidos formados con un
analizador de aminoácidos de la Compañía
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio de iones y posterior reacción de
columna con detección de ninhidrina. En las Tablas 2 y 3 se
presentan los resultados de los ensayos.
Se precultivó la cepa
DSM5399/pEK1,9gdh-1 en medio completo CgIII (Kase y
Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36 (9),
1611-1621 (1972)) con 50 \mug/ml de kanamicina. Se
inocularon 10 ml de Medio CgIII, contenido en un matraz de
Erlenmeyer de 100 ml con 4 deflectores, con un asa de inoculación de
la cepa y el cultivo se incubó durante 16 horas a 240 rpm y a
30ºC.
Para la inoculación de 10 ml del medio de
producción, contenidos en el matraz de Erlenmeyer de 100 ml con 4
capas de desviación, se determinó la DO (660 nm) del precultivo. El
cultivo principal se inoculó hasta una DO de 0,1. Como medio de
producción se utilizó el medio CgXII descrito por Keilhauer et
al. (Journal of Bacteriology 1993,
175:5595-5603). La composición del medio se
representa en la Tabla 1. Se agregaron 4% de glucosa y 50 mg/l de
sulfato de kanamicina. Las células se incubaron a 33ºC, 250 rpm y
una humedad del aire de 80% durante 48 horas. Seguidamente, se
determinó, de la forma anteriormente indicada, la densidad óptica a
660 nm y la concentración de L-treonina y
L-isoleucina formadas. En la Tabla 2 se representa
el resultado del ensayo.
| Cepa | DO | L-treonina g/l | L-isoleucina g/l |
| DSM5399 | 10,5 | 1,77 | 1,05 |
| DSM5399/pEK1,9gdh-1 | 11,0 | 2,26 | 1,44 |
Se precultivó la cepa
ATCC13032\Deltailva/pEK1,9gdh-1 en medio completo
CgIII (Kase y Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36 (9)
1611-1621 (1972)) con 50 \mug/ml de kanamicina.
Se agregaron 50 ml de Medio CgIII, contenido en un matraz de
Erlenmeyer de 500 ml con 4 deflectores, con un asa de incubación de
la cepa y el cultivo se incubó durante 16 horas a 140 rpm y
30ºC.
Para la inoculación de 60 ml de medio de
producción, contenidos en un matraz de Erlenmeyer de 500 ml con 4
deflectores, se determinó la DO (660 nm) del precultivo. El cultivo
principal se separó por centrifugación y se retiró el sobrenadante.
El granulado se recogió en 5 ml de medio de producción y el cultivo
principal se inoculó a una DO de 0,3. Como medio de producción se
utilizó Medio CgXII (Keilhauer et al., Journal of
Bacteriology 1993 175:5595-5603), como se ha
descrito en el Ejemplo 2 (con 4% de glucosa). Las células se
incubaron a 30ºC, 150 rpm durante 48 h. Seguidamente, se determinó
la densidad óptica a 660 nm y la concentración en
L-valina formada, del modo anteriormente descrito.
En la Tabla 3 se representa el resultado del ensayo.
| Cepa | DO | L-valina g/l |
| ATCC13032\DeltailvA | 18,5 | 0,29 |
| ATCC13032\DeltailvA/pEK1,9gdh-1 | 17,6 | 0,45 |
Se precultivó la cepa DSM5715/pEKExpgdh en medio
complejo 2TY, compuesto por 16 g/l de triptona, 10 g/l de extracto
de levadura y 5 g/l de NaCl. Se inocularon 60 ml de medio 2TY,
contenidos en matraces de Erlenmeyer de 500 ml con 2 deflectores,
con un asa de inoculación de la cepa y el cultivo se incubó durante
12 horas a 150 rpm y a 30ºC.
Para la inoculación de 60 ml de medio de
producción, contenidos en matraces de Erlenmeyer de 500 ml con 2
placas de desviación, el precultivo se separó por centrifugación a
5000 rpm en una centrifugadora Sepatech Minifuge RF (Heraeus, Hanau,
Alemania) durante 10 minutos. El sobrenadante se eliminó y el
granulado se resuspendió en 1 ml de medio de producción. Se agregó
al medio de producción una parte alícuota de esta suspensión
celular, de forma que se obtuvo una DO600 de aprox. 0,4. Como medio
de producción se utilizó el medio CGC descrito por Schrumpf et
al. (Journal of Bacteriology 173, 4510-4516
(1991)) (Tabla 5), suplementado con 25 g/l de glucosa, 350 mg/l de
leucina, 42 g/l de ácido
3-morfolino-propanosulfónico y 50
mg/l de monosulfato de kanamicina a pH 7. Los cultivos se incubaron
durante 30 horas a 30ºC y a 150 rpm.
| Componente | Concentración por litro |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 5 g |
| Urea | 5 g |
| KH_{2}PO_{4} | 0,5 g |
| K_{2}HPO_{4} | 0,5 g |
| MgSO_{4} \cdot 7 H_{2}O | 0,25 g |
| FeSO_{4} \cdot 7 H_{2}O | 10 mg |
| MnSO_{4} \cdot H_{2}O | 10 mg |
| ZnSO_{4} \cdot 7 H_{2}O | 1 mg |
| CuSO_{4} | 0,2 mg |
| NiCl_{2} \cdot 6 H_{2}O | 0,02 mg |
| CaCl_{2} \cdot 2 H_{2}O | 10 mg |
| Biotina | 200 \mug |
A continuación, se determinaron la densidad
óptica (DO) (Biochrom Novaspec 4049, LKB Instruments GmbH,
Gräfelfing, Alemania) a una longitud de onda de medición de 600 nm
y la concentración en L-alanina,
L-lisina y L-valina formadas, con
un analizador de aminoácidos de la Compañía
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción de columna posterior
con detección de ninhidrina. En la Tabla 5 aparece el resultado del
ensayo.
| Cepa | DO | L-alanina g/l | L-lisina g/l | L-valina g/l |
| DSM5715 | 29,4 | Indicios | 1,6 | 0,1 |
| DSM5715/pEKExpgdh | 19,4 | 0,6 | 2,1 | 0,6 |
Claims (7)
1. Procedimiento para la preparación de uno o
varios de los L-aminoácidos, seleccionados del grupo
de L-treonina, L-isoleucina,
L-valina y L-triptófano, por
fermentación de bacterias corineformes, caracterizado porque
se utilizan bacterias transformadas con un gen de la
glutamato-deshidrogenasa procedente de
microorganismos, en las que se incrementa la actividad intracelular
de la glutamato-deshidrogenasa,
sobre-expresándose en especial la secuencia de
nucleótidos que codifica el gen de la
glutamato-deshidrogenasa.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se utilizan bacterias en las que se
refuerzan, además, los genes restantes de la vía metabólica de la
formación de los L-aminoácidos deseados.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se utilizan bacterias en las que se
inactivan, al menos parcialmente, las vías metabólicas que reducen
la formación del o de los L-aminoácidos
deseados.
4. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se utiliza
una cepa transformada con un vector de plasmidio y porque el vector
de plasmidio es portador de la secuencia de nucleótidos que
codifica la glutamato-deshidrogenasa.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque se utiliza la bacteria transformada con
el vector de plasmidio pEK1,9gdh-1, depositado en
Corynebacterium glutamicum, bajo el número DSM 12614.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque se utilizan bacterias transformadas con
el vector de plasmidio pEKExpgdh, depositado en E. coli bajo
el número DSM 12613.
7. Procedimiento para la preparación de uno o
varios de los L-aminoácidos, seleccionados del grupo
de L-treonina, L-isoleucina,
L-valina y L-triptófano, por
fermentación de bacterias corineformes según la reivindicación 1,
caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes
etapas:
- a)
- fermentación de bacterias transformadas con el gen de la glutamato-deshidrogenasa, en las cuales se incrementa la actividad intracelular de la glutamato-deshidrogenasa, sobre-expresándose en especial la secuencia de nucleótidos que codifica el gen de la glutamato-deshidrogenasa,
- b)
- aumento del o de los L-aminoácidos deseados en el medio o en las células de las bacterias, y
- c)
- aislamiento del o de los L-aminoácidos.
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